CN111647071B - 识别靶细胞表面抗原的t细胞受体及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及识别靶细胞表面抗原的T细胞受体及其组合物，所述T细胞受体包含α和/或β链，所述α或β链包含SEQ ID NO.1～16任一项所述的CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列。所述组合物包含T细胞受体或编码T细胞受体的核酸、表达载体或重组细胞。本发明同时涉及所述T细胞及其组合物在诊断检测和治疗中的应用。

Description

识别靶细胞表面抗原的T细胞受体及其组合物
技术领域
本发明本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及识别靶细胞表面抗原的T细胞受体及其组合物。
背景技术
近年来，肿瘤的免疫治疗取得了巨大进展，其旨在激活人体免疫系统，希望依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织。过继性免疫细胞治疗(Adoptivecellular therapy，ACT)属于肿瘤免疫治疗的重要组成部分，其通过向患者回输在体外扩增的自身或同种(特异性或非特异性)免疫细胞，从而达到抗肿瘤目的。
T细胞受体(Tcell receptor，TCR)是T细胞表面的一种受体分子，它特异性识别抗原提呈细胞上的抗原肽-MHC复合物，进而触发T细胞免疫应答由于TCR分子决定着T细胞的抗原识别特异性，如果将肿瘤抗原特异性的TCR基因转入普通T细胞中，能够赋予该T细胞肿瘤抗原的识别能力，经体外活化增殖后再转输入患者体内，可以发挥抗肿瘤功效。因此利用TCR基因导入的方法可以方便地获得大量识别特定抗原的T细胞，经TCR基因修饰的T细胞被称为TCR-T，近年来TCR-T已经成为肿瘤免疫治疗中的研究热点，在临床实验中显示了良好的治疗效果。
TCR分子主要由α和β两条链组成，其编码基因V，(D)J，C在T细胞发育过程中经过胚系重排，在胸腺中经过阳性选择和阴性选择过程。机体成熟T细胞所产生的TCRαβ组成了一个能与成千万种抗原结合的抗原识别受体库(Repertoire)。成功获得高效的TCR基因是肿瘤TCR-T细胞治疗的重要前提。由于大部分肿瘤抗原均为自身抗原，外周T细胞经历了阴性选择，其TCR分子对自身抗原肽/MHC复合物的亲和力低下，难以有效活化和形成克隆，表现为一种无反应性状态。因此寻找高效的TCR基因成为TCR-T细胞治疗研究的重点。
发明内容
如本文描述的，本发明涉及一种识别靶细胞表面抗原的T细胞受体，所述T细胞受体包括对靶细胞上的表面抗原的亲和力。
本发明的一个方面提供了一种识别靶细胞表面抗原的T细胞受体，所述T细胞受体包含Vβ链。
在一个实施方案中，Vβ链的CDR1、CDR2、CDR3包含以下所示的序列：SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7。在另一个实施方案中，Vβ链的CDR1、CDR2、CDR3包含以下所示的序列：SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8。在另一个实施方案中，Vβ链的CDR1、CDR2、CDR3包含以下所示的序列：SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9。在另一个实施方案中，Vβ链的CDR1、CDR2、CDR3包含以下所示的序列：SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.10。在另一个实施方案中，Vβ链的CDR1、CDR2、CDR3包含以下所示的序列：SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.11。
在一个实施方案中，Vα链的CDR1、CDR2、CDR3包含以下所示的序列：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3。
在一个实施方案中，Vβ包含SEQ ID NO.12所示的序列或其功能等同物；在另一个实施方案中，Vβ包含SEQ ID NO.13所示的序列或其功能等同物；另一个实施方案中，Vβ包含SEQ ID NO.14所示的序列或其功能等同物；另一个实施方案中，Vβ包含SEQ ID NO.15所示的序列或其功能等同物；另一个实施方案中，Vβ包含SEQ ID NO.16所示的序列或其功能等同物；
在一个实施方案中，Vα包含SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或其功能等同物。
在本发明中，靶细胞表面抗原选自病毒抗原、细菌抗原、寄生虫抗原、肿瘤抗原、疾病细胞相关抗原和/或其任意片段。优选的，靶细胞表面抗原选自肿瘤抗原。
所述“肿瘤抗原”，是指全部地或以片段形式(例如MHC/肽)在肿瘤细胞表面上被表达的分子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其用于将药理学作用剂优先靶向肿瘤细胞。肿瘤抗原可以为由正常细胞和癌细胞表达的标记物，例如谱系标记物例如在B细胞上的CD19；肿瘤抗原也可以为在癌细胞中与正常细胞相比过表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍或以上过表达；肿瘤抗原也可以为癌细胞中被不适当地合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上被表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子；肿瘤抗原也可以全部或以片段形式(例如，MHC/肽)被专一性地表达在癌细胞的细胞表面上，而不是在正常细胞的表面上合成或表达。
在一优选例中，所述肿瘤包括但不限于：肉瘤和癌症(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤，滑膜vioma，间皮瘤，尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、癌、支气管癌、髓样癌、肾细胞癌、肝癌，尼罗河管癌，绒癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤，颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、食管癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤；优选胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌和胶质瘤；更优选胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌。
在一个实施方案中，所述T细胞受体呈可溶形式。
本发明的另一个方面提供了编码前述T细胞受体或其抗原结合片段的核酸。所述核酸为DNA或RNA。
除非另外规定，编码氨基酸序列的核苷酸序列包括是彼此的简并形式并且编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可以包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可以在一些形式中包含内含子(一个或多个)。
如本文使用的术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。另外，核酸是核苷酸的聚合物。因而，如本文使用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸是可以被水解为单体“核苷酸”的多核苷酸的一般知识。单体核苷酸可以被水解为核苷。如本文使用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可获得的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段非限制性地包括重组手段，即，使用普通克隆技术和PCRTM等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，和通过合成手段。
本发明的另一个方面提供了一种可操作地连接于表达控制序列的根据前面所述的核酸的表达载体。
“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的并入重组多核苷酸的那些，比如粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“可操作地连接”指的是调控序列和异源核酸序列之间的功能连接，其导致异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列处于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的DNA序列是邻近的，并且在必要时在同一的阅读框中接合两个蛋白编码区。
在一个实施方案中，所述表达载体能够将所述核酸递送至宿主细胞。
如本文使用的“慢病毒”指的是逆转录病毒科家族的属。在逆转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可以递送显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，以便它们是基因递送载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。衍生自慢病毒的载体提供了实现显著水平的体内基因转移的工具。
本发明的另一个方面提供了一种包含前述表达载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，所述宿主细胞是造血祖细胞或免疫系统细胞。
在一个实施方案中，所述免疫系统细胞为T细胞。
优选的，所述T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系。
所述“外周血单核细胞”(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)是指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞等。
本发明的另一个方面提供了一种组合物，所述组合物包含：前面所述的T细胞受体、核酸、表达载体或宿主细胞。
本发明的另一个方面提供了用于刺激针对对象中的靶细胞或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，包括给对象施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括前面所述的组合物。
如本文使用的术语“免疫应答”定义为当淋巴细胞将抗原分子识别为异物并诱发形成抗体和/或活化淋巴细胞以移除抗原时发生的对抗原的细胞应答。
本发明的药物组合物还包括一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包括缓冲液比如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物比如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸比如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂比如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选地配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由如下因素确定，比如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度，但是可以由临床试验确定适当的剂量。
当指示“免疫学有效量”、“抗免疫应答有效量”、“免疫应答-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明的组合物的准确量可以由医师考虑个体在年龄、重量、免疫应答、和患者(对象)的状况中的差异来确定。
本发明的另一个方面提供了前面所述的组合物在制备治疗肿瘤、病原体感染、增强个体免疫耐受能力、检测抗原、疫苗制备的产品中的应用。
在具体的实施方式中，所述的肿瘤包括白血病(如急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病，急性粒细胞白血病，急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性白血病、慢性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症)，淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、原发性巨球蛋白血症，重链病，实体瘤如肉瘤和癌症(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、血管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤，滑膜vioma，间皮瘤，尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、癌、支气管癌、髓样癌、肾细胞癌、肝癌，尼罗河管癌，绒癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤，颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、食管癌、胆囊癌、肾癌、多发性骨髓瘤；较佳地，所述的“肿瘤”包括但不限于：胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴瘤、胆囊癌、肾癌、白血病、多发性骨髓瘤、卵巢癌、宫颈癌和胶质瘤，以及它们的任意组合；或
所述的病原体包括：病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫；较佳地，所述的病毒包括：巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类免疫缺陷病毒或流感病毒。
如本文使用的，术语“T细胞受体”或“TCR”指的是响应于抗原的呈递参与T细胞的活化的膜蛋白的复合体。TCR负责识别结合至主要组织相容性复合体分子的抗原。TCR由alpha(a)和beta(β)链的异二聚体组成，但是在一些细胞中，TCR由γ和δ(γ/δ)链构成。TCR可以以α/β和γ/δ形式存在，其是结构上相似的，但是具有不同的解剖学位置和功能。每个链由两个胞外结构域——可变和恒定结构域——组成。在一些实施方式中，TCR可以在包括TCR的任何细胞上被修饰，包括，例如，辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T细胞和γδT细胞。
序列表
<110> 深圳豪石生物科技有限公司
<120> 识别靶细胞表面抗原的T细胞受体及其组合物
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Ser Asn Ala Tyr Asn
1               5
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ser Lys Pro
1
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Cys Ala Val Asp Glu Asp Gln Thr Gly Ala Asn Asn Leu Phe Phe
1               5                   10                  15
<210> 4
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Asp Gln Val Phe Gln Pro Ser Thr Val Ala Ser Ser Glu Gly Ala
1               5                   10                  15
Val Val Glu Ile Phe Cys Asn His Ser Val Ser Asn Ala Tyr Asn Phe
            20                  25                  30
Phe Trp Tyr Leu His Phe Pro Gly Cys Ala Pro Arg Leu Leu Val Lys
        35                  40                  45
Gly Ser Lys Pro Ser Gln Gln Gly Arg Tyr Asn Met Thr Tyr Glu Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Ser Ser Leu Leu Ile Leu Gln Val Arg Glu Ala Asp Ala Ala
65                  70                  75                  80
Val Tyr Tyr Cys Ala Val Asp Glu Asp Gln Thr Gly Ala Asn Asn Leu
                85                  90                  95
Phe Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr Val Ile Pro Tyr
            100                 105
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Gly His Asp Arg
1               5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Phe Asp Val Lys Asp
1               5
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Cys Ala Thr Ser Asp Pro Lys Gly Thr Ala Thr Tyr Glu Gln Tyr Phe
1               5                   10                  15
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Cys Ala Thr Ser Asp Asn Pro Ala Gly Tyr Gln Glu Thr Gln Tyr Phe
1               5                   10                  15
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Cys Ala Thr Ser Ala His Val Glu Arg Glu Gly Gln Tyr Phe
1               5                   10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Cys Ala Thr Ser Asp Pro Asp Leu Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1               5                   10
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Cys Ala Thr Ser Asp Ala Gly Ala Trp Leu Glu Ala Phe Phe
1               5                   10
<210> 12
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr Lys Thr Gly
1               5                   10                  15
Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His Asp Arg Met
            20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr
        35                  40                  45
Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr
    50                  55                  60
Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Trp Tyr
                85                  90                  95
Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp
            100                 105                 110
Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser
        115                 120                 125
Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser Ala Ile Pro
    130                 135                 140
Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Asp Pro Lys Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ala Thr Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val
                165                 170                 175
<210> 13
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr Lys Thr Gly
1               5                   10                  15
Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His Asp Arg Met
            20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr
        35                  40                  45
Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr
    50                  55                  60
Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Trp Tyr
                85                  90                  95
Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp
            100                 105                 110
Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser
        115                 120                 125
Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser Ala Ile Pro
    130                 135                 140
Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Asp Asn Pro Ala Gly
145                 150                 155                 160
Tyr Gln Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val
                165                 170                 175
<210> 14
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr Lys Thr Gly
1               5                   10                  15
Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His Asp Arg Met
            20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr
        35                  40                  45
Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr
    50                  55                  60
Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Trp Tyr
                85                  90                  95
Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp
            100                 105                 110
Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser
        115                 120                 125
Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser Ala Ile Pro
    130                 135                 140
Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Ala His Val Glu Arg
145                 150                 155                 160
Glu Gly Gln Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val
                165                 170
<210> 15
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr Lys Thr Gly
1               5                   10                  15
Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His Asp Arg Met
            20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr
        35                  40                  45
Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr
    50                  55                  60
Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Trp Tyr
                85                  90                  95
Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp
            100                 105                 110
Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser
        115                 120                 125
Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser Ala Ile Pro
    130                 135                 140
Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Asp Pro Asp Leu Ser
145                 150                 155                 160
Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val
                165                 170
<210> 16
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr Lys Thr Gly
1               5                   10                  15
Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His Asp Arg Met
            20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr
        35                  40                  45
Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr
    50                  55                  60
Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Trp Tyr
                85                  90                  95
Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp
            100                 105                 110
Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser Asp Gly Tyr Ser Val Ser
        115                 120                 125
Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser Leu Glu Ser Ala Ile Pro
    130                 135                 140
Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr Ser Asp Ala Gly Ala Trp
145                 150                 155                 160
Leu Glu Ala Phe Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val
                165                 170
附图说明
图1是TCR-T杀伤功能检测图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1高通量测序筛选TCR序列
1、RNA提取及质控
收集急性髓系白血病患者的外周血样本，患者无甲肝，乙肝，丙肝，戊肝，艾滋病，梅毒，淋病和结核感染。
在5mL Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min，磁珠分选T细胞。采用TRIzol法对处理的细胞样本进行RNA的提取，对提取后的RNA质量使用Qubit RNA HS Assay kits，经2100生物分析仪(安捷伦)检测RNA完整性。
2、反转录及文库制备
用Repertoire Analysis Kit(Human TCR alpha,beta)进行建库。将所有试剂置于冰上解冻，在配置mix之前，混匀和离心这些试剂。在冰上配置杂交引物需用的mix(表1)。充分混匀后离心，加热反转录引物杂交mix，65℃5min，冰上孵育至少2min。在冰上准备配制反转录mix(表2)，混匀后离心mix。
表1反应体系
组分 体积
RT dNTP Mixture 1μl
RT Primer H TCRα/β 1μl
RNA样本(100pg-1000ng) 最多到6.2μl
Nuclease-free water 补足至8.2μl
表2反转录体系
Figure BDA0002544294810000071
Figure BDA0002544294810000081
将11.8μl的杂交buffer加到上一步反应的杂交RNA中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序(表3)：
表3反应条件
Figure BDA0002544294810000082
3、第一步PCR
准备第一步PCR需用的试剂(表4)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第一步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。
表4第一步PCR反应体系
Figure BDA0002544294810000083
每管中加入41μl的第一步PCR mix，加入9μl的第一链cDNA产物中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：
表5第一步PCR反应条件
Figure BDA0002544294810000084
Figure BDA0002544294810000091
4、第二步PCR
准备第二步PCR需用的试剂(表6)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。
表6第二步PCR反应体系
组分 体积
PCR buffer 25μl
PCR dNTP Mixture 10μl
Nuclease-free water 3μl
DNA polymerase 1μl
总体积 39μl
准备一个新的PCR管，每管中加入1μl的第二步PCR引物，hTCRα#1-18(编号：A1-A18)，或者hTCRβ#1-18(编号：B1-B18)。加入39μl第二步反应的mix和10μl的第一步PCR产物混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：
表7第二步PCR反应条件
Figure BDA0002544294810000092
5、第三步PCR
准备第三步PCR需用的试剂在冰上解冻(表9)，混匀后瞬时离心。在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。
表8第三步PCR反应体系
组分 体积
PCR buffer 25μl
PCR dNTP Mixture 10μl
3rd universal primer 2.5μl
Nuclease-free water 6.5μl
DNA polymerase 1μl
总体积 45μl
准备一个新的PCR管，每管中加入45μl的第三步PCR mix，加入5μl的第二步PCR产物中，用手指肚弹匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：
表9第三步PCR反应条件
Figure BDA0002544294810000101
6、琼脂糖凝胶电泳
配置1.5％的琼脂糖胶，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。hTCRɑ/β片段在650bp左右。
7、用AGENCOURT AMPure XP(BEACKMAN)磁珠纯化
准备nuclease-free 0.2mL的8连管，按照表10稀释文库。
表10稀释体系
组分 体积
第三步PCR产物 30μl
Nuclease-free water 20μl
总体积 50μl
配置DNase-free 70％乙醇(sigma)。磁珠使用前室温平衡30min，将22.5μl的磁珠加到稀释后文库中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单的离心。将8连管放置在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。将所有的上清转移到新的8连管中。再次混匀未使用过的磁珠，加17.5μl的磁珠到上清中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单离心。将8连管放在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。弃85μl的上清，保留5μl的上清以免吸到磁珠。不要将磁珠与磁力架分离。加200μl的70％的乙醇漂洗。室温30s，弃酒精，重复酒精洗涤步骤。弃所有上清，加30μl的10mM Tris-HCl到每个PCR管中，用移液器混匀至少10次。室温孵育2min然后简单离心。将离心管放置在磁力架上室温5min，分离液体和磁珠。将上清20μl转移至新的PCR管中。
8、文库浓度定量及质控
测定文库浓度用Qubit dsDNA HS kit(英潍捷基)，使用设备Qubit 2.0(life)，取2μl的样本用于测定。通常文库浓度集中在5-40ng/μl。如果样本浓度≥1.72ng/μl可用于Miseq测序。
9、文库目标片段质控
人的TCRα/β文库目标片段集中在650bp，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对文库片段进行质控，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。
10、文库混库及质控
文库混样，是按此批次浓度最低的文库为标准，浓度最低文库乘以10μl为基准纳克数，其他文库按照此纳克数进行取样，确保每个文库的总量是一致的，混样后按照纳克与摩尔数之间的换算，稀释到8.58ng/μl(20nM，650bp)。
11、高通量测序
文库使用Miseq(Illumina)进行2×300bp双端测序，对上述混合完成的文库再次使用设备Qubit 2.0(life)进行文库定量，最终稀释到10pM，与10pM denatured PhiX进行混合(PhiX占比30％)，混合后的600μl进行上机测序。
12、数据分析
采用MiXCR进行初级分析，可以对高度个性化的TCR和免疫球蛋白序列进行分析。MiXCR可以针对不同的数据类型在参数上进行调整，并对分析结果和输出进行优化。进一步高级分析多个多样性指数，如香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)、Inverse-Simpson指数和基尼指数(Gini)等。采用VDJtools用于二级TCR profiling分析以及多样性评估。
13、噬菌体展示技术筛选高亲和力的TCR序列。
14、结果
通过噬菌体展示技术筛选出高亲和力的TCR，其α链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，其中CDR1-3的序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；其β链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.12-16任一项所示，其中，CDR1-2的序列分别如SEQ ID NO.5-6所示，CDR3的序列如SEQ ID NO.7-11任一项所示。
实施例2 TCR-T的构建
1、利用高通量测序和数据分析结果，全合成相关序列，通过XbaI/SalI限制内切酶切点，连接到pCDH载体中。
2、TCR-T细胞制备
采集健康人外周血，在Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min。磁珠分选T细胞。同时加入CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激，24h及48h后加入病毒感染2次，病毒感染时加入IL-2，培养3-20天，获得TCR-T细胞。
实施例3TCR-T杀伤功能检测
从本研究中所述的序列构建的TCR-T中任选一个进行功能检测。
计数靶细胞(U937)和阴性参照靶细胞(Daudi)，分别标记Celltrace far red和CFSE染色。计数TCR-T(TCR的Vβ可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)细胞作为效应细胞。按照计划效靶比(3：1，9：1，18：1)，重悬效应细胞和靶细胞至相应浓度。圆底96孔板中每个效靶比分别铺入铺入组1效应细胞、组2靶细胞和组3效应细胞+靶细胞，每组4个复孔。培养2-24h，收细胞样本，分别收管A：组1效应细胞+组2靶细胞，管B：组3效应细胞+靶细胞，多聚甲醛液固定，流式上机。作Killing Rate与E:T Ratio曲线图。其中，Killing
Figure BDA0002544294810000131
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (19)

1.一种识别靶细胞表面抗原的T细胞受体，其特征在于，Vβ链的CDR1、CDR2、CDR3分别具有如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示的序列；Vα链的CDR1、CDR2、CDR3分别具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的序列；其中，Vβ具有如SEQ ID NO.12所示的序列；Vα具有如SEQ ID NO.4所示的序列。
2.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体呈可溶形式。
3.一种编码权利要求1或2所述T细胞受体的核酸。
4.根据权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述核酸为DNA或RNA。
5.一种可操作地连接于表达控制序列的根据权利要求3所述的核酸的表达载体。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体能够将所述核酸递送至宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述宿主细胞是造血祖细胞或免疫系统细胞。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述免疫系统细胞为T细胞。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞。
10.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述T细胞获得自纯化的T细胞群。
11.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述T细胞获得自纯化的T细胞系。
12.一种包含权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。
13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是造血祖细胞或免疫系统细胞。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其特征在于，所述免疫系统细胞为T细胞。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于，所述T细胞获得自外周血单核细胞、脐带血细胞。
16.根据权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于，所述T细胞获得自纯化的T细胞群。
17.根据权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于，所述T细胞获得自纯化的T细胞系。
18.一种组合物，其特征在于，包含：权利要求1或2所述的T细胞受体；或权利要求3或4所述的核酸；或权利要求5-11任一项所述的表达载体；或权利要求12-17任一项所述的宿主细胞。
19.权利要求18所述的组合物在制备治疗白血病的产品中的应用。
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