CN113831404B

CN113831404B - 应用于疾病治疗的t细胞受体

Info

Publication number: CN113831404B
Application number: CN202111200176.8A
Authority: CN
Inventors: 于力; 王智鼎
Original assignee: Shenzhen University General Hospital
Current assignee: Shenzhen University General Hospital
Priority date: 2021-10-14
Filing date: 2021-10-14
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2041-10-14
Also published as: CN113831404A

Abstract

本发明公开了应用于疾病治疗的T细胞受体，所述T细胞受体包含α和/或β链，所述α或β链包含SEQ ID NO.1‑16任一项所述的CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列。本发明还公开了编码T细胞受体的核酸分子、表达载体、宿主细胞和组合物及其应用。

Description

应用于疾病治疗的T细胞受体

技术领域

本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及应用于疾病治疗的T细胞受体。

背景技术

T细胞受体(Tcell receptor，TCR)是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体，这种外源肽或内源肽可能会是细胞出现异常的唯一迹象。在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。

TCR以αβ和γδ的形式存在，这两种形式在结构上相似，但具有非常不同的结构位置和可能的功能。天然异质二聚体αβTCR的α链和β链为跨膜蛋白，每个链均包含两个胞外结构域，即膜近端恒定结构域和膜远端可变结构域。每个恒定区和可变区都包含链内二硫键。可变区含有高度多态性的环，类似于抗体的互补决定区(CDRs)。每个TCR链的可变区包括可变段和连接段，在β链的情况下还包括多样性段。每个可变区由嵌入框架序列的三个CDRs(互补决定区)组成，其中一个是名为CDR3的高变区。多种类型的α链可变区(Vα)和多种类型的β链可变区(Vβ)，通过它们的框架、CDR1和CDR2序列以及部分定义的CDR3序列来区分。特定的TRAV或TRBV编号由IMGT命名法赋予Vα或Vβs。T细胞受体对识别的表位的特异性主要由CDR3区决定。

采用过继性TCR基因疗法可使患者自身的T细胞具备所需的特异性，并在短时间内产生足够数量的T细胞，从而避免其衰竭。TCR可转导至所有T细胞或T细胞亚群，如CD8、中枢记忆T细胞或具有干细胞特征的T细胞，这可确保更好的持久性和转移时的功能。可以将TCR工程改造的T细胞输注到癌症患者中，所述癌症患者具有例如通过化疗或放疗导致的淋巴细胞减少，诱导稳态扩增，从而大大增强移植的具有高治愈率的T细胞的植入和长期持久性。自然状态下T细胞受体亲和力比较低下，而且肿瘤细胞存在逃逸机制，比如降低自身MHCI类分子的表达水平，因此，在TCR-T疗法当中，优化TCR的亲和力，寻找具有杀伤功效的TCR成为研究的热点。

发明内容

如本文描述的，本发明涉及一种T细胞受体，其具有较高的亲和力和杀伤肿瘤细胞的效果。本发明进一步提供了如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种T细胞受体，

包含α链的可变域Vα和/或β链的可变域Vβ，所述Vα包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述Vβ包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。

进一步，

所述T细胞受体包含：

(a)SEQ ID NO：1所示的CDR1α氨基酸序列，任选地如SEQ ID NO：2所示，进一步任选地如SEQ ID NO：3所示；

(b)SEQ ID NO：4所示的CDR2α氨基酸序列；

(c)SEQ ID NO：5所示的CDR3α氨基酸序列；

(d)SEQ ID NO：9所示的CDR1β氨基酸序列，任选地如SEQ ID NO：10所示，进一步任选地如SEQ ID NO：11所示；

(e)SEQ ID NO：12所示的CDR2β氨基酸序列；和

(f)SEQ ID NO：13所示的CDR3β氨基酸序列。

进一步，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:6-8任一所示的氨基酸序列具有至少80％、优选地90％、优选地95％同一性的Vα和/或与SEQ ID NO:14-16任一所示的氨基酸序列具有至少80％、优选地90％、优选地95％同一性的Vβ。

进一步，所述T细胞受体包含SEQ ID NO:6-8任一所示的氨基酸序列所示的Vα，和/或与SEQ ID NO:14-16任一所示的氨基酸序列所示的Vβ。

进一步，所述T细胞受体包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列所示的Vα，和/或与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列所示的Vβ。

进一步，所述T细胞受体是缺乏跨膜结构域的可溶性T细胞受体。

进一步，所述T细胞受体结合MHC I和/或MHC II肽复合物。

进一步，所述T细胞受体还包含可检测标记。

进一步，所述可检测标记包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质、生物素。

进一步，所述α链进一步包含α恒定区Cα和/或β链进一步包含β恒定区Cβ。

进一步，Cα区和/或该Cβ区包含引入一个或多个能够在α链与β链之间形成一个或多个非天然二硫桥键的半胱氨酸。

进一步，所述α链与β链进一步包含信号肽。

本发明第二方面提供了重组T细胞受体，其特征在于，所述重组T细胞受体包含本发明第一方面所述的T细胞受体，和/或共刺激区。

进一步，所述共刺激区包含选自CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP-10多肽、及其任意组合的共刺激分子。

进一步，所述共刺激区包含CD28多肽。本发明第三方面提供了一种核酸，所述核酸编码本发明第一方面所述的T细胞受体；或编码本发明第二方面所述的重组T细胞受体。

进一步，所述核酸的核苷酸序列是针对宿主细胞中表达而优化的密码子。

进一步，所述宿主细胞任选地为免疫系统细胞。

进一步，所述免疫系统细胞为T细胞。

本发明第四方面提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明第三方面所述的核酸。

进一步，所述表达载体能够将所述多核苷酸递送至宿主细胞。

进一步，所述表达载体为病毒载体。

进一步，所述病毒载体为逆转录病毒载体或慢病毒表达载体。

本发明第五方面提供了一种宿主细胞，包含本发明第三方面所述的核酸或本发明第四方面所述的表达载体。

进一步，所述T细胞受体对于所述宿主细胞是异源的。

进一步，所述宿主细胞选自造血祖细胞或免疫系统细胞；

进一步，所述免疫系统细胞选自免疫系统细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、树突细胞或其任何组合；

进一步，所述免疫系统细胞是T细胞；

进一步，所述T细胞是幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、效应记忆T细胞或其任何组合。

本发明第六方面提供了一种嵌合分子，包含与非细胞底物、毒素和/或抗体缀合的本发明第一方面所述的T细胞受体或其一部分。

进一步，所述非细胞底物选自下组：纳米颗粒、外泌体和其他非细胞底物。

本发明第七方面提供了一种组合物，包含本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的重组T细胞受体、本发明第三方面所述的核酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面所述的嵌合分子。

进一步，所述组合物进一步包含药学上可接受的载剂。

本发明第八方面提供了用于改造免疫细胞的方法，其特征在于，其包括使所述免疫细胞与本发明第四方面所述的表达载体接触。

进一步，所述免疫细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、NK细胞、恒定NK细胞或NKT细胞。

进一步，所述接触为转染或转导。

所述方法进一步包括对所述免疫细胞进行分选以分离经TCR改造的T细胞。

所述方法进一步包括通过连续稀释进行T细胞克隆、以及通过快速扩增方案扩增T细胞克隆。本发明第九方面提供了如下任一项所述的应用：

(1)本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的重组T细胞受体、本发明第三方面所述的核酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面所述的嵌合分子、本发明第七方面所述的组合物在制备过继细胞转移治疗产品中的应用。

进一步，所述过继细胞转移为过继T细胞转移。

进一步，所述过继T细胞转移是同种异体过继T细胞转移、自体过继T细胞转移或通用的非同种异体反应性过继T细胞转移。

(2)本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的重组T细胞受体、本发明第三方面所述的核酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面所述的嵌合分子、本发明第七方面所述的组合物在制备肿瘤细胞中肽/MHC诊断评价产品中的应用。

(3)本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的重组T细胞受体、本发明第三方面所述的核酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面所述的嵌合分子、本发明第七方面所述的组合物在制备靶向产品中的应用，所述靶向产品引导治疗分子至肿瘤部位。

(4)本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的重组T细胞受体、本发明第三方面所述的核酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面所述的嵌合分子、本发明第七方面所述的组合物在制备增强免疫力的产品中的应用。

(5)本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的重组T细胞受体、本发明第三方面所述的核酸、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面所述的嵌合分子、本发明第七方面所述的组合物在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用。

进一步，所述疾病选自血液恶性疾病或实体瘤；

进一步，所述血液恶性疾病选自下组：急性髓系白血病、慢性髓系白血病、成淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

进一步，所述血液恶性疾病选自急性髓系白血病、淋巴瘤。

进一步，所述实体瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、宫颈癌和结直肠癌。

附图说明

图1是TCR-T杀伤白血病细胞U937功能检测图。

发明详述

在更详细地阐述本公开之前，提供本文中使用的某些术语的定义可能有助于其理解。除非另有明确定义，否则本文所用的技术术语具有其在本领域中所理解的正常含义。在整个本公开中阐述了附加的定义。

本发明所涉及的替代方案(例如“或”)的使用应理解为是指替代方案中的任何一个，全部或任何组合。在本发明中术语“包括”，“具有”和“包含”是同义使用的，这些术语和其变体旨在被解释为非限制性的。

如本文所用，“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然氨基酸相似的方式起作用的化合物。

在本发明中，可以使用PCR，重组工程等来构建编码本发明涉及的T细胞受体或重组T细胞受体的核酸，或者可以合成这样的T细胞受体。T细胞受体可进一步包含其他成分，例如标签、接头或转导标记。在某些实施例中，由宿主细胞(例如，T细胞)表达或产生的蛋白或多肽位于细胞表面，其中蛋白或多肽锚定在细胞膜上(例如，通过跨膜结构域)，并包含细胞外部分或细胞内部分或组分(例如，包含结合结构域，并且在某些实施例中，包含接头、间隔子或两者)和细胞内部分或组分。

“核酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”在本发明中可以互换使用，指包括共价连接的核苷酸的聚合化合物，其可以由天然亚基(例如嘌呤或嘧啶碱基)或非天然亚基(例如吗啉环)组成。嘌呤碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤，以及嘧啶碱基包括尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。核酸分子包括聚核糖核酸(RNA)、聚脱氧核糖核酸(DNA)，其可以是单链或双链的cDNA，基因组DNA和合成DNA。如果是单链，则核酸分子可以是编码链或非编码链(反义链)。编码氨基酸序列的核酸分子包括编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。核苷酸序列的某些形式还可以包括内含子，以至于内含子将通过共转录或转录后机制被除去。换句话说，由于遗传密码的冗余或简并或通过剪接，不同的核苷酸序列可编码相同的氨基酸序列。

也考虑了本公开内容的核酸分子的变体。变体核酸分子与本文定义的或参考的多核苷酸的核酸分子至少70％、75％、80％、85％、90％，并且优选95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同，或在严格杂交条件下与多核苷酸杂交的条件：0.015M氯化钠，在约65-68℃的0.0015M柠檬酸钠或0.015M氯化钠，0.0015M柠檬酸钠和在约42℃的50％甲酰胺。核酸分子变体保留编码具有本文所述功能性(例如特异性结合靶分子)的T细胞受体的能力。

“序列同一性百分比”是指通过比较序列确定的两个或更多个序列之间的关系。确定序列同一性的优选方法被设计为在所比较的序列之间给出最佳匹配。例如，为了最佳比较目的而对序列进行比对(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入缺口)。此外，出于比较目的，可以忽略非同源序列。除非另外指出，否则本文所参考的序列同一性百分比是在参考序列的长度上计算的。确定序列同一性和相似性的方法可以在可公开获得的计算机程序中找到。序列比对和百分比同一性计算可以使用BLAST程序(例如，BLAST 2.0，BLASTP，BLASTN或BLASTX)进行。

如本领域中所理解的，两个多肽之间的“相似性”是通过比较该多肽的氨基酸序列和保守氨基酸取代基与第二个多肽的序列来确定的(例如，使用GENEWORKSTM，Align、Clustal^TM、BLAST算法等)。在某些实施例中，BLAST算法是优选的。

在一些实施例中，术语“变体”不仅涉及至少一个片段，而且涉及包括其与参考氨基酸序列或其片段至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的氨基酸序的多肽或其片段，其中除生物学活性或多肽的折叠或结构所必需的氨基酸以外的氨基酸被缺失或取代，一种或多种此类必需氨基酸以保守的方式被替换，和/或氨基酸为添加这样的多肽以保持多肽的生物学活性。

在某些实施例中，变体可以另外包括化学修饰，例如同位素标记或共价修饰，例如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧、瓜氨酸化、羟基化等。修饰多肽的方法是已知的，并且通常将被采用以便不消除或基本上不降低多肽的期望活性。

在一实施例中，术语核酸分子的“变体”包括其互补链例如在严格条件下与参照或野生型核酸杂交的核酸。杂交反应的严格性可由本领域普通技术人员容易地确定，并且通常是取决于探针长度，洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长的探针需要较高的温度才能进行适当的退火，而较短的探针则需要较少的温度。杂交通常取决于变性DNA与低于其解链温度的环境中存在的互补链退火的能力：探针和可杂交序列之间所需的同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。结果，较高的相对温度倾向于使反应条件更严格，而较低的温度则不太严格。

在一实施例中，如本文所用，术语核酸序列的变体是指根据遗传密码的简并性而编码与参考核酸序列相同的氨基酸序列及其变体的任何核酸序列。

“功能变体”是指多肽或多核苷酸，其与本公开的亲本或参考化合物在结构上相似或基本在结构上相似，但是在某些情况下在组成上略有不同(例如，一个碱基，原子或官能团是不同的，添加的或去除的；或者一个或多个氨基酸被突变，插入或删除)，这样多肽或编码的多肽能够以至少50％的功能执行编码的亲本多肽的至少一种功能效率，优选至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的活性水平亲本多肽的片段。

如本文所用，“异源的”或“非内源的”或“外源的”是指不是宿主细胞或受试者非天然的任何基因，蛋白质，化合物，核酸分子或活性，或任何基因，蛋白质，化合物，核酸分子或宿主细胞或已改变的受试者的天然活性。异源，非内源或外源包括基因，蛋白质，化合物或核酸分子，这些基因，蛋白质，化合物或核酸分子已被突变或以其他方式改变，使得结构，活性或两者在天然和改变后的基因，蛋白质，化合物或核酸分子。在某些实施例中，异源，非内源或外源基因，蛋白质或核酸分子(例如受体，配体等)对于宿主细胞或受试者而言可能不是内源的，而是编码此类基因的核酸，蛋白质或核酸分子可能已经通过缀合，转化，转染，电穿孔等方法添加到宿主细胞中，其中添加的核酸分子可以整合到宿主细胞基因组中或可以作为染色体外遗传物质存在(例如作为质粒或其他自我复制载体)。应当理解，在包含异源多核苷酸的宿主细胞的情况下，无论该后代本身是否被操纵(例如转导)以包含该多核苷酸，该多核苷酸与宿主细胞的后代“异源”。

如本文所用，术语“表达”是指基于核酸分子例如基因的编码序列生产多肽的过程。该过程可以包括转录，转录后控制，转录后修饰，翻译，翻译后控制，翻译后修饰或其任何组合。表达的核酸分子通常可操作地连接至表达控制序列(例如，启动子)。

术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上两个或更多个核酸分子的缔合，从而一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响该编码序列的表达时(即，该编码序列在该启动子的转录控制下)，该启动子与该编码序列可操作地连接。“无关联的”是指相关的遗传要素彼此之间不紧密关联，并且其中一个的功能不影响另一个。

在将核酸分子插入细胞中的上下文中的术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括提及将核酸分子掺入真核或原核生物中。细胞，其中可以将核酸分子掺入细胞的基因组中(例如染色体，质粒，质体或线粒体DNA)，转化为自主复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。在本发明中，术语“工程的”，“重组的”或“非天然的”或“修饰的”是指包括至少一种遗传改变或已被修饰的生物，微生物，细胞，核酸分子或载体。引入外源核酸分子，其中这种改变或修饰是通过基因工程(即人为干预)引入的。遗传改变包括，例如，引入编码蛋白质，融合蛋白或酶的可表达核酸分子的修饰，或其他核酸分子对细胞遗传物质的添加，缺失，取代或其他功能破坏。另外的修饰包括例如非编码调节区，其中所述修饰改变多核苷酸，基因或操纵子的表达；例如，内源核酸分子或基因的表达被控制，去调节或组成型，其中这样的改变或修饰可以通过基因工程引入。遗传改变可以包括例如引入编码一种或多种蛋白质或酶的核酸分子(其可以包括表达控制元件，例如启动子)的修饰，或其他核酸分子的添加，缺失，取代，或细胞遗传物质的其他功能破坏或补充。示例性修饰包括来自参考或亲本分子的异源或同源多肽的编码区或其功能片段中的修饰。

术语“可变区”或“可变结构域”是指TCR的α-链或β-链(或对于γδTCR为γ-链和δ-链)的结构域，其参与与抗原的结合。天然TCR的α链和β链的可变结构域(分别为Vα和Vβ)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个通常保守的框架区(FR)和三个CDR。在TCR中，构架区分开的CDR，并且CDR位于构架区之间(即，在一级结构中)。

天然TCR的α链和β链的可变结构域(分别为Vα和Vβ)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。Vα结构域由两个分开的DNA片段，可变基因片段和连接基因片段(V-J)编码。Vβ结构域由三个5个独立的DNA片段(可变基因片段，多样性基因片段和连接基因片段(V-D-J))编码。人TCR V，D和J等位基因，包括其核苷酸和编码的氨基酸序列，是本领域已知的。单个Vα或Vβ结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用Vα或Vβ结构域从结合抗原的TCR中分离结合特定抗原的TCR，以分别筛选互补的Vα或Vβ结构域的文库。

术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，并且在本领域中已知是指TCR可变区中的氨基酸序列，通常，赋予抗原特异性和/或结合亲和力，并且在一级结构中通过构架序列彼此分开。在某些情况下，构架氨基酸也可有助于结合，例如也可接触抗原或含抗原的分子。通常，在每个可变区中存在三个CDR。对于TCR，CDR3被认为是负责识别加工抗原的主要CDR。CDR1和CDR2主要或在某些情况下仅与MHC相互作用。可变域序列可以与编号方案(例如，Kabat，欧盟，国际免疫遗传学信息系统(IMGT)和Aho(Kabat,EU,InternationalImmunogenetics Information System(IMGT)and Aho))比对，并可以使用抗原受体编号和受体分类(ANARCI)软件工具(2016，Bioinformatics 15：298-300)对等效残基位置进行注释并比较不同的分子。

如本文所用，“免疫系统细胞”是指免疫系统中源自骨髓造血干细胞的任何细胞，其产生两个主要谱系，即髓系祖细胞(其产生髓样细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、巨核细胞和粒细胞)和淋巴样祖细胞(产生淋巴样细胞，例如T细胞，B细胞和自然杀伤(NK)细胞)。示例性免疫系统细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、调节性T细胞、干细胞记忆T细胞、天然杀伤细胞(例如NK细胞或NK-T细胞)、B细胞和树突状细胞。巨噬细胞和树突状细胞可以称为“抗原呈递细胞”或“APC”，它们是当与肽复合的APC表面上的主要组织相容性复合物(MHC)受体与T细胞表面的TCR相互作用时可以激活T细胞的专门细胞。

“T细胞”或“T淋巴细胞”是一种在胸腺中成熟并产生TCR的免疫系统细胞。T细胞可以是幼稚的(不暴露于抗原；与TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA的表达增加，而CD45RO的表达减少)，记忆性T细胞(TM)(经历过抗原且时间长-存活的细胞)和效应细胞(经历过抗原的细胞毒性)。TM可以进一步分为中央记忆T细胞(TCM，与原始T细胞相比，CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和CD95的表达增加，以及CD54RA的表达减少)和效应记忆T细胞(TEM，与原始T细胞或TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD45RA的表达降低，而CD127的表达增加)。

“造血祖细胞”是源自造血干细胞(HSC)或胎儿组织的细胞，其能够进一步分化成成熟细胞类型(例如，T细胞谱系的细胞)。在某些实施例中，CD24^loLin^-CD117⁺造血祖细胞是有用的。如本文所定义，造血祖细胞可包括能够进一步分化为T细胞谱系细胞的胚胎干细胞。造血祖细胞可以来自各种动物，包括人，小鼠，大鼠或其他哺乳动物。“胸腺细胞祖细胞”或“胸腺细胞”是存在于胸腺中的造血祖细胞。

“造血干细胞”或“HSC”是指未分化的造血细胞，其能够在体内自我更新，在体外基本上无限制地增殖，并且能够分化为其他细胞类型，包括T细胞谱系的细胞。HSC可以例如但不限于从胎儿肝脏，骨髓和脐带血中分离。

“胚胎干细胞”，“ES细胞”或“ESC”是指未分化的胚胎干细胞，具有整合到发育中的胚胎的种系中并成为其一部分的能力。胚胎干细胞能够分化为造血祖细胞和任何组织或器官。

术语“T细胞受体”(TCR)是指免疫球蛋白超家族成员(具有可变的结合结构域，恒定的结构域，跨膜区域和短的细胞质尾；参见，例如，Janeway,et al.,Immunobiology:TheImmune System in Health and Disease,3rd Ed.,Current Biology Publications,p.4:33,1997)，其能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽。TCR可以发现在细胞表面或呈可溶性形式，通常由具有α和β链(分别称为TCRα和TCRβ)或γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)的异二聚体组成。像免疫球蛋白一样，TCR链的细胞外部分(例如α链和β链)包含两个免疫球蛋白结构域，一个可变域(例如α链可变域或Vα，β链可变域或Vβ)；通常是在N-处基于末端Kabat编号(Kabat,et al.,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”USDept.Health and Human Services,Public Health Service National Institutes ofHealth,1991,5^th ed.)的编号从1到116的氨基酸，和与细胞膜相邻的一个恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常基于Kabat 117至259的氨基酸，β链恒定结构域或Cβ，通常基于Kabat 117至295的氨基酸)。也像免疫球蛋白一样，可变域包含由框架区(FRs)隔开的互补决定区(CDRs)。在某些实施例中，TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现并与CD3复合物缔合。如本公开中所使用的TCR的来源可以来自各种动物物种，诸如人，小鼠，大鼠，猫，狗，山羊，马或其他哺乳动物。

如本文所用，“表达载体”是指含有核酸分子的DNA构建体，该核酸分子可操作地连接至能够影响核酸分子在合适宿主中表达的合适控制序列。此类控制序列包括实现转录的启动子，控制此类转录的任选操纵子序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、病毒或仅是潜在的基因组插入物。一旦转化成合适的宿主，载体就可以独立于宿主基因组复制和发挥作用，或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。

在某些实施例中，病毒载体用于引入编码靶标特异性多肽的非内源性核酸序列。病毒载体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体。病毒载体还可以包括编码转导标记的核酸序列。

适合与本发明的组合物一起使用的病毒载体包括已鉴定用于人类基因治疗应用的那些。合适的病毒载体包括基于RNA病毒的载体，例如逆转录病毒来源的载体，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)来源的载体，并且包括更复杂的逆转录病毒来源的载体，例如慢病毒来源的载体。HIV-1衍生的载体属于这一类。

病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒，细小病毒(如腺相关病毒)，冠状病毒，负链RNA病毒(如正粘病毒(如流感病毒)，弹状病毒(如狂犬病和水疱性口炎病毒)，副粘病毒(如，麻疹和仙台病毒)，正链RNA病毒(例如小核糖核酸病毒和甲型病毒)以及双链DNA病毒，包括腺病毒，疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒和爱泼斯坦-巴尔病毒和巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘，鸡痘和金丝雀痘)。其他病毒包括但不限于诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒、肝炎病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的例子包括禽类白血病肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒和泡沫病毒。

“逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒，其使用逆转录酶逆转录成DNA，然后将逆转录的DNA掺入宿主细胞基因组中。“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科的属。γ逆转录病毒的例子包括小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮病病毒。

如本文所用，“慢病毒载体”是指用于基因递送的基于HIV的慢病毒载体，其可以是整合的或非整合的，具有相对大的包装能力，并且可以转导多种不同的细胞类型。慢病毒载体通常是在将三个或多个质粒(包装，包膜和转移)瞬时转染到生产细胞后产生的。像HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面受体的相互作用进入靶细胞。进入时，病毒RNA经历逆转录，该逆转录由病毒逆转录酶复合体介导。逆转录产物是双链线性病毒DNA，是病毒整合到感染细胞DNA中的底物。“慢病毒”是指能够感染分裂和非分裂细胞的逆转录病毒属。慢病毒的几个例子包括HIV(人类免疫缺陷病毒：包括HIV1型和HIV2型)；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。其他实例包括衍生自HIV-2、FIV、马传染性贫血病毒、SIV和维斯纳病毒(绵羊慢病毒)的慢病毒载体。

本发明还提供包括TCR或其抗原结合片段和工程化细胞的组合物，包括药物组合物和配制剂，和这些分子和组合物的使用方法和用途，诸如用于预防/治疗疾病，和/或检测、诊断和预后方法。

“药学上可接受的载剂”是指药物配制剂中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在一些方面中，载剂的选择部分地由特定细胞或结合分子和/或由施用方法决定。因此，存在多种适合的配制剂。例如，药物组合物可含有防腐剂。适合的防腐剂可包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。载剂例如由Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)描述。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下一般对接受者无毒，且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六羟季铵；氯苄烷铵；苄索氯铵；酚醇、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。

在一些实施方案中，组合物含有可有效治疗或预防疾病或病状的量的结合分子和/或细胞，诸如治疗有效量或预防有效量。在一些实施方案中，治疗或预防功效通过定期评定所治疗的受试者来监测。对于经数天或更长时间的重复施用，视病状而定，重复治疗直至出现疾病症状的所期望的抑制为止。然而，其他给药方案可为适用的且可加以确定。所期望的剂量可通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物或通过连续输注施用组合物来递送。

如本文中所用的术语“治疗”和“预防”以及源自这些术语的词语并不一定意味着100％或完全治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，而本领域普通技术人员认识到具有潜在的益处或治疗效果。就此而言，本发明的方法可为哺乳动物的病症提供任何治疗或预防水平的任意量。此外，本发明方法提出的治疗或预防可包括待治疗或预防病症(例如，白血病)的一种或多种病症或症状的治疗或预防。此外，为了本文之目的，“预防”可以包括推迟疾病或其症状或病症的发作。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1高通量测序筛选TCR序列

1、RNA提取及质控

收集急性髓系白血病患者的外周血样本，患者无甲肝，乙肝，丙肝，戊肝，艾滋病，梅毒，淋病和结核感染。

在5mL Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min，磁珠分选T细胞。采用TRIzol法对处理的细胞样本进行RNA的提取，对提取后的RNA质量使用Qubit RNA HS Assay kits，经2100生物分析仪(安捷伦)检测RNA完整性。

2、反转录及文库制备

用Repertoire Analysis Kit(Human TCR alpha,beta)进行建库。将所有试剂置于冰上解冻，在配置mix之前，混匀和离心这些试剂。在冰上配置杂交引物需用的mix(表1)。充分混匀后离心，加热反转录引物杂交mix，65℃5min，冰上孵育至少2min。在冰上准备配制反转录mix(表2)，混匀后离心mix。

表1反应体系

组分	体积
		RT dNTP Mixture	1μl
RT Primer H TCRα/β	1μl
		RNA样本(100pg-1000ng)	最多到6.2μl
Nuclease-free water	补足至8.2μl

表2反转录体系

组分	体积
		RT buffer A	4μl
RT buffer B	1μl
		RT buffer C	3.8μl
RT Universal primer	1μl
		RNase inhibitor	1μl
Reverse Transcriptase	1μl
		总体积	11.8μl

将11.8μl的杂交buffer加到上一步反应的杂交RNA中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序(表3)：

表3反应条件

3、第一步PCR

准备第一步PCR需用的试剂(表4)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第一步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。

表4第一步PCR反应体系

每管中加入41μl的第一步PCR mix，加入9μl的第一链cDNA产物中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：

表5第一步PCR反应条件

4、第二步PCR

准备第二步PCR需用的试剂(表6)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。

表6第二步PCR反应体系

准备一个新的PCR管，每管中加入1μl的第二步PCR引物，hTCRα#1-18(编号：A1-A18)，或者hTCRβ#1-18(编号：B1-B18)。加入39μl第二步反应的mix和10μl的第一步PCR产物混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：

表7第二步PCR反应条件

5、第三步PCR

准备第三步PCR需用的试剂在冰上解冻(表9)，混匀后瞬时离心。在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。

表8第三步PCR反应体系

组分	体积
		PCR buffer	25μl
PCR dNTP Mixture	10μl
		3rd universal primer	2.5μl
Nuclease-free water	6.5μl
		DNA polymerase	1μl
总体积	45μl

准备一个新的PCR管，每管中加入45μl的第三步PCR mix，加入5μl的第二步PCR产物中，用手指肚弹匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：

表9第三步PCR反应条件

6、琼脂糖凝胶电泳

配置1.5％的琼脂糖胶，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。hTCRɑ/β片段在650bp左右。

7、用AGENCOURT AMPure XP(BEACKMAN)磁珠纯化

准备nuclease-free 0.2mL的8连管，按照表10稀释文库。

表10稀释体系

组分	体积
		第三步PCR产物	30μl
Nuclease-free water	20μl
		总体积	50μl

配置DNase-free 70％乙醇(sigma)。磁珠使用前室温平衡30min，将22.5μl的磁珠加到稀释后文库中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单的离心。将8连管放置在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。将所有的上清转移到新的8连管中。再次混匀未使用过的磁珠，加17.5μl的磁珠到上清中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单离心。将8连管放在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。弃85μl的上清，保留5μl的上清以免吸到磁珠。不要将磁珠与磁力架分离。加200μl的70％的乙醇漂洗。室温30s，弃酒精，重复酒精洗涤步骤。弃所有上清，加30μl的10mM Tris-HCl到每个PCR管中，用移液器混匀至少10次。室温孵育2min然后简单离心。将离心管放置在磁力架上室温5min，分离液体和磁珠。将上清20μl转移至新的PCR管中。

8、文库浓度定量及质控

测定文库浓度用Qubit dsDNA HS kit(英潍捷基)，使用设备Qubit 2.0(life)，取2μl的样本用于测定。通常文库浓度集中在5-40ng/μl。如果样本浓度≥1.72ng/μl可用于Miseq测序。

9、文库目标片段质控

人的TCRα/β文库目标片段集中在650bp，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对文库片段进行质控，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。

10、文库混库及质控

文库混样，是按此批次浓度最低的文库为标准，浓度最低文库乘以10μl为基准纳克数，其他文库按照此纳克数进行取样，确保每个文库的总量是一致的，混样后按照纳克与摩尔数之间的换算，稀释到8.58ng/μl(20nM，650bp)。

11、高通量测序

文库使用Miseq(Illumina)进行2×300bp双端测序，对上述混合完成的文库再次使用设备Qubit 2.0(life)进行文库定量，最终稀释到10pM，与10pM denatured PhiX进行混合(PhiX占比30％)，混合后的600μl进行上机测序。

12、数据分析

采用MiXCR进行初级分析，可以对高度个性化的TCR和免疫球蛋白序列进行分析。MiXCR可以针对不同的数据类型在参数上进行调整，并对分析结果和输出进行优化。进一步高级分析多个多样性指数，如香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)、Inverse-Simpson指数和基尼指数(Gini)等。采用VDJtools用于二级TCR profiling分析以及多样性评估。

13、噬菌体展示技术筛选高亲和力的TCR序列。

14、结果

通过噬菌体展示技术筛选出高亲和力的TCR，其α链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：6-8任一所示，其中CDR1的序列如SEQ ID NO：1-3任一所示；CDR2的序列如SEQ ID NO：4所示；CDR3序列分别如SEQ ID NO：5所示。TCR的β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14-16任一所示，其中，CDR1的序列如SEQ ID NO：9-11任一所示；CDR2的序列如SEQ ID NO：12所示；CDR3的序列如SEQ ID NO：13所示。

实施例2 TCR-T的构建

1、利用高通量测序和数据分析结果，全合成相关序列，通过XbaI/SalI限制内切酶切点，连接到pCDH载体中。

2、TCR-T细胞制备

采集健康人外周血，在Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min。磁珠分选T细胞。同时加入CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激，24h及48h后加入病毒感染2次，病毒感染时加入IL-2，培养3-20天，获得TCR-T细胞。

实施例3 TCR-T杀伤功能检测

从本研究中所述的序列构建的TCR-T中任选一个进行功能检测。

计数靶细胞(U937)和阴性参照靶细胞(Daudi)，分别标记Celltrace far red和CFSE染色。计数TCR-T(TCR的Vα和Vβ可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO：14所示)细胞作为效应细胞。按照计划效靶比(3：1，9：1，18：1)，重悬效应细胞和靶细胞至相应浓度。

圆底96孔板中每个效靶比分别铺入铺入组1效应细胞、组2靶细胞和组3效应细胞+靶细胞，每组4个复孔。培养2-24h，收细胞样本，分别收管A：组1效应细胞+组2靶细胞，管B：组3效应细胞+靶细胞，多聚甲醛液固定，流式上机。作Killing Rate与E:T Ratio曲线图。其中，Killing

结果如图1所示，TCR-T具有较高的杀伤U937细胞系的效果，说明可将TCR-T应用于白血病的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 深圳大学总医院

<120> 应用于疾病治疗的T细胞受体

<141> 2021-10-14

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu Phe Trp

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu Ala Phe Trp

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu Leu Phe Trp

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Phe Leu Ser Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Cys Ala Val Met Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp

1 5 10

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Phe Trp Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr Asn

35 40 45

Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu Ser

50 55 60

Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met Lys

65 70 75 80

Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met Asp Ser

85 90 95

Ser Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys Pro

100 105 110

<210> 7

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Ala Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

35 40 45

Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe

50 55 60

Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln

65 70 75 80

Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met

85 90 95

Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile

100 105 110

Lys Pro

<210> 8

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

35 40 45

Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe

50 55 60

Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln

65 70 75 80

Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met

85 90 95

Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile

100 105 110

Lys Pro

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln Asp Met Arg His Asn Ala Met Tyr

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Asp Met Arg Met Asn Ala Met Tyr

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Asp Met Arg Ala Asn Ala Met Tyr

1 5

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys

1 5 10

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe

1 5 10 15

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala

85 90 95

Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg Met Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala

85 90 95

Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg Ala Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala

85 90 95

Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

Claims

1.一种T细胞受体，其特征在于，包含α链的可变域Vα和β链的可变域Vβ，所述Vα为SEQID NO：6所示的氨基酸序列，所述Vβ为SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体是缺乏跨膜结构域的可溶性T细胞受体。

3.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体结合MHC I和/或MHCII肽复合物。

4.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体还包含可检测标记。

5.根据权利要求4所述的T细胞受体，其特征在于，所述可检测标记包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质、生物素。

6.根据权利要求1-5任一项所述的T细胞受体，其特征在于，所述α链进一步包含α恒定区Cα和/或β链进一步包含β恒定区Cβ。

7.根据权利要求1-5任一项所述的T细胞受体，其特征在于，Cα区和/或该Cβ区包含引入一个或多个能够在α链与β链之间形成一个或多个非天然二硫桥键的半胱氨酸。

8.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述α链与β链进一步包含信号肽。

9.重组T细胞受体，其特征在于，所述重组T细胞受体包含权利要求1-8任一项所述的T细胞受体，和共刺激区。

10.根据权利要求9所述的重组T细胞受体，其特征在于，所述共刺激区包含选自CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP-10多肽、及其任意组合的共刺激分子。

11.根据权利要求10所述的重组T细胞受体，其特征在于，所述共刺激区包含CD28多肽。

12.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1-8任一项所述的T细胞受体；或编码权利要求9-11任一项所述的重组T细胞受体。

13.根据权利要求12所述的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列是针对宿主细胞中表达而优化的密码子。

14.根据权利要求13所述的核酸，其特征在于，所述宿主细胞为免疫系统细胞。

15.根据权利要求14所述的核酸，其特征在于，所述免疫系统细胞为T细胞。

16.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含可操作地连接至表达控制序列的根据权利要求12-15任一项所述的核酸。

17.根据权利要求16所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体能够将所述多核苷酸递送至宿主细胞。

18.根据权利要求17所述的表达载体，其特征在于，所述载体为病毒载体。

19.根据权利要求18所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体为逆转录病毒载体或慢病毒表达载体。

20.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求12-15任一项所述的核酸或权利要求16-19任一项所述的表达载体。

21.根据权利要求20所述的宿主细胞，其特征在于， T细胞受体对于所述宿主细胞是异源的。

22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自造血祖细胞或免疫系统细胞。

23.根据权利要求22所述的宿主细胞，其特征在于，所述免疫系统细胞选自CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突细胞或其任何组合。

24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其特征在于，所述免疫系统细胞是T细胞。

25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其特征在于，所述T细胞是幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、效应记忆T细胞或其任何组合。

26.嵌合分子，其特征在于，包含与非细胞底物、毒素和/或抗体缀合的权利要求1-8任一项所述的T细胞受体。

27.根据权利要求26所述的嵌合分子，其特征在于，所述非细胞底物选自下组：纳米颗粒、外泌体。

28.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1-8任一项所述的T细胞受体、权利要求9-11任一项所述的重组T细胞受体、权利要求12-15任一项所述的核酸、权利要求16-19任一项所述的表达载体、权利要求20-25任一项所述的宿主细胞、权利要求26或27所述的嵌合分子。

29.根据权利要求28所述的组合物，其特征在于，所述组合物进一步包含药学上可接受的载剂。

30.用于改造免疫细胞的方法，其特征在于，其包括使所述免疫细胞与权利要求16-19任一项所述的表达载体接触。

31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、NK细胞。

32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述接触为转染或转导。

33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括对所述免疫细胞进行分选以分离经TCR改造的T细胞。

34.根据权利要求33所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括通过连续稀释进行T细胞克隆、以及通过快速扩增方案扩增T细胞克隆。

35.权利要求1-8任一项所述的T细胞受体，权利要求9-11任一项所述的重组T细胞受体，权利要求12-15任一项所述的核酸，权利要求16-19任一项所述的表达载体、权利要求20-25任一项所述的宿主细胞、权利要求26或27所述的嵌合分子、权利要求27或28所述的组合物在制备过继细胞转移治疗产品中的应用。

36.根据权利要求35所述的应用，其特征在于，所述过继细胞转移为过继T细胞转移。

37.根据权利要求36所述的应用，其特征在于，所述过继T细胞转移是同种异体过继T细胞转移、自体过继T细胞转移或通用的非同种异体反应性过继T细胞转移。

38.权利要求1-8任一项所述的T细胞受体，权利要求9-11任一项所述的重组T细胞受体，权利要求12-15任一项所述的核酸，权利要求16-19任一项所述的表达载体、权利要求20-25任一项所述的宿主细胞、权利要求26或27所述的嵌合分子、权利要求27或28所述的组合物在制备肿瘤细胞中肽/MHC诊断评价产品中的应用。

39.权利要求1-8任一项所述的T细胞受体，权利要求9-11任一项所述的重组T细胞受体，权利要求12-15任一项所述的核酸，权利要求16-19任一项所述的表达载体、权利要求20-25任一项所述的宿主细胞、权利要求26或27所述的嵌合分子、权利要求27或28所述的组合物在制备靶向产品中的应用，所述靶向产品引导治疗分子至肿瘤部位。

40.权利要求1-8任一项所述的T细胞受体，权利要求27或29-11任一项所述的重组T细胞受体，权利要求12-15任一项所述的核酸，权利要求16-19任一项所述的表达载体、权利要求20-25任一项所述的宿主细胞、权利要求26或27所述的嵌合分子、权利要求27或28所述的组合物在制备增强免疫力的产品中的应用。

41.权利要求1-8任一项所述的T细胞受体，权利要求27或29-11任一项所述的重组T细胞受体，权利要求12-15任一项所述的核酸，权利要求16-19任一项所述的表达载体、权利要求20-25任一项所述的宿主细胞、权利要求26或27所述的嵌合分子、权利要求27或28所述的组合物在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用，所述疾病选自血液恶性疾病或实体瘤。

42.根据权利要求41所述的应用，其特征在于，所述血液恶性疾病选自下组：急性髓系白血病、慢性髓系白血病、成淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。

43.根据权利要求42所述的应用，其特征在于，所述血液恶性疾病选自急性髓系白血病、淋巴瘤。

44.根据权利要求41所述的应用，其特征在于，所述实体瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、宫颈癌和结直肠癌。