CN113929767B - 具有高亲和力的t细胞受体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有高亲和力的T细胞受体及其用途，同时还涉及编码T细胞受体的核酸，包含T细胞受体的核酸的载体以及经修饰的细胞、嵌合分子、药物组合物及其制备预防和/或治疗肿瘤的产品和筛选检测抗原、靶向引导中的用途。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及具有高亲和力的T细胞受体及其用途。
背景技术
免疫治疗为肿瘤提供了一种有吸引力的疗法，其优势是在增强或重建患者的抗肿瘤免疫的同时副作用较小。目前已有两种主要策略被用于刺激抗肿瘤免疫。包括肿瘤治疗性疫苗(therapeutic vaccination)和过继性细胞治疗(adoptivecell therapy )。其中过继性细胞治疗主要是指向荷瘤宿主体内回输自体或异体免疫细胞，如以肿瘤反应性T细胞为主要成分的CTL细胞，肿瘤浸润性淋巴细胞( tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)等。肿瘤反应性CTL细胞回输已被成功应用于黑色素瘤，EB病毒诱导淋巴瘤(Epstein-BarrVirus)等肿瘤的临床治疗。
由于难以从大多数肿瘤患者体内获得对肿瘤抗原有高亲和力和特异性的肿瘤反应性T细胞。研究者逐渐尝试通过基因工程的方法，将可识别肿瘤抗原的特异性TCR基因导入患者T细胞，从而获得特异性TCR基因转染T细胞。即通过对患者无能T细胞抗原特异性的再定向(redirect )，获得肿瘤反应性T细胞。从根本上说，TCR是T细胞识别抗原的分子基础。占外周血T淋巴细胞总数的80%以上的α+β+T细胞而言。其TCR分子由α，β双链构成，TCRα链和β链都在蛋白结构上均由可变区(V区)和恒定区(C区)两部分组成，其中V区是识别抗原肤/MHC复合物(pMHC)的关键部位。TCRα链和β链的v区各含有三个与免疫球蛋白的v区结构类似的高变区，也称互补决定区(Complementarity Determining Region ，CDR)，一般用CDR1、CDR2和CDR3表示。另外，TCRVβ链还含有第四个高变区CDR4。通过基因重排等机制形成的具有极高多样性的TCR决定了T细胞识别抗原的多样性。
免疫治疗的快速发展为人类对抗肿瘤带来了新希望，然而TCR-T细胞临床免疫治疗也面临一些挑战，提高TCR-T细胞治疗的有效性和安全性成为目前研究的重点。
发明内容
本发明第一方面提供了一种分离的T细胞受体，包含具有SEQ ID NO：5-7任一所示的氨基酸序列的α链CDR3和/或具有SEQ ID NO：19氨基酸序列的β链CDR3。
进一步，所述T细胞受体还包含具有SEQ ID NO：1-3任一所示的氨基酸序列的α链CDR1和SEQ ID NO：4所示的α链CDR2；和/或具有SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的β链CDR1和CDR2。
进一步，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:8-16任一所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的β链可变区。
进一步，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:8-16任一所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的β链可变区。
进一步，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:8-16任一所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的β链可变区。
进一步，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:8-16任一所示的氨基酸序列具有至少99%同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少99%同一性的β链可变区。
进一步，所述T细胞受体包含SEQ ID NO:8-16任一所示的氨基酸序列所示的α链可变区，和/或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列所示的β链可变区。
进一步，所述T细胞受体包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列所示的α链可变区，和/或与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列所示的β链可变区。
进一步，所述T细胞受体是缺乏跨膜结构域的可溶性T细胞受体。
进一步，所述T细胞受体结合MHC I和/或MHC II肽复合物。
进一步，所述T细胞受体还包含可检测标记。
进一步，所述可检测标记包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质、生物素。
进一步，所述T细胞受体还包含治疗剂。
本发明第二方面提供了多价T细胞受体复合体，包含多个本发明第一方面所述的T细胞受体；
进一步，所述多价T细胞受体复合体包含2、3、4或更多个T细胞受体。
进一步，所述多价T细胞受体复合体存在于脂双层中或附着于颗粒。
进一步，所述多价T细胞受体通过接头分子缀合。
本发明第三方面提供了多肽，包含含有序列CDR1(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3)、CDR2(SEQ ID NO：4)和CDR3(SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7)的TCRα多肽和/或含有序列CDR1(SEQ ID NO：17)、CDR2(SEQ ID NO：18)和CDR3(SEQ ID NO：19)的TCRβ多肽。
进一步，所述多肽包含与SEQ ID NO：8-16任一所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的TCRα多肽和/或与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的TCRβ多肽。
进一步，所述多肽包含与SEQ ID NO：8-16任一所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的TCRα多肽和/或与SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的TCRβ多肽。
进一步，所述多肽包含具有SEQ ID NO：8-16任一所示的氨基酸序列的TCRα多肽和/或具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的TCRβ多肽。
进一步，所述多肽包含具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的TCRα多肽和/或具有SEQID NO：20所示的氨基酸序列的TCRβ多肽。
本发明第四方面提供了多核苷酸，编码本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合体或本发明第三方面所述的多肽。
进一步，所述多核苷酸是优化的密码子。
进一步，所述多核苷酸用于在目的宿主细胞中表达。
本发明第五方面提供了表达载体，包含本发明第四方面所述的多核苷酸。
进一步，所述表达载体是病毒载体。
进一步，所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。
进一步，所述表达载体还包含接头结构域。
进一步，所述接头结构域在所述TCRα多肽与TCRβ多肽之间。
进一步，所述接头结构域包含一个或更多个切割位点。
进一步，所述一个或更多个切割位点被间隔区隔开。
本发明第六方面提供了宿主细胞，所述宿主细胞被改造成表达本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合体或本发明第三方面所述的多肽。
进一步，所述细胞包含大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，或哺乳动物细胞。
进一步，所述细胞是造血祖细胞或免疫细胞。
进一步，所述免疫细胞是T细胞或外周血淋巴细胞。
进一步，所述T细胞是CD8+ T细胞、CD4+ T细胞或γδ T细胞。
进一步，所述T细胞为幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、效应记忆T细胞，或其任何结合。
进一步，所述细胞是NK细胞、恒定NK细胞、NKT细胞、间充质干细胞(MSC)或诱导多能干(iPS)细胞。
进一步，所述细胞是从脐带或血液分离的。
进一步，所述细胞是同种异体或自体的。
本发明第七方面提供了嵌合分子，包含与非细胞底物、毒素和/或抗体缀合的本发明第一方面所述的T细胞受体或其一部分。
进一步，所述非细胞底物选自下组：纳米颗粒、外泌体和其他非细胞底物。
本发明第八方面提供了药物组合物或试剂盒，所述药物组合物或试剂盒包括本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的T细胞受体复合体、本发明第三方面所述的多肽、本发明第四方面所述的多核苷酸、本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的宿主细胞或本发明第七方面所述的嵌合分子。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
本发明第九方面提供了用于改造免疫细胞的方法，其包括使所述免疫细胞与本发明第五方面所述的表达载体接触。
进一步，所述免疫细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、NK细胞、恒定NK细胞或NKT细胞。
进一步，所述接触为转染或转导。
进一步，所述方法进一步包括对所述免疫细胞进行分选以分离经TCR改造的T细胞。
进一步，所述方法进一步包括通过连续稀释进行T细胞克隆、以及通过快速扩增方案扩增T细胞克隆。
本发明第十方面提供了如下任一项所述的应用：
（1）本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合体、本发明第三方面所述的多肽、本发明第四方面所述的多核苷酸，本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的宿主细胞、本发明第七方面所述的嵌合分子或本发明第八方面所述的药物组合物或试剂盒在制备过继细胞转移治疗产品中的应用。
进一步，所述过继细胞转移为过继T细胞转移。
进一步，所述过继T细胞转移是同种异体过继T细胞转移、自体过继T细胞转移或通用的非同种异体反应性过继T细胞转移。
（2）本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合体、本发明第三方面所述的多肽、本发明第四方面所述的多核苷酸、本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的宿主细胞或本发明第七方面所述的嵌合分子在制备肿瘤细胞中肽/MHC诊断评价产品中的应用。
（3）本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合体、本发明第三方面所述的多肽、本发明第四方面所述的多核苷酸、本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的宿主细胞或本发明第七方面所述的嵌合分子在制备靶向产品中的应用，所述靶向产品引导治疗分子至肿瘤部位；
（4）本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合体、本发明第三方面所述的多肽、本发明第四方面所述的多核苷酸，本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的宿主细胞、本发明第七方面所述的嵌合分子或本发明第八方面所述的药物组合物或试剂盒在制备增强免疫力的产品中的应用；
（5）本发明第一方面所述的T细胞受体、本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合体、本发明第三方面所述的多肽、本发明第四方面所述的多核苷酸，本发明第五方面所述的表达载体、本发明第六方面所述的宿主细胞、本发明第七方面所述的嵌合分子或本发明第八方面所述的药物组合物或试剂盒在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用。
进一步，所述疾病为增殖性疾病。
进一步，增殖性病症是血液恶性疾病或实体瘤。
进一步，所述血液恶性疾病选自下组：急性髓系白血病、慢性髓系白血病、成淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
进一步，所述血液恶性疾病是急性髓系白血病。
进一步，所述实体瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、宫颈癌和结直肠癌。
附图说明
图1是TCR-T杀伤白血病细胞K562功能检测图。
发明详述
本发明中对 “细胞” 的提及包括多个这样的细胞，并且对 “肽” 的提及包括对本领域技术人员已知的一种或更多种肽及其等同物(例如，多肽)的提及。
除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则本文中和所附权利要求书中使用的术语 “或/或者” 意指 “和/或” 。
T细胞受体/TCR
“T细胞受体”(TCR)是指在T细胞(或T淋巴细胞)表面发现的分子，与CD3联合，通常负责识别结合于主要组织相容性复合体(MHC)分子的抗原。在大多数T细胞中，所述TCR具有二硫键连接的高度变化的α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)的异源二聚体。在小的子集的T细胞中，所述TCR由可变的γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)的异源二聚体构成。TCR的各个链是免疫球蛋白超家族的成员并且具有一个N-末端免疫球蛋白可变结构域，一个免疫球蛋白恒定结构域，跨膜区域，和在C-末端的短胞质尾区。在本公开中所使用的TCR可以来自不同动物物种，包括人、小鼠、大鼠、或其它哺乳动物。TCR可以是结合细胞的或可溶的形式。
“主要组织相容性复合体分子”(MHC分子)是指递送肽抗原至细胞表面的糖蛋白。I类MHC分子是异源二聚体，其由跨膜α链(具有三个α结构域)和非共价关联的β2微球蛋白组成。II类MHC分子由两个跨膜糖蛋白，α和β构成，二者都跨膜。各个链具有两个结构域。I类MHC分子递送源自胞质中的肽至细胞表面，在那里，肽：MHC复合体被CD8+T细胞识别。II类MHC分子递送源自囊泡系统中的肽至细胞表面，在那里它们被CD4+T细胞识别。MHC分子可以来自不同动物物种，包括人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
本发明提供了一种分离的T细胞受体，包含具有SEQ ID NO：5-7任一所示的氨基酸序列的α链CDR3和/或具有SEQ ID NO：19氨基酸序列的β链CDR3。
所述T细胞受体还包含具有SEQ ID NO：1-3任一所示的氨基酸序列的α链CDR1和SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的α链CDR2；和/或具有SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18氨基酸序列的β链CDR1和CDR2。
在一个实施方案中，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:8-16任一所示的氨基酸序列具有至少80%同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少80%同一性的β链可变区。
在另外一个实施方案中，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:8-16任一所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少95%同一性的β链可变区。
在一个实施方案中，所述T细胞受体为可溶性的TCR（sTCR），其包含：(i)TCRα链(例如SEQ ID NO：8-16任一所示)的全部或部分，除其跨膜结构域之外，以及(ii)TCRβ链(例如，SEQ ID NO：20)的全部或部分，除其跨膜结构域之外，其中(i)和(ii)各自包含TCR链的功能可变结构域和至少一部分的恒定结构域，并且通过天然TCR中不存在的恒定结构域残基之间的二硫键连接。
本公开内容的可溶性TCR可以以基本上纯的形式或作为经纯化或经分离的制剂提供。例如，其可以以基本上不含其他蛋白质的形式提供。
多价T细胞受体复合体
本公开内容的多种TCR可以以多价复合体提供。因此，在一个方面中，本公开内容提供了多价TCR复合体，其包含多种如本文中所述的可溶性TCR。所述多种可溶性TCR中的每一种优选是相同的。
在其最简单的形式中，根据本公开内容的多价TCR复合体包含优选通过接头分子的两个或三个或四个或更多个T细胞受体分子彼此缔合(例如共价地或以其他方式连接)的多聚体。合适的接头分子包括但不限于多价附接分子，例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和extravidin，它们各自具有针对生物素的四个结合位点。因此，生物素化的TCR分子可形成到具有多个TCR结合位点的TCR的多聚体中。多聚体中TCR分子的数目将取决于与用于制造该多聚体的接头分子的量相关的TCR的量，并且还取决于是否存在任何其他生物素化的分子。优选的多聚体是二聚体、三聚体或四聚体TCR复合体。
用于本发明方法中的合适的结构包括膜结构，例如脂质体；以及固体结构，其优选颗粒，例如珠(例如胶乳珠)。可在外部包被有T细胞受体分子的其他结构也是合适的。优选地，所述结构包被有T细胞受体多聚体而不是包被有单独T细胞受体分子。
在脂质体的情况下，T细胞受体分子或其多聚体可与膜附接或以其他方式与膜缔合。针对于此的技术是本领域技术人员公知的。
标记或另外的部分(例如毒性或治疗部分)可包含在本公开内容的多价TCR复合体中。例如，标记或另外的部分可包含在混合的分子多聚体中。这样的多聚体分子的一个实例为四聚体，其包含三个TCR分子和一个过氧化物酶分子。这可通过以3∶1的摩尔比来混合TCR和酶以产生四聚体复合体并从任何不包含正确比的分子的复合体中分离所期望的复合体来实现。这些经混合的分子可包含任何分子组合，条件是位阻不会损害或不会显著地损害分子的所期望功能。由于不太可能发生位阻，链霉抗生物素蛋白分子上的结合位点的定位适合于经混合的四聚体。
作为替代或补充，本公开内容的TCR(或其多价复合体)可与治疗剂缔合(例如与其共价地或以其他方式连接) ，所述治疗剂可以是例如用于细胞杀伤中的毒性部分，或者免疫刺激剂(例如白介素或细胞因子)。与非多聚体的T细胞受体异二聚体相比，本公开内容的多价TCR复合体可具有针对TCR配体的增强的结合能力。因此，根据本公开内容的多价TCR复合体特别可用于在体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，并且还可用作用于产生具有这样的用途的另外的多价TCR复合体的中间体。因此，TCR或多价TCR复合体可以以可药用制剂提供以用于体内。
本公开内容的可溶性TCR可用于通过与特异性TCR配体结合并从而抑制T细胞活化来调节T细胞活化。涉及T细胞介导的炎症和/或组织损伤的自身免疫病(例如I型糖尿病)将适用于该方法。
多核苷酸/核酸
本发明的另一个方面提供了一种核酸，所述核酸编码前述的T细胞受体、多价T细胞受体复合体或多肽。
在其它相关实施例中，核酸可以是编码经修饰的TCR的多核苷酸的变异体。多核苷酸变异体与编码本文所述的经修饰的TCR的核酸序列可以具有实质一致性。举例来说，多核苷酸可以是使用本文所述的方法（例如，使用标准参数的BLAST分析，如下文所描述），与参考多核苷酸序列（例如编码本文所述的TCR的序列）相比包含至少70%序列一致性、优选至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高序列一致性的多核苷酸。本领域的技术人员将认识到，这些值可以适当地调整，以便通过考虑密码简并、氨基酸类似性、阅读框架定位等，确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应一致性。
典型地，多核苷酸变异体将含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选使得由变异的多核苷酸编码的TCR的结合亲和力相对于由本文阐述的多核苷酸序列编码的TCR并不实质上降低。
本领域的普通技术人员应了解，作为遗传密码简并的结果，存在许多编码如本文所述的TCR的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与编码结合到例如相同抗原的经修饰的TCR的天然或初始多核苷酸序列的核苷酸序列具有最小序列一致性。尽管如此，本发明明确地涵盖由于密码子使用差异而改变的多核苷酸。在某些实施例中，具体涵盖已经经过密码子优化以用于哺乳动物表达的序列。
如本文所用，“核酸”或“核酸分子”或“多核苷酸”可互换使用，是指任何脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、寡核苷酸，例如通过聚合酶链式反应（PCR），或通过体外翻译产生的片段，以及由任何连接、断裂、核酸内切酶作用或核酸外切酶作用产生的片段。在某些实施方案中，通过PCR产生本公开的核酸。核酸可以由作为天然存在的核苷酸（诸如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸）的单体、天然存在的核苷酸的类似物（例如天然存在的核苷酸的α-对映体形式）或两者的组合构成。经修饰的核苷酸可以具有糖部分或嘧啶或嘌呤碱基部分的修饰或置换。核酸单体可以通过磷酸二酯键或这类键的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等。核酸分子可以是单链或双链。
用于本发明的多核苷酸可以是密码子优化的。不同的细胞在其特定密码子的选择上不同。此密码子偏倚对应于细胞类型中特定tRNA的相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子，使得它们适合于与相应tRNA的相对丰度匹配，可以增加表达。同样，可以通过有意选择已知在特定细胞类型中罕见的相应tRNA的密码子来减少表达。因此，可获得额外程度的翻译控制。
载体
“载体”是能够转运其它核酸的核酸分子。载体可以是，例如，质粒，粘粒，病毒，或噬菌体。“表达载体”是当其存在于适当的环境中时，能够引导由载体携带的一个以上基因编码的蛋白的表达的载体。
本发明的提供了一种表达载体，所述载体包含前述的多核苷酸。
载体是能够在宿主细胞中自主地复制并且可以接受外源DNA的核酸分子。载体携有其自身的复制起点；一个或多个可以用于插入外源DNA的限制性核酸内切酶的独特识别位点；以及通常可选标记，例如编码抗生素抗性的基因，和通常用于表达插入的DNA的识别序列（例如，启动子）。
“逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒。“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科的一个属。示例性γ逆转录病毒包括但不限于，小鼠干细胞病毒，鼠白血病病毒，猫白血病病毒，猫肉瘤病毒，禽网状内皮组织增殖病毒。
“慢病毒”是指逆转录病毒的一个属，其能够感染分裂细胞和非分裂细胞。慢病毒的一些实例包括HIV(人免疫缺陷病毒：包括1型HIV，和2型HIV)；马感染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猴免疫缺陷病毒(SIV)。
其它载体也可以用于多核苷酸递送，所述载体包括DNA病毒载体，所述DNA病毒载体包括，例如基于腺病毒的载体和基于腺病毒伴随病毒(AAV)的载体；源自单纯疱疹病毒的载体(HSVs)，所述源自单纯疱疹病毒的载体包括扩增子载体，复制缺陷HSV和减毒HSV。
细胞
本文中还提供了改造成表达本文中提供的TCR、多价T细胞受体复合体或多肽的细胞。所述细胞包括但不限于包含大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，或哺乳动物细胞。
在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞。
在另外一个实施方案中，所述细胞是T细胞。
术语“T细胞”是在胸腺中成熟并产生T细胞受体（TCR）的免疫系统细胞。T细胞可以是原始的（不暴露于抗原；与TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA的表达增加，且CD45RO的表达降低）、记忆性T细胞（TM）（经历抗原且长寿命）和效应细胞（经历抗原，具有细胞毒性）。TM可进一步分为中央记忆性T细胞（TCM，与原始T细胞相比，CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和CD95的表达增加，且CD54RA的表达降低）和效应记忆T细胞（TEM，与原始T细胞或TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD45RA的表达降低，且CD127的表达增加）的亚群。效应T细胞（TE）是指经历抗原的CD8+细胞毒性T淋巴细胞，其相比TCM具有降低的CD62L、CCR7、CD28表达，并且对颗粒酶和穿孔素呈阳性。其他示例性T细胞包括调节性T细胞，诸如CD4+ CD25+（Foxp3+）调节性T细胞和Treg17细胞，以及Tr1、Th3、CD8+CD28-和Qa-1限制性T细胞。
可使用本领域技术人员已知的许多公认的基因转移方法中的任一种来构建经改造的免疫细胞。在某些实施方案中，使用基于病毒载体的基因转移方法以引入TCR的核酸来构建经改造的细胞。基于病毒载体的基因转移方法可包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒或腺相关病毒载体。在某些实施方案中，使用基于非病毒载体的基因转移方法以引入TCR的核酸来构建经改造的细胞。用于TCR的载体可包含α链多肽和β链多肽，其可通过接头结构域或IRES序列连接。接头结构域可包含一个或更多个切割位点，例如弗林蛋白酶切割位点和/或P2A切割位点，其可被间隔区，例如SGSG或GSG隔开。在某些实施方案中，基于非病毒载体的基因转移方法包括选自以下的基因编辑方法 ：锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)核酸酶。在某些实施方案中，基于非病毒载体的基因编辑方法包括选自以下的转染或转化方法：脂质体转染、核转染、病毒微体、脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒体和增强DNA摄取的试剂。
嵌合分子
本公开内容中的嵌合分子，包含与非细胞底物、毒素和/或抗体缀合的本发明所述的T细胞受体或其一部分。
在一个实施方案中，所述嵌合分子包含与非细胞底物缀合的本发明所述的T细胞受体或其一部分，非细胞底物可以是纳米颗粒、外泌体或本领域已知的任何非细胞底物。
在另外一个实施方案中，所述嵌合分子包含与毒素和/或抗体缀合的本发明所述的T细胞受体或其一部分。毒素或抗体可以是细胞毒性的。毒素可以是细胞毒性分子或化合物，例如放射性分子或化合物。嵌合分子的TCR部分可以赋予识别表达抗原蛋白或肽的细胞的能力。因此，嵌合分子可以特异性识别和/或结合表达抗原的肿瘤细胞。因此，本发明的嵌合分子可以提供细胞毒性毒素、抗体和/或化合物的抗原靶向性递送。
药物组合物/试剂盒
本公开内容中的药物组合物或试剂盒包括本发明所述的T细胞受体、T细胞受体复合体、多肽、多核苷酸、表达载体、的宿主细胞或嵌合分子，和/或药学上可接受的载体。
本文中使用的术语“药学上可接受的” 是指当施用于哺乳动物或脊椎动物对象时不产生不良反应、变应性反应或其他不期望反应的治疗剂的药物制剂。这样的制剂应遵照FDA标准、GMP标准来配置。
药学上可接受的载体是指用于配制用于递送至哺乳动物或脊椎动物对象的治疗剂的任何和所有化学化合物或溶剂，例如水性溶剂(例如水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外载剂(例如氯化钠、林格右旋糖(Ringer’s dextrose)等))、非水溶剂(例如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯(例如油酸乙酯))、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等张剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、流体和营养补充剂、及其任意组合，如本领域普通技术人员将已知的。
药学上可接受的载体用以将本文公开用于实践本发明的化合物调配成适用于全身性投药的剂量的用途属于本发明的范围内。通过恰当选择载体和适合制造实践，本发明的组合物、尤其调配成溶液的组合物可以在肠胃外，例如通过静脉内注射而投与。适当化合物可以容易使用本领域中熟知的医药学上可接受的载体调配成适用于口服投药的剂量。此类载体使本发明的化合物能调配成片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，用于由待治疗的患者口服摄取。
许多治疗剂可用于该发明中，例如放射性化合物、酶(例如穿孔素)或化学治疗剂(例如顺铂)。为了确保在所期望的位置中进行毒性作用，毒素可在与链霉抗生物素蛋白连接的脂质体内部，使得化合物缓慢地释放。这将防止在体内转运期间的损伤作用，并确保毒素在TCR与相关抗原呈递细胞结合之后具有最大效果。
合适的治疗剂的实例包括但不限于：
·小分子细胞毒性剂，即具有杀死哺乳动物细胞的能力的分子量小于700道尔顿的化合物。这种化合物还可以含有能够具有细胞毒性作用的有毒金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒性剂还包括前药，即在生理条件下衰变或转化以释放细胞毒性剂的化合物。这种药剂的实例包括顺铂、美登素(maytansine)衍生物、雷卡霉素(rachelmycin)、卡奇霉素(ca licheamicin) 、多西他赛(d oceta xel) 、依托泊苷(etoposid e) 、吉西他滨(gemcitabine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、美法仑(melphalan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、卟吩姆钠光敏素II(sorfimersodiumphotofrin II)、替莫唑胺(temozolomide) 、拓扑替康(topotecan) 、trimetreate arbourate 、奥瑞斯他汀E(auristatin E)、长春新碱(vincristine)和多柔比星(doxorubicin)；
·肽细胞毒素，即具有杀死哺乳动物细胞能力的蛋白质或其片段。例如，蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶；
·放射性核素，即随着α或β粒子或γ射线中的一种或多种的同时发射而衰变的元素的不稳定同位素。例如，碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213；可以使用螯合剂来促进这些放射性核素与高亲和力TCR或其多聚体的缔合；
·免疫刺激剂，即刺激免疫应答的免疫效应子分子。例如，细胞因子，比如IL-2和IFN-γ；
·超级抗原及其突变体；
·TCR-HLA融合体，例如与肽-HLA复合物的融合体，其中，所述肽衍生自常见的人病原体，例如埃伯斯坦巴尔病毒(Epstein Barr Virus，EBV)；
·趋化因子，比如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；
· 抗体或其片段，包括抗T细胞或NK细胞决定簇抗体(例如抗CD3、抗CD28或抗CD16)；
·具有抗体样结合特征的替代蛋白质支架；
·补充激活剂；
·异种蛋白结构域、同种异体蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域、病毒/细菌肽。
应用
本发明的TCR可用作用于肿瘤细胞中的肽/MHC的诊断评价的探针，或者用于将治疗分子引导至肿瘤部位。该TCR分子也可用示踪剂(例如荧光探针或放射性探针)进行标记，并随后用于肿瘤细胞中肽/MHC的呈递的诊断评价。此外，该可溶性TCR分子可与治疗分子(例如毒素)连接，并随后将这些治疗分子引导至肿瘤部位以治疗癌症患者。
在一些实施方案中，本发明提供了的TCR可用于研究特定TCR-pMHC相互作用，或者用作检测感染或用于检测自身免疫病标志物的诊断工具。TCR可应用于染色，例如用于针对在MHC背景下呈递的特定肽抗原的存在而对细胞进行染色。类似地，TCR可用于将治疗剂(例如细胞毒性化合物或免疫刺激化合物)递送至呈递特异性抗原的细胞。TCR还可用于抑制T细胞，例如，与自身免疫肽抗原反应的那些。在一些方面中，TCR与将邻近处细胞递送至肿瘤的另一个分子连接。在另一些方面中，TCR将毒素、细胞因子、共刺激配体或抑制剂配体递送至并且将分子、细胞或化合物引导至表达肽-MHC的靶细胞。
本公开的可溶性TCR可以以基本上纯的形式或作为经纯化或经分离的制剂提供。例如，其可以以基本上不含其他蛋白质的形式提供。
在一些实施方案中，本发明提供了T细胞受体、多价T细胞受体复合体、多肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、嵌合分子或药物组合物用于过继细胞转移。如本文所用，术语“过继细胞转移” 是指向患者施用细胞群体。通常，细胞是T细胞，其从受试者分离，然后进行遗传修饰和体外培养，以便在施用于患者之前表达本发明的TCR。
过继细胞转移可以是同种异体的或自体的。
通过 “自体细胞转移” 应理解，起始细胞群体(其然后根据本发明的方法转导，或用根据本发明的载体转导)从与接收经转导的T细胞群体施用的受试者相同的受试者获得。自体转移是有利的，因为它避免了与免疫学不相容性相关的问题，并且无论遗传匹配供体的可用性如何都可用于受试者。
“同种异体细胞转移” 应理解为起始细胞群体(其然后根据本发明的方法转导或用根据本发明的载体转导)从与接受经转导的细胞群体施用的受试者不同的受试者获得。优选地，将供体与接受细胞施用的受试者遗传匹配以最小化免疫学不相容的风险。或者，供体可以是与患者错配且无关。
经转导的细胞群体的合适剂量例如在治疗和/或预防上是有效的。待施用的剂量可以取决于受试者和待治疗的状况，并且可以由技术人员容易地确定。
细胞可以源自从受试者分离的T细胞。T细胞可以是从受试者分离的混合细胞群体的部分，例如外周血淋巴细胞(PBL)群体。可以通过本领域已知的方法来活化PBL群体内的T细胞，例如使用抗CD3和/或抗CD28抗体或与抗CD3和/或抗CD28抗体缀合的细胞大小的珠。
T细胞可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。细胞可以在CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群体中。多克隆活化(例如任选与抗CD28抗体组合使用抗CD3抗体)将触发CD4+和CD8+T细胞的增殖。
可以从要接受经遗传修饰的细胞过继转移的受试者分离细胞。在这方面，可以通过从受试者分离T细胞，任选地活化T细胞，离体将TCR基因转移到细胞来制备细胞。然后可以通过过继转移经TCR转导的细胞来进行受试者的后续免疫疗法。如本文所用，此过程指自体T细胞转移，即将经TCR转导的细胞施用到最初衍生T细胞的同一受试者。
或者，可以从不同的受试者分离T细胞，使得它是同种异体的。T细胞可以从供体受试者分离。
或者，细胞可以是或可以源自干细胞，例如造血干细胞(HSC)。由于干细胞不表达CD3分子，因此基因转移到HSC不导致细胞表面的TCR表达。但是，当干细胞分化为迁移到胸腺的淋巴样前体时，CD3表达的启动导致胸腺细胞中导入的TCR的表面表达。
在一些实施方案中，本发明提供了T细胞受体、多价T细胞受体复合体、多肽、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、嵌合分子或药物组合物用于治疗和/或预防疾病。
所述疾病可以是增殖性疾病。
增殖性疾病可以是血液恶性疾病或实体瘤。血液恶性疾病可以选自下组：急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、成淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
实体瘤可以选自下组：肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤，横纹肌肉瘤、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、宫颈癌和结肠直肠癌。
如本发明所用，“治疗”是指用于获得有益或所要结果、包括并且优选临床结果的方法。治疗可以指改善疾病或病况的症状或延迟疾病或病况的进展。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 高通量测序筛选TCR序列
1、RNA提取及质控
收集急性髓系白血病患者的外周血样本，患者无甲肝，乙肝，丙肝，戊肝，艾滋病，梅毒，淋病和结核感染。
在5mL Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9%生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min，磁珠分选T细胞。采用TRIzol法对处理的细胞样本进行RNA的提取，对提取后的RNA质量使用Qubit RNA HS Assay kits，经2100生物分析仪（安捷伦）检测RNA完整性。
2、反转录及文库制备
用Repertoire Analysis Kit （Human TCR alpha, beta）进行建库。将所有试剂置于冰上解冻，在配置mix之前，混匀和离心这些试剂。在冰上配置杂交引物需用的mix（表1）。充分混匀后离心，加热反转录引物杂交mix，65℃ 5 min，冰上孵育至少2 min。在冰上准备配制反转录mix（表2），混匀后离心mix。
表1 反应体系
表2 反转录体系
将11.8μl的杂交buffer加到上一步反应的杂交RNA中混匀，然后离心， 在PCR仪（T100，Bio-RAD）上运行以下程序（表3）：
表3 反应条件
3、第一步PCR
准备第一步PCR需用的试剂（表4），并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第一步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。
表4 第一步PCR反应体系
每管中加入41μl的第一步PCR mix，加入9μl的第一链cDNA产物中混匀，然后离心，在PCR仪（T100，Bio-RAD）上运行以下程序：
表5 第一步PCR反应条件
4、第二步PCR
准备第二步PCR需用的试剂（表6），并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。
表6 第二步PCR反应体系
准备一个新的PCR管，每管中加入1μl的第二步PCR 引物，hTCR α#1-18（编号：A1-A18），或者hTCR β#1-18（编号：B1-B18）。加入39μl 第二步反应的mix和10μl的第一步PCR产物混匀，然后离心，在PCR仪（T100，Bio-RAD）上运行以下程序：
表7 第二步PCR反应条件
5、第三步PCR
准备第三步PCR需用的试剂在冰上解冻（表9），混匀后瞬时离心。在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。
表8 第三步PCR反应体系
准备一个新的PCR管，每管中加入45μl的第三步PCR mix，加入5μl的第二步PCR产物中，用手指肚弹匀，然后离心，在PCR仪（T100，Bio-RAD）上运行以下程序：
表9 第三步PCR反应条件
6、琼脂糖凝胶电泳
配置1.5%的琼脂糖胶，用1*TAE buffer和核酸染料（北京金博益），DNA marker上样量为2μl，加1μl的6* loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统（1708195，Bio-RAD），判断产物大小。hTCRɑ/β片段在650bp左右。
7、用AGENCOURT AMPure XP（BEACKMAN）磁珠纯化
准备nuclease-free 0.2 mL的8连管，按照表10稀释文库。
表10 稀释体系
配置DNase-free 70% 乙醇（sigma）。 磁珠使用前室温平衡30min，将22.5μl的磁珠加到稀释后文库中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单的离心。将8连管放置在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。将所有的上清转移到新的8连管中。再次混匀未使用过的磁珠，加17.5μl的磁珠到上清中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单离心。将8连管放在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。弃85μl的上清，保留5μl的上清以免吸到磁珠。不要将磁珠与磁力架分离。加200μl的70%的乙醇漂洗。室温30s，弃酒精，重复酒精洗涤步骤。弃所有上清，加30μl的10 mM Tris-HCl到每个PCR管中，用移液器混匀至少10次。室温孵育2min然后简单离心。将离心管放置在磁力架上室温5min，分离液体和磁珠。将上清20μl转移至新的PCR管中。
8、文库浓度定量及质控
测定文库浓度用Qubit dsDNA HS kit（英潍捷基），使用设备Qubit 2.0（life），取2μl的样本用于测定。通常文库浓度集中在5-40ng/μl。如果样本浓度≥1.72ng/μl可用于Miseq测序。
9、文库目标片段质控
人的TCR α/β文库目标片段集中在650 bp，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳对文库片段进行质控，用1*TAE buffer和核酸染料（北京金博益），DNA marker上样量为2μl，加1μl的6* loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统（1708195，Bio-RAD），判断产物大小。
10、文库混库及质控
文库混样，是按此批次浓度最低的文库为标准，浓度最低文库乘以10μl为基准纳克数，其他文库按照此纳克数进行取样，确保每个文库的总量是一致的，混样后按照纳克与摩尔数之间的换算，稀释到8.58ng/μl（20nM，650bp）。
11、高通量测序
文库使用Miseq（Illumina）进行2×300bp双端测序，对上述混合完成的文库再次使用设备Qubit 2.0（life）进行文库定量，最终稀释到10pM，与10 pM denatured PhiX进行混合（PhiX占比30%），混合后的600μl进行上机测序。
12、数据分析
采用MiXCR进行初级分析，可以对高度个性化的TCR和免疫球蛋白序列进行分析。MiXCR可以针对不同的数据类型在参数上进行调整，并对分析结果和输出进行优化。进一步高级分析多个多样性指数，如香农指数（Shannon）、辛普森指数（Simpson）、Inverse-Simpson指数和基尼指数（Gini）等。采用VDJtools用于二级TCR profiling分析以及多样性评估。
13、噬菌体展示技术筛选高亲和力的TCR序列。
14、结果
通过噬菌体展示技术筛选出高亲和力的TCR，其α链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：8-16任一所示，其中CDR1的序列如SEQ ID NO：1-3任一所示；DR1的序列如SEQ ID NO：4所示；CDR3的序列如SEQ ID NO：5-7任一所示。
TCR的β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，其中，CDR1-3的序列分别如SEQ ID NO：17-19所示。
实施例2 TCR-T的构建
1、利用高通量测序和数据分析结果，全合成相关序列，通过XbaI/SalI限制内切酶切点，连接到pCDH载体中。
2、TCR-T细胞制备
采集健康人外周血，在Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9%生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min。磁珠分选T细胞。同时加入CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激，24 h及48 h后加入病毒感染2次，病毒感染时加入IL-2，培养3-20天，获得TCR-T细胞。
实施例3 TCR-T 杀伤功能检测
从本研究中所述的序列构建的TCR-T中任选一个进行功能检测。
计数靶细胞（K562）和阴性参照靶细胞（Daudi），分别标记Celltrace far red和CFSE染色。计数TCR-T（TCR的Vα氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示）细胞作为效应细胞。按照计划效靶比（3：1，9：1，18：1），重悬效应细胞和靶细胞至相应浓度。
圆底96孔板中每个效靶比分别铺入铺入组1效应细胞、组2靶细胞和组3效应细胞+靶细胞，每组4个复孔。培养2-24h，收细胞样本，分别收管A：组1效应细胞+组2靶细胞，管B：组3效应细胞+靶细胞，多聚甲醛液固定，流式上机。作Killing Rate与E:T Ratio曲线图。其中，Killing Rate=（1-）×100%
结果，如图1所示，相比对照组，本申请的TCR-T具有较好的杀伤效果。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 深圳大学总医院
<120> 具有高亲和力的T细胞受体及其用途
<141> 2021-10-14
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu Leu Phe Trp
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu Ala Phe Trp
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu Phe Trp
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Phe Leu Ser Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Cys Ala Val Met Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Cys Ala Val Met Asp Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Cys Ala Val Met Asp Ser Gln Tyr Gln Leu Ile Trp
1 5 10
<210> 8
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala
1 5 10 15
Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu
20 25 30
Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser
35 40 45
Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe
50 55 60
Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln
65 70 75 80
Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met
85 90 95
Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile
100 105 110
Lys Pro
<210> 9
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala
1 5 10 15
Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu
20 25 30
Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser
35 40 45
Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe
50 55 60
Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln
65 70 75 80
Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met
85 90 95
Asp Ser Asn Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile
100 105 110
Lys Pro
<210> 10
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala
1 5 10 15
Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu
20 25 30
Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser
35 40 45
Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe
50 55 60
Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln
65 70 75 80
Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met
85 90 95
Asp Ser Gln Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile
100 105 110
Lys Pro
<210> 11
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala
1 5 10 15
Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu
20 25 30
Ala Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser
35 40 45
Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe
50 55 60
Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln
65 70 75 80
Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met
85 90 95
Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile
100 105 110
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100 105 110
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85 90 95
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100 105 110
Claims (31)
1.表达载体，其特征在于，包含编码T细胞受体的多核苷酸，和接头结构域；所述T细胞受体包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的α链CDR3和SEQ ID NO：19氨基酸序列的β链CDR3；
所述T细胞受体还包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的α链CDR1和SEQ ID NO：4所示的α链CDR2； SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的β链CDR1和CDR2。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述T细胞受体包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列所示的α链可变区， SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列所示的β链可变区。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述T细胞受体是缺乏跨膜结构域的可溶性T细胞受体。
4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述T细胞受体结合MHC I和/或MHCII肽复合物。
5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述T细胞受体还包含可检测标记。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述可检测标记包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质、生物素。
7.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述T细胞受体还包含治疗剂。
8.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是病毒载体。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。
10.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述接头结构域在所述TCRα多肽与TCRβ多肽之间。
11.根据权利要求10所述的表达载体，其特征在于，所述接头结构域包含一个或更多个切割位点。
12.根据权利要求11所述的表达载体，其特征在于，所述一个或更多个切割位点被间隔区隔开。
13.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1-12任一项所述的表达载体，所述细胞是免疫细胞。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其特征在于，所述免疫细胞是T细胞或外周血淋巴细胞。
15.根据权利要求13-14任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是从脐带或血液分离的。
16.根据权利要求13-14任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是同种异体或自体的。
17.嵌合分子，其特征在于，包含与非细胞底物、毒素和/或抗体缀合的T细胞受体；其中所述T细胞受体为权利要求1-7任一项中所述的T细胞受体。
18.根据权利要求17所述的嵌合分子，其特征在于，所述非细胞底物选自下组：纳米颗粒、外泌体和其他非细胞底物。
19.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-12任一项所述的表达载体、权利要求13-16任一项所述的宿主细胞、权利要求17或18所述的嵌合分子。
20.根据权利要求19所述的药物组合物或试剂盒，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
21.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-12任一项所述的表达载体、权利要求13-16任一项所述的宿主细胞、权利要求17或18所述的嵌合分子。
22.用于改造免疫细胞的方法，其特征在于，其包括使所述免疫细胞与表达载体接触，所述表达载体包含编码T细胞受体的多核苷酸，所述T细胞受体为权利要求1-7任一项中所述的T细胞受体。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞是T细胞、外周血淋巴细胞、NK细胞、恒定NK细胞或NKT细胞。
24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述接触为转染或转导。
25.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括对所述免疫细胞进行分选以分离经TCR改造的T细胞。
26.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括通过连续稀释进行T细胞克隆、以及通过快速扩增方案扩增T细胞克隆。
27.权利要求1-12任一项所述的表达载体、权利要求13-16任一项所述的宿主细胞、权利要求17-18任一项所述的嵌合分子、权利要求19-20任一项所述的药物组合物或权利要求21所述的试剂盒在制备过继细胞转移治疗产品中的应用。
28.根据权利要求27所述的应用，其特征在于，所述过继细胞转移为过继T细胞转移。
29.根据权利要求28所述的应用，其特征在于，所述过继T细胞转移是同种异体过继T细胞转移、自体过继T细胞转移或通用的非同种异体反应性过继T细胞转移。
30.权利要求1-12任一项所述的表达载体、权利要求13-16任一项所述的宿主细胞、权利要求17-18任一项所述的嵌合分子、权利要求19-20任一项所述的药物组合物或权利要求21所述的试剂盒在制备治疗和/或预防慢性髓系白血病的药物中的应用。
31.T细胞受体、编码T细胞受体的多核苷酸、包含编码所述T细胞受体的多核苷酸的表达载体、被改造成表达所述T细胞受体的宿主细胞在制备治疗和/或预防慢性髓系白血病的药物中的应用，其中T细胞受体为权利要求1-7任一项中所述的T细胞受体。
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