KR20220070487A - 면역원성 egfr 펩타이드 조성물 및 암의 치료에서 그의 용도 - Google Patents

면역원성 egfr 펩타이드 조성물 및 암의 치료에서 그의 용도 Download PDF

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그레고리 리제
펑저 리
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Abstract

본 발명은 HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II 복합체에 결합하는 EGFR 돌연변이 펩타이드를 포함하는 조성물 및 다수의 이와 같은 펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 실시태양의 펩타이드에 의한 EGFR-돌연변이 암의 치료 방법을 마찬가지로 제공한다. 면역 효과기 세포, 예를 들어 T 세포의 관련 집단을 확대시키는 방법을 또한 제공한다.

Description

면역원성 EGFR 펩타이드 조성물 및 암의 치료에서 그의 용도
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 2019년 9월 26일자로 출원된 미국 가 특허출원 제 62/906,688 호에 대해 우선권을 주장하는 특허협력조약하의 국제 출원이며, 상기 출원은 내용 전체가 본원에 참고로 인용된다.
전자 제출된 서열 목록에 대한 참조
EFS-Web 법적 프레임워크 및 37 CFR §§ 1.821-825(MPEP § 2442.03(a) 참조)에 의하여, ASCII 호환 텍스트 파일 형식의 서열 목록(2020년 9월 22일에 생성되고 크기가 243,949 바이트인 "Sequence_Listing_3000072-02597"이란 표제의 목록)이 본 출원과 동시에 제출되었으며, 서열 목록의 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 HLA 부류 I 및 HLA 부류 II 분자에 결합하는 암-특이성 펩타이드에 관한 것이다.
T 세포 기반 요법은 많은 암을 치료하는 방법으로서 상당한 가능성을 보여주었으나; 불행하게도,이 접근법은 또한 일반적인 암에 대한 면역원성 항원 표적의 부족과 비-암성 조직에 대한 잠재적인 독성으로 인해 방해를 받았다. 이러한 T 세포 기반 요법에는 ACT(입양 세포 이식) 및 백신접종 접근법이 포함될 수 있다. ACT는 일반적으로, 예를 들어 암을 치료하기 위해 다수의 자기유래 활성화된 종양 특이성 T 세포를 환자에게 주입하는 것을 포함한다. 일반적으로, 유효한 항종양 T 세포 반응을 발생시키려면 통상적으로 항원 특이성 T 세포 프라이밍 및 활성화, 활성화된 T 세포의 종양 부위로의 이동, 및 항원 특이성 T 세포에 의한 종양 인식 및 사멸의 3개 단계가 필요하다. 유효한 항원 특이성 T 세포의 유도를 위해서는 표적 항원의 선택이 중요하다.
인간 백혈구 항원(HLA) 분자에 의해 종양 세포 표면에 표시되는 단백질-암호화 종양 돌연변이로부터 유래된 신생항원 펩타이드는 유효한 면역 반응을 생성하기 위한 유망한 항원으로 작용할 수 있다. 그러나, HLA 다양성과 대부분의 종양-관련 돌연변이의 개인적인 특성으로 인해 환자 간에 공유되는 신생항원은 거의 없으며 백신-유도 임상 반응은 드문 사건으로 남아 있다. 따라서, 신생항원을 발현하는 암에 대한 신규 에피토프의 확인 및 검증 방법이 필요하다.
일부 실시태양에서, 본 개시내용은 EGFR-돌연변이 암을 갖는 대상에게 적어도 EGFR로부터의 제1 HLA-결합 펩타이드 및 적어도 제1 EGFR 억제제를 투여함을 포함하는 상기 대상의 치료 방법을 제공하고, 상기 펩타이드는 상기 대상의 암 중의 돌연변이와 일치하는, 야생형 인간 EGFR에 비해 돌연변이된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 태양에서, 상기 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드는 HLA 부류 I 분자에 결합한다. 일부 태양에서, 상기 HLA 부류 I-결합 펩타이드는 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 아미노산 길이이다. 추가의 태양에서, 상기 HLA 부류 I-결합 펩타이드는 9, 10 또는 11개의 아미노산 길이이다. 일부 태양에서, 상기 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드는 HLA 부류 II 분자에 결합한다. 일부 태양에서, 상기 HLA 부류 II-결합 펩타이드는 13 내지 30개의 아미노산 길이이다. 추가의 태양에서, 상기 HLA 부류 II-결합 펩타이드는 15 내지 23개의 아미노산 길이이다.
일부 태양에서, 상기 방법은 적어도 EGFR로부터의 제1 및 제2 HLA-결합 펩타이드를 투여함을 포함하고, 여기서 상기 펩타이드는 각각 대상의 암 중의 돌연변이와 일치하는, 야생형 인간 EGFR에 비해 돌연변이된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 태양에서, 상기 EGFR로부터의 제1 HLA-결합 펩타이드는 HLA 부류 I 분자에 결합하고 상기 EGFR로부터의 제2 HLA-결합 펩타이드는 HLA 부류 II 분자에 결합한다. 일부 태양에서, 상기 방법은 EGFR로부터의 다수의 HLA-결합 펩타이드를 투여함을 포함하고, 여기서 상기 펩타이드는 각각 대상의 암 중의 돌연변이와 일치하는, 야생형 인간 EGFR에 비해 돌연변이된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 태양에서, 상기 다수의 HLA-결합 펩타이드는 HLA 부류 I 및 HLA 부류 II 분자 둘 다에 결합한다. 일부 태양에서, 상기 방법은 대상에게 2 내지 30개의 상이한 HLA-결합 펩타이드를 투여함을 포함한다. 추가의 태양에서, 상기 방법은 대상에게 5 내지 30개의 상이한 HLA-결합 펩타이드를 투여함을 포함한다.
일부 태양에서, 상기 대상의 HLA 유전자형이 결정되었다. 일부 태양에서, 상기 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드를, 대상이 보유하는 HLA 유형에 결합하는 것으로 예측한다. 일부 태양에서, EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드를, 자동 분석 프로그램을 사용하여 대상이 보유하는 HLA 유형에 결합하는 것으로 예측한다. 일부 태양에서, 상기 EGFR-돌연변이 암은 야생형 EGFR에 비해 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 EGFR 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 태양에서, 상기 EGFR-돌연변이 암은 E709K, E709A, E709H, G719A, G719S, G719C, S768I, H773L, T790M, L858R, L861Q, 709_710del>D, 745_749del, 745_750del, 746_750del, 746_751del, 746_751del>A, 746_752del>V, 747_750del, 747_751del, 747_751del>P, 747_753del, 747_753del>S, 747_753del>Q, 747_750del>P, 747_752del, 751_759del>N, 752_759del, 744_745ins>KIPVAI, 745_746ins>IPVAIK, 745_746ins>VPVAIK, 745_746ins>TPVAIK, 763_764ins>FQEA, 764_765ins>HH, 766_767ins>AI, 768_770dupSVD, 769_770ins>ASV, 770_771ins>G, 770_771ins>NPG, 770_771ins>SVD, 771_772ins>N, 771_772ins>H, 772_773ins>NP, 772_773ins>PR, 773_774ins>H, 773_774ins>PH, 773_774ins>NPH, 773_774ins>AH, 774_775ins>HV, 및 775_776ins>YVMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 EGFR-돌연변이 암은 G719A, G719S, G719C, S768I, H773L, T790M, L858R, L861Q, 709_710del>D, 746_750del, 746_752del>V, 747_751del, 747_751del>P, 747_753del>S, 747_750del>P, 747_752del, 744_745ins>KIPVAI, 745_746ins>IPVAIK, 763_764ins>FQEA, 768_770dupSVD, 769_770ins>ASV, 770_771ins>SVD, 772_773ins>PR, 773_774ins>H, 773_774ins>PH, 773_774ins>NPH, 및 773_774ins>AH로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 EGFR-돌연변이 암은 L858R, H773L, T790M, E709V, 747_751Del, V774M 및 S768I로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 돌연변이를 포함한다.
일부 태양에서, 상기 EGFR 억제제를 상기 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드 전에 투여한다. 다른 태양에서, 상기 EGFR 억제제를 상기 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드(들) 후에 또는 이와 본질적으로 동시에 투여한다. 일부 태양에서, 상기 돌연변이 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드(들)를 TLR 리간드와 함께 투여한다. 일부 태양에서, 상기 TLR 리간드는 TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 또는 TLR9 작용물질이다. 일부 태양에서, 상기 TLR 리간드는 TLR7 작용물질이다. 일부 태양에서, 상기 TLR7 작용물질은 CL075, CL097, CL264, CL307, GS-9620, Poly(dT), 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드(R848), 록소리빈 또는 ssRNA 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 태양에서, 상기 TLR7 작용물질은 이미퀴모드이다. 일부 태양에서, 상기 EGFR 억제제는 타이로신 키나제 억제제이다. 일부 태양에서, 상기 EGFR 억제제는 EGFR 결합 항체이다. 일부 태양에서, 상기 EGFR 억제제는 오시메르티닙, 에를로티닙, 제피티닙, 세툭시맙, 마투주맙, 파니투무맙, AEE788, CI-1033, HKI-272, HKI-357 또는 EKB-569이다.
일부 태양에서, 상기 암은 폐암이다. 일부 태양에서, 상기 폐암은 비-소세포 폐암이다. 일부 태양에서, 상기 폐암은 전이성 폐암이다. 일부 태양에서, 상기 폐암은 폐 선암종이다. 일부 태양에서, 상기 암은 EGFR 억제제 내성이다.
또 다른 실시태양에서, 본 개시내용은 적어도 EGFR로부터의 제1 및 제2 HLA-결합 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하고, 상기 제1 및 제2 펩타이드는 인간 EGFR-돌연변이 암 중의 돌연변이와 일치하는, 야생형 인간 EGFR에 비해 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 EGFR로부터의 제1 HLA-결합 펩타이드는 HLA 부류 I 분자에 결합하고 상기 EGFR로부터의 제2 HLA-결합 펩타이드는 HLA 부류 II 분자에 결합한다. 일부 태양에서, 상기 HLA-결합 펩타이드는 약학적으로 허용가능한 담체 중에서 제형화된다. 일부 태양에서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 수성 담체이다. 일부 태양에서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 염 용액이다. 일부 태양에서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 염수 용액, 바람직하게는 등장성 염수 용액이다. 일부 태양에서, 상기 HLA 부류 I-결합 펩타이드는 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 아미노산 길이이다. 추가의 태양에서, 상기 HLA 부류 I-결합 펩타이드는 9, 10 또는 11개의 아미노산 길이이다. 일부 태양에서, 상기 HLA 부류 II-결합 펩타이드는 13 내지 30개의 아미노산 길이이다. 추가의 태양에서, 상기 HLA 부류 II-결합 펩타이드는 15 내지 23개의 아미노산 길이이다. 일부 태양에서, 상기 조성물은 EGFR로부터의 다수의 HLA-결합 펩타이드를 포함하고, 여기서 상기 펩타이드는 각각 인간 EGFR-돌연변이 암 중의 EGFR 돌연변이와 일치하는, 야생형 인간 EGFR에 비해 돌연변이된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 태양에서, 상기 조성물은 대상에게 2 내지 30개의 상이한 HLA-결합 펩타이드를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 조성물은 2개 이상의 HLA 부류 I-결합 펩타이드 및 하나 이상의 HLA 부류 II-결합 펩타이드를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 조성물은 하나 이상의 HLA 부류 I-결합 펩타이드 및 2개 이상의 HLA 부류 II-결합 펩타이드를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 조성물은 2개 이상의 HLA 부류 I-결합 펩타이드 및 2개 이상의 HLA 부류 II-결합 펩타이드를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 조성물은 3개 이상의 HLA 부류 I-결합 펩타이드 및 3개 이상의 HLA 부류 II-결합 펩타이드를 포함한다.
일부 태양에서, 상기 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드는 야생형 EGFR에 비해 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 일부 태양에서, EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드는 야생형 EGFR에 비해 아미노산 치환을 포함한다. 일부 태양에서, 상기 HLA-결합 펩타이드는 야생형 인간 EGFR에 비해 E709K, E709A, E709H, G719A, G719S, G719C, S768I, H773L, T790M, L858R, L861Q, 709_710del>D, 745_749del, 745_750del, 746_750del, 746_751del, 746_751del>A, 746_752del>V, 747_750del, 747_751del, 747_751del>P, 747_753del, 747_753del>S, 747_753del>Q, 747_750del>P, 747_752del, 751_759del>N, 752_759del, 744_745ins>KIPVAI, 745_746ins>IPVAIK, 745_746ins>VPVAIK, 745_746ins>TPVAIK, 763_764ins>FQEA, 764_765ins>HH, 766_767ins>AI, 768_770dupSVD, 769_770ins>ASV, 770_771ins>G, 770_771ins>NPG, 770_771ins>SVD, 771_772ins>N, 771_772ins>H, 772_773ins>NP, 772_773ins>PR, 773_774ins>H, 773_774ins>PH, 773_774ins>NPH, 773_774ins>AH, 774_775ins>HV, 및 775_776ins>YVMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 HLA-결합 펩타이드는 야생형 인간 EGFR에 비해 G719A, G719S, G719C, S768I, H773L, T790M, L858R, L861Q, 709_710del>D, 746_750del, 746_752del>V, 747_751del, 747_751del>P, 747_753del>S, 747_750del>P, 747_752del, 744_745ins>KIPVAI, 745_746ins>IPVAIK, 763_764ins>FQEA, 768_770dupSVD, 769_770ins>ASV, 770_771ins>SVD, 772_773ins>PR, 773_774ins>H, 773_774ins>PH, 773_774ins>NPH, 및 773_774ins>AH로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 HLA-결합 펩타이드는 야생형 인간 EGFR에 비해, L858R, H773L, T790M, E709V, 747_751Del, V774M 및 S768I로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 돌연변이를 포함한다.
일부 태양에서, 상기 조성물은 EGFR 억제제를 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 상기 조성물은 TLR 리간드를 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 상기 TLR 리간드는 TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 또는 TLR9 작용물질이다. 일부 태양에서, 상기 조성물은 TLR-7 작용물질을 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 상기 TLR7 작용물질은 CL075, CL097, CL264, CL307, GS-9620, Poly(dT), 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드(R848), 록소리빈 또는 ssRNA 올리고뉴클레오타이드이다. 추가의 태양에서, 상기 TLR7 작용물질은 이미퀴모드이다. 일부 태양에서, 상기 HLA-결합 펩타이드는 HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II 분자와 복합체를 이룬다. 일부 태양에서, 상기 조성물은 항원 제시 세포를 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 HLA-결합 펩타이드는 리포솜, 지질-함유 나노입자, 또는 지질-기반 담체 중에 포함된다. 일부 태양에서, 상기 조성물은 항원보강제 성분을 추가로 포함한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 본 개시내용은 대상에게 유효량의 본 개시내용의 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법(예를 들어 상기를 포함하는 조성물)을 제공하고, 여기서 상기 대상은 EGFR-돌연변이 암을 갖고 여기서 상기 조성물 중의 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드는 상기 대상의 EGFR-돌연변이 암의 돌연변이와 일치하는 돌연변이를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 방법은 상기 대상의 암에서 EGFR 유전자를 서열분석함을 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 상기 대상의 HLA 유전자형은 결정되었다. 일부 태양에서, EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드를, 대상이 보유하는 HLA 부류 I 또는 HLA 부류 II 유형에 결합하는 것으로 예측한다. 추가의 태양에서, 상기 조성물 중에 포함된 EGFR-돌연변이 펩타이드를, 상기 대상에서 발현된 HLA 유형에 결합하는 HLA를 예측하는 알고리즘을 사용하여 선택한다. 일부 태양에서, 상기 조성물 중에 포함된 펩타이드를 예측된 HLA 친화도 및/또는 예측된 HLA 순위에 기반하여 선택한다. 추가의 태양에서, 상기 조성물 중에 포함된 펩타이드를 예측된 HLA 친화도 및 예측된 HLA 순위에 기반하여 선택한다. 추가의 태양에서, HLA-결합 펩타이드의 선택에 사용되는 알고리즘은 NetMHC4.0, NetMHCpan3.0, NetMHCpan4.0, NetMHCII2.2 및/또는 NetMHCII2.3 중에서 선택된다. (예를 들어 문헌[Andreatta et al., 2015] 및 문헌[Jensen et al., 2018](이들은 각각 본원에 참고로 인용된다)을 참조하시오).
일부 태양에서, 상기 방법은 EGFR 억제제를 대상에게 투여함을 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 상기 EGFR 억제제를 상기 돌연변이된 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드 전에 투여한다. 일부 태양에서, 상기 EGFR 억제제를 상기 돌연변이된 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드 후에 또는 이와 본질적으로 동시에 투여한다. 일부 태양에서, 상기 EGFR 억제제는 EGFR 결합 항체이다. 일부 태양에서, 상기 EGFR 억제제는 오시메르티닙, 에를로티닙, 제피티닙, 세툭시맙, 마투주맙, 파니투무맙, AEE788, CI-1033, HKI-272, HKI-357 또는 EKB-569이다. 일부 태양에서, 상기 EGFR 억제제는 타이로신 키나제 억제제이다. 일부 태양에서, 상기 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드를 TLR 리간드와 함께 투여한다. 일부 태양에서, 상기 TLR 리간드는 TLR2, TLR2, TLR4, TLR7, TLR8 또는 TLR9 작용물질, 바람직하게는 TLR7 작용물질이다. 일부 태양에서, 상기 TLR7 작용물질은 CL075, CL097, CL264, CL307, GS-9620, Poly(dT), 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드(R848), 록소리빈 또는 ssRNA 올리고뉴클레오타이드이다. 추가의 태양에서, 상기 TLR7 작용물질은 이미퀴모드이다.
일부 태양에서, 암은 폐암이다. 일부 태양에서, 상기 폐암은 비-소세포 폐암이다. 일부 태양에서, 상기 폐암은 전이성 폐암이다. 일부 태양에서, 상기 폐암은 폐 선암종이다. 일부 태양에서, 상기 암은 EGFR 억제제 내성이다. 일부 태양에서, 상기 조성물을 비경구 투여, 정맥내 주사, 근육내 주사, 흡입, 또는 피하 주사에 의해 투여한다. 일부 태양에서, 상기 조성물을 수성 담체 중에서 제형화한다. 일부 태양에서, 상기 수성 담체는 염 용액이다. 일부 태양에서, 상기 수성 담체는 등장성 염수 용액이다. 일부 태양에서, 상기 조성물을 적어도 2, 3, 4, 또는 5회 투여한다. 일부 태양에서, 투여 사이에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일이 존재한다. 일부 태양에서, 상기 방법은 추가의 항암 요법을 투여함을 추가로 포함한다. 일부 태양에서, 상기 추가의 항암 요법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 또는 수술로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 태양에서, 상기 면역요법은 하나 이상의 면역관문 억제제를 포함한다. 일부 태양에서, 상기 면역관문 억제제는 항-PD1 또는 항-CTLA-4 단클론 항체이다. 일부 태양에서, 상기 면역요법은 면역관문 억제제의 조합이다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 본 개시내용은 면역 효과기 세포의 출발 집단을 수득하고 상기 면역 효과기 세포의 출발 집단을 본 개시내용의 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 EGFR-돌연변이 암-특이성 면역 효과기 세포를 생성시킴을 포함하는 EGFR-돌연변이 암-특이성 면역 효과기 세포의 생성 방법을 제공한다. 일부 태양에서, 접촉은 상기 면역 효과기 세포의 출발 집단을 항원 제시 세포(APC)와 공-배양하는 것으로서 추가로 정의되며, 여기서 상기 APC는 그의 표면상에 본 개시내용의 HLA-결합 펩타이드를 제시한다. 일부 태양에서, 상기 APC는 수지상 세포이다. 일부 태양에서, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포, 말초 혈액 림프구, NK 세포, 불변 NK 세포, NKT 세포이다. 일부 태양에서, 상기 면역 효과기 세포는 중간엽 줄기 세포(MSC) 또는 유도 만능 줄기(iPS) 세포로부터 분화되었다. 일부 태양에서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 γδ T 세포이다. 일부 태양에서, 상기 T 세포의 출발 집단은 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포이다. 일부 태양에서, 상기 T 세포는 세포독성 T 림프구(CTL)이다. 일부 태양에서, 수득은 말초 혈액 단핵세포(PBMC)로부터 면역 효과기 세포의 출발 집단을 단리함을 포함한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 EGFR-돌연변이 암-특이성 T 세포를 제공한다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 EGFR-돌연변이 암-특이성 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 개시내용은 대상에게 유효량의 EGFR-돌연변이 암-특이성 T 세포를 투여함을 포함하는, 상기 대상에서 암의 치료 방법을 제공한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 개시내용은 대상에서 암을 치료하기 위한 유효량의 본 개시내용의 EGFR-돌연변이 암-특이성 T 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 명시된 성분에 대해 "본질적으로 없는"은 본원에서 상기 명시된 성분이 조성물 중에 고의로 제형화되지 않았고/않았거나 단지 오염물질로서 또는 미량으로 존재함을 의미하는데 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "하나"는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "또는"이란 용어는 단지 대안만을 지칭하도록 명시적으로 나타내지 않거나 또는 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하지만, 본 개시내용은 단지 대안 및 "및/또는"만을 지칭하는 정의를 지지한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "또 다른"은 적어도 두 번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본원 전체를 통해서, "약"이란 용어는 값이 장치에 대한 고유한 오차의 변동, 값을 측정하기 위해 사용되는 방법, 또는 연구 대상 사이에 존재하는 변동을 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양을 나타내면서 단지 예시의 목적으로 제공되는 것으로 이해되어야 하고, 따라서 본 발명의 진의 및 범위내의 다양한 변화 및 수정은 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
하기의 도면은 본 명세서의 부분을 형성하고 본 발명의 몇몇 태양을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제공된 특정한 실시태양의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참고로 보다 양호하게 이해될 수 있다.
도 1a 내지 1h는 개인맞춤된 펩타이드 백신(PPV) 시험 설계 및 환자 결과를 도시한다. (도 1a) 진행된 비-소세포 폐암(NSCLC) 환자의 면역화로 이어지는 신생항원 펩타이드 백신 제조 파이프라인. 폐 종양 생검의 DNA는 508개의 종양 관련 유전자 패널을 사용하여 서열분석되었으며 환자 말초 혈액에서 고해상도 HLA 유형분석이 수행되었다. 신생항원 백신 펩타이드는 주로 HLA 부류 I 및 부류 II 결합 예측을 기반으로 선택되었다(방법 참조). 각 환자는 2개의 칵테일로 나뉜 짧고 긴 신생항원 펩타이드의 염수-기반 혼합물로 매주 면역화되고 12주 동안 반대쪽 사지에 투여되었다. 화살표는 백신 접종을 받은 주수를 나타낸다. 주사기 기호로 표시된 대로 0, 4, 8 및 12주에 혈액을 채혈하였다. (도 1b) PPV를 받은 24명의 NSCLC 환자에 대한 임상 사건 타임라인. 어두운 막대(신생항원 백신 표지), PPV 면역화 지속기간. 가늘고 밝은 막대(EGFR 억제제 표지), EGFR 억제제 요법 지속기간. (도 1c) 14명의 PPV 환자를 백신 접종 중 EGFR 돌연변이 상태 및 EGFR 억제제의 용도에 기반하여 3개 그룹으로 나누었다. (도 1d 내지 1f) 환자 코호트, 임상 반응 및 무-진행 생존에 의해 계층화된 백신 펩타이드의 수, 표적화된 돌연변이의 수 및 예측된 백신 펩타이드 결합 친화도. 검은색 점은 비-EGFR 신생항원 펩타이드를 표시하고 회색 점은 EGFR 신생항원 펩타이드를 표시하고, 후자의 백분율은 하단에 나열된다. (도 1g) 3개의 환자 그룹의 생존 분석은 그룹 3의 환자가 다른 그룹에 비해 유의하게 더 긴 전체 생존을 경험함을 보여주었다(그룹 2 대 그룹 3, P=0.038). (도 1h) 객관적인 임상 반응(CR/PR, n=7), 안정 질병(SD, n=9) 또는 진행성 질병(PD, n=8)을 경험하는 환자 간의 무-진행 생존 비교. 생존 분석은 로그 순위(만텔 콕스(Mantel-Cox)) 검정을 사용하여 수행되었다. 양측 독립표본 t 검정 또는 만 휘트니(Mann-Whitney) U 검정을 사용하여 그룹 간의 통계학적 유의수준을 분석하였다. P<0.05는 유의하게 상이한 것으로 간주되었다.
도 2는 24명의 PPV 환자의 면역화 시간 과정을 도시한다. 각각의 사각형은 1주일을 나타낸다. 어두운 사각형과 화살표는 백신 접종을 받은 주수를 나타내고 흰색 사각형은 백신이 투여되지 않은 주를 나타낸다. 시험 설계에 따르면, 환자는 최소 12주 동안 매주 백신 접종을 받아야 했다. 진행된 질병으로 인해 초기 시험 기간 중에 사망한 Pt. 9, 19 및 20을 제외한 모든 환자는 12주의 백신 접종을 완료하였다. 환자는 원할 경우 12주 넘게 백신 접종을 계속할 수 있는 기회가 주어졌다.
도 3은 그룹으로 분리된 24명의 PPV 환자의 치료 및 임상 결과를 도시한다.
도 4a & 4b는 그룹별 임상 기준선 특징의 요약을 도시한다. (도 4a) 기준선에서 PPV 그룹의 임상 및 인구통계학적 특징을, 그룹 PPV-1(EGFR-WT, PPV 단독), PPV-2(EGFR 돌연변이체, PPV 단독) 및 PPV-3(EGFR 돌연변이체, PPV + EGFRi)의 통계학적 비교와 함께 나타낸다. SQ, 편평세포 암종; AD, 선암종. 연속적인 데이터를 평균+표준 편차(SD)로서 나타내었다. (도 4b) PPV-2 및 PPV-3 환자의 EGFR 억제제 치료 이력. TKI, 타이로신 키나제 억제제, 양측 독립표본 t 검정 또는 카이-제곱 검정을 사용하여 그룹간 통계학적 유의수준을 분석하였다. P<0.05는 유의하게 상이한 것으로 간주되었다.
도 5a 내지 5c는 그룹별 PPV 환자의 임상 반응을 도시한다. (도 5a) PPV 개시 후 12-18주에 RECIST1.1 기준을 사용하여 평가된 바와 같은 무-진행 생존, 전체 생존 및 임상 반응을 나타내는 그룹별 면역화된 환자의 반응 요약. (도 5b) 치료 과정에 걸친 PPV 환자의 전체 종양 부담(모든 표적 병변의 합)의 측정. 각 환자의 임상 반응은 하기와 같다: Pt.1 - PD; Pt.4 - PD; Pt. 6 - SD; Pt.7 - SD; Pt.9 - SD; Pt.10 - PD; Pt. 19 - PD; Pt.11 - CR 또는 PR; Pt.14 - CR 또는 PR; Pt.16 - SD; Pt.17 - CR 또는 PR; Pt.18 - PD; Pt.20 - PD; Pt. 24 - PD; Pt.3 - SD; Pt.5 - CR 또는 PR; Pt.8 - CR 또는 PR; Pt.12 - CR 또는 PR; Pt.13 - SD; Pt.15 - SD; Pt.21 - SD; Pt.22 - CR 또는 PR; Pt.23 - PD. *환자 1은 12주째에 흉막삼출이 발생하였다. **환자 11의 추적 CT 스캔은 24주째에 촬영되었다. 측정 가능한 종양이 없기 때문에 환자 2에 대한 종양 측정값이 표시되지 않는다. 추적 CT 스캔은 환자 13 및 15에 대해 입수할 수 없었지만, 반응 및 생존에 관한 다른 임상 추적 정보를 획득하였다. PPV, 개인맞춤된 펩타이드 백신; PPV-1, PPV 그룹 1; PPV-2, PPV 그룹 2; PPV-3, PPV 그룹 3. MUT, 돌연변이됨; CR, 완전한 반응; PR, 부분 반응; PD, 진행성 질병; SD, 안정 질병. (도 5c) 치료-관련 부작용 목록.
도 6a 내지 6c는 백신 시험-전 EGFR 억제제 실패를 포함하여, 선택된 PPV 환자의 전형적인 CT 스캔을 도시한다. (도 6a) 환자 2(그룹 1)의 흉막삼출액이 PPV 치료 10주 후에 사라졌음을 보여주는 일련의 CT 스캔. (도 6b) PPV 치료 동안 간 전이의 진행을 보이는 환자 23의 CT 스캔. 환자 24는 면역화 시작 후 11주째에 유사하게 폐 종양 진행을 나타내었다. (도 6c) 환자 17, 5, 8 및 12에서 PPV 시험-전 EGFR 억제제 실패에 이어서 PPV 치료를 시작한 후 객관적 임상 반응을 나타내는 일련의 CT 스캔.
도 7a 내지 7f는 개인맞춤된 신생항원 펩타이드 백신 접종 후 환자 임상 반응을 도시한다. (도 7a) 완전한 반응자 환자 17로부터의 2개의 폐 병변의 퇴행을 도시하는 CT 스캔. (도 7b) 조직 생검은 나머지 폐 CT 신호가 생육성 종양 세포를 함유하지 않는 섬유증성 조직만으로 구성되었음을 확인하였다. (도 7c) T2 가중된 자기공명영상(MRI)에 의해 평가된 환자 17 골 전이가 신생항원 백신 접종 시작 후 18주째에 사라졌다. 이러한 골 전이는 RECIST(버전 1, 골 병변 측정가능성)에 따라 비-표적 병변으로 간주되었다. (도 7d) 그룹 2의 2명의 추가적인 환자는 PPV에 대한 객관적인 임상 반응을 나타내었다. 환자 11은 PPV 시작 후 24주째에 폐쇄성 무기폐의 해소와 함께 폐 종양 퇴행을 경험한 반면(흰색 화살표, 우측), 기흉은 변화를 나타내지 않았다(회색 화살표). 환자 14의 목 전이는 PPV 치료 시작 후 12주째에 유의미한 퇴행을 보였다(우측). (도 7e) 환자 5, 8, 12 및 22에서 폐 종양 퇴행을 도시하는 CT 스캔, 이들 모두는 PPV 치료 후 부분적 임상 반응을 가졌다. (도 7f) 치료-전 기준선과 비교하여 PPV 후 3 내지 4개월째에 PPV 연구 환자의 전체 종양 부담의 변화. *환자 1은 12주째에 흉막삼출이 발생하였다. CR, 완전한 반응; PR, 부분 반응.
도 8a 내지 8e는 상이한 환자 그룹의 생존 분석을 도시한다. (도 8a) 그룹별 PPV 환자의 무-진행 생존(PFS) 분석. (도 8b) 그룹별 PPV 환자의 전체 생존(OS) 분석. (도 8c) 질병 억제가 있는 환자(CR + PR + SD, n = 16) 또는 PD가 있는 환자(n = 8ted EGFR 환자, 그룹 2 환자 또는 그룹 3 환자) 간의 PFS 비교. 및 객관적인 임상 반응(CR/PR, n=7), 안정 질병(SD, n=9) 또는 진행성 질병(PD, n=8)을 경험하는 환자간 전체 생존의 비교. (도 8d) 모든 16명의 환자, 그룹 2 환자 또는 그룹 3 환자에 대해 도시된 바와 같이, 3세대 TKI 오시메르티닙을 사용하였거나 사용하지 않은 환자 간의 PFS 비교. (도 8e) 16명의 돌연변이된 EGFR 환자 모두에 대해 오시메르티닙을 사용하였거나 사용하지 않은 환자 간의 전체 생존 비교. 생존 분석은 로그 순위(만텔 콕스) 검정을 사용하여 수행되었으며, 이때 P<0.05는 유의하게 상이한 것으로 간주되었다(굵게 표시). 95% 신뢰도 구간(Cl)은 위험비에 대한 것이다.
도 9a 내지 9c는 그룹별 백신 펩타이드 분석, 임상 반응 및 무-진행 생존을 도시한다. (도 9a) HLA 펩타이드 결합 친화도에 의해 예측된 바와 같이 백신 펩타이드에 의해 관여된 상이한 HLA 부류 I 및 부류 I 분자의 수. 각 점은 한 명의 PPV 환자를 나타낸다. (도 9b) HLA 부류 I(짧은) 또는 HLA 부류 II(긴)로 제한된 투여된 백신 펩타이드의 수. 각 점 또는 원은 한 명의 PPV 환자를 나타낸다. (도 9c) 백신 펩타이드의 펩타이드 델타 점수. 델타 점수는 상응하는 야생형 펩타이드 결합 친화도에서 돌연변이 신생항원 펩타이드 예측 결합 친화도를 감하여 계산된다. 각 점은 하나의 백신 펩타이드를 나타낸다. 회색, EGFR 신생항원 펩타이드; 검은색, 비-EGFR 신생항원 펩타이드. 양측 독립표본 t 검정을 사용하여 그룹 간에 유의한 차이가 발견되지 않았으며 P<0.05는 유의하게 상이한 것으로 간주되었다. MUT, 돌연변이. WT, 야생형. PD, 진행성 질병; SD, 안정 질병; PR, 부분 반응; CR, 완전한 반응.
도 10a & 10b. (도 10a) 단변량 분석에 의해 측정된 바와 같은, 개인맞춤된 펩타이드 백신 환자의 생존과 관련된 인자. (도 10b) 흉막 삼출 및 종양 부담이 PPV 시험 환자의 전체 생존에 영향을 미치는 두 가지 위험 인자임을 보여주는 카플란-마이어 분석. 생존 분석은 로그 순위(만텔 콕스) 검정을 사용하여 수행되었으며, P<0.05는 유의한 것으로 간주되었다(굵게). SD, 표준편차; EGFRi; EGFR 억제제; ECOG, 동부 협력 종양학 그룹; PS, 수행성능 상태; *SQ, 편평 세포 암종; AD, 선암종. EGFRi 실패 범주 1, 실패한 1세대 EGFRi; 2/3, 실패한 2세대 또는 3세대 EGFRi.
도 11a 내지 11i는 EGFR 신생항원 펩타이드가 면역원성이며 공유되고 독특한 HLA 부류 I 결합 선호도를 나타낸다는 것을 도시한다. (도 11a) 펩타이드 풀-자극된 환자 PBMC 상등액에 대해 수행된 인터페론-감마(IFN-γ) ELISA 분석은 주로 6명의 PPV 환자: 5, 8, 14, 17, 21 및 22에서 백신 펩타이드 풀-특이성 반응을 나타내었다. 상기 6명의 환자 중 5명은 PPV 후 객관적인 임상 반응을 경험하였다(Pt.11, Pt.14, Pt.17, Pt.5, Pt.8, Pt.12, Pt.22). (도 11b) 환자 5, 8, 14 및 17에 대한 IFN-γ ELISA에 의한 개별 백신 펩타이드 반응성의 디콘볼루션은 HLA-A*1101 제한된 EGFR-L858R 펩타이드 KITDFGRAK(서열번호(SEQ ID NO:) 4)에 대한 환자 5, 8 및 14에서 우세한 면역 반응을 나타내었다. 완전한 반응자 환자 17은 유사하게 HLA*C1502 제한된 EGFR-T790M 펩타이드 LTSTVQLIM(서열번호 65)에 대해 우세한 반응을 보였다. 다른 PPV 연구 환자에 대한 개별 펩타이드 반응성은 도 12에 도시되어 있다. (도 11c 및 11d) IFN-γ ELISPOT 분석 및 HLA 사량체-기반 염색의 요약은 환자 5, 8 및 14의 HLA-A*1101/KITDFGRAK(서열번호 4)-특이성 CD8+ T 세포 및 환자 17의 HLA-C*1502/LTSTVQLIM(서열번호 65)-특이성 CD8+ T 세포의 PBMC 빈도가 PPV 과정에 걸쳐 유의하게 증가함을 밝혀내었다. (도 11e) ELISPOT 분석은 환자 5, 8, 14 및 17로부터의 PPV-후 PBMC가 돌연변이된 EGFR 신생항원 펩타이드를 특이적으로 인식하지만 상응하는 야생형(WT) EGFR 펩타이드는 인식하지 않음을 보여주었다. (도 11f) 돌연변이 EGFR-L858R(더 큰 펩타이드 서열번호 980의 박스 영역) 및 T790M(더 큰 펩타이드 서열번호 982의 박스 영역) 펩타이드 및 상응하는 WT 에피토프(각각 더 큰 펩타이드 서열번호 979의 박스 영역 및 더 큰 펩타이드 서열번호 981의 박스 영역)의 EGFR 단백질 서열 및 예측된 HLA 펩타이드 결합 친화도. (도 11g 및 11h) 가장 널리 퍼진 EGFR 돌연변이, L858R(밝은 회색) 및 엑손 19 결실(Ex19del, 중간 회색)로부터 유래된 신생항원은 A3 슈퍼패밀리 내에서 HLA 부류 I 알로타입에 대해 독특한 결합 선호도를 나타내는 반면, 다른 덜 널리 퍼진 EGFR 점 돌연변이(S768I, T790M 및 L861Q, 짙은 회색)는 A2 및 C3 슈퍼패밀리 구성원에 대한 결합 선호도를 나타낸다. (도 11i) 폐암에서 가장 널리 퍼진 공유된 EGFR 돌연변이에 대해 가장 높은 수의 예측된 결합 EGFR 신생항원(<500 nM 친화도)을 갖는 개별 HLA 부류 I 알로타입을 도시하는 확대도. 검은색 화살표는 A*1101-제한된 KITDFGRAK 펩타이드(서열번호 4) 및 C*1502-제한된 LTSTVQLIM 펩타이드(서열번호 65)를 표시한다. 그룹 간의 통계적 유의수준을 분석하기 위해 양측 독립표본 t 검정을 사용하였다. P<0.05는 유의하게 상이한 것으로 간주되었다.
도 12a 및 12b는 PPV-유도된 면역 반응의 ELISA 기반 면역 모니터링을 도시한다. (도 12a) 개별 백신 펩타이드에 대한 말초혈액 반응성을 측정한 IFN-γ ELISA 분석 결과. 펩타이드 번호는 표 5에 나열된 번호에 해당한다. 변화 배수는 표시된 시점에서 펩타이드 없음 대조군(아니오)에 대해 측정된다. I.C., 관련 없는 펩타이드 대조군. 임상 반응자는 (CR) 또는 (PR)로 표시된다. (도 12b) 연관된 그룹, 조직학 및 임상 결과와 함께 각 환자에 대한 전체 백신 펩타이드-특이성 면역 반응성(ComboScore, 방법 참조)을 도시하는 요약도.
도 13a 내지 13h는 백신-유도된 반응의 ELISPOT 기반 생체외 말초 혈액 면역 모니터링을 도시한다. IFN-γ ELISPOT 분석 결과는 7명의 임상 반응자를 포함하여 8명의 면역화된 환자에서 선택된 백신 펩타이드(웰당 2.5 x 105 세포)에 대한 PPV 유도된 면역 반응성을 보여준다. EGFR(L858R) NeoAg 펩타이드 KITDFGRAK(서열번호 4)는 3명의 다른 반응 Pt. 5, 8 및 14(도 13a, 13b 및 13d)에서 우세한 IFN-γ 반응을 유도하였지만; SD Pt. 16에서 이 백신 펩타이드에 대한 면역 반응은 검출할 수 없었다(도 13e). 완전한 반응 Pt. 17은 공유 EGFR(T790M) 돌연변이를 함유하는 LTSTVQLIM(서열번호 65) NeoAg 펩타이드에 대해 우세한 면역 반응을 생성하였다(도 13f). 2명의 추가적인 PR 환자는 개인 돌연변이-암호화 NeoAg: Pt. 11에서 AQP12A(L28R) 펩타이드 KARLPVGAY(서열번호 875)(도 13c) 및 Pt. 22에서 FGFR1(R734W) 펩타이드 YMMMWDCWHAV(서열번호 964)(도 13g)에 대한 CD8+ T 세포 반응을 생성하였다. 긴 CD4+ 제한된 EGFR NeoAg 펩타이드에 대한 면역 반응은 또한 환자 중 3명에서도 유도되었다: Pt. 8 및 16에서 EGFR(L858R)-함유 펩타이드 HVKITDFGRAKLLGAEE(서열번호 826)(도 13b & 13e), 및 Pt. 22에서 H773L/V774M NeoAg 펩타이드 MASVDNPLMCRLLGICL(서열번호 958)(도 13g). 또한 반응을 유도한 각 백신 펩타이드에 대한 106 PBMC당 IFN-γ 스폿 수(정규화됨)를 나타내는 선 그래프 요약이 도시되어 있다. 펩타이드 식별 번호(P1, P2 등)는 표 5에 나열된 번호에 상응하고 또한 서열번호 874(RLPVGAYEV); 서열번호 880(VMASVDNPL); 서열번호 1(HVKITDFGR); 서열번호 16(VKITDFGRAK); 서열번호 32(AIKESPKANK); 서열번호 914(KIPVAIKESPKANKEIL); 서열번호 687(STVQLIMQL); 서열번호 956(NPLMCRLLGI); 서열번호 15(TDFGRAKLL); 및 서열번호 884(RLSISFENLDTAKKKLP)에 상응한다. 그룹 간의 통계학적 유의수준을 분석하기 위해 양측 독립표본 t 검정을 사용하였다. P<0.05는 유의하게 상이한 것으로 간주되었다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
도 14a 내지 14c는 백신-유도된 CD8+ T 세포 반응의 HLA/펩타이드 사량체 기반 면역 모니터링을 도시한다. (도 14a) 면역 모니터링 분석에 사용된 맞춤 합성된 EGFR 신생항원 사량체의 목록: KITDFGRAK(서열번호 4); VKITDFGRAK(서열번호 16); HVKITDFGR(서열번호 1); AIKESPKANK(서열번호 32); AIKTSPKANK(서열번호 20); LTSTVQLIM(서열번호 65). (도 14b 및 14c) 표시된 시점에서 추출된 생체외 백신-전 및 -후 PBMC의 사량체 염색 결과. (도 14b) PPV Pt. 5, 8, 14 및 16(L858R; 서열번호 4) 및 17(T790M; 서열번호 65)에 대해 EGFR 신생항원-특이성 CD8+ T 세포 집단이 관찰되었다. (도 14c) 백신접종된 Pt. 3, 5, 8, 14 및 16로부터 추출된 PBMC의 음성 EGFR 신생항원 사량체 염색의 예가 도시되어 있다.
도 15a 내지 15c는 공유된 EGFR 신생항원의 HLA 부류 I 및 부류 II 슈퍼패밀리 펩타이드 결합 분석을 도시한다. HLA 결합 예측은 5개의 공유된 점 돌연변이(S768I, H773L, T790M, L858R 및 L861Q)와 5개의 공통 엑손 19 결실(범례)을 포함하여, 폐암에서 가장 널리 퍼진 10개의 EGFR 돌연변이를 함유하는 EGFR 신생항원 펩타이드에 대해 수행되었다. (도 15a) 500 nM 이하의 예측된 결합 친화도로 전 세계적으로 가장 널리 퍼진 100개의 HLA 부류 I 알로타입에 결합하는 것으로 예측된 9, 10 또는 11-머 EGFR 신생항원 펩타이드의 수. 알로타입은 HLA 슈퍼패밀리로 나뉘며, 상이하게 공유된 EGFR 돌연변이에 대한 뚜렷한 슈퍼패밀리 결합 선호도를 나타낸다. (도 15b) 5000 nM 이하의 예측된 결합 친화도로 HLA 부류 I 알로타입에 결합하는 것으로 예측된 9, 10 또는 11-머 EGFR 신생항원 펩타이드의 수. (도 15c) 500 nM 이하의 예측된 결합 친화도로 HLA 부류 II 알로타입에 결합하는 것으로 예측된 17-머 EGFR 신생항원 펩타이드의 수. 결합 예측은 HLA 부류 I 펩타이드에 대해 NetMHCpan4.0을 사용하고 HLA 부류 II 펩타이드에 대해 NetMHCII2.3을 사용하여 수행되었다. HLA 부류 I 및 II 슈퍼패밀리 그룹은 문헌[Sidney et al., 2008], 문헌[Harjanto et al., 2014] 및 문헌[Jensen et al., 2018. BX]으로부터 조정되었으며, HLA-B 알로타입은 분류되지 않았다.
도 16a 내지 16h는 말초 혈액 및 종양에서 EGFR-L858R 신생항원 특이성 T 세포 클론의 증가된 빈도 및 수를 유도한 신생항원 백신접종을 도시한다. (도 16a 및 16b) 환자 그룹 및 무-진행 생존에 의해 계층화된, PPV-후 환자 PBMC에서 TCRVβ-CDR3 클론성 점수의 변화 퍼센트. (도 16c) 환자 5의 10-개월 PPV-후 PBMC로부터의 CD8+ 사량체+(Tet+) T 세포의 HLA-A*1101/KITDFGRAK(서열번호 4) 사량체 염색 및 유식 분류. 분류된 Tet+ 세포는 단-세포 TCRα/β 서열분석 과정을 겪었다. (도 16d) TCRVβ-CDR3 서열분석은 환자 5 PBMC에 대해 수행되었고 종양 생검은 PPV 치료-전 또는 -후에 수행되었다. 벤다이어그램과 도트 플롯은 샘플 쌍 간에 겹치는 CDR3 클론의 수와 빈도를 보여준다. PPV-후에서 분류된 52개의 높은 신뢰도 Tet+ Vβ-CDR3 클론은 PBMC 및 TIL CDR3 클론(회색 점) 모두와 높은 정도의 중첩을 나타내었다. PPV는 신생항원-특이성 Tet+ 클론(작은 상자)의 빈도에서 상당한 증가를 유도하였으며, 13개의 새로운 Tet+ 클론도 또한 PPV-후에 나타났다(밝은 회색 점). 면역화는 또한 PBMC 및 TIL 모두에서 다른 CDR3 클론의 집단을 유도하였다(검은색 화살표) (도 16e) PPV-전 및 -후 시점에서 상위 10개의 기존 Tet+ CDR3 클론의 PBMC 및 TIL 빈도. (도 16f) PPV-전 및 -후의 12개의 백신-유도된 Tet+ CDR3 클론의 PBMC 및 TIL 빈도. (도 16g) 분류된 Tet+ 클론의 단-세포 서열분석은 HLA-A*1101/KITDFGRAK(서열번호 4) 사량체를 갖는 Vα-N1 및 Vβ-N1의 클로닝을 용이하게 하였다. A549 세포는 또한 HLA-A*1101 및/또는 KITDFGRAK(서열번호 4) 펩타이드-암호화 미니유전자를 발현하도록 조작되었다. (도 16h) A11과 공-배양된 TCR-N1 조작된 T 세포. KIT-형질도입된 A549 세포는 IFN-γ ELISA(상단)에 의해 측정된 바와 같이, 대조군 T 세포와 비교하여 현저하게 더 많은 IFN-γ를 생산하였다(P<0.001). TCR-N1 T 세포는 대조용 부모 A549, A549-A11 또는 A549.KIT 표적 세포를 인식하지 못하였으며, 이는 신생항원 특이적 반응성(하단)을 입증한다. 대조군과 비교하여 통계학적 비교를 측정하였다. 양측 독립표본 t 검정 또는 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정을 사용하여 그룹 간의 통계학적 유의수준을 분석하였다. P<0.05는 유의하게 상이한 것으로 간주되었다. **, P<0.01; ***, P<0.001.
도 17a 내지 17g. (도 17a) 10 Mo PBMC로부터의 KITDFGRAK(서열번호 4) 사량체-양성 CD8+(Tet+) T 세포의 단-세포 TCR 서열분석을 통해 확인된 52개의 TCR-VβCDR3 클론은 환자 5의 PPV 치료 동안 PMBC 빈도의 변화를 보여준다. Y-축은 분류된 Tet+ 세포 내 CDR3 빈도를 나타내고, X-축은 표시된 시점에서 PBMC 내 CDR3 빈도를 나타낸다. 상관 계수를 나타낸다. (도 17b) PPV 치료 과정 동안 말초 혈액에서 52개의 Tet+ CDR3 클론의 최대 확대 배수. 유도된 클론은 전처리 PBMC에서 검출할 수 없었다. (도 17c) 52개의 Tet+ 클론이 PPV-전 또는 12Mo 후에 채취된 종양 샘플에서 CDR3 빈도와 비교된다는 점을 제외하고 도 17a와 유사한 분석. (도 17d) H1975(EGFR-L858R/T790M) 및 H1299(EGFR-WT) 폐암 세포의 EGFR 억제제 오시메르티닙 처리는 웨스턴 블롯에 의해 나타난 바와 같이 H1975 세포에서 유의하게 감소된 포스포-EGFR 및 포스포-ERK를 나타내었다. μM의 EGFRi 농도를 나타낸다. C1 및 C2는 미처리된 대조용 세포이다. (도 17e) EGFRi(24h) 또는 EGFR(24h) + IFN-γ(12h)에 노출된 후 H1975 및 H1299 세포에서 RNA 전사물 변화를 나타내는 히트맵. (도 17f) H1975 세포(원) 및 H1299 세포(사각형)의 EGFRi 또는 EGFRi+IFNγ 처리 후 Jak-Stat, TNFα 및 TRAIL 신호전달의 유전자 특징 변화. (도 17g) H1975 세포의 EGFRi 처리 후 RNAseq의 유전자 세트 농축 분석.
도 18a 내지 18m은 EGFR 억제제에 의한 면역조절이 면역 세포 침윤, 종양 항원 제시 및 T 세포 활성화를 촉진함을 도시한다. H1975(EGFR-L858R/T790M) 및 H1299(EGFR-WT) 세포주를 EGFR 억제제(EGFRi) 오시메르티닙으로 처리하고, RNAseq 분석을 처리 후 0, 12 또는 24시간째에 수행하였다. RNAseq는 또한 4개의 환자 종양, 2개의 온-EGFRi 및 2개의 오프-EGFRi에 대해 수행되었다. (도 18a) 세포 분열, 세포 주기, 세포자멸사 및 세포 생존과 연관된 유전자의 상대적 전사물 발현 수준은 EGFRi 처리 후 H1975 세포에서 감소하였고, 이는 온-EGFRi 환자 종양 샘플에 반영된 경향이다. (도 18c) EGFRi-처리된 H1975 및 H1299 세포주에서 유전자 발현 경로 변화. H1975 세포에서, HLA 발현, STAT 신호전달, TRAIL 신호전달, 세포자멸사, TNF-알파 신호전달 및 NF-카파B 신호전달이 상향 조절되었으며; EGFR 신호전달, MAPK 신호전달, PI3K 신호전달, 세포 주기, MYC 신호전달 및 EMT 특징은 24h EGFRi 처리 후 하향 조절되었다. H1299 세포에서, TRAIL 신호전달, 세포자멸사, STAT 신호전달 및 EMT 특징이 상향 조절되었으며; TNF-알파 신호전달, NF카파B 신호전달, HLA 발현, EGFR 신호전달, MAPK 신호전달, PI3K 신호전달, 세포 주기, MYC 신호전달은 24h EGFRi 처리 후 하향조절되었다. (도 18b) EGFRi는 H1975 세포에서 항원 제시 및 면역 세포 수송과 연관된 면역 관련 유전자의 발현을 상향조절하였다. (도 18d) H1975 세포(원) 및 H1299 세포(사각형)의 EGFRi 처리는 TRAIL 신호전달과 연관된 유전자를 상향조절하면서 EGFR 신호전달 및 증식 속도와 연관된 유전자를 하향조절하였다. (도 18f 및 18g) H1975 세포 상등액의 루미넥스(Luminex) 분석은 단백질 수준에서 10개의 케모카인 및 사이토카인의 변화를 확인하였다. 대조군과 비교하여 통계학적 비교를 측정하였다. (도 18h) 이동 분석은 H1975 세포의 EGFRi 처리가 PBMC 단핵세포 및 CD4+ T 세포, 및 활성화된 CD8+ 종양 침윤 림프구(TIL)의, H1975 세포 상등액을 향한 이동을 보여주었다. (도 18i) HLA 부류 I 표면 발현은 EGFRi 처리 후 H1975 세포에서 증가하였지만 H1299 세포에서는 증가하지 않았다. (도 18j) 종양 항원-특이성 CD8+ T 세포는 처리되지 않은 세포와 비교하여 EGFRi-처리된 H1975 세포 상의 동족 항원의 인식에 반응하여 유의하게 증가된 IFN-γ 분비를 나타내었다. (도 18e) on-EGFRi 치료를 받은 환자는 EGFRi-처리된 H1975 세포와 유사한 EGFR 신호전달, 증식 속도 및 TRAIL 신호전달 변화를 나타내었다. (도 18k 및 18l) 환자 종양 시편의 면역 세포 함량은 면역 세포-유형 특이성 유전자 발현을 고려하는 방법(방법)을 사용하여 RNAseq 데이터로부터 추론되었다. (도 18m) EGFRi 처리가 종양 부위에서 면역 세포 수송 및 T 세포 활성화를 향상시키기 위해 PPV와 어떻게 상승작용 효과를 낼 수 있는지 설명하기 위해 제안된 기계론적 모델. 양측 독립표본 t 검정 또는 만-휘트니 U 검정을 사용하여 그룹 간의 통계학적 유의수준을 분석하였다. P<0.05는 유의하게 상이한 것으로 간주되었다. *, P<0.05; **, P<0.01.
I. 본 발명
일부 태양에서, HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II 분자에 의해 인식되고 이들에 결합하는, 돌연변이된 EGFR 신생항원으로부터 유래된 펩타이드를 제공한다. 특히, 주어진 EGFR 돌연변이 암을 갖는 암 환자에 의해 특이성 HLA 분자 담체에 결합하는 것으로 예측되는 펩타이드가 식별된다. 이러한 펩타이드, 또는 이와 같은 펩타이드의 칵테일(예를 들어 HLA 부류 I 및 HLA 부류 II-결합 펩타이드 모두 포함)을 사용하여 EGFR 돌연변이 암에 대한 유효 면역 반응을 자극할 수 있다. 따라서, 이와 같은 펩타이드 및 펩타이드 칵테일을 대상에게 직접 투여하여 폐암과 같은 EGFR-돌연변이 암을 갖는 대상에서 생체내 면역 반응을 시뮬레이션할 수 있다. 대안적으로, 상기 실시태양의 펩타이드를 사용하여 항암 면역요법 조성물에 사용하기 위한 면역 효과기 세포(예를 들어 T 세포)를 생체외에서 활성화하고 확대시킬 수 있다.
II. 정의
본원에 사용되는 바와 같이, 명시된 성분과 관련하여 "본질적으로 없는"은 명시된 성분 중 어느 것도 조성물로 의도적으로 제형화되지 않았거나 및/또는 오염 물질로서 또는 미량으로만 존재한다는 것을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 따라서 조성물의 임의의 의도하지 않은 오염으로부터 발생하는 명시된 성분의 총량은 0.01% 미만이다. 가장 바람직한 것은 상기 명시된 성분의 양이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에서 청구항(들)에 사용되는 바와 같이, "하나의"라는 단어는 "포함하는"이라는 단어와 함께 사용될 때, 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
청구항에서 "또는"이란 용어의 사용은, 단지 대안만을 지칭하도록 명시적으로 나타내지 않거나 또는 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하지만, 본 개시내용은 단지 대안 및 "및/또는"만을 지칭하는 정의를 지지한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "또 다른"은 적어도 두 번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본원 전체를 통해서, "약"이란 용어는 값이 장치에 대한 고유한 오차의 변동, 값을 측정하기 위해 사용되는 방법, 또는 연구 대상 사이에 존재하는 변동을 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
"치료" 및 "치료하는"은 질병 또는 건강-관련 상태의 치료학적 이득을 얻을 목적으로 대상에 대한 치료제의 투여 또는 적용 또는 대상에 대한 절차 또는 양식의 수행을 지칭한다. 예를 들어, 치료에는 T 세포 요법의 투여가 포함될 수 있다.
"대상" 및 "환자"는 인간 또는 비-인간, 예를 들어 영장류, 포유동물 및 척추동물을 지칭하는데 호환가능하게 사용된다. 특정한 실시태양에서, 상기 대상은 인간이다.
본원 전체를 통해 사용되는 바와 같은 "치료학적 이득" 또는 "치료학적으로 유효한"이란 용어는 상태의 의학적 치료에 관하여 대상의 안녕을 증대시키거나 향상시키는 어떤 것을 지칭한다. 여기에는 비제한적으로 질병의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소가 포함된다. 예를 들어, 암 치료는 예를 들어 종양 크기의 감소, 종양 침습성의 감소, 암 성장 속도의 감소, 또는 전이의 예방을 수반할 수 있다. 암 치료는 또한 암이 있는 대상의 생존을 연장시킴을 지칭할 수 있다.
"항암"제는 예를 들어 암세포의 사멸을 촉진하거나, 암세포의 세포자멸사를 유도하거나, 암세포의 성장 속도를 감소시키거나, 전이의 발생률 또는 수를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양 또는 암세포로의 혈액 공급을 감소시키거나, 암세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진하거나, 암의 진행을 예방 또는 억제하거나, 암이 있는 대상의 수명을 증가시킴으로써, 대상에서 암세포/종양에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다.
본원에서 "항체"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 구체적으로 단클론 항체(완전길이 단클론 항체 포함), 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 목적하는 생물 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다.
"약학적으로 또는 약물학적으로 허용가능한"이란 어구는 동물, 예를 들어 인간에게 적합하게 투여될 때, 불리한 반응, 알러지 또는 다른 뜻밖의 반응을 생성시키지 않는 분자 개체 및 조성물을 지칭한다. 항체 또는 추가적인 활성 성분을 포함하는 약학 조성물의 제조는 본 개시내용에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 더욱이, 동물(예를 들어 인간) 투여의 경우, 제제는 FDA 생물 표준 관청에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성, 및 순도 표준을 충족시켜야 함을 이해할 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 모든 수성 용매(예를 들어 수, 알콜/수용액, 염수 용액, 비경구 비히클, 예를 들어 염화 나트륨, 링거 덱스트로스 등), 비-수성 용매(예를 들어 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸올리에이트), 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 보존제(예를 들어 항균 또는 항진균제, 산화방지제, 킬레이트제, 및 불활성 기체), 등장화제, 흡수 지연제, 염, 약물, 약물 안정제, 젤, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 유체 및 영양 보충제, 당업자에게 공지된 바와 같은 이와 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함한다. 약학 조성물 중의 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 주지된 매개변수에 따라 조절된다.
"단위 용량" 또는 "투여량"이란 용어는 대상에서 사용하기에 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 각 단위는 투여와 관련하여, 즉 적합한 경로 및 치료 섭생과 관련하여, 상기에서 논의된 목적하는 반응을 생성시키도록 계산된 미리결정된 양의 치료학적 조성물을 함유한다. 치료의 수 및 단위 용량 모두에 따라, 투여되는 양은 목적하는 효과에 의존한다. 환자 또는 대상에게 투여되는 본 실시태양의 조성물의 실제 투여량은 신체적 및 생리학적 인자, 예를 들어 대상의 체중, 연령, 건강 및 성별, 치료되는 질병의 유형, 질병 침투 정도, 이전의 또는 동반되는 치료학적 중재, 환자의 특발증, 투여 경로, 및 특정 치료 물질의 효능, 안정성 및 독성에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 투여당 약 1 ㎍/㎏/체중 내지 약 1000 ㎎/㎏/체중(이와 같은 범위는 사이의 용량을 포함한다) 이상, 및 이 중에서 추론될 수 있는 임의의 범위를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 나열된 숫자로부터 추론될 수 있는 범위의 비제한적인 예에서, 약 5 ㎍/㎏/체중 내지 약 100 ㎎/㎏/체중, 약 5 ㎍/㎏/체중 내지 약 500 ㎎/㎏/체중 등을 투여할 수 있다. 투여를 담당하는 의사는 어쨌든 조성물 중의 활성 성분(들)의 농도 및 개별 대상에 대한 적합한 용량(들)을 결정할 것이다. 일부 실시태양에서, 항원-특이성 T 세포 주입의 투여량은 약 1억 내지 약 300억 개의 세포, 예를 들어, 100억, 150억 또는 200억 개의 세포를 포함할 수 있다.
"면역관문"이란 용어는 면역 반응의 균형을 위해 성분에 신호를 제공하는 면역계 중의 단백질과 같은 분자를 지칭한다. 공지된 면역관문 단백질은 CTLA-4, PD1 및 그의 리간드 PD-L1 및 PD-L2 및 추가로 LAG-3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, KIR을 포함한다. LAG3, BTLA, B7H3, B7H4, TIM3, 및 KIR을 수반하는 경로는 당해 분야에서 CTLA-4 및 PD-1 의존성 경로와 유사한 면역관문 경로를 구성하는 것으로 인식된다(예를 들어 문헌[Pardoll, 2012]; 문헌[Mellman et al., 2011]을 참조하시오).
"면역관문 억제제"는 면역관문 단백질의 기능을 억제하는 임의의 화합물을 지칭한다. 억제는 기능의 감소 및 전적인 차단을 포함한다. 특히, 면역관문 단백질은 인간 면역관문 단백질이다. 따라서, 면역관문 단백질 억제제는 특히 인간 면역관문 단백질의 억제제이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "보호 면역 반응"은 암에 대한 포유동물 숙주의 면역계에 의한 반응을 지칭한다. 보호 면역 반응은 암 치료를 위한 치료학적 효과, 예를 들어 종양 크기 감소 또는 생존 증가를 제공할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원"이란 용어는 항체 또는 T 세포 수용체에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 항원은 일반적으로 B 및/또는 T 림프구의 생성으로 이어지는 체액 면역 반응 및/또는 세포 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다.
"종양-관련 항원", "종양 항원" 및 "암세포 항원"이란 용어는 본원에서 호환가능하게 사용된다. 각각의 경우에, 상기 용어들은 암세포에 의해 특이적으로 또는 우선적으로 발현되는 단백질, 당단백질 또는 탄수화물을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "키메라 항원 수용체(CAR)"란 용어는 예를 들어 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 또는 키메라 면역수용체를 지칭할 수 있으며, 특정 면역 효과기 세포상에 인공적인 특이성을 접목시키는 조작된 수용체를 포함한다. CAR을 사용하여 T 세포상에 단클론 항체의 특이성을 부여함으로써, 예를 들어 입양 세포 요법에 사용하기 위해, 다수의 특이성 T 세포가 생성되게 할 수 있다. 특정한 실시태양에서, CAR은 세포의 특이성을 예를 들어 종양 관련 항원을 향하게 한다. 일부 실시태양에서, CAR은 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인, 및 종양 관련 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 특정 태양에서, CAR은 CD3-제타에 융합된 단클론 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv)의 융합물, 막관통 도메인 및 엔도도메인을 포함한다. 다른 CAR 설계의 특이성은 수용체의 리간드(예를 들어 펩타이드)로부터 또는 패턴-인식 수용체, 예를 들어 덱틴으로부터 유래될 수 있다. 몇몇 경우에, 항원-인식 도메인의 간격을 조정하여 활성화-유도된 세포사를 줄일 수 있다. 몇몇 경우에, CAR은 추가적인 보조-자극성 신호전달을 위한 도메인, 예를 들어 CD3ζ, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10, 및/또는 OX40을 포함한다. 일부의 경우에, 분자는 보조-자극 분자, 영상화(예를 들어 양전자 방출 단충촬영)를 위한 리포터 유전자, 전구약물 첨가시 T 세포를 조건적으로 제거하는 유전자 산물, 귀소 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 및 사이토카인 수용체를 포함하여, CAR과 공-발현될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역(또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은, 또 다른 서열에 대해 일정한 백분율(예를 들어 80%, 85%, 90%, 또는 95%)의 "서열 일치성" 또는 "상동성"을 갖고, 이는 정렬시 염기(또는 아미노산)의 백분율이 2개 서열의 비교에서 동일함을 의미한다. 이러한 정렬 및 상동성 퍼센트 또는 서열 일치성은 당해 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직하게, 디폴트 매개변수가 정렬에 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 매개변수를 사용하는 BLAST이다. 특히 바람직한 프로그램은 하기의 디폴트 매개변수를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전 암호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 기재 = 50개 서열; 분류 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-중복, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 번역+SwissProtein+SPupdate+PIR.
III. EGFR 돌연변이 펩타이드
본 개시내용의 실시태양은 종양 항원-특이성 펩타이드, 예를 들어 돌연변이 EGFR 서열을 포함하는 EGFR 펩타이드(예를 들어 야생형 EGR 서열에 비해 삽입, 치환 또는 결실을 갖는 펩타이드)에 관한 것이다. 특정한 실시태양에서, 상기 종양 항원-특이성 펩타이드는 EGFR 돌연변이 펩타이드의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 태양에서, 상기 펩타이드는 길이가 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 또는 15 아미노산 이하이다. 몇몇 태양에서, 이와 같이 표 1-3의 펩타이드 중 어느 하나를 비-EGFR 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(즉 이종 폴리펩타이드)에 융합시킨다. 일부 태양에서 상기 종양 항원-특이성 펩타이드는 표 1-3의 펩타이드의 펩타이드 서열, 또는 표 1-3의 서열에 상응하지만 표 1-3의 서열에 비해 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 퍼센트 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "펩타이드"란 용어는 7-35 아미노산, 바람직하게는 8-35 아미노산 잔기, 및 훨씬 더 바람직하게는 8-25 아미노산, 또는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35 아미노산의 길이, 또는 이 중에서 추론될 수 있는 임의의 범위의 길이인 아미노산을 포함하는 아미노산 쇄를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 EGFR 돌연변이 펩타이드는 일부 실시태양에서 표 1-3의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다. 본원에 사용되는 바와 같이, "항원성 펩타이드"는 척추동물에 도입시, 상기 척추동물에서 항체의 생산을 자극할 수 있는, 즉 항원성인 펩타이드이며, 여기서 상기 항체는 상기 항원성 펩타이드를 선택적으로 인식하고/하거나 이에 결합할 수 있다. 항원성 펩타이드는 면역반응성 EGFR 돌연변이 펩타이드를 포함할 수 있으며 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 상기 추가적인 서열은 고유 항원으로부터 유래할 수 있으며 이종일 수 있고, 이와 같은 서열은, 필요하지는 않지만, 면역원성일 수 있다. 일부 실시태양에서, 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)는 특정한 HLA 부류 I 또는 HLA 부류 II 복합체와 선택적으로 결합할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 EGFR 돌연변이 펩타이드는 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35 아미노산, 또는 이 중에서 추론될 수 있는 임의의 범위이다. 바람직하게, 상기 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)는 길이가 8 내지 35 아미노산이다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)는 길이가 8 내지 10 아미노산이다.
당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, MHC 분자는 다양한 크기의 펩타이드에 결합할 수 있으나, 전형적으로는 완전길이 단백질에는 결합할 수 없다. MHC 부류 I 분자는 전통적으로 8-11개의 아미노산 길이의 펩타이드에 결합하는 것으로 기재되어 왔지만, 15 아미노산 길이의 펩타이드가 결합 부위의 중앙에서 팽창하거나 MHC 부류 I 결합 홈 밖으로 연장됨으로써 MHC 부류 I 분자에 결합할 수 있는 것으로 나타났다(문헌[Guo et al., 1992]; 문헌[Burrows et al., 2006]; 문헌[Samino et al., 2006]; 문헌[Stryhn et al., 2000]; 문헌[Collins et al., 1994]; 문헌[Blanchard and Shastri, 2008]). 더욱이, 최근의 연구는 또한 보다 긴 펩타이드가 항원-제시 세포에 의해 더 효율적으로 세포내도입되고, 처리되고, 제시될 수 있음을 입증하였다(문헌[Zwaveling et al., 2002]; 문헌[Bijker et al., 2007]; 문헌[Melief and van der Burg, 2008]; 문헌[Quintarelli et al., 2011]). 문헌[Zwaveling et al. (2002)]에 입증된 바와 같이, 최대 35 아미노산 길이의 펩타이드를 사용하여 부류 II MHC에 선택적으로 결합할 수 있으며 이는 유효하다. 당업자에 의해 즉각적으로 이해될 수 있는 바와 같이, 천연 완전길이 종양 항원, 예를 들어 돌연변이 EGFR은, 세포내도입되고 T 세포의 증식을 생성하도록 부류 II MHC에 선택적으로 결합하는데 유용하지 않을 것이다. 일반적으로, 천연 완전길이 종양 항원 단백질은 이러한 성질을 나타내지 않으므로 이러한 면역요법 목적에 유용하지 않을 것이다.
몇몇 실시태양에서, 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)는 면역원성 또는 항원성이다. 하기의 실시예에 나타내는 바와 같이, 본 개시내용의 다양한 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)는 T 세포의 증식을 촉진할 수 있다. 이와 같은 펩타이드는 어느 정도의 보호 면역성을 유도하는데 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)는 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 정제된 펩타이드, 고정화된 펩타이드, 검출가능하게 표지된 펩타이드, 캡슐화된 펩타이드, 또는 벡터-발현된 펩타이드(예를 들어 핵산에 작동적으로 연결된 이종 프로모터를 포함하는 벡터 중의 핵산에 의해 암호화된 펩타이드)일 수 있다. 일부 실시태양에서, 합성 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)를 대상, 예를 들어 인간 환자에게 투여하여, 상기 대상에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 합성 펩타이드는 재조합 발현된 펩타이드에 비해, 몇몇 장점, 예를 들어 감소된 세균 오염 위험을 나타낼 수 있다. 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)는 또한 포유동물 또는 인간 대상에게 투여하기 위해 제형화된 약학 조성물, 예를 들어 백신 조성물에 포함될 수 있다.
A. HLA 부류 I 및 II 라이브러리 펩타이드 선택을 위한 예시적 과정
하기 표 1은 특정한 HLA 부류 I 복합체에 결합하는 것으로 예측된 EGFR 돌연변이 펩타이드의 최종 펩타이드 조성물의 예를 나타낸다. 이 펩타이드는 예측된 결합 특징에 기반하여 등급화되었다. 이 경우에, 예시적인 환자는 L858R 돌연변이 및 2개의 상이한 특정한 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자를 갖는다.
HLA 부류 I 펩타이드를 선택하기 위한 예시적인 과정(HLA 부류 II 펩타이드는 동일한 과정을 사용하여 선택될 수 있다):
1. 환자의 종양을 유전학적으로 분석하여 상기 종양이 EGFR 돌연변이를 갖는지를 결정한다.
2. 환자의 HLA 부류 I 및 HLA 부류 II 유형분석을 수행하여 이들이 발현하는 HLA 분자를 결정한다.
3. 환자가 EGFR 돌연변이를 포함하는 경우, EGFR 돌연변이를 포함하는 펩타이드가 HLA 부류 I 또는 HLA 부류 II 분자에 결합할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 HLA 펩타이드 결합 예측을 수행한다. 가장 널리 퍼진 상위 20개 EGFR 돌연변이의 경우, 상기 예측된 펩타이드가, 포함된 표에 나열되어 있다.
4. 표 1의 환자 예: EGFR 서열분석은 환자가 L858R EGFR 돌연변이를 갖고 HLA 부류 I 유형분석이 HLA-A*0101, A*0301, B*0702, B*4601, C*0102 및 C*0701임을 나타내었다.
5. 특정 펩타이드 목록(표 2 및 3 참조)에서, 해당 6가지 HLA 유형에 대해 나열된 모든 펩타이드를 수득하고 이를 하나의 목록으로 합한다.
6. 다음과 같이 예측된 친화도(nM) 및 예측된 백분위수에 따라 펩타이드를 개별적으로 채점한다:
친화도 순위: 우선순위 점수
<1000 nM 높은 우선순위 3 점
1001 - 5000 nM 중간 2 점
5001 - 12000 nM 낮음 1 점
>12001 nM 매우 낮음 0 점
백분위수 순위:
<1.0 높은 우선순위 3 점
1.0 - 3.0 중간 2 점
3.0 - 7.0 낮음 1 점
>7.0 매우 낮음 0 점
7. 친화도 점수(최대 = 3) 및 백분위수 점수(최대 = 3)를 합산하여 각 펩타이드에 대한 최종 총점을 획득한다(최대 총점 = 6).
8. 총점에 따라 펩타이드의 순위를 매긴다.
9. 총점이 가장 높은 펩타이드가 면역원성 조성물(백신)에 포함되도록 우선 순위를 지정한다.
HLA 부류 I 라이브러리는 상위 20개 EGFR 돌연변이를 포함하고 EGFRmut 환자의 약 95%를 포함한다(하기 표 2 참조). 이 라이브러리에는 342개의 돌연변이-특이성 펩타이드와 2개의 돌연변이에 의해 공유되는 16개의 펩타이드를 포함하여 총 364개의 EGFR 돌연변이 펩타이드가 존재한다. 이 라이브러리는 100개의 HLA 부류 I 알로타입(HLA-A, 30; HLA-B, 48; 및 HLA-C, 22)을 함유한다.
HLA 부류 II 라이브러리는 상위 20개 EGFR 돌연변이를 포함하고 이 라이브러리 중에 총 429개의 EGFR 돌연변이 펩타이드를 함유한다(하기 표 3 참조). 상기 상위 20개 EFGR 돌연변이는 A763_Y764insFQEA, D770_N771insSVD, E746_A750del, E746_S752del>V, G719A, G719C, G719S, H773_V774insH, I744_K745insKIPVAI, L747_A750del>P, L747_P753del>S, L747_S752del, L747_T751del, L747_T751del>P, L858R, L861Q, P772_H773insPR, S768I, T790M, 및 V769_D770insASV이다.
[표 1]
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[표 2]
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[표 3]
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B. 세포 침투 펩타이드
일부 실시태양에서, 면역요법은 세포 침투제, 예를 들어 리포솜 또는 세포 침투 펩타이드(CPP)와 연관된, 본 개시내용의 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)를 활용할 수 있다. 펩타이드로 펄스화된 항원 제시 세포(예를 들어 수지상 세포)를 사용하여 항종양 면역성을 향상시킬 수 있다(문헌[Celluzzi et al., 1996]; 문헌[Young et al., 1996]). 리포솜 및 CPP는 하기에 더욱 상세히 기재된다. 일부 실시태양에서, 면역요법은 본 개시내용의 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)를 암호화하는 핵산을 활용할 수 있으며, 여기서 상기 핵산은 예를 들어 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터에서 전달된다.
종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)는 또한 세포 침투 펩타이드(CPP)와 회합되거나 이에 공유 결합될 수 있다. 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)에 공유 결합될 수 있는 세포 침투 펩타이드는 예를 들어 HIV Tat, 헤르페스 바이러스 VP22, 드로소필라(Drosophila) 안테나페디아 호메오박스 유전자 산물, 신호 서열, 융합 서열, 또는 프로테그린 I를 포함한다. 펩타이드를 CPP에 공유 결합시키면 수지상 세포에 의한 펩타이드의 제시가 연장되어, 항종양 면역성을 향상시킬 수 있다(문헌[Wang and Wang, 2002]). 일부 실시태양에서, 본 개시내용의 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)(예를 들어 펩타이드 또는 폴리에피토프 스트링내에 포함된)를 CPP에 공유 결합시켜(예를 들어 펩타이드 결합을 통해) 융합 단백질을 생성시킬 수 있다. 다른 실시태양에서, 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드) 또는 종양 항원-특이성 펩타이드를 암호화하는 핵산을 리포솜, 예를 들어 다층, 소포, 또는 다중소포 리포솜, 세포외 소포 또는 엑소솜내에 캡슐화하거나 또는 이들과 회합시킬 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "회합"은 물리적 회합, 화학적 회합, 또는 이 둘 모두를 의미한다. 예를 들어, 회합은 공유 결합, 소수성 상호작용, 캡슐화, 표면 흡착 등을 수반할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포 침투제"는 항원 제시 세포로의 펩타이드/폴리에피토프 스트링의 세포내 전달을 향상시키는 조성물 또는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 세포 침투제는 펩타이드와 회합시 원형질막을 횡단하는 상기 펩타이드의 능력을 향상시키는 지질일 수 있다. 대안적으로, 상기 세포 침투제는 펩타이드일 수 있다. 세포 침투 펩타이드(CPP)는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 HIV의 Tat 단백질(문헌[Frankel and Pabo, 1988]), HSV의 VP22 단백질(문헌[Elliott and O'Hare, 1997]) 및 섬유아세포 성장인자(문헌[Lin et al., 1995])를 포함한다.
세포-침투 펩타이드(또는 "단백질 형질도입 도메인")는 드로소필라 안테나페디아 호메오박스 유전자(Antp), HIV Tat 및 헤르페스 바이러스 VP22(이들은 모두 아르기닌 및 리신 잔기가 풍부한 양으로 하전된 도메인을 함유한다)의 제3 나선으로부터 확인되었다(문헌[Schwarze et al., 2000]; 문헌[Schwarze et al., 1999]). 또한, 신호 서열로부터 유래된 소수성 펩타이드는 세포-침투 펩타이드로서 확인되었다(문헌[Rojas et al., 1996]; 문헌[Rojas et al., 1998]; 문헌[Du et al., 1998]). 이들 펩타이드를 β-갈락토시다제와 같은 마커 단백질에 커플링시키면 상기 마커 단백질의 세포내로의 효율적인 내면화를 부여하는 것으로 나타났으며, 이들 펩타이드를 함유하는 키메라, 인-프레임 융합 단백질은 시험관내 및 생체내 모두에서 광범위한 세포 유형으로 단백질을 전달하는데 사용되어 왔다(문헌[Drin et al., 2002]). 본 개시내용에 따른 이러한 세포 침투 펩타이드의 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)에의 융합은 폴리펩타이드의 세포 흡수를 향상시킬 수 있다.
일부 실시태양에서, 세포 흡수는 지질, 예를 들어 스테아레이트 또는 마이리스틸레이트의 폴리펩타이드에의 부착에 의해 촉진된다. 지질화는 세포내로의 펩타이드의 통과를 향상시키는 것으로 나타났다. 지질 모이어티의 부착은 본 개시내용이 세포에 의한 폴리펩타이드 흡수를 증가시키는 또 다른 방식이다. 세포 흡수를 하기에 추가로 논의한다.
본 개시내용의 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)를 리포솜 백신 조성물에 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 리포솜 조성물은 단백질리포솜 조성물이거나 이를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 사용될 수 있는 단백질리포솜 조성물의 생성 방법은 예를 들어 문헌[Neelapu et al. (2007)] 및 [Popescu et al. (2007)]에 기재되어 있다. 일부 실시태양에서, 단백질리포솜 조성물은 흑색종의 치료에 사용될 수 있다.
종양 항원-특이성 폴리펩타이드의 흡수를 향상시킴으로써, 치료에 필요한 단백질 또는 펩타이드의 양을 감소시키는 것이 가능할 수 있다. 이는 차례로 치료 비용을 현저하게 줄이고 치료제의 공급을 증가시킬 수 있다. 보다 낮은 투여량은 또한 펩타이드의 잠재적인 면역원성을 최소화하고 독성 부작용을 제한할 수 있다.
일부 실시태양에서, 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)를 나노입자와 회합시켜 나노입자-폴리펩타이드 복합체를 형성시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 나노입자는 리포솜 또는 다른 지질-기반 나노입자, 예를 들어 지질-기반 소포(예를 들어 DOTAP:콜레스테롤 소포)이다. 다른 실시태양에서, 상기 나노입자는 철-산화물 기반 초상자성 나노입자이다. 약 10 내지 100 ㎚ 직경 범위의 초상자성 나노입자는 비장에 의한 봉쇄를 피하기에 충분히 작지만, 간에 의한 제거를 피하기에는 충분히 크다. 이러한 크기의 입자는 매우 작은 모세관을 침투할 수 있으며 체 조직에 유효하게 분포될 수 있다. 초상자성 나노입자-폴리펩타이드 복합체는 MRI 콘스라스트제로서 사용되어 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)를 흡수하는 세포를 확인하고 추적할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 나노입자는 반도체 나노결정 또는 반도체 양자점이며, 이 둘은 모두 광학 영상화에 사용될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 나노입자는 나노쉘일 수 있으며, 이는 실리카 코어 위에 골드 층을 포함한다. 나노쉘의 한 가지 장점은 폴리펩타이드를 표준 화학을 사용하여 골드 층에 접합시킬 수 있다는 것이다. 다른 실시태양에서, 상기 나노입자는 풀러렌 또는 나노튜브일 수 있다(문헌[Gupta et al., 2005]).
펩타이드는 신장에 의해 순환으로부터 빠르게 제거되며 혈청 중 프로테아제에 의한 분해에 민감하다. 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)를 나노입자와 회합시킴으로써, 본 개시내용의 나노입자-폴리펩타이드 복합체는 신장에 의한 분해를 보호하고/하거나 제거를 감소시킬 수 있다. 이는 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시켜, 유효 치료법에 필요한 폴리펩타이드 용량을 줄일 수 있다. 더욱이, 이는 치료 비용을 감소시킬 수 있으며, 치료법의 면역학적 문제와 독성 반응을 최소화한다.
C. 폴리에피토프 스트링
일부 실시태양에서, 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)는 폴리에피토프 스트링에 포함된다. 폴리에피토프 스트링은 함께 연결된 하나 이상의 항원으로부터 다수의 항원성 에피토프를 함유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드이다. 폴리에피토프 스트링을 사용하여 대상, 예를 들어 인간 대상에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 폴리에피토프 스트링은 앞서 말라리아 및 다른 병원체를 표적화하는데 사용되었다(문헌[Baraldo et al., 2005]; 문헌[Moorthy et al., 2004]; 문헌[Baird et al., 2004]). 폴리에피토프 스트링은 핵산(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드를 포함하는 다수의 항원을 암호화하는 핵산) 또는 펩타이드 또는 폴리펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드를 포함하는 다수의 항원을 함유하는)를 지칭할 수 있다. 폴리에피토프 스트링은 암 백신 조성물에 포함될 수 있다.
D. 생물학적 기능성 균등물
본 개시내용의 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)를, HLA 부류 단백질, 예를 들어 HLA-A*0101, 결합 영역과의 각각의 상호작용을 변경시키지 않는 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 함유하도록 변형할 수 있다. 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)의 이와 같은 생물학적 기능성 균등물은 유사하거나 또는 달리 바람직한 특징, 예를 들어 특정한 HLA 부류 I 또는 HLA 부류 II 복합체의 결합을 갖는 분자일 수 있다. 비제한적인 예로서, 몇몇 아미노산을, HLA에 대한 검출가능하게 변하지 않은 펩타이드 결합에 의해 입증된 바와 같이, 상호작용 능력의 인지할 정도의 상실 없이 본원에 개시된 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드) 중의 다른 아미노산 대신 치환할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 종양 항원-특이성 펩타이드는 앵커 잔기에 치환 돌연변이, 예를 들어 위치: 1(P1), 2(P2) 및/또는 9(P9) 중 1, 2개 또는 전부에 치환 돌연변이를 갖는다. 따라서, 서열 및/또는 구조가 변형되지만, 생물학적 유용성 또는 활성은 변하지 않는 본원에 개시된 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)(또는 이와 같은 펩타이드를 암호화하는 핵산)는 여전히 본원에 개시된 조성물 및 방법의 범위내에 있다.
또한, 당업자는 생물학적으로 기능상 균등한 펩타이드의 정의에, 허용가능한 수준의 균등한 생물 활성을 여전히 유지하면서 상기 분자의 한정된 부분내에서 이루어질 수 있는 변화의 수에 대한 제한이 존재한다는 개념이 내재되어 있음을 충분히 이해한다. 따라서, 생물학적으로 기능상 균등한 펩타이드는 본원에서 아미노산 중 일부(대부분이나 전부는 아닌)가 치환될 수 있는 펩타이드로서 정의된다. 물론, 상이한 치환을 갖는 다수의 별개의 펩타이드가 본 개시내용에 따라 쉽게 제조되고 사용될 수 있다.
당업자는 또한, 몇몇 잔기, 예를 들어 특정 에피토프 중의 잔기가 펩타이드의 생물학적 또는 구조적 성질에 특히 중요한 것으로 입증된 경우, 이와 같은 잔기는 일반적으로 교환될 수 없음을 안다. 이는 본 개시내용에서, 본원에 개시된 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드) 중의 돌연변이가 종-특이성의 상실을 초래할 수 있고 차례로 본 개시내용의 방법에 사용하기 위한, 생성되는 펩타이드의 유용성을 감소시킬 수 있는 경우일 수 있다. 따라서, 항원성이고(예를 들어 HLA 부류 I 또는 HLA 부류 II 복합체에 특이적으로 결합하고) 보존적 아미노산 치환을 포함하는 펩타이드는 본 개시내용에 포함되는 것으로 이해된다. 보존적 치환은 단백질의 활성을 극적으로 변경시킬 가능성이 가장 적다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 교체하는 것, 즉 비극성 아미노산을 다른 비극성 아미노산으로 교체하는 것; 극성 아미노산의 다른 극성 아미노산에 의한 치환, 산성 잔기의 다른 산성 아미노산에 의한 치환 등을 지칭한다.
본원에 개시된 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)의 변형에 사용될 수 있는 바와 같은 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적인 유사성, 예를 들어 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기반한다. 아미노산 측쇄 치환체의 크기, 모양 및 유형의 분석은 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 모두 양으로 하전된 잔기이고; 알라닌, 글리신 및 세린이 모두 유사한 크기이고; 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신이 모두 일반적으로 유사한 모양임을 설명한다. 따라서, 이러한 고려사항에 기반하여; 아르기닌, 리신 및 히스티딘; 알라닌, 글리신 및 세린; 및 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 본원에서 생물학적 기능성 균등물로서 정의된다. 일부 실시태양에서, 상기 돌연변이는 TCR-pMHC 상호작용 및/또는 펩타이드-MHC 결합을 향상시킬 수 있다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)의 동형을 고려한다. 동형은 본 개시내용의 펩타이드와 동일한 수 및 종류의 아미노산을 함유하지만, 분자 구조가 상이하다. 본 개시내용에 의해 고려되는 동형은 본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 펩타이드와 동일한 성질을 갖는 것이다.
비표준 아미노산은 기존 아미노산의 화학적 변형에 의해 또는 본원에 개시된 펩타이드의 신규 합성에 의해 단백질에 통합될 수 있다. 비표준 아미노산은 유전자 암호에 의해 암호화된 20개의 표준 아미노산과 화학 구조가 다른 아미노산을 의미한다.
선택 실시태양에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어, EGFR 돌연변이 펩타이드)의 화학적 유도체를 고려한다. "화학적 유도체"는 기능적 측기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖고 생물학적 활성 및 유용성을 유지하는 펩타이드를 의미한다. 이러한 유도체화된 펩타이드는 예를 들어 특히 유리 아미노기가 유도체화되어 특정 염을 형성하거나 알킬화 및/또는 아실화, p-톨루엔 설포닐기, 카보벤족시기, t-부틸로시카보닐기, 클로로아세틸기, 폼일 또는 아세틸기에 의해 유도체화된 것들을 포함한다. 유리 카복실기는 유도체화되어 유기 또는 무기 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 다른 유형의 에스테르 또는 하이드라지드, 바람직하게는 아미드(1차 또는 2차)를 형성할 수 있다. 화학적 유도체는 20개의 표준 아미노산의 하나 이상의 천연 아미노산 유도체를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 4-하이드록시프롤린은 세린 대신 치환될 수 있고; 오르니틴은 리신 대신 치환될 수 있다.
모든 아미노산 잔기 서열을 본원에서는 아미노-말단에서 카복시-말단으로의 통상적인 방향인 좌측 및 우측 배향을 갖는 화학식으로 나타낸다는 점에 유의해야 한다. 또한, 아미노산 잔기 서열의 시작 또는 단부에 있는 대시는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 서열에 대한 펩타이드 결합을 나타낸다는 점에 유의해야 한다. 본원에 기재된 아미노산은 "L" 이성질체 형태인 것이 바람직하다. 그러나, "D" 이성질체 형태의 잔기는 본원에 제시된 원하는 기능적 특성이 단백질에 의해 유지되는 한, 임의의 L-아미노산 잔기 대신 치환될 수 있다.
바람직한 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어, EGFR 돌연변이 펩타이드) 또는 이의 유사체는 바람직하게는 특정한 HLA 부류 I 또는 HLA 부류 II 복합체에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 특정한 종양 항원-특이성 펩타이드 또는 표지된 펩타이드, 또는 이의 유사체가 특정한 HLA 부류 I 또는 HLA 부류 II 복합체에 결합할 수 있는지의 여부 또는 그 정도를 결정하고 예를 들어 하기와 같은 시험관내 분석, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 면역블럿팅, 면역침전, 방사선면역분석(RIA), 면역염색, 라텍스 응집, 간접 혈구응집 분석(IHA), 보체 고정, 간접 면역형광 분석(FA), 비탁법, 유식 세포측정 분석, 화학발광 분석, 측면 유동 면역분석, u-포획 분석, 질량 분광분석, 입자-기반 분석, 억제 분석 및/또는 결합활성 분석을 사용하여 평가할 수 있다.
E. 종양 항원-특이성 펩타이드를 암호화하는 핵산
하나의 태양에서, 본 개시내용은 표 1-3의 펩타이드 중에서 선택된 펩타이드, 또는 표 1-3의 펩타이드 중에서 선택된 펩타이드와 비교하여 1, 2, 3 또는 4개의 점 돌연변이(예를 들어 치환 돌연변이)를 가질 수 있는 펩타이드에 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 항원-특이성 펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다. 상기에 서술된 바와 같이, 이와 같은 종양 항원-특이성 펩타이드는 예를 들어 8 내지 35 아미노산 길이, 또는 이 중에서 추론할 수 있는 임의의 범위일 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시태양은 특정한 HLA 부류 I 또는 HLA 부류 II 복합체에 특이적으로 결합할 수 있는 재조합적으로-생성된 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)를 제공한다. 상응하게, 종양 항원-특이성 펩타이드를 암호화하는 핵산을 발현 벡터에 작동적으로 연결할 수 있으며 상기 펩타이드를 분자 생물학 분야에 주지된 방법을 사용하여 적합한 발현 시스템에 생성시킬 수 있다. 본원에 개시된 종양 항원-특이성 펩타이드를 암호화하는 핵산을 상기 펩타이드의 양호한 발현을 보장하는 임의의 발현 벡터에 통합시킬 수 있다. 가능한 발현 벡터는, 상기 벡터가 숙주 세포의 형질전환에 적합한 한, 비제한적으로 코스미드, 플라스미드, 또는 변형된 바이러스(예를 들어 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.
"숙주 세포의 형질전환에 적합한" 재조합 발현 벡터는 상기 발현 벡터가 본 개시내용의 핵산 분자 및 발현에 사용되는 숙주 세포를 기반으로 선택된 조절 서열(상기 핵산 분자에 작동적으로 연결된다)을 함유함을 의미한다. "작동적으로 연결된" 또는 "작동 연결된"이란 용어는 호환가능하게 사용되며, 핵산이 상기 핵산의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열에 연결됨을 의미하고자 한다.
상응하게, 본 개시내용은 종양 항원-특이성 펩타이드를 암호화하는 핵산, 및 삽입된 단백질-서열의 전사 및 번역에 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 적합한 조절 서열은 다양한 소스, 예를 들어 세균, 진균 또는 바이러스 유전자로부터 유래될 수 있다(예를 들어 문헌[Goeddel(1990)]에 기재된 조절 서열 참조).
적합한 조절 서열의 선택은 일반적으로, 선택된 숙주 세포에 의존하고, 당업자에 의해 쉽게 수행될 수 있다. 이와 같은 조절 서열의 예는 번역 개시 신호를 포함하여, 전사 프로모터 및 인핸서 또는 RNA 폴리머라제 결합 서열, 리보솜 결합 서열을 포함한다. 추가로, 선택된 숙주 세포 및 사용된 벡터에 따라, 다른 서열, 예를 들어 복제 기원, 추가적인 DNA 제한 부위, 인핸서, 및 전사 유도성을 부여하는 서열을 발현 벡터에 통합시킬 수 있다. 필요한 조절 서열은 고유 단백질 및/또는 그의 측면인접 영역에 의해 공급될 수 있음을 또한 알 것이다.
재조합 발현 벡터는 또한, 본원에 개시된 재조합 종양 항원-특이성 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드)로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포의 선택을 촉진하는 선택성 마커 유전자를 함유할 수 있다. 선택성 마커 유전자의 예는 몇몇 약물, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 또는 개똥벌레 루시페라제에 내성을 부여하는 단백질, 예를 들어 G418 및 하이그로마이신을 암호화하는 유전자이다. 상기 선택성 마커 유전자의 전사는 상기 선택성 마커 단백질, 예를 들어 β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 또는 개똥벌레 루시페라제의 농도 변화에 의해 모니터링된다. 상기 선택성 마커 유전자가 네오마이신 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 경우 형질전환 세포는 G418에 의해 선택될 수 있다. 상기 선택성 마커 유전자가 통합된 세포는 생존하지만 다른 세포는 죽을 것이다. 이러한 마커는 재조합 발현 벡터의 발현의 시각화 및 분석, 및 특히 발현 및 표현형에 대한 돌연변이의 영향 측정을 가능하게 한다. 선택성 마커를 관심 핵산으로부터 별도의 벡터상에 도입시킬 수 있음을 알 것이다.
재조합 발현 벡터를 숙주 세포내에 도입시켜 형질전환 숙주 세포를 생성시킬 수 있다. "형질전환 숙주 세포"란 용어는 본 개시내용의 재조합 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 원핵생물 및 진핵생물 세포를 포함하고자 한다. "~로 형질전환된", "~로 형질감염된", "형질전환" 및 "형질감염"이란 용어는 당해 분야에 공지된 다수의 가능한 기법 중 하나에 의한 세포내로의 핵산(예를 들어 벡터)의 도입을 포함하고자 한다. 적합한 숙주 세포는 광범위하게 다양한 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 단백질을 세균 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 곤충 세포(바큘로바이러스 사용), 효모 세포 또는 포유동물 세포에서 발현시킬 수 있다.
본 개시내용의 핵산 분자를 또한 표준 기법을 사용하여 화학적으로 합성시킬 수 있다. 폴리데옥시-뉴클레오타이드의 다양한 화학 합성 방법, 예를 들어 고상 합성이 공지되어 있으며, 이는 펩타이드 합성과 같이, 상업적으로 입수할 수 있는 DNA 합성기에서 충분히 자동화되었다(예를 들어 미국특허 제4,598,049호; 미국특허 제4,458,066호; 미국특허 제4,401,796호; 및 미국특허 제4,373,071호를 참조하시오).
IV. 항원-특이성 세포 요법
본 개시내용의 실시태양은 항원-특이성 세포(예를 들어 자기유래 또는 동종이계 T 세포(예를 들어 조절성 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 감마-델타 T 세포), NK 세포, 불변 NK 세포, NKT 세포, 중간엽 줄기 세포(MSC), 또는 유도 만능 줄기(iPS) 세포)를 수득하고 대상에게 면역요법으로서 투여하여 암세포를 표적화함에 관한 것이다. 특히, 상기 세포는 항원-특이성 T 세포(예를 들어 돌연변이 EGFR-특이성 T 세포)이다. 기능성 항-종양 효과기 세포의 유도체화, 활성화 및 확대를 위한 다수의 기본적인 접근법이 최근 20년간 기재되었다. 여기에는 자기유래 세포, 예를 들어 종양-침윤성 림프구(TIL); 자기유래 DC, 림프구, 인공 항원-제시 세포(APC) 또는 T 세포 리간드 및 활성화 항체로 코팅된 비드를 사용하여 생체외에서 활성화된 T 세포, 또는 표적 세포막의 포획에 의해 단리된 세포; 항-숙주 종양 T 세포 수용체(TCR)를 자연적으로 발현하는 동종이계 세포; 및 "T-바디"로서 공지된 항체-유사 종양 인식 능력을 나타내는 종양-반응성 TCR 또는 키메라 TCR 분자를 발현하도록 유전자 재프로그램화되거나 "재유도된" 비-종양-특이성 자기유래 또는 동종이계 세포가 포함된다. 이러한 접근법은 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있는 T 세포 제조 및 면역화를 위한 다수의 프로토콜을 생성시켰다.
B. T 세포 제조
일부 실시태양에서, T 세포는 혈액, 골수, 림프, 탯줄, 또는 림프양 기관으로부터 유래된다. 일부 태양에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 상기 세포는 전형적으로 1차 세포, 예를 들어 대상으로부터 직접 단리되고/되거나 대상으로부터 단리되고 동결된 세포이다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 T 세포 또는 다른 세포 유형의 하나 이상의 부분집합, 예를 들어 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 이들의 하위집단, 예를 들어 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 가능성, 확대, 재순환, 국소화, 및/또는 지속 능력, 항원-특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 기관 또는 구획 중의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화 정도에 의해 한정되는 것들을 포함한다. 치료되는 대상을 참조하여, 상기 세포는 동종이계 및/또는 자기유래일 수 있다. 일부 태양에서, 예를 들어 기성품(off-the-shelf) 기술의 경우, 상기 세포는 만능성 및/또는 다능성, 예를 들어 줄기세포, 예를 들어 유도 만능 줄기세포(iPSC)이다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같이 대상으로부터 세포를 단리하고, 제조, 처리, 배양 및/또는 조작하고, 이를 저온보존 전 또는 후에 동일한 환자에 재-도입시킴을 포함한다.
T 세포(예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포)의 하위 유형 및 하위 집단 중에는 미경험 T(TN) 세포, 효과기 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 그의 하위-유형, 예를 들어 줄기세포 기억 T(TSCM), 중심 기억 T(TCM), 효과기 기억 T(TEM), 또는 말단 분화된 효과기 기억 T 세포, 종양-침윤성 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막-연관 불변 T(MAIT) 세포, 천연 및 적응 조절성 T(Treg) 세포, 헬퍼 T 세포, 예를 들어 TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 실시태양에서, 상기 T 세포 집단 중 하나 이상은 특정 마커, 예를 들어 표면 마커에 대해 양성인, 또는 특정 마커에 대해 음성인 세포가 풍부하거나 고갈된다. 일부의 경우에, 이와 같은 마커는 T 세포(예를 들어 비-기억 세포)의 몇몇 집단상에서 존재하지 않거나 비교적 낮은 수준으로 발현되지만 몇몇 다른 T 세포(예를 들어 기억 세포)의 집단상에는 존재하거나 비교적 높은 수준으로 발현되는 것이다.
일부 실시태양에서, T 세포를 비-T 세포, 예를 들어 B 세포, 단핵구, 또는 다른 백혈구, 예를 들어 CD14상에서 발현된 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리시킨다. 일부 태양에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계를 사용하여 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리시킨다. 이와 같은 CD4+ 및 CD8+ 집단을 하나 이상의 미경험, 기억, 및/또는 효과기 T 세포 하위집단상에서 발현되거나 비교적 높은 정도로 발현된 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위-집단으로 추가로 분류할 수 있다.
일부 실시태양에서, CD8+ T 세포는 예를 들어 각각의 하위집단과 연관된 표면 항원에 기반한 양성 또는 음성 선택에 의해 미경험, 중심 기억, 효과기 기억, 및/또는 중심 기억 줄기세포가 추가로 농축되거나 고갈된다. 일부 실시태양에서, 중심 기억 T(TCM) 세포의 농축을 수행하여 효능, 예를 들어 투여에 따른 장기간 생존, 확대 및/또는 생착을 개선시키며, 이는 일부 태양에서 상기와 같은 하위-집단에서 특히 확고하다. 문헌[Terakura et al., 2012]; 문헌[Wang et al., 2012]을 참조하시오.
일부 실시태양에서, T 세포는 자기유래 T 세포이다. 이러한 방법에서, 종양 샘플을 환자로부터 수득하고 단세포 현탁액을 수득한다. 상기 단세포 현탁액을 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 기계적으로(종양을 예를 들어 gentleMACS(상표) 분리기(Dissociator), 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 미국 캘리포니아주 어번 소재) 또는 효소적으로(예를 들어 콜라게나제 또는 DNase) 수득할 수 있다. 종양 효소 절단물의 단-세포 현탁액을 인터류킨-2(IL-2)에서 배양한다. 상기 세포를 합류시까지(예를 들어 약 2x106 림프구), 예를 들어 약 5 내지 약 21일, 바람직하게는 약 10 내지 약 14일까지 배양한다.
상기 배양된 T 세포를 모으고 신속하게 확대시킬 수 있다. 신속한 확대는 약 10 내지 약 14일의 기간에 걸쳐 적어도 약 50배(예를 들어 50-, 60-, 70-, 80-, 90-, 또는 100-배, 또는 그 이상)의 항원-특이성 T 세포 수의 증가를 제공한다. 보다 바람직하게, 신속한 확대는 약 10 내지 약 14일의 기간에 걸쳐 적어도 약 200배(예를 들어 200-, 300-, 400-, 500-, 600-, 700-, 800-, 900-, 또는 그 이상)의 증가를 제공한다.
확대는 당해 분야에 공지된 바와 같은 다수의 방법 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, T 세포를 피더 림프구 및 인터류킨-2(IL-2) 또는 인터류킨-15(IL-15)의 존재하에서(IL-2가 바람직하다) 비-특이성 T 세포 수용체 자극을 사용하여 신속하게 확대시킬 수 있다. 상기 비-특이성 T 세포 수용체 자극은 대략 30 ng/㎖의 OKT3, 마우스 단클론 항-CD3 항체(Ortho-McNeil(등록상표)(미국 뉴저지주 래리턴 소재)로부터 입수할 수 있다)를 포함할 수 있다. 대안적으로, T 세포를 시험관내에서 하나 이상의 암 항원(그의 항원성 부분, 예를 들어 에피토프(들) 또는 세포 포함)에 의한 PBMC의 자극에 의해 신속하게 확대시킬 수 있으며, 상기 항원은 T 세포 성장인자, 예를 들어 300 IU/㎖ IL-2 또는 IL-15(IL-2가 바람직하다)의 존재하에서 벡터, 예를 들어 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2) 결합 펩타이드로부터 임의로 발현될 수 있다. 상기 시험관내-유도된 T 세포는 HLA-A2-발현 항원-제시 세포상에서 펄스화된 동일한 암 항원(들)에 의한 재-자극에 의해 신속하게 확대된다. 대안적으로, 상기 T 세포를 예를 들어, 조사된 자기유래 림프구 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2로 재-자극할 수 있다.
상기 자기유래 T 세포를, 상기 자기유래 T 세포의 성장 및 활성화를 촉진하는 T 세포 성장인자를 발현하도록 변형시킬 수 있다. 적합한 T 세포 성장인자는 예를 들어 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-12를 포함한다. 적합한 변형 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al., 2001]; 및 문헌[Ausubel et al., 1994]을 참조하시오. 특정한 태양에서, 변형된 자기유래 T 세포는 T 세포 성장인자를 높은 수준으로 발현한다. T 세포 성장인자 암호화 서열, 예를 들어 IL-12의 상기 서열을 프로모터로서 당해 분야에서 쉽게 입수할 수 있으며, T 세포 성장인자 암호화 서열에 대한 그의 작동성 연결은 높은-수준 발현을 촉진한다.
C. 항원-제시 세포
대식세포, B 림프구 및 수지상 세포를 포함하는 항원-제시 세포는 그의 특정한 MHC 분자의 발현에 의해 구별된다. APC는 항원을 내면화하고 상기 항원의 일부를, 그의 외부 세포막상의 MHC 분자와 함께 재-발현한다. 주 조직적합성 복합체(MHC)는 다수의 유전자좌를 갖는 큰 유전자 복합체이다. 상기 MHC 유전자좌는 부류 I 및 부류 II MHC라 지칭되는, MHC 막 분자의 2개의 주요 부류를 암호화한다. T 헬퍼 림프구는 일반적으로 MHC 부류 II 분자와 회합된 항원을 인식하고, T 세포독성 림프구는 MHC 부류 I 분자와 회합된 항원을 인식한다. 인간에서 상기 MHC는 HLA 복합체로서 지칭되며 마우스에서는 H-2 복합체라 지칭된다. 일부 태양에서, 상기 실시태양의 EGFR 돌연변이 펩타이드는 항원 제시 세포에서 발현된다. 이와 같은 세포는 관심 돌연변이 EGFR 항원에 특이적인 면역 효과기 세포를 특이적으로 전파하는데 사용될 수 있는 조작된 APC를 제공한다.
일부의 경우에, aAPC는 상기 실시태양의 치료학적 조성물 및 세포 요법 생성물의 제조에 유용하다. 항원-제시 시스템의 제조 및 용도에 관한 일반적인 지침에 대해서, 예를 들어 미국특허 제6,225,042호, 미국특허 제6,355,479호, 미국특허 제6,362,001호, 및 미국특허 제6,790,662호; 미국 특허출원 공보 제2009/0017000호 및 미국 특허출원 공보 제2009/0004142호; 및 국제 공보 제WO2007/103009호를 참조하시오.
aAPC 시스템은 하나 이상의 외인성 보조 분자를 포함할 수 있다. 보조 분자의 임의의 적합한 수 및 조합을 사용할 수 있다. 상기 보조 분자는 보조-자극 분자 및 부착 분자와 같은 보조 분자 중에서 선택될 수 있다. 예시적인 보조-자극 분자는 CD86, CD64 (FcγRI), 41BB 리간드, 및 IL-21을 포함한다. 부착 분자는 탄수화물-결합 당단백질, 예를 들어 셀렉틴, 막관통 결합 당단백질, 예를 들어 인테그린, 칼슘-의존성 단백질, 예를 들어 카데린, 및 단일-통과 막관통 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리 단백질, 예를 들어 세포간 부착 분자(ICAM)(이는 예를 들어 세포-세포 또는 세포-기질 접촉을 촉진한다)를 포함할 수 있다. 예시적인 부착 분자는 LFA-3 및 ICAM, 예를 들어 ICAM-1을 포함한다. 보조-자극 분자 및 부착 분자를 포함하여 예시적인 보조 분자의 선택, 클로닝, 제조 및 발현에 유용한 기법, 방법 및 시약은 예를 들어 미국특허 제6,225,042호, 미국특허 제6,355,479호, 및 미국특허 제6,362,001호에 예시되어 있다.
V. 치료 방법
본원은 개인에게 유효량의 항원-특이성 세포 요법, 예를 들어 돌연변이 EGFR-특이성 T 세포 요법을 투여함을 포함하는, 상기 개인에서 암을 치료하거나 또는 그의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 유전자 조작된 TCR-형질도입된 T 세포(TCR을 다른 생물반응성 단백질(예를 들어 항-CD3)에 접합시킨다)에 의한 입양 T 세포 요법을 또한 본원에서 제공한다. 추가의 실시태양에서, 대상을 정제된 종양 항원 또는 면역우세 종양 항원-특이성 펩타이드로 면역시킴을 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
본원에서 제공된 EGFR 돌연변이 펩타이드를 활용하여 암 백신 또는 면역원(예를 들어 항원보강제, 암호화 폴리뉴클레오타이드 및 상응하는 발현 산물, 예를 들어 불활성 바이러스 또는 다른 미생물 백신과의 펩타이드 또는 변형된 펩타이드 믹스)을 개발할 수 있다. 이러한 펩타이드 특이성 백신 또는 면역원을, 직접 생체내에서 항-종양 면역-반응을 유도하기 위해 암 환자를 면역화하거나, 또는 시험관내에서 항원 특이성 T 세포를 펩타이드 또는 암호화된 폴리뉴클레오타이드 로딩된 APC 자극에 의해 확대하기 위해 사용할 수 있다.
치료에 고려되는 암의 예는 폐암, 두경부암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 골암, 고환암, 자궁경부암, 위장관암, 림프종, 폐의 전-신생물성 병변, 결장암, 흑색종, 방광암을 포함한다.
일부 실시태양에서, T 세포는 자기유래이다. 그러나, 상기 세포는 동종이계일 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 T 세포를 환자 자신으로부터 단리하고, 따라서 상기 세포는 자기유래이다. 상기 T 세포가 동종이계인 경우, 상기 T 세포를 다수의 공여자로부터 모을 수 있다. 상기 세포를 관심 대상에게 치료되는 질병의 증상 및 징후의 억제, 감소 또는 제거에 충분한 양으로 투여한다.
일부 실시태양에서, 상기 대상은 T 세포 요법 전에 비골수파괴성 림프구고갈 화학요법을 투여받을 수 있다. 비골수파괴성 림프구고갈 화학요법은 임의의 적합한 경로로 투여될 수 있는 임의의 적합한 요법일 수 있다. 비골수파괴성 림프구고갈 화학요법은 예를 들어, 특히 암이 전이성일 수 있는 흑색종인 경우 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 투여를 포함할 수 있다. 사이클로포스파미드 및 플루다라빈을 투여하는 예시적인 경로는 정맥내이다. 마찬가지로, 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 적합한 용량을 투여할 수 있다. 특정 태양에서, 약 60 ㎎/㎏의 사이클로포스파미드가 2일 동안 투여된 후 약 25 ㎎/㎡ 플루다라빈이 5일 동안 투여된다.
몇몇 실시태양에서, 자기유래 T 세포의 성장 및 활성화를 촉진하는 T 세포 성장인자를 대상에게, 자기유래 T 세포와 동반하여 또는 자기유래 T 세포에 후속적으로 투여한다. 상기 T 세포 성장인자는 자기유래 T 세포의 성장 및 활성화를 촉진하는 임의의 적합한 성장 인자일 수 있다. 적합한 T 세포 성장인자의 예는 IL-2, IL-7, IL-15, 및 IL-12를 포함하고, 이를 단독으로 또는 다양한 조합으로, 예를 들어 IL-2 및 IL-7, IL-2 및 IL-15, IL-7 및 IL-15, IL-2, IL-7 및 IL-15, IL-12 및 IL-7, IL-12 및 IL-15, 또는 IL-12 및 IL2로 사용할 수 있다. IL-12가 바람직한 T 세포 성장인자이다.
상기 T 세포를 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 안와내, 이식, 흡입, 척추강내, 뇌실내 또는 비내로 투여할 수 있다. T 세포 요법의 적합한 투여량은 치료할 질병의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 개인의 임상 상태, 개인의 임상 병력 및 치료에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 결정될 수 있다.
종양내 주사, 또는 종양 혈관계로의 주사는 별개의, 고형의, 접근가능한 종양에 대해 특별히 고려된다. 국소, 부위 또는 전신 투여가 또한 적합할 수 있다. >4 ㎝ 종양의 경우, 투여되는 부피는 약 4-10 ㎖(특히 10 ㎖)인 반면, <4 ㎝ 종양의 경우에는 약 1-3 ㎖의 부피(특히 3 ㎖)가 사용될 것이다. 단일 용량으로 전달되는 수회 주사는 약 0.1 내지 약 0.5 ㎖ 부피를 포함한다.
B. 약학 조성물
본원은 또한 항원-특이성 면역 세포(예를 들어 T 세포) 또는 수용체(예를 들어 TCR) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물 및 제형을 제공한다. 대상에서 약학적 용도를 위한 백신 조성물은 본원에 개시된 종양 항원 펩타이드(예를 들어 EGFR 돌연변이 펩타이드) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 약학 조성물 및 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분(예를 들어 항체 또는 폴리펩타이드)을 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012])와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 일반적으로 수용자에게 무독성이며, 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 간질성 약물 분산제, 예를 들어 용해성 중성-활성 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 용해성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예를 들어 rHuPH20(HYLENEX(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하여, 몇몇 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국특허 공보 제2005/0260186호 및 미국특허 공보 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 하나의 태양에서, sHASEGP를 하나 이상의 추가적인 글리코스아미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나제와 병용한다.
C. 병용 요법
몇몇 실시태양에서, 본 실시태양의 조성물 및 방법은 하나 이상의 추가적인 치료법과 함께 항원-특이성 면역세포 집단 또는 TCR을 수반한다. 상기 추가적인 치료법은 방사선요법, 수술(예를 들어 유방종괴 절제술 및 유방 절제술), 화학요법, 유전자 요법, DNA 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 면역요법, 골수 이식, 나노요법, 단클론 항체 요법 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 추가적인 치료법은 보조 요법 또는 신보조 요법의 형태일 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 추가적인 치료법은 소분자 효소 억제제 또는 전이방지제의 투여이다. 일부 실시태양에서, 상기 추가적인 치료법은 부작용 제한제(예를 들어, 오심-방지제 등과 같은, 치료 부작용의 발생 및/또는 중증도를 감소시키도록 의도된 작용제)의 투여이다. 일부 실시태양에서, 상기 추가적인 치료법은 방사선요법이다. 일부 실시태양에서, 상기 추가적인 치료법은 수술이다. 일부 실시태양에서, 상기 추가적인 치료법은 방사선요법과 수술의 조합이다. 일부 실시태양에서, 상기 추가적인 치료법은 감마 조사이다. 일부 실시태양에서, 상기 추가적인 치료법은 PBK/AKT/mTOR 경로를 표적으로 하는 요법, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 세포자멸사 억제제 및/또는 화학예방제이다. 상기 추가적인 치료법은 당업계에 공지된 하나 이상의 화학요법제일 수 있다.
면역세포 요법은 면역관문 요법과 같은 추가적인 암 요법에 대해, 상기 요법 전, 상기 요법 도중, 상기 요법 후에 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시에서 수 분, 수일, 수주 범위의 간격으로 이루어질 수 있다. 면역세포 요법이 추가적인 치료제와 별도로 환자에게 제공되는 실시태양에서, 일반적으로 두 화합물이 여전히 환자에게 유리하게 결합된 효과를 발휘할 수 있도록 각 전달 시간 사이에 상당한 기간이 만료되지 않도록 할 것이다. 이와 같은 경우에, 항체 요법 및 항암 요법은 서로 약 12 내지 24 또는 72h 이내에, 및 보다 특히 서로 약 6 내지 12h 이내에 환자에게 제공할 수 있음이 고려된다. 일부 상황에서, 각각의 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7)에서 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8)가 경과하는 치료 기간을 현저하게 연장시키는 것이 바람직할 수 있다.
다양한 조합을 사용할 수 있다. 예를 들어 하기의 항원-특이성 면역세포 요법에 대해서, 펩타이드 또는 TCR은 "A"이고, 항암 요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
환자에 대한 본 실시태양의 임의의 화합물 또는 치료법의 투여는 작용제의 독성(존재하는 경우)을 고려하여 이러한 화합물의 투여를 위한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 일부 실시태양에서 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계가 존재한다.
2. 화학요법
매우 다양한 화학요법제가 본 실시태양에 따라 사용될 수 있다. "화학요법"이란 용어는 암을 치료하기 위해 약물을 사용하는 것을 지칭한다. "화학요법제"는 암 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 내포하기 위해 사용된다. 이러한 약제 또는 약물은 세포 내 활성 방식(예를 들어 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지 여부 및 영향을 미치는 단계)에 따라 분류된다. 대안적으로, 작용제는 DNA를 직접 교차 연결하거나, DNA에 삽입되거나, 또는 핵산 합성에 영향을 주어 염색체 이상 및 유사분열 이상을 유도하는 능력을 기반으로 특성화될 수 있다.
화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 사이클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 유레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포아미드, 트라이에틸렌티오포스포아미드, 및 트라이메틸올멜라민; 아세토제닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신(합성 토포테칸 유사체 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스터드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드 및 우라실 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님누스틴과 같은 니트로스우레아; 엔디인 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마II 및 칼리케아미신 오메가II)와 같은 항생제; 다이네미신 A를 포함하는 다이네미신; 클로드로네이트와 같은 비스포스포네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백 엔디인 항생물질 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라르니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 대사길항물질; 데노프테린, 프테로프테린 및 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록수리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤과 같은 안드로젠; 미토탄 및 트리로스탄과 같은 항-부신; 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 나이트라에린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK폴라사카라이드 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트라이클로로트라이에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 배위 착체; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예: CPT-11); 국소이성화효소 억제제 RFS 2000; 다이플루오로메틸로니틴(DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 카페시타빈; 카르보플라틴, 프로카르바진, 플리코마이신, 젬시타빈, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라티늄, 및 상기 중 어느 하나의 약학적으로 허용가능한 염, 산, 또는 유도체를 포함한다.
3. 방사선요법
DNA 손상을 야기하고 광범위하게 사용되어 온 다른 인자는 일반적으로 γ-선, X-선 및/또는 종양 세포에 대한 방사성 동위원소의 유도 전달로 통상적으로 공지된 것을 포함한다. 마이크로파, 양성자 빔 조사(미국특허 제5,760,395호 및 미국특허 제4,870,287호) 및 UV 조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 인자도 또한 고려된다. 이러한 모든 인자가 DNA, DNA 전구체, DNA 복제 및 수복, 및 염색체 조립 및 유지에 대한 광범위한 손상에 영향을 미칠 가능성이 가장 높다. X선의 선량 범위는 연장된 기간(3 내지 4주) 동안 50 내지 200 뢴트겐의 일일 선량에서부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 선량 범위이다. 방사성 동위원소의 선량 범위는 매우 다양하고 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도와 유형, 신생물 세포에 의한 흡수에 따라 다르다.
4. 면역요법
숙련가는 추가적인 면역요법을 상기 실시태양의 방법과 조합하여 또는 함께 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료의 상황에서, 면역요법은 일반적으로 암세포를 표적화하고 파괴하기 위한 면역 효과기 세포 및 분자의 용도에 따라 변한다. 리툭시맙(리툭산(RITUXAN)(등록상표))이 이와 같은 예이다. 면역 효과기는 예를 들어 종양 세포 표면상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 상기 항체는 단독으로 치료법의 효과기로서 작용하거나, 또는 다른 세포를 모집하여 세포 사멸에 실제로 영향을 미칠 수 있다. 상기 항체를 또한 약물 또는 독소(화학요법제, 방사성핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합시킬 수 있으며 이는 표적화제로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 상기 효과기는 종양 세포 표적과 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 갖는 림프구일 수 있다. 다양한 효과기 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
항체-약물 접합체는 암 치료제 개발에 대한 획기적인 접근법으로 등장하였다. 암은 세계에서 사망의 주요 원인 중 하나이다. 항체-약물 접합체(ADC)는 세포-사멸 약물에 공유적으로 연결된 단클론 항체(MAb)로 구성된다. 이러한 접근법은 항원 표적에 대한 MAb의 높은 특이성을 매우 강력한 세포독성 약물과 조합하여, 항원 수준이 풍부한 종양 세포에 페이로드(약물)를 전달하는 "무장된" MAb를 생성시킨다. 약물의 표적 전달은 또한 정상 조직에서의 노출을 최소화하여, 독성을 감소시키고 치료 지수를 향상시킨다. FDA는 2011년 ADCETRIS(등록상표)(브렌툭시맙 베도틴) 및 2013년 KADCYLA(등록상표)(트라스투주맙 엠탄신 또는 T-DM1)의 두 가지 ADC 약물의 승인을 통해 상기 접근 방식을 검증하였다. 현재 암 치료를 위한 다양한 임상 시험 단계에서 30개가 넘는 ADC 약물 후보가 존재한다(문헌[Leal et al., 2014]). 항체 조작 및 링커-페이로드 최적화가 점점 더 성숙해짐에 따라, 신규 ADC의 발견 및 개발은 이 접근 방식에 적합한 새로운 표적의 식별 및 검증과 표적 MAb의 생성에 점점 더 의존하고 있다. ADC 표적에 대한 두 가지 기준은 종양 세포에서 상향조절된/높은 발현 수준 및 확고한 내면화이다.
면역요법의 하나의 태양에서, 종양 세포는 표적화가능한, 즉 대다수의 다른 세포에는 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 다수의 종양 마커가 존재하고 이들 중 임의의 것이 본 실시태양의 상황에서 표적화에 적합할 수 있다. 통상적인 종양 마커는 CD20, 암배아 항원, 타이로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B 및 p155를 포함한다. 면역요법의 대안적인 태양은 항암 효과와 면역 자극 효과를 겸비하는 것이다. IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN과 같은 사이토카인, MIP-1, MCP-1, IL-8과 같은 케모카인, 및 FLT3 리간드와 같은 성장인자를 포함한 면역 자극 분자도 또한 존재한다.
현재 조사 중이거나 사용 중인 면역요법의 예는 면역 항원보강제, 예를 들어 마이코박테리움 보비스, 플라스모디움 팔시파룸, 다이나이트로클로로벤젠, 및 방향족 화합물(미국특허 제5,801,005호 및 미국특허 제5,739,169호; 문헌[Hui and Hashimoto, 1998]; 문헌[Christodoulides et al., 1998]); 사이토카인 요법, 예를 들어 인터페론 α, β, 및 γ, IL-1, GM-CSF, 및 TNF(문헌[Bukowski et al., 1998]; 문헌[Davidson et al., 1998]; 문헌[Hellstrand et al., 1998]); 유전자 요법, 예를 들어 TNF, IL-1, IL-2, 및 p53(문헌[Qin et al., 1998]; 문헌[Austin-Ward and Villaseca, 1998]; 미국특허 제5,830,880호 및 미국특허 제5,846,945호); 및 단클론 항체, 예를 들어 항-CD20, 항-강글리오사이드 GM2, 및 항-p185(문헌[Hollander, 2012]; 문헌[Hanibuchi et al., 1998]; 미국특허 제5,824,311호)이다. 하나 이상의 항암 요법을 본원에 기재된 항체 요법과 함께 사용할 수 있음이 고려된다.
일부 실시태양에서, 상기 면역요법은 면역관문 억제제일 수 있다. 면역관문 억제제는 신호(예를 들어 보조-자극 분자)를 높이거나 또는 신호를 낮춘다. 면역관문 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제성 면역관문은 아데노신 A2A 수용체(A2AR), B7-H3(또한 CD276으로서 공지됨), B 및 T 림프구 감독제(BTLA), 세포독성 T-림프구-연관된 단백질 4(CTLA-4, 또한 CD152로서 공지됨), 인돌아민 2,3-다이옥시게나제(IDO), 킬러-세포 면역글로불린(KIR), 림프구 활성화 유전자-3(LAG3), 예정세포사 1(PD-1), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA)를 포함한다. 특히, 면역관문 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적화한다.
면역관문 억제제는 약물, 예를 들어 소분자, 재조합 형태의 리간드 또는 수용체이거나, 또는 특히 항체, 예를 들어 인간 항체이다(예를 들어 국제 특허 공보 WO2015016718; 문헌[Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012]; 둘 다 본원에 참고로 인용된다). 상기 면역관문 단백질 또는 그의 유사체의 공지된 억제제를 사용할 수 있으며, 특히 키메라화된, 인간화된 또는 인간 형태의 항체를 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되는 바와 같이, 대안 및/또는 등가명을 본 개시내용에 언급된 몇몇 항체에 대해 사용할 수 있다. 이와 같은 대안 및/또는 등가명은 본 개시내용의 맥락에서 호환가능하다. 예를 들어, 람브롤리주맙은 대안 및 등가명 MK-3475 및 펨브롤리주맙으로도 공지되어 있는 것으로 알려져 있다.
일부 실시태양에서, PD-1 결합 길항물질은 PD-1의, 그의 리간드 결합 상대에의 결합을 억제하는 분자이다. 특정한 태양에서, 상기 PD-1 리간드 결합 상대는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 실시태양에서, PDL1 결합 길항물질은 PDL1의, 그의 결합 상대에의 결합을 억제하는 분자이다. 특정한 태양에서, PDL1 결합 상대는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 실시태양에서, PDL2 결합 길항물질은 PDL2의, 그의 결합 상대에의 결합을 억제하는 분자이다. 특정한 태양에서, PDL2 결합 상대는 PD-1이다. 상기 길항물질은 항체, 그의 항원 결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질, 또는 올리고펩타이드일 수 있다. 예시적인 항체는 미국특허 제US8735553호, 미국특허 제US8354509호, 및 미국특허 제US8008449호(이들은 모두 본원에 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 다른 PD-1 축 길항물질은 당해 분야에 공지되어 있다, 예를 들어 미국특허 출원 제US20140294898호, 미국특허 출원 제US2014022021호, 및 미국특허 출원 제US20110008369호(이들은 모두 본원에 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
일부 실시태양에서, 상기 PD-1 결합 길항물질은 항-PD-1 항체(예를 들어 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라 항체)이다. 일부 실시태양에서, 상기 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 CT-011로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 PD-1 결합 길항물질은 면역부착소(예를 들어 불변 영역(예를 들어 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역부착소)이다. 일부 실시태양에서, 상기 PD-1 결합 길항물질은 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, 및 OPDIVO(등록상표)로서 또한 공지된 니볼루맙은 WO2006/121168에 기재된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA(등록상표), 및 SCH-900475로서 또한 공지된 펨브롤리주맙은 WO2009/114335에 기재된 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로서 또한 공지된 CT-011은 WO2009/101611에 기재된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로서 또한 공지된 AMP-224는 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 기재된 PDL2-Fc 융합 용해성 수용체이다.
본원에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 관문은 세포독성 T-림프구-연관 단백질 4(CTLA-4)(또한 CD152로서 공지됨)이다. 인간 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 Genbank 수탁번호 L15006을 갖는다. CTLA-4는 T 세포의 표면상에서 발견되며, 항원-제시 세포의 표면상에서 CD80 또는 CD86에 결합될 때 "오프" 스위치로서 작동한다. CTLA4는 헬퍼 T 세포의 표면상에서 발현되고 T 세포로 억제 신호를 전송하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 일원이다. CTLA4는 T 세포 보조-자극 단백질, CD28과 유사하고, 두 분자 모두 항원-제시 세포상의 CD80 및 CD86(또한 각각 B7-1 및 B7-2라 칭한다)에 결합한다. CTLA4는 T 세포에 억제 신호를 전송하는 반면, CD28은 자극 신호를 전송한다. 세포내 CTLA4는 또한 조절성 T 세포에서 발견되며 그의 기능에 중요할 수 있다. 상기 T 세포 수용체 및 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자에 대한 억제 수용체인 CTLA-4의 증가된 발현으로 이어진다.
일부 실시태양에서, 상기 면역관문 억제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들어 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라 항체), 그의 항원 결합 단편, 면역부착소, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드이다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-CTLA-4 항체(또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)를 당해 분야에 주지된 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 대안적으로, 당해 분야 인정된 항-CTLA-4 항체를 사용할 수 있다. 예를 들어 하기의 문헌들에 개시된 항-CTLA-4 항체를 본원에 개시된 방법에 사용할 수 있다: 미국특허 제8,119,129호, WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504(CP675,206, 또한 트레멜리무맙으로서 공지되며; 이전에는 티실리무맙), 미국특허 제6,207,156호; Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206); 및 Mokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304. 상기 언급한 각각의 간행물의 교시는 본원에 참고로 인용된다. CTLA-4에의 결합에 대해 이들 당해 분야-인정된 항체 중 어느 하나와 경쟁하는 항체를 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간화된 CTLA-4 항체가 국제 특허출원 WO2001014424, WO2000037504, 및 미국특허 제8,017,114호에 기재되어 있으며; 이들은 모두 본원에 참고로 인용된다.
예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(또한 10D1, MDX- 010, MDX- 101, 및 Yervoy(등록상표)로서 공지됨) 또는 그의 항원 결합 단편 및 변이체이다(예를 들어 WO 01/14424를 참조하시오). 다른 실시태양에서, 상기 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 상응하게, 하나의 실시태양에서, 상기 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인, 및 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 상기 언급한 항체와 동일한 CTLA-4상의 에피토프와의 결합에 대해 경쟁하고/하거나 상기와 결합한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 항체는 상기 언급한 항체와 적어도 약 90% 가변 영역 아미노산 서열 일치성(예를 들어 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95%, 또는 99% 가변 영역 일치성)을 갖는다.
CLTA-4의 조절을 위한 다른 분자는 US5844905, US5885796 및 국제특허 출원 WO1995001994 및 WO1998042752(모두 본원에 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같은 CTLA-4 리간드 및 수용체, 및 미국특허 제US8329867호(본원에 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같은 면역부착소를 포함한다.
5. 수술
암에 걸린 사람의 약 60%는 예방, 진단 또는 병기결정, 치유 및 고식적 수술을 포함하는 일부 유형의 수술을 받을 것이다. 근치적 수술은 암 조직의 전체 또는 일부를 물리적으로 제거, 절제 및/또는 파괴하는 절제를 포함하고, 본 실시태양의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬요법, 유전자요법, 면역요법 및/또는 대체요법과 같은 다른 치료법과 함께 사용될 수 있다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부를 물리적으로 제거하는 것을 지칭한다. 수술에 의한 치료에는 종양 절제 외에 레이저 수술, 냉동 수술, 전기 수술, 현미경으로-통제되는 수술(모스 수술)이 있다.
암성 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제시, 신체 중에 공동이 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접 주사 또는 추가 항암 요법과 함께 해당 부위의 국소 도포에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다, 또는 1, 2, 3, 4 및 5주마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월마다 반복될 수 있다. 이러한 치료도 다양한 투여량이 있을 수 있다.
6. 기타 작용제
치료의 치료학적 효능을 개선시키기 위해 다른 작용제가 본 실시태양의 특정 태양과 조합되어 사용될 수 있음이 고려된다. 이러한 추가적인 작용제에는 세포 표면 수용체 및 GAP 접합의 상향조절에 영향을 미치는 작용제, 세포증식억제제 및 분화제, 세포 부착 억제제, 세포자멸사 유도제에 대한 과증식성 세포의 감수성을 증가시키는 작용제, 또는 기타 생물학적 작용제가 포함된다. GAP 접합의 수를 증가시킴에 의한 세포간 신호전달의 증가는, 이웃하는 과증식성 세포 집단에 대한 과증식-방지 효과를 증가시킬 것이다. 다른 실시태양에서, 세포증식억제제 또는 분화제를, 치료의 과증식-방지 효능을 개선시키기 위해 본 실시태양의 특정 태양과 조합하여 사용할 수 있다. 세포 부착의 억제제가 본 실시태양의 효능을 개선시키기 위해 고려된다. 세포 부착 억제제의 예는 병소 부착 키나제(FAK) 억제제 및 로바스타틴이다. 항체 c225와 같은, 세포자멸사에 대한 과증식성 세포의 감수성을 증가시키는 다른 작용제가, 치료 효능을 개선시키기 위해 본 실시태양의 특정 태양과 조합하여 사용될 수 있음이 추가로 고려된다.
VI. 제조 물품 또는 키트
항원-특이성 면역 세포, TCR, 또는 항원 펩타이드(예를 들어, EGFR 펩타이드)를 포함하는 제조 물품 또는 키트가 또한 제공된다. 제조 물품 또는 키트는 항원-특이성 면역 세포를 사용하여 개체에서 암을 치료하거나 진행을 지연시키거나 암에 걸린 개체의 면역 기능을 향상시키기 위한 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 항원-특이성 면역 세포 중 임의의 것이 제조 물품 또는 키트에 포함될 수 있다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알, 주머니 및 주사기가 포함된다. 용기는 유리, 플라스틱(예를 들어 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀) 또는 금속 합금(예를 들어 스테인리스강 또는 하스텔로이)과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일부 실시태양에서, 용기는 제형을 유지하고 상기 용기 상의, 또는 상기 용기와 결합된 표지는 사용 지침을 나타낼 수 있다. 제조 물품 또는 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 비롯하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 제조 물품은 하나 이상의 또 다른 작용제(예를 들어, 화학요법제 및 항종양제)를 추가로 포함한다. 상기 하나 이상의 작용제에 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주머니 및 주사기를 포함한다.
VII. 실시예
하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양을 설명하기 위해 포함된다. 당업자는, 하기의 실시예에 개시된 기법이 본 발명의 실시에 잘 기능하도록 본 발명자에 의해 발견된 기법을 나타내며, 따라서 그의 실시에 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알아야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어 다수의 변화를 개시된 특정한 실시태양에서 수행할 수 있고, 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 여전히 같거나 유사한 결과를 획득할 수 있음을 알 것이다.
실시예 1 - 결과 및 방법
A. 결과
환자 특징, PPV 투여 및 반응 평가. 광범위하게 공유된 EGFR-L858R 돌연변이에 대한 CD8+ T 세포 반응과 연관된 PPV에 이어서 다수의 폐 종양의 현저한 퇴행을 경험한 IV기 NSCLC 환자가 최근에 보고되었다(문헌[Li et al., 2016]). 상기 사례 연구에 기반하여, III/IV기 NSCLC 환자에 대한 PPV의 Ib상 임상 시험을 개시시켜 PPV의 안전성과 실행가능성을 측정하였으며, 이때 2차 종점은 개인맞춤되고 공유된 NeoAg의 면역원성 외에 잠재적인 임상 생존 이득을 평가하였다(도 1a). 24명의 환자(18건의 선암종 및 6건의 편평세포 암종)가 성공적으로 등록하였으며 12주의 PPV 면역화에 이어서 CT 스캔에 의한 반응 평가를 수용하였다. 임상 반응을 PPV의 개시 후 3 내지 4개월째에 RECIST 기준을 사용하여 측정하였다. 경우에 따라, 환자에게 12주 넘게 PPV를 계속할 수 있는 선택권이 제공되었으며; 모든 24명의 환자의 면역화 시간 과정은 도 2에 도시되어 있다. 환자 중 3명(Pt. 1, 6, 및 24)은 12주 백신접종 후 질병 진행에 따른 대체 구제 요법을 받았고 연구를 중단하였다. 5명의 추가 환자가 CT 기반 병기결정을 완료하지 못하였다: 3명의 환자(Pt. 9, 19 및 20)가 백신접종 12주 동안 질병 진행으로 사망하였고, 2명의 환자(Pt. 13 및 15)는 저자와 소통되는 외부 병원에서 추적 관찰을 받았다. 환자 치료 및 임상 결과의 완전한 요약이 도 1b에 도시되어 있다.
24명의 NSCLC 환자 모두는 이전에 수술, 방사선요법 및/또는 화학요법을 포함한 여러 기존 요법에 실패한 적이 있다. EGFR 돌연변이 종양이 있는 환자 중 16명은 이전에 EGFRi 요법을 진행했으며 이 중 9명은 2개 이상의 다른 EGFRi 약물에 실패하였다. 이 16명의 환자에게는 PPV 백신접종과 동시에 EGFRi 요법을 중단하거나 계속할 수 있는 선택권이 주어졌으며; 9명의 환자는 EGFRi 치료를 계속하기로 선택했고 7명의 환자는 EGFRi 요법을 중단하기로 선택하였다. 이 9명의 환자를 제외하고 PPV 시험의 다른 15명의 환자는 추적 기간 동안 어떠한 다른 치료도 받지 않았다. 환자가 처음에는 별도의 코호트로 무작위 배정되지 않았지만, 하기에 나타낸 바와 같이 후향적 분석에서 24명의 환자를 하기의 3개 그룹으로 나누었을 때 뚜렷한 반응 및 생존 프로파일이 나타났다: PPV만 수용하는 EGFR 야생형(WT) 환자(그룹 1), PPV만 수용하는 EGFR-돌연변이 환자(그룹 2); 및 동시 EGFRi와 함께 PPV를 수용하는 EGFR-돌연변이 환자(그룹 3)(도 1c; 도 3). 3개의 환자 그룹의 임상적 특징은 기준선에서 크게 다르지 않았다(도 4a). 그룹 2 및 3 환자의 상세한 EGFR 억제제 이력은 도 4b에 도시되어 있다.
개인맞춤된 신생항원 백신 설계. 대규모 전체 엑솜 서열분석 연구는 NSCLC가 모든 암 유형 중에서 가장 높은 돌연변이 부담을 갖고, 이때 개별 환자 종양은 종종 >100개의 비동의(nonsynonymous) 체세포 돌연변이를 발현함을 입증하였다(문헌[Rizva et al., 2015]; 문헌[Lawrence et al., 2013]). 이와 같은 프로파일을 기반으로, 현재 HLA 부류 I 펩타이드 결합 예측 알고리즘은 일반적으로 단일의 다중에피토프 펩타이드 백신에 통합될 수 있는 것보다 더 많은 잠재적인 NeoAg 펩타이드 후보 수백 개를 생성시킨다.
그러나, 이러한 돌연변이의 대부분은 종양 하위 클론에 의해 발현되는 "분지" 돌연변이로 간주되지만 모든 종양 세포에 의해 발현되는 것은 아니며; 이러한 돌연변이는 또한 종양 생존을 유지하는데 필수적인 구동자 돌연변이를 구성할 가능성이 적다(문헌[Hao et al., 2016]). 공유된 구동자 돌연변이를 표적으로 하는데 초점을 맞추기 위해서, 우리는 바늘-생검된 신선한 종양 조직의 DNA를 사용하여 508개의 공지된 암 관련 유전자 패널에서 돌연변이 프로파일링을 수행하기로 선택하였다(표 4). 백신 펩타이드는 주로 각 환자의 개별 HLA 부류 I 및 부류 II 알로타입에 대한 돌연변이-암호화 NeoAg의 가장 높은 예측 결합 친화도를 기반으로 선택되었다(표 5, 방법). 각 환자는 염수에 용해된 짧고 긴 NeoAg 펩타이드의 독특하고 개인맞춤된 혼합물로 면역화되었고, 2개의 풀로 나뉘고 반대쪽 사지에 피하 투여되었다. 이미퀴모드를, 톨형 수용체(TLR) 7을 통해 보조-자극 신호를 제공하기 위해 각각의 면역화 후에 국소적으로 적용하였다(도 1a).
[표 4]
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24명의 등록된 환자 중에서, 종양당 평균 6.1개의 암호화 돌연변이가 검출되었다(범위, 1-20). EGFR 돌연변이 종양이 있는 16명의 환자 중 14명은 통상적인 EGFR 구동자 돌연변이를 갖고 있었다(7명은 L858R 점 돌연변이, 7명은 엑손 19 결실). 그 중 2명은 1세대 EGFRi에 내성을 부여하는 것으로 알려진 T790M 돌연변이를 동반하였다. 다른 2명의 추가 환자는 비교적 드문 H773L 돌연변이를 갖고 있었다. 투여된 백신 펩타이드의 수는 환자당 5 내지 14개(평균, 9.4개)의 범위였으며, 이는 주로 환자 HLA 부류 I(평균, 6.5개 펩타이드) 또는 HLA 부류 II(평균 = 2.9개 펩타이드)에 결합할 것으로 예측되는 NeoAg의 수에 의해 결정되었다. 그룹 2 및 3의 환자는 각각 평균 4개의 돌연변이 EGFR 펩타이드(2.8개 짧은 및 1.2개 긴)를 수용하였다. 면역화 펩타이드의 수 또는 평균 예측 펩타이드 결합 친화도는 그룹 간에 유의한 차이가 없었으나, 그룹 2 및 3의 환자는 전반적으로 보다 적은 체세포 돌연변이를 표적으로 하는 백신을 수용하였다(도 1d 내지 1f). 이는 초기 사례 연구 환자에서 폐 종양 퇴행을 유도하는데 성공한 것으로 나타난 접근법인 다중 NeoAg 펩타이드를 사용한 개별 EGFR 돌연변이의 의도적 표적화에 기인하였다(문헌[Li et al., 2016]; 표 5).
[표 5]
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EGFR-돌연변이 종양이 있는 다수의 환자에서 PPV 유도된 임상 반응. 모든 24명의 환자에 대한 임상 결과를 표 6에 나타내며, 이때 그룹 결과를 도 5a & 5b 및 표 7에 요약한다. 3명의 환자가 경험한 등급 1의 일시적인 발진, 피로 및/또는 발열을 제외하고는, 치료-관련 부작용이 관찰되지 않았다(도 5c). 그룹 1의 EGFR-WT 환자 중 4명은 PPV 12주 후에 안정 질병(SD)을 보였고 4명은 진행성 질병(PD)을 보였다. 환자 2는 흉수 제거를 경험했지만, 종양 퇴행은 관찰되지 않았다(도 6a & 6b). 대조적으로, 2명의 PR(Pt. 11 및 14) 및 1명의 CR(Pt. 17)을 포함하여 그룹 2의 7명의 환자 중 3명의 환자에서 객관적인 임상 반응이 관찰되었으며, 이는 생육성 종양 세포를 보이지 않는 치료-후 생검에 의해 확인되었다(도 7a 내지 7d). 더욱 또한, 그룹 3의 9명의 환자 중 4명은 부분 반응(PR)을 경험했으며, 이때 4명의 추가적인 환자는 SD로 간주되었다(도 7e & 7f; 도 5a). 그룹 3 환자는 EGFRi 요법에 대한 이전의 질병 진행에도 불구하고 반응하였다(도 6c).
[표 6]
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[표 7, 파트 1]
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[표 7, 파트 2]
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[표 7, 파트 3]
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[표 7, 파트 4]
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특히, 그룹 3의 환자 중 누구도 시험 치료 전에 EGFRi 치료를 중단하거나 "휴약기"를 갖지 않았으며, 이는 NeoAg 백신 접종이 이러한 임상 반응에서 핵심적인 역할을 했음을 뒷받침한다. 특히, 그룹 3 환자는 그룹 2 환자와 비교하여 더 긴 중간 OS를 경험하였다(13.8 대 7.6개월, P=0.038, 도 1g; 도 8a & 8b). 임상적 이득(PR/CR 또는 SD)을 경험한 환자는 또한 유의하게 연장된 OS 및 PFS를 나타내었다(도 1H; 도 8c). 그러나, 임상 반응이나 무진행 생존(PFS) 모두 면역화 펩타이드의 수, 펩타이드 길이, 예측된 HLA 결합 친화도, 관여된 HLA 분자의 수, 펩타이드 델타 점수 또는 EGFRi 치료 이력과 관련이 없었다(도 1d 내지 1f; 도 8d & 8d; 도 9a 내지 9c). PR/CR 환자는 PD 환자의 백신에 비해 현저히 적은 체세포 돌연변이를 표적화하는 백신을 수용하였다(P=0.014). 이는 7명의 반응 환자가 그들의 백신에서 상당히 더 높은 비율의 EGFR NeoAg 펩타이드를 수용한 결과였으며(P<0.001, 도 1f), 이는 EGFR NeoAg 백신접종이 관찰된 임상 반응과 연계되었다는 개념을 뒷받침한다. 단변량 분석은 흉막 삼출의 존재 및 증가된 종양 부담이 환자 생존 결과에 부정적인 영향을 미치는 두 가지 위험 인자임을 보여주었으며(도 10a & 10b); 이들은 둘 다 NSCLC의 주지된 위험 인자이다(문헌[Morgensztern et al., 2012a]; 문헌[Morgensztern et al., 2012b]).
PPV는 공유된 EGFR 돌연변이에 대한 NeoAg-특이성 T 세포 반응을 유도하였다. 항종양 반응의 특성을 더 잘 이해하기 위해 PPV-전 또는 -후에 수집된 환자 말초혈액 단핵세포(PBMC) 샘플에 대해 순차적 면역 모니터링을 수행하였다(방법 참조). 백신-유도된 면역 반응은 개별 환자 PBMC를 그들의 면역화 펩타이드 풀로 자극하고 ELISA에 의해 특이적인 인터페론-감마(IFN-γ) 분비를 측정함으로써 초기에 선별되었다(도 11a). 이 분석에서, 펩타이드 풀-특이적 반응성은 평가된 20명의 환자 중 6명에서 검출되었으며, 모두 그룹 2(5 pt 중 2) 또는 그룹 3(7 pt 중 4)에서 검출되었다. 펩타이드 디콘볼루션은 7명의 추가적인 PPV 환자에서 개별 NeoAg 펩타이드-특이성 IFN-γ 반응을 나타내었다(도 12a; 표 5). 이러한 결과에 기초하여, 우리는 PPV-특이성 IFN-γ 반응의 폭, 강도 및 지속성을 설명하는 면역 반응 ComboScore(IRC)를 계산하였다(방법 참조; 도 12b). 최저의 ComboScore(IRC = 0)를 갖는 7명의 환자 중 5명의 환자는 그룹 1에 있었고 단지 1명(그룹 3의 Pt 12)만이 임상적 객관적 반응을 경험하였다. 대조적으로, 가장 높은 IRC를 가진 6명의 환자는 모두 그룹 2 또는 그룹 3에 속했고, 이 환자 중 5명은 중간 PFS 시간보다 더 긴 PFS를 경험한 임상 반응자였다(도 12b).
ELISPOT-기반 면역 모니터링은 EGFR 돌연변이가 백신-유도된 반응이 관찰된 6명의 반응 환자 중 5명의 NeoAg-특이성 T 세포 반응의 우세한 표적을 구성함을 설명하였다. Pt. 11이 HLA-A*0301로 제한된 돌연변이된 AQP12A(L28R) NeoAg 펩타이드에 대해 중간 정도의 IFN-γ 반응을 생성하였지만, HLA-A*0201-제한된 EGFR(H773L) NeoAg 백신 펩타이드에 대해서는 어떠한 검출 가능한 반응도 생성하지 않았다(도 13). 대조적으로, 3명의 다른 반응 HLA-A *1101+ 환자(Pt. 5, 8 및 14)는 고도로 공유된 EGFR- L858R 돌연변이를 포함하는 A*1101-제한된 펩타이드 KITDFGRAK(서열번호 4)에 대해 우세한 면역 반응성을 생성시켰다(도 11b). 마찬가지로, CR Pt. 17은 HLA-C*1502-제한된, T790M-함유 펩타이드 LTSTVQLIM(서열번호 65)에 대해 강한 반응을 나타내었다. ELISPOT 및 HLA/펩타이드 사량체 염색 분석은 이러한 NeoAg 펩타이드 둘 다에 대해 특이적인 CD8+ T 세포 반응을 입증하였으며, 두 분석 모두 면역화 중 최대 3개월 동안 T 세포 빈도의 증분적 증가를 나타내었다(도 11c & 11d; 도 13; 도 14). 중요하게는, 4명의 환자로부터의 백신-유도된 T 세포는 야생형 및 돌연변이 EGFR 펩타이드를 기능적으로 구별할 수 있었다(도 11e).
환자 22(PR)는, A*0201-제한된 FGFR1(R734W) NeoAg 펩타이드에 대한 강력한 반응을 생성시키는 것 외에도, 화합물 EGFR 돌연변이 H773L/V774M을 포함하는 긴 DRB1 *0901-제한된 NeoAg 펩타이드(MASVDNPLMCRLLGICL)(서열번호 958)에 대한 백신-유도된 반응성을 생성시킨다. Pt. 8 및 16 둘 다 L858R 돌연변이를 함유하는 긴 HLA 부류 II-제한된 EGFR NeoAg 펩타이드(HVKITDFGRAKLLGAEE)(서열번호 826)에 대한 면역 반응을 생성시켰다(도 13). 그러나, 동일한 긴 L858R 펩타이드로 백신접종된 3명의 다른 환자(5, 12 및 14)는 Pt. 8 및 16과 관련된 HLA 부류 II 알로타입을 공유함에도 불구하고 검출 가능한 항원-특이성 면역 반응을 생성시키지 않았다. KITDFGRAK 펩타이드(서열번호 4)로 면역화된 4명의 HLA-A*1101+ 환자 중 Pt. 16은 이 NeoAg에 대해 검출 가능한 CD8+ T 세포 반응을 생성하지 못한 유일한 환자였으며 또한 4명의 환자 중 임상 반응(SD)을 경험하지 않은 유일한 환자였다. 종합적으로, 이러한 결과는 다수의 별개의 EGFR 돌연변이가 NSCLC 환자의 임상적 객관적 반응과 연관된 NeoAg 백신-특이성 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응의 면역원성 표적이 될 수 있다는 증거를 제공한다.
놀랍게도, KITDFGRAK NeoAg 펩타이드(서열번호 4)는 HLA-A*1101에 상응하는 WT 펩타이드(20 nM)보다 낮은 친화도(163 nM)로 결합할 것으로 예측되지만, 이는 여전히 중간 친화도 HLA 결합제에 대한 일반적인 범위 내에 충분히 속한다(도 11f). 대조적으로, 상기 EGFR-T790M 돌연변이는 펩타이드 C-말단 앵커를 극성 트레오닌 잔기에서 소수성 메티오닌 잔기로 전환시키기 때문에, NeoAg LTSTVQLIM 펩타이드(서열번호 65)의, HLA-C*1502에 대한 결합이 WT 펩타이드보다 강하게 촉진된다(도 11f). HLA 펩타이드-결합 선호도에 대한 전반적인 분석은 HLA 슈퍼패밀리 수준에서 EGFR NeoAg 제시의 현저한 왜곡을 보여주었다: 모든 EGFR 돌연변이의 >80%를 함께 포함하는 L858R 및 Exon 19 결실 돌연변이는 상승된 염기성 아미노산 함량을 갖는 NeoAg를 생성하여, 주로 HLA-A*1101을 포함한 A3 슈퍼패밀리 구성원에의 결합을 촉진하는 반면, 공유된 S768I, T790M 및 L861Q 돌연변이를 포함하는 NeoAg는 더 소수성이고 따라서 HLA-C* 1502를 포함하는 A2, B15, B27 및 C3 슈퍼패밀리의 구성원에 결합하는데 유리하다(도 11g 내지 11i; 문헌[Kobayashi et al., 2016]). 대조적으로, A1, A24, B8 및 C7 슈퍼패밀리 내의 HLA 부류 I 알로타입은 대부분의 공유된 EGFR NeoAg에 결합하여 존재하지 않을 것으로 예상된다(도 15a & 15b). HLA 부류 II 분자는 광범위한 배열의 EGFR 돌연변이를 함유하는 펩타이드에 결합할 것으로 예측되고, 부류 II 슈퍼패밀리는 DP1 및 DP3 알로타입의 잠재적인 예외를 제외하고, 왜곡된 결합 선호도를 보이지 않을 것으로 예측된다(도 15c; 문헌[Sidney et al., 2008]; 문헌[Harjanto et al., 2014]; 문헌[Jensen et al., 2018]).
PPV는 EGFR NeoAg-특이성 T 세포의 증식 및 종양 침윤을 구동하였다. TCRVβ-CDR3 서열분석은 17명의 PPV 환자로부터 수집된 백신-전 및 -후 PBMC에서 단리된 DNA에서 수행되었다. 클론성 점수가 각 시점에 대해 계산되었으며, PPV 후 10명의 환자에서 증가된 T 세포 클론성을 입증하였고, 5명의 환자는 클론성의 감소를 나타내며 2명의 환자는 변하지 않은 채로 남아 있었다(평균 변화, +13.2%, 도 16a). 가장 긴 PFS(>9개월)를 갖는 5명의 환자는 모두, 특히 환자 5 및 8(각각 69.8% 및 95.5%, 도 16b)은 PPV-후 증가된 T 세포 클론성을 나타내었다. 이러한 결과는 PPV-후 이들 2명의 환자에서 면역 모니터링에 의해 검출된 NeoAg-특이성 T 세포의 확대와 일치하였다(도 12; 도 13; 도 14).
환자 5는 >20개월에 질병 진행 없이 PPV-후 객관적인 임상 반응을 경험하였으며, 이는 이 환자에서 NeoAg 특이적 면역 반응의 장기간 역학을 분석할 수 있는 독특한 기회를 제공하였다. A*1101/KITDFGRAK(서열번호 4) 사량체를 사용하여, PPV 개시 12개월 후에 추출된 PBMC로부터 EGFR(L858R)-특이성 CD8+ T 세포를 분류하였다(도 16c; 도 14). 이어서 분류된 NeoAg-특이성 세포는 단-세포 TCRα/β 서열분석을 겪었으며, 이로부터 52개의 높은 신뢰도 TCR 클론이 식별되었다(Tet+, 방법 참조). 치료-전 또는 PPV-후 12개월째에 수행된 종양 생검은 또한 종양 침윤성 림프구(TIL)의 TCRVβ-CDR3 서열분석을 겪었으며, 이를 통해 면역화-전 및 -후 혈액 및 종양 구획의 CDR3 빈도를 자세히 비교할 수 있었다(표 7). 도 16d에 도시된 바와 같이, PBMC 및 TIL PPV-전 둘 다에서 중첩되는 CDR3 클론은 NeoAg-특이성 Tet+ 클론을 포함하여, 혈액 내에서 더 높은 빈도로 존재하였다(도 17a & 17b). 대조적으로, 백신-후 샘플은 혈액과 TIL 사이에 중복되는 CDR3 클론의 수의 절반만을 나타내었지만, 이들 클론은 TIL 구획 내에서 상당히 더 높은 빈도로 존재하였다. 중요하게는, NeoAg-특이성 Tet+ 클론은 전처리 샘플에서 검출되지 않은 13개의 새로운 T 세포 클론을 포함하여, 면역화-후 PBMC 및 TIL 구획 둘 다에서 상당한 빈도 증가를 나타내었다(도 16d; 도 17c). PPV-전 및 -후의 PBMC CDR3 서열을 비교하면 면역화 후에 T 세포의 하위집합(Tet+ 클론 포함)이 증가하는 반면, 대부분의 다른 T 세포 클론은 빈도가 감소하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 종양 부위에서 거의 모든 CDR3 클론은 40개의 Tet+ 클론 중 35개를 포함하여, 면역화 후에 증가된 빈도를 나타내었다(도 16d).
상기 분석에 의해 밝혀진 한 가지 두드러진 특징은 PPV-후 분류된 52개의 Tet+ 클론 중 40개가 PPV-전 PBMC 및 TIL 샘플에서 이미 상승된 빈도로 존재한다는 것이었으며, 이는 EGFR NeoAg-특이성 세포의 자발적 프라이밍이 면역화 전에 발생함을 시사한다. 그러나, 이들 Tet+ CDR3 클론의 대부분은 IFN-γ 면역 모니터링 결과와 일치하는, 환자의 임상 반응과 연관된 12주 PPV 과정에 걸친 PBMC 빈도의 상당한 증가를 나타내었다(도 16e; 도 7e; 도 11a 내지 11d). 흥미롭게도, PPV는 또한 치료-전 PBMC에서는 검출할 수 없었지만 PBMC와 종양 부위 모두에서 수개월 후에 유의하게 상승된 빈도를 나타내는 대략 12개의 Tet+ 클론의 확대를 자극하는 것으로 나타났다(도 16d & 16f; 도 17b). 이와 같은 유도된 Tet+ 클론 중 하나인 Vβ-N1은 종양 부위에서 빈도가 >500배 증가하였다. 이 Tet+ 클론으로부터의 TCRα/β 쇄는 렌티바이러스 벡터로 서브클로닝되었고 TCR-N1을 발현하도록 PBMC-유래 T 세포를 형질도입하는데 사용되었다(도 16g). EGFR NeoAg-특이적인 인식은 TCR-N1 형질도입된 T 세포를, HLA-A*1101 및/또는 KITDFGRAK(서열번호 4) 미니유전자를 발현하도록 조작된 A549 종양 표적 세포와 공-배양함으로써 확인되었다(도 16g & 16h). 종합적으로, 이 데이터는 Pt. 5의 펩타이드 백신접종이 말초 혈액에서 NeoAg-특이성 CD8+ T 세포의 상당한 확대를 자극하여, 최종적으로 종양 부위에서 이러한 Tet+ T 세포의 증가된 빈도에 이르렀다는 증거를 제공한다. Tet+ 세포에 의한 증가된 종양 침윤이 종양으로의 향상된 T 세포 수송, 종양 부위에서 NeoAg 인식으로 인한 T 세포 증식, 또는 상기 두 가지 과정 모두에 의해 유발되었는지의 여부는 여전히 알려지지 않고 있다.
EGFRi는 면역 세포 침윤, 항원 제시 및 T 세포 활성화를 촉진한다. 그룹 2 및 그룹 3 환자는 PPV에 이어서 유사한 임상 객관적 반응률을 나타내었지만, 그룹 3 환자는 유의하게 연장된 OS 및 PFS를 나타내었다(도 8). 그룹 3 환자가 더 나은 생존 결과를 경험한 이유를 더 잘 이해하기 위해서, 우리는 다음으로 EGFRi 요법이 백신 접종과 상승작용 효과를 낼 수 있는 잠재적 기전을 평가하였다. 2개의 폐암 세포주, H1975(EGFR 돌연변이: L858R+/T790M+) 및 H1299(EGFR-WT)를 EGFRi 또는 DMSO로 처리하고, 세포 상등액 및 전체 RNA를 처리 후 다수의 시점에서 수집하였다. 예상대로, EGFRi-처리된 H1975 세포는 MYC 신호전달, 증식, 세포 주기, 및 세포자멸사 및 생존과 연관된 유전자의 감소된 발현 외에, RNAseq 및 웨스턴 블럿 분석 모두에 의해 확인된 감소된 EGFR 신호전달을 나타내었다(도 18a, 18c, 및 18d; 도 17d). 면역-관련 유전자의 검사는 EGFRi 처리가 관문 유전자의 동반 감소와 함께, TRAIL 신호전달 및 HLA 부류 I 및 II 항원 제시와 연관된 유전자의 전사를 증가시킴을 보여주었다(도 18b & 18d; 도 17e & 17f). 다수의 케모카인 및 사이토카인을 암호화하는 전사물은 EGFRi 처리 후 증가하거나 감소하였고, 루미넥스 분석은 세포 상등액의 단백질 수준에서 이들 중 10개에 대한 변화를 확인하였다(도 18b, 17e 및 17f). EGFRi 처리는 면역 세포 이동을 촉진하는 것으로 잘 알려진 케모카인인 CXCL1, CXCL2 및 CCL2를 상향 조절하였기 때문에, 우리는 다음으로 말초 혈액 백혈구가 EGFRi- 또는 DMSO-처리된 H1975 세포 상등액에 반응하여 이동하는 방법을 조사하였다(도 17e & 17f). 생체 외 PBMC로부터의 CD4+ T 세포 및 CD14+ 단핵세포 둘 다, EGFRi 처리된 세포 상등액으로의 증가된 이동을 나타내었다. 예상대로, 이동 능력을 상향 조절하기 위해 사전 활성화가 필요하였지만, CD8+ T 세포는 또한 동일한 세포 상등액에 반응하여 상당히 증가된 이동을 나타내었다(도 18h). 표면 HLA 부류 I 표면 발현은 또한 H1975에서 증가하였지만, EGFRi 처리 후 H1299 세포에서는 증가하지 않았으며, 결과적으로 EGFRi-처리된 H1975 종양 세포의 인식 후 더 많은 IFN-γ를 생산하는 항원-특이성 CD8+ T 세포가 생성되었다(도 18i & 18j; 17g). 이러한 결과는 EGFRi가 종양 부위에서 면역 세포 침윤 및 항원 제시를 촉진하여 항종양 면역 반응을 증가시킬 수 있다는 개념을 뒷받침한다(문헌[Wantanabe et al., 2019]; 문헌[Im et al., 2016]).
그룹 3 환자의 종양 샘플이 유사한 유전자 특징을 보이는지 확인하기 위해 PPV 환자의 작은 하위집합에서 수득된 종양 생검에 대해 RNAseq 분석을 수행하였다. 분석된 2개의 종양 시편은 EGFRi 요법을 받지 않은 환자(그룹 2 Pt. 16 및 24)에서, 2개의 시편은 EGFRi 치료를 받은 환자(그룹 3 Pt. 12 및 23)에서 유래하였다. PPV-전에 수득된 Pt. 24 시편을 제외하고, 생검을 PPV 면역화 동안 수행하였다. EGFRi-처리된 Pt. 12 및 23에서 세포 주기, 세포 분열 및 세포 생존에 대한 유전자 발현 특징은, EGFR 신호전달 및 증식률에 대한 유전자 특징과 마찬가지로, EGFRi-처리된 H1975 세포의 경우와 충분한 상관관계가 있었다(도 18a, 18d 및 18e). PPV 환자 종양의 면역-관련 유전자 특징은 PR 환자 12에서 가장 두드러지게, 상향 조절된 항원 제시와의 일부 일치를 포함하여 H1975 특징과 부분적으로 중복되는 것으로 나타났다. CCL2 및 IL1RN을 제외하고, 대부분의 케모카인 및 사이토카인 특징은 거의 일치하지 않았고, 이는 정상 면역 세포와 기질 세포 침윤으로부터 유래된 RNA를 함유하는 종양 시편의 결과와 유사하다. 종양 시편의 면역 세포 함량 값을 개별적으로 추론하기 위해서, 면역 세포-유형 특이성 유전자를 참조하여 종양 RNAseq 데이터를 분석하였다. 도 18k에 도시된 바와 같이, 2명의 EGFRi-처리된 환자의 종양은 EGFRi를 취하지 않은 2명의 환자와 비교하여 상승된 수준의 M2 대식세포 및 B 세포, 및 감소된 호중구 침윤을 함유하였다. Pt. 23의 온-EGFRi 종양 생검은 상승된 수준의 수지상 세포를 나타내는 유일한 샘플이었으며, 또한 증가된 CD4+ T 세포 및 NK 세포 침윤과 연관되었다(도 18l). 특히, 종양-침윤성 CD8+ T 세포는 Pt. 24의 PPV-전 종양 샘플과 비교하여 온-PPV시 3명의 환자 모두에서 상승된 수준으로 발견되었다(도 18k). 분석된 환자 샘플의 수가 결정적인 결론을 내리기에는 너무 적지만, 이러한 결과를 종합하면 EGFRi가 종양 미세 환경 내에서 유전자 발현을 변경하여 면역 세포 침투 및 항원 제시를 촉진할 수 있는 능력이 있음이 암시된다.
종합적으로, 우리 연구는 펩타이드 백신 접종과 EGFRi 요법의 치료학적 상승작용 효과를 설명하기 위해 하기의 모델을 지원한다(도 18m): PPV 투여는 순환에서 NeoAg 특이성 T 세포의 확대를 자극하는 반면, EGFRi는 종양 부위에서 증대된 항원 제시 및 케모카인 분비를 촉진한다. 증가된 케모카인은 차례로 활성화된 T 세포를 포함한 면역 세포의, 종양으로의 수송을 증대시키며, 여기서 T 세포에 의한 동족 종양 항원의 인식은 종양 세포 파괴 및 IFN-γ 생산을 자극한다(문헌[Venugopalan et al., 2016]). IFN-γ는 항원 제시 및 케모카인 생산을 강력하게 상향 조절하는 것으로 공지되어 있기 때문에(문헌[Schoebom et al., 2007]; 문헌[Schroder et al., 2004]; 도 17e & 17f), PPV와 EGFRi의 조합은 초기 항종양 T 세포를 자극할 수 있고, 이는 후속적으로 항종양 면역 반응을 지속하기 위해 종양 부위에서 '피드-포워드(feed-forward)' 루프를 개시시킨다(도 18m). 이러한 지속적인 면역 반응은 환자 5에서 관찰된 유도된 NeoAg-특이성 T 세포 클론의 장기적인 확대에 추가하여, 그룹 3 PPV 환자에서 관찰된 연장된 PFS에 대한 설명을 제공할 것이다.
논의. 이것은 공유된 NeoAg에 대한 펩타이드 백신접종이 여러 암 환자에서 객관적인 임상 퇴행을 유도할 수 있음을 보여주는 첫 번째 보고서일 수 있다. HLA 다양성과 개인 돌연변이의 압도적인 유행으로 인해, 이전의 백신 연구에서는 잠재적으로 공유된 NeoAg 펩타이드로 단일 환자보다 많은 환자를 면역화하는 것이 보고되지 않았다. 그러나 아시아 NSCLC 환자에서 HLA-A*1101 및 EGFR(L858R) 돌연변이의 유병률이 상대적으로 높기 때문에 EGFR 돌연변이 환자의 -15%가 이 결합된 표현형을 공유할 것이 예측되었다(문헌[Kobayashi et al., 2016]; 문헌[Gonzalez-Galarza et al., 2015]). 이것은 A*1101-제한된 KITDFGRAK 펩타이드(서열번호 4)를 포함하는 EGFR NeoAg 펩타이드를 공통으로 함유하는 백신으로 5명의 이와 같은 환자(이 연구에서 4명)를 면역화할 수 있는 특유의 기회를 제공하였다(문헌[Li et al., 2016]). 놀랍게도, 5명의 환자 중 4명은 NeoAg 백신접종 12주 이내에 종양 퇴행을 경험하였으며, 4명의 환자 모두 임상 반응 기간 동안 KITDFGRAK(서열번호 4) 특이성 CD8+ T 세포 반응성이 유의하게 증가하거나 우세함을 나타냈다(문헌[Li et al., 2016]). 다수의 A*1101/EGFR(L858R) 환자가 공유된 NeoAg 펩타이드를 사용한 면역화에 임상적으로 반응했음을 보여줌으로써, 이 연구는 암 백신 연구에서 중요한 첫 번째 개념 증명을 제공한다.
우리의 연구는 또한 2개 이상의 다른 EGFR 돌연변이가 NSCLC 환자에서 면역원성일 수 있다는 증거를 발견했으며, 이때 2개의 추가적인 임상 반응은 각각 H773L/V774M 또는 T790M 돌연변이에 대한 우세한 백신-유도된 co4+ 또는 cos+ T 세포 반응과 연관이 있다(도 12a). T790M은 원발성 NSCLC에서 낮은 유병률을 보이지만 제1선 EGFRi 요법에 대한 내성 기전으로서 빈번히 발생한다(문헌[Kobayashi et al., 2005]; 문헌[Xu et al., 2017]; 문헌[El Nadi et al., 2018]). T790M 함유 LTSTVQLIM 펩타이드(서열번호 65)는 우리 연구(Pt. 17)에서 유일한 완전한 반응자에서 CD8+ T 세포의 우세한 NeoAg 표적이었으며, 따라서 HLA-C*1502를 발현하는 전 세계 환자의 수의 약 7%에 대한 또 다른 유망한 잠재적 공유 표적을 구성한다. 비-EGFR NeoAg 특이적 면역 반응, 특히 Pt. 11에서 AQP12A(L28R) 및 Pt. 22에서 FGFR1(R734)에 대한 CD8+ T 세포 반응이 또한 반응 환자에서 검출되었다. 우리 연구는 EGFR NeoAg의 면역원성을 다른 돌연변이 유전자에서 유래한 면역원성과 직접 비교하도록 설계되지 않았지만, 우리는 그룹 1의 환자간에, 및 그룹 2 및 3의 환자간에 IRC 점수의 차이에 의해 입증되는 바와 같이, 면역 반응성의 우세함이 돌연변이된 EGFR 표적에 집중됨을 관찰하였다(도 12b). EGFR-유래된 NeoAg가 다른 돌연변이 단백질에서 유래된 것보다 본래적으로 더 면역원성이 있을 것이라고 의심할 이유가 없기 때문에, 이 발견에 대한 설명은 하기에서 추가로 논의되는 바와 같이, 그룹 2/3 환자의 EGFRi 사용과 관련될 수 있다. 다수의 비-반응 환자는 또한 1DH2, MAP2K4, PIK3CA, TP53 및 EGFR(746_750del)에서 유래한 돌연변이된 NeoAg에 대한 것을 포함하여, PPV-유도된 T 세포 반응성을 생성시켰다. 우리는 이들 환자의 임상 반응 부족이 기능부전 항원 처리, 면역 편집, HLA 손실 또는 신생항원 프로모터 과메틸화를 비롯한 여러 가지 잠재적인 이유로 환자 종양에 의한 NeoAg 제시 부족을 반영할 수 있다고 가정한다(문헌[McGranahan et al., 2017]; 문헌[Bedognetti et al., 2019]; 문헌[Rosenthal et al., 2019]).
펩타이드-기반 암 백신 연구는 백신접종 후 임상 반응을 거의 보고하지 않았기 때문에 백신접종 접근 방식의 독특한 특징에 대해 논의할 가치가 있다. CD4+ 및 CD8+ T 세포-매개 면역성을 모두 활성화하기 위해서, 우리는 동일한 표적 NeoAg에 대해 종종 다수의 펩타이드(최대 6개)를 포함하여, 길고 짧은 NeoAg 펩타이드의 혼합물로 환자를 면역화하기로 선택하였다(표 5). 펩타이드는 염수 중에 용해되고 투여되어 어떠한 억제성의 장기간 항원 저장소 효과도 피하였으며; 염수-용해된 펩타이드의 전형적으로 짧은 반감기를 보완하기 위해서, 백신접종을 매주 투여하였다(문헌[Li et al., 2016]; 문헌[Overwijk et al., 2015]). 508개의 암-연관된 잠재적 구동자 유전자 패널에 대한 돌연변이에 초점을 맞추어 PPV 설계가 크게 단순화되었으나, 환자당 식별되는 잠재적인 NeoAg 표적의 수를 제한했는데 이는 우리 연구의 중대한 한계였다. 그러나, 이 보다 집중된 접근 방식을 통해, EGFR 돌연변이가 유망한 치료 잠재력을 가진 공유된 NeoAgs로서 식별될 수 있었다. 백신 항원보강제를 위해서, 우리는 국소 항원-제시 세포를 활성화하는데 보통으로 유효한 것으로 공지된 TLR7 작용물질인 국소-적용 이미퀴모드 크림을 사용하였다. 관찰된 NeoAg-특이성 T 세포 반응의 폭, 규모 및 타이밍에 기초하여, 우리는 우리의 면역화 접근법이 이전에 환자에서 자발적으로 프라이밍된 T 세포 반응을 높이는데 가장 효과적이었을 가능성이 있지만, 신규 T 세포 반응을 프라이밍하는 데는 제한된 효능을 나타낼 것으로 해석한다. polyI:C, 항-CD40 또는 STING 작용물질과 같은 보다 효능있고 유망한 백신 항원보강제를 장래의 펩타이드 백신 제형에 통합하면 드노보 T 세포 프라이밍의 부족을 해결하는데 도움이 될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 기존 면역 반응의 PPV-매개 활성화는 우리 연구에서 다중 임상 반응을 유도하는데 유효하였으며, 이는 NSCLC 환자를 위한 장래 백신 설계를 안내하기 위해 NeoAg 면역 반응성 사전-선별을 강력하게 지지하는 발견이다(문헌[Malekzadeh et al., 2019]).
EGFRi 요법은 PPV에 대한 임상 반응률이나 PPV-유도된 면역 반응의 크기에 영향을 미치지 않았지만, 단독 요법으로서는 이전에 실패했음에도 불구하고 환자 OS 및 PFS에 놀랍게도 긍정적인 영향을 미쳤다(도 1g; 도 5b; 도 6c; 도 8a & 8b). 우리의 기계론적 연구는 EGFRi의 면역 조절 효과가 암 백신의 효능을 증가시킬 뿐만 아니라 관문 차단 또는 조작된 T 세포요법과 같은 다른 T 세포-기반 면역요법을 개선시킬 가능성이 있음을 시사한다. 그러나, 이러한 개념은 유효성과 유용성을 확인하기 위해 향후 연구에서 엄격하게 시험해야 할 필요가 있을 것이다. 우리 연구의 더 주목할만한 발견 중 하나는 7명의 PPV 반응자 모두가 EGFR 돌연변이를 포함하는 종양을 갖고 있는 반면, EGFR-WT 종양을 가진 8명의 환자 중 누구도 PPV에 반응하지 않았다는 것이다. 상기에서 논의한 기존 면역 반응에 비추어, 우리는 1차 EGFRi 치료가 초기에 NeoAg 특이성 T 세포의 자발적 교차 프라이밍으로 이어지는 '면역원성' 종양 세포 사멸을 유도할 수 있고(문헌[Pol et al., 2015]; 문헌[Goodridge et al., 2013]), 이는 후속적으로 PPV 면역화에 의해 증대되는 것으로 추측한다. EGFR NeoAg-특이성 T 세포 프라이밍이 다른 종양 관련 NeoAg보다 유리한 지의 여부는 아직 결정되지 않았으나; EGFRi 약물은 돌연변이된 EGFR 표적 단백질에 비가역적으로 결합하는 것으로 공지되어 있으며, 이는 생각컨대 APC와 종양 세포 모두에 의한 처리 및 후속적인 NeoAg 제시에 영향을 미칠 수 있다(문헌[Yamaoka et al., 2017]). NeoAg-특이성 면역 반응의 프라이밍에서 EGFRi 요법의 정확한 역할을 기술하기 위해서는 추후의 연구가 필요할 것이다. 여러 반응 환자가 또한 관찰된 임상 반응에 기여했을 수도 있는 사적인 NeoAg에 대한 특이적 면역 반응을 생성시켰다는 점에 주목하는 것이 중요하다(도 12).
개인맞춤된 NeoAg 식별에 대한 많은 중요한 문제가 해결되어야 하지만 이러한 결과는 공유된 NeoAg가 여러 암 환자에서 면역 및 임상 반응을 유도할 수 있는 치료 백신 표적을 구성할 수 있다는 첫 번째 증거를 제공한다. HLA-A*1101 및 L858R 돌연변이의 유병률을 기반으로, KITDFGRAK NeoAg 펩타이드(서열번호 4)는 아시아인의 최대 8.4% 및 북미 NSCLC 환자의 최대 1.2%가 나타내는 것으로 추정되며, 이는 상기를 암에서 가장 널리 공유되는 NeoAg 중 하나로 만든다(문헌[Kobayashi et al., 2016]; 문헌[Gonzalez-Galarza et al., 2015]; 문헌[Wirth and Kuhnel, 2017]; 문헌[Lu and Robbins, 2016]). 다수의 다른 EGFR 돌연변이가 특정한 HLA 1배체형을 발현하는 환자에 대해 면역원성일 수 있으며, 가장 널리 퍼진 EGFR 돌연변이와 부류 I 알로타입의 HLA-A3 슈퍼패밀리 사이에 자연적인 항원 제시 '상승작용'이 존재함이 입증되었고, 이는 장래의 백신 개발 및 환자 선택에 대한 중요한 실제적 의미가 있음을 밝혔다. 또한, 종양 부담과 흉막 삼출은 둘 다 PPV 환자의 더 나쁜 전체 생존과 연관이 있기 때문에(도 10a & 10b), 초기 단계의 NSCLC 환자의 면역화는 아마도 심지어 EGFRi 내성이 발병하기 이전에, 더 나은 임상 결과와 연관될 수 있음에 주목하는 것이 중요하다. 매우 고무적이지만 이 1b상 시험의 결과는 대규모 무작위 백신 시험의 상황에서 복제되고 검증될 필요가 있을 것이나; 제시된 데이터는 이러한 연구를 시작하기 위한 설득력 있는 근거를 제공한다.
B. 방법
데이터 리포팅. 환자 샘플 수를 미리 결정하기 위해 통계학적 방법을 사용하지 않았다. 연구는 무작위화되지 않았으며 일부 연구자는 실험 및 결과 평가 동안 맹검되지 않았다.
임상 시험 설계 및 치료.
2016년 11월과 2018년 12월 사이에, 중국의 텐진 베이천(Tianjin Beichen) 병원에서 단일-군 시험이 수행되었다. 연구 프로토콜은 1975년 헬싱키 선언의 윤리 지침을 준수했으며 국제적으로 인정받는 ChiCTR과 텐진 베이천 병원의 윤리 위원회(Chinese Clinical Trial Registry(ChiCTR) 번호: ChiCTR-IIR-16009867)의 승인을 받았다. 상기 시험의 1차 종점은 안전성과 내약성, 개인맞춤된 접근법의 실행 가능성이었고, 2차 종점은 항종양 면역 반응성, 임상 반응 및 잠재적인 생존 이득이었다. 모든 환자는 연구에 등록하기 전에 서면 동의서를 제공하였다.
환자 자격. III-IV기 NSCLC 환자 24명(18명의 선암종 및 6명의 편평 세포 암종)이 개인맞춤된 신생항원 펩타이드 백신(PPV)의 이러한 임상 연구에 등록되었고 성공적으로 면역화되었다. 상기 24명의 연구 환자는 하기의 포함 기준에 따라 선택되었다: 18세 이상의 성인 환자; 임상 평가는 종양학의 NCCN 임상 관행 지침, 버전 3.2016, 비-소세포 폐암 및 8번째 판 폐암 병기 분류(Clinical Practice Guidelines in Oncology, Version 3.2016, Non-Small Cell Lung Cancer and the Eighth Edition Lung Cancer Stage Classification)에 따라 NSCLC III/IV기의 모든 환자를 분류하였다; NSCLC 진단은 생검 및 병리학적 평가에 의해 확인되었고; 환자는 수술, 화학요법, 방사선요법 및/또는 EGFR 억제제(EGFRi) 요법을 포함한 통상적인 치료에 실패한 후 질병 재발을 경험하였고, 활성 치료가 없었으며; 환자는 양호하거나 중등도의 동부 협력 종양학 그룹(ECOG) 수행성능 상태(PS≤3)를 보였고; 환자는 다른 동반 면역요법을 받고 있지 않았으며; 전처리 생검 샘플을 입수할 수 있었고 하나 이상의 유전적 돌연변이를 나타내었으며; 환자의 기대 수명은 >3개월이었다. 하기와 같은 경우 환자는 제외되었다: 임신 중이거나 수유 중인 경우; 자가면역질환 또는 기타 면역계 질환을 알고 있거나 의심되는 경우; 개인맞춤된 백신(EGFRi 제외)의 첫 번째 용량 전 4주 이내에 전이성 NSCLC 치료를 위한 전신 세포독성 화학요법 또는 실험 약물을 투여받은 경우; 개인맞춤된 백신의 첫 번째 용량 전 4주 이내에 또 다른 연구제를 수반하는 임의의 다른 임상 시험에 참여한 적이 있는 경우; 간 또는 신장 기능장애, 심각한 심장질환, 응고 기능장애 또는 조혈 손상이 있는 경우; 전신 치료가 필요한 임의의 활동성 감염이 있는 경우; 진행 중이거나 지난 5년 이내에 치료된, 현재 다른 악성종양을 앓고 있는 경우. 치료-전 종양 생검이 상기 시험에 필요하였으며, 치료-후 생검은 선택적이었고, 추가 환자 동의가 필요하였다. 연구 환자의 임상적 특징을 도 4a에 나타내었고, 16명의 EGFR 돌연변이 환자의 EGFRi 치료 이력을 도 4b에 나타내었다.
개인맞춤된 신생항원 백신의 생성.
체세포 돌연변이 분석. 환자 종양 시편을 폐 또는 림프절에 있는 종양 부위의 미세 바늘 생검으로 수득하였다(표 7). 개별 환자의 종양 생검은 텐진 베이천 병원(중국 텐진 소재)에서 표준 임상 및 병리학 실험실 시험 절차와 함께 508 유전자 패널을 사용하여 DNA 서열분석되었다. 이 유전자유형분석 패널은 508개의 암 관련 유전자 내에서 공유된, 종양-연관 구동자 돌연변이를 감지하도록 설계되었다(표 4). TIANamp 제노믹(Genomic) DNA 키트(중국 티앙젠 소재)의 지침에 따라 생검 샘플에서 종양 DNA를 추출하고, 하이브리드화 후 차세대 DNA 서열분석(헝지아 의학 실험실(HengJia Medical Laboratory), 중국 텐진 소재)에 의한 엑손 포획을 사용하여 프로파일된 Hiseq X-10(일루미나(Illumina), 미국 소재)으로 검출하였다. 체세포 돌연변이 호출의 경우, 환자의 종양 및 일치하는 PBMC(정상 생식세포계열 DNA의 공급원으로서)의 차세대 서열분석 데이터의 분석을 사용하여, 단일 아미노산 미스센스 돌연변이 및 작은 삽입/결실(indel)로 이어지는 단일-, 이중- 또는 삼중-뉴클레오타이드 변이체를 포함한 특정 암호화-서열 돌연변이를 식별하였다. 일루미나 소프트웨어의 출력은 잘 보정된 품질 점수와 함께 정렬된 판독값(bwa 버전 0.7.8, NCBI 휴먼 레퍼런스 게놈 빌드(Human Reference Genome Build) hg19에 정렬됨)을 포함하는 BAM 파일을 생성하기 위해 브로드 피카드 파이프라인(Broad Picard Pipeline)에 의해 처리되었다. 체세포 단일 뉴클레오타이드 변이(sSNV), 체세포 작은 삽입 및 결실은 모두 Varscan2(버전 2.4.3)를 사용하여 검출되었다. 모든 indel은 인테그라티브 제노믹스 뷰어(Integrative Genomics Viewer)(버전 2.4.1)를 사용하여 수동으로 리뷰되었다. 모든 체세포 돌연변이, 삽입 및 결실은 안노바(Annovar)(버전 2013-07-28 11:32:41)를 사용하여 주석첨가되었다. 신생항원 펩타이드는 0.04 이상의 돌연변이된 변이 대립유전자 빈도에서 검출된 비동의 체세포 돌연변이를 기반으로 선택되었다.
HLA 유형분석. 등록 당시 고분해능 HLA 유형분석을 위해 말초 혈액을 채취하였다. 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자좌는 DNA 증폭 단계(캐피탈바이오(CapitalBio), 중국 소재)를 사용하는 폴리머라제 쇄 반응-서열 기반 유형분석(PCR-SBT) 방법을 통해 유형분석되었다. 간단히 말해서, 매직 비즈(Magic Beads) DNA 추출 키트(TANBead, 중국 소재)의 설명에 따라 환자의 말초혈액에서 DNA를 추출하였다. HLA 부류 I 유전자(HLA-A, B, C)의 엑손 2 및 3과 HLA 부류 II α 및 β 유전자(HLA-DQ, DR)의 엑손 2를 증폭 및 정제하고, ABI 3730XL DNA 분석기(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 미국 소재)에서 PCR 산물을 서열분석하였다. ATF1.5 소프트웨어(코넥시오 제노믹스(Conexio Genomics), 오스트레일리아 소재)를 사용하여 서열 크로마토그램을 분석하였다.
백신 펩타이드 선택. 폐암에서 전형적으로 발견되는 체세포 돌연변이의 높은 수, 및 대다수가 개인 '승객' 돌연변이를 구성한다는 사실로 인해, 우리는 508개의 종양 관련 유전자의 집중 패널에서 검출된 체세포 돌연변이를 표적화하도록 선택하였다. 이 접근법의 근거는 두 가지이다: (1) 돌연변이의 표적화를 가능하게 하여 종양 표현형에 필수적일 가능성이 높으므로 면역 편집을 통해 손실될 가능성이 적고, (2) 다수의 NSCLC 환자에게 잠재적으로 이득이 될 수 있는 공유된 신생항원 표적의 식별 기회를 증가시킨다. 상기 508-유전자 패널에 의해 검출된 비동의 암호화 돌연변이는 인 실리코(in silico)로 번역되었고 생성된 신생항원 서열은 HLA-펩타이드 예측 알고리즘 NetMHC4.0, NetMHCpan3.0, NetMHCpan4.0, NetMHCII2.2 및 NetMHCII2.3(문헌[Andretta et al., 2015]; 문헌[Jensen et al., 2018])에 따라 환자 HLA 부류 I 및 부류 II 분자에 대해 예측된 결합 친화도에 대해서 평가되었다. 면역화 신생항원 펩타이드는 주로 환자의 HLA 부류 I 및 부류 II 분자에 대한 가장 높은 예측 결합 친화도를 기반으로 선택되었다. 그러나, 백신은 관여된 다양한 HLA 분자의 수를 최대화하고 가능한 경우 HLA-내 펩타이드 경쟁을 최소화하도록 설계되었다. 면역화 펩타이드의 합성 가능성 또는 용해도에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 몇몇 생화학적 성질(예를 들어 상승된 소수성 또는 다수의 시스테인의 존재)이 또한 고려되었다. 또한, 우리는 대략 2:1 비의 짧은 백신 펩타이드 대 긴 백신 펩타이드를 함유하거나, 또는 체세포 돌연변이 프로파일링 및 HLA/펩타이드 결합 예측이 허용하는 것에 최대한 근접하도록 개별 환자 백신을 설계하는 것을 목표로 하였다. 각 환자에 대해서, 최대 12개의 독립적인 돌연변이에서 발생하는 9 내지 17개 아미노산 길이의 최대 14개 펩타이드가 선택되었고 우선 순위가 지정되었다. 환자당 평균 9.4개의 신생항원 펩타이드가 펩타이드 합성을 위해 선택되었으며, 여기에는 평균 6.5개의 짧은 HLA 부류 I-제한된 펩타이드 및 2.9개의 긴 HLA 부류 II-제한된 펩타이드가 포함되었다(표 5).
환자 면역화. 면역 펩타이드는 표준 고상 합성 펩타이드 화학을 사용하여 합성되었고 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 >98%까지 정제되었으며 무균 및 내독소의 존재를 시험하여 양호한 제조 관행(헝지아 네오안티젠 바이오테크놀로지(HengJia Neoantigen Biotechnology)(텐진) 캄파니 리미티드)과 일치하는 방법론을 사용하여 안전성 및 내약성을 보장한다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 환자당 5 내지 14개의 펩타이드를 합성하고 멸균 포스페이트-완충된 염수(PBS)에 개별적으로 용해시키고 2개의 개별 펩타이드 칵테일로 혼합하였으며, 각각 총 1 ㎖ 부피당 2 내지 7개의 짧은 펩타이드 및 1 내지 3개의 긴 펩타이드를 갖는다. 동일한 HLA 알로타입에 결합하는 펩타이드를 잠재적인 항원 경쟁을 줄이기 위해 상이한 칵테일로 분리하였다. 환자는 면역화당 200 ㎍의 각 펩타이드를 수용하였으며, 왼쪽과 오른쪽 사지에 피하 주사되었고, 최소 12주 동안 매주 투여되었다. pAPC의 동반 톨형 수용체(TLR)-7 자극을 제공하기 위해서, 5% 이미퀴모드를 갖는 알드라(Aldara) 크림을 펩타이드 칵테일 투여 직후 백신 부위에 백신 항원보강제로서 국소 적용하였다. 환자는 목적하는 경우 환자의 최선의 이익을 위해 12주 후에 면역화를 계속할 수 있었다. 24명의 환자 중 11명은 도 2 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 12주를 초과하여 백신접종을 계속 수용하였다.
샘플 수집. 일련의 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 샘플을 치료-전 및 백신접종-후 4, 8 및 12주째에 수집하였다. 텐진 베이천 병원의 진행성 암 환자 규정에 따라, 한 달에 최대 15 ㎖의 혈액을 채취하였다. 시험 기간 12주 이후에 추가 혈액 샘플을 수집하는 것은 선택 사항이었고 추가적인 환자 동의가 필요하였다. 추가 혈액 샘플은 모두 임상 객관적 반응을 경험한 환자 5, 8 및 17로부터 수집되었다. 생육성 PBMC를 수집하고 -80℃에서 보관하였다. 백신-후 종양 생검의 수집은 선택 사항이지만 그 과정의 침습적 특성, 불확실한 실행 가능성 및 대부분의 환자의 일반적인 꺼림으로 인해 이 시험에서 필수는 아니다. 추가의 RNA 서열분석 및/또는 벌크 T 세포 수용체 VB CDR3 서열분석을 위해 수득된 종양 조직을, 서면 동의서를 제공한 후 PPV 시험 환자 5, 12, 16, 23 및 24로부터 수집하였다.
종양 반응 평가 기준. 객관적인 종양 반응 평가는 고형 종양의 반응 평가 기준(RECIST 버전 1.1) 지침에 따라 이루어졌다. 우리는 컴퓨터 단층 촬영(CT) 및/또는 자기 공명 영상(MRI) 스캔을 사용하여 선택된 표적 병변을 측정하였다. 환자는 기준선 측정을 위해 적어도 한 번의 치료-전 스캔을 수행하고 반응 평가를 위해 백신 접종 후 3 내지 4개월째에 또 다른 스캔을 수행해야 했다. 가능한 경우 백신 접종의 첫 12주 동안 매월 추가적인 환자 스캔을 수행하였다. 최소 크기가 10 ㎜(악성 림프절의 경우 15 ㎜)인 표적 병변은 3명의 다른 영상의학과 의사에 의해 가장 긴 직경에서 측정되었으며, 3개의 독립적인 측정값의 평균이 임상 평가에 사용되었다. 기관당 최대 2개의 표적 병변이 측정되었으며, 가장 큰 2개의 병변이 선택되어 최대 총 5개의 병변이 선택되었다. 종양 부담은 모든 표적 병변의 직경의 합으로 계산되었다(도 5b). 임상 반응은 하기와 같이 평가되었다: CR, 모든 표적 병변의 완전한 소실; PR, 부분 반응, 표적 병변의 직경 합계의 30% 감소로 정의됨; PD, 진행성 질병, 표적 병변의 직경 합계의 최소 20% 증가 또는 새로운 병변의 출현으로 정의됨; 및 SD, PR 또는 PD에 대한 자격을 갖추기에 불충분한 종양 부담의 변화로 정의되는 안정 질병. 임상 반응은 첫 번째 면역화 날짜로부터 3 내지 4개월 후에 평가되었다.
임상 시험 통계 계획. 통계학적 분석은 이상 반응을 경험한 환자의 수를 포함하여 주로 기술적이었다. 모든 통계학적 검정은 0.05의 알파 수준으로 양측이었다. 평가할 신뢰도 구간은 유의수준 0.05로 구성되었다. 데이터에 대한 추가적인 탐색 분석이 적합하다고 판단되는 경우 수행되었다.
1차 종점 분석. 치료-연관된 부작용이 국립 암 연구소의 부작용에 대한 공통 용어 기준(버전 4.0)에 따라 분류 및 등급화된 것을 기반으로 분석되었다. 백신 치료의 첫 12주 동안 및 12주를 초과하여 백신접종을 지속하는 동안, 각 백신접종 당일부터 그 후 최대 48시간 동안 안전성 평가를 수행하였다. 추적 관찰 기간이 연장된 환자에 대해 2개월마다 안전성 평가를 수행하였다. 기준선(치료 전)에 존재했던 질병 관련 증상은 백신접종 후 악화되지 않는 한 보고되지 않았다.
2차 종점 분석. 무진행 생존(PFS) 및 전체 생존(OS)을 포함한 2차 종점은 카플란 마이어 방법을 사용하여 요약되었다. ELISA, ELISPOT 및 사량체 분석을 통한 면역 반응의 측정은 첫 번째 백신접종 전 및 각 백신접종 후 4주마다 기술적으로 요약되었다. 등록된 대상에 대한 PFS 및 OS의 측정은 등록 날짜부터 질병 진행 및/또는 사망까지 또는 2018년 12월 31일까지 각각 계산되었다. 하위 그룹 분석. 다양한 반응 및 생존 프로파일을 기반으로, 우리는 야생형(WT) 또는 돌연변이(Mut) EGFR 돌연변이 상태를 기반으로 하는 하위 그룹에 따라, 등록된 환자를 분석하였으며, 면역화 시작 전에 EGFR 억제제 사용이 계속되었는지 또는 중단되었는지 여부를 분석하였다. 이 그룹은 EGFR WT-PPV 단독(그룹 1), EGFR Mut-PPV 단독(그룹 2) 및 EGFR Mut-PPV+EGFRi(그룹 3)로 정의되었다.
효소 결합 면역 흡착(ELISA) 및 효소 결합 면역 스팟(ELISPOT) 분석. 면역화 시작 전 및 PPV 후 상이한 시점에서 수집된 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 피콜(Ficoll) 밀도 구배 원심분리에 의해 분리하고 동결보존 전에 생육력을 평가하기 위해 트립판 블루 염료의 존재 하에서 카운트하였다. ELISA 분석을 위해, 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640 중의 5x105 PBMC를 총 부피가 250 ul인 96-웰 플레이트의 각 웰에 가하였다. PBMC를 300 IU/㎖ 인터류킨(IL-2)과 함께 백신 펩타이드 풀, 개별 백신 펩타이드 또는 무관한 대조군 펩타이드(7.5u g/㎖)의 존재하에 5% CO2가 있는 37℃ 가습 배양기에서 5시간 동안 배양하였다. 24시간의 펩타이드 재자극 후, 제조사의 지침에 따라 인간 IFN-γ ELISA 키트(Dakewe, 중국 소재)를 사용하여 세포 상등액의 IFN-γ 농도를 측정하였다. 펩타이드 대조군이 없는 배경 신호에 비해 IFN-γ 분비 수준이 1.5배 이상인 경우 양성 면역 반응으로 간주되었다. 백신-유도된 면역 반응의 폭, 강도 및 지속성을 고려한 면역 반응 ComboScore(IRC)는 각 환자에 대해 하기와 같이 계산되었다: 모든 시점에서(처리-전, 4, 8 및 12주) 모든 백신 펩타이드에 대해 ComboScore = 변화 배수의 합 >1.5. ELISPOT 분석을 위해, 2.5x105 PBMC를, 96웰 플레이트의 각 웰에 대해 총 부피가 150 ㎕인, 0.5% FBS를 함유하는 RPMI-1640에서 제조하였다. 생체 외 PBMC를 10 ug/㎖의 최종 농도에서 개별 백신 펩타이드로 3회 반복하여 자극하고, 플레이트를 36시간 동안 5% CO2가 있는 가습 배양기에서 37℃에서 배양하였다. 스폿 검출을 인간 IFN-γ ELISpotPRO 키트(MABTECH Inc., 미국 소재)를 사용하여 수행하였고, 106 PBMC당 검출된 IFN-γ 스폿 수로 정규화하였다.
사량체 염색 및 유식 세포측정 분석. 선택된 맞춤형 피코에레트린(PE) 또는 APC-접합된 HLA-펩타이드 사량체(미국 베일러 의과대학; MBL, 일본 소재)가 성공적으로 생성되었다(도 13a). PBMC를 해동하고 0.5% 소 태아혈청(FBS)을 함유하는 RPMI-1640에 재현탁시켰다. 형광단이 접합된 HLA/펩타이드 사량체(1:50 희석)를 포함하는 100 ㎕ PBS-1% BSA를 5x105 PBMC에 가하고 암실에서 20분 동안 실온에서 배양하였다. 세포를 PBS-1% BSA로 세척하고 FITC- 또는 PE-접합된 항-CD8 mAb(바이오레전드(Biolegend), 미국 소재, 1:200 희석)로 염색하고 15분 동안 배양하였다. 이어서 세포를 세척하고 유식 세포측정 분석(LSRFortessa X-20 분석기)을 위해 400 ㎕ PBS-1% BSA에 재현탁하였다.
종양 RNA 서열분석 및 벌크 T 세포 수용체 Vβ CDR3 서열분석. 백신접종-후 종양 샘플을 환자 동의를 얻은 후 환자 12, 16, 23 및 24로부터 수집하였다. RNA 추출 키트(퀴아겐(Qiagen), 미국 소재)를 사용하여 환자의 종양 조직에서 RNA를 단리하였다. 제조사의 설명에 따라 NEBNext(등록상표) Ultra(상표) RNA 라이브러리 프렙 키트(일루미나, 미국 소재)를 사용하여 라이브러리를 생성시켰다. 라이브러리를 AMPure XP 시스템(벡크만 쿨터(Beckman Coulter), 독일 소재)으로 정제하고 샘플을 일루미나 NovaSeq 플랫폼(일루미나, 미국 소재)을 사용하여 서열분석하였다. T 세포 수용체(TCR) 다양성 분석을 위해, DNA 추출 키트(퀴아겐, 미국 소재)를 사용하여 환자 5의 PBMC 또는 치료-전 및 -후 종양 생검에서 DNA 샘플을 추출한 후 2 라운드의 PCR-기반 증폭으로 라이브러리를 구성하였다. V 및 J 유전자 각각에 대한 특정한 프라이머를 사용하여 CDR3 단편을 먼저 증폭시키고, 다중-PCR 산물의 표적 단편을 자기 비드(A63882, 벡크만, 독일 소재)를 사용하여 정제하였다. 다음으로, 범용 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고 200-350 bp의 표적 단편을 검색하고 QIAquick 젤 정제 키트(퀴아겐, 미국 소재)를 사용하여 정제하였다. 이어서 일루미나 X10 플랫폼을 사용하여 PCR 산물을 서열분석하였다. 단일-판독 CDR3 서열을 제거하고 나머지 서열을 분석하여, 이전에 기재한 바와 같이 치료 전후 환자의 TCRVβ IMGT 클론성을 평가하였다(문헌[Tumeh et al., 2014]).
단-세포 T 세포 수용체 서열분석. 환자 5의 PPV-후 PBMC에서 HLA-A*1101/KITDFGRAK(서열번호 4) 사량체+ CD8+ T 세포를 유동-기반 세포 분류기(BD FACSAria III, 미국 소재)를 사용하여 분류하고 공초점 현미경(레이카(Leica), 독일 소재)으로 영상화하였다. 분류된 Tet+ 세포를 PBS에서 ㎖당 1 x 106 세포로 조절하고 크로뮴 단세포 조절기(Chromium Single Cell Controller)(10X 제노믹스(Genomics), 미국 소재)에 로딩하여, 싱글 셀 5'라이브러리 앤드 젤 비드 키트(Single Cell 5'Library and Gel Bead Kit)(10X 제노믹스, 미국 소재)를 사용하여 유화액(GEM) 중의 단-세포 젤 비드를 생성시켰다. 포획된 세포를 제조사의 설명에 따라 용해하고 방출된 RNA를 역전사를 통해 바코딩하여 개별 GEM 중의 바코드-함유 cDNA를 생성시켰다. V(D)J 서열을, 보존된 TCR 서열을 표적화하는 특정 프라이머를 사용한 네스티드 PCR 증폭에 의해 농축시켰다. 서열분석을 150 bp(PE150) 짝 단부가 있는 일루미나 NovaSeq 플랫폼에서 수행하였다. 셀레인저(Cellranger) VDJ를 V(D)J 재조합, T 세포 다양성 및 각 개별 T 세포에 대한 적합한 TCR α 및 β 쇄 서열의 짝짓기를 분석하는데 사용하였다. Tet+ 세포의 단-세포 서열분석으로 639개의 별개의 TCRα/β 쌍이 확인되었다. 그러나 사량체 기반 세포 분류는 비-항원 특이성 T 세포로 오염될 수 있기 때문에 최소 10개의 VβCDR3 판독이 검출된 TCR 클론을 선택하여 51개의 독특한 TCR 클론을 생성시켰다. 임의의 PBMC 또는 TIL 샘플에 거의 존재하지 않거나 전혀 존재하지 않는 Vβ-CDR3 서열을 갖는 4개의 클론은 분석에서 제거되었고, 7 또는 8개의 CDR3 판독이 있는 5개의 추가 TCR 클론은 신생항원-특이성 T 세포 클론에 대해 예상되는 바와 같이, PPV 중 PBMC 및/또는 TIL에서 증가하는 빈도를 기반으로 포함되었다.
TCR 클로닝 및 검증. 단세포 서열분석에 의해 획득된 TCR Vα-N1 및 Vβ-N1 쇄의 가변 영역 서열을 α 및 β 쇄 짝짓기를 향상시키기 위해 조작된 인간 불변 영역에 융합시켰다(문헌[Cohen et al., 2007]). 이들 변형된 Vα 및 Vβ 쇄 서열을 합성하고 렌티바이러스 렌티-EF1a-TCR-N1을 생성시키기 위해 렌티바이러스 발현 벡터 pCDH 기반 EF1a 프로모터에 삽입하였다. 건강한 공여자 PBMC를 림프구 분리 배지(스템 셀(Stem Cell), 캐나다 소재)를 사용하여 준비하였다. T 세포를 다이나비즈(Dynabeads)(등록상표) 인간 T-Expander CD3/CD28 키트(써모피셔(Thermofisher), 미국 소재)를 사용하여 단리하고, 3 ㎖ X-Vivo15 무혈청 배지(론자(Lonza), 스위스 소재)와 혼합하고, 37℃에서 5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 세포 밀도를 1 x 106/㎖로 조절하고 5% CO2에서 37℃에서 4일 동안 패키징된 렌티바이러스 렌티-EF1a-TCR-N1과 공-배양하였다. TCR-N1 발현 및 항원 특이성을, HLA-A*1101/KITDFGRAK(서열번호 4) 사량체로 염색하여 확인하였다. IRES 서열을 통해 HLA-A*1101 cDNA에 연결된 KITDFGRAK 펩타이드(서열번호 4)를 암호화하는 미니유전자를 합성하고 EF1a 프로모터가 있는 렌티바이러스 벡터 pCDH에 삽입하여 렌티바이러스 lenti-EF1a-KIT-A11을 생성시켰다. 대조용 렌티바이러스 구성물은 KITDFGRAK(서열번호 4) 미니유전자 또는 HLA-A*1101을 개별적으로 발현하는 벡터가 포함되었다. 관심 유전자(들)를 안정적으로 발현하는 렌티바이러스-형질도입된 A549 폐암 세포를 퓨리노마이신-기반 선택을 통해 선택하였다. HLA-A*1101 표면 발현을, A*1101-특이성 mAb로 염색한 후 유식 세포측정 분석을 통해 확인하였다. 조작된 TCR-N1-T 세포를, 1:1, 2.5:1, 5:1 및 10:1의 효과기-대-표적 비로, 5% CO2에서 37℃에서 모 A549, A549-A11, A549-KIT 또는 A549-A11.KIT 세포(웰당 20,000 표적 세포)와 공-배양하였다. 동일한 PBMC 공여자로부터의 형질도입되지 않은, 확대된 T 세포를 대조군에 사용하였다. ELISA에 의해 IFN-γ 분비 수준을 평가하기 위해 공-배양 24시간 후에 상등액을 수집하였다.
면역침전 및 웨스턴 블럿. H1975(EGFR-L85R/T790M) 및 H1299(EGFR-WT) 폐암 세포주(ATCC, USA)를, EGFRi 치료 조건을 최적화하기 위해 상이한 기간 동안 상이한 농도(0.1, 1, 2 및 5 μM)의 EGFRi 오시메르티닙(LC 레보라토리즈, 미국 소재)으로 처리하였다. 세포를 냉 PBS로 세척하고 용해 완충액(1% 트리톤 X-100, 시그마, 미국 소재) 및 할트 프로테아제 억제제 칵테일(Halt Protease Inhibitor Cocktail) 100X 및 0.5 μM EDTA 100X(써모 사이언티픽, 미국 소재)를 사용하여 용해시켰다. 브래드포드(Bradford) 분석 키트(바이오래드(BioRad), 미국 소재)로 단백질 농도를 측정하기에 앞서 용해물을 수집하고 4℃에서 30분 동안 고속으로 원심분리시켰다. 샘플당 10 ㎕ 피어스(Pierce) 단백질 A/G 울트라 링크(Ultra Link) 수지(써모 사이언티픽)를 사용하여 사전 제거를 수행하고 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 동일한 양의 총 단백질을 사용하고 세포 용해물을 하기의 항체와 500:1 희석비로 4℃에서 18시간 동안 배양함으로써 면역침전을 수행하였다: 항-포스포-EGFR(EMD 밀리포어(Millipore)), 항-EGFR, 항-p44/42 MAPK ERK1/2, 항-포스포-p44/42 MAPK ERK1/2 및 항-GAPDH(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)). 단백질 A/G 가교결합 비드를 가하고 냉 PBS로 세척하기에 앞서 4시간 동안 배양하였다. 샘플을 SDS-PAGE 구배(8-16%) 젤(인비트로젠(Invitrogen), 미국 소재)을 사용하여 실행시켰다. 단백질을 PVDF 멤브레인(써모 사이언티픽, 미국 소재)으로 옮기고, 1:1000 농도에서 밤새 특정 항체와 배양하기 전에 5% 우유로 블럿을 차단하였다. 블럿을 세척하고 퍼옥시다제-접합된 항-토끼 2차 항체(1:10,000)(잭슨 임뮤노 리써치(Jackson Immuno Research), 미국 소재)와 배양하였다. 블럿을, 슈퍼 시그널 웨스트 피코(Super Signal West Pico) PLUS 화학발광 증대된 양고추냉이 페록시다제 기질(써모 사이언티픽, 미국 소재)를 사용하여 전개시키고 X-선 필름으로 시각화하였다.
폐 종양 세포주의 RNA 서열분석. H1975 및 H1299 폐암 세포를 1 μM의 EGFRi 오시메르티닙(LC 레보라토리즈, 미국 소재)으로 0h, 12h 또는 24h 동안; 또는 배양 마지막 12시간 동안 첨가된 1μM의 EGFRi 오시메르티닙(LC 레보라토리즈, 미국 소재) + 500 U/㎖ 재조합 인간 IFNγ(R&D 시스템스, 미국 소재)으로 24h 동안 처리하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy 미니 키트(퀴아겐, 미국 소재)를 사용하여 세포를 용해하고 전체 RNA를 준비하였다. RNAseq는 아베라 인간 유전학 연구소(Avera Institute for Human Genetics)(미국 사우스 다코타주 소재)에서 하기와 같이 수행하였다: 전체 RNA를 2100 생물분석기(에이질런트(Agilent), 미국 소재)에서 실행된 RNA 6000 Nano 칩에서 분해에 대해 평가하였으며, 여기서 샘플 세트의 평균 RNA 무결성 점수는 9.7이었다. 낮은 샘플 과정에 따라 TruSeq 가닥 전체 RNA 라이브리러 프렙 키트(일루미나 인코포레이티드, 미국 소재)를 사용하여 서열분석 라이브러리를 제조하였다. 간단히, 리보솜 RNA(rRNA)를 전체 RNA에서 고갈시키고 나머지 RNA는 정제하고 적합하게 단편화하고 cDNA 합성을 위해 프라이밍하였다. 첫 번째 및 두 번째 가닥 합성 후에 절두된-단부 cDNA가 생성되었다. 3' 절두된-단부의 아데닐화에 이어서 cDNA 단편의 농축 전에 어댑터를 결찰시켰다. 최종 라이브러리 품질 관리를 2100 생물분석기(에이질런트, 미국 소재)에서 실행된 DNA1000 칩에서 단편 크기를 평가하여 수행하였다. 평균 라이브러리는 326의 삽입 bp 크기를 생성시켰다. 각 라이브러리의 농도를 서열분석에 앞서, 차세대 서열분석을 위한 KAPA 라이브러리 정량분석 키트(KAPA 바이오시스템스, 미국 소재)에 의한 정량적 PCR(qPCR)에 의해 측정하였다. 라이브러리를 0.1% 트윈 20을 사용하여 10 mM 트리스-Cl, pH 8.5에서 2 nM로 정규화한 다음 균일하게 모았다. 모은 라이브러리를 0.05 M NaOH로 변성시키고 20 pM로 희석하였다. 변성된 라이브러리의 클러스터 생성은 HiSeq PE 클러스터 키트 v2 화학 및 유동 셀을 사용하여 제조사의 명세서(일루미나 인코포레이티드, 미국 소재)에 따라 수행되었다. 라이브러리를 대략 1% PhiX 스파이크-인으로 클러스터링하였다. 서열분석 x 합성(SBS)을 대응-단부 101 bp 판독과 함께 v2 화학을 활용하는 HiSeq2500 상에서 수행하여, 샘플당 평균 5,240만 대응-단부 판독을 생성시켰다. 서열 판독 데이터를 일루미나 베이스스페이트(Illumina BaseSpace) 분석 소프트웨어, FASTQ 세대 v1.0.0에 의해 하류 분석을 위한 FASTQ 형식으로 처리하고 변환시켰다.
RNA 서열분석 데이터 분석. 환자 및 세포주 RNAseq 데이터의 품질 관리는 FastQC v0.11.5, FastQ Screen v0.11.1, RSeQC v3.0.0, MultiQC v1.6 및 BostonGene 플랫폼의 독점 알고리즘을 사용하여 수행되었다(문헌[Wingett et al., 2018]). 허용 가능한 품질(양호한 phred 점수, 판독 길이에 따른 염기서열 함량에 따라 양호함, 암호화 판독 >50 M, 어댑터 함량 <15%, <5% 미생물군집/마우스 고유 게놈 오염)을 가진 4명의 환자 샘플이 추가 분석을 위해 선택되었다. RNAseq 판독을 칼리스토(Kalisto) v0.42.4를 사용하여 GENCODE v23 전사물에 위-정렬시켰다(문헌[Bray et al., 2016]). [protein_coding, IG_C_gene, IG_D_gene, IG_J_gene, IG_V_gene, TR_C_gene, TR_V_gene, TR_D_gene, TR_J_gene] 중의 전사물 유형을 갖는 전사물을 선택하고, 비-암호화 RNA 전사물 및 히스톤 및 미토콘드리아 전사물을 제거하여 20,062개의 단백질 암호화 유전자를 생성시켰다. 유전자 발현을, 백만당 전사물(TPM) 및 변환된 log2로 정량분석하였다(문헌[Conesa et al., 2016]). EGFRi로 처리된 세포주의 유전자 발현 변화는 처리되지 않은 대조용 세포에 대해 정규화된 상대적(log) 발현으로 도시되었다. 환자의 종양 유전자 발현은 4명의 환자 샘플 내에서 중간값-중심이었고, 이때 유전자 발현은 히트맵에 표시된 대조용 중간값에 비교되었다. PROGENy v1.4.1을 사용하여 7개의 경로 활성 점수를 계산하였다(EGFR, MAPK, PI3K, TRAIL, TNFa, NFkB, JAK-STAT; 문헌[Schubert et al., 2018]). 다른 경로 특징 점수는 사내 파이톤 실행을 사용하여 ssGSEA를 사용하여 계산되었다. 상기 경로 활성을 달리 명시되지 않는 한, mSIGdB v6.2(문헌[Subramanian et al., 2005])로부터 다운로드된, 유전자 특징으로서 나타내었다: "세포 주기 특징" -HALLMARK_G2M_CHECKPOINT, "세포자멸사 특징" - HALLMARK_APOPTOSIS, MYC HALLMARK_MYC_TARGETS_V2, "EMT 특징" 788-HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION, "IFN-0 특징" HALLMARK_INTERFERON_GAMMA_RESPONSE, "HLA 발현" - 유전자 세트(HLA-A, HLA-B, HLA-C). 대조군에 대한 경로 점수 차이는 개별적으로 각 경로의 최대값으로 정규화되었고 선 플롯에 표시되었다. 도식적 표현을 위해, 대조용 시점(0시간)에서 24h 시점까지 경로 활성 점수 변화의 최대 절대 편차를 각 경로 내에서 계산하였다. 스키마의 경로 색상은 최대 절대 편차의 퍼센트에 해당한다. 세포 디콘볼루션을 quanTIseq 접근법을 사용하여 RNAseq 데이터로부터 수행하였다(문헌[Finotello et al., 2018]). 히트맵, 점 플롯, 선 플롯, 막대 플롯을 pandas v0.23.4, matplotlib v2.1.1 및 seaborn v0.9.0 파이톤 패키지를 사용하여 생성시켰다(문헌[Liang et al., 2016]).
루미넥스 분석. 미처리 및 1 μM EGFRi 처리된 H1975 및 H1299 세포주에서 얻은 상등액의 중복 샘플을 제조사의 설명(R&D 시스템스, 미국 소재)에 따라 맞춤 루미넥스 키트를 사용하여 CCL2, CXCL1, CXCL2, CXCL8, IP10, IL1RA, IL6, VEGFA, CSF2 및 CSF3 단백질의 존재에 대해 분석하였다. 50 마이크로리터의 시험 상등액 및 적합한 미세입자 칵테일을 각 웰에 첨가하고(1:10 희석) 실온에서 미세플레이트 진탕기에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 3회 세척하고 비오틴-항체 칵테일(1:10 희석) 50 ㎕를 가하고 1시간 동안 배양한 다음 3회 세척하였다. 50 ㎕의 스트렙트아비딘(1:25 희석)과 30분간 배양 후에, 상기 플레이트를 3회 세척하고, 미세입자를 완충액에 재현탁시키고 루미넥스 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 판독하였다. EGFRi-유도된 변화를 측정된 기준선(0시간) 농도와 비교하여 증가 배수 또는 감소 배수로서 나타내었다. 측정된 농도가 검출 수준 미만인 경우, 제조사에 따른 검출의 최소 한계를 사용하였다.
T 세포 기능 분석. T 세포 이동: 1 μM 농도의 EGFRi 오시메르티닙(LC 레보라토리즈, 미국 소재)을 사용하여 24시간 동안 H1975 세포를 처리하였다. 배지만 있는 DMSO를 대조군으로 사용하였다. 이어서 세포를 세척하고 ImmunoCulut-XF T 세포 확대 배지(스템 셀 테크놀로지, 캐나다 소재)에서 24시간 동안 배양하고, 그 후에 세포 상등액을 수집하고 밀렉스(Millex)-GS 필터를 사용하여 여과하였다. 건강한 공여자 PBMC 또는 확대된 흑색종 CD8+ 종양-침윤성 림프구(TIL 3311 및 TIL3329)를 이동 분석을 수행하기 약 16시간 전에 해동하였다. 650 ㎕의 H1975 세포 상등액을 트랜스웰 플레이트(코닝(Corning), 미국 소재)의 바닥에 놓고 상단 웰에서 3x105 개의 건강한 공여자 PBMC와 함께 6시간 동안 배양하였다. 웰 바닥에서 이동된 세포를 수집하고 4℃에서 30분 동안 CD4, CD8 또는 CD14(바이오레전드(Biolegend))에 대해 염색하고, PBS로 세척하고, 4% PFA로 고정시켰다. 정확한 세포 수를 얻기 위해 50 ㎕의 카운팅 비드를 각 샘플에 가하였다. 샘플을 칸토(Canto) II 유식 세포계에서 실행하고 플로우조(FlowJo) V10을 사용하여 분석하였다.
HLA 부류 I 정량분석 및 T 세포 항원 인식: H1299 및 H1975 세포를 6시간 또는 20시간 동안 1 μM EGFRi 오시메르티닙(LC 레보라토리즈) 또는 DMSO 대조군으로 처리하였다. 세포를 수집하고 전체 부류 I(W6/32-APC, 써모 피셔, 미국 소재)에 대해 염색하고, 세척하고 4% PFA에서 고정시켰다. 샘플을 칸토 II 유식 세포계에서 실행하고 플로우조 V10을 사용하여 분석하였다. H1975 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 50,000개 세포로 시딩하고 EGFRi를 사용하여 웰당 0, 0.1 및 0.3 μM 농도의 세포를 24시간 동안 처리하였다. 이어서 H1975 세포를 세척 전 1시간 동안 0, 10 또는 100 nM의 동족 HLA-A*0101-제한된 VGLL1 펩타이드 LSELETPGKY(서열번호 978)로 펄스화하였다. 이어서 VGLL1 펩타이드 항원-특이성 CD8+ T 세포를 1:1 효과기 대 표적 세포 비로 가하고 밤새 공-배양하였다. 인간 IFN-γ ELISA 키트(인비트로젠, 미국 소재)를 사용하여 24시간 세포 상등액 중의 IFN-γ를 분석하고 스펙트라맥스(SpectraMax)(등록상표) M5/M5e 다중 모드 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 판독하였다.
통계학적 분석. 모든 통계학적 분석은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad Software Inc.), 미국 캘리포니아주 라 호이아 소재)를 사용하여 수행되었다. 생존곡선과 생존율을 로그-순위(만텔-콕스) 검정을 사용하여 계산하고, 전체 생존을 등록일로부터 2018년 12월 31일 또는 사망시까지 측정하였다. 양측 스튜던트 t 검정 또는 만-휘트니 U 검정을 사용하여 그룹 간의 통계학적 유의수준을 분석하였다. 0.05 이하의 P-값은 통계학적 유의수준을 결정하는데 사용된 한계값이었다.
데이터 가용성. 환자 종양 및 세포주의 대량 RNA 서열분석, 단세포 TCR 쌍 αβ 쇄 서열분석, 현재 연구 중에 생성 및 분석된 TCR VβCDR3 서열분석의 원 데이터는 NCBI 서열 판독 아카이브((Sequence Read Archive)(SRA)(코드 SRP188005)를 통해 입수할 수 있다. 잠재적인 환자 식별이 가능한 DNA 서열분석 데이터(돌연변이 발견을 위한)는 등록된 환자의 사전 동의에 포함되지 않았으며, 식별 정보가 없는 데이터는 합리적인 요청에 따라 공유될 수 있다. 다른 모든 데이터는 합당한 요청이 있는 경우 해당 저자로부터 입수할 수 있다.
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 작성되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시태양의 관점에서 설명되었지만, 본 발명의 개념, 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 본원에 기재된 방법 및 단계 또는 방법의 단계의 순서에 변동을 적용할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 작용제가, 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서, 본원에 기재된 작용제를 대체할 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이와 같은 모든 유사한 대체물 및 수정은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 진의, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌은 이들 문헌이 본원에 제시된 것에 보충적인 예시적인 과정 또는 다른 세부사항을 제공하는 정도로 본원에 구체적으로 참고로 인용된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Board of Regents, The University of Texas System <120> IMMUNOGENIC EGFR PEPTIDE COMPOSITIONS AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF CANCER <130> 3000072-001977 <140> PCT/US2020/052930 <141> 2020-09-25 <150> US 62/906,688 <151> 2019-09-26 <160> 982 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Arg 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 2 Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Ile Thr Asp Phe Gly Arg Ala Lys Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Arg Ala Lys 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> 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<223> Synthetic peptide <400> 13 Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 14 His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Arg Ala 1 5 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 15 Thr Asp Phe Gly Arg Ala Lys Leu Leu 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 16 Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Arg Ala Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 17 Ile Thr Asp Phe Gly Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 18 Gly Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ala Glu 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 19 Ile Pro Val Ala Ile Lys Thr Ser Pro Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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<223> Synthetic peptide <400> 953 Phe Gln Gln Glu Ile Gln Ile Leu Lys 1 5 <210> 954 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 954 Gln Gln Arg Asp Phe Gln Gln Glu Ile Gln Ile Leu Lys Ala Leu His 1 5 10 15 Ser <210> 955 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 955 Met Ala Ser Val Asp Asn Pro Leu Met 1 5 <210> 956 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 956 Asn Pro Leu Met Cys Arg Leu Leu Gly Ile 1 5 10 <210> 957 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 957 Val Asp Asn Pro Leu Met Cys Arg Leu 1 5 <210> 958 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 958 Met Ala Ser Val Asp Asn Pro Leu Met Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys 1 5 10 15 Leu <210> 959 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 959 Thr Asn Glu Leu Tyr Met Met Met Trp Asp Cys Trp His Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser <210> 960 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 960 Met Met Met Trp Asp Cys Trp His Ala 1 5 <210> 961 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 961 Met Met Trp Asp Cys Trp His Ala Val 1 5 <210> 962 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 962 Tyr Met Met Met Trp Asp Cys Trp His Ala 1 5 10 <210> 963 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 963 Met Met Met Trp Asp Cys Trp His Ala Val 1 5 10 <210> 964 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 964 Tyr Met Met Met Trp Asp Cys Trp His Ala Val 1 5 10 <210> 965 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 965 Thr Tyr Gln Val Ser Tyr Gly Phe Arg 1 5 <210> 966 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 966 Tyr Gln Val Ser Tyr Gly Phe Arg Leu 1 5 <210> 967 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 967 Lys Thr Tyr Gln Val Ser Tyr Gly Phe Arg 1 5 10 <210> 968 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 968 Gln Lys Thr Tyr Gln Val Ser Tyr Gly Phe Arg 1 5 10 <210> 969 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 969 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Val Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 1 5 10 15 Phe <210> 970 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 970 His Ser His Phe Trp Asp Asn Ser Lys 1 5 <210> 971 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 971 Glu Arg Ile Val Gly Tyr Pro Ala His Ser His Phe Trp Asp Asn Ser 1 5 10 15 Lys <210> 972 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 972 Arg Ala Glu Thr Asp Asp Glu Asp Asn Glu Glu Ser Asp Glu Glu Glu 1 5 10 15 Glu <210> 973 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 973 Lys Ser Ala Val Leu Ala Ser Asn Ser Gln Phe 1 5 10 <210> 974 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 974 Lys Tyr Glu Lys Ser Ala Val Leu Ala Ser Asn Ser Gln Phe Leu Val 1 5 10 15 Lys <210> 975 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 975 Asp Leu Val Pro Phe Ala Leu Leu Arg Leu Leu His Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Lys <210> 976 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 976 Arg Lys Arg Lys Phe Ile Asn Arg Gly Leu Ala His Asp Ser Glu Glu 1 5 10 15 Leu <210> 977 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 977 Gln Asp Phe Arg Arg Asn Ile Leu Ser Val Cys Lys Glu Ala Val Asp 1 5 10 15 Leu <210> 978 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 978 Leu Ser Glu Leu Glu Thr Pro Gly Lys Tyr 1 5 10 <210> 979 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 979 Lys Thr Pro Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu 1 5 10 15 Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu 20 <210> 980 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 980 Lys Thr Pro Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Arg Ala Lys Leu 1 5 10 15 Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu 20 <210> 981 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 981 Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr 1 5 10 15 Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys 20 <210> 982 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 982 Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile Met 1 5 10 15 Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys 20

Claims (85)

  1. 적어도 EGFR로부터의 제1 HLA-결합 펩타이드 및 적어도 제1 EGFR 억제제를 EGFR-돌연변이 암을 갖는 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법으로서, 상기 HLA-결합 펩타이드가 상기 대상의 암 중의 돌연변이와 일치하는, 야생형 인간 EGFR에 비해 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드가 HLA 부류 I 분자에 결합하는, 치료 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    HLA 부류 I-결합 펩타이드가 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 아미노산의 길이, 바람직하게는 9, 10 또는 11개의 아미노산의 길이인, 치료 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드가 HLA 부류 II 분자에 결합하는, 치료 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    HLA 부류 II-결합 펩타이드가 13 내지 30개의 아미노산 길이, 바람직하게는 15 내지 23개의 아미노산 길이인, 치료 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    적어도 EGFR로부터의 제1 및 제2 HLA-결합 펩타이드를 투여함을 포함하고, 상기 제1 및 제2 HLA-결합 펩타이드가 각각 대상의 암 중의 돌연변이와 일치하는, 야생형 인간 EGFR에 비해 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는, 치료 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    EGFR로부터의 제1 HLA-결합 펩타이드가 HLA 부류 I 분자에 결합하고, EGFR로부터의 제2 HLA-결합 펩타이드가 HLA 부류 II 분자에 결합하는, 치료 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    EGFR로부터의 다수의 HLA-결합 펩타이드를 투여함을 포함하고, 상기 HLA-결합 펩타이드가 각각 대상의 암 중의 돌연변이와 일치하는, 야생형 인간 EGFR에 비해 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는, 치료 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    다수의 HLA-결합 펩타이드가 HLA 부류 I 및 HLA 부류 II 분자 둘 다에 결합하는 펩타이드를 포함하는, 치료 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    2 내지 30개의 상이한 HLA-결합 펩타이드, 바람직하게는 5 내지 30개의 상이한 HLA-결합 펩타이드를 대상에게 투여함을 포함하는, 치료 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상의 HLA 유전자형이 결정된 것인, 치료 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드가, 대상이 보유하는 HLA 유형에 결합하는 것으로 예측되는, 치료 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드가, 자동 분석 프로그램을 사용하여 대상이 보유하는 HLA 유형에 결합하는 것으로 예측되는, 치료 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR-돌연변이 암이 야생형 EGFR에 비해 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 EGFR 폴리펩타이드를 발현하는, 치료 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR-돌연변이 암이 E709K, E709A, E709H, G719A, G719S, G719C, S768I, H773L, T790M, L858R, L861Q, 709_710del>D, 745_749del, 745_750del, 746_750del, 746_751del, 746_751del>A, 746_752del>V, 747_750del, 747_751del, 747_751del>P, 747_753del, 747_753del>S, 747_753del>Q, 747_750del>P, 747_752del, 751_759del>N, 752_759del, 744_745ins>KIPVAI, 745_746ins>IPVAIK, 745_746ins>VPVAIK, 745_746ins>TPVAIK, 763_764ins>FQEA, 764_765ins>HH, 766_767ins>AI, 768_770dupSVD, 769_770ins>ASV, 770_771ins>G, 770_771ins>NPG, 770_771ins>SVD, 771_772ins>N, 771_772ins>H, 772_773ins>NP, 772_773ins>PR, 773_774ins>H, 773_774ins>PH, 773_774ins>NPH, 773_774ins>AH, 774_775ins>HV 및 775_776ins>YVMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 돌연변이; 바람직하게는 G719A, G719S, G719C, S768I, H773L, T790M, L858R, L861Q, 709_710del>D, 746_750del, 746_752del>V, 747_751del, 747_751del>P, 747_753del>S, 747_750del>P, 747_752del, 744_745ins>KIPVAI, 745_746ins>IPVAIK, 763_764ins>FQEA, 768_770dupSVD, 769_770ins>ASV, 770_771ins>SVD, 772_773ins>PR, 773_774ins>H, 773_774ins>PH, 773_774ins>NPH 및 773_774ins>AH로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 돌연변이; 보다 바람직하게는 L858R, H773L, T790M, E709V, 747_751Del, V774M 및 S768I로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 돌연변이를 포함하는, 치료 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR 억제제가 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드 전에 투여되는, 치료 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR 억제제가 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드 후에 또는 이와 본질적으로 동시에 투여되는, 치료 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    돌연변이 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드가 TLR 리간드와 함께 투여되는, 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    TLR 리간드가 TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 또는 TLR9 작용물질, 바람직하게는 TLR7 작용물질인, 치료 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    TLR7 리간드가 CL075, CL097, CL264, CL307, GS-9620, Poly(dT), 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드(R848), 록소리빈 및 ssRNA 올리고뉴클레오타이드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 TLR7 작용물질인, 치료 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    TLR7 작용물질이 이미퀴모드인, 치료 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR 억제제가 타이로신 키나제 억제제 및/또는 EGFR 결합 항체인, 치료 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR 억제제가 오시메르티닙, 에를로티닙, 제피티닙, 세툭시맙, 마투주맙, 파니투무맙, AEE788, CI-1033, HKI-272, HKI-357 또는 EKB-569인, 치료 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 폐암인, 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    폐암이 비-소세포 폐암, 전이성 폐암 및/또는 폐 선암종 중에서 선택되는, 치료 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 EGFR 억제제 내성인, 치료 방법.
  27. 적어도 EGFR로부터의 제1 및 제2 HLA-결합 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 제1 및 제2 HLA-결합 펩타이드가 각각 인간 EGFR-돌연변이 암 중의 돌연변이와 일치하는, 야생형 인간 EGFR에 비해 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 EGFR로부터의 제1 HLA-결합 펩타이드가 HLA 부류 I 분자에 결합하고, 상기 EGFR로부터의 제2 HLA-결합 펩타이드가 HLA 부류 II 분자에 결합하는, 면역원성 조성물.
  28. 제27항에 있어서,
    HLA-결합 펩타이드가 약학적으로 허용가능한 담체 중에서 제형화되는, 면역원성 조성물.
  29. 제28항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 담체가 수성 담체, 염 용액, 염수 용액 및/또는 등장성 염수 용액인, 면역원성 조성물.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    HLA 부류 I-결합 펩타이드가 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 아미노산 길이, 바람직하게는 9, 10 또는 11개의 아미노산 길이인, 면역원성 조성물.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    HLA 부류 II-결합 펩타이드가 13 내지 30개의 아미노산 길이, 바람직하게는 15 내지 23개의 아미노산 길이인, 면역원성 조성물.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR로부터의 다수의 HLA-결합 펩타이드를 포함하고, 상기 HLA-결합 펩타이드가 각각 인간 EGFR-돌연변이 암 중의 EGFR 돌연변이와 일치하는, 야생형 인간 EGFR에 비해 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
  33. 제32항에 있어서,
    대상에 대해 2 내지 30개의 상이한 HLA-결합 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    2개 이상의 HLA 부류 I-결합 펩타이드 및 하나 이상의 HLA 부류 II-결합 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물.
  35. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    하나 이상의 HLA 부류 I-결합 펩타이드 및 2개 이상의 HLA 부류 II-결합 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    2개 이상의 HLA 부류 I-결합 펩타이드 및 2개 이상의 HLA 부류 II-결합 펩타이드, 바람직하게는 3개 이상의 HLA 부류 I-결합 펩타이드 및 3개 이상의 HLA 부류 II-결합 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물.
  37. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드가 각각 야생형 EGFR에 비해 아미노산 치환, 결실 또는 삽입, 바람직하게는 야생형 EGFR에 비해 아미노산 치환을 포함하는, 면역원성 조성물.
  38. 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    HLA-결합 펩타이드가 각각 야생형 인간 EGFR에 비해 E709K, E709A, E709H, G719A, G719S, G719C, S768I, H773L, T790M, L858R, L861Q, 709_710del>D, 745_749del, 745_750del, 746_750del, 746_751del, 746_751del>A, 746_752del>V, 747_750del, 747_751del, 747_751del>P, 747_753del, 747_753del>S, 747_753del>Q, 747_750del>P, 747_752del, 751_759del>N, 752_759del, 744_745ins>KIPVAI, 745_746ins>IPVAIK, 745_746ins>VPVAIK, 745_746ins>TPVAIK, 763_764ins>FQEA, 764_765ins>HH, 766_767ins>AI, 768_770dupSVD, 769_770ins>ASV, 770_771ins>G, 770_771ins>NPG, 770_771ins>SVD, 771_772ins>N, 771_772ins>H, 772_773ins>NP, 772_773ins>PR, 773_774ins>H, 773_774ins>PH, 773_774ins>NPH, 773_774ins>AH, 774_775ins>HV 및 775_776ins>YVMA로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 돌연변이; 바람직하게는 야생형 인간 EGFR에 비해 G719A, G719S, G719C, S768I, H773L, T790M, L858R, L861Q, 709_710del>D, 746_750del, 746_752del>V, 747_751del, 747_751del>P, 747_753del>S, 747_750del>P, 747_752del, 744_745ins>KIPVAI, 745_746ins>IPVAIK, 763_764ins>FQEA, 768_770dupSVD, 769_770ins>ASV, 770_771ins>SVD, 772_773ins>PR, 773_774ins>H, 773_774ins>PH, 773_774ins>NPH 및 773_774ins>AH로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 돌연변이; 보다 바람직하게는 야생형 인간 EGFR에 비해 L858R, H773L, T790M, E709V, 747_751Del, V774M 및 S768I로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 돌연변이를 포함하는 면역원성 조성물.
  39. 제27항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR 억제제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  40. 제27항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    TLR 리간드 및/또는 TLR-7 작용물질을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  41. 제40항에 있어서,
    TLR7 작용물질이 CL075, CL097, CL264, CL307, GS-9620, Poly(dT), 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드(R848), 록소리빈 또는 ssRNA 올리고뉴클레오타이드, 바람직하게는 이미퀴모드인, 면역원성 조성물.
  42. 제27항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    HLA-결합 펩타이드가 HLA 부류 I 및/또는 HLA 부류 II 분자와의 복합체로 존재하는, 면역원성 조성물.
  43. 제27항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 제시 세포를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  44. 제43항에 있어서,
    항원 제시 세포가 수지상 세포를 포함하는, 면역원성 조성물.
  45. 제27항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    HLA-결합 펩타이드가 리포솜, 지질-함유 나노입자 또는 지질-기반 담체 중에 포함되는, 면역원성 조성물.
  46. 제27항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원보강제 성분을 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  47. 유효량의 제27항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상의 치료 방법으로서, 상기 대상이 EGFR-돌연변이 암을 갖고, 상기 조성물 중의 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드가 각각 상기 대상의 EGFR-돌연변이 암의 돌연변이와 일치하는 돌연변이를 포함하는, 치료 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    대상의 암에서 EGFR 유전자를 서열분석함을 추가로 포함하는 치료 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    대상의 HLA 유전자형이 결정된 것인, 치료 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드가, 대상이 보유하는 HLA 부류 I 또는 HLA 부류 II 유형에 결합하는 것으로 예측되는, 치료 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서,
    조성물 중에 포함된 HLA-결합 펩타이드가, 대상에서 발현된 HLA 유형에 결합하는 HLA를 예측하는 알고리즘을 사용하여 선택되는, 치료 방법.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물 중에 포함된 HLA-결합 펩타이드가 예측된 HLA 친화도 및/또는 예측된 HLA 순위에 기반하여 선택되고, 바람직하게는 상기 조성물 중에 포함된 펩타이드가 예측된 HLA 친화도 및 예측된 HLA 순위에 기반하여 선택되는, 치료 방법.
  53. 제51항에 있어서,
    알고리즘이 NetMHC4.0, NetMHCpan3.0, NetMHCpan4.0, NetMHCII2.2 및/또는 NetMHCII2.3 중에서 선택되는, 치료 방법.
  54. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR 억제제를 대상에게 투여함을 추가로 포함하는 치료 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    EGFR 억제제가 돌연변이된 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드 전에 투여되는, 치료 방법.
  56. 제54항에 있어서,
    EGFR 억제제가 돌연변이된 EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드 후에 또는 이와 본질적으로 동시에 투여되는, 치료 방법.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR 억제제가 EGFR 결합 항체 및/또는 타이로신 키나제 억제제인, 치료 방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR 억제제가 오시메르티닙, 에를로티닙, 제피티닙, 세툭시맙, 마투주맙, 파니투무맙, AEE788, CI-1033, HKI-272, HKI-357 또는 EKB-569인, 치료 방법.
  59. 제47항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    EGFR로부터의 HLA-결합 펩타이드가 TLR 리간드와 함께 투여되는, 치료 방법.
  60. 제59항에 있어서,
    TLR 리간드가 CL075, CL097, CL264, CL307, GS-9620, Poly(dT), 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드(R848), 록소리빈 또는 ssRNA 올리고뉴클레오타이드 중에서 선택된 TLR7 작용물질인, 치료 방법.
  61. 제60항에 있어서,
    TLR7 작용물질이 이미퀴모드인, 치료 방법.
  62. 제47항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 폐암인, 치료 방법.
  63. 제62항에 있어서,
    폐암이 비-소세포 폐암, 전이성 폐암 및/또는 폐 선암종 중에서 선택되는, 치료 방법.
  64. 제47항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    암이 EGFR 억제제 내성인, 치료 방법.
  65. 제47항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 비경구 투여, 정맥내 주사, 근육내 주사, 흡입 또는 피하 주사에 의해 투여되는, 치료 방법.
  66. 제47항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물이 2, 3, 4 또는 5회 이상 투여되는, 치료 방법.
  67. 제66항에 있어서,
    투여 사이에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일이 존재하는, 치료 방법.
  68. 제47항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가의 항암 요법을 대상에게 투여함을 추가로 포함하는 치료 방법.
  69. 제68항에 있어서,
    추가의 항암 요법이 화학요법, 방사선요법, 면역요법 및 수술로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는, 치료 방법.
  70. 제69항에 있어서,
    면역요법이 하나 이상의 면역관문 억제제를 포함하는, 치료 방법.
  71. 제70항에 있어서,
    면역관문 억제제가 항-PD1 또는 항-CTLA-4 단클론 항체인, 치료 방법.
  72. 제69항 또는 제70항에 있어서,
    면역요법이 면역관문 억제제의 조합인, 치료 방법.
  73. (a) 면역 효과기 세포의 출발 집단을 수득하는 단계;
    (b) 상기 면역 효과기 세포의 출발 집단을 제27항에 따른 면역원성 조성물과 접촉시키고, 이에 의해 EGFR-돌연변이 암-특이성 면역 효과기 세포를 생성시키는 단계
    를 포함하는, EGFR-돌연변이 암-특이성 면역 효과기 세포의 생성 방법.
  74. 제73항에 있어서,
    접촉이, 면역 효과기 세포의 출발 집단을 항원 제시 세포(APC)와 공-배양하는 것으로서 추가로 정의되고, 상기 APC가 그의 표면상에 제27항에 기재된 HLA-결합 펩타이드를 제시하는, 생성 방법.
  75. 제74항에 있어서,
    APC가 수지상 세포인, 생성 방법.
  76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 효과기 세포가 T 세포, 말초 혈액 림프구, NK 세포, 불변 NK 세포 또는 NKT 세포인, 생성 방법.
  77. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 효과기 세포가 중간엽 줄기 세포(MSC) 또는 유도 만능 줄기(iPS) 세포로부터 분화된 것인, 생성 방법.
  78. 제76항에 있어서,
    T 세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 또는 γδ T 세포인, 생성 방법.
  79. 제76항에 있어서,
    T 세포의 출발 집단이 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포인, 생성 방법.
  80. 제76항에 있어서,
    T 세포가 세포독성 T 림프구(CTL)인, 생성 방법.
  81. 제73항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서,
    수득이, 말초 혈액 단핵세포(PBMC)로부터 면역 효과기 세포의 출발 집단을 단리함을 포함하는, 생성 방법.
  82. 제73항 내지 제81항 중 어느 한 항에 따른 생성 방법에 의해 생성된 EGFR-돌연변이 암-특이성 면역 효과기 세포.
  83. 제73항 내지 제81항 중 어느 한 항에 따른 생성 방법에 의해 생성된 EGFR-돌연변이 암-특이성 면역 효과기 세포를 포함하는 약학 조성물.
  84. 유효량의 제82항에 따른 EGFR-돌연변이 암-특이성 면역 효과기 세포 또는 제83항에 따른 약학 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 상기 대상에서 암의 치료 방법.
  85. 유효량의 제82항에 따른 EGFR-돌연변이 암-특이성 면역 효과기 세포를 포함하는, 대상에서 암을 치료하기 위한 조성물.
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