JP2023500567A - 免疫原性ｅｇｆｒペプチド組成物及び癌の治療におけるそれらの使用 - Google Patents

免疫原性ｅｇｆｒペプチド組成物及び癌の治療におけるそれらの使用 Download PDF

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Abstract

HLAクラスI及び/又はHLAクラスII複合体に結合するEGFR変異ペプチドを含む組成物、ならびに複数のそのようなペプチドを含む組成物が提供される。実施態様のペプチドを用いてEGFR変異癌を治療するための方法も同様に提供される。T細胞などの免疫エフェクター細胞の関連集団を拡大するための方法も提供される。

Description

関連出願の参照
本出願は特許協力条約に基づく国際出願であり、令和1年9月26日に出願された米国仮特許出願第62/906,688号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたシーケンスリストの参照
EFS-Web法的枠組み及び37 CFR・1.821-825(MPEP・2442.03(a)参照)に従い、ASCII準拠のテキストファイル(「Sequence_Listing_3000072-001977_ST25.txt」と題する、2020年9月22日に作成され、サイズで243,949バイトのサイズのもの)の形式での配列リストが本出願と同時に提出され、ここでは、Sequence Listingの全内容が盛り込まれている。
1. 発明の分野
本発明は、一般に、免疫学及び医学の分野に関する。さらに特に、HLAクラスI及びHLAクラスII分子に結合する癌特異ペプチドに関するものである。
2. 関連技術の説明
T細胞に基づく治療は多くの癌を治療するための方法として有意な可能性を示している;残念ながら、このアプローチは、また、一般的な癌に対する免疫原性抗原標的の不足及び非癌性組織に対する潜在的な毒性によって妨げられている。これらのT細胞に基づく治療法には、ACT(養子細胞移入)及びワクチン接種アプローチが含まれ得る。ACTは、一般に、多数の自己活性化腫瘍特異的T細胞を患者に、例えば癌を治療するために注入することを含む。一般に、効果的な抗腫瘍T細胞応答を発現させるためには、以下の3つのステップが通常必要である:抗原特異的T細胞のプライミング及び活性化、活性化T細胞の腫瘍部位への移動、抗原特異的T細胞による腫瘍の認識及び殺傷。標的抗原の選択は、有効な抗原特異的T細胞の誘導に重要である。
ヒト白血球抗原(HLA)分子により腫瘍細胞表面に提示される、腫瘍突然変異をコードするタンパク質に由来するネオアンティゲンペプチドは、有効な免疫応答を生み出すための有望な抗原として役立つ可能性がある。しかしながら、HLAの多様性及びほとんどの腫瘍関連突然変異の固有的性質の結果として、患者間で共有されるネオアンティゲンはほとんどなく、ワクチン誘発性の臨床応答は依然としてまれな事象であった。従って、ネオアンティゲンを発現する癌のための新規エピトープの同定及び評価のための方法が必要とされる。
いくつかの実施態様では、本発明は、、少なくともEGFR(Epidermal Growth Factor Receptor:上皮成長因子受容体)からの第1のHLA結合ペプチド及び少なくとも第1のEGFRインヒビターを、対象に、投与することを含む、EGFR変異癌を有する対象を治療する方法を提供し、前記ペプチドは対象の癌における突然変異と一致する、野生型ヒトEGFRと関係ある、突然変異したアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、EGFR由来のHLA結合ペプチドは、HLAクラスI分子に結合する。いくつかの態様において、HLAクラスI結合ペプチドは、長さが8、9、10、11、12又は13のアミノ酸である。さらなる態様において、HLAクラスI結合ペプチドは、長さが9、10又は11のアミノ酸である。いくつかの態様において、EGFR由来のHLA結合ペプチドは、HLAクラスII分子に結合する。いくつかの態様において、HLAクラスII結合ペプチドは、13～30アミノ酸長である。さらなる態様において、HLAクラスII結合ペプチドは、15～23アミノ酸長である。
いくつかの態様において、この方法はEGFR由来の少なくとも第1及び第2のHLA結合ペプチドを投与する工程を包含し、ここで、前記ペプチドはそれぞれ、対象の癌における変異に一致する、野生型ヒトEGFRと関係ある、変異アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、EGFRからの第一のHLA結合ペプチドは、HLAクラスI分子に結合し、EGFRからの第二のHLA結合ペプチドは、HLAクラスII分子に結合する。いくつかの態様において、この方法はEGFR由来の複数のHLA結合ペプチドを投与する工程を包含し、ここで、前記ペプチドはそれぞれ、対象の癌における変異に一致する、野生型ヒトEGFRと関係ある、変異アミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、複数のHLA結合ペプチドが、HLAクラスI及びHLAクラスII分子の両方に結合するペプチドを含む。いくつかの態様において、この方法は、2～30の異なるHLA結合ペプチドを対象に投与することを包含する。さらなる態様において、この方法は、5～30の異なるHLA結合ペプチドを対象に投与する工程を包含する。
いくつかの態様において、対象のHLA遺伝子型が決定されている。いくつかの態様において、EGFR由来のHLA結合ペプチドは、対象によって担持されるHLA型(タイプともいう)に結合すると予測される。いくつかの態様において、EGFR由来のHLA結合ペプチドは、自動分析プログラムを用いて、対象によって担持されるHLA型に結合すると予測される。いくつかの態様において、EGFR変異癌は、野生型EGFRと関係ある、アミノ酸置換、欠失又は挿入を有するEGFRポリペプチドを発現する。
いくつかの態様において、EGFR変異癌は、E709K,E709A,E709H,G719A,G719S,G719C,S768I,H773L,T790M,L858R,L861Q,709_710del>D,745_749del,745_750del,746_750del,746_751del,746_751del>A,746_752del>V,747_750del,747_751del,747_751del>P,747_753del,747_753del>S,747_753del>Q,747_750del>P,747_752del,751_759del>N,752_759del,744_745ins>KIPVAI,745_746ins>IPVAIK,745_746ins>VPVAIK,745_746ins>TPVAIK,763_764ins>FQEA,764_765ins>HH,766_767ins>AI,768_770dupSVD,769_770ins>ASV,770_771ins>G,770_771ins>NPG,770_771ins>SVD,771_772ins>N,771_772ins>H,772_773ins>NP,772_773ins>PR,773_774ins>H,773_774ins>PH,773_774ins>NPH,773_774ins>AH,774_775ins>HV,and775_776ins>YVMAからなる群から選ばれる変異を含む。
いくつかの態様において、EGFR変異癌は、G719A,G719S,G719C,S768I,H773L,T790M,L858R,L861Q,709_710del>D,746_750del,746_752del>V,747_751del,747_751del>P,747_753del>S,747_750del>P,747_752del,744_745ins>KIPVAI,745_746ins>IPVAIK,763_764ins>FQEA,768_770dupSVD,769_770ins>ASV,770_771ins>SVD,772_773ins>PR,773_774ins>H,773_774ins>PH,773_774ins>NPH,and773_774ins>AHからなる群から選択された変異を含む。
いくつかの態様において、EGFR変異癌は、L858R,H773L,T790M,E709V,747_751Del,V774MandS768Iからなる群から選択される変異を含みむ。
いくつかの態様において、EGFRインヒビターは、EGFRからのHLA結合ペプチドよりも前に投与される。他の態様において、EGFRインヒビターは、EGFR由来の前記HLA結合ペプチドの後に、又は本質的に同時に投与される。いくつかの態様において、突然変異EGFR由来のHLA結合ペプチドは、TLRリガンドとともに投与される。いくつかの態様において、TLRリガンドは、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8若しくはTLR9アゴニストである。いくつかの態様において、TLRリガンドは、TLR7アゴニストである。いくつかの態様において、TLR7アゴニストは、CL075、CL097、CL264、CL307、GS-9620、Poly(dT)、イミキモド、ガルジキモド、レジキモド(R848)、ロキソリビン又はssRNAオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、TLR7アゴニストは、イミキモドである。いくつかの態様において、EGFRインヒビターは、チロシンキナーゼインヒビターである。いくつかの態様において、EGFRインヒビターは、EGFR結合抗体である。いくつかの態様において、EGFRインヒビターは、オシメルチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、マツズマブ、パニツムマブ、AEE788、CI-1033、HKI-272、HKI-357又はEKB-569である。
いくつかの態様では、癌は肺癌である。いくつかの態様において、肺癌は非小細胞肺癌である。いくつかの態様において、肺癌は転移性肺癌である。いくつかの態様において、肺癌は肺腺癌である。いくつかの態様において、癌はEGFRインヒビター抵抗性である。
別の実施態様では、本発明は、EGFR由来の少なくとも第1及び第2のHLA結合ペプチドを含む免疫原性組成物を提供し、前記第1及び第2のペプチドはヒトEGFR変異癌における突然変異と一致する、野生型ヒトEGFRと関係ある、突然変異アミノ酸配列を含み、EGFR由来の第1のHLA結合ペプチドは、HLAクラスI分子に結合し、EGFR由来の第2のHLA結合ペプチドは、HLAクラスII分子に結合する。いくつかの態様において、HLA結合ペプチドは、薬学的に受容可能なキャリア中に処方される。いくつかの態様において、薬学的に受容可能なキャリアは、水性キャリアである。いくつかの態様において、薬学的に受容可能なキャリアは塩溶液である。いくつかの態様において、薬学的に許容される担体は、生理食塩水溶液、好ましくは等張生理食塩水溶液である。いくつかの態様において、HLAクラスI結合ペプチドは、長さが8、9、10、11、12又は13のアミノ酸である。さらなる態様において、HLAクラスI結合ペプチドは、長さが9、10又は11のアミノ酸である。いくつかの態様において、HLAクラスII結合ペプチドは、13～30アミノ酸長である。さらなる態様において、HLAクラスII結合ペプチドは、15～23アミノ酸長である。いくつかの態様では、組成物がEGFR由来の複数のHLA結合ペプチドを含み、前記ペプチドはそれぞれ、ヒトEGFR変異癌におけるEGFR変異に一致する、野生型ヒトEGFRと関係ある、突然変異したアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、組成物は、対象に対して2～30の異なるHLA結合ペプチドを含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも2つのHLAクラスI結合ペプチド及び少なくとも1つのHLAクラスII結合ペプチドを含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも1つのHLAクラスI結合ペプチド及び少なくとも2つのHLAクラスII結合ペプチドを含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも2つのHLAクラスI結合ペプチド及び少なくとも2つのHLAクラスII結合ペプチドを含む。いくつかの態様では、組成物が少なくとも3つのHLAクラスI結合ペプチド及び少なくとも3つのHLAクラスII結合ペプチドを含む。
いくつかの態様において、EGFR由来のHLA結合ペプチドは、野生型EGFRと関係ある、アミノ酸置換、欠失又は挿入を含む。いくつかの態様において、EGFR由来のHLA結合ペプチドは、野生型EGFRと関係ある、アミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、HLA結合ペプチドは、野生型ヒトEGFRと関係ある、E709K,E709A,E709H,G719A,G719S,G719C,S768I,H773L,T790M,L858R,L861Q,709_710del>D,745_749del,745_750del,746_750del,746_751del,746_751del>A,746_752del>V,747_750del,747_751del,747_751del>P,747_753del,747_753del>S,747_753del>Q,747_750del>P,747_752del,751_759del>N,752_759del,744_745ins>KIPVAI,745_746ins>IPVAIK,745_746ins>VPVAIK,745_746ins>TPVAIK,763_764ins>FQEA,764_765ins>HH,766_767ins>AI,768_770dupSVD,769_770ins>ASV,770_771ins>G,770_771ins>NPG,770_771ins>SVD,771_772ins>N,771_772ins>H,772_773ins>NP,772_773ins>PR,773_774ins>H,773_774ins>PH,773_774ins>NPH,773_774ins>AH,774_775ins>HV,及び775_776ins>YVMAからなる群より選択される変異を含む。
いくつかの態様において、HLA結合ペプチドは、野生型ヒトEGFRと関係ある、G719A,G719S,G719C,S768I,H773L,T790M,L858R,L861Q,709_710del>D,746_750del,746_752del>V,747_751del,747_751del>P,747_753del>S,747_750del>P,747_752del,744_745ins>KIPVAI,745_746ins>IPVAIK,763_764ins>FQEA,768_770dupSVD,769_770ins>ASV,770_771ins>SVD,772_773ins>PR,773_774ins>H,773_774ins>PH,773_774ins>NPH及び773_774ins>AHからなる群より選択される変異を含む。
いくつかの態様において、HLA結合ペプチドは、野生型ヒトEGFRと関係ある、L858R, H773L, T790M, E709V, 747_751Del, V774M及びS768Iからなる群より選択される変異を含む。
いくつかの態様では、組成物がEGFRインヒビターをさらに含む。いくつかの態様では、組成物がTLRリガンドをさらに含む。いくつかの態様において、TRLリガンドは、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8又はTLR9アゴニストである。いくつかの態様において、組成物は、TLR7アゴニストをさらに含む。いくつかの態様において、TLR7アゴニストは、CL075、CL097、CL264、CL307、GS-9620、Poly(dT)、イミキモド、ガルジキモド、レジキモド(R848)、ロキソリビン又はssRNAオリゴヌクレオチドである。さらなる態様において、TLR7アゴニストは、イミキモドである。いくつかの態様において、HLA結合ペプチドは、HLAクラスI及び/又はHLAクラスII分子と複合体である。いくつかの態様では、組成物が抗原提示細胞をさらに含む。いくつかの態様において、抗原提示細胞は、樹状細胞を含む。いくつかの態様において、HLA結合ペプチドは、リポソーム、脂質含有ナノ粒子、又は脂質ベースのキャリアに含まれる。いくつかの態様では、組成物が、アジュバント成分をさらに含む。
さらに別の実施態様では、本発明は、対象に有効量の本発明の組成物(例えば、有効量を含む本発明の組成物)を投与することを含む対象を治療する方法を提供し、ここで、対象はEGFR変異癌を有し、組成物中のEGFR由来のHLA結合ペプチドは対象中のEGFR変異癌由来のものと一致する突然変異を含む。いくつかの態様において、この方法は、対象の癌におけるEGFR遺伝子を配列決定する工程をさらに包含する。いくつかの態様において、対象のHLA遺伝子型が決定されている。いくつかの態様において、EGFR由来のHLA結合ペプチドは、対象が有するHLAクラスI又はHLAクラスII型に結合すると予測される。
さらなる態様において、組成物に含まれるEGFR変異ペプチドは、対象において発現されるHLA型へのHLA結合を予測するアルゴリズムを用いて選択される。いくつかの態様において、組成物に含まれるペプチドは、予測されるHLA親和性及び/又は予測されるHLAランキングに基づいて選択される。さらなる態様において、組成物に含まれるペプチドは、予測されるHLA親和性及び予測されるHLAランキングに基づいて選択される。
さらなる態様において、HLA結合ペプチドを選択するために使用されるアルゴリズムはNetMHC4.0、NetMHCpan3.0、NetMHCpan4.0、NetMHCII2.2及び/又はNetMHCII2.3から選択される〔例えば、Andreattaら（2015）及びJensenら（2018）、これらの各々は、本明細書中で参考として援用される、を参照のこと〕。
いくつかの態様では、該方法がEGFRインヒビターを対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様において、EGFRインヒビターは、変異EGFRからのHLA結合ペプチドよりも前に投与される。いくつかの態様において、EGFRインヒビターは、変異EGFR由来の前記HLA結合ペプチドの後に、又は本質的に同時に、投与される。いくつかの態様において、EGFRインヒビターは、EGFR結合抗体である。いくつかの態様において、EGFRインヒビターは、オシメルチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、マツズマブ、パニツムマブ、AEE788、 CI-1033、HKI-272、HKI-357又はEKB-569である。いくつかの態様において、EGFRインヒビターは、チロシンキナーゼインヒビターである。いくつかの態様において、EGFR由来のHLA結合ペプチドは、TLRリガンドとともに投与される。いくつかの態様において、TRLリガンドはTLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8又はTLR9アゴニストであり、好ましくは、TLR7アゴニストである。いくつかの態様において、TLR7アゴニストは、CL075、CL097、CL264、CL307、GS-9620、Poly(dT)、イミキモド、ガルジキモド、レジキモド(R848)、ロキソリビン又はssRNAオリゴヌクレオチドである。さらなる態様において、TLR7アゴニストは、イミキモドである。
ある局面では、癌は肺癌である。いくつかの態様において、肺癌は非小細胞肺癌である。いくつかの態様において、肺癌は転移性肺癌である。いくつかの態様において、肺癌は肺腺癌である。いくつかの態様において、癌はEGFRインヒビター抵抗性である。いくつかの態様において、組成物は、非経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、吸入、又は皮下注射によって投与される。いくつかの態様では、組成物が水性担体（キャリアー）中に製剤化される。いくつかの態様では、水性キャリアは塩溶液である。いくつかの態様において、水性キャリアは、等張食塩水である。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも2回、3回、4回、又は5回投与される。いくつかの態様において、投与の間に2、3、4、5、6又は7日が存在する。いくつかの態様において、この方法は、さらなる抗癌療法を投与する工程をさらに包含する。いくつかの態様において、さらなる抗癌療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、又は手術からなる群から選択される。いくつかの態様では、免疫療法が少なくとも1つの免疫チェックポイントインヒビターを含む。いくつかの態様において、免疫チェックポイントインヒビターは、抗PD1又は抗CTLA-4モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、免疫療法は免疫チェックポイントインヒビターの組合せである。
さらに別の実施態様では、本発明は、免疫エフェクター細胞の出発集団を“得ること”、及び免疫エフェクター細胞の出発集団を本発明の組成物と接触させ、それによってEGFR変異癌特異的免疫エフェクター細胞を生成することを含む、EGFR変異癌特異的免疫エフェクター細胞を産生する方法を提供する。
いくつかの態様において、接触は免疫エフェクター細胞の出発集団を抗原提示細胞(APC)と共培養することとしてさらに定義され、ここで、APCはそれらの表面上に本発明のHLA結合ペプチドを提示する。いくつかの態様において、APCは樹状細胞である。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞は、T細胞、末梢血リンパ球、NK細胞、インバリアントNK細胞、NKT細胞である。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞は、間葉系幹細胞(MSC)又は誘導多能性幹(iPS)細胞から分化されている。いくつかの態様において、T細胞は、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、又はγδ T細胞である。いくつかの態様において、T細胞の出発集団は、CD8+ T細胞又はCD4+ T細胞である。ある局面では、T細胞は細胞傷害性Tリンパ球(CTL)である。
いくつかの態様において、該“得ること”は、末梢血単核細胞(PBMC)から免疫エフェクター細胞の出発集団を単離することを含む。
さらに別の実施態様では、本発明は、本発明の方法によって産生されるEGFR変異癌特異的T細胞を提供する。
さらに別の実施態様では、本発明は、本発明の方法によって産生されたEGFR変異癌特異的T細胞を含む医薬組成物を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、有効量の本発明のEGFR変異癌特異的T細胞を対象に投与することを含む、対象における癌を治療する方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、対象における癌の処置のための、有効量の本発明のEGFR変異癌特異的T細胞を含む組成物を提供する。
本明細書で使用される「本質的に含まない：essentially free」とは、特定の成分に関して、本明細書で使用される場合、特定の成分が組成物に意図的に配合されていないこと、及び/又は汚染物質としてのみ又は微量で存在することを意味する。
本明細書で使用される「a」又は「an」は、1つ以上を意味し得る。
本明細書において、「又は」という用語は、選択肢のみを指すことが明示的に示されているか又は選択肢が相互に排他的である場合を除き、「及び/又は」を意味するが、当該開示は、選択肢のみ及び「及び/又は」を指す定義を支持している。
本明細書において使用されるばあい、「別の」という用語は、少なくとも２又はそれ以上を意味する。
本出願明細書記述の全体を通して、用語「約」は、値がデバイス、値を決定するために使用される方法、又は研究対象の間に存在する変動の固有の変動を含むことを示すために使用される。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるのであろう。しかしながら、本発明の詳細な説明、特異的な実施例及び好適な実施例は例示として行われるものであって、この詳細な説明によって当業者に明らかになる各種の変更や修正は、本発明の思想及び範囲内にあることを理解しなくてはならない。
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、ここに提示される特別な具体例の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の1以上を参照することによって良好に理解されるのであろう。
図1A-1Hは、個別化ペプチドワクチン(PPV)試験デザインと患者転帰(アウトカム:outcome)を示す。(図1A)進行非小細胞肺癌(NSCLC)患者の免疫化を導くネオアンティゲンペプチドワクチン製造パイプライン。肺腫瘍生検由来のDNAは508個の腫瘍関連遺伝子のパネルを用いて配列決定し、一方、患者の末梢血に対して高分解能HLAタイピングを実施した。ネオアンティゲンワクチンペプチドは、主にHLAクラスI及びクラスII結合予測に基づいて選択された(方法を参照のこと)。各患者を、2つのカクテル(cocktails)に分けられ、短い及び長いネオアンティゲンペプチドの生理食塩水ベースの混合物で、毎週免疫化し、反対側の四肢に12週間投与された。矢印はワクチン接種を受けた週を示す。シリンジ記号で示すように、0、4、8及び12週目に血液を採取した。 (図1B)PPVを投与した24名のNSCLC患者の臨床イベントスケジュール。ダークバー(ラベル化Neoantigenワクチン)、PPV免疫化の期間。薄いライトバー(ラベル化EGFRインヒビター)、EGFRインヒビター治療の期間。 (図1C)14例のPPV患者を、EGFR変異状態及びワクチン接種中のEGFRインヒビターの使用に基づいて3群に分けた。 (図1D-1F)患者コホート（cohort：群）、臨床応答及び無増悪生存期間で層別化したワクチンペプチド数、標的とする突然変異数、及び予測されるワクチンペプチド結合親和性。黒い点は非EGFRネオアンティゲンペプチドを示し、灰色の点はEGFRネオアンティゲンペプチドを示し、後者の割合を下に列挙する。 (図1G)3つの患者群の生存分析は、第3群の患者が他の群と比較して有意に長い全生存を経験したことを示した(第2群 対 第3群、P=0.038)。(図1H)客観的（objective）臨床奏効(CR/PR、n=7)、病勢安定(SD、n=9)、又は病勢進行(PD、n =8)を経験した患者間の無増悪生存期間の比較。生存分析は、Log-rank(Mantel-Cox)検査を用いて行った。群間の統計学的有意差の解析には、両側対応のないt検定又はMann-WhitneyのU検定を用いた。P＜0.05を有意差ありとした。
図2は、PPV患者24例の免疫化の経時変化を示す。各四角は1週間を表す。濃い四角と矢印はワクチン接種を受けた週を表し、白い四角はワクチンが投与されなかった週を表す。トライアルデザインによれば、患者は週1回のワクチン接種を最低12週間受けることとされた。9、19、20例を除き、すべての患者は12週間のワクチン接種を完了し、最初の試験期間中に進行性疾患のために期限切れとなった。患者に希望があれば12週間を超えて免疫化を継続する機会を与えた。
図3は、群に分けられた24例のPPV患者の治療及び臨床転帰(outcome)を示す。
図4A & 4Bは、群ごとの臨床ベースライン特性の要約を示している。
(図4A)ベースライン時のPPV群の臨床的及び人口統計学的特性を示し、PPV-1群(EGFR-WT、PPVのみ)、PPV-2群(EGFR変異体、PPVのみ)及びPPV-3群(EGFR変異体、PPV + EGFRi)の統計学的比較を行う。SQ: 扁平上皮癌、AD: 腺癌。連続データは、平均+標準偏差(SD)として示した。 (図4B)PPV-2及びPPV-3患者のEGFRインヒビター治療歴。TKI:チロシンキナーゼインヒビター。両側不対t検定(Two tailed unpaired t test)又はカイ二乗検定(Chi-square test)を用いて、群間の統計的有意性を分析した。P＜0.05を有意差ありとした。
図5A-5Cは、群ごとにPPV患者の臨床応答を示す。(図5A)PPVの開始から12～18週間後にRECIST1.1基準を用いて評価した無増悪生存期間、全生存期間、及び臨床応答を示す群別の免疫化患者の応答の概要。 (図5B)治療経過中のPPV患者の全腫瘍量(全標的病変の合計)の測定値。各患者の治療効果は次の様であった：Pt.1 PD; Pt.4 PD; Pt.6 SD; Pt.7 SD; Pt.9 SD; Pt.10 PD;Pt.19 PD; Pt.11 CR or PR; Pt.14 CR or PR; Pt.16 SD; Pt.17 CR or PR; Pt.18 PD; Pt.20 PD; Pt.24 PD; Pt.3 SD;Pt.5 CR or PR; Pt.8 CR or PR; Pt.12 CR or PR; Pt.13 SD; Pt.15 SD; Pt.21 SD; Pt.22 CR or PR; Pt.23 PD。* 患者1は12週目に胸水を発症した。** 患者11のフォローアップCTスキャンを24週目に撮影した。測定可能な腫瘍がないため、患者2の腫瘍測定値は示されていない。患者13及び15については追跡CTスキャンを利用できなかったが、奏効及び生存に関する他の臨床追跡情報が得られた。PPV、個人化ペプチドワクチン; PPV-1、PPV群1; PPV-2、PPV第2群;PPV-3、PPV第3群。MUT、変異型；CR、完全奏効；PR、部分奏効；PD、病勢進行；SD、病勢安定。 (図5C)治療関連有害事象のリスト。
図6A-6Cは、ワクチン接種前のトライアルEGFRインヒビター不成功を含む、選択されたPPV患者の代表的CTスキャンを示す。(図6A)患者2(群1)の胸水がPPV治療の10週後に消失したことを示す連続CTスキャン。(図6B)PPV治療中の肝転移の進行を示す患者23のCTスキャン。患者24も同様に、免疫処置開始から11週間後の肺腫瘍進展を表示した。(図6C)患者17、5、8及び12におけるPPV接種前のトライアルEGFRインヒビター不成功、続いてPPV治療開始後の客観的（objective）臨床応答を示す連続CTスキャン。
図7A-7Fは、個別化ネオアンティゲンペプチドワクチン接種後の患者の臨床応答を示す。(図7A)完全応答患者17からの2つの肺病変の退行を示すCTスキャン (図7B)組織生検は、残りの肺CTシグナルが生存腫瘍細胞を含まない線維性組織のみから構成されることを確認した。(図7C)T2強調磁気共鳴画像法(MRI)により評価した患者17の骨転移は、ネオアンティゲンワクチン接種の開始から18週間後に消失した。この骨転移はRECIST(version 1, bone lesion measurability)によりnon-targeted lesionと考えられた。 (図7D)第2群の2人のさらなる患者は、PPVに対する客観的（objective）臨床応答を有した。患者11はPPV開始24週後に閉塞性無気肺の消失に加えて肺腫瘍の退縮を経験した(白矢印、右)が、気胸は変化を示さなかった(灰色矢印)。患者14の頸部転移はPPV治療開始12週後に有意な退縮を示した(右)。 (図7E)患者5、8、12及び22における肺腫瘍退縮を示すCTスキャン。全員がPPV治療後に部分的な臨床応答を示した。 (図7F)PPV試験患者の、予備処理ベースラインと比較した、PPV投与3～4カ月後の、全腫瘍量の変化。*患者1は12週目に胸水を発症した。CR:完全寛解; PR:部分寛解。
図8A-8Eは、様々な患者群の生存分析を示す。(図8A)群によるPPV患者の無増悪生存期間(PFS)解析。(図8B)群別のPPV患者の全生存(OS)分析。 (図8C)疾患コントロール(CR + PR + SD; n=16)又はPD(n = 8ted EGFR患者、Group 2患者、又はGroup 3患者)の患者間のPFSの比較。及び、 客観的（objective）臨床応答(CR/PR、n=7)、病勢安定(SD、n=9)、又は病勢進行(PD、n =8)を経験した患者間の全生存期間の比較。(図8D)第3世代TKIであるオシメルチニブを使用した患者と使用しなかった患者のPFSの比較。16例全例、第2群の患者、又は第3群の患者について示した。 (図8E)全16例の変異型EGFR患者に対してオシメルチニブを使用した患者と使用しなかった患者との全生存期間の比較。Log-rank (Mantel-Cox)検定を用いて生存分析を行い、P＜0.05を有意差あり(太字)とした。95%信頼区間(C1)はハザード比に対するものである。
図9A-9Cは、群のワクチンペプチド分析、臨床応答及び無増悪生存率を示す。(図9A)HLAペプチド結合親和性によって予測されるように、ワクチンペプチドが関与する異なるHLAクラスI及びクラスI分子の数。各点は、1人のPPV患者を表す。(図9B)投与されたワクチンペプチドの数は、HLAクラスI(短い)又はHLAクラスII(長い)に限定された。各点又は円は、1人のPPV患者を表す。 (図9C)ワクチンペプチドのペプチドデルタスコア。デルタスコアは、突然変異ネオアンティゲンペプチド予測結合親和性を、対応する野生型ペプチド結合親和性から、差し引くことによって計算される。各点は、1つのワクチンペプチドを表す。灰色、EGFRネオアンティゲンペプチド; 黒色、非EGFRネオアンティゲンペプチド。両側対応のないt検定を用いたところ、群間に有意な差異は認められず、P＜0.05を有意な差異ありとみなした。MUT、突然変異。WT、野生型。PD、病勢進行；SD、病勢安定；PR、部分奏効；CR、完全奏効。
(図10A)単変量解析によって決定される、個人化ペプチドワクチン患者の生存に関連する因子。 (図10B)胸水及び腫瘍量がPPV試験患者の全生存に影響する2つの危険因子であることを示すKaplan-Meier分析。生存分析はLog-rank(Mantel-Cox)検査を用い、P＜0.05を有意(太字)とした。SD、標準偏差；EGFRi；EGFRインヒビター；ECOG、Eastern Cooperative Oncology Group;PS、performance status；*SQ、扁平上皮癌；AD、腺癌。EGFRi failureカテゴリ1、failed第1世代EGFRi; 2/3、failed第2世代又は第3世代EGFRi。
図11A～11Iは、EGFRネオアンティゲンペプチドが免疫原性であり、共有され、そして特有のHLAクラスI結合優先性を示すことを示す。(図11A)ペプチドプール-刺激患者PBMC上清について行われたインターフェロン－γ(IFN‐γ)ELISAアッセイは、主に6人のPPV患者:5、8、14、17、21、及び22においてワクチンペプチドプール-特異的応答を示した。6人の患者のうち5人がPPV後に客観的（objective）臨床応答を経験した(Pt.11、Pt.14、Pt.17、Pt.5、Pt.8、Pt.12、Pt.22)。 (図11B)患者5、8、14及び17に対するIFN‐γ ELISAによる個々のワクチンペプチド反応性のデコンボリューション（deconvolution:逆重畳積分）は、HLA-A*1101限定EGFR-L858RペプチドKITDFGRAK(配列番号4)に対する患者5、8及び14において高い免疫応答を明らかにした。完全応答者患者17も同様に、HLA*C1502限定EGFR-T790MペプチドLTSTVQLIM(配列番号65)に対して高い応答を示した。他のPPV研究用患者に対する個々のペプチド応答性を図12に示す。 (図11C及び11D)IFN-γ ELISPOTアッセイ及びHLAテトラマー-ベース染色の要約により、患者5、8及び14におけるHLA-A*1101/KITDFGRAK(配列番号4)-特異的CD8+ T細胞、ならびに患者17におけるHLA-C*1502/LTSTVQLIM(配列番号65)-特異的CD8+ T細胞の、PBMC頻度は、PPVの経過に亘って有意に増加したことが決定された (図11E)ELISPOTアッセイが、患者5、8、14及び17からのポスト-PPV PBMCが、突然変異EGFRネオアンティゲンペプチドを特異的に認識することを示したが、対応する野生型(WT)EGFRペプチドでは示さなかった、ことを表示した。 (図11F)EGFRタンパク質配列決定、及び変異EGFR-L858R(より大きなペプチド配列番号980のボックス領域)及びT790M(より大きなペプチド配列番号982のボックス領域)ペプチド及び対応するWTエピトープ(それぞれ、より大きなペプチド配列番号979のボックス領域及びより大きなペプチド配列番号981のボックス領域)の、予測されるHLAペプチド結合親和性。(図11G & 11H)もっとも一般的なEGFR変異体、L858R(光灰色)及びExon 19欠失(Ex19del、中灰色)から由来するネオアンティゲンは、A3スーパーファミリー内ではHLAクラスIアロタイプに対して顕著な結合選択性を示し、他のそれほど一般的でないEGFR点変異(S768I、T790M及びL861Q、濃い灰色)は、A2及びC3スーパーファミリーへの結合選択性を示した。 (図11I)肺癌において最も一般的な共有（shared）EGFR変異に対する予測結合EGFRネオアンティゲンの最高数(＜500nM親和性)を有する個々のHLAクラスIアロタイプを示す拡大図。黒い矢印は、A*1101‐限定KITDFGRAKペプチド(配列番号4)及びC*1502限定LTSTVQLIMペプチド(配列番号65)を示す。群間の統計的有意性解析には両側対応のない（tow-tailed unpaired）t検定を用いた。P＜0.05を有意差ありとした。
図12A及び12Bは、PPV誘導免疫応答のELISAベースの免疫モニタリングを示す。(図12A)個々のワクチンペプチドに対する末梢血反応性を測定するIFN-γ ELISAアッセイの結果。ペプチド数は、表5に列挙したものに対応する。示された時点で、ペプチドなし対照(No)と対比して、倍の変化が測定される。I.C、無関係なペプチド対照。臨床的奏効例は、(CR)又は(PR)のいずれかで示される。 (図12A)のつづき (図12A)のつづき (図12A)のつづき (図12A)のつづき (図12B)各患者についての全ワクチンペプチド特異的免疫反応性(ComboScore、方法を参照)を、それらの関連する群、組織学、及び臨床転帰と共に示す要約図。
図13A-13Hは、ELISPOTベースのワクチン誘導応答のex vivo末梢血免疫モニタリングを示す。IFN-γ ELISPOTアッセイの結果は、7名の臨床応答者を含む8名の免疫患者において、選択されたワクチンペプチド(ウェルあたり2.5x 105細胞)に対するPPV誘導免疫応答を示す。(図13A、13B、及び13D)EGFR(L858R)ネオアンティゲン（以下Neo Agともいう）ペプチドKITDFGRAK(配列番号4)は3つの異なる応答性Pt.5、8、及び14において高いIFN-γ応答を誘発した(図13A、13B、及び13D); (図13E)しかし、SD Pt.16においてこのワクチンペプチドに対して免疫応答は検出されなかった(図13E)。 (図13F)完全応答Pt.17は、共有(shared)EGFR(T790M)変異を含むLTSTVQLIM(配列番号65)Neo Agペプチドに対する高い免疫応答を生じた(図13F)。(図13G)2人のさらなるPR患者は、プライベート突然変異をコードするNeo Agに対するCD8+ T細胞応答を生じた:Pt.11(図13C)におけるAQP12A(L28R)ペプチドKARLPVGAY(配列番号875)及びPt.22におけるFGFR1(R734W)ペプチドYMMMWDCWHAV(配列番号964)(図13G)。長いCD4+限定EGFR Neo Agペプチドに対する免疫応答もまた、患者の3人において誘発された:Pts.8及び16(図13B及び13E)におけるEGFR(L858R)含有ペプチドHVKITDFGRAKLLGAEE(配列番号826)、ならびにPt.22(図13G)におけるH773L/V774MNeoAgペプチドMASVDNPLMCRLLGICL(配列番号958)。また、応答を誘発した各ワクチンペプチドについての106 PBMC当たりのIFN-γスポット数(標準化)を示す線グラフの概要を示す。ペプチド同定番号(P1、P2など)は表5に列挙されるものに対応し、配列番号:874 (RLPVGAYEV); 配列番号:880 (VMASVDNPL); 配列番号:1 (HVKITDFGR); 配列番号:16 (VKITDFGRAK); 配列番号:32 (AIKESPKANK); 配列番号:914(KIPVAIKESPKANKEIL);配列番号:687(STVQLIMQL); 配列番号:956(NPLMCRLLGI); 配列番号:15 (TDFGRAKLL); 及び配列番号:884(RLSISFENLDTAKKKLP)にも対応する。群間の統計的有意性解析には両側対応のない(two-tailed unpaired)t検定を用いた。P＜0.05を有意差ありとした。*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001. 同上
14A-14Cワクチン誘導性CD8+T細胞応答のHLA/ペプチドテトラマーベースの免疫モニタリングを示す。(図14A)免疫モニタリング分析に使用した特注合成EGFRネオアンティゲン四量体のリスト: KITDFGRAK (配列番号:4); VKITDFGRAK (配列番号:16); HVKITDFGR (配列番号:1); AIKESPKANK (配列番号:32); AIKTSPKANK (配列番号:20); LTSTVQLIM (配列番号:65) (図14B及び14C)示された時点で採取されたワクチン接種前及び接種後のex vivo PBMCのテトラマー染色結果。(図14B)EGFRネオアンティゲン特異的CD8+ T細胞集団は、PPV Pt.5、8、14、及び16(L858R;配列番号:4)及び17(T790M;配列番号:65)について観察された。 (図14C)示されるのは、ワクチン接種されたPts.3、5、8、14及び16から採取されたPBMCの陰性EGFRネオアンティゲン四量体染色の実施例である。
図15A-15Cは、共有(shared)EGFRネオアンティゲンのHLAクラスI及びクラスIIスーパーファミリーペプチド結合分析を示す。5つの共有(shared)ポイント突然変異(S768I,H773L,T790M,L858R及びL861Q)及び5つの共通Exon19欠失(legend:凡例)を含む、肺癌における最も一般的なEGFR変異10個を含むEGFRネオアンティゲンペプチドについてHLA結合予測を行った。(図15A)9、10、又は11量体EGFRネオアンティゲンペプチドの数は、500nM以下の予測結合親和性をもって、世界中で100の最も一般的なHLAクラスIアロタイプに結合すると予測された。アロタイプはHLAスーパーファミリーに分けられ、異なる共有(shared)EGFR変異に対する異なるスーパーファミリー結合選択性を明らかにする。 (図15A)のつづき (図15B)予測結合親和性5000 nM以下でHLAクラスIアロタイプに結合すると予測される9、10、又は11量体EGFRネオアンティゲンペプチドの数。 (図15B)のつづき (図15C)予測結合親和性500 nM以下でHLAクラスIIアロタイプに結合すると予測される17量体EGFRネオアンティゲンペプチドの数。結合予測はHLAクラスIペプチドについてはNetMHCpan4.0を用い、HLAクラスIIペプチドについてはNetMHCII2.3を用いて行った。HLAクラスI及びIIスーパーファミリーの群分けは、Sidneyら、2008、Harjantoら、2014、及びJensenら、2018から適合させた。BX、分類不能のHLA-Bアロタイプ。
図16A-16Hでは、ネオアンティゲンワクチン接種により、末梢血及びがんにおけるEGFR-L858Rneoantigen-specific T cellクローンの頻度と数が増加したことが示されている。(図16A及び16B)PPV後患者PBMCにおけるTCRVβ-CDR3クローン性スコアの変化パーセント(患者群及び無増悪生存によって層別化)。(図16C)HLA-A*1101/KITDFGRAK(配列番号4)四量体染色及び患者5の10ヶ月後PPV PBMCからのCD8+テトラマー+(Tet+)T細胞のフローソーティング。仕分けられたTet+細胞は、単一-細胞TCRα/β配列決定をした。(図16D)TCRVβ-CDR3配列は、患者5のPBMC及びPPV治療前又は治療後に採取した腫瘍生検で実施した。 (図16D)ベン図(Venn diagram)及びドットプロットは、試料の対(pairs)の間で重複するCDR3クローンの数及び頻度を示す。PPV後から選別した52の高信頼性Tet+Vβ-CDR3クローンは、PBMC及びTILCDR3クローンの両方と高度の重複を示した(灰色の点)。PPVはネオアンティゲン特異的Tet+クローン(スモールボックス)の頻度の有意な増加を誘導し、13の新しいTet+クローンもPPV後に出現した(明るい灰色の点)。 (図16E)免疫化は、また、PBMC及びTIL(黒い矢印)PBMCの両方において他のCDR3クローンの集団を誘導し(図16E)、PPVの前及び後の時点で、上位10個の既存のTet+ CDR3クローンのTIL頻度を誘導した。(図16F)PPV前及び後の12のワクチン誘導Tet+ CDR3クローンのPBMC及びTIL頻度。 (図16G)選別されたTet+クローンの単一配列決定は、HLA-A*1101/KITDFGRAK(配列番号4)四量体を用いたVα-N1及びVβ-N1のクローニングを容易にした。A549細胞は、また、HLA-A*1101及び/又はKITDFGRAK(配列番号4)ペプチドをコードするミニ遺伝子を発現するように操作された。 (図16H)A11と共培養したTCR-N1操作T細胞。キット形質導入A549細胞はIFN-γ ELISA(上)によって測定されるように、対照T細胞と比較して有意に多くのIFN-γを産生した(P＜0.001)。TCR-N1 T細胞は対照親株A549、A549-A11、A549.KIT標的細胞を認識せず、ネオアンティゲン特異的反応性を示した(下)。統計的比較を対照と比較して測定した。群間の統計学的有意差の解析には、両側対応のない(two-tailed unpaired)t検定又はMann-WhitneyのU検定を用いた。P＜0.05を有意差ありとした。**,P＜0.01; ***, P＜0.001.
(FIG.17A)10 Mo PBMC由来のKITDFGRAK(配列番号:4)四量体陽性CD8+(Tet+)T細胞の単一-細胞TCR配列によって同定された52TCR-VβCDR3クローンについて、患者5のPPV治療の間のPMBC頻度の変化を示す。Y軸は選別されたTet+細胞内のCDR3頻度を示し、X軸は、示された時点でのPBMC内でのCDR3頻度を示す。相関係数が示される。 (FIG.17B)PPV治療の過程の間の末梢血における52 Tet+CDR3クローンの最大倍数増殖。誘導クローンは前処理PBMCでは検出できなかった。 （FIG.17C)52 Tet+クローンを除いて、図17 Aと同様の分析を、PPV前若しくは12Mo後に、採取した腫瘍サンプルにおけるCDR3頻度と比較する。 (FIG.17D)H1975(EGFR-L858R/T790M)及びH1299(EGFR-WT)肺がん細胞のEGFRインヒビターオシマチニブ治療はウエスタンブロットに示されるように、H1975細胞において、著しくリン-EGFR及びリン-ERKを減少させた。μMでEGFRi濃度を示す。C1及びC2は、未処理の対照細胞である。 (FIG.17E)EGFRi(24h)又はEGFR(24h)+IFN-γ(12h)への暴露後のH1975及びH1299細胞におけるRNA転写物変化を示すヒートマップ。 (FIG.17F)H1975細胞(丸)及びH1299細胞(四角)のEGFRi又はEGFRi+IFNγ治療後のJak-Stat、TNFα、及びTRAILシグナル伝達における、遺伝子シグネチャ（signature）変化。 (FIG.17G)H1975細胞のEGFRi治療後のRNAseqの遺伝子セット濃縮分析。
図18A-18M ：EGFRインヒビターによる免疫調節は、免疫細胞の浸潤、腫瘍抗原提示、T細胞の活性化を促進する。H1975(EGFR-L858R/T790M)及びH1299(EGFR-WT)細胞株を、EGFRインヒビター(EGFRi)オシメルティニブで治療し、0時間、12時間又は24時間処置後にRNAseq分析を行った。RNAseqは、患者腫瘍4例、on-EGFRi 2例、off-EGFRi 2例についても実施した。(図18A)EGFRi治療後のH1975細胞において、細胞分裂、細胞周期、アポトーシス及び細胞生存に関連する遺伝子の相対的転写物発現レベルは減少し、この傾向はon-EGFRi患者腫瘍サンプルにおいて反映された。(図18B)EGFRiは、H1975細胞における抗原提示及び免疫細胞輸送に関連する免疫関連遺伝子の発現をアップレギュレートした。 (図18C)EGFRi処理H1975及びH1299細胞株における遺伝子発現経路の変化。H1975細胞では、HLA発現、STATシグナル伝達、TRAILシグナル伝達、アポトーシス、TNF-αシグナル伝達、NF-κBシグナル伝達がアップレギュレートされ、EGFRシグナル伝達、MAPKシグナル伝達、PI3Kシグナル伝達、Cell cycle、MYCシグナル伝達、EMTシグナル伝達が24時間のEGFRi治療後にダウンレギュレートされた。H1299細胞では、TRAILシグナル伝達、アポトーシス、STATシグナル伝達、EMTシグナル伝達がアップレギュレートされ、TNF-αシグナル伝達、NFkappaBシグナル伝達、HLA発現、EGFRシグナル伝達、MAPKシグナル伝達、PI3Kシグナル伝達、Cell cycle、MYCシグナル伝達が24時間のEGFRi治療後にダウンレギュレートされた。 (図18D)H1975細胞(丸)及びH1299細胞(四角)のEGFRi治療はTRAILシグナル伝達に関連する遺伝子をアップレギュレートしながら、EGFRシグナル伝達及び増殖速度に関連する遺伝子をダウンレギュレートした。(図18E)EGFRi治療中の患者は、EGFRi治療H1975細胞と同様のEGFRシグナル伝達、増殖速度、及びTRAILシグナル伝達の変化を示した。 (図18F及び18G)H1975細胞上清のLuminex分析は、タンパク質レベルで10のケモカイン及びサイトカインの変化を確認した。統計的比較を対照と比較して測定した。(図18H)移動アッセイは、H1975細胞のEGFRi治療がPBMC単球及びCD4+ T細胞の移動を増加させ、H1975細胞上清に向けてCD8+腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を活性化することを示した。 (図18I)HLAクラスI表面発現はEGFRi治療後にH1975細胞で増加したが、H1299細胞では増加しなかった。(図18J)腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞は、未処理細胞と比較して、EGFRi処理H1975細胞上の同族抗原の認識に応答して、有意に増加したIFN-γ分泌を示した。 (図18K及び18L)患者腫瘍標本の免疫細胞含有量は、免疫細胞型特異的遺伝子発現を考慮する方法(方法)を用いてRNAseqデータから補完した。 (図18M)どのようにEGFRi治療がPPVと相乗作用して、腫瘍部位での免疫細胞輸送及びT細胞活性化を増強し得るかを説明するための提案された機構モデル。群間の統計学的有意差の解析には、両側対応のないt検定又はMann-WhitneyのU検定を用いた。P<0.05を有意差ありとした。*, P<0.05; **, P<0.01.
I.本発明
いくつかの態様では、HLAクラスI及び／又はHLAクラスII分子によって認識され、それに結合する、変異EGFRネオアンティゲンに由来するペプチドが提供される。特に、所与のEGFR変異癌を有する癌患者によって特定のHLA分子担体に結合すると予測されるペプチドが同定される。これらのペプチド、又はこのようなペプチドのカクテル(例えば、HLAクラスI及びHLAクラスII結合ペプチドの両方を含む)は、EGFR変異癌に対する有効な免疫応答を刺激するために使用され得る。従って、このようなペプチド及びペプチドカクテルは、EGFR変異癌(例えば、肺癌)を有する対象においてインビボでの免疫応答をシミュレートするために、対象に直接投与され得る。あるいは、実施態様のペプチドが、抗癌免疫療法組成物における使用のために、ex vivoで免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)を活性化及び拡大するために使用され得る。
II. 定義
本明細書で使用されるように、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、本明細書では特定の成分のいずれも組成物に意図的に配合されておらず、及び/又は汚染物質としてのみ又は微量で存在することを意味するために使用される。したがって、組成物の意図しない汚染から生じる特定の成分の総量は、0.01%をはるかに下回る。最も好ましいのは、標準的な分析方法で特定の成分の量を検出することができない組成物である。
本明細書で使用される場合、「a」又は「an」は、1つ以上を意味し得る。請求項において本明細書で使用されるように、単語「含む」と共に使用される場合、単語「a」又は「an」は、1つ又は2つ以上を意味し得る。
特許請求の範囲における「又は」（or:若しくは、との記載もある）という用語の使用は代替のみを指すことが明示的に示されない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるか、又は代替は相互に排他的であるが、開示は、代替のみ及び「及び／又は」を指す定義をサポートする。
本出願全体を通して、用語「約」は、値が、装置の、値を決定するために使用される方法の、又は研究対象の間に存在する変動の、固有の変動を含むことを示すために使用される。
「治療」及び「治療する」とは、疾患又は健康関連状態の治療上の利益を得ることを目的とした、対象への治療剤の投与又は適用、又は対象に対する処置又はモダリティ(modality)の実施をいう。例えば、処置は、T細胞治療の投与を含み得る。
「対象」及び「患者」は、霊長類、哺乳類、及び脊椎動物などのヒト又は非ヒトのいずれかを指すために互換的に使用される。特定の実施態様において、対象はヒトを指す。
本出願全体を通して使用される「治療上の利益」又は「治療上有効」という用語は、この状態の医学的処置に関して対象の健康を促進又は増強する任意のものを指す。これには疾患の徴候又は症状の頻度又は重症度の減少が含まれるが、これらに限定されない。例えば、癌の治療は、例えば、腫瘍のサイズの減少、腫瘍の侵襲性の減少、癌の増殖速度の減少、又は転移の予防を含み得る。癌の治療は、また、癌を有する対象の生存期間を延長することを意味し得る。
「抗癌剤」は、例えば、対象中の癌細胞/腫瘍に負の影響を及ぼすことができ、これは、癌細胞の死滅を促進し、癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌細胞の成長速度を低下させ、転移の発生率又は数を減少させ、腫瘍サイズを縮小させ、腫瘍成長を阻害し、腫瘍又は癌細胞への血液供給を減少させ、癌細胞又は腫瘍に対する免疫応答を促進し、癌の進行を予防又は阻害し、又は癌を有する対象の寿命を増大させる。
本明細書で使用される用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び抗体フラグメントを特に包含する。
「医薬又は薬理学的に許容される」という語句は、必要に応じて、ヒトなどの動物に投与された場合に、有害な、アレルギー性の、又は他の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。抗体又は追加の活性成分を含む医薬組成物の調製は、本件発明の開示に照らして当業者に公知である。さらに、動物(例えば、ヒト)投与のために、調製物は、FDA生物学的基準局によって要求されるように、無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度基準を満たすべきであることが理解される。
本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、当業者に公知であるように、任意の及び全ての水性溶媒(例えば、水、アルコール/水溶液、生理食塩水溶液、非経口ビヒクル(例えば、塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなど)、非水性溶媒(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及び注射用有機エステル(例えば、エチルオレエート)、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤(例えば、抗菌剤又は抗真菌剤、キレート剤、及び不活性ガス)、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、染料、流体及び栄養補充剤、例えば、材料及びそれらの組み合わせを含む。医薬組成物中の種々の構成要素のpH及び正確な濃度は、周知のパラメーターに従って調節される。
用語「単位用量」又は「投薬量」は、対象における使用に適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち適切な経路及び処置レジメンに関連して上記で議論される所望の応答を生じるように計算された所定量の治療組成物を含む。投与される量は、治療回数及び単位用量の両方に応じて、所望の効果に依存する。患者又は被験体に投与される本実施態様の組成物の実際の投薬量は、対象の体重、年齢、健康、及び性別、処置される疾患の型、疾患浸透の程度、以前の又は同時の治療介入、患者の特発性、投与経路、ならびに特定の治療物質の効力、安定性、及び毒性などの物理的及び生理学的因子によって決定され得る。例えば、用量は、また、投与当たり約1μg/kg/体重～約1000mg/kg/体重(この範囲は、介在用量を含む)以上、及びその中で誘導可能な任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙される数からの誘導可能な範囲の非限定的な例において、約5μg/kg/体重～約100mg/kg/体重、約5μg/kg/体重～約500mg/kg/体重などの範囲を投与することができる。投与の責任を負う医師は、いずれにしても、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象のための適切な用量を決定する。いくつかの実施態様では、抗原特異的T細胞注入の用量が、約1億～約300億個の細胞、例えば、10、15、又は200億個の細胞を含み得る。
「免疫チェックポイント」という用語は、免疫反応のバランスをとるためにその成分にシグナルを提供する免疫系におけるタンパク質などの分子を指す。既知の免疫チェックポイントタンパク質はCTLA-4、PD1及びそのリガンドであるPD-L1及びPD-L2を含み、さらにLAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIRを含む。LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、及びKIRが関与する経路は、CTLA-4及びPD-1依存性経路と同様の免疫チェックポイント経路を構成することが当技術分野で認識されている(例えば、Pardoll、2012; Mellmanら、2011を参照されたい)。
「免疫チェックポイントインヒビター」は、免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻害する任意の化合物を指す。抑制には、機能の低下及び完全遮断が含まれる。特に、免疫チェックポイントタンパク質は、ヒト免疫チェックポイントタンパク質である。したがって、特に免疫チェックポイントタンパク質インヒビターは、ヒト免疫チェックポイントタンパク質のインヒビターである。
本明細書中で使用される場合、「防御免疫応答」は、癌に対する哺乳動物宿主の免疫系による応答をいう。防御免疫応答は、癌の治療、例えば、腫瘍サイズを減少させるか、又は生存を増加させるための治療効果を提供し得る。
本明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、抗体又はT細胞受容体によって結合され得る分子である。抗原は、B及び／又はTリンパ球の産生につながる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導するために一般的に使用され得る。
用語「腫瘍関連抗原」、「腫瘍抗原」及び「癌細胞抗原」は、本明細書中で互換可能に使用される。それぞれの場合において、この用語は、癌細胞によって特異的に又は優先的に発現されるタンパク質、糖タンパク質又は炭水化物をいう。
用語「キメラ抗原レセプター(CAR)」は、本明細書中で使用される場合、例えば、人工T細胞レセプター、キメラT細胞レセプター、又はキメラ免疫レセプターをいい得、そして特定の免疫エフェクター細胞上に人工特異性を植え付ける操作されたレセプターを包含する。CARは、モノクローナル抗体の特異性をT細胞に付与するために使用され得、それによって、例えば養子細胞治療における使用のために、多数の特異的T細胞が生成されることを可能にする。特定の実施態様では、CARが、例えば、腫瘍関連抗原に対する細胞の特異性を指向する。いくつかの実施態様では、CARが、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。特定の局面において、CARは、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片(scFv)の融合物を含み、これは、CD3ゼータ、膜貫通ドメイン及びエンドドメインに融合される。他のCAR設計の特異性は、レセプター(例えば、ペプチド)のリガンドから、又はパターン認識レセプター(例えば、Dectins)から誘導され得る。特定の場合において、抗原認識ドメインの間隔は、活性化誘導細胞死を減少させるように改変され得る。特定の場合において、CARは、CD3ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10、及び／又はOX40などのさらなる共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。場合によっては、共刺激分子、イメージング用レポーター遺伝子(例えば、ポジトロン放出断層撮影用)、プロドラッグ、ホーミングレセプター、ケモカイン、ケモカインレセプター、サイトカイン、及びサイトカインレセプターの添加時にT細胞を条件的に除去する遺伝子産物を含む、分子をCARと共発現させることができる。
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域(又はポリペプチド又はポリペプチド領域)は、別の配列に対する「配列同一性」又は「相同性」の特定の割合(例えば、80%、85%、90%、又は95%)を有し、これは、アライン（整列）された場合、塩基(又はアミノ酸)の割合が2つの配列を比較する際に同じであることを意味する。このアラインメント及び相同性パーセント又は配列同一性パーセントは、当該分野で公知のソフトウェアプログラム(例えば、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubelら編、1987)Supplement30、7.7. 18節、表7.7.1に記載されるもの)を使用して決定され得る。好ましくは、デフォルトパラメータが、アラインメントのために使用される。好ましいアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するBLASTである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメーターを使用するBLASTN及びBLASTPである:Geneticcode=standard;filter=none;strand=both;cutoff=60;expect=10;Matrix=BLOSUM62;Descriptions=50配列;sort by=HIGH SCORE;Databases=non-redundant,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。
III.EGFR変異ペプチド
本件発明で開示の実施態様は、突然変異EGFR配列(例えば、野生型EGR配列に対して挿入、置換又は欠失を有するペプチド)を含むEGFRペプチドなどの腫瘍抗原特異的ペプチドに関する。特定の実施態様では、腫瘍抗原特異的ペプチドが、EGFR変異ペプチドのアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、ペプチドが、長さが、50、45、40、35、30、25、20又は15アミノ酸以下である。特定の局面において、例えば、表1～3におけるもののいずれかは、非EGFRアミノ酸配列を有するポリペプチド(すなわち、異種ポリペプチド)に融合される。いくつかの態様において、腫瘍抗原特異的ペプチドは、表1～3のペプチド配列と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99、又は100パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列、又は表1～3のものに従う配列を有し得るが、表1～3のものと比較して、1、2又は3個のアミノ酸置換又は欠失を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」は、7～35アミノ酸残基、好ましくは8～35アミノ酸残基、さらにより好ましくは8～25アミノ酸、又は7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、若しくは35アミノ酸長、又はその中で誘導可能な任意の範囲を含むアミノ酸鎖を包含する。例えば、本件発明で開示のEGFR変異ペプチドは、いくつかの実施態様では、表1～3のいずれか1つの配列を含むか、又はそれからなってもよい。本明細書中で使用される場合、「抗原性ペプチド」は脊椎動物に導入される場合、脊椎動物における抗体の産生を刺激し得る、すなわち抗原性があり、そしてここで、抗体は、抗原性ペプチドを選択的に認識及び／又は結合し得る、ペプチドである。抗原性ペプチドは、免疫反応性EGFR変異ペプチドを含むことができ、追加の配列を含むことができる。さらなる配列は天然抗原に由来し得、そして異種であり得、そしてこのような配列は免疫原性であり得るが、免疫原性である必要はない。いくつかの実施態様では、腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)は、特異的HLAクラスI又はHLAクラスII複合体と選択的に結合することができる。特定の実施態様では、EGFR変異ペプチドが、長さが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、若しくは35アミノ酸、又はその中で誘導可能な任意の範囲である。好ましくは、腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)は、8～35アミノ酸長である。いくつかの実施態様では、腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)は、8～10アミノ酸長である。
当業者によって理解されるように、MHC分子は、様々なサイズのペプチドに結合することができるが、典型的には全長タンパク質に結合することはできない。MHCクラスI分子は、8～11アミノ酸長のペプチドに結合することが伝統的に記載されているが、長さ15アミノ酸のペプチドが結合部位の中央で膨らむか、又はMHCクラスI結合溝(groove:グローブ)から外に延びることによって、MHCクラスI分子に結合し得ることが示されている(Guoら、1992; Burrowsら、2006; Saminoら、2006;Stryhnら、2000; Collinsら、1994; Blanchard及びShastri、2008)。さらに、最近の研究は、また、より長いペプチドが抗原提示細胞によって、より効率的にエンドサイトーシスされ、プロセシングされ、そして提示され得ることを実証した(Zwavelingら、2002; Bijkerら、2007; Melief及びvan der Burg、2008; Quintarelliら、2011)。Zwavelingら(2002)に示されるように、35アミノ酸長までのペプチドを使用して、クラスII MHCに選択的に結合し得、そして有効である。当業者によって直ちに理解されるように、天然に存在する全長腫瘍抗原、例えば変異EGFRは、それがエンドサイトーシスされ、T細胞の増殖を生成するように、クラスII MHCを選択的に結合するのに有用ではないであろう。一般に、天然に存在する全長腫瘍抗原タンパク質は、これらの特性を示さず、したがって、これらの免疫療法目的に有用ではない。
特定の実施態様において、腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)は、免疫原性又は抗原性である。以下の実施例に示すように、本件発明で開示の種々の腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)は、T細胞の増殖を促進することができる。このようなペプチドは、ある程度の防御免疫を誘導するために使用され得ることが予想される。
腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)は、組換えペプチド、合成ペプチド、精製ペプチド、固定化ペプチド、検出可能に標識されたペプチド、カプセル化ペプチド、又はベクター発現ペプチド(例えば、核酸に作動可能に連結された異種プロモーターを含むベクター中の核酸によってコードされるペプチド)であり得る。いくつかの実施態様では、合成腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)をヒト患者などの対象に投与して、対象における免疫応答を誘導することができる。合成ペプチドは、組換えによって発現されたペプチドと比較して、細菌汚染のリスクの減少などの特定の利点を示し得る。腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)は、また、哺乳動物又はヒト被験体への投与のために処方される、例えば、ワクチン組成物のような医薬組成物に含まれ得る。
A. ペプチド選択のための手順のHLAクラスI及びIIライブラリーペプチドの例
以下の表1は、特定のHLAクラスI組成物に結合すると予測されるEGFR変異ペプチドの最終ペプチド組成の実施例を示す。ペプチドは、予測される結合特性に基づいてランク付けされている。この場合、この実例の患者は、L858Rの突然変異を有し、2種類の異なる特定HLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子を有している。
HLAクラスIペプチドを選択するための例示的な手順(HLAクラスIIペプチドは、同じ手順を使用して選択されえる):
1.
患者の腫瘍を遺伝学的に解析し、EGFR変異の有無を調べる。
2.
患者のHLAクラスI及びHLAクラスIIのタイピングを行い、どのHLA分子を発現しているかを調べる。
3.
患者がEGFR変異を含む場合、HLAペプチド結合予測を行い、EGFR変異を含むペプチドがHLAクラスI又はHLAクラスII分子のいずれかに結合できるかどうかを判定する。上位20の最も一般的なEGFR変異について、これらの予測されるペプチドを、含まれる(included)表に列挙する。
4.
表1の患者例: EGFR配列の結果、患者はL858RのEGFR変異を有し、HLAクラスIタイピングはHLA-A*0101、A*0301、B*0702、B*4601、C*0102、C*0701であった。
5.
特異的ペプチドリスト(表2及び3を参照のこと)から、これらの6つのHLA型について列挙される全てのペプチドを得、そしてそれらを1つのリストに組み合わせる。
6.
ペプチドを、それらの予測される親和性(nM)及び予測されるパーセンタイル(percentile)に従って、以下のように個別にスコア化する:
Figure 2023500567000002
 7.
各ペプチドの最終合計スコア(最大合計スコア=6)を求めるために、親和性スコア(max = 3)とパーセンタイルスコア(max = 3)を合計する。
8.
ペプチドをそれらの総スコアに従ってランク付けする。
9.
最高の総スコアを有するペプチドは、免疫原性組成物(ワクチン)に含まれるように優先される。
HLA Class I Libraryには、上位20のEGFR変異が含まれており、EGFRmut患者の約95%をカバーしている(以下の表2参照)。ライブラリーには、342個の突然変異特異ペプチド及び2個の突然変異によって共有される16個のペプチドを含む364個の総数EGFR変異ペプチドが存在する。ライブラリーは、100のHLAクラスIアロタイプ(HLA-A、30;HLA-B、48;及びHLA-C、22)を含む。
HLAクラス2ライブラリーは、上位20のEGFR変異を持ち、ライブラリー中に429の全EGFR変異ペプチドを含んでいる(以下の表3参照)。上位20のEFGR突然変異は、A763_Y764insFQEA,D770_N771insSVD,E746_A750del,E746_S752del>V,G719A,G719C,G719S,H773_V774insH,I744_K745insKIPVAI,L747_A750del>P,L747_P753del>S,L747_S752del,L747_T751del,L747_T751del>P,L858R,L861Q,P772_H773insPR,S768I,T790M,andV769_D770insASVである。
表１：ペプチドの例示HLAクラスIライブラリーと関連特徴
Figure 2023500567000003
 表２：ペプチドのHLAクラスIライブラリーと関連特徴
Figure 2023500567000004
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Figure 2023500567000013
Figure 2023500567000014
Figure 2023500567000015
 表3：ペプチドのHLAクラスIIライブラリーと関連特徴
Figure 2023500567000016
Figure 2023500567000017
Figure 2023500567000018
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Figure 2023500567000030
Figure 2023500567000031
B. 細胞透過性ペプチド
いくつかの実施態様では、免疫療法が、リポソーム又は細胞透過性ペプチド(CPP)などの細胞ペネトレ－タ－に関連する本件発明で開示の腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)を利用することができる。ペプチドでパルスした抗原提示細胞(樹状細胞など)を使用して、抗腫瘍免疫を増強することができる(Celluzziら、1996;Youngら、1996)。リポソーム及びCPPは、以下にさらに詳細に記載される。いくつかの実施態様では、免疫療法が、本件発明で開示の腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)をコードする核酸を利用することができ、ここで、核酸は、例えば、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター中で送達される。
腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)は、また、細胞透過性ペプチド(CPP)と会合するか、又は共有結合することができる。腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)に共有結合し得る細胞透過性ペプチドには、例えば、HIV Tat、ヘルペスウイルスVP22、ショウジョウバエ・アンテナペディア・ホメオボックス遺伝子産物、シグナル配列、融合配列、又はプロテグリンIが含まれる。ペプチドをCPPに共有結合させることにより、樹状細胞によるペプチドの提示を延長することができ、したがって抗腫瘍免疫を増強することができる(Wang and Wang, 2002)。いくつかの実施態様において、本件発明で開示の腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)(例えば、ペプチド又はポリエピトープ ストリング内に含まれる)はCPPに共有結合(例えば、ペプチド結合を介して)されて、融合タンパク質を生成し得る。他の実施態様において、腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)又は腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸は、リポソーム(例えば、多重層、小胞、又は多重小胞リポソーム、開口分泌小胞:exocytic vesicle、エキソソーム)内にカプセル化され得るか、又はリポソームと会合され得る。
本明細書中で使用される場合、「会合」は、物理的会合、化学的会合、又はその両方を意味する。例えば、会合は、共有結合、疎水性相互作用、カプセル化、表面吸着などを含むことができる。
本明細書中で使用される場合、「細胞ペネトレ－タ－:cell penetrator」は、抗原提示細胞へのペプチド/ポリエピトープ ストリングの細胞内送達を増強する組成物又は化合物をいう。例えば、細胞ペネトレ－タ－は、ペプチドと会合した場合に、原形質膜を横切るその能力を増強する脂質であり得る。あるいは、細胞ペネトレ－タ－は、ペプチドであってもよい。細胞透過性(cell penetrating)ペプチド(CPP)は、当該分野で公知であり、そして例えば、HIVのTatタンパク質(Frankel及びPabo、1988)、HSVのVP22タンパク質(Elliott及びO'Hare、1997)及び線維芽細胞成長因子(Linら、1995)を含む。
細胞透過性ペプチド(又は「タンパク質形質導入ドメイン」)は、ショウジョウバエアンテナペディアホメオボックス遺伝子(Antp)、HIV Tat、及びヘルペスウイルスVP22の第3のヘリックスから同定されており、これらの全ては、アルギニン及びリジン残基について濃縮された正に荷電したドメインを含む(Schwarzeら、2000; Schwarzeら、1999)。また、シグナル配列に由来する疎水性ペプチドは、細胞透過性ペプチドとして同定されている。(Rojasら、1996; Rojasら、1998; Duら、1998)。これらのペプチドをβ-ガラクトシダーゼのようなマーカータンパク質に結合させることは、細胞へのマーカータンパク質の効率的な内在化を付与することが示されており、これらのペプチドを含有するキメラインフレーム融合タンパク質は、インビトロ及びインビボの両方の広範囲の細胞型にタンパク質を送達するために使用されている(Drinら、2002)。本件発明の開示による腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)へのこれらの細胞透過性ペプチドの融合は、ポリペプチドの細胞取り込みを増強し得る。
いくつかの実施態様において、細胞取り込みは、脂質(例えば、ステアリン酸塩又はミリスチル酸塩)のポリペプチドへの付着によって促進される。脂質化は、細胞へのペプチドの通過を増強することが示されている。脂質部分の付着は、本件発明の開示の内容が、細胞によるポリペプチド取り込みを増加させる別の方法である。細胞取り込みは、以下でさらに議論される。
本件発明で開示の腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)は、リポソームワクチン組成物に含まれ得る。例えば、リポソーム組成物は、プロテオリポソーム組成物であってもよく、又はそれを含んでもよい。本件発明の開示とともに使用され得るプロテオリポソーム組成物を産生するための方法は、例えば、Neelapuら(2007)及びPopescuら(2007)に記載される。いくつかの実施態様において、プロテオリポソーム組成物は、黒色腫を処置するために使用され得る。
腫瘍抗原特異的ポリペプチドの取り込みを増強することによって、治療に必要とされるタンパク質又はペプチドの量を減少させることが可能であり得る。これは、次に、処置のコストを有意に減少させ得、そして治療剤の供給を増加させ得る。より低い投薬量は、また、ペプチドの潜在的な免疫原性を最小限にし得、そして毒性の副反応を抑制し得る。
いくつかの実施態様では、腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)をナノ粒子と会合させて、ナノ粒子-ポリペプチド複合体を形成することができる。いくつかの実施態様では、ナノ粒子が、リポソーム、又は脂質ベースの小胞(例えば、DOTAP:コレステロール小胞)などの他の脂質ベースのナノ粒子である。他の実施態様では、ナノ粒子が、酸化鉄ベースの超常磁性ナノ粒子である。約10～100nmの直径範囲の超常磁性ナノ粒子は、脾臓による隔離を回避するのに十分小さいが、肝臓によるクリアランスを回避するのに十分大きい。このサイズの粒子は、非常に小さな毛細血管に浸透することができ、体組織中に効果的に分布させることができる。超常磁性ナノ粒子-ポリペプチド複合体をMRI造影剤として使用して、腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)を取り込む細胞を同定し、追跡することができる。いくつかの実施態様では、ナノ粒子が、半導体ナノ結晶又は半導体量子ドットであり、その両方を光学的イメージングに使用することができる。さらなる実施態様では、ナノ粒子がシリカのコア上に金層を含むナノシェルであり得る。ナノシェルの1つの利点は、標準的な化学を用いてポリペプチドを金層に結合させることができることである。他の実施態様において、ナノ粒子はフラーレン又はナノチューブであり得る(Guptaら、2005)。
ペプチドは、腎臓によって循環から迅速に除去され、血清中のプロテアーゼによる分解に感受性がある。腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)をナノ粒子と会合させることによって、本件発明で開示のナノ粒子-ポリペプチド複合体は分解から保護し、及び／又は腎臓によるクリアランスを減少させ得る。これは、ポリペプチドの血中半減期を増加させ得、それによって、有効な治療のために必要なポリペプチド用量を減少させる。さらに、これは、処置のコストを減少させ得、そして免疫学的問題及び治療の毒性反応を最小限にし得る。
C. ポリエピトープ ストリングス
いくつかの実施態様において、腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)は、ポリエピトープ ストリングに含まれるか、又は含まれる。ポリエピトープ ストリングは、一緒に連結された1つ以上の抗原由来の複数の抗原エピトープを含むペプチド又はポリペプチドである。ポリエピトープ ストリングは、ヒト対象のような対象において免疫応答を誘導するために使用され得る。ポリエピトープ ストリングはマラリア及び他の病原体を標的とするために以前に使用されている(Baraldoら、2005;Moorthyら、2004; Bairdら、2004)。ポリエピトープ ストリングは、核酸(例えば、EGFR変異ペプチドを含む複数の抗原をコードする核酸)又はペプチド若しくはポリペプチド(例えば、EGFR変異ペプチドを含む複数の抗原を含む)を指すことができる。ポリエピトープ ストリングは、癌ワクチン組成物に含まれ得る。
D.生物学的機能的同等物
本件発明で開示の腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)はHLAクラスタンパク質(例えば、HLA-A*0101)結合領域とのそれぞれの相互作用を変化させないアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含むように改変され得る。腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)のこのような生物学的に機能的な等価物は、類似の又は他の所望の特徴(例えば、特異的HLAクラスI又はHLAクラスII複合体の結合)を有する分子であり得る。非限定的な例として、特定のアミノ酸は、HLAに結合する検出可能に変化しないペプチドによって実証されるように、相互作用能力のかなりの損失なしに、本明細書中に開示される腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)中の他のアミノ酸と置換され得る。いくつかの実施態様では、腫瘍抗原特異的ペプチドが、1(P1)、2(P2)、及び／又は9(P9)位の1つ、2つ、又はすべてにおける置換変異などの、アンカー残基における置換変異を有する。従って、本明細書に開示される腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)(又はこのようなペプチドをコードする核酸)は、配列及び／又は構造が修飾されているが、生物学的有用性又は活性が変化しておらず、本明細書に開示される組成物及び方法の範囲内にあることが意図される。
生物学的に機能的に等価なペプチドの定義に固有のものは、等価な生物学的活性の許容可能なレベルを依然として維持しながら、分子の規定された部分内でなされ得る変化の数に限界があるという概念であることもまた、当業者によって十分に理解される。生物学的に機能的に同等なペプチドとは、かくして、アミノ酸のほとんど又は全てではなく、特定のものを置換されることができるようなペプチド、とここでは定義される。もちろん、異なる置換を有する複数の別個のペプチドは、本件発明の開示に従って容易に作製され得、そして使用され得る。
特定の残基、例えば特定のエピトープ中の残基がペプチドの生物学的又は構造的特性に特に重要であることが示される場合、このような残基は、一般に変換され得ないこともまた、当業者は認識する。このことは、本明細書中に開示される腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)における変異が種特異的損失をもたらし得、そして次に、本件発明で開示の方法における使用のための得られるペプチドの有用性を減少させ得るので、本件発明の開示における場合であり得る。したがって、抗原性があり(例えば、HLAクラスI又はHLAクラスII複合体に特異的に結合し)、保存的アミノ酸置換を含むペプチドは、本件発明の開示に含まれると理解される。保存的置換は、タンパク質の活性を劇的に変化させる可能性が最も低い。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸を化学的に類似のアミノ酸で置換すること、すなわち、非極性アミノ酸を他の非極性アミノ酸で置換すること;極性アミノ酸を他の極性アミノ酸で置換すること、酸性残基を他の酸性アミノ酸で置換することなどをいう。
本明細書中に開示される腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)を改変する際に使用され得るようなアミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性(例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなど)に基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状及びタイプの分析は、アルギニン、リジン及びヒスチジンがすべて正に荷電した残基であること;アラニン、グリシン及びセリンがすべて同様のサイズであること;ならびにフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンがすべてほぼ同様の形状を有することを明らかにする。従って、これらの考察に基づいて、アルギニン、リジン及びヒスチジン;アラニン、グリシン及びセリン;ならびにフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、本明細書中で生物学的に機能的な等価物として定義される。いくつかの実施態様において、変異は、TCR-pMHC相互作用及び／又はペプチド-MHC結合を増強し得る。
本件発明の開示は、また、本明細書中に開示される腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)のアイソフォームを意図する。アイソフォームは、本件発明で開示のペプチドと同じ数及び種類のアミノ酸を含むが、アイソフォームは異なる分子構造を有する。本件発明の開示によって意図されるアイソフォームは、本明細書中に記載される本件発明で開示のペプチドと同じ特性を有するアイソフォームである。
非標準アミノ酸は、既存のアミノ酸の化学修飾によって、又は、本明細書に開示されるペプチドのde novo合成によって、タンパク質に組み込まれ得る。非標準アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされる20個の標準アミノ酸と化学構造が異なるアミノ酸を指す。
選択された実施態様において、本件発明の開示は、本明細書中に開示される腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)の化学誘導体を意図する。「化学誘導体」は、官能性側鎖基の反応によって化学的に誘導体化され、生物学的活性及び有用性を保持する1つ以上の残基を有するペプチドをいう。このような誘導体化ペプチドとしては、例えば、遊離アミノ基が特定の塩を形成するように誘導体化されているか、又はアルキル化及び／又はアシル化によって誘導体化されているもの、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオシカルボニル基、クロロアセチル基、ホルミル又はアセチル基が挙げられる。遊離カルボキシル基を誘導体化して、有機又は無機塩、メチル及びエチルエステル、又は他のタイプのエステル又はヒドラジド、好ましくはアミド(第一級又は第二級)を形成することができる。化学誘導体は、20個の標準アミノ酸の1つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチドを含み得る。例えば、4-ヒドロキシプロリンは、セリンに置換されてもよく、オルニチンは、リジンに置換されてもよい。
すべてのアミノ酸残基配列は、本明細書において、その左及び右の配向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である式によって表されることに留意されたい。
さらに、アミノ酸残基配列の開始又は末端のダッシュは、1つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合を示すことに留意すべきである。本明細書中に記載されるアミノ酸は、「L」異性体形態であることが好ましい。しかしながら、「D」異性体形態の残基は、本明細書中に記載される所望の機能特性がタンパク質によって保持される限り、任意のL-アミノ酸残基に置換することができる。
好ましい腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)又はその類似体は、好ましくは特異的HLAクラスI又はHLAクラスII複合体に特異的又は優先的に結合する。特定の腫瘍抗原特異的ペプチド若しくは標識ペプチド、又はその類似体が、特定のHLAクラスI又はHLAクラスII複合体に結合し得るかどうか、又はどの程度結合し得るかの決定はインビトロアッセイ〔例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、イムノブロッティング、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫染色、ラテックス凝集、間接赤血球凝集アッセイ(IHA)、補体結合、間接免疫蛍光アッセイ(FA)、比濁法、フローサイトメトリー、化学発光アッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、u-キャプチャアッセイ、質量分析、粒子ベースアッセイ、阻害アッセイ及び／又はアビディティ(avidity)アッセイ〕を使用して評価され得る。
E. 腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸
一態様では、本件発明の開示が、表1～3のものから選択されるペプチドと少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む単離された抗原特異的ペプチドをコードする核酸を提供し、又はペプチドは表1～3のものから選択されるペプチドと比較して、1、2、3、又は4つの点突然変異(例えば、置換変異)を有する可能性がある。上記のように、このような腫瘍抗原特異的ペプチドは、例えば、8～35アミノ酸長、又はその中で誘導可能な任意の範囲であり得る。
本件発明で開示のいくつかの実施態様は、特定HLAクラスI又はHLAクラスII複合体に特定に結合することができる組換え産生腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)を提供する。従って、腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸は、分子生物学分野で周知の方法を使用して、発現ベクターに作動可能に連結され得、そしてペプチドは適切な発現系において産生され得る。本明細書中に開示される腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸は、ペプチドの良好な発現を確実にする任意の発現ベクターに組み込まれ得る。可能な発現ベクターは、ベクターが宿主細胞の形質転換に適している限り、コスミド、プラスミド、又は修飾ウイルス(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)を含むが、これらに限定されない。
「宿主細胞の形質転換に適している」組換え発現ベクターは、発現ベクターが本件発明で開示の核酸分子、及び核酸分子に作動可能に連結された、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択された調節配列を含むことを意味する。
用語「作動可能に連結された：operatively linked」又は「作動可能に連結された：operably linked」は、互換的に使用され、核酸の発現を可能にする様式で、核酸が調節配列に連結されることを意味することが意図される。
従って、本件発明の開示は、腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸、ならびに挿入されたタンパク質配列の転写及び翻訳に必要な調節配列を含む組換え発現ベクターを提供する。適切な調節配列は、細菌、真菌、又はウイルス遺伝子を含む種々の供給源に由来し得る(例えば、Goeddel(1990)に記載される調節配列を参照のこと)。
適切な調節配列の選択は、一般に、選択される宿主細胞に依存し、当業者によって容易に達成され得る。そのような調節配列の例としては、転写プロモーター及びエンハンサー又はRNAポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択される宿主細胞及び使用されるベクターに依存して、他の配列(例えば、複製起点、さらなるDNA限定部位、エンハンサー、及び転写の誘導性を付与する配列)が、発現ベクターに組み込まれ得る。必要な調節配列は、天然タンパク質及び／又はその隣接領域によって供給されてもよいことも理解されるのであろう。
組換え発現ベクターは、また、本明細書中に開示される組換え腫瘍抗原特異的ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子を含み得る。選択マーカー遺伝子の実施例は、特定の薬物、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、又はホタルルシフェラーゼに対する耐性を付与する、G418及びヒグロマイシンなどのタンパク質をコードする遺伝子である。選択マーカー遺伝子の転写は、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、又はホタルルシフェラーゼのような選択マーカータンパク質の濃度の変化によってモニターされる。選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性形質転換細胞のような抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合は、G418で選択することができる。選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るが、他の細胞は死ぬ。これにより、組換え発現ベクターの発現の可視化及びアッセイが可能となり、特に、発現及び表現型に対する突然変異の影響を決定することが可能となる。選択マーカーは、目的の核酸とは別のベクター上に導入され得ることが理解される。
組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して、形質転換宿主細胞を産生することができる。用語「形質転換宿主細胞」は、本件発明で開示の組換え発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトされた原核細胞及び真核細胞を含むことが意図される。用語「で形質転換された」、「でトランスフェクトされた」、「形質転換」及び「トランスフェクション」は当技術分野で公知の多くの可能な技術の1つによる細胞への核酸(例えば、ベクター)の導入を包含することが意図される。適切な宿主細胞には、多種多様な原核及び真核宿主細胞が含まれる。例えば、本件発明で開示のタンパク質は細菌細胞(例えば、E. coli)、昆虫細胞(バキュロウイルスを使用する)、酵母細胞又は哺乳動物細胞において発現され得る。
本件発明で開示の核酸分子は、また、標準的な技術を使用して化学的に合成され得る。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する種々の方法が知られており、これには、ペプチド合成と同様に、市販のDNA合成機において完全に自動化されている固相合成が含まれる(例えば、米国特許第4,598,049号;第4,458,066号;第4,401,796号;及び第4,373,071号を参照のこと)。
IV. 抗原特異的細胞治療
本件発明で開示の実施態様は、抗原特異的細胞〔例えば、自己又は同種T細胞(例えば、制御性T細胞、CD4+T細胞、CD8+ T細胞、又はガンマデルタT細胞)、NK細胞、インバリアントNK細胞、NKT細胞、間葉系幹細胞(MSC)、又は誘導多能性幹(iPS)細胞〕を、取得し、癌細胞を標的とする免疫療法として、対象に、投与することに関するものである。特に、その細胞は、抗原特異的T細胞(例えば、変異EGFR特異的T細胞)である。機能性抗腫瘍エフェクター細胞の誘導、活性化及び拡大のためのいくつかの基本的アプローチが過去20年間に記載されている。
これらには、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)などの自己細胞;自己DC、リンパ球、人工抗原提示細胞(APC)又はT細胞リガンド及び活性化抗体でコーティングされたビーズ、又は標的細胞膜を捕獲することによって単離された細胞を用いてex vivoで活性化されたT細胞;抗宿主腫瘍T細胞受容体(TCR)を自然に発現する同種細胞;及び「T体:T-bodies」として知られる抗体様腫瘍認識能力を示す腫瘍反応性TCR分子又はキメラTCR分子を発現するように非腫瘍特異的自己又は同種細胞を遺伝的に再プログラム又は「方向付け」された。これらのアプローチは、本明細書中に記載される方法において使用され得るT細胞調製及び免疫化のための多数のプロトコールを生じた。
B. T細胞調製
いくつかの実施態様では、T細胞が、血液、骨髄、リンパ、臍帯、又はリンパ器官に由来する。いくつかの態様では、細胞は、ヒト細胞である。細胞は、典型的には対象から直接単離されたもの及び／又は対象から単離され凍結されたものなどの初代細胞である。
いくつかの実施態様では、細胞が、機能、活性化状態、成熟度、分化の潜在性、拡大(expansion)、再循環、局在化、及び／又は持続能、抗原特異性、抗原レセプターの型、特定の器官又はコンパートメントにおける存在、マーカー又はサイトカイン分泌プロフィール、及び／又は分化の程度によって定義されるものなど、T細胞又は他の細胞型(例えば、T細胞集団全体、CD4+細胞、CD8+細胞、及びそれらの亜集団)の1つ以上のサブセットを含む。治療される対象に関して、細胞は、同種異系(allogeneic)及び／又は自己(autologous)であってもよい。既製技術などのいくつかの態様では、細胞が、誘導多能性幹細胞(iPSC)などの幹細胞であるような多能性(pluripotent)及び／又は多能性(multipotent)である。いくつかの実施態様では、方法が本明細書に記載されるように、対象から細胞を単離すること、それらを調製すること、処理すること、培養すること、及び／又は操作すること、ならびにそれらを凍結保存の前又は後に同じ患者に再導入することを含む。
T細胞のサブタイプ及びサブ集団(例えば、CD4+及び／又はCD8+ T細胞)のうち、ナイーブT(TN)細胞、エフェクターT細胞(TEFF)、メモリーT細胞及びそのサブタイプ、例えば幹細胞メモリーT(TSCM)、セントラルメモリーT(TCM)、エフェクターメモリーT(TEM)、又は末端分化エフェクターメモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、未熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞、自然発生及び適応制御性T(Treg)細胞、ヘルパーT細胞、例えばTH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞、α/βT細胞、及びδ/γT細胞である。
いくつかの実施態様では、1つ以上のT細胞集団が、表面マーカーなどの特定のマーカーについて陽性であるか、又は特定のマーカーについて陰性である細胞について濃縮されるか、又は枯渇される。いくつかの場合において、このようなマーカーは、T細胞の特定の集団(例えば、非メモリー細胞)上では存在しないか、又は比較的低いレベルで発現されるが、T細胞の特定の他の集団(例えば、メモリー細胞)上では、比較的高いレベルで存在するか、又は発現されるマーカーである。
いくつかの実施態様において、T細胞は、非T細胞〔例えば、B細胞、単球、又は他の白血球(例えば、CD14) 〕上で発現されるマーカーのネガティブ選択によって、PBMCサンプルから分離される。いくつかの態様において、CD4+又はCD8+選択段階は、CD4+ヘルパーT細胞及びCD8+細胞傷害性T細胞を分離するために使用される。このようなCD4+及びCD8+集団は、一以上のナイーブT細胞亜集団、メモリーT細胞亜集団、及び／又はエフェクターT細胞亜集団上で比較的高い程度に発現又は発現されるマーカーに対するポジティブ又はネガティブ選択によって、亜集団にさらに選別することができる。
いくつかの実施態様において、CD8+ T細胞はナイーブ、中枢メモリー(central memory)、エフェクターメモリー、及び／又は中枢メモリー幹細胞について、例えば、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく陽性又は陰性選択によって、さらに濃縮又は枯渇される。いくつかの実施態様では、中枢メモリーT(TCM)細胞の濃縮が効力を増大させるために、例えば、投与後の長期生存、拡大、及び／又は生着を改善するために実施され、これはいくつかの態様において、このような亜集団において特に強固である。Terakuraら、2012;Wangら、2012を参照のこと。
いくつかの実施態様では、T細胞は、自己T細胞である。この方法において、腫瘍サンプルは患者から得られ、単一細胞懸濁液が得られる。単一細胞懸濁液は、任意の適切な様式で、例えば、機械的に(例えば、gentleMACS(商標)Dissociator、Miltenyi Biotec、Auburn、CAを使用して腫瘍を脱凝集させる)、又は酵素的に(例えば、コラゲナーゼ又はDNase)得ることができる。腫瘍酵素消化物の単細胞懸濁剤をインターロイキン-2(IL-2)中で培養する。細胞は、コンフルエンス(confluence)(例えば、約2×106リンパ球)まで、例えば、約5～約21日、好ましくは約10～約14日まで培養される。
培養したT細胞をプールし、迅速に増殖させることができる。迅速な増殖は約10～約14日の期間にわたって、少なくとも約50倍(例えば、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、又は100倍以上)の抗原特異的T細胞の数の増加を提供する。より好ましくは、急速な増殖が、約10～約14日の期間にわたって、少なくとも約200倍(例えば、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、又はそれ以上)の増加を提供する。
増殖は、当技術分野で知られている多くの方法のいずれかによって達成することができる。例えば、T細胞は、フィーダーリンパ球及びインターロイキン-2(IL-2)又はインターロイキン-15(IL-15)のいずれかの存在下で非特異的T細胞受容体刺激を用いて迅速に増殖させることができ、IL-2が好ましい。非特異的T細胞受容体刺激は、約30ng/mlのOKT3、マウスモノクローナル抗CD3抗体(Ortho-McNeil(登録商標)、Raritan、NJから入手可能)を含み得る。あるいは、T細胞が、300IU/mlのIL-2又はIL-15などのT細胞増殖因子の存在下で、ヒト白血球抗原A2(HLA-A2)結合ペプチドなどのベクターから任意選択で発現させることができる癌の1つ又は複数の抗原(エピトープなどのその抗原部分、又は細胞を含む)でのPBMCのin vitro刺激によって迅速に増殖させることができ、IL-2が好ましい。インビトロで誘導されたT細胞は、HLA-A2発現抗原提示細胞上にパルスされた癌の同一抗原(複数)での再刺激によって急速に拡大される。代わりに、T細胞を、放射線照射、自己リンパ球、又は放射線照射されたHLA-A2+同種リンパ球及びIL-2で再刺激することができる。
自己T細胞は、自己T細胞の増殖及び活性化を促進するT細胞増殖因子を発現するように改変され得る。適切なT細胞増殖因子としては、例えば、IL-2、IL-7、IL-15、及びIL-12が挙げられる。適切な修飾方法は、当技術分野で公知である。例えば、Sambrookら、2001;及びAusubelら、1994を参照のこと。特に、改変された自己T細胞は、高レベルでT細胞成長因子を発現する。
T細胞増殖因子コード配列(例えば、IL-12の配列)は、プロモーターがそうであるように、当該分野で容易に利用可能であり、そのT細胞増殖因子コード配列への作動可能な連結は、高レベルの発現を促進する。
C. 抗原提示細胞
マクロファージ、Bリンパ球、樹状細胞などの抗原提示細胞（APC）は、特定のMHC分子の発現によって区別される。APCは、抗原を取り込み、その抗原の一部をMHC分子とともにその外膜上に再発現する。主要組織適合遺伝子複合体(MHC)は、複数の遺伝子座を有する大きな遺伝的複合体である。MHC遺伝子座は、クラスI及びクラスII MHCと呼ばれる2つの主要なクラスのMHC膜分子をコードしている。ヘルパーTリンパ球は、一般にMHCクラス2分子と結合した抗原を認識し、細胞傷害性Tリンパ球は、MHCクラス1分子と結合した抗原を認識する。MHCは、ヒトでは、HLA複合体と呼ばれ、マウスでは、H-2複合体と呼ばれる。いくつかの態様において、実施態様のEGFR変異ペプチドは、抗原提示細胞において発現される。このような細胞は、目的の変異EGFR抗原に特異的な免疫エフェクター細胞を特異的に増殖させるために用いることができる操作されたAPCを提供する。
いくつかの場合において、aAPCは、本実施態様の治療組成物及び細胞治療生成物を調製する際に有用である。抗原提示システムの調製及び使用に関する一般的なガイダンスについては、例えば、米国特許を参照のこと。米国特許番号6,225,042, 6,355,479、6,362,001及び6,790,662;米国特許出願公開番号2009/0017000及び2009/0004142;並びに国際公開第WO2007/103009号。
aAPCシステムは、少なくとも1つの外因性補助分子を含み得る。任意の適切な数及び組み合わせの補助分子が使用され得る。補助分子は、例えば、共刺激分子及び接着分子のような補助分子から選択され得る。例示的な共刺激分子としては、CD86、CD64(FcγRI)、41BBリガンド、及びIL-21が挙げられる。接着分子には、セレクチンなどの炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、細胞間又は細胞-マトリックス間接触などを促進する細胞間接着分子(ICAM)などの単一回膜貫通型免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリータンパク質が含まれうる。例示的な接着分子としては、LFA-3及びICAM(例えば、ICAM-1)が挙げられる。同時刺激分子及び接着分子を含む例示的な補助分子の選択、クローニング、調製、及び発現に有用な技術、方法、及び試薬は、例えば、米国特許番号6,225,042, 6,355,479、6,362,001に例示されている。。
V. 治療方法
本明細書中に提供されるのは個体における癌の進行を処置又は遅延させるための方法であり、これは個体に、有効量を抗原特異的細胞療法(例えば、変異EGFR特異的T細胞療法)において、投与する工程を包含する。遺伝子操作されたTCR形質導入T細胞〔TCRを他の生体反応性タンパク質(例えば、抗CD3)に結合させる〕を用いた適応（adoptive）T細胞療法もまた、本発明において提供される。さらなる実施態様において、精製された腫瘍抗原又は免疫優性腫瘍抗原特異的ペプチドで対象を免疫することを含む、癌の治療のための方法が提供される。
本明細書中に提供されるEGFR変異ペプチドは、癌ワクチン又は免疫原(例えば、アジュバントと、ポリヌクレオチドをコードする、及び不活性ウイルス又は他の微生物ワクチンのような発現産物に相当する、ペプチド若しくは改変ペプチドの混合物)を、開発するために利用され得る。これらのペプチド特異的ワクチン又は免疫原は、インビボで抗腫瘍免疫応答を誘導するために癌患者を直接免疫するのに、又はペプチド若しくはコードされたポリヌクレオチド負荷APC刺激を用いてインビトロで抗原特異的T細胞を増殖させるのに、使用され得る。これらの多数のT細胞を、患者に養子(adoptively)移入し、腫瘍の退縮を誘導することができる。
治療のために計画される癌の実施例は、肺癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、子宮頸癌、胃腸癌、リンパ腫、肺における前新生物病変、結腸癌、黒色腫、及び膀胱癌を含む。
いくつかの実施態様では、T細胞は自己由来である。しかしながら、細胞は同種異系であり得る。いくつかの実施態様において、T細胞は細胞が自己由来であるように、患者自身から単離される。T細胞が、同種異系であれば、T細胞を数人のドナーからプールすることができる。細胞は、治療される疾患の症状及び徴候を制御する、減少する、又は排除するのに十分な量で、目的の対象に投与される。
いくつかの実施態様では、対象が、T細胞療法の前に骨髄非破壊的リンパ除去的(lymphodepleting)化学療法を施され得る。骨髄非破壊的リンパ除去的化学療法は、任意の適切な経路によって投与され得る任意の適切なこのような治療であり得る。骨髄非破壊的リンパ除去的化学療法は、特に癌が転移性であり得るメラノーマである場合には、例えば、シクロホスファミド及びフルダラビンの投与を含むことができる。シクロホスファミド及びフルダラビンを投与する例示的な経路は静脈内である。同様に、任意の適切な用量のシクロホスファミド及びフルダラビンを投与することができる。特に、シクロホスファミド約60mg/kgを2日間投与した後、フルダラビン約25mg/m2を5日間投与する。
特定の実施態様において、自己T細胞の増殖及び活性化を促進するT細胞増殖因子は、自己T細胞と同時に、又は自己T細胞の後で、投与される。T細胞増殖因子は、自己T細胞の増殖及び活性化を促進する任意の適切な増殖因子であり得る。適当なT細胞増殖因子の実施例としては、IL-2、IL-7、IL-15、及びIL-12が挙げられ、これらはIL-2及びIL-7、IL-2及びIL-15、IL-7及びIL-15、”IL-2、IL-7及びIL-15”、IL-12及びIL-7、IL-12及びIL-15、又はIL-12及びIL-2などの様々な組み合わせで単独又は種々の組み合わせで使用することができる。IL-12は好ましいT細胞増殖因子である。
T細胞は、静脈内、筋肉内、皮下、局所的、経口的、経皮的、腹腔内、眼窩内、埋め込み、吸入、髄腔内、脳室内、又は鼻腔内に投与され得る。T細胞療法の適切な投与量は、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、個人の臨床状態、個人の病歴及び治療に対する反応、ならびに主治医の裁量に基づいて決定され得る。
腫瘍内注射又は腫瘍血管系への注射は、個別の、固形の、接近可能な腫瘍について特に意図される。局所的、局部的又は全身投与もまた適切であろう。4cmを超える腫瘍については、投与される容量は約4～10ml(特に10ml)であり、4cm未満の腫瘍については約1～3ml(特に3ml)の容量が使用される。単一用量として投与される複数の注射（multiple injection）は、約0.1ないし約0.5mlの容量を含む。
B. 医薬組成物
抗原特異的免疫細胞(例えば、T細胞)若しくはレセプター(例えば、TCR)及び薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物及び処方物もまた、本願発明において提供される。対象における医薬的使用のためのワクチン組成物は、本明細書に開示される腫瘍抗原ペプチド(例えば、EGFR変異ペプチド)組成物及び薬学的に許容される担体を含み得る。
本明細書に記載の医薬組成物及び製剤は、所望の純度を有する活性成分(抗体又はポリペプチドなど)を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、1つ又は複数の任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012)と混合することによって調製することができる。薬学的に受容可能なキャリアは、一般に、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、これにはリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;（塩化オクタデシルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメソニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼソニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;レゾルシノール;シクロヘクサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールのような）防腐剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどの親水性ポリマー;単糖類、二糖類、グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Znタンパク質錯体);及び／又はポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン性界面活性剤、が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中の例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性ニュ－トラル活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rHuPH20〔HYLENEX(登録商標)、Baxter International, Inc. 〕などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの組織内薬物分散剤をさらに含む。rHuPH20を含む特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、米国特許公開番号2005/0260186及び2006/0104968に記載されている。1つの態様では、sHASEGPが、コンドロイティナーゼのような1つ以上の追加的なグリコサミノグリカンと結合される。
C. 併用療法
特定の実施態様において、本実施態様の組成物及び方法は、抗原特異的免疫細胞集団又はTCRを、少なくとも1つの付加的治療と組み合わせて含む。付加的治療は、放射線治療、手術(例えば、腫瘤摘出及び乳房切除)、化学治療、遺伝子治療、DNA治療、ウイルス治療、RNA治療、免疫治療、骨髄移植、ナノ治療、モノクローナル抗体治療、又は前記これらとの組合せでよい。この付加的治療は、アジュバント療法又はネオアジュバント療法の形態であり得る。
いくつかの実施態様では、付加的治療が小分子酵素インヒビター又は抗転移剤の投与である。いくつかの実施態様において、付加的治療は副反応抑制剤〔例えば、治療の副反応(例えば、抗悪心剤など)の発生及び／又は重症度を減少させることを意図される薬剤〕の投与である。いくつかの実施態様では、付加的治療は放射線療法である。いくつかの実施態様では、付加的治療は手術である。いくつかの実施態様では、付加的治療が放射線療法と手術との組み合わせである。いくつかの実施態様では、付加的治療はガンマ線照射である。いくつかの実施態様では、付加的治療がPBK/AKT/mTOR経路を標的とする治療であり、HSP90インヒビター、チューブリンインヒビター、アポトーシスインヒビター、及び／又は化学防止剤(chemopreventative agent)である。付加的治療は、当技術分野で知られている化学療法剤の1つ又は複数であってもよい。
免疫細胞療法は、免疫チェックポイント療法のような追加の癌治療に関連して、様々な組み合わせで投与され得る。投与は、同時から数分～数日～数週間の範囲の間隔であってもよい。免疫細胞療法が付加的治療薬とは別に患者に提供される実施態様では、一般に、2つの化合物が依然として患者に有利に組み合わされた効果を及ぼすことができるように、各送達の時間の間に有意な期間が満了しないことを保証する。このような場合、患者に、互いに約12～24時間又は72時間以内、より詳細には、互いに約6～12時間以内に、抗体療法及び抗癌療法を提供し得ることが意図される。いくつかの状況では、それぞれの投与の間に数日(2、3、4、5、6、又は7)から数週間(1、2、3、4、5、6、7、又は8)が経過する治療期間を有意に延長することが望ましい場合がある。
様々な組み合わせを用いることができる。以下の例では、抗原特異的免疫細胞療法、ペプチド、又はTCRは、「A」と表示され、抗癌療法は「B」と表示される:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
本実施態様の任意の化合物又は治療の患者への投与は、薬剤の毒性(存在する場合)を考慮して、このような化合物の投与のための一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの実施態様では、併用療法に起因する毒性をモニタリングするステップがある。
２．化学療法
多種多様な化学療法剤が、本実施態様に従って使用され得る。「化学療法」という用語は癌を治療するための薬物の使用を意味する。「化学療法剤」は、癌の治療において投与される化合物又は組成物を意味するために使用される。これらの薬剤又は薬物が、例えば、それらが細胞周期に影響を及ぼすかどうか、及びどの段階で影響を及ぼすかといった、細胞内でのそれらの活性の様式によって分類される。あるいは薬剤がDNAを直接架橋する能力、DNAに挿入する能力、又は核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体及び有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられ得る。
化学療法剤の例には以下を含む：
thiotepa 及び cyclosphosphamideのようなalkylating agents;
busulfan, improsulfan, 及び piposulfanのようなalkyl sulfonates;
benzodopa, carboquone, meturedopa, 及び uredopaのようなaziridines;
altretamine, triethylenemelamine, trietylenephosphoramide,triethiylenethiophosphoramide,及び trimethylolomelamineをふくむethylenimines 及び methylamelamines;
acetogenins (特にbullatacin 及びbullatacinone);
the synthetic analogue topotecanを含むa camptothecin;
bryostatin; callystatin;CC-1065 (その adozelesin, carzelesin及び bizelesinsyntheticanaloguesを含む);
cryptophycins (特に cryptophycin 1 及び cryptophycin 8);
dolastatin; duocarmycin(thesynthetic analogues, KW-2189 及びCB1-TM1を含む);
eleutherobin; pancratistatin;asarcodictyin;spongistatin;
chlorambucil, chlornaphazine,cholophosphamide,estramustine,ifosfamide,mechlorethamine,mechlorethamine oxidehydrochloride, melphalan, novembichin,phenesterine, prednimustine,trofosfamide, 及び uracilmustardのようなnitrogen mustards; carmustine,chlorozotocin,fotemustine,lomustine,nimustine, 及び ranimnustineのようなnitrosureas;
the enediyne antibiotics (例えば calicheamicin, 特に calicheamicin gammalI 及び calicheamicin omegaI1)のようなantibiotics, ;
dynemicin Aを含むdynemicin; clodronateのようなbisphosphonates; an esperamicin; 同様の neocarzinostatin chromophore 及び 関連 chromoprotein enediyne antiobioticchromophores,aclacinomysins,actinomycin,authrarnycin,azaserine, bleomycins,cactinomycin, carabicin, carminomycin, carzinophilin,chromomycinis,dactinomycin,daunorubicin,detorubicin,6-diazo-5-oxo-L-norleucine,doxorubicin(morpholino-doxorubicin,cyanomorpholino-doxorubicin,2-pyrrolino-doxorubicin 及びdeoxydoxorubicinを含む), epirubicin,esorubicin,idarubicin,marcellomycin,mitomycins（mitomycinC,mycophenolic acid, nogalarnycin,olivomycins,peplomycin,potfiromycin,puromycin, quelamycin,rodorubicin, streptonigrin,streptozocin,tubercidin,ubenimex, zinostatin, 及びzorubicinのような）;
methotrexate 及び 5-fluorouracil (5-FU)のようなanti-metabolites;
denopterin, pteropterin, 及び trimetrexateのようなfolic acid analogues;
fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, 及び thioguanineのようなpurine analogs;
ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, carmofur,cytarabine, dideoxyuridine,doxifluridine,enocitabine,及びfloxuridineのようなpyrimidineanalogs;
calusterone, dromostanolone propionate, epitiostanol, mepitiostane, 及び testolactoneのようなandrogens;
mitotane 及び trilostaneのようなanti-adrenals;
frolinic acidのようなfolic acidreplenisher; aceglatone;
aldophosphamide glycoside; aminolevulinicacid;eniluracil;amsacrine;bestrabucil;bisantrene;edatraxate;defofamine;demecolcine; diaziquone; elformithine;elliptinium acetate; an epothilone; etoglucid;galliumnitrate; hydroxyurea; lentinan; lonidainine;
maytansine 及び ansamitocinsのようなmaytansinoids;
mitoguazone; mitoxantrone; mopidanmol; nitraerine; pentostatin; phenamet; pirarubicin;losoxantrone;podophyllinicacid;2-ethylhydrazide; procarbazine; PSKpolysaccharidecomplex;razoxane; rhizoxin; sizofiran; spirogermanium;tenuazonicacid;triaziquone;2,2',2"-trichlorotriethylamine;trichothecenes (特にT-2 toxin, verracurinA, roridinA 及び anguidine);urethan; vindesine;dacarbazine; mannomustine;mitobronitol;mitolactol;pipobroman; gacytosine;arabinoside("Ara-C");cyclophosphamide;taxoids,例えばpaclitaxel 及びdocetaxelgemcitabine;6-thioguanine; mercaptopurine; cisplatin,oxaliplatin, 及び carboplatinのようなplatinumcoordinationcomplexes;vinblastine;platinum; etoposide(VP-16); ifosfamide;mitoxantrone;vincristine;vinorelbine;novantrone; teniposide;edatrexate;daunomycin; aminopterin; xeloda;ibandronate;irinotecan (例えば CPT-11); topoisomeraseinhibitorRFS 2000; difluorometlhylornithine(DMFO);retinoicacidのようなretinoids; capecitabine;carboplatin,procarbazine,plicomycin,gemcitabine, navelbine,farnesyl-protein transferaseinhibitors, transplatinum,及び これらのいずれかの薬学的に許容される塩, 酸,若しくは誘導体。
３．放射線療法
DNA損傷を引き起こし、広く使用されてきた他の因子には、一般にγ線、X線、及び/又は腫瘍細胞への放射性同位元素の指向性デリバリーとして知られるものが含まれる。マイクロ波、陽子ビーム照射(米国特許第5,760,395号及び第4,870,287号)、及びUV照射のような他の形態のDNA損傷因子もまた意図される。これらの因子のすべてが、DNA上、DNAの前駆体上、DNAの複製と修復上、染色体の集合と維持上に広範な損傷に影響を及ぼす可能性が最も高い。X-線についての用量範囲は長時間の(3ないし4週間の)50ないし200レントゲンの日用量、ないし2000ないし6000レントゲンの単一用量の範囲である。放射性同位体についての用量範囲は広く変化し、同位体の半減期、発せられる放射線の強度及びタイプ、及び新形成細胞による取込に依存する。
４．免疫療法
当業者は付加的免疫療法が、実施態様の方法と組み合わせて、又は結合せて使用され得ることを理解する。癌治療の関係では免疫療法剤は、一般には、癌細胞を標的化し、それを破壊するための免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依拠する。リツキシマブ(RITUXAN(登録商標))がそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で、治療のエフェクターとして働くこともあれば、他の細胞を動員して、細胞殺傷に実際に影響を及ぼすこともある。抗体は、又、薬物又は毒素(化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など)に結合され得、そして標的化剤として役立ち得る。別法として、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的に又は間接的に相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であってよい。種々のエフェクター細胞は、細胞傷害性T細胞及びMK細胞を含む。
抗体薬物結合体が、癌治療薬の開発への画期的なアプローチとして登場している。癌は世界の主要な死亡原因の1つである。抗体―薬物結合体(ADC)は、細胞殺傷薬物に共有結合したモノクローナル抗体(MAb)を含む。このアプローチは、その抗原標的に対するMAbの高い特異性と、非常に強力な細胞傷害性薬物とを組み合わせたものであり、その結果、抗原のレベルが濃縮された腫瘍細胞にペイロード(payload)(薬物)を送達する「武装化」MAbが生じる。
薬物の標的送達は、また、正常組織におけるその曝露を最小限にし、毒性の減少及び治療指数の改善をもたらす。2011年にADCETRIS(登録商標)(ブレンツキシマブ・ベドチン)、2013年にKADCYLA(登録商標)(トラスツズマブ・エムタンシン又はT-DM1)の2つのADC治療薬がFDAにより承認されたことで、このアプローチの妥当性が確認された。現在、癌治療のための臨床試験の様々な段階で30以上のADC治療薬候補がある(Lealら、2014)。抗体工学及びリンカー－ペイロード最適化がますます成熟することにつれて、新しいADCの発見及び開発はこのアプローチに適切な新しい標的の同定及び確認、ならびに標的MAbの生成にますます依存している。ADC標的の2つの判定基準は、腫瘍細胞における発現のアップレギュレート/高レベルであり、及び強固な内在化である。
免疫療法の1つの態様において、腫瘍細胞は標的化できる、すなわち、他の細胞の大部分に存在しないいくつかのマーカーを担持しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれも、本実施態様の文脈において標的化に適切であり得る。
一般的な腫瘍マーカーには、CD20、癌胎児性抗原、チロシナーゼ(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、ラミニン受容体、erb B、及びp155が含まれる。免疫療法の代替態様は、抗癌効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。免疫刺激分子は、また、IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFNなどのサイトカイン、MIP-1、MCP-1、IL-8などのケモカイン、FLT3リガンドなどの増殖因子を含みえる。
現在開発中又は使用中の免疫療法の例は、
免疫アジュバント、例えば、Mycobacterium bovis、Plasmodium falciparum、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物(米国特許第5,801,005号及び第5,739,169号と、Hui and Hashimoto, 1998と、Christodoulidesら、1998)；
サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β及びγ、IL-1、GM-CSF、及びTNF(Bukowskiら、1998と、Davidsonら、1998と、Hellstrand et al.,1998)；
遺伝子治療、例えば、TNF、IL-1、IL-2、及びp53(Qinら、1998と、Austin-Ward and Villaseca, 1998と、U. S.Patents 5,830,880及び5,846,945)；及び
モノクローナル抗体、例えば、抗CD20、抗ガングリオシドGM2、及び抗p185(Hollander、2012と、Hanibuchiら、1998と、U. S. Patent 5,824,311)である。
1つ以上の抗癌療法が本明細書中に記載される抗体療法と共に使用され得ることが意図される。
いくつかの実施態様では、免疫療法が免疫チェックポイントインヒビターであってもよい。
免疫チェックポイントは、シグナル(例えば、共刺激分子)をターンアップするか、又はシグナルをターンダウンする。免疫チェックポイント遮断によってターゲティングされ得る阻害免疫チェックポイントには、アデノシンA2A受容体(A2AR)、B7-H3(CD276としても知られる)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4、別名CD152)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、キラー細胞免疫グロブリン(KIR)、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG3)、プログラム死1(PD-1)、T細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン3(TIM-3)及びT細胞活性化のVドメインIgサプレッサー(VISTA)が含まれる。特に、免疫チェックポイントインヒビターは、PD-1アクシス(axis)及び/又はCTLA-4を標的とする
免疫チェックポイントインヒビターは、小分子、リガンド又はレセプターの組換え形態のような薬物であり得るか、又は特に、ヒト抗体のような抗体である(例えば、国際特許公開WO2015-016718);Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012;両方とも参照により本明細書に組み込まれる)。免疫チェックポイントタンパク質又はその類似体の公知のインヒビターが使用され得、特に、抗体のキメラ化形態、ヒト化形態又はヒト形態が使用され得る。当業者が知るように、代替及び/又は同等の名称が本開示において言及される特定の抗体のために使用され得る。そのような代替及び/又は同等の名前は、本開示の文脈において互換可能である。例えば、ラムブロリズマブは、MK-3475及びPembrolizumabの代替名称及び同等名称のもとで既知であることが知られている
いくつかの実施態様では、PD-1結合アンタゴニストが、PD-1のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の局面において、PD-1リガンド結合パートナーは、PDL1及び/又はPDL2である。別の実施態様において、PDL1結合アンタゴニストは、その結合パートナーへのPDL1の結合を阻害する分子である。特定の局面において、PDL1結合パートナーは、PD-1及び/又はB7-1である。別の実施態様において、PDL2結合アンタゴニストは、その結合パートナーへのPDL2の結合を阻害する分子である。特定の態様では、PDL2結合パートナーは、PD-1である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、免疫付着因子、融合タンパク質、又はオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許番号US8735553, US8354509、及びUS8008449に記載され、すべて参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中に提供される方法において使用するための他のPD-1アクシス(axis)アンタゴニストは、米国特許出願公開第2014/0294898号、同第2014/022021号、及び同第2011/0008369号(全て、本明細書中に参考として援用される)に記載されるように、当該分野で公知である。
いくつかの実施態様では、PD-1結合アンタゴニストが、抗PD-1抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体)である。いくつかの実施態様では、抗PD-1抗体がニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びCT-011からなる群から選択される。いくつかの実施態様ではPD-1結合アンタゴニストが、免疫付着因子〔例えば、定常領域(例えば、免疫グロブリン配列のFc領域)に融合されたPDL1又はPDL2の細胞外又はPD-1結合部分を含む免疫付着因子〕である。いくつかの実施態様では、PD-1結合アンタゴニストはAMP224である。
ニボルマブ(Nivolumab)が、MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558、及びOPDIVO(登録商標)としても知られており、WO2006/121168に記載されている抗PD-1抗体である。ペンブロリズマブ(pembrolizumab)は、MK-3475、Merck 3475、lambrolizumab、KEYTRUDA(登録商標)、及びSCH-900475としても知られており、WO2009/114335に記載されている抗PD-1抗体である。CT-011, hBAT又はhBAT-1としても知られているのはWO2009/101611に記載されている抗PD-1抗体である。B7-DCIgとしても知られているAMP-224が、WO2010/027827及びWO2011/066342に記載されているPDL2-Fc融合可溶性受容体である。
本明細書中に提供される方法において標的化され得る別の免疫チェックポイントは、CD152としても知られる細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)である。ヒトCTLA-4の完全なcDNA配列は、Genbank受託番号L15006を有する。CTLA-4が、T細胞の表面上に見出され、抗原提示細胞の表面上のCD80又はCD86に結合した場合に「オフ」スイッチとして作用する。CTLA4は、ヘルパーT細胞の表面に発現し、T細胞に抑制性シグナルを伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。CTLA4は、T細胞補助刺激タンパク質であるCD28と類似しており、両分子とも抗原提示細胞上のCD80及びCD86(それぞれB7-1及びB7-2とも呼ばれる)に結合する。CTLA4は、T細胞に抑制性シグナルを伝達するが、CD28は刺激性シグナルを伝達する。細胞内CTLA4は、制御性T細胞にも認められ、その機能は重要である可能性がある。T細胞受容体とCD28を介したT細胞の活性化は、B7分子の抑制性レセプターであるCTLA-4の発現増加につながる。
いくつかの実施態様では、免疫チェックポイントインヒビターが、抗CTLA-4抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体)、その抗原結合断片、免疫付着因子、融合タンパク質、又はオリゴペプチドである。
本方法での使用に適した抗ヒトCTLA-4抗体(又はそれに由来するVH及び/又はVLドメイン)は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは当技術分野で認識されている抗CTLA-4抗体を使用することができる。例えば、抗CTLA-4抗体は米国特許第8,119,129号、WO01/14424号、WO98/42752号；WO00/37504(CP675,206、トレメリムマブとしても知られる、以前はticilimumab)、米国特許第6,207,156号；Hurwitzら(1998)Proc NatlAcadSciUSA95(17)10067-10071；Camacho et al.(2004)J ClinOncology 22(145):要約番号2505(抗体CP-675,206)；及びMokyrら(1998)CancerRes 58:5301-5304を、本明細書中に開示される方法において使用し得る。これら刊行物の各々の教示は参照により本明細書に組み込まれる。CTLA-4への結合について、これらの当技術分野で認識されている抗体のいずれかと競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化CTLA-4抗体は、WO2001/014424号、WO2000/037504号、及び米国特許第8,017,114号に記載されている。全て参照により本明細書に組み込まれる。
例示的な抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ(10D1、MDX010、MDX101、及びYervoy(登録商標)としても知られる)又はその抗原結合フラグメント及び改変体である(例えば、WO 01/14424を参照のこと)。他の実施態様では、抗体が、イピリムマブの重鎖及び軽鎖CDRs又はVRsを含む。したがって、一実施態様では、抗体が、イピリムマブのVH領域のCDR1、CDR2、及びCDR3ドメイン、ならびにイピリムマブのVL領域のCDR1、CDR2、及びCDR3ドメインを含む。別の実施態様では、抗体が、上述の抗体のようにCTLA-4上の同じエピトープとの結合及び/又は結合について競合する。別の実施態様において、抗体は上記の抗体と少なくとも約90%の可変領域アミノ酸配列同一性を有する(例えば、イピリムマブと少なくとも約90%、95%、又は99%の可変領域同一性)。
CTLA-4を調節するための他の分子には、US5844905, US5885796及びWO1995/001994及びWO1998/042752に記載されているようなCTLA-4リガンド及び受容体が含まれる。これらすべてが、参照により本明細書に組み込まれる。及び、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第US8329867号に記載されるような免疫付着因子も含まれる。
５．手術
がん患者の約60%が予防的、診断的又は病期分類、治癒的、及び緩和的手術を含む何らかの種類の手術を受ける。治癒的手術は、癌性組織の全て又は一部が物理的に除去され、切除され、及び/又は破壊され、本実施態様の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び/又は代替療法などの他の療法と併用され得る切除を含む。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去をいう。手術による治療には腫瘍切除に加えて、レーザー手術、凍結手術、電気外科手術、顕微鏡下手術(モース手術)などがある。
癌性細胞、組織、又は腫瘍の一部若しくは全部を切除すると、体内に空洞が形成され得る。治療は、潅流、直接注射、又は追加の抗癌治療を伴う領域の局所適用によって達成され得る。そのような治療は、例えば、1、2、3、4、5、6、7日毎に、又は1、2、3、4及び5週間毎に、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12ヶ月毎に反復することができる。これらの治療は、同様に、変化させた容量のものとすることができる。
６．その他の薬剤
治療の治療有効性を改善するために、本実施態様の特定の態様と組み合わせて他の薬剤を使用してもよい。これらの付加的薬剤には、細胞表面受容体及びGAP結合のアップレギュレーションに影響する薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着のインヒビター、アポトーシス誘導剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる薬剤、又は他の生物学的薬剤が含まれる。GAP結合数を増加させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させるのであろう。他の実施態様において、細胞増殖抑制剤又は分化剤は、治療の抗過剰増殖効力を改善するために、本実施態様の特定の局面と組み合わせて使用され得る。細胞接着のインヒビターは、本実施態様の効力を改善されえる。細胞接着インヒビターの実施例は、局所接着キナーゼ(FAK)インヒビター及びロバスタチンである。抗体c225のような、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる他の薬剤が治療効力を改善するために、本実施態様の特定の局面と組み合わせて使用され得る。
VI. 製造物品又はキット
抗原特異的免疫細胞、TCR、又は抗原ペプチド(例えば、EGFRペプチド)を含む製造物品又はキットもまた、本発明によって提供される。製造物品又はキットは、個体における癌の進行を処置若しくは遅延させるために、又は癌を有する個体の免疫機能を増強するために、抗原特異的免疫細胞を使用するための説明書を含む、パッケージ挿入物をさらに含み得る。本明細書中に記載される抗原特異的免疫細胞のいずれも、製造物品又はキットに含まれ得る。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、バッグ及びシリンジが挙げられる。容器は、ガラス、プラスチック〔ポリ塩化ビニル又はポリオレフィンなど)、又は金属合金(ステンレス鋼又はハステロイ（hastelloy）など) 〕などの様々な材料から形成することができる。いくつかの実施態様では容器が製剤を保持し、容器上の、又は容器に関連付けられたラベルは使用のための指示を示してもよい。製造物品又はキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、及び使用説明書を伴う添付文書を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。いくつかの実施態様では、製造物品が1つ以上の別の薬剤(例えば、化学療法剤、及び抗腫瘍剤)をさらに含む。1つ以上の薬剤のための適切な容器は、例えば、瓶、バイアル、バッグ及びシリンジを含む。
VII. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい具体例を示すために含める。以下の実施例において開示される手法が本発明の実施において十分に機能することが発明者らによって見いだされた技術を代表しており、そのため、本発明の実践において十分に機能することが当業者には理解されるはずである。しかしながら、当業者であれば、本発明の開示を考慮して、開示されかつ同様の結果を得られる特定の実施例において、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であることは理解できるのであろう。
結果と方法
A. 結果
患者背景、PPV投与、及び効果判定。
既に報告されているのは、広く共有されているEGFR-L858Rの突然変異に対して、CD8+ T細胞の反応に関連するPPVに続いて、多重肺がんの顕著な回帰（regression）を経験したステージIVのNSCLC患者である(Li etal., 2016)。この症例研究に基づき、病期III/IVのNSCLC患者に対するPPVの第Ib相臨床試験を開始し、PPVの安全性と実行可能性を判定した。副次評価項目は、個別化及び共有NeoAgの免疫原性に加えて、潜在的臨床的延命効果を評価することであった(図1A)。24例(腺癌18例、扁平上皮癌6例)の登録に成功し、PPVによる12回の週1回の免疫化とその後のCTスキャンによる効果判定を受けた。PPV開始から3～4ヵ月後にRECIST基準を用いて臨床応答を判定した。所望であれば、患者に12週間を超えてPPVを継続する選択肢を与えた;24人全ての患者の免疫化時間経過を図2に示す。
患者のうち3例(Pts.1、6、及び24)は、12週間の免疫化後に疾患進行後に代替サルベージ療法を受け、試験を中止した。さらに5人の患者はCTに基づく病期分類を完了しなかった:3人の患者(Pts.9、19、及び20)はワクチン接種の12週間の間に疾患進行がなくなり、2人の患者(Pts.13及び15)は著者に伝えられた外部の病院で追跡調査を受けた。患者の治療及び臨床転帰の完全な要約を図1Bに示す。
NSCLC患者24人全員が、手術、放射線療法、及び/又は化学療法を含む複数系統の従来療法に失敗していた。EGFR遺伝子変異を有する腫瘍を担持する患者のうち16人は、以前にEGFRi治療でも進行しており、これらの患者のうち9人は2種類以上の異なるEGFRi治験薬が無効であった。これらの16例には、PPV免疫化と同時にEGFRi治療を中止するか継続するかの選択肢が与えられ、9例はEGFRiの投与を継続することを選択し、7例はEGFRi治療を中止することを選択した。これらの9例の患者以外では、PPVトライアルの他の15例の患者のうち、追跡期間中に他の治療を受けた患者はいなかった。患者は、当初別々のコホート(cohorts:集団)にランダム化されなかったが、以下に示すように、24人の患者を以下の3群に分けた場合、明確な奏効及び生存プロファイルが明らかになった:PPVのみを投与されたEGFR野生型(WT)患者(第1群)、PPVのみを投与されたEGFR変異患者(第2群)、及びEGFRiを同時に投与されたEGFR変異患者(第3群)(図1C;図3)。3つの患者群の臨床的特徴は、ベースライン時に有意差はなかった(図4A)。第2群及び第3群の患者の詳細なEGFRインヒビター履歴を図4Bに示す。
個別ネオアンティゲンワクチン設計。
大規模な全エクソーム塩基配列決定研究により、NSCLCは全てのがん種の中で最も突然変異負荷が高いものの１つであり、個々の患者の腫瘍はしばしば100個以上又は有意に多くの非同義体細胞突然変異(nonsynonymous somatic mutations)を発現していることが実証されている(Rizvaetal、2015;Lawrence et al、2013)。このようなプロフィールに基づいて、流通するHLAクラスIペプチド結合予測アルゴリズムは典型的には単一のマルチエピトープペプチドワクチンに組み込むことができるよりもはるかに多い、何百もの潜在的NeoAgペプチド候補を生成する。
しかし、これらの変異のほとんどは腫瘍サブクローンが発現するが、すべての腫瘍細胞が発現するわけではない「分枝:branch」変異と考えられている。これらの変異も、腫瘍の生存維持に必須なドライバー(driver)変異を構成する可能性は低い(Haoら、2016年)。共有ドライバー変異のターゲティングに焦点を当てるために、針生検した新鮮腫瘍組織のDNAを用いて、既知の癌関連遺伝子508個のパネルで突然変異プロファイリングを行うことを選択した(表4)。ワクチンペプチドは、主に、各患者の個々のHLAクラスI及びクラスIIアロタイプに対する突然変異をコードするNeoAgの最も高い予測結合親和性に基づいて選択した(表5、方法)。各患者を、生理食塩水に溶解した短いNeoAgペプチドと長いNeoAgペプチドとの独特の個別化された混合物で免疫し、2つのプールに分け、反対側の四肢に皮下投与した。イミキモドを、各免疫化の後に局所的に適用して、Toll様受容体(TLR)7を通して共刺激シグナルを提供した(図1A)。
表4. 508癌関連遺伝子パネル。
Figure 2023500567000032
Figure 2023500567000033
登録された患者24人のうち、1腫瘍当たり平均6.1個のコーディング突然変異が検出された(範囲、1～20個)。EGFR変異の患者16例のうち、14例が一般的EGFRドライバー突然変異(L858R点突然変異7例、Exon19欠損7例)を保持し(harbored)、そのうち2例は第1世代EGFRiに対する耐性を付与することが知られているT790M突然変異を伴った。他の2人の追加患者は比較的稀なH773Lの突然変異を保持していた。投与されたワクチンペプチドの数は患者あたり5～14個(平均9.4個)であり、これは主に患者のHLAクラスI(平均6.5ペプチド)又はHLAクラスII(平均2.9ペプチド)に結合すると予測されるNeoAgの数によって決定された。第2群及び第3群の患者には、変異EGFRペプチドをそれぞれ平均4個(短い2.8個及び長1.2個)投与した。免疫化ペプチドの数又は平均予測ペプチド結合親和性は群間で有意に異ならなかった;しかしながら、第2群及び第3群の患者は、全体的により少ない体細胞突然変異を標的とするワクチンを受けた(図1D～1F)。これは、複数のNeoAgペプチドを用いた個々のEGFR変異の意図的な標的化によるものであり、本発明者らの最初の症例試験患者において肺腫瘍退縮を誘導することに成功したアプローチであった(Liら、2016;表5)。
表5:個別化されたneo抗原ペプチド及び予測されたHLA結合親和性。
* NetMHC4.0、NetMHCpan4.0(HLAクラスI)及びNetMHCII2.3(HLAクラスII)によって予測されるペプチド結合親和性
**デルタスコア= WTペプチド親和性マイナス突然変異ペプチド親和性
Figure 2023500567000034
Figure 2023500567000035
Figure 2023500567000036
Figure 2023500567000037
Figure 2023500567000038
Figure 2023500567000039
Figure 2023500567000040
Figure 2023500567000041
Figure 2023500567000042
Figure 2023500567000043
PPV（個別化ペプチドワクチン）はEGFR変異腫瘍を有する複数の患者において臨床応答を誘発した。
全24人の患者の臨床転帰を表6に示し、群転帰を図5A及び5Bならびに表7に要約する。
3例の患者が経験したグレード1の一過性の発疹、疲労及び/又は発熱以外に、治療関連の有害事象は観察されなかった(図5C)。第1群のEGFR-WT患者のうち、4人は12週間のPPV後に病勢安定 (SD)を示し、4人は病勢進行 (PD)を示した。患者2は胸水のクリアランスを経験したが、腫瘍退縮は観察されなかった(図6A及び6B)。対照的に、治療後の生検で生存腫瘍細胞が認められなかったことが確認されたPR2例(Pt. 11及び14)及びCR1例(Pt. 17)の計2群7例中3例で客観的臨床奏効が認められた(図7 A-7D)。さらに、第3群の9人の患者のうちの4人が部分応答(PR)を経験し、4人のさらなる患者がSDとみなされた(図7E及び7F;図5A)。第3群の患者は、EGFRi治療で過去に疾患進行があったにもかかわらず奏効した(図6C)。
表6：24例の個別化ネオアンティゲンワクチン患者の臨床転帰。
F:女性, M:男性、SR:外科的切除、RT:放射線療法、CM:化学療法、EGFRi:EGFRインヒビター、PFS:無増悪生存期間、CR:完全奏効、PR:部分奏効、PD:病勢進行、SD:病勢安定。
Figure 2023500567000044
Figure 2023500567000045
表7-1：患者の臨床応答に関連するEGFRネオアンティゲンワクチンペプチド。
* Li et al., 2016からのPR患者のワクチンに含まれるペプチド。
+Pt.17は完全応答者である。
Figure 2023500567000046
Figure 2023500567000047
表7-2：
患者の臨床応答に関連するEGFRネオアンティゲンワクチンペプチド。
*Li et al., 2016からのPR患者のワクチンに含まれるペプチド。
++2人の患者は、それぞれ列挙したHLAクラスIIアロタイプを発現した。
Figure 2023500567000048
表7-3：患者の臨床応答に関連するEGFRネオアンティゲンワクチンペプチド。
* Li et al., 2016からのPR患者のワクチンに含まれるペプチド。
** T790M有病率は未処置患者ではまれであるが(2%未満)、耐性を発現するEGFRi処置患者では～50%で獲得される。
Figure 2023500567000049
Figure 2023500567000050
表7-4：患者の臨床応答に関連するEGFRネオアンティゲンワクチンペプチド。
*Li et al., 2016からのPR患者のワクチンに含まれるペプチド。
Figure 2023500567000051
注目すべきことに、第3群の患者はいずれも、治験の処置前にEGFRi処置から休薬又は「休薬期間」を設けておらず、このことはNeoAgワクチン接種がこれらの臨床応答において重要な役割を果たしたことを裏付けている。特に、第3群の患者は、第2群の患者と比較して、より長い中央値のOSを経験した(13.8対7.6ヶ月、P=0.038、図1G;図8A及び8B)。臨床的利益(PR/CR又はSD)を経験した患者は、又、有意に延長されたOS及びPFSを示した(図1H;図8C)。
しかしながら、臨床応答も無増悪生存(PFS)も、免疫化ペプチドの数、ペプチド長、予測されるHLA結合親和性、係合したHLA分子の数、ペプチドデルタスコア、又はEGFRi処置履歴に関連しなかった(図1D～1F;図8D及び8D;図9A～9C)。PR/CR患者は、PD患者のワクチンと比較して有意に少ない体細胞突然変異を標的とするワクチン処置を受けた(P=0.014)。これは、反応した患者7例がワクチン中にEGFR NeoAgペプチドを有意に高い割合のものを投与された結果であり(P<0.001、図1F)、EGFR NeoAgワクチン接種が観察された臨床応答と関連していたという考えを裏付けるものであった。単変量分析は胸水の存在及び腫瘍負荷の上昇が患者の生存転帰に悪影響を及ぼす2つの危険因子であることを示した(図10A及び10B);両方とも、NSCLCの既知の危険因子である(Morgenszternら、2012a;Morgenszternら、2012b)。
PPV（個別化ワクチンともいう）は共有するEGFR変異に対してNeoAg特異的T細胞応答を誘導した。
抗腫瘍応答の性質をよりよく理解するために、PPV前又はPPV後に採取した患者末梢血単核細胞(PBMC)のサンプルに対して連続的な免疫モニタリングを実施した(方法を参照のこと)。ワクチン誘導免疫応答は、まず、個々の患者PBMCをその免疫ペプチドのプールで刺激し、ELISAにより特異的インターフェロン-γ(IFN-γ)分泌を測定することによりスクリーニングした(図11A)。このアッセイにおいて、ペプチドプール特異的反応は、評価された20人の患者のうち6人、全て第2群(5人のうち2人)又は第3群(7人のうち4人)から検出された。ペプチドデコンボリューション(deconvolution:翻訳)は、7人の追加のPPV患者において個々のNeoAgペプチド特異的IFN-γ応答を明らかにした(図12A;表5)。これらの結果に基づいて、本発明者らは、PPV特異的IFN-γ応答の幅、強度、及び持続性を説明する免疫応答コンボスコア(ComboScore:2つ以上のスコアの組合せ)(IRC)を計算した(方法;図12Bを参照のこと)。コンボスコアが最も低かった7例(IRC =ゼロ)のうち、5例は第1群の患者であり、 客観的臨床奏効が得られたのは1例(第3群のPt.12)のみであった。対照的に、IRCが最も高かった6例はすべて第2群又は第３群の患者であり、これらの患者のうち5人例はPFS期間中央値よりも長くPFSを経験した臨床的奏効例であった(図12B)。
ELISPOTに基づく免疫モニタリングにより、ワクチン誘発反応が観察された応答患者6例中5例において、EGFR変異がNeoAg特異的T細胞応答の主要標的を構成していることが明らかになった。Pt.11は、HLA-A*0301に限定された変異AQP12A(L28R)NeoAgペプチドに対する中程度のIFN-γ応答を生じたが、HLA-A*0201に限定されたEGFR(H773L)NeoAgワクチンペプチドに対する検出可能な応答を生じなかった(図13)。対照的に、3人の異なる応答HLA-A*1101+患者(Pts.5、8、及び14)は、高度に共有されたEGFR-L858R突然変異を包含する、A*1101限定ペプチドKITDFGRAK(配列番号4)に対して優位の免疫反応性を生じた(図11B)。同様に、CR Pt.17は、HLA-C*1502限定T790M含有ペプチドLTSTVQLIM(配列番号65)に対して強い応答を示した。ELISPOT及びHLA/ペプチドテトラマー染色アッセイは、これらのNeoAgペプチドの両方に対する特異的CD8+ T細胞応答を確認し、両方のアッセイは、免疫化の間、3ヶ月までの間、T細胞頻度の増加を示す(図11C及び11D;図13;図14)。重要なことに、4人の患者からのワクチン誘導T細胞は、野生型EGFRペプチドと変異EGFRペプチドとを機能的に区別することができた(図11E)。
患者22(PR)は、A*0201限定FGFR1(R734W)NeoAgペプチドに対する強力な応答を生成することに加えて、化合物EGFR変異H773L/V774Mを含有する長いDRB1 *0901限定NeoAgペプチド(MASVDNPLMCRLLGICL)(配列番号958)に対するワクチン誘導反応性も生じた。Pts.8及び16は両方とも、L858R突然変異を含む長いHLAクラスII限定EGFR NeoAgペプチド(HVKITDFGRAKLLGAEE)(配列番号826)に対する免疫応答を生じた(図13)。しかしながら、同じ長さのL858Rペプチドをワクチン化した3人の他の患者(5、12、14)は、関連するHLAクラスIIの割当タイプをPt.8及び16と共有していたにもかかわらず、検出可能な抗原特異的な免疫反応を生成しなかった。KITDFGRAKペプチド(配列番号4)で免疫化した4名のHLA-A*1101+患者のうち、Pt.16はこのNeoAgに対する検出可能なCD8+T細胞応答を生じなかった孤立性患者(loan patient)であり、また、臨床的応答(SD)を経験しなかった4名の患者の唯一人であった。まとめると、これらの結果は、複数の異なるEGFR変異が、NSCLC患者における 客観的臨床奏効と関連する、NeoAgワクチン特異的CD4+及びCD8+ T細胞応答の免疫原性標的となりうるという証拠を提供している。
驚くべきことに、KITDFGRAK NeoAgペプチド(配列番号4)は、対応するWTペプチド(20 nM)よりも低い親和性(163nM)でHLA-A*1101に結合すると予想されるが、中程度の親和性のHLAバインダーについての典型的な範囲内に依然として十分に入る(図11F)。対照的に、EGFR-T790M突然変異は、ペプチドC末端アンカーを極性トレオニン残基から疎水性メチオニン残基に変換するので、NeoAg LTSTVQLIMペプチド(配列番号65)のHLA-C*1502への結合はWTペプチドよりも強く有利である(図11F)。HLAペプチド結合選択性のグローバルな分析は、HLAスーパーファミリーレベルでのEGFR NeoAg提示の顕著な歪みを明らかにした:L858R及びExon 19欠失変異体は、共に、全EGFR変異の>80%を含む一方、HLA-A*1101、共有S768I、T790M及びL861Q変異体を含むA3スーパーファミリーメンバーに、主に、結合する指向性の(favoring)塩基性アミノ酸含有量の高いNeoAgを生成し、したがって、より疎水性であり、したがって、HLA-C* 1502を含むA2、B15、B27及びC3スーパーファミリーのメンバーを結合することに指向する(favored)(図11G-11I;小林ら、2016)。対照的に、A1スーパーファミリー、A24スーパーファミリー、B8スーパーファミリー、及びC7スーパーファミリー内のHLAクラスIアロタイプは、ほとんどの共有EGFRNeoAgに結合し、提示するとは予想されない(図15A及び15B)。HLAクラスII分子は、広範なEGFR変異を含むペプチドに結合すると予測され、クラスIIスーパーファミリーは、DP1及びDP3アロタイプを除いて、歪んだ結合優先性を示すとは予測されない(図15C; Sidneyら、2008;Harjantoら、2014; Jensenら、2018)。
PPVは、EGFR NeoAg特異的T細胞の増殖と腫瘍浸潤を促進した。
17名のPPV患者から採取したワクチン接種前後のPBMCから分離したDNAについて、TCR Vβ-CDR3配列決定を行った。各時点についてクローナリティ(clonality:クローン性)スコアを算出したところ、PPV後に、10例でT細胞クローナリティの上昇が認められ、5例でクローナリティの低下、2例で不変であった(平均変化量+13.2%、図16A)。PFSが最も長かった(>9ヵ月)患者5例では、いずれもPPV後にT細胞クローナリティの上昇が認められ、特に患者5及び8で顕著であった(それぞれ69.8%及び95.5%、図16B)。これらの結果は、PPV後のこれらの2人の患者における免疫モニタリングによって検出されたNeoAg特定T細胞の拡大と一致した(図12;図13;図14)。
患者5は、PPV後の客観的臨床応答を経験し、20ヵ月以上経過しても疾患進行が認められなかったことから、この患者におけるNeoAg特異的免疫応答のより長い期間の動態を分析する独自の機会が得られた。A*1101/KITDFGRAK (配列番号4)四量体を用いて、PPVの開始から12ヶ月後に採取したPBMCからEGFR(L858R)特異的CD8+ T細胞を選別した(図16C;図14)。
選別されたNeoAg特異的細胞は、次に単細胞TCRα/β配列決定を受け、そこから52の高信頼性TCRクローンが同定された(Tet+、方法を参照)。また、処置前又はPPV後12カ月時に採取した腫瘍生検では、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のTCR Vβ-CDR3配列決定を実施し、免疫化前後の血液及び腫瘍コンパートメントにおけるCDR3頻度の詳細な比較が可能であった(表7)。図16Dに示されるように、PBMC及びTILプレPPVの両方においてオーバーラップしたCDR3クローンは、NeoAg特異的Tet+クローンを含む、より高い頻度で血液中に存在した(図17A及び17B)。
対照的に、ワクチン接種後のサンプルは、血液とTILの間で重複するCDR3クローン数の、半分しか、示さなかったが、これらのクローンは、TILコンパートメント内に有意に高い頻度で存在していた。重要なことに、NeoAg特定Tet+クローンは、免疫化後のPBMC及びTILコンパートメントの両方において有意な頻度増加を示し、これには、前処理試料において検出されなかった13の新しいT細胞クローンが含まれる(図16D;図17C)。PPV前後のPBMC CDR3配列の比較では、T細胞のサブセット(Tet+クローンを含む)は免疫後に増加したが、他のほとんどのT細胞クローンでは頻度が減少した。対照的に、腫瘍部位では、ほぼ全てのCDR3クローンが、40個のTet+クローンのうち35個を含み、免疫化後に増加した頻度を示した(図16D)。
この分析によって明らかにされた1つの著しい特徴は、PPV後に選別された52のTet+クローンのうち40が、PPV前のPBMC及びTILサンプルですでに高頻度で存在していたことであり、EGFR NeoAg特異的細胞の自然プライミングが、免疫化前に起こっていたことを示唆している。しかしながら、これらのTet+ CDR3クローンの大部分は、患者の臨床応答と関連した12週間のPPV経過にわたってPBMC頻度の有意な増加を示し、IFN-γ免疫モニタリング結果と一致した(図16E;図7E;図11A～11D)。興味深いことに、PPVは、又、処置前PBMCにおいて検出できなかったが、PBMC及び腫瘍部位の両方において数ヶ月後に有意に上昇した頻度を示した、約十のTet+クローンの拡大(expansion)を刺激するように見えた(図16D及び16F;図17B)。そのような誘導Tet+クローンの1つ、Vβ‐N1は、腫瘍部位で頻度が500倍以上増加した。
このTet+クローンからのTCRα/β鎖をレンチウイルスベクターにサブクローニングし、PBMC由来T細胞を形質導入してTCR-N1を発現させた(図16G)。EGFR NeoAg特異的認識は、TCR-N1形質導入T細胞を、HLA-A*1101及び/又はKITDFGRAK(配列番号4)ミニ遺伝子(minigene)を発現するように操作されたA549腫瘍標的細胞と共培養することによって確認した(図16G及び16H)。
まとめると、このデータは、Pt. 5のペプチドワクチン接種が末梢血中のNeoAg特異的CD8+T細胞の有意な拡大を刺激し、最終的に腫瘍部位でのこれらTet+ T細胞の頻度増加につながるという証拠を提供している。Tet+細胞による腫瘍浸潤の増加が、腫瘍へのT細胞輸送の亢進、腫瘍部位でのNeoAg認識に起因するT細胞増殖、又はその両方の過程によって引き起こされたかどうかは依然として不明である。
EGFRiは免疫細胞の浸潤、抗原提示、T細胞の活性化を促進する。
第2群及び第3群の患者は、PPV後に同様の 客観的臨床奏効率を示したが、第3群の患者は有意に延長したOS及びPFSを示した(図8)。なぜ第3群の患者が、より良好な生存転帰を経験したのかをよりよく理解するために、次に、EGFRi処置がワクチン接種と相乗作用する可能性のある機序を評価した。2つの肺癌細胞株、H1975(EGFR変異:L858R+/T790M+)及びH1299(EGFR-WT)を、EGFRi又はDMSOで処理し、細胞上清及び全RNAを、処理後の複数の時点で収集した。予想通り、EGFRi処理H1975細胞は、MYCシグナル伝達、増殖、細胞周期、及びアポトーシスと生存に関連する遺伝子の発現減少に加えて、RNAseq及びウェスタンブロット解析の両方によって確認されたEGFRシグナル伝達の減少を示した(図18A、18C、及び18D;図17D)。
免疫関連遺伝子を調べたところ、EGFRi処置により、チェックポイント遺伝子の同時減少とともに、TRAILシグナル伝達及びHLAクラスI及びII抗原提示に関連する遺伝子の転写が増加した(図18B及び18D;図17E及び17F)。いくつかのケモカイン及びサイトカインをコードする転写物は、EGFRi処置後に増加又は減少し、そしてLuminex分析は、細胞上清中のタンパク質レベルで、それらの10への変化を確認した(図18B、17E、及び17F)。EGFRi処置は、免疫細胞遊走を促進することが既知のケモカインであるCXCL1、CXCL2、及びCCL2をアップレギュレートしたので、次に、EGFRi又はDMSO処置したH1975細胞上清に応答して末梢血白血球がどのように遊走するかを試験した(図17E及び17F)。ex vivoPBMC由来のCD4+ T細胞及びCD14+単球は、いずれも、EGFRi処理細胞上清に向かう遊走の増加を示した。
予想されたように、それらはそれらの遊走能力をアップレギュレートする前に活性化を必要としたが、CD8+T細胞は、又、同じ細胞上清に応答して、有意に増加した遊走を示した(図18H)。表面HLAクラスI表面発現も、また、EGFRi処置後にH1975細胞で増加したが、H1299細胞では増加せず、その結果、EGFRi処置H1975腫瘍細胞の認識後により多くのIFN-γを産生する抗原特異的CD8+ T細胞が生じた(図18I及び18J;図17G)。これらの結果は、EGFRiが、腫瘍部位における免疫細胞浸潤及び抗原提示を促進し、したがって、抗腫瘍免疫応答を増大させ得るという概念を支持する(Wantanabeら、2019; Imら、2016)。
第3群の患者の腫瘍サンプルが、同様の遺伝子シグネチャーを示したかどうかを判定するために、PPV患者の小サブセットからの腫瘍生検でRNAseq解析を実施した。分析した腫瘍標本は、EGFRi処置を受けていない患者から採取したもの2例(第2群Pts.16及び24)、EGFRi処置を受けている患者から採取したもの2例(第3群Pts.12及び23)であった。PPV前に得られたPt.24標本を除いて、PPV免疫化の間に生検を採取した。EGFRi処理したPts.12及び23における細胞周期、細胞分裂、及び細胞生存に関する遺伝子発現シグネチャーは、EGFRシグナル伝達及び増殖速度に関する遺伝子シグネチャーと同様に、EGFRi処理したH1975細胞のものとよく相関した(図18A、l8D、及び18E)。
PPV患者腫瘍由来の免疫関連遺伝子シグネチャーは、アップレギュレートされた抗原提示とのいくらかの一致を含む、H1975シグネチャーとの部分的な重複を示し、これはPR患者12において最も顕著であった。CCL2及びIL1RNを除いて、ほとんどのケモカイン及びサイトカインの特徴は、ほとんど一致せず、浸潤している正常な免疫細胞及び間質細胞に由来するRNAを含む腫瘍標本の結果である可能性が高い。腫瘍標本の免疫細胞含有量を個別に補完するために、腫瘍RNAseqデータを、免疫細胞型特異的遺伝子を参照して、分析した。図18Kに示すように、2例のEGFRi投与患者由来の腫瘍は、EGFRiを投与していない患者2例と比較して、M2マクロファージ及びB細胞のレベルの上昇、ならびに好中球浸潤の減少を含んでいた。
Pt. 23からのon-EGFRi腫瘍生検は、樹状細胞のレベル上昇を示す唯一の試料であり、CD4+T細胞及びNK細胞浸潤の増加とも関連していた(図18L)。注目すべきことに、腫瘍浸潤性CD8+ T細胞は、Pt.24からのプレPPV腫瘍試料と比較して、PPV上の全3患者において上昇したレベルで認められた(図18K)。分析した患者試料の数が少なすぎて決定的な結論を下すことはできないが、これらの結果を総合すると、EGFRiは、免疫細胞の浸潤及び抗原提示を促進するために腫瘍微小環境内の遺伝子発現を変化させる能力を有することが示唆される。
まとめると、本発明者らの研究はペプチドワクチン接種及びEGFRi療法の治療的相乗作用を説明するための以下のモデルを支持する(図18M): PPV投与が循環中のNeoAg特異的T細胞の増殖を刺激し、一方、EGFRiは、腫瘍部位での増強された抗原提示及びケモカイン分泌を促進する。ケモカインの増加は、次に、活性化T細胞を含む免疫細胞の腫瘍への輸送を増大させ、そこでは、T細胞による同族腫瘍抗原の認識が腫瘍細胞破壊及びIFN-γの産生を刺激する(Venugopalanら、2016年)。
IFN-γは抗原提示及びケモカイン産生を強くアップレギュレートすることが知られているので(Schoebomら、2007; Schroderら、2004;図17E及び17F)、PPV及びEGFRiの組み合わせは最初の抗腫瘍T細胞応答を刺激し得、これは続いて、腫瘍部位で「フィードフォワード(feed-forward」ループ(loop)を開始して、抗腫瘍免疫応答を維持する(図18M)。このような持続的な免疫応答は、患者5で観察された誘導されたNeoAg特異的T細胞クローンの長期拡大に加えて、第3群のPPV患者で観察された延長されたPFSの説明となるのであろう。
考察.
これは、共有NeoAgに対するペプチドワクチン接種が、複数の癌患者において客観的な臨床的退縮を誘導できることを示す最初の報告であると考えられる。HLAの多様性と個別突然変異の圧倒的な有病率のために、潜在的に共有されているNeoAgペプチドで1人以上の患者を免疫化したことを報告した過去のワクチン研究はない。しかしながら、アジア人NSCLC患者におけるHLA-A*1101及びEGFR(L858R)突然変異の両方の比較的高い有病率は我々のEGFR変異患者の-15%がこの組み合わせ表現型を共有することを予測した(Kobayashiら、2016; Gonzalez-Galarzaら、2015)。
これは、A*1101限定KITDFGRAKペプチド(配列番号4)(Liら、2016)を含む、EGFR NeoAgペプチドを共通に含有するワクチンで、5人のこのような患者(この研究では4人)を免疫化する独特の機会を提供した。注目すべきことに、5人の患者のうち4人は、NeoAgワクチン接種の12週間以内に腫瘍退縮を経験し、4人全ての患者は、臨床応答の時間中に有意に増加したか又は優性のKITDFGRAK(配列番号4)特異的CD8+ T細胞反応性を実証した(Liら、2016)。複数のA*1101/EGFR(L858R)患者が、共有されたNeoAgペプチドによる免疫化に対して、臨床的に反応したことを示すことにより、本研究は、がんワクチン研究における重要な最初の実証的概念を提供する。
我々の研究は、又、少なくとも2つの他のEGFR変異が、NSCLCの患者において免疫源となりうることを明らかにした。2つの追加的な臨床応答は、それぞれH773L/V774M又はT790Mの突然変異に対する優勢なワクチン誘発のco4+又はcos+ Tセルの反応に関連している(図12A)。T790Mは、原発性NSCLCにおいて低い有病率を有するが、第一選択EGFRi治療に対する耐性メカニズムとして頻繁に発症する(Kobayashiら、2005; Xuら、2017; El Nadiら、2018)。T790M含有LTSTVQLIMペプチド(配列番号65)は、本発明者らの研究における唯一の完全応答者(Pt.17)におけるCD8+T細胞の優性なNeoAg標的であり、したがって、HLA-C*1502を発現する世界中の患者の～7%についての別の有望な潜在的共有標的を構成する。
反応した患者でも、又、非EGFR NeoAg特異的免疫応答が検出され、Pt. 11でのAQP12A(L28R)、Pt. 22でのFGFR1(R734)に対するCD8+ T細胞応答が最も顕著であった。われわれの試験は、EGFR NeoAgの免疫原性を、他の変異遺伝子由来のものと直接比較するようにはデザインされていなかったが、第1群の患者と第2群及び第3群の患者の、患者間のIRCスコアの不一致から明らかなように(図12B)、免疫反応性の優勢は変異EGFR標的に焦点が当てられていることが観察された。EGFR由来NeoAgが、本質的に他の変異タンパク質に由来するものよりも免疫原性が高いと疑う理由はないため、この所見の説明は以下でさらに考察するように、第2/3群の患者によるEGFRiの使用に関連している可能性がある。
また、いくつかの無反応患者は、1DH2, MAP2K4, PIK3CA,TP53,及びEGFR(746_750del)から由来する変異NeoAgsに対してを含む、PPV誘発T細胞反応性を生み出した。本発明者らは、これらの患者における臨床応答の欠如が、機能不全抗原プロセシング、免疫編集、HLA喪失、又はネオアンティゲンプロモーター過剰メチル化を含む、任意の数の潜在的理由のために、患者腫瘍によるNeoAg提示の欠如を反映し得ると仮定する(McGranahanら、2017;Bedognettiら、2019; Rosenthalら、2019)。
ペプチドベースの癌ワクチン研究は、免疫化後の臨床応答を報告することは稀であるため、著者らのワクチン接種アプローチの独特な特徴を考察する価値がある。CD4+及びCD8+ T細胞性免疫の両方を活性化するために、同一の標的NeoAgに対する複数のペプチド(最大6個)を含むことが多い、長いNeoAgペプチドと短いNeoAgペプチドの混合物で、患者を免疫することを選択した(表5)。ペプチドを可溶化し、生理食塩水中に投与して、任意の阻害性の長期抗原デポー(depot:保存)効果を回避した；生理食塩水可溶化ペプチドの典型的に短い半減期を補うために、ワクチン接種を毎週投与した(Liら、2016; Overwijkら、2015)。
508の癌関連遺伝子のパネルにおいてコーリング(calling)する突然変異に焦点を当てると、潜在的ドライバー遺伝子は、PPVデザインを大幅に簡略化したが、患者ごとに同定される可能性のあるNeoAg標的の数も制限した。このことは我々の研究の重大な限界である。しかしながら、このより焦点を絞ったアプローチにより、EGFR変異を共有NeoAgとして同定することが可能となり、有望な治療的可能性があった。ワクチンアジュバントとして、局所抗原提示細胞を活性化するのに適度に有効であることが知られているTLR7アゴニストである、局所適用イミキモドクリーム(Imiquimod Cream)を用いた。
観察されたNeoAg特異的T細胞応答の幅、大きさ、タイミングに基づいて、我々の免疫化アプローチは、患者において、以前に自然にプライミングされていたT細胞応答のブーストに最も有効である可能性が高いと解釈され、一方で、新たなT細胞応答のプライミングに対する有効性は限られている。より強力で有望なワクチンアジュバント(例えば、ポリI:C、抗CD40、又はSTINGアゴニスト)を将来のペプチドワクチン製剤に組み込むことは、新たなT細胞プライミングの欠如に対処するのに役立ち得る。それにもかかわらず、既存の免疫応答のPPV媒介活性化は我々の研究において複数の臨床応答の誘導に有効であった。この知見がNSCLC患者の将来のワクチンデザインの指針となる、NeoAg免疫反応性プレスクリーニングを強く支持するものである(Malekzadehら、2019年)。
EGFRi療法は、PPVに対する臨床応答速度にもPPV誘発免疫応答の大きさにも影響を与えないが、単独療法としての以前の障害にもかかわらず、患者のOS及びPFSに驚くほどプラスの影響を与えた(図1G;図5B;図6C;図8A及び8B)。著者らの機械論的研究は、EGFRiの免疫調節作用が、癌ワクチンの有効性を増強するだけでなく、チェックポイント遮断又は遺伝子操作T細胞療法などの他のT細胞ベースの免疫療法を改善する可能性を有することを示唆する。
しかしながら、これらの概念はそれらの有効性及び有用性を確認するために、将来の研究において厳密に試験される必要がある。我々の研究のより注目すべき所見の1つは、PPV奏効例7例全例にEGFR変異を含む腫瘍が認められたのに対し、EGFR-WT腫瘍を担持する患者8例ではPPVが奏効した患者はいなかったことであった。上記の既存の免疫応答に鑑みて、本発明者らは、ファーストライン(fast-line)EGFRi処置が、最初に「免疫原性」腫瘍細胞死を誘導し、NeoAg特異的T細胞の自然交差プライミングをもたらし得(Polら、2015; Goodridgeら、2013)、これは、続いてPPV免疫化で追加免疫されると推測する。
EGFR NeoAg特異的T細胞プライミングが、他の腫瘍関連NeoAgよりも好まれるかどうかは未だ明らかにされていない。しかし、EGFRi薬物は、変異EGFR標的タンパク質に不可逆的に結合することが知られており、APCと腫瘍細胞の両方によるプロセシングとその後のNeoAg提示におそらく影響を及ぼす可能性がある(Yamaokaら、2017年)。NeoAg特異的免疫応答のプライミングにおけるEGFRi療法の正確な役割を明らかにするためには、今後の研究が必要である。いくつかの応答患者が、また、観察された臨床応答に寄与した可能性のある個別（private)NeoAgに対する特異的免疫応答も発生させたことに注意することが重要である(図12)。
個別化(personalized)NeoAg同定への多くの重大な課題はまだ取り組まれていないが、これらの結果は、共有NeoAgが複数の癌患者において免疫反応及び臨床応答を誘導できる治療ワクチン標的を構成し得るという最初の証拠を提供する。HLA-A*1101及びL858R突然変異の有病率に基づいて、KITDFGRAK NeoAgペプチド(配列番号4)は、アジア人の8.4%まで及び北米NSCLC患者の1.2%までによって提示されると推定され、癌において最も広く共有されているNeoAgの1つとなっている(Kobayashiら、2016; Gonzalez-Galarzaら、2015; Wirth及びKuhnel、2017; Lu及びRobbins、2016)。
他の複数のEGFR変異が、特定のHLAハプロタイプを発現する患者に対しても免疫原性を示す可能性があること、及び最も多くみられるEGFR変異とクラスIアロタイプのHLA-A3スーパーファミリーとの間に自然な抗原提示「相乗作用synergy」があることが実証されており、今後のワクチン開発及び患者選択に重要な実用的意味をもつ知見である。また、腫瘍量及び胸水はいずれもPPV患者の全生存期間の悪化と関連していた(図10A及び10B)ことから、おそらくEGFRi耐性発現前であっても、早期NSCLC患者への免疫付与はより良好な臨床転帰と関連している可能性があることに留意することも重要である。今回のフェーズ1b試験の結果は有望性が高いもの、大規模な無作為化ワクチン試験との関連で再現し検証する必要がある。しかし、提示されたデータは、これらの試験を開始する説得力のある理論的根拠を提供するものである。
B. 方法
データ報告。
患者試料数を予め決定するために統計的方法は使用されなかった。この研究はランダム化されておらず、一部の研究者は、実験及びアウトカム評価の際に盲検化されなかった。
臨床試験のデザインと処置。
2016年11月から2018年12月の間に、中国の天津ベイシェン病院で単一群試験が実施された。試験プロトコールは、1975年ヘルシンキ宣言の倫理指針に準拠し、国際的に認知されたChiCTR及び天神北鶏病院倫理委員会(Chinese Clinical Trial Registry(ChiCTR)No.:ChiCTR-IIR-16009867)の承認を得た。本試験の主要評価項目は、安全性及び忍容性、個別化アプローチの実現可能性、副次評価項目は抗腫瘍免疫反応性、臨床応答及び潜在的延命効果とした。すべての患者は、本試験に登録する前に書面によるインフォームド・コンセントを提出した。
患者の適格性。
ステージIII～IVのNSCLC患者24例(腺癌18例、扁平上皮癌6例)を、個別化ネオアンティゲンペプチドワクチン(PPV)の本臨床試験に登録し、免疫化に成功した。24例の試験対象患者は、以下の選択基準に従って選択した。18歳以上の成人患者NCCN腫瘍学診療ガイドライン第3.2016版、非小細胞肺癌及び第8版肺癌病期分類に従ってNSCLC病期III/IV期の全患者を分類した。NSCLC診断は、生検及び病理学的評価によって確認された。手術、化学療法、放射線療法及び/又はEGFRインヒビター(EGFRi)療法を含む従来の治療が失敗した後に再発し、積極的な治療を受けていない患者は、良好又は中等度のEastern Cooperative Oncology Group(ECOG)履行(performance)状態(PS≦3)を示した。患者は他の同時免疫療法を受けていなかった。処置前の生検試料が入手でき、少なくとも1つの遺伝子変異を示した。患者の余命は3か月を超えていた。
以下の患者は除外した:妊娠中又は授乳中、既知又は疑いのある自己免疫疾患、その他の免疫系疾患、転移性NSCLCの治療のための全身性細胞毒性化学療法又は試験薬を個別化ワクチン(EGFRiは含まない)の用量投与前4週間以内に受けた患者、個別化ワクチンの最初の投与前4週間以内に他の治験薬を含む治験に参加した患者、肝機能障害又は腎機能障害、重度の心疾患、凝固機能障害又は造血機能障害を有する患者、全身治療を必要とする活動性感染症を有する患者、進行中又は過去5年以内に処置を受けたその他の悪性腫瘍を担持する患者。試験には投与前の腫瘍生検が必要であり、投与後の生検は任意であり、付加患者の追加の同意が必要であった。研究患者の臨床特性を、図4Aに示し、16人のEGFR変異患者のEGFRi処置歴を図4Bに示す。
個別化ネオアンティゲンワクチンの作製。
体細胞突然変異解析：
患者の腫瘍標本は、肺又はリンパ節の腫瘍部位の細針生検により採取した(表7)。個々の患者からの腫瘍生検は、天津北京病院(中国天神、中国)で標準的な臨床及び病理検査手順と併せて、508遺伝子パネルを用いてDNA配列決定を行った。この遺伝子型決定パネルは、508個の癌関連遺伝子内の、共有された(shared)、腫瘍関連ドライバー突然変異(driver mutation: 発癌や悪性化に関連する遺伝子変異)を検出するように設計された(表4)。腫瘍DNAは、TIANamp Genomic DNA Kit(中国ティアンゲン)の指示書に従って生検試料から抽出し、ハイブリダイゼーションによるエクソンキャプチャーとその後の次世代DNAシークエンシングを用いてプロファイリングしたHiseq X‐10(米国イルミナ)により検出した(中国、天津、HengJia Medical Laboratory)。
体細胞突然変異の呼びかけ(calling)については、患者由来の腫瘍及び対応するPBMC(正常な生殖細胞系DNAの供給源として)の次世代シークエンシングデータの解析が、単一アミノ酸ミスセンス突然変異及び小さな挿入/欠失(インデル)につながる単一、ジ若しくはトリヌクレオチド変異を含む、特異的コーディング配列突然変異を同定のために使われた。Illuminaソフトウェアからの出力は、Broad Picard Pipelineによって処理され、良く較正された品質スコアを有するアライン化読取り(aligned reds)〔bwaバージョン0.7.8、NCBI Human Reference Genome Build hg19にアライン化(aligned to) 〕を含むBAMファイルを得た。
体細胞単一塩基変異(sSNV)、体細胞小挿入及び欠失は、すべて、Varscan2(バージョン2.4.3)を用いて検出した。Integrative Genomics Viewer (バージョン2.4.1)を使用して、すべてのインデル（indels:挿入欠失）を手動でレビューした。すべての体細胞突然変異、挿入及び欠失は、Annovar(バージョン2013-07-2811:32:41)を用いて注釈付けした（annotated）。ネオアンティゲンペプチドは、0.04以上の変異対立遺伝子頻度(a mutated variant allele frequency)で検出された非同義の体細胞突然変異(nonsynonymous somatic mutations)に基づいて選択された。
HLAタイピング：
登録（enrollment）時に、高分解能HLAタイピングのために末梢血を採取した。ヒト白血球抗原(HLA)遺伝子座を、DNA増幅ステップ(CapitalBio, China)を用いたポリメラーゼ連鎖反応‐配列‐ベースタイピング(PCR‐SBT)法によりタイピングした。簡潔には、Magic Beads DNA Extraction Kit(TANBead,China)の指示書に従って、患者の末梢血からDNAを抽出した。HLAクラスI遺伝子(HLA-A、B、及びC)のエクソン2及び3、ならびにHLAクラスII α及びβ遺伝子(HLA-DQ及びDR)のエクソン2を増幅及び精製し、PCR産物をABI 3730XL DNA Analyzer(Applied Biosystems, USA)で配列決定した。配列クロマトグラムを、ATF1.5ソフトウェア(Conexio Genomics, Australia)を使用して分析した。
ワクチンペプチド選択:
肺癌に典型的にみられる体細胞突然変異の数が多いこと、及び大部分が個別な「パッセンジャー」突然変異を構成するという事実のために、われわれは、508個の腫瘍関連遺伝子のフォーカス化パネルから検出された体細胞突然変異を標的とすることを選択した。このアプローチの理論的根拠は、次の2つの組み合わせであった：(1)腫瘍の表現型に必須である可能性が高く、したがって免疫編集によって失われにくい突然変異のターゲティングを可能にするであろう、(2)複数のNSCLC患者に潜在的に有益となりうる共通のネオアンティゲン標的を同定する機会を増やすであろう。
508遺伝子パネルによって検出された非同義のコード突然変異をインシリコで翻訳し、得られたネオアンティゲン配列を、HLA-ペプチド予測アルゴリズムNetMHC4.0、NetMHCpan3.0、NetMHCpan4.0、NetMHCII2.2及びNetMHCII2.3(Andrettaら、2015; Jensenら、2018)に従って、患者HLAクラスI及びクラスII分子に対する予測結合親和性について評価した。免疫化ネオアンティゲンペプチドは、主に、患者のHLAクラスI及びクラスII分子に対する最高の予測結合親和性に基づいて選択した。しかしながら、ワクチンは、又、関与する異なるHLA分子の数を最大にし、可能な場合にはHLA内ペプチド競合を最小にするように設計された。
免疫化ペプチドの合成性又は溶解性に負の影響を及ぼし得る特定の生化学的特性(例えば、高い疎水性又は複数のシステインの存在)もまた、考慮された。さらに、短/長のワクチンペプチドを約2:1の比率で含むか、体細胞突然変異プロファイリング及びHLA/ペプチド結合予測と同程度に近いものを含むように、個々の患者ワクチンを設計することを目的とした。各患者について、12までの独立した突然変異から生じる9～17アミノ酸長の14までのペプチドを選択し、優先順位をつけた。平均6.5個の短いHLAクラスI限定ペプチド及び2.9個の長さのHLAクラスII限定ペプチドを含む、患者当たり平均9.4個のネオアンティゲンペプチドをペプチド合成のために選択した(表5)。
患者の免疫化：
標準的な固相合成ペプチド化学を用いて免疫ペプチドを合成し、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて>98%まで精製し、無菌性及びエンドトキシンの存在について試験して、Good Manufacturing Practice〔HengJia Neoantigen Biotechnology(Tianjin) Co.,Ltd. 〕と一致する方法論を用いて安全性及び認容性を確保した。表5に示すように、患者当たり5～14個のペプチドを合成し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に個別に可溶化し、2つの別々のペプチドカクテルに混合し、それぞれ2～7個の短いペプチド及び1～3個の長さのペプチドを総容量1mlで含む。
同じHLAアロタイプに結合するペプチドを異なるカクテルに分離して、潜在的抗原競合を減少させた。患者には、各ペプチド200μgを1回の免疫につき投与し、左右の四肢に皮下注射し、週1回、最低12週間投与した。pAPCの同時Toll様受容体(TLR)‐7刺激を提供するために、5%イミキモドを含むアルダラクリームを、ペプチドカクテル投与直後に、ワクチン部位上にワクチンアジュバントとして局所適用した。患者は、希望があれば12週間後も免疫化を継続することが許可され、患者の最善の利益が得られた。図2及び表5に示すように、24人の患者のうち11人は、12週間を超えてワクチン接種を受け続けた。
サンプル収集：
連続的な末梢血単核細胞(PBMC)サンプルを、処置前、ならびにワクチン接種後4、8、及び12週目に採取した。進行期癌患者に対し、1カ月あたり最大15mlの採血が、天津Beichen病院の規定に従い、行われた。治験期間の12週間を超える追加の血液サンプルの採取は任意であり、患者の同意を追加する必要があった。すべて 客観的臨床奏効を経験した患者5、8、17から追加血液サンプルを採取した。
生PBMCを収集し、-80℃で保存した。ワクチン接種後の腫瘍生検の採取は任意であったが、手技の侵襲的な性質、実行可能性の不確かさ、及びほとんどの患者の全般的な消極性のため、この試験では必要とされなかった。さらなるRNA配列決定及び/又はバルクT細胞受容体VB CDR3配列解析のために得られた腫瘍組織は、書面によるインフォームドコンセントを提供した後に、PPV試験患者5、12、16、23及び24から収集した。
腫瘍縮小効果判定基準：
客観的な腫瘍縮小効果の評価は、Response Evaluation Criteria in Solid Tumors(RECIST version 1.1)ガイドラインに従って行った。選択した標的病変を測定するためにコンピュータ断層撮影(CT)及び/又は磁気共鳴画像(MRI)スキャンを利用した。患者には、ベースライン測定のために少なくとも1回の処置前スキャンを、反応評価のためにワクチン接種後3～4ヵ月の時点で別のスキャンを実施することが求められた。可能であれば、ワクチン接種の最初の12週間は月1回、追加の患者スキャンを実施した。
最小サイズ10mm(悪性リンパ節では15mm)の標的病変を、3名の異なる放射線科医が最長径で測定し、臨床評価に用いる3つの独立した測定値の平均を用いた。1臓器あたり最大2個の標的病変を測定し、2個の最大病変を選択し、最大で合計5個の病変を選択した。腫瘍量を、全ての標的病変の直径の合計として計算した(図5B)。
臨床効果は、CR:すべての標的病変の完全消失、PR:標的病変の直径の合計が30%減少した場合と定義される部分奏効、PD:標的病変の直径の合計が最低20%増加した場合又は新たな病変が出現した場合と定義される進行性の疾患、SD:PR又はPDに適格とするには不十分な腫瘍量の変化、又はPDと定義される安定疾患と評価された。臨床効果は初回免疫日から3～4ヶ月後に評価された。
臨床試験の統計計画：
統計解析は主に記述的解析であり、有害事象を経験した患者の数を列挙した。統計学的検定はすべて両側検定とし、αレベルは0.05とした。評価される信頼区間は、0.05の有意水準で構築された。データのさらなる探索的分析を、適切と思われる場合に実施した。
主要評価項目の分析：
治療関連有害事象は、米国国立癌研究所有害事象共通用語規準(バージョン4.0)に従って分類し、グレード分類したものに基づいて解析した。ワクチン治療の最初の12週間、及び12週間を超えての継続ワクチン接種で、その後48時間まで、各ワクチン接種日から安全性評価を実施した。追跡期間が延長した患者については、2ヵ月毎に安全性評価を実施した。ベースライン時(処置前)に認められた疾患関連症状は、ワクチン接種後に悪化しない限り報告されなかった。
副次評価項目の分析：
無増悪生存期間(PFS)及び全生存期間(OS)を含む副次評価項目は、Kaplan-Meier法を用いて集計した。初回ワクチン接種前及び各ワクチン接種後4週間ごとのELISA、ELISPOT及びテトラマー分析を介した免疫応答の測定値を記述的に要約した。登録された対象のPFS及びOSの判定は、それぞれ登録日から疾患進行及び/又は死亡、又は2018年12月31日までから算出した。
サブ群分析：
異なる奏効及び生存プロファイルに基づき、野生型(WT)又は変異型(Mut)EGFR変異状態に基づいて、サブ群ごとに登録患者を解析した。そして、EGFRインヒビターの使用が、継続された、又は免疫化開始前に中止された、場合を解析した。これらの群を、EGFR WT-PPVのみ(第１群)、EGFR Mut-PPVのみ(第2群)及びEGFR Mut-PPV+EGFRi(第3群)として定義した。
酵素免疫測定法(ELISA)及び酵素免疫測定法(ELISPOT)：
免疫化の開始前及びPPV後の異なる時点で収集した末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll密度勾配遠心分離によって単離し、トリパンブルー色素の存在下で計数して、凍結保存前の生存率を評価した。ELISA分析のために、10% FBSを含有するRPMI-1640中の5×105PBMCを、総体積250μlで96ウェルプレートの各ウェルに添加した。PBMCを、ワクチンペプチドプール、個々のワクチンペプチド、又は無関係な対照ペプチド(7.5μg/ml)の存在下で、300IU/mlのインターロイキン(IL-2)と共に、37℃の加湿インキュベーター中、5% CO2で5日間培養した。
ペプチド再刺激の24時間後、細胞上清のIFN-γ濃度を、ヒトIFN-γ ELISAキット(Dakewe, China)を使用して、製造業者の指示書に従って測定した。非ペプチドである対照のバックグラウンドシグナルの1.5倍以上のIFN-γ分泌レベルは、陽性免疫応答であると考えられた。ワクチン誘発性免疫応答の幅、強度、持続性を考慮したImmune Response ComboScores(IRC)を、各患者について以下のように算出した：ComboScore = 全ワクチンペプチドについて、全時点(処置前、4週、8週、12週)での倍数変化の合計>1.5。
ELISpotアッセイのために、2.5×105のPBMCを、96ウェルプレート中の各ウェルについて、150μLの総容量を有して、0.5%FBS含有RPMI-1640中で調製した。Ex vivo PBMCを、最終濃度10μg/mlで、個々のワクチンペプチドを用いて3連で刺激し、プレートを、5% CO2を含む加湿インキュベーター中37℃で36時間インキュベートした。スポット検出は、Human IFN-γ ELISpot PROキット(MABTECH Inc., USA)を用いて実施し、106PBMC当たりに検出されたIFN-γスポットの数に対して正規化した。
テトラマー染色及びフローサイトメトリー統計解析：
選択されたカスタムフィコエレトリン(PE)又はAPC結合HLAペプチド四量体(Baylor College of Medicine, USA; MBL,Japan)を首尾よく生成した(図13A)。PBMCを解凍し、0.5%ウシ胎仔血清(FBS)を含有するRPMI-1640に再懸濁した。100μLのフルオロフォア結合HLA/ペプチド四量体含有PBS-1% BSA (1:50希釈)を、5×105PBMCに添加し、暗所・室温で、20分間インキュベートした。細胞をPBS-1% BSAで洗浄し、FITC又はPE結合抗CD8 mAb(Biolegend, USA, 1:200希釈)で染色し、15分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析(LSRFortessa X-20 Analyzer)のために、400μLのPBS-1%BSAに再懸濁した。
腫瘍RNA配列決定及びバルクT細胞受容体VβCDR3配列決定解析：
患者の同意を得た後、患者12、16、23及び24からワクチン接種後の腫瘍サンプルを採取した。RNA抽出キット(Qiagen, USA)を用いて、患者の腫瘍組織からRNAを単離した。ライブラリーは、NEBNext(登録商標)UltraTM RNA Library Prep Kit(Illumina, USA)を使用して、製造者の指示書に従って調製した。ライブラリーをAMPure XPシステム(Beckman Coulter, Germany)で精製し、試料をIllumina NovaSeqプラットフォーム(Illumina, USA)を用いて配列決定した。
T細胞受容体(TCR)多様性分析のために、DNAサンプルを、DNA抽出キット(Qiagen, USA)を使用して、患者PBMC又は患者5からの処置前及び処置後の腫瘍生検から抽出し、続いて、2ラウンドのPCRベースの増幅を伴うライブラリー構築を行った。CDR3フラグメントを、最初に、各V及びJ遺伝子についての特定のプライマーを使用して増幅し、そして多重化PCR産物の標的フラグメントを、磁気ビーズ(A63882, Beckman, Germany)を使用して精製した。
次に、ユニバーサルプライマーを用いてPCRを行い、QIAquick Gel Purification Kit(Qiagen社、米国)により標的断片200～350bpを検索・精製した。次いで、PCR産物を、Illumina X10プラットフォームを使用して配列決定した。シングルリードCDR3配列を除去し、残りの配列を分析して、以前に記載されているように(Tumehら、2014)、処置前後の患者のTCRVβ IMGTクローン性を評価した。
単一細胞T細胞受容体の配列決定：
患者5のPPV後PBMC由来のHLA-A*1101/KITDFGRAK(配列番号4)テトラマー+CD8+ T細胞を、フローベースの細胞ソーター(BD FACSAriaIII, USA)を用いて選別し、共焦点顕微鏡(LeicaSP8,Germany)によって画像化した。選別されたTet+細胞を、PBS中1mlあたり1×106細胞に調整し、Chromium Single Cell Controller(10XGenomics, USA)にロードして、Single Cell 5'Library及びGel Bead Kit(10X Genomics, USA)を使用して、乳剤中に単一細胞ゲルビーズ(GEM)を生成した。
捕捉された細胞を溶解し、放出されたRNAを逆転写によってバーコード化して、製造業者の指示書に従って、個々のGEM中にバーコード含有cDNAを生成した。V(D)J配列を、保存されたTCR配列を標的とする特異的プライマーを用いたネステッド(nested)PCR増幅によって濃縮した。150bp (PE150)対末端を有するIllumina NovaSeqプラットフォーム上で配列決定を行った。Cellranger VDJを用いて、V(D)J組換え、T細胞の多様性、個々のT細胞ごとの適切なTCRα鎖及びβ鎖配列の対合を解析した。Tet+細胞の単一細胞配列決定の結果、639の異なるTCRα/β対が同定された。
しかしながら、テトラマーベースの細胞選別は、非抗原特異的T細胞によるコンタミネーションを生じ得るので、最小10のＶβCDR3読取りが検出され、51の独特なTCRクローンを生じる、TCRクローンを選択した。PBMC又はTIL試料中に、ほとんど又は全く存在しないことを示したVβ-CDR3配列を有する4つのクローンを分析から排除した。そして7又は8のCDR3読み取りを有する5つのさらなるTCRクローンを、ネオアンティゲン特異的T細胞クローンについて予想されるように、PPVの間のPBMC及び/又はTILにおける、それらの増加する頻度に基づいて含めた。
TCRクローニングと検証：
単一細胞配列決定によって得られたTCR Vα-N1鎖及びVβ-N1鎖の可変領域配列を、操作されたヒト定常領域に融合させて、α鎖及びβ鎖の対合(pairing)を増強した(Cohenら、2007)。これらの修飾Vα及びVβ鎖配列を合成し、EF1aプロモーターに基づくレンチウイルス発現ベクターpCDHに挿入して、レンチウイルスlenti-EF1a-TCR-N1を作成した。健康なドナーPBMCを、リンパ球分離培地(Stem Cell, Canada)を使用して調製した。
Dynabeads(登録商標)Human T-Expander CD3/CD28キット(Thermofisher, USA)を用いてT細胞を単離し、3mlのX-Vivo15無血清培地(Lonza, Switzerland)と混合し、37℃で5% CO2中で48時間培養した。細胞密度を1×106/mLに調整し、パッケージされたレンチウイルスlenti-EF1a-TCR-N1と、5% CO2中37℃で4日間共培養した。TCR-N1 発現及び抗原特異性は、HLA-A*1101/KITDFGRAK(配列番号4)四量体で染色することによって確認した。
IRES配列を介してHLA-A*1101 cDNAに連結されたKITDFGRAKペプチド(配列番号4)をコードするミニ遺伝子を合成し、EF1Aプロモーターを有するレンチウイルスベクターpCDHに挿入して、レンチウイルスlenti-EF1a-KIT-A11を作製した。対照レンチウイルス構築物は、KITDFGRAK(配列番号4)ミニ遺伝子又はHLA-A*1101のいずれかを個々に発現するベクターを含んだ。目的の遺伝子を安定に発現するレンチウイルス形質導入A549肺癌細胞を、プリノマイシンベースの選択を通して選択した。
HLA-A*1101表面発現を、A*1101特異的mAbで染色し確認し、続いてフローサイトメトリー分析をした。操作TCR-N1-T細胞を、親A549、A549-A11、A549-KIT、又はA549-A11.KIT細胞(ウェル当たり2万個の標的細胞)と、エフェクター対標的比、1:1、2.5:1、5:1、及び10:1で、5% CO2中37℃で共培養した。同じPBMCドナー由来の非形質導入、増殖T細胞を対照に使用した。上清を、共培養の24時間後に収集して、ELISAによるIFN-γ分泌のレベルを評価した。
免疫沈降及びウェスタンブロット：
H1975(EGFR-L85R/T790M)及びH1299(EGFR-WT)肺癌細胞株(ATCC、米国)を異なる濃度(0.1、1、2及び5μM)のEGFRi Osimertinib(LC Laboratories、米国)で、異なる時間処理し、EGFRi処理条件を最適化した。細胞を冷PBSで洗浄し、溶解緩衝液(1%TritonX-100, Sigma, USA)及びHalt Protease Inhibitor Cocktail 100X及び0.5μM EDTA 100X(Thermo Scientific, USA)を用いて溶解した。
溶解物を収集し、Bradfordアッセイキット(BioRad、米国)でタンパク質濃度を測定する前に、4℃で30分間、高速で遠心分離した。試料当たり10μLのPierce Protein A/G Ultra Link樹脂(Thermo Scientific社製)を用いてプレクリアリング(preclearing)を行い、4℃で2時間インキュベートした。
免疫沈降は、同量の総タンパク質を使用し、細胞溶解物を、以下の抗体と共に、500:1希釈で、4℃・18時間インキュベートすることによって行った: 抗ホスホ-EGFR(EMD Millipore)、抗EGFR、抗p44/42 MAPK ERK1/2、抗ホスホ-p44/42 MAPK ERK1/2、及び抗GAPDH(Cell Signaling Technology)。
プロテインA/G架橋ビーズを添加し、冷PBSで洗浄する前に4時間インキュベートした。SDS-PAGE勾配(8～16%)ゲル(Invitrogen,USA)を用いて試料を流した。タンパク質をPVDF膜(Thermo Scientific, USA)に移し、ブロットを5%ミルクでブロックした後、特異的抗体と1:1000の濃度で一晩インキュベートした。ブロット(blots)を洗浄し、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギ二次抗体(1:1万)(Jackson Immuno Research, USA)と共にインキュベートした。Super Signal West Pico PLUS Chemiluminescent enhanced horseradish peroxidase substrate (Thermo Scientific,USA)を用いてブロットを展開し、X線フィルムで可視化した。
肺腫瘍細胞株のRNA配列決定：
H1975及びH1299肺癌細胞を、1μMのEGFRi Osimertinib(LC Laboratories, USA)で0時間、12時間、若しくは24時間;又は24時間、1μMのEGFRi Osimertinib(LC Laboratories, USA)+500U/mLの組換えヒトIFNγ(R&D Systems, USA)を培養の最後の12時間添加して、処置された。細胞を溶解し、RNeasy Mini Kit(Qiagen, USA)を用いて、製造者のプロトコールに従って全RNAを調製した。RNAseqは、Avera Institute for Human Genetics(South Dakota, USA)によって以下のように実施した: 総RNAを、2100 Bioanalyzer(Agilent, USA)上で実行したRNA 6000 Nanoチップ上での分解について評価し、ここで、サンプルセットについての平均RNA完全スコア(integrity score)は9.7であった。
配列決定ライブラリーは、ロー試料(low sample)手順に従って、TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit(Illumina, Inc, USA)を用いて調製した。簡単に述べると、リボソームRNA(rRNA)を、全RNAから枯渇させ、残りのRNAを精製し、適切に断片化し、cDNA合成のためにプライミングした。平滑末端cDNAが、第1及び第2鎖合成後に生成された。3'平滑末端のアデニル化に続いて、cDNA断片を富化する前にアダプター連結（adapter ligation）を行った。最終ライブラリーの品質管理は、2100 BioAnalyzer(Agilent,USA)で運転したDNA1000チップ上で断片サイズを評価することによって行った。
平均ライブラリーは、326のインサートbpサイズを生じた。各ライブラリーの濃度を、配列決定の前に、次世代配列決定のためのKAPAライブラリー定量キット(KAPA Biosystems, USA)による定量PCR(qPCR)によって決定した。ライブラリーを、0.1% Tween 20を含む10mMTris-Cl(pH8.5)中で2 nMに標準化し、次いで均一にプールした。プールしたライブラリーを、0.05 M NaOHで変性させ、20pMに希釈した。変性ライブラリーのクラスター生成は、HiSeq PE Cluster Kit v2化学及びフローセルを利用して、製造業者の仕様書(Illumina,Inc,USA)に従って行った。
ライブラリーを、1% PhiXスパイクイン(spike-in)で適切にクラスター化した。合成によるシークエンシング(Sequencing-by-synthesis:SBS)を、v2化学を用いてHiSeq2500上で行い、対になった末端101bpの読み取りを行い、その結果、試料あたり平均5240万の対になった末端読み取りを得た。配列読み取りデータを処理し、Illumina BaseSpace分析ソフトウェア、FASTQ Generation v1.0.0による下流分析のためにFASTQフォーマットに変換した。
RNA配列データ解析:
患者及び細胞株RNAseqデータの品質管理は、FastQC v0.11.5、FastQ Screen v0.11.1、RSeQC v3.0.0、MultiQC v1.6及びBostonGeneプラットフォームの独自のアルゴリズム(Wingettら、2018)を用いて行った。許容可能な品質(良好なphredスコア、読み取り長さに沿った塩基当たりの良好な配列決定内容、コード読み取り>50 M、アダプター内容<15%、<5%微生物/マウス固有ゲノム コンタミネーション)を有する4つの患者試料を、さらなる分析のために選択した。Kalisto v0.42.4を用いて、GENCODE v23転写物に対して、RNAseq読み取りを、擬似整列(pseudo-aligned)させた(Brayら、2016)。[protein_coding,IG_C_gene, IG_D_gene, IG_J_gene, IG_V_gene, TR_C_gene, TR_V_gene, TR_D_gene, TR_J_gene]における転写タイプを有する転写物を選択し、次いで非コードRNA転写物及びヒストン及びミトコンドリア転写物を除去し、20,062のタンパク質コード遺伝子を得た。
遺伝子発現を、100万当たりの転写物(TPM)及び形質転換されたlog2として定量した(Conesaら、2016)。EGFRiで処理した細胞株における遺伝子発現変化を、未処理対照細胞に対して正規化した相対(log)発現〔relative (log) expression〕として示した。患者の腫瘍遺伝子発現は、患者4例のサンプル内で中央値を中心とし、ヒートマップ上に示された対照の中央値に対する遺伝子発現が認められた。PROGENy v1.4.1を用いて、7つの経路活性スコアを計算した(EGFR、MAPK、PI3K、TRAIL、TNFa、NFkB、JAK-STAT; Schubertら、2018)。他の経路シグネチャスコアは、自社のpython実装を使用してssGSEAを使用して計算した。
経路活性は、他に指定されない限り、mSIGdB v6.2(Subramanianら、2005)からダウンロードされた遺伝子シグネチャとして表された:「Cell cycle signature」-HALLMARK_G2M_CHECKPOINT、「Apoptosis signature」-HALLMARK_APOPTOSIS、MYCHALLMARK_MYC_TARGETS_V2、「EMT signature」788-HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION、「IFN-0 signature」HALLMARK_INTERFERON_GAMMA_RESPONSE、「HLA expression」-遺伝子セット(HLA-A、HLA-B、HLA-C。
対照に対する経路スコアの差を、各経路における最大値に対して別々に正規化し、ラインプロット上に表示した。概略的な表現のために、対照点(0時間)から24時間の時点までの経路活性スコア変化の最大絶対偏差を、各経路内で計算した。スキーマ上のパスウェイ着色剤は、最大絶対偏差のパーセントに対応する。quanTIseqアプローチ(Finotello et al., 2018)を用いて、RNAseqデータから細胞デコンボリューション(cell deconvolution)を行った。ヒートマップ、点プロット、線プロット、棒プロットを、pandas v0.23.4、matplotlib v2.1.1及びseaborn v0.9.0 pythonパッケージを使用して作成した(Liangら、2016)。
Luminexアッセイ：
未処理及び1μM EGFRi処理のH1975及びH1299細胞株由来の上清の二重(duplicate)試料を、製造業者の説明書(R&D Systems, USA)に従うカスタムLuminexキットを使用して、CCL2、CXCL1、CXCL2、CXCL8、IP10、IL1RA、IL6、VEGFA、CSF2、及びCSF3タンパク質の存在について分析した。50マイクロリットルの試験上清及び適切な微粒子カクテルを各ウェルに添加し(1:10希釈)、室温でマイクロプレートシェーカー中で2時間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、50μlのビオチン-抗体カクテル(1:10希釈)を添加し、1時間インキュベートし、続いて3回洗浄した。
50μlのストレプトアビジン(1:25希釈)と共に30分間インキュベートした後、プレートを3回洗浄し、微粒子を緩衝液に再懸濁し、プレートを、Luminexプレートリーダーを用いて読み取った。EGFRi誘発変化は、測定されたベースライン(0時間)濃度と比較した増加倍率又は減少倍率として表した。測定された濃度が検出レベル未満に低下した場合には、製造業者による検出の最小閾値を使用した。
T細胞機能アッセイ：
T細胞移動:1μM濃度のEGFRi Osimertinib(LC laboratories, USA)を使用して、H1975細胞を24時間処理した。培地のみを含むDMSOを対照として使用した。次いで、細胞を洗浄し、ImmunoCulut-XF T細胞増殖培地(Stem Cell Technology, Canada)中で24時間インキュベートし、その後、細胞上清を収集し、Millex-GSフィルターを使用して濾過した。健康なドナーPBMC又は増殖した黒色腫CD8+腫瘍浸潤リンパ球(TIL 3311及びTIL3329)を、遊走アッセイを行う約16時間前に解凍した。
H1975細胞上清650μLをトランスウェルプレート(Corning, USA)の底に置き、上部ウェル中の3×105個の健康なドナーPBMCと共に6時間インキュベートした。ウェル底部の遊走細胞を回収し、CD4、CD8、又はCD14(Biolegend)について4℃で30分間染色し、PBSで洗浄し、4% PFAで固定した。正確な細胞数を得るために、50μlの計数ビーズを各試料に添加した。試料をCanto IIフローサイトメーターで流し、FlowJo V10を用いて分析した。
HLAクラスI定量及びT細胞抗原認識：
H1299及びH1975細胞を、1μM EGFRi Osimertinib(LCラボラトリーズ)又はDMSO対照で6時間又は20時間処理した。細胞を回収し、全クラスI(W6/32-APC、Thermo-Fisher、米国)について染色し、洗浄し、4% PFA中で固定した。試料をCanto IIフローサイトメーターで流し、FlowJo V10を用いて分析した。H1975細胞をウェル当たり5万細胞で96ウェルプレートに播種し、EGFRiを使用して、ウェル当たり0、0.1、及び0.3μMの濃度で24時間細胞を処理した。
次いで、H1975細胞を、洗浄の1時間前に、0、10、又は100 nMの同起源の(cognate)HLA-A*0101限定VGLL1ペプチドLSELETPGKY(配列番号978)でパルスした。次いで、VGL1ペプチド抗原特異的CD8+ T細胞を1:1エフェクター/標的細胞比で加え、一夜共培養した。24時間の細胞上清中のIFN-γを、ヒトIFN-γ ELISAキット(Invitrogen, USA)を使用して分析し、プレートを、SpectraMax(登録商標)M5/M5eマルチモードプレートリーダーを使用して読み取った。
統計解析：
全ての統計解析は、GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc., LaJolla, CA)を用いて行った。生存曲線及び生存率はLog-rank(Mantel-Cox)検査を用いて計算し、全生存率は、登録日から2018年12月31日まで、又は死亡時まで測定した。両側スチューデントt検定(two-tailed student’s t test)又はMann-Whitney U検定を用いて、群間の統計的有意性を分析した。0.05以下のP値を、統計的有意性を決定するために使用した閾値とした。
データの可用性：
現在の研究中に生成及び分析された、患者の腫瘍及び細胞株のバルクRNA配列、単一細胞TCR対αβ鎖配列、TCR VβCDR3配列の生データは、NCBI Sequence Read Archive(SRA)(コードSRP188005)を通して入手可能である。(突然変異を発見するための)患者が同定される可能性のあるDNA塩基配列決定データは、登録患者のインフォームドコンセントに含まれておらず、情報を同定しないデータは合理的な要請があれば共有できる。他のすべてのデータは、合理的な要求に応じて、対応する著者から入手可能である。
本明細書に開示され、特許請求される方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく、作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施態様に関して説明してきたが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び方法のステップ又はステップの順序に変形を適用できることは、当業者には明らかであろう。
より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤で本明細書中に記載の薬剤を代用し、同じ又は類似の結果が達成され得ることが理解されるのであろう。当業者に明らかなすべてのそのような同様な置換及び修飾は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念内にあるとみなされる。
引用文献
以下の文献は、それらが、ここに開示される内容への、例示的方法若しくは他の詳細の補足の範囲で、引用により、ここに特異的に挿入される。
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Claims (85)

  1. EGFR由来の少なくとも第1のHLA結合ペプチド及び少なくとも第1のEGFRインヒビターを対象に投与する、EGFR変異癌（EGFR-mutant cancer）を有する対象の処置用薬剤であって、前記HLA結合ペプチドは、対象の癌における変異に一致する、野生型ヒトEGFRと関係ある、変異アミノ酸配列を含む、剤。
  2. EGFR由来のHLA結合ペプチドがHLAクラスI分子に結合する、請求項1に記載の剤。
  3. HLAクラスI結合ペプチドが、長さ8、9、10、11、12若しくは13アミノ酸、又は長さ9、10若しくは11アミノ酸である、請求項2に記載の剤。
  4. EGFR由来のHLA結合ペプチドが、HLAクラスII分子に結合する、請求項1に記載の剤。
  5. HLAクラスII結合ペプチドが、13～30アミノ酸長、又は15～23アミノ酸長である請求項4に記載の剤。
  6. EGFR由来の少なくとも第1及び第2のHLA結合ペプチドを投与することを含む、請求項1に記載の剤であって、前記第1及び第2のHLA結合ペプチドは、それぞれ、対象の癌における突然変異に一致する、野生型ヒトEGFRと関係ある、突然変異アミノ酸配列を含む、剤。
  7. EGFR由来の第1のHLA結合ペプチドが、HLAクラスI分子に結合し、EGFR由来の第2のHLA結合ペプチドが、HLAクラスII分子に結合する、請求項6に記載の剤。
  8. EGFR由来の複数のHLA結合ペプチドを投与することを含む、請求項6に記載の剤であって、前記HLA結合ペプチドは、それぞれ、対象の癌における変異と一致する、野生型ヒトEGFRと関係ある、変異したアミノ酸配列を含む、剤。
  9. 前記複数のHLA結合ペプチドが、HLAクラスI及びHLAクラスII分子の両方に結合するペプチドを含む、請求項8に記載の剤。
  10. 2～30の異なるHLA結合ペプチド、又は5～30の異なるHLA結合ペプチド、を対象に投与することを含む、請求項8又は9に記載の剤。
  11. 対象のHLA遺伝子型(HLA genotype)が決定されている、請求項1～10のいずれか1項に記載の剤。
  12. EGFR由来のHLA結合ペプチドが、対象が担持するHLA型(HLA type)に結合すると予測される、請求項11に記載の剤。
  13. EGFR由来のHLA結合ペプチドが、自動分析プログラムによって、対象が担持するHLA型に結合すると予測される、請求項12に記載の剤。
  14. EGFR変異癌が、野生型EGFRと関係ある、アミノ酸置換、欠失又は挿入を有するEGFRポリペプチドを発現する、請求項1～13のいずれか1項に記載の剤。
  15. EGFR変異癌が、E709K, E709A, E709H, G719A, G719S, G719C,S768I, H773L, T790M, L858R, L861Q, 709_710del>D, 745_749del, 745_750del,746_750del, 746_751del, 746_751del>A, 746_752del>V, 747_750del,747_751del, 747_751del>P, 747_753del, 747_753del>S, 747_753del>Q,747_750del>P, 747_752del, 751_759del>N, 752_759del, 744_745ins>KIPVAI,745_746ins>IPVAIK, 745_746ins>VPVAIK, 745_746ins>TPVAIK,763_764ins>FQEA, 764_765ins>HH, 766_767ins>AI, 768_770dupSVD,769_770ins>ASV, 770_771ins>G, 770_771ins>NPG, 770_771ins>SVD,771_772ins>N, 771_772ins>H, 772_773ins>NP, 772_773ins>PR,773_774ins>H, 773_774ins>PH, 773_774ins>NPH, 773_774ins>AH, 774_775ins>HV,及び 775_776ins>YVMAからなる群より選択される変異、又は、G719A, G719S, G719C, S768I, H773L, T790M, L858R, L861Q,709_710del>D, 746_750del, 746_752del>V, 747_751del, 747_751del>P,747_753del>S, 747_750del>P, 747_752del, 744_745ins>KIPVAI,745_746ins>IPVAIK, 763_764ins>FQEA, 768_770dupSVD, 769_770ins>ASV,770_771ins>SVD, 772_773ins>PR, 773_774ins>H, 773_774ins>PH,773_774ins>NPH, 及び 773_774ins>AHからなる群より選択される変異、又は、L858R, H773L, T790M, E709V, 747_751Del, V774M 及び S768Iからなる群より選択される変異、を含む、請求項1～14のいずれか一項に記載の剤
  16. EGFRインヒビターが、EGFR由来の前記HLA結合ペプチドの前に投与される、請求項1～15のいずれか1項に記載の剤。
  17. EGFRインヒビターが、EGFR由来の前記HLA結合ペプチドの後に、又は、本質的に同時に投与される、請求項1～15のいずれか1項に記載の剤。
  18. 変異EGFR由来のHLA結合ペプチドが、TLRリガンドと組み合わせて投与される、請求項1～17のいずれか1項に記載の剤。
  19. TLRリガンドが、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8若しくはTLR9アゴニスト、又はTLR7アゴニストである、請求項18に記載の剤。
  20. TLRリガンドが、CL075、CL097、CL264、CL307、GS-9620、ポリ(dT)、イミキモド、ガルジキモド、レジキモド(R848)、ロキソリビン、及びssRNAオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるTLR7アゴニストである、請求項19に記載の剤。
  21. TLR7アゴニストが、イミキモドである請求項19又は20に記載の剤。
  22. EGFRインヒビターが、チロシンキナーゼインヒビター及び/又はEGRF結合抗体である請求項1～21のいずれか1項に記載の剤。
  23. 前記EGFRインヒビターが、オシメルチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、マツズマブ、パニツムマブ、AEE788; CI-1033、HKI-272、HKI-357又はEKB-569である請求項1～22のいずれか一項に記載の剤。
  24. 癌が、肺癌である請求項1～23のいずれか1項に記載の剤。
  25. 前記肺癌が、非小細胞肺癌、転移性肺癌、及び/又は肺腺癌から選択される、請求項24に記載の剤。
  26. 癌が、EGFRインヒビター耐性である請求項1～25のいずれか1項に記載の剤。
  27. EGFR由来の少なくとも第1及び第2のHLA結合ペプチドを含む免疫原性組成物であって、前記第1及び第2のHLA結合ペプチドは、それぞれ、ヒトEGFR変異癌における突然変異と一致する、野生型ヒトEGFRに関係する、変異アミノ酸配列を含み、EGFR由来の第1のHLA結合ペプチドは、HLAクラスI分子に結合し、EGFR由来の第2のHLA結合ペプチドは、HLAクラスII分子に結合する、免疫原性組成物。
  28. HLA結合ペプチドが、薬学的に受容可能なキャリア中に処方される、請求項27に記載の組成物。
  29. 前記薬学的に許容される担体が、水性担体、塩溶液、生理食塩水、及び/又は等張生理食塩水である請求項28に記載の組成物。
  30. HLAクラスI結合ペプチドが、8、9、10、11、12若しくは13アミノ酸長、又は9、10又は11アミノ酸長である請求項27～29のいずれか1項に記載の組成物。
  31. HLAクラスII結合ペプチドが、13～30アミノ酸長、又は15～23アミノ酸長である請求項27～30のいずれか1項に記載の組成物。
  32. EGFR由来の複数のHLA結合ペプチドを含み、該HLA結合ペプチドが、それぞれ、ヒトEGFR変異癌におけるEGFR変異と一致する、野生型ヒトEGFRと関係ある(relative to)、突然変異アミノ酸配列を含む、請求項27～31のいずれか1項に記載の組成物。
  33. 対象への、2～30の異なるHLA結合ペプチドを含む、請求項32に記載の組成物。
  34. 少なくとも2つのHLAクラスI結合ペプチド及び少なくとも1つのHLAクラスII結合ペプチドを含む、請求項32又は33に記載の組成物。
  35. 少なくとも1つのHLAクラスI結合ペプチド及び少なくとも2つのHLAクラスII結合ペプチドを含む、請求項32又は33に記載の組成物。
  36. 少なくとも2つのHLAクラスI結合ペプチド及び少なくとも2つのHLAクラスII結合ペプチドを含む、又は、少なくとも3つのHLAクラスI結合ペプチド及び少なくとも3つのHLAクラスII結合ペプチドを含む、請求項33～35のいずれか1項に記載の組成物。
  37. EGFR由来のHLA結合ペプチドが、それぞれ、野生型EGFRに関係ある（relative to）、アミノ酸置換、欠失若しくは挿入、又は野生型EGFRに関係ある、アミノ酸置換を含む、請求項27～36のいずれか1項に記載の組成物。
  38. HLA結合ペプチドが、それぞれ、野生型ヒトEGFRに関係する（relative to）、E709K, E709A, E709H, G719A, G719S, G719C, S768I,H773L, T790M, L858R, L861Q, 709_710del>D, 745_749del, 745_750del,746_750del, 746_751del, 746_751del>A, 746_752del>V, 747_750del,747_751del, 747_751del>P, 747_753del, 747_753del>S, 747_753del>Q,747_750del>P, 747_752del, 751_759del>N, 752_759del, 744_745ins>KIPVAI,745_746ins>IPVAIK, 745_746ins>VPVAIK, 745_746ins>TPVAIK,763_764ins>FQEA, 764_765ins>HH, 766_767ins>AI, 768_770dupSVD,769_770ins>ASV, 770_771ins>G, 770_771ins>NPG, 770_771ins>SVD,771_772ins>N, 771_772ins>H, 772_773ins>NP, 772_773ins>PR,773_774ins>H, 773_774ins>PH, 773_774ins>NPH, 773_774ins>AH, 774_775ins>HV,及び 775_776ins>YVMAからなる群より選択される変異;又は、野生型ヒトEGFRに関係する（relative to）、G719A, G719S, G719C, S768I, H773L, T790M, L858R,L861Q, 709_710del>D, 746_750del, 746_752del>V, 747_751del,747_751del>P, 747_753del>S, 747_750del>P, 747_752del,744_745ins>KIPVAI, 745_746ins>IPVAIK, 763_764ins>FQEA, 768_770dupSVD,769_770ins>ASV, 770_771ins>SVD, 772_773ins>PR, 773_774ins>H,773_774ins>PH, 773_774ins>NPH, 及び773_774ins>AHからなる群より選択される;又は、野生型ヒトEGFRに関係する（relative to）、L858R、H773L、T790M、E709V、747_751Del、V774M及びS768Iからなる群より選択される、請求項27～37のいずれか1項に記載の組成物
  39. EGFRインヒビターをさらに含む、請求項27～38のいずれか1項に記載の組成物。
  40. TLRリガンド及び/又はTLR-7アゴニストをさらに含む、請求項27～39のいずれか1項に記載の組成物。
  41. TLR7アゴニストが、CL075、CL097、CL264、CL307、GS-9620、ポリ(dT)、イミキモド、ガルジキモド、レジキモド(R848)、ロキソリビン若しくはssRNAオリゴヌクレオチド、又はイミキモドである請求項40に記載の組成物。
  42. HLA結合ペプチドが、HLAクラスI及び/又はHLAクラスII分子と複合体である請求項27～41のいずれか1項に記載の組成物。
  43. 抗原提示細胞をさらに含む、請求項27～42のいずれか1項に記載の組成物。
  44. 前記抗原提示細胞が、樹状細胞を含む、請求項43に記載の組成物。
  45. HLA結合ペプチドが、リポソーム、脂質含有ナノ粒子、又は脂質ベースのキャリアに含まれる、請求項27～44のいずれか1項に記載の組成物。
  46. アジュバント成分をさらに含む、請求項27～45のいずれか1項に記載の組成物。
  47. 対象を治療する薬剤であって、有効量の請求項27～46のいずれか1項に記載の組成物を対象に投与することを含み、対象はEGFR変異癌を有し、組成物中のEGFR由来のHLA結合ペプチドは、それぞれ、対象中のEGFR変異癌由来のものと一致する変異を含む、薬剤。
  48. 対象の癌におけるEGFR遺伝子を配列決定することをさらに含む、請求項47に記載の薬剤。
  49. 対象のHLA遺伝子型が決定されている、請求項47又は48に記載の薬剤。
  50. EGFR由来のHLA結合ペプチドが、対象によって担持されるHLAクラスI又はHLAクラスII型に結合すると予測される、請求項49に記載の薬剤。
  51. 組成物に含まれるHLA結合ペプチドが、対象において発現されるHLA型へのHLA結合を予測するアルゴリズムを用いて選択される、請求項49又は50に記載の薬剤。
  52. 組成物に含まれるHLA結合ペプチドが、予測されるHLA親和性及び/若しくは予測されるHLAランキング(predicted HLA ranking)に基づいて選択される、又は、組成物に含まれるペプチドが、予測されるHLA親和性及び予測されるHLAランキングに基づいて選択される、請求項49～51のいずれか1項に記載の薬剤。
  53. 前記アルゴリズムは、NetMHC4.0；NetMHCpan3.0、NetMHCpan4.0、NetMHCII2.2及び/又はNetMHCII2.3から選択される、請求項51に記載の薬剤。
  54. EGFRインヒビターを対象に投与することをさらに含む、請求項47～53のいずれか1項に記載の薬剤。
  55. 前記EGFRインヒビターが、変異EGFR由来の前記HLA結合ペプチドの、前に、投与される、請求項54に記載の薬剤。
  56. 前記EGFRインヒビターが、変異EGFR由来の前記HLA結合ペプチドの、後に、又は、本質的に同時に投与される、請求項54に記載の薬剤。
  57. EGFRインヒビターが、EGFR結合抗体及び/又はチロシンキナーゼインヒビターである請求項54～56のいずれか1項に記載の薬剤。
  58. 前記EGFRインヒビターが、オシメルチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、マツズマブ、パニツムマブ、AEE788; CI-1033、HKI-272、HKI-357又はEKB-569である請求項54～57のいずれか一項に記載の薬剤。
  59. EGFR由来のHLA結合ペプチドが、TLRリガンドと一緒に投与される、請求項47～58のいずれか1項に記載の薬剤。
  60. TLRリガンドが、CL075、CL097、CL264、CL307、GS-9620、ポリ(dT)、イミキモド、ガルジキモド、レジキモド(R848)、ロキソリビン又はssRNAオリゴヌクレオチドから選択されるTLR7アゴニストである請求項59に記載の薬剤。
  61. TLR7アゴニストが、イミキモドである請求項60に記載の薬剤。
  62. 癌が、肺癌である請求項47～61のいずれか1項に記載の薬剤。
  63. 前記肺癌が、非小細胞肺癌、転移性肺癌、及び/又は肺腺癌から選択される、請求項62記載の薬剤。
  64. 癌が、EGFRインヒビター耐性である請求項47～63のいずれか1項に記載の薬剤。
  65. 組成物が、非経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、吸入、又は皮下注射によって投与される、請求項47～64のいずれか1項に記載の薬剤。
  66. 組成物が、少なくとも2、3、4又は5回投与される、請求項47～65のいずれか1項に記載の薬剤。
  67. 投与の間に、2、3、4、5、6又は7日がある、請求項66に記載の薬剤。
  68. さらなる抗癌治療を対象に施すことをさらに含む、請求項47～67のいずれか1項に記載の薬剤。
  69. さらなる抗癌療法が、化学療法、放射線療法、免疫療法、又は手術からなる群から選択される、請求項68に記載の薬剤。
  70. 前記免疫療法が、少なくとも1つの免疫チェックポイントインヒビターを含む、請求項69に記載の薬剤。
  71. 前記免疫チェックポイントインヒビターが、抗PD1又は抗CTLA-4モノクローナル抗体である請求項70に記載の薬剤。
  72. 免疫療法が、免疫チェックポイントインヒビターの組み合わせである請求項69又は70に記載の薬剤。
  73. 以下を含む、EGFR変異癌特異的免疫エフェクター細胞を産生する方法:
    (a)免疫エフェクター細胞のスタート集団（starting population）を得ること(obtaining)；及び
    (b)請求項27に記載の組成物と免疫エフェクター細胞のスタート集団とを接触させ、それによって、EGFR変異癌特異的免疫エフェクター細胞を生成させる。
  74. 接触が、免疫エフェクター細胞のスタート集団を抗原提示細胞(APC)と共培養することとしてさらに定義され、ここで、APCは、それらの表面上に請求項27に記載のHLA結合ペプチドを提示する、請求項73に記載の方法。
  75. APCが、樹状細胞である請求項74に記載の方法。
  76. 免疫エフェクター細胞が、T細胞、末梢血リンパ球、NK細胞、インバリアントNK細胞、NKT細胞である請求項73から75のいずれか一項に記載の方法。
  77. 免疫エフェクター細胞が、間葉系幹細胞(MSC)又は誘導多能性幹(iPS)細胞から分化されている、請求項73から76のいずれか一項に記載の方法。
  78. T細胞が、CD8+ T細胞、CD4+T細胞、又はγδ T細胞である請求項76記載の方法。
  79. T細胞の出発集団が、CD8+ T細胞又はCD4+T細胞である請求項76記載の方法。
  80. T細胞が、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)である請求項76に記載の方法。
  81. 得ること(obtaining)が、末梢血単核細胞(PBMC)から免疫エフェクター細胞のスタート集団を単離することを含む、請求項73～80のいずれか1項に記載の方法。
  82. 請求項73～81のいずれか一項に記載の方法によって製造された、EGFR変異癌特異的免疫エフェクター細胞。
  83. 請求項73～81のいずれか1項に記載の方法によって産生された、EGFR変異癌特異的免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物。
  84. 有効量の請求項82に記載のEGFR変異癌特異的免疫エフェクター細胞又は請求項83に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における癌を治療する薬剤。
  85. 対象における癌の治療のための、有効量の請求項82に記載のEGFR変異癌特異的免疫エフェクター細胞を含む組成物。
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