JP2021517810A - 養子免疫療法における腫瘍自己抗原の使用のための方法および組成物 - Google Patents

養子免疫療法における腫瘍自己抗原の使用のための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、疾患(例えば、がん)処置のために患者に投与することができる新たに同定された腫瘍抗原に結合する受容体を含む改変T細胞またはNK細胞を利用する免疫療法のための方法および組成物を提供する。それをコードするポリヌクレオチドおよびベクターも記載する。

Description

優先権情報
本出願は、2018年3月12日付で出願された米国特許仮出願第62/641,541号の優先権の恩典を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
1. 技術分野
本開示は概して、医学、がん、腫瘍学、免疫学、免疫療法、細胞生物学、および分子生物学の分野に関する。ある種の局面において、本開示の分野は養子免疫療法に関する。より具体的には、腫瘍抗原、ワクチン、キメラ抗原受容体(CAR)操作されたT細胞、操作されたT細胞受容体(TCR)を有するT細胞、操作された抗体、およびそのような方式を用いての治療方法に関する。
2. 背景
免疫系は発がんにおいて二重の役割を果たすと考えられている(Ichim, 2005)。第一に、適切な免疫応答が開始されると、免疫系は、初期の腫瘍開始事象から生じる新生細胞を排除することができる(免疫編集)。対照的に、免疫系は、腫瘍形成を助長する環境の育成に役立ちうる創傷治癒経路のシグナル伝達を開始することができる。ヒト白血球抗原(HLA)タンパク質は、T細胞による監視のために、細胞表面上の全ての有核細胞のプロテオームのスナップショットを提示する。個体は6つの異なるHLAクラスI対立遺伝子(A、BおよびC)を持っているが、これまでに計13,145種のユニークなクラスI対立遺伝子がこれらの高度に多型の遺伝子座で特徴付けられている(Robinson et al., 2018)。これらのHLA対立遺伝子の少なくとも1つによる処理された病原体由来ペプチドの提示は、適応免疫応答の開始における主要なボトルネックである。各HLA対立遺伝子は、利用可能なペプチドの限定されたセットに特異性を制限するペプチド結合溝内の生物物理学的特性に基づいて、免疫システムに異なるペプチドのセットを提示する能力を保持する。ペプチド結合は、これらの位置で数個のアミノ酸に制限されている2つのHLAに面したアンカー残基によって主に決定される(Fritsch et al., 2014)。最近、NetMHCおよびSYFPEITHIのようなアルゴリズムは、特定のHLA対立遺伝子に対するペプチド配列の結合親和性の予測を可能にし、90〜95%の範囲の正の予測値で、75%超の結合剤の正確な予測をもたらす(Andreatta et al., 2016; He et al., 2010; Nielsen et al., 2007)。
提示される新抗原は2つの異なるクラス: TCRに面した残基の変異から生じ、それに応じてペプチド/ HLA複合体の結合親和性を変化させる可能性が低いグループ1、およびペプチドのアンカー残基から生じるため、グループ1抗原の単一残基改変と比較して、免疫系に対しさらに長い新規ポリペプチド配列を提示するグループ2に分けることができる(Fritsch et al., 2014)。HLAタンパク質、提示されたペプチド、およびT細胞間の適切に媒介された相互作用は、外部の病原体と体細胞変異から生じるものの両方から外来遺伝物質を担持する細胞を排除することにより、生物のゲノムの完全性を維持するのに役立つ。腫瘍の免疫編集理論により、前がん細胞増殖を引き起こす初期の病原性事象は、がん細胞がこの選択圧を逃れる能力を進化させない限り、適応免疫系によって排除されうることが予測される(Dunn et al., 2004)。
適応免疫系は既存の腫瘍の排除において重要な役割を果たす可能性を有するものとますます認識されるようになっているが、初期の起因事象中のがん細胞のクリアランスにおけるその役割は、研究するのが難しいままである。ヒトでの免疫抑制はがんの発生率の増加に関連することが十分に実証されているが(Grulich et al., 2007; Gallagher et al., 2010; Penn at al., 1973)、初期の免疫編集事象を定量化すること、および免疫適格性個体での前がん性病変のクリアランスを腫瘍由来新抗原のクリアランスに起因するものとすることは、がん誘発性ウイルスを担持する細胞の排除のような他の機構とは対照的に、難しいままである。
概要
本開示によれば、表1もしくは2または図6Bに記載される抗原に結合する、キメラ抗原受容体(CAR)タンパク質が提供される。CARタンパク質は、
Figure 2021517810
に結合しうる。上記のCARタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。ポリヌクレオチド分子は、真核細胞において活性なプロモーターをさらに含んでもよく、発現ベクターとしてさらに定義されてもよい。
別の態様において、表1もしくは2または図6Bに記載される抗原に結合する、T細胞受容体タンパク質が提供される。T細胞受容体タンパク質は、
Figure 2021517810
に結合しうる。上記のT細胞受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。ポリヌクレオチド分子は、真核細胞において活性なプロモーターをさらに含んでもよく、発現ベクターとしてさらに定義されてもよい。
さらに別の態様において、
Figure 2021517810
のような、表1もしくは2または図6Bの抗原に結合するT細胞受容体をコードするポリヌクレオチド分子を含む操作されたT細胞が提供される。細胞はT細胞またはNK細胞でありうる。細胞はトランスポサーゼをさらに含みうる。
さらなる態様において、上記の1つまたは複数の細胞を含む細胞療法の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要性があるヒト対象においてがんを処置する方法が提供される。本方法は、化学療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、または手術のような、第2のがん療法をヒト対象に投与する段階をさらに含みうる。第2のがん療法は、細胞療法と同時に、または細胞療法の前もしくは後に投与されうる。本方法は同様に、上記に定義の1つまたは複数の細胞の有効量の第2の投与をヒト対象に施す段階をさらに含みうる。
がんは転移性、再発性、または薬剤耐性のがんでありうる。細胞療法は、がん部位の局所、がん部位の領域、または全身に投与されうる。がんは、神経芽細胞腫、肺がん(小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、および肺扁平上皮がんを含む)、腹膜がん、胃(gastric)または胃(stomach)がん(胃腸がんおよび消化管間質がんを含む)、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮がん、唾液腺がん、腎臓(kidney)または腎臓(renal)がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、さまざまなタイプの頭頸部がん、ならびに黒色腫でありうる。
さらなる態様において、(a) 腫瘍サンプルから腫瘍RNAおよび/またはDNAを得る段階; (b) 該RNAおよび/またはDNAを配列決定する段階; (c) 腫瘍遺伝子発現データをTARGET/TCGA vs. GTExの腫瘍特異的差異分析と比較し、それによって腫瘍に特異的であり、正常組織には存在しないことが知られている高度に発現された遺伝子を同定する段階; (d) 該腫瘍サンプルからMHC分子を得る段階; (e) 溶出およびLC/MS/MSプロテオミクスによってMHC結合リガンドを特徴付ける段階; (f) 腫瘍における差次的発現に基づいて同定されたMHCリガンドをフィルタリングする段階; (g) 段階(f)からの残りのリガンドを、正常リガンドームのデータベースにそれらが存在しないことに基づいてフィルタリングする段階; ならびに(h) 経験的に特徴付けられたリガンドを、標準タンパク質にマッピングされないRNA配列決定読み取りと照合することにより非標準腫瘍抗原を同定する段階を含む、非標準腫瘍抗原を同定する方法が提供される。
本方法は、ニューラルネットワーク機械学習を適用して、ペプチド/MHC結合親和性に基づく腫瘍抗原、LC/MS/MSによって判定されるMHC表面上の腫瘍リガンドの量的な存在度、腫瘍タイプとの生物学的関連性、他の腫瘍に及ぶ再発、提示HLA対立遺伝子の集団頻度、および/または複数の腫瘍に及ぶ抗原の再発に優先順位を付ける段階をさらに含みうる。本方法は同様に、(i) 腫瘍抗原/MHCデキストラマーを調製し、健常なHLA適合ドナーから抗原特異的CD8細胞を選別すること; ならびに(j) 選別された抗原特異的T細胞に対し単一細胞配列決定を実施して、ペアのα/βTCR配列を得ることにより、同定された抗原を検証する段階をさらに含みうる。本方法は同様に、α/β TCR配列をマウス定常領域とペアリングし、それに続いてコドン最適化を行う段階、および哺乳動物細胞においてコドン最適化されたコンストラクトを発現させる段階をさらに含みうる。本方法は同様に、哺乳動物細胞を腫瘍細胞と共培養する段階をさらに含みうる。
さらなる態様において、(i)
Figure 2021517810
のような、表1もしくは2または図6Bにおける抗原に選択的に結合する第1の一本鎖抗体; および(ii) TまたはB細胞に結合する第2の一本鎖抗体を含む融合タンパク質が提供される。第2の一本鎖抗体はCD3、T細胞、またはB細胞に結合しうる。融合タンパク質は、標識または治療部分をさらに含みうる。
さらなる態様において、
Figure 2021517810
のような、表1および2または図6Bに記載される1つまたは複数の抗原を含むワクチン組成物が提供される。ワクチン組成物は、アジュバントをさらに含んでもよく、生物学的応答修飾因子をさらに含んでもよく、および/またはケモカインをさらに含んでもよい。1つまたは複数の抗原は、無傷の樹状細胞で送達されうる。上記に定義のワクチン組成物を対象に投与する段階を含む、対象において抗がん免疫応答を生じさせる方法も提供される。
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、開示のある特定の態様を示しているが、これらは単に例示を目的としたものに過ぎず、本開示の趣旨および範囲の範囲内でさまざまな変更および改変が、この詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、かつ本開示のある種の局面をさらに明らかにするために含まれる。本開示は、本明細書において提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の1つまたは複数を参照することによって、よりよく理解されうる。
（図１）腫瘍特異的抗原を同定するために用いられた戦略のワークフロー。8名の患者由来の異種移植片および8つの原発患者腫瘍のMHCクラスI分子を精製し、LC/MS/MSによる特徴付けのためにペプチドを酸溶出して、見つかったMHC抗原を同定した。PHLATアルゴリズムを用いてエクソームデータから予測されたHLAタイピングを使用して、機械学習アルゴリズムNetMCHおよびSYFPEITHIアルゴリズムによりペプチドの結合親和性を予測し、MHCに最もよく結合するものとT細胞応答を誘発する可能性が最も高いものを判定した。次に、本発明者らは、1641個の健常組織を153個の神経芽細胞腫腫瘍に対して比較することにより作製された差次的発現のデータベースで再度これらのペプチドをフィルタリングした。本発明者らは、MHCプロテオミクスにより特徴付けられた190個の健常組織および273個の腫瘍サンプルのデータベースに対して、得られた遺伝子に由来するペプチドを検索した。さらに、本発明者らは、非標準の読み取りを処理してプロテオミクス検索ライブラリを作製し、選択的スプライス部位、挿入欠失、フレームシフトおよびイントロン読み過ごしから作製された抗原を同定した。
（図２)MHCクラスI腫瘍特異的抗原の同定。腫瘍特異的抗原のフィルタリングと、プロテオミクス、RNA-seqおよびリガンドミクスデータベースの組み合わせを用いた同定の概略図。
（図３)試験された腫瘍4/4で観察された再発性腫瘍特異的抗原(PHOX2B)の例。PDX腫瘍における腫瘍 vs 正常組織のFPKM値、および標的ペプチドPHOX2Bの構造。
（図４)(図4A) ペプチド-MHC多量体の概略図。(図4B) HLA適合ドナーから同定された腫瘍抗原特異的CD8 T細胞の希少集団のデキストラマー染色。
（図５)(図5A) W6/32 pan-MHCクラスI抗体によって測定されたNBにおける代表的な表面MHC発現(赤色: 抗体なし; 青色: ベースライン; 橙色 IFN-γ刺激細胞)。(図5B) インフルエンザ(flue) CEF1マトリックスタンパク質抗原を用いた抗原提示実験。HLA-A2神経芽細胞腫細胞をペプチドおよびインフルエンザウイルスで処理し、IL-2放出についてELISAによりアッセイした。(図5C) インフルエンザ抗原特異的T細胞ハイブリドーマとの共インキュベーション後のIL-2放出。
（図６)図6AおよびB。タンパク質領域によるHLA提示スコアから、がんワクチン候補として広く適用可能な非保護ドメインおよびタンパク質領域が明らかにされる。(図6A) 16個の神経芽細胞腫腫瘍においてリガンドミクスにより検出された29個のペプチドをHLA集団提示スコアにマッピングした。経験的に検出されたペプチドは、タンパク質の高スコア領域で高度に濃縮されていた(p=0.000011)。(図6B) タンパク質のスパンにわたるMYCN HLA提示の分析。個々のペプチドの分析(上)から、MYCNに由来する最も高度に提示されたペプチドTVRPKNAAL (SEQ ID NO: 25)が、集団の58.1%に相当する9つのHLA対立遺伝子に提示されることが明らかにされる。リガンドミクスにより検出されたKATEYVHSL (SEQ ID NO: 26)ペプチドは、計10個のHLA対立遺伝子(集団の31.9%)に提示されると予測される。17merの領域(中央)分析から、19個のHLA対立遺伝子(集団の73.1%)に結合すると予測されるペプチドを生じるペプチド
Figure 2021517810
が明らかにされる。33merの領域分析から、集団の85.4%における18個のHLA対立遺伝子に提示される最高のスコアリングペプチド
Figure 2021517810
が明らかにされ、これらが広く適用可能なワクチン接種のためのMYCNタンパク質の有望な領域であることを示唆している。
（図７)NPYは神経芽細胞腫において高度に差次的に発現され、ワクチン接種の有望な標的である。標的(TARGET) (最初の列)における153例の神経芽細胞腫腫瘍からのRNA配列決定データは、臓器(次列)によってコンパイルされたGTExからの1643例の正常組織との比較から、正常組織と比較して神経芽細胞腫におけるNPYの高い発現が明らかである。表2を参照されたい。
例示的な態様の説明
養子T細胞療法を含む免疫療法は注目に値する最近の結果を示しているが、これらの症例のほとんどは、黒色腫および肺がんのような高度に変異した腫瘍内にあった(図1; HLAタイピングボックスから右方向に伸びる線)。さらに、上記で論じられたように、抗原特異的T細胞の発生は特化型の、労働集約的なプロセスのままであり、これらの技法を実施することができる少数の研究室に付託されたままである。標準的な新抗原(SNVを有するタンパク質に由来する抗原)を提示しない腫瘍における腫瘍抗原を同定する方法に対する大いなる必要性が依然として存在する。
神経芽細胞腫は、MHC発現が低く、変異負荷の頻度が低いことを特徴とする腫瘍であり(図1)、したがって養子免疫療法のいっそう「困難な」標的に対しての良好なモデルである。本発明者らは、養子T細胞免疫療法のための特異的かつ強力な標的であると期待する患者特異的腫瘍抗原を同定するための拡張性のある方法を開発した。さらに、本発明者らは、研究および臨床の場面で用いるためにこれらの腫瘍抗原に結合するT細胞受容体(TCR)を同定するための合理化されたワークフローを作製した。
まとめると、本発明者らは、拡張性のある腫瘍抗原同定およびこれらの抗原に特異的なTCRの開発のための新規の方法を開発した。加えて、本発明者らは養子がん免疫療法の有望な標的である神経芽細胞腫特異的抗原、および他の「困難な」腫瘍における抗原を同定した。本開示のこれらのおよびその他の局面は、以下に詳細に示される。
I. 定義
本開示において、単数形の使用は複数形を含み、「1つの(a)」または「1つの(an)」という単語は「少なくとも1つ」を意味し、「または」の使用は、特に明記されていない限り、「および/または」を意味する。さらに、「含む(including)」という用語、ならびに「含む(includes)」および「含まれる(included)」などの他の形態の使用は、限定するものではない。また、「要素」または「成分」のような用語は、特に明記されていない限り、1つの単位を含む要素および成分と、2つ以上の単位を含む要素または成分の両方を包含する。
本明細書において用いられる「約」という用語は、割合または他の数値量と併せて用いられる場合、その割合または他の数値量のプラスまたはマイナス10%を意味する。例えば、「約80%」という用語は、80%プラスまたはマイナス8%を包含する。
本明細書において用いられるセクションの見出しは、組織化の目的のためのみであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、記事、書籍、および条約文を含むがこれらに限定されない、本出願において引用される、全ての文書または文書の一部分は、参照によりその全体が全ての目的のために明示的に本明細書に組み入れられる。組み入れられた文献および類似の資料の1つまたは複数が、本出願におけるその用語の定義と矛盾する形で用語を定義する場合、本出願が優先される。
本明細書において用いられる場合、および特に示されない限り、「疾患」、「障害」、または「状態」という用語は、本明細書において提供される化合物、薬学的組成物、または方法で処置することができる患者または対象の状態または健康状態をいう。いくつかの態様において、疾患は、がん(例えば、膵臓がん、結腸がん、胃がん、肺がん、卵巣がん、骨肉腫、膀胱がん、子宮頸がん、肝臓がん、腎臓がん、皮膚がん(例えば、メルケル細胞がん)、精巣がん、白血病、リンパ腫、頭頸部がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、黒色腫、乳がん、神経芽細胞腫、胃がん)である。
本明細書において用いられる場合、および特に示されない限り、「処置すること」または「処置」という用語は、軽減; 寛解; 症状の軽減、または傷害、病的状態、もしくは状態を患者にとってより耐容可能にすること; 変性もしくは衰退の速度の緩徐化; 変性の最終点をあまり衰弱のないようにすること; 患者の肉体的もしくは精神的健康を改善することのような、任意の客観的または主観的パラメータを含む、傷害、疾患、病的状態、または状態の処置または改善における成功の任意の兆候をいう。症状の処置または改善は、身体検査、神経精神医学的検査、および/または精神医学的評価の結果を含めて、客観的または主観的パラメータに基づくことができる。用語「処置すること」およびその活用語は、傷害、病的状態、状態、または疾患の予防を含む。いくつかの態様において、「処置すること」は、がんの処置をいう。
本明細書において用いられる場合、および特に示されない限り、「予防する」、「予防すること」、および「予防」という用語は、がんの発症を遅延する、および/またはがんの重症度を阻害するもしくは低減する、がんを伴う障害に患者が苦しみ始める前に行われる行動を企図する。
本明細書において用いられる場合、および特に示されない限り、「管理する」、「管理すること」、および「管理」という用語は、がんのような障害の再発の重症度を、そのような疾患、傷害、または状態に既に苦しんでいる患者において予防すること、遅延すること、または低減することを包含する。この用語は、がんを伴う障害の閾値、発達、および/もしくは持続期間を調節すること、またはがんを伴う障害に患者がどのように応答するかを変化させることを包含する。
本明細書において用いられる場合、および特に示されない限り、化合物の「治療的有効量」は、限定されるものではないが、神経機能障害、ニューロン媒介障害、眼障害もしくは心臓障害のような、電気的に活性な細胞を伴う障害の処置または管理において任意の治療的有用性を提供するのに、または限定されるものではないが、神経機能障害、ニューロン媒介障害、眼障害もしくは心臓障害のような、電気的に活性な細胞を伴う障害に関連する1つもしくは複数の症状を遅延するもしくは最小限に抑えるのに十分な量である。化合物の治療的有効量は、限定されるものではないが、神経機能障害、ニューロン媒介障害、眼障害または心臓障害のような、電気的に活性な細胞を伴う障害の処置または管理において治療的有用性を提供する1つまたは複数の他の治療法および/または治療剤との組み合わせでのまたは単独での、化合物の量を意味する。
本明細書において用いられる場合、および特に示されない限り、「有効量」は、化合物が存在しない場合と比べて化合物が規定された目的を達成する(例えばそれが投与される効果を達成する、疾患を処置する、酵素活性を低減する、酵素活性を増大する、シグナル伝達経路を低減する、または疾患もしくは状態の1つもしくは複数の症状を低減する)のに十分な量である。「治療的有効量」の例は、疾患の症状の処置、予防、または低減に寄与するのに十分な量であり、これを「治療的有効量」ということもできる。症状の「低減」(およびこの語句の文法的同意語）は、症状の重症度もしくは頻度の減少、または症状の排除を意味する。正確な量は、処置の目的に依存し、公知の技法を用いて当業者により確認可能であろう(例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkinsを参照のこと)。
本明細書において用いられる場合、および特に示されない限り、化合物の「予防的有効量」は、がんまたはがんに関連する1つもしくは複数の症状の発症を予防または遅延するのに、あるいはその再発を予防または遅延するのに十分な量である。化合物の予防的有効量は、がんのような障害の予防において予防的有用性を提供する1つまたは複数の他の処置および/または予防剤との組み合わせでのまたは単独での、化合物の量を意味する。「予防有効量」という用語は、がんのような障害を予防する、全体的な予防を改善する、または別の予防剤の予防効果を増強する量を包含することができる。「予防的有効量」は、例えば、がんのような障害の発症前に処方することができる。
本明細書において用いられる場合、「患者」または「それを必要とする対象」は、本明細書において提供される組成物または薬学的組成物の投与によって処置できる疾患または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい生体をいう。非限定的な例としては、ヒト、霊長類、伴侶動物(イヌ、ネコなど)、限定されるものではないが、ウシ、ラット、マウス、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカのような他の哺乳動物、および他の非哺乳類動物が挙げられる。いくつかの態様において、患者はヒトである。
本明細書において用いられる場合、「保存的置換」という用語は一般に、タンパク質またはポリペプチドの構造および機能特性を保存するアミノ酸置換をいう。そのような機能的に等価な(保存的置換)ペプチドアミノ酸配列には、サイレント変化をもたらし、したがって機能的に等価な遺伝子産物を産生するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加または置換が含まれるが、これらに限定されることはない。保存的アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および/または両親媒性の性質の類似性に基づいて行われうる。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ; 極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ; 正に帯電した(基本)アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれ; ならびに負に帯電した(酸性)アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
本明細書において用いられる略語は、化学および生物学分野内でのその従来の意味を有する。本明細書において記載される化学構造および式は、化学分野において公知の化学原子価の標準規則にしたがって構築される。
他に定義されない限り、本明細書において用いられる技術的および科学的用語は、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)を参照されたい。本明細書において記載されるものと類似または同等の任意の方法、装置、および材料を本開示の実践において用いることができる。以下の定義は、本明細書において頻繁に使用されるある種の用語の理解を容易にするために提供されており、本開示の範囲を限定することを意味するものではない。
「生体サンプル」または「サンプル」は、対象もしくは患者から得られるまたは対象もしくは患者に由来する材料をいう。生体サンプルには、生検および剖検サンプルのような組織切片、ならびに組織学的目的で採取された凍結切片が含まれる。そのようなサンプルには、体液、例えば血液および血液画分また製剤(例えば、血清、血漿、血小板、赤血球など)、痰、組織、培養細胞(例えば、初代培養物、外植片、および形質転換細胞)、便、尿、滑液、関節組織、滑膜組織、滑膜細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、マクロファージ様滑膜細胞、免疫細胞、造血細胞、線維芽細胞、マクロファージ、T細胞などが含まれる。生体サンプルは、典型的には、哺乳動物、例えば霊長類、例えばチンパンジーもしくはヒト; ウシ; イヌ; ネコ; げっ歯類、例えばモルモット、ラット、マウス; ウサギ; または鳥類; 爬虫類; または魚類のような、真核生物から得られる。
本明細書において用いられる「細胞」は、そのゲノムDNAを保存または複製するのに十分な代謝機能または他の機能を実行する細胞をいう。細胞は、例えば、無傷の膜の存在、特定の色素による染色、子孫を生み出す能力または、配偶子の場合、第2の配偶子と組み合わせて生存可能な子孫を生み出す能力を含む、当技術分野において周知の方法により同定することができる。細胞は原核細胞および真核細胞を含みうる。原核細胞には、細菌が含まれるが、これに限定されることはない。真核細胞には、酵母細胞ならびに植物および動物、例えば哺乳動物、昆虫(例えば、スポドプテラ(Spodoptera))に由来する細胞ならびにヒト細胞が含まれるが、これらに限定されることはない。細胞は、それらが自然に非付着性であるか、または表面に付着しないように、例えばトリプシン処理により、処理されている場合に有用でありうる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体をいうために本明細書において互換的に用いられ、ここで重合体は、アミノ酸からならない部分に任意で結合されてもよい。この用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸重合体に適用され、ならびに天然アミノ酸重合体および非天然アミノ酸重合体に適用される。「融合タンパク質」は、単一の部分として組み換えにより発現される2つまたはそれ以上の別個のタンパク質配列をコードするキメラタンパク質をいう。
「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態のどちらかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの重合体、ならびにそれらの相補体をいう。「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの線状配列をいう。「ヌクレオチド」という用語は、典型的には、ポリヌクレオチドの単一の単位、すなわち単量体をいう。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの改変型であることができる。本明細書において企図されるポリヌクレオチドの例としては、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖RNA (siRNAを含む)、ならびに一本鎖および二本鎖DNAおよびRNAの混合物を有するハイブリッド分子が挙げられる。本明細書において用いられる核酸は同様に、天然に存在する核酸と同じ基本的な化学構造を有する核酸をいう。そのような類似体は、修飾された糖および/または修飾された環置換基を有するが、天然に存在する核酸と同じ基本的な化学構造を保持している。核酸模倣体は、核酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在する核酸と同様に機能する化合物をいう。そのような類似体の例としては、非限定的に、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイト、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸(PNA)が挙げられる。
「配列同一性の割合」は、最適なアラインメントがなされた2つの配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定され、この際、比較ウィンドウ内にあるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、この2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列(これは付加も欠失も含まない)との比較で付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでもよい。この割合は、両方の配列に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で除算し、その結果に100を掛けて配列同一性の割合を求めることによって算出される。
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一な」または「同一性」の割合という用語は、同一であるか、あるいは比較ウィンドウにわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかもしくは手作業によるアラインメントおよび目視検査によって測定された指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、同一(すなわち、例えば本開示のポリペプチド配列全体もしくは本開示のポリペプチドの個々のドメインの、特定の領域にわたって60%の同一性、任意で65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%もしくは99%の同一性)であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の割合を有するかの、2つまたはそれ以上の配列または部分配列をいう。そのような配列は「実質的に同一」であると言われる。この定義は同様に、試験配列の相補体をいう。任意で、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長の領域にわたって、またはより詳細には100〜500もしくは1000またはそれ以上のヌクレオチド長の領域にわたって存在する。本開示は、本明細書において同定されるいずれかと実質的に同一であるポリペプチドを含む。
遺伝子に関して本明細書において用いられる「発現」または「発現された」という単語は、その遺伝子の転写産物および/または翻訳産物を意味する。細胞におけるDNA分子の発現レベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量または細胞によって産生されたそのDNAによりコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて判定されうる。非コード核酸分子(例えば、siRNA)の発現レベルは、当技術分野において周知の標準的なPCRまたはノザンブロット法によって検出されうる。Sambrook et al., 1989 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 18.1-18.88を参照されたい。トランスフェクトされた遺伝子の発現は、細胞内で一過的または安定的に起こりうる。「一過性発現」の間、トランスフェクトされた遺伝子は、細胞分裂中に娘細胞に移入されない。その発現はトランスフェクトされた細胞に限定されるため、遺伝子の発現は時間とともに失われる。対照的に、遺伝子が、トランスフェクトされた細胞に選択的利点を与える別の遺伝子と同時トランスフェクトされると、トランスフェクトされた遺伝子の安定的な発現が起こりうる。そのような選択的利点は、細胞に提示されるある種の毒素に対する耐性でありうる。トランスフェクトされた遺伝子の発現は、宿主ゲノムへのトランスポゾン媒介挿入によってさらに達成することができる。トランスポゾンを介した挿入中、遺伝子は、宿主ゲノムへの挿入とその後の切除を可能にする2つのトランスポゾンリンカー配列の間に予測可能な方法で配置される。トランスフェクトされた遺伝子の安定的な発現は、感染後に細胞ゲノムの一部を形成する(組み込まれる)ことにより、遺伝子の安定的な発現をもたらすレンチウイルスベクターを細胞に感染させることによってさらに達成することができる。
「プラスミド」、「ベクター」、または「発現ベクター」という用語は、遺伝子および/または遺伝子の発現に必要な調節要素をコードする核酸分子をいう。プラスミドからの遺伝子の発現は、シスまたはトランスで起こりうる。遺伝子がシスで発現される場合、遺伝子および調節要素は同じプラスミドによってコードされる。トランスでの発現は、遺伝子および調節要素が別々のプラスミドによってコードされる場合をいう。
「トランスフェクション」、「形質導入」、「トランスフェクトする」、または「形質導入する」という用語は、互換的に用いることができ、核酸分子またはタンパク質を細胞に導入するプロセスと定義される。核酸は、非ウイルスまたはウイルスに基づく方法を用いて細胞に導入される。核酸分子は、完全なタンパク質またはその機能的部分をコードする遺伝子配列でありうる。非ウイルスのトランスフェクション法には、核酸分子を細胞に導入するための送達システムとしてウイルスDNAまたはウイルス粒子を使用しない任意の適切なトランスフェクション法が含まれる。例示的な非ウイルストランスフェクション法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショックによるトランスフェクション、磁化およびエレクトロポレーションが挙げられる。いくつかの態様において、核酸分子は、当技術分野において周知の標準的な手順にしたがって、エレクトロポレーションを用いて細胞に導入される。ウイルスに基づくトランスフェクション法の場合、本明細書において記載される方法では、任意の有用なウイルスベクターが用いられうる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、核酸分子は、当技術分野において周知の標準的な手順にしたがってレトロウイルスベクターを用い細胞に導入される。「トランスフェクション」または「形質導入」という用語は、外部環境から細胞にタンパク質を導入することもいう。典型的には、タンパク質の形質導入またはトランスフェクションは、細胞膜を通過して関心対象のタンパク質に移行することができるペプチドまたはタンパク質の付着に依る。例えば、Ford et al. (2001) and Prochiantz (2007)を参照されたい。
「抗体」は、抗原を特異的に結合かつ認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドをいう。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのどちらかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、これが免疫グロブリンクラス、それぞれIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを定義する。典型的には、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性を決定する上で重要な役割を果たす。いくつかの態様において、抗体または抗体の断片は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ラクダなどを含む異なる生物に由来しうる。抗体は、抗体の所望の機能(例えば、グリコシル化、発現、抗原認識、エフェクター機能、抗原結合、特異性など)を改善または調節するために1つまたは複数のアミノ酸位置で改変または変異されている抗体を含みうる。
タンパク質またはペプチドに言及する場合、抗体に「特異的(もしくは選択的)に結合する」または「と特異的(もしくは選択的)に免疫反応する」という語句は、多くの場合にはタンパク質および他の生物製剤の不均一な集団における、タンパク質の存在を決定する結合反応をいう。したがって、指定された免疫アッセイ条件の下で、指定された抗体は、バックグラウンドの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドの10〜100倍超で特定のタンパク質に結合する。そのような条件下での抗体への特異的結合は、典型的には、特定のタンパク質に対するその特異性のために選択された抗体を必要とする。例えば、ポリクローナル抗体を選択して、選択された抗原と特異的に免疫反応するが、他のタンパク質とは免疫反応しない抗体のサブセットのみを得ることができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成されうる。種々の免疫アッセイ形式を用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ELISA免疫アッセイ法は、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に用いられる(例えば、特異的な免疫反応性を判定するために用いることができる免疫アッセイ形式および条件の記載については、Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)を参照されたい)。
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然の状態で結び付いている他の細胞成分を本質的に含まないことを示す。それは、例えば、均質な状態であることができ、乾燥または水溶液のどちらかでありうる。純度および均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーのような分析化学技法を用いて判定される。調製物中に存在する主要な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。
「対照」サンプルまたは値は、試験サンプルとの比較のための参照、通常は既知の参照として役立つサンプルをいう。例えば、試験サンプルは試験条件から、例えば試験化合物の存在下で、採取することができ、既知の条件からの、例えば試験化合物の非存在下(陰性対照)での、または既知の化合物の存在下(陽性対照)での、サンプルと比較することができる。対照は、いくつかの試験または結果から収集された平均値を表すこともできる。当業者は、対照が任意の数のパラメータの評価のためにデザインされうることを認識するであろう。例えば、薬理学的データ(例えば、半減期)または治療的手段(例えば、副作用の比較)に基づいて治療上の利点を比較するために、対照を考案することができる。当業者は、所与の状況においてどの対照が有益であるかを理解し、対照値との比較に基づいてデータを分析することができるであろう。対照は、データの有意性を判定するためにも有益である。例えば、所与のパラメータの値が対照で大きく異なる場合、試験サンプルのバラツキは有意と見なされないであろう。
本明細書において用いられる場合、「転移」、「転移性」、および「転移性がん」という用語は、互換的に用いることができ、ある臓器もしくは別の非隣接臓器または身体部分からの増殖性疾患または障害、例えば、がんの広がりをいう。がんは、原発腫瘍、例えば、原発性乳がんといわれる発生部位、例えば乳房で発生する。原発腫瘍または発生部位の一部のがん細胞は、局所領域の周囲の正常組織に浸透および浸潤する能力、ならびに/またはリンパ系または血管系の壁に浸透しその系を循環して体内の他の部位および組織に到達する能力を獲得する。原発腫瘍のがん細胞から形成された臨床的に検出可能な第2の腫瘍は、転移性または二次性腫瘍といわれる。がん細胞が転移する場合、転移性腫瘍およびその細胞は元の腫瘍のものと同様であると推定される。したがって、肺がんが乳房に転移する場合、乳房の部位の二次性腫瘍は異常な肺細胞からなり、異常な乳房細胞からならない。乳房内の二次性腫瘍は転移性肺がんといわれる。したがって、転移性がんという語句は、対象が原発性腫瘍を有するかまたは有していたかであり、1つまたは複数の二次性腫瘍を有する疾患をいう。非転移性がんまたは転移性ではないがんを有する対象という語句は、対象が原発性腫瘍を有するが、1つまたは複数の二次性腫瘍を有しない疾患をいう。例えば、転移性肺がんは、原発性肺腫瘍を有するかまたはその病歴を有し、第2の場所または複数の場所、例えば乳房内に1つまたは複数の二次性腫瘍を有する対象における疾患をいう。
「抗がん剤」は、その単純な通常の意味にしたがって用いられ、抗新生物特性または細胞の成長または増殖を阻害する能力を有する組成物(例えば、化合物、薬物、アンタゴニスト、阻害剤、調節因子)をいう。いくつかの態様において、抗がん剤は化学療法剤である。いくつかの態様において、抗がん剤は、がんを処置する方法において有用性を有する、本明細書において同定された薬剤である。いくつかの態様において、抗がん剤は、がんを処置するための、FDAまたは米国以外の国の同様の規制当局によって承認された薬剤である。
II. 神経芽細胞腫
神経芽細胞腫(NB)はある種のタイプの神経組織に生じるがんのタイプである。最も頻繁には、副腎の1つから始まるが、首、胸、腹部、または脊椎にも発生しうる。症状には、骨の痛み、腹部、首もしくは胸のしこり、または皮膚下の痛みのない青みがかったしこりが含まれうる。
神経芽細胞腫は、人の両親から受け継いだ変異が原因でありうることもある。環境因子が関与していることは見出されていない。診断は組織生検に基づいている。妊娠中に超音波検査によって赤ちゃんに見出されうることもある。診断時に、がんは通常、既に広がっている。がんは、子供の年齢、がんの病期、およびがんがどのように見えるかに基づいて、低リスク、中リスク、および高リスクの群に分類される。
処置および転帰は、人が属するリスク群に依る。処置には観察、手術、放射線療法、化学療法、または幹細胞移植が含まれうる。乳児の低リスク疾患は、通常、手術または単に観察することで良好な結果となる。しかし、リスクの高い疾患では、積極的な処置にもかかわらず、長期生存の可能性は40%未満である。
神経芽細胞腫は、乳児で最も一般的ながんであり、白血病および脳腫瘍に続いて子供で3番目に一般的ながんである。ある時点で、7,000人の子供に約1人が影響を受ける。症例の約90%は5歳未満の子供に発生し、成人では稀である。小児のがんによる死亡の約15%は神経芽細胞腫によるものである。
A. 徴候および症状
神経芽細胞腫の最初の症状は不明瞭なことが多く、診断を困難にする。倦怠感、食欲不振、発熱、および関節痛が一般的である。症状は、原発腫瘍の位置と存在する場合には転移がんに依る:
・腹部では、腫瘍が腹部膨満および便秘を引き起こしうる。
・胸部の腫瘍は呼吸障害を引き起こしうる。
・腫瘍が脊髄を圧迫すると、脱力を起こし、かくして立ったり、這ったり、または歩いたりすることができなくなりうる。
・脚部および臀部の骨病変は、疼痛および跛行を引き起こしうる。
・眼窩または眼の周りの骨の腫瘍は明瞭な挫傷および腫れを引き起こしうる。
・骨髄の浸潤は貧血による蒼白を引き起こしうる。
・神経芽細胞腫は、症状が現れる前に体の他の部分に広がることが多く、全ての神経芽細胞腫症例の50〜60%が転移を示す。
神経芽細胞腫が発生する最も一般的な場所(すなわち、原発腫瘍)は副腎中である。これは、限局性腫瘍の40%および広範囲の疾患の症例の60%で発生する。神経芽細胞腫はまた、首から骨盤までの交感神経系鎖に沿ってどこでも発症しうる。さまざまな場所での頻度には、首(1%)、胸部(19%)、腹部(30%非副腎)、または骨盤(1%)が含まれる。稀に、原発腫瘍を識別できない場合がある。
稀であるが特徴的な所見には、横断性脊髄症(腫瘍脊髄圧迫、症例の5%)、処置抵抗性下痢(腫瘍血管作動性腸管ペプチド分泌、症例の4%)、ホルネル症候群(頸部腫瘍、症例の2.4%)、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、および運動失調(疑わしい腫瘍随伴の原因、症例の1.3%)、および高血圧(カテコールアミン分泌または腎動脈圧迫、症例の1.3%)が含まれる。
B. 原因
神経芽細胞腫の原因はよく分かっていない。症例の大多数は散発性かつ非家族性である。症例の約1〜2%は家族で発生し、特定の遺伝子変異に関連している。家族性神経芽細胞腫は、場合によっては、未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)遺伝子における稀な生殖細胞変異によって引き起こされる。PHOX2AまたはKIF1B遺伝子における生殖細胞変異は、家族性神経芽細胞腫にも関係している。神経芽細胞腫は、神経線維腫症1型およびベックウィズ・ヴィーデマン症候群の特徴でもある。
腫瘍内のMYCNがん遺伝子の増幅は、神経芽細胞腫の一般的な所見である。増幅の程度は、3〜10倍、または100〜300倍のどちらかの2峰性分布を示す。この変異の存在は、疾患の進行期と高度に相関している。
神経芽細胞腫腫瘍細胞内のLMO1遺伝子の重複セグメントは、攻撃的ながんの形態を発症するリスクを高めることが示されている。
神経芽細胞腫はNBPF10遺伝子内のコピー数多型に関連しており、これは1q21.1欠失症候群または1q21.1重複症候群を引き起こす。
いくつかのリスク因子が提案されており、現在進行中の研究の対象になっている。特徴的な早期発症のため、多くの研究は受精前後および妊娠中の親の要因に焦点を合わせている。調査された要因には、職業(すなわち、特定の産業における化学物質への曝露)、喫煙、アルコール消費、妊娠中の医薬品の使用および出生因子が含まれていた; しかしながら、結果は決定的ではなかった。
他の研究では、アトピーと人生初期の感染への曝露、ホルモンと排卵誘発剤の使用、および母方の染毛剤使用との関連の可能性が調査されている。
C. 診断
診断は通常、臨床所見、顕微鏡的知見、および他の臨床試験を考慮して、外科病理学者によって確認される。それは交感神経系(SNS)のいずれかの神経堤要素から生じうる。
嗅神経芽細胞腫としても知られる鼻腔神経芽細胞腫は、嗅上皮から発生すると考えられており、その分類についてはまだ議論の余地がある。しかしながら、それは交感神経系の悪性腫瘍ではないため、鼻腔神経芽細胞腫は別個の臨床的実体であり、神経芽細胞腫と混同されるべきではない。
D. 生化学
神経芽細胞腫の症例の約90%で、カテコールアミンまたはその代謝物のレベルの上昇が尿または血液において見出される。カテコールアミンおよびその代謝物には、ドーパミン、ホモバニリン酸(HVA)、および/またはバニリルマンデル酸(VMA)が含まれる。
E. 画像化
神経芽細胞腫を検出する別の方法はmIBGスキャン(メタヨードベンジルグアニジン)であり、これは「mIBG-avid」と呼ばれることが多い、全ての神経芽細胞腫の90〜95%に採用され実践される。その機構は、mIBGが交感神経細胞に取り込まれ、神経伝達物質ノルエピネフリンの機能的な類似体であるというものである。それはI131またはI123 (放射性ヨウ素同位体)で放射性イオン化される場合に、この疾患の処置に対する応答の診断およびモニタリングにとって非常に優れた放射性医薬品である。半減期13時間のI123は、画像化の感度および品質にとって特別な同位体である。I131は8日の半減期を有し、高線量では再発性および難治性の神経芽細胞腫に対する標的放射線として効果的な治療法である。
F. 組織学
顕微鏡検査で、腫瘍細胞は、典型的には、小さく、丸くて青色であると記載され、ロゼットパターン(ホーマーライトロゼット)が見られうる。ホーマーライトロゼットは神経網の周りの腫瘍細胞であり、血管の周りの腫瘍細胞である偽ロゼットと混同されるべきではない。それらはまた、血管に向かって先細りになるグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)陽性プロセスを伴う腫瘍細胞からなる上衣腫の偽ロゼット(したがって2つの組み合わせ)とは異なる。病理学者は、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、リンパ腫、およびウィルムス腫瘍のような、組織学的模倣体から神経芽細胞腫を区別するために、種々の免疫組織化学的染色を用いる。
神経芽細胞腫は、同様の起源を有し、良性神経節神経腫から、神経芽細胞が混合されているかまたは結節にある間質に富んだ神経節芽細胞腫、非常に悪性の神経芽細胞腫に至るまでの幅広い分化パターンを示す末梢神経芽細胞腫(pNT)の1つである。処置前の腫瘍病理におけるこの区別は、年齢および有糸分裂-核崩壊指数(MKI)とともに、重要な予後因子である。この病理分類システム(シマダシステム)は、1999年に設立され2003年に改められた国際神経芽細胞腫病理委員会(International Neuroblastoma Pathology Committee; INPC)による「好ましい」および「好ましくない」腫瘍を記載している。
G. 病期分類
1986年に設立され1988年に改められた「国際神経芽細胞腫病期分類システム(International Neuroblastoma Staging System; INSS)」では、診断時の解剖学的存在によって神経芽細胞腫を層別化する:
・病期1: 起始域に限局した限局性腫瘍。
・病期2A: 不完全な肉眼的切除を有する片側性腫瘍; 腫瘍が陰性の識別可能な同側および対側リンパ節。
・病期2B: 完全または不完全な肉眼的切除を有する片側性腫瘍; 同側リンパ節が腫瘍陽性である; 腫瘍が陰性の識別可能な対側リンパ節。
・病期3: 領域リンパ節転移の有無にかかわらず正中線を越えて浸潤する腫瘍; または対側リンパ節転移を有する片側性腫瘍; または両側リンパ節転移を有する正中線腫瘍。
・病期4: 病期4Sで定義されている場合を除き、遠隔リンパ節、骨髄、骨、肝臓、または他の臓器への腫瘍の伝播。
・病期4S: 年齢1歳未満で、病期1または2で定義されている限局性の原発腫瘍を有し、伝播は肝臓、皮膚、または骨髄に限定される(有核骨髄細胞の10%未満が腫瘍である)。
病期分類に関する国際合意(INSS)が用いられているが、研究結果で同様のコホートを比較するために、リスク割り当てに関する国際的なコンセンサスの必要性も認識されている。2005年以降、主要な小児腫瘍学協力グループの代表者が集まって、1990年から2002年の間にヨーロッパ、日本、米国、カナダ、およびオーストラリアで処置された神経芽細胞腫患者8,800名のデータを見直した。この作業部会により、国際神経芽細胞腫リスク群(INRG)分類システムが提唱されている。後ろ向き研究により、高リスクとして以前は分類されていた、12〜18ヶ月齢群の高い生存率が明らかになり、N-myc (一般にMYCNともいわれる)増幅のない12〜18ヶ月齢小児を中リスクの部類に再分類する決断が促された。
新たなINRGリスク割り当てでは、新たな国際神経芽細胞腫リスク群病期分類システム(INRGSS)に基づいて診断時に神経芽細胞腫を分類する:
・病期L1: 画像で定義されたリスク因子を有しない限局性疾患。
・病期L2: 画像で定義されたリスク因子を有する限局性疾患。
・病期M: 転移性疾患。
・病期MS: MSが病期4Sと同等である「特殊な」転移性疾患。
新たなリスク層別化は、新たなINRGSS病期分類システム、年齢(18ヶ月で二分)、腫瘍悪性度、N-myc増幅、不均衡な11q異常、および倍数性に基づき4つの処置前リスク群: 非常に低リスク、低リスク、中リスクおよび高リスクになる。
H. スクリーニング
尿中カテコールアミンレベルは、前臨床神経芽細胞腫で上昇しうる。1980年代以降、日本、カナダ、オーストリア、およびドイツで、3週間、6ヶ月、および1年時の無症候性乳児のスクリーニングが実施されている。日本では1984年にホモバニリン酸およびバニルマンデル酸のレベルの分析を介して神経芽細胞腫の6ヶ月齢のスクリーニングが開始された。カナダとドイツでの研究から神経芽細胞腫による死亡の低減が示されず、むしろ処置がなくとも消滅したであろう診断の増加をもたらし、それらの幼児を不必要な手術および化学療法に供した後、2004年にスクリーニングは中止された。
I. 処置
病変が限局している場合、それは一般的に治癒可能である。しかし、積極的な集中的治療(強化化学療法、手術、放射線療法、幹細胞移植、13-シス-レチノイン酸とも呼ばれる分化剤イソトレチノイン、および頻繁には抗GD2モノクローナル抗体療法による免疫療法)にもかかわらず、18ヶ月齢以上の進行性疾患を有する小児の長期生存は不良である。
生物学的および遺伝的特徴が特定されており、これにより、古典的な臨床病期分類に追加されると、処置強度を計画するためのリスク群への患者の割り当てが可能とされている。これらの基準には、患者の年齢、疾患の広がりの程度、顕微鏡的外観、ならびに低リスク、中リスクおよび高リスク疾患へのDNA倍数性およびN-mycがん遺伝子増幅(N-mycはマイクロRNAを調節する)などの遺伝的特徴が含まれる。最近の生物学的研究(COG ANBL00B1)により、2687名の神経芽細胞腫患者が分析され、リスク割り当ての範囲が判定された: 神経芽細胞腫症例の37%が低リスク、18%が中リスク、45%が高リスクである。高リスクタイプと低リスクタイプは異なる機構により引き起こされ、単に同じ機構の2つの異なる発現度ではないといういくつかの証拠がある。
これらの異なるリスク部類の治療法は非常に異なる。低リスク疾患は、処置を全く行わず観察されたり、または手術のみで治癒したりすることがよくある。中リスク疾患は手術および化学療法で処置される。高リスク神経芽細胞腫は、強化化学療法、手術、放射線療法、骨髄/造血幹細胞移植、13-シス-レチノイン酸(イソトレチノインまたはアキュテイン)による生物学に基づく療法ならびに通常サイトカインGM-CSFおよびIL-2を投与される抗体療法で処置される。
現行の処置では、低リスクおよび中リスク疾患を有する患者は優れた予後を有し、治癒率は低リスクで90%を超え、中リスクで70〜90%である。対照的に、過去20年間の高リスク神経芽細胞腫の治療では、治癒は約30%の確率に過ぎなかった。抗体療法の追加により、高リスク疾患の生存率が大幅に上昇した。2009年3月、高リスク患者226名を伴う小児腫瘍学グループ(Children's Oncology Group; COG)研究の初期分析では、幹細胞移植の2年後に、GM-CSFおよびIL-2とともにch14.18抗体を投与するように無作為化された群の66%が、抗体を投与されなかった群でのわずか46%と比較して生存しかつ無病であることが示された。試験に登録している全ての患者が抗体療法を受けるように、無作為化は中止された。
組み合わせて使用される化学療法剤は、神経芽細胞腫に対して有効であることが見出されている。誘導および幹細胞移植のコンディショニングに一般的に使用される薬剤は、白金化合物(シスプラチン、カルボプラチン)、アルキル化剤(シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン)、トポイソメラーゼII阻害剤(エトポシド)、アントラサイクリン抗生物質(ドキソルビシン)およびビンカアルカロイド(ビンクリスチン)である。いくつかのいっそう新しいレジメンには、再発性疾患に対して有効であることが分かっている誘導におけるトポイソメラーゼI阻害剤(トポテカンおよびイリノテカン)が含まれる。
J. 予後
高リスク症例の20%から50%は、高用量化学療法の導入に適切に応答せず、進行性または難治性である。最前線の治療の完了後の再発も一般的である。神経芽細胞腫に対する新しい薬剤および薬剤の組み合わせを試験する第I相および第II相臨床試験では、さらなる処置が利用可能であるが、再発した高リスク疾患の転帰は依然として非常に不良である。
今日生きているほとんどの長期生存者は、低リスクまたは中リスク疾患を有し、高リスク疾患と比較していっそう穏やかな処置経過を有した。生存者の大多数は処置からの長期的な影響を有する。中リスクおよび高リスク処置の生存者は、聴力損失を経験することが多い。成長低下、甲状腺機能障害、学習障害、および二次がんのリスクの増大は、高リスク疾患の生存者に影響を与える。小児がんの生存者3名中の推定2名は、がんの診断後20〜30年以内に、少なくとも1つの慢性的で時には生命を脅かす健康問題を最終的に発症する。
K. 細胞遺伝学的プロファイル
一連の神経芽細胞腫サンプル493例に基づき、アレイに基づく核型分析によって試験された、全体的なゲノムパターンが神経芽細胞腫における転帰の予測因子であることが報告されている:
・染色体全体のコピー数の変化のみを示す腫瘍は、優れた生存性と関連していた。
・あらゆる種類の部分的な染色体コピー数の変化を示す腫瘍は、再発のリスクが高いことに関連していた。
・部分的変化を示す腫瘍内で、全生存性低下の独立したさらなる予測因子は、N-myc増幅、1pおよび11q欠失、ならびに1q獲得であった。
以前の刊行物では、細胞遺伝学的プロファイルに基づいて神経芽細胞腫が3つの主要なサブタイプに分類された:
・サブタイプ1: ほぼ三倍体性で、数値の増減が優勢で、主に非転移性NB病期1、2および4Sを表す好ましい神経芽細胞腫。
・サブタイプ2Aおよび2B: 好ましくない広範囲の神経芽細胞腫、病期3および4において見られ、N-myc増幅なしで11q損失および17q獲得を有し(サブタイプ2A)、または1p欠失および17q獲得を伴うことが多いN-myc増幅を有する(サブタイプ2B)。
仮想核型分析は、これらの遺伝子座でのコピー数を評価するために、新鮮な腫瘍またはパラフィン包埋腫瘍で実施することができる。SNPアレイ仮想核型分析は、神経芽細胞腫を含む腫瘍サンプルに用いることができる。これは、コピー数変化のないヘテロ接合性喪失(copy neutral loss of heterozygosity) (後天性片親性ダイソミー)を検出することができるためである。コピー数変化のないLOHは、欠失と生物学的に同等である可能性があり、神経芽細胞腫での主要な遺伝子座で検出されている。ArrayCGH、FISH、または従来の細胞遺伝学では、コピー数変化のないLOHを検出することができない。
L. 疫学
神経芽細胞腫は、全ての小児がんの6〜10%、および小児のがんによる死亡の15%を含む。年間死亡率は、0〜4歳群の子供100万人あたり10人、および4〜9歳群の子供100万人あたり4人である。
発生率が最も高いのは生後1年であり、先天性の場合もある。年齢幅は、年長児および大人を含め、幅広いが、5歳以上の人で発生するのは症例のわずか10%である。ヨーロッパの大規模な研究では、4000例を超える神経芽細胞腫症例の2%未満が18歳超であると報告された。
M. 処置指針
最近の焦点は、生存率を90%に維持しながら、低リスクおよび中リスク神経芽細胞腫の治療を減らすことであった。1997年から2005年にA3961に登録された467名の中リスク患者の研究により、このリスク群の治療を成功裏に低減できるという仮説が確認された。好ましい特徴(腫瘍悪性度および応答)を有する者は4サイクルの化学療法を受け、好ましくない特徴を有する者は8サイクルを受け、3年間無事象の生存および全生存はコホート全体の90%で安定であった。将来の計画は、1p36または11q23染色体の異常を有する患者、および処置に対する初期応答がない患者の処置を強化することである。
対照的に、過去20年以上の焦点は、高リスク神経芽細胞腫の処置を強化することであった。化学療法導入の差異、手術のタイミング、幹細胞移植レジメン、放射線のさまざまな送達スキーム、ならびに最小限の残存疾患を処置するためのモノクローナル抗体およびレチノイドの使用が引き続き検討されている。これらの問題に応えて高リスク疾患の生存性を改善するために、無作為化を伴う最近の第III相臨床試験が実行されている。
III. 腫瘍特異的自己抗原を同定するための方法
1つの局面において、本開示は、免疫細胞の標的として作用できる腫瘍抗原、特に腫瘍抗原を標的とすることができる受容体を発現するように特に遺伝子操作されたものを同定する新たな方法を記載する。これらの方法は、現在の技術よりも大幅に改善されており、変異率が比較的低いがんからの抗原の同定、ならびに変異負荷の高い腫瘍における再発性腫瘍特異的抗原の同定を可能にする。
抗原を同定するために、腫瘍RNAおよびDNAを腫瘍サンプルから得て、腫瘍細胞の溶出およびLC/MS/MSプロテオミクス(リガンドミクス)により経験的に特徴付けられたMHCリガンドと並行して配列決定する。腫瘍遺伝子発現データをTARGET/TCGA vs. GTExの腫瘍特異的差次分析と比較して、腫瘍に特異的であり正常組織には存在しないことが知られている高度に発現された遺伝子を同定する。MHCリガンドミクスによって同定されたリガンドを、腫瘍における差次的発現に基づいてフィルタリングし、残りのリガンドを、正常なリガンドームのデータベースに存在しないことに基づいてさらにフィルタリングする。経験的に特徴付けられたリガンドを、標準的タンパク質にマッピングされないRNA-seq読み取りと照合するアルゴリズムを用いて、非標準的な腫瘍抗原のさらなるクラスを同定する。腫瘍抗原を、神経回路網機械学習アルゴリズムNetMHCによって判定されるペプチド/MHC結合親和性、LC/MS/MSによって判定されるMHC表面上の腫瘍リガンドの量的存在、腫瘍タイプとの生物学的関連性、他の腫瘍全体での再発、HLA対立遺伝子を提示する集団頻度、および複数の腫瘍に及ぶ抗原の再発に基づいて優先順位付けする。
選択した抗原を検証するために、ペプチド/MHCデキストラマーを腫瘍リガンドに特異的に合成し、健常なHLA適合ドナーから抗原特異的CD8細胞を選別するために使用する。次に、抗原特異的T細胞のサブセットに対して単細胞配列決定を実施して、ペアのα/β TCR配列を得る。TCR配列の可変領域をデータから推定し、マウス定常領域と対合し、発現の改善のためにコドン最適化する。等モル発現のためにP2Aペプチドによって連結された、TCR β鎖とそれに続くα鎖の発現カセットを、pMP71 T細胞特異的発現ベクターにクローニングする。レトロウイルスTCRベクターを、NFAT駆動型ルシフェラーゼ発現により操作されたJurkat/MAレポーター細胞株に形質導入する。TCRの発現を検証するために、形質導入されたJurkat/MA細胞を腫瘍細胞と共培養し、ルシフェラーゼ発現についてアッセイする。
このアプローチを用いて、本発明者らは、腫瘍により発現されるポリペプチド中のいくつかの異なるペプチド抗原を同定した。これらのタンパク質には、IGFBPL1 (NP_001007564)、GFRA2 (NM_001158510)、PHOX2B (NP_003915)、PBK (NP_001265874)、CHRNA3 (NP_000743)、HMX1 (NP_001293071.1)、チロシンヒドロキシラーゼ(AAI43612.1)、RBM34 (NP_001155005)、およびATP6V0C (NP_001185498)が含まれる。特定のペプチド配列を以下の表1に示す。
IV. ワクチン、操作された受容体分子、および細胞を伴う、免疫療法
A. BitES
二重特異性T細胞エンゲージャ(BiTE)は、抗がん剤としての使用が調査されている人工二重特異性モノクローナル抗体のクラスである。それらは、がん細胞に対する宿主の免疫系、より具体的にはT細胞の細胞傷害活性を指令する。BiTEは、Micromet AGの登録商標である。
BiTEは約55キロダルトンの単一ペプチド鎖上の、異なる抗体の2つの一本鎖可変断片(scFv)、または4つの異なる遺伝子由来のアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。scFvの1つはCD3受容体を介してT細胞に結合し、もう1つは腫瘍特異的分子、この場合は表1の抗原を介して腫瘍細胞に結合する。
他の二重特異性抗体と同様に、および通常のモノクローナル抗体とは異なり、BiTEはT細胞と腫瘍細胞の間にリンクを形成する。これによってT細胞は、MHC Iまたは共刺激分子の存在とは無関係に、パーフォリンおよびグランザイムのようなタンパク質を産生することにより、腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を発揮する。これらのタンパク質は腫瘍細胞に入り、細胞のアポトーシスを開始する。この作用は、腫瘍細胞に対するT細胞の攻撃中に観察される生理学的プロセスを模倣している。
2010年7月の時点で臨床試験中のBiTEには、B細胞上に発現される表面分子CD19に対して作製された、非ホジキンリンパ腫および急性リンパ芽球性白血病の処置用のブリナツモマブ(MT103); ならびにEpCAM抗原に対して作製された、胃腸がんおよび肺がんの処置用のMT110が含まれる。
同じ技術を利用して、黒色腫(MCSP特異的BiTEにより)および急性骨髄性白血病(CD33特異的BiTEにより)を標的にすることができる。この領域の研究は現在進行中である。新規抗がん療法の別の手段は、BiTEアプローチを用いて、トラスツズマブ(HER2/neuを標的とする)、セツキシマブ、およびパニツムマブ(両方ともEGF受容体を標的とする)のような、現在使用されている従来の抗体の一部を再操作することである。CD66eおよびEphA2に対するBiTEも開発されている。
pf BiTE技術の別の例は、HLA-A＊02:01に提示された細胞内がんタンパク質WT1に由来するペプチドに結合するT細胞受容体（TCR）模倣モノクローナル抗体(mAb) ESK1に由来するBiTE抗体に関する。細胞表面の複合体の密度が非常に低いにもかかわらず、ESK1-BiTEは細胞溶解性ヒトT細胞の増殖を選択的に活性化および誘導し、これがインビトロでおよびマウスで複数の白血病および固形腫瘍からの細胞を死滅させた。自家のインビトロの場面では、ESK1-BiTEはWT1以外の腫瘍関連抗原に特異的な強力な二次CD8 T細胞応答を誘導した(Dao et al., Nature Biotechnol. 33: 1079-1086, 2015)。
B. 他の多価抗体の形式
現在、種々の多価抗体コンストラクトがデザインされている。これらのなかには単一のエピトープに対する特異性を有するものもあれば、複数の異なる結合特異性を有するものもある。二重特異性抗体には、全長およびFab2コンストラクトの両方、およびダイアボディと呼ばれる分子が含まれる。ダイアボディは、小さなペプチドリンカーによって接続された重鎖可変(VH)領域および軽鎖可変(VL)領域からなる、一本鎖Fv (scFv)断片の非共有二量体である。ダイアボディの別の形態は、2つのscFv断片が互いに共有結合している一本鎖(Fv)2である。三重特異性コンストラクトには、Fab3およびトリアボディが含まれ、後者はダイアボディの3つのscFv型である。scFv-Fcは、無傷のFc領域に融合した2つの連結された一本鎖可変断片で構成されている。ミニボディはscFv-Fcに似ているが、完全なFc領域ではなくCH1ドメインを含有するだけである。他の多価コンストラクトには、IgNARおよびhcIgGが含まれる。
C. ペプチド抗原特異性を有する操作されたT細胞
本発明の別の局面において、表1に記載されるペプチド抗原に対する特異性を有するTCRを発現する操作された標的細胞が開示される。本開示の態様においては、TCRのαおよびβサブユニットをコードする組成物; ならびに組成物の使用説明書がある。組成物は、例えば、組み換えウイルスまたはウイルスベクターでありうる。いくつかの態様において、組成物は、実質的に本明細書において記載される可変領域のうちの少なくとも1つを含むTCRサブユニットをコードする1つまたは複数の配列を含む。
いくつかの態様において、ベクターを用いて、機能的TCRの全部または一部をコードするポリヌクレオチド配列を、組み換えウイルスの調製のためのパッケージング細胞株に導入することができる。本明細書において記載される要素に加えて、ベクターは、組み換えウイルスのさまざまな成分および本明細書において記載される少なくとも1つの可変領域、ならびにパッケージング細胞株によって提供されないウイルスの産生に必要な任意の成分をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。他の態様において、本明細書において記載される要素に加えて、ベクターは、組み換えウイルスのさまざまな成分および本明細書で記載される少なくとも1つの可変領域、ならびにパッケージング細胞株によって提供されないウイルスの産生に必要な任意の成分をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。真核細胞発現ベクターは当技術分野において周知であり、いくつかの商業的供給源から入手可能である。
いくつかの態様において、パッケージング細胞における所望の組み換えウイルスの産生に必要な2つまたはそれ以上の要素(例えば、ウイルス遺伝子、以下の少なくとも1つ: m1-α配列およびm1-β配列、自殺遺伝子)を含む1つまたは複数の多シストロン性発現ベクターが利用される。多シストロン性ベクターの使用により、必要とされるベクターの総数が低減され、したがって複数のベクターからの発現の調整に関連する潜在的に困難な問題が回避される。多シストロン性ベクターにおいて、発現されるさまざまな要素は、1つまたは複数のプロモーター(および必要に応じて他の発現制御要素)に機能的に連結されている。いくつかの態様において、自殺遺伝子および/またはレポーター遺伝子、ウイルス要素ならびにTCRのαまたはβサブユニットの全部または一部をコードするヌクレオチド配列を含む多シストロン性ベクターが使用され、ここでヌクレオチド配列は実質的に本明細書において記載される通りである。
多シストロン性発現ベクターにおいて発現される各成分は、例えば、IRES要素またはウイルス2A要素より分離されて、同じプロモーターからのさまざまなタンパク質の別々の発現を可能にしうる。IRES要素および2A要素は当技術分野において公知である(米国特許第4,937,190号; de Felipe et al., 2004. Traffic 5: 616-626、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。1つの態様において、口蹄疫ウイルス(FMDV)、ウマA型鼻炎ウイルス(ERAV)、およびゾーシーアシグナ(thosea asigna)ウイルス(TaV)由来の2A様配列と連結したフューリン切断部位配列(RAKR) (Fang et al., 2005. Nat. Biotech 23: 584-590、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)をコードするオリゴヌクレオチド(Szymczak et al., 2004. Nat. Biotechnol. 22: 589-594、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)を用いて、多シストロン性ベクターにおける遺伝的要素を分離する。所望の組み換えウイルスの合成で用いるための特定の多シストロン性ベクターの有効性を、標準的なプロトコルを使って各遺伝子の発現を検出することにより容易に試験することができる。当技術分野において周知である例示的なプロトコルには、ウエスタンブロッティングのような抗体特異的免疫アッセイ法が含まれるが、これらに限定されることはない。
ベクターは通常、パッケージング細胞により認識され、かつターゲティング分子、ウイルス成分などをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されているプロモーターを含むであろう。プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写が行われることを可能にする核酸配列によって形成される発現制御要素である。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流(5') (一般に約100〜1000 bp以内)に位置する非翻訳配列であり、それらが機能的に連結されている抗原特異的ポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御する。プロモーターは誘導性または構成性でありうる。誘導性プロモーターの活性は、生物的または非生物的因子の存在または非存在によって誘導される。誘導性プロモーターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を、生物の発生のある種の段階でまたは特定の組織でオンまたはオフにすることができるので、遺伝子操作において有用なツールとすることができる。誘導性プロモーターは、化学的に調節されるプロモーター、および物理的に調節されるプロモーターとしてグループ化することができる。典型的な化学的に調節されるプロモーターには、アルコール調節プロモーター(例えば、アルコールデヒドロゲナーゼI (alcA)遺伝子プロモーター)、テトラサイクリン調節プロモーター(例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター)、ステロイド調節プロモーター(例えば、ラットグルココルチコイド受容体(GR)に基づくプロモーター、ヒトエストロゲン受容体(ER)に基づくプロモーター、モスエクジソン受容体に基づくプロモーター、およびステロイド/レチノイド/甲状腺受容体スーパーファミリーに基づくプロモーター)、金属調節プロモーター(例えば、メタロチオネイン遺伝子に基づくプロモーター)、ならびに病因関連プロモーター(例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis)およびトウモロコシ病原体関連(PR)タンパク質に基づくプロモーター)が含まれるが、これらに限定されることはない。典型的な物理的に調節されるプロモーターには、温度調節プロモーター(例えば、熱ショックプロモーター)、および光調節プロモーター(例えば、大豆SSUプロモーター)が含まれるが、これらに限定されることはない。他の例示的なプロモーターは他所に、例えば、ハイパーテキスト転送プロトコル(hypertext transfer protocol): patentlens.net/daisy/promoters/768/271.htmlのワールドワイドウェブに記載されている。
当業者は、特定の状況に基づいて適切なプロモーターを選択することができるであろう。プロモーターを発現される遺伝子に機能的に連結するための方法と同様に、多くの異なるプロモーターが当技術分野において周知である。天然のプロモーター配列と多くの異種プロモーターの両方を用いて、パッケージング細胞および標的細胞での発現を指令することができる。しかしながら、異種プロモーターが企図される。というのは、それらが一般に、天然のプロモーターと比較して、所望のタンパク質のいっそう多くの転写およびいっそう高い収量を可能にするからである。
プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス40 (SV40)のようなウイルスのゲノムから得られうる。プロモーターは、例えば、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、またはそのようなプロモーターが標的細胞と適合性であるという条件で、通常は、天然配列に結び付いているプロモーターであってもよい。1つの態様において、プロモーターは、ウイルス発現系における天然に存在するウイルスプロモーターである。
転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加されうる。エンハンサーは、典型的には、通常長さが約10〜300 bpの、DNAのシス作用性要素であり、プロモーターに作用してその転写を増加させる。現在、哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、およびインスリン)から多くのエンハンサー配列が公知である。真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されることが特に企図される。例としては、複製起点の後側のSV40エンハンサー(bp 100〜270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、抗原特異的ポリヌクレオチド配列の5'または3'側の位置でベクターにスプライシングされ、プロモーターから5'側の部位に位置付けられうる。
ウイルスポリペプチドの発現への適応に適した他のベクターおよび方法は、当技術分野において周知であり、特定の状況に容易に適応される。
本明細書において提供される教示を用いて、当業者は、レポータータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターでパッケージング細胞を形質転換し、適当な技法を用いて発現を測定することにより、例えば、緑色蛍光タンパク質コンジュゲートからの蛍光を測定することにより特定の発現系の有効性を試験できることを認識するであろう。適当なレポーター遺伝子は当技術分野において周知である。
コアウイルスをコードするベクターは「ウイルスベクター」としても公知である。PfeiferおよびVerma (2001, 参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)により記載されたものなどの、ヒト遺伝子治療用途のために同定されたものを含めて、本発明で用いるのに適している利用可能なウイルスベクターが多数ある。適当なウイルスベクターには、レトロウイルス由来のベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス(MLV)由来のベクターのような、RNAウイルスに基づくベクターが含まれ、より複雑なレトロウイルス由来のベクター、例えば、レンチウイルス由来のベクターが含まれる。ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)由来のベクターはこの分類に属する。他の例としては、HIV-2に由来するレンチウイルスベクター、ネコ免疫不全ウイルス(Hy)、ウマ感染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス(SIV)およびマエディ/ビスナ(maedi/visna)ウイルスが挙げられる。
特にウイルスベクターは、組み換えウイルスの成分をコードする1つまたは複数の遺伝子、ならびに機能的なMART-1 TCRの全部または一部をコードする核酸を含みうる。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、組み換えウイルスの成分ならびにm1-α可変領域、m1-β可変領域およびm2-β可変領域の少なくとも1つ、任意で、自殺遺伝子またはレポーター遺伝子をコードする。他の態様において、ウイルスベクターは、組み換えウイルスの成分、ならびにm1-αサブユニット、m1-βサブユニット、およびm2-βサブユニットの少なくとも1つ、任意で、自殺遺伝子またはレポーター遺伝子をコードする。ウイルスベクターはまた、プロモーターおよびエンハンサー配列のような、標的細胞における対応するαおよびβポリヌクレオチド配列の発現を促進する遺伝的要素を含みうる。標的細胞での複製を防ぐために、複製に必要な内在性ウイルス遺伝子を除去し、パッケージング細胞株で別個に提供してもよい。
特定の態様において、ウイルスベクターは、無傷のレトロウイルス5' LTRおよび自己不活化3' LTRを含む。
当技術分野において公知の任意の方法を用いて、そのゲノムがウイルスベクターのRNAコピーを含む感染性レトロウイルスおよび/またはレンチウイルス粒子を産生することができる。この目的のために、ウイルスベクター(表1のペプチド抗原を認識するTCRのm1-αサブユニットおよびm1-βサブユニットの少なくとも1つ、任意で、自殺遺伝子をコードする他のベクターとともに)を、ウイルスベクターに基づくウイルスゲノムRNAをウイルス粒子にパッケージングするパッケージング細胞株に導入することができる。
パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムRNAをウイルス粒子にパッケージングするためにトランスで必要とされるウイルスタンパク質を提供する。パッケージング細胞株は、レトロウイルスタンパク質を発現することができる任意の細胞株でありうる。特定のパッケージング細胞株には、293 (ATCC CCL X)、Platinum A、HeLa (ATCC CCL 2)、D17 (ATCC CCL 183)、MDCK (ATCC CCL 34)、BHK (ATCC CCL-10)、およびCf2Th (ATCC CRL 1430)が含まれる。パッケージング細胞株は、必要なウイルスタンパク質を安定的に発現しうる。そのようなパッケージング細胞株は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第6,218,181号に記載されている。あるいは、パッケージング細胞株は、表1のペプチド抗原を認識するTCRのm1-αサブユニットおよびm1-βサブユニットの少なくとも1つをコードするウイルスベクターとともに、gag、pol、rev、および標的細胞の形質導入を促進する任意のエンベロープタンパク質を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数の必要なウイルスタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドで一過性にトランスフェクトされうる。
典型的には、m1-α可変領域ヌクレオチド配列、m1-β可変領域ヌクレオチド配列、m2-β可変領域ヌクレオチド配列の少なくとも1つ、任意で、自殺遺伝子またはレポーター遺伝子を含む、関心対象の遺伝子を含むポリヌクレオチドを含むウイルス粒子を収集し、標的細胞に感染させる。いくつかの態様において、関心対象の遺伝子は、m1-αサブユニットヌクレオチド配列、m1-βサブユニットヌクレオチド配列、およびm2-βサブユニットヌクレオチド配列の少なくとも1つを含む。いくつかの態様において、ウイルスは、標的細胞特異性を達成するために偽型化される。偽型化の方法は当技術分野において周知であり、本明細書にも記載されている。
1つの態様において、関心対象の遺伝子を送達するために用いられる組み換えウイルスは、改変されたレンチウイルスであり、ウイルスベクターはレンチウイルスに基づく。レンチウイルスは分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができるので、この態様において、標的細胞が分裂している(または標的細胞が分裂するように刺激する)必要はない。
別の態様において、関心対象の遺伝子を送達するために用いられる組み換えウイルスは、改変されたガンマレトロウイルスであり、ウイルスベクターはガンマレトロウイルスに基づく。
別の態様において、ベクターは、マウス幹細胞ウイルス(MSCV; (Hawley, R. G., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10297-10302; Keller, G., et al. (1998) Blood 92:877-887; Hawley, R. G., et al. (1994) Gene Ther. 1:136-138, 前記の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)に基づく。MSCVベクターは、標的細胞、特に造血前駆細胞およびその分化した子孫において長期的に安定した発現を提供する。
別の態様において、ベクターは改変されたモロニーウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルスに基づく。ウイルスベクターは同様に、Choi, J. K.ら(2001. Stem Cells 19, No. 3, 236-246, これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)に記載されているものなどのハイブリッドウイルスに基づくことができる。
例えばアデノウイルスに基づくベクターおよびアデノ随伴ウイルス(AAV)に基づくベクターを含めて、DNAウイルスベクターが用いられうる。同様に、本発明の方法でレトロウイルス-アデノウイルスベクターを用いることもできる。
アンプリコンベクター、複製欠損HSVおよび弱毒化HSVを含めて、単純ヘルペスウイルス(HSV)に由来するベクターを含む他のベクターも、ポリヌクレオチド送達に用いることができる(Krisky et al. 1998. Gene Ther. 5: 1517-30, これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)。
遺伝子治療の使用のために最近開発された他のベクターを、本発明の方法で用いることもできる。そのようなベクターには、バキュロウイルスおよびアルファウイルスに由来するものが含まれる。Jolly, D.J. (1999). Emerging viral vectors. pp 209-40 in Friedmann T, ed. (1999). The development of human gene therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab, これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの特定の態様において、ウイルスコンストラクトは、HIVゲノムまたはSIVゲノムのような、レンチウイルスゲノムからの配列を含む。ウイルスコンストラクトは、レンチウイルスの5'および3' LTRからの配列を含みうる。より詳細には、ウイルスコンストラクトは、レンチウイルスの5' LTRからのRおよびU5配列ならびにレンチウイルスからの不活化または自己不活性化3' LTRを含む。LTR配列は、任意の種由来の任意のレンチウイルスからのLTR配列でありうる。例えば、それらはHIV、SIV、FIV、またはBIVからのLTR配列でありうる。詳細には、LTR配列はHIV LTR配列である。
ウイルスコンストラクトは、不活化または自己不活性化3' LTRを含みうる。3' LTRは、当技術分野において公知の任意の方法によって自己不活性化されうる。特定の態様において、3' LTRのU3要素は、TATAボックス、SplおよびNFκB部位のような、そのエンハンサー配列の欠失を含む。自己不活性化3' LTRの結果として、宿主細胞ゲノムに組み込まれるプロウイルスは、不活化5' LTRを含む。
任意で、レンチウイルス5' LTRからのU3配列を、ウイルスコンストラクト中のプロモーター配列で置き換えてもよい。これは、パッケージング細胞株から回収されるウイルスの力価を増加させうる。エンハンサー配列が含まれてもよい。パッケージング細胞株におけるウイルスRNAゲノムの発現を増加させる任意のエンハンサー/プロモーターの組み合わせが用いられうる。特定の態様において、CMVエンハンサー／プロモーター配列が用いられる。
いくつかの態様において、ウイルスコンストラクトは、不活化または自己不活性化3' LTRを含みうる。3' LTRは、当技術分野において公知の任意の方法によって自己不活性化されうる。特定の態様において、3' LTRのU3要素は、TATAボックス、SplおよびNFκB部位のような、そのエンハンサー配列の欠失を含む。自己不活性化3' LTRの結果として、宿主細胞ゲノムに組み込まれるプロウイルスは、不活化5' LTRを含む。
ウイルスコンストラクトは一般に、典型的には、m1-α可変領域ヌクレオチド配列、m1-β可変領域ヌクレオチド配列、m2-β可変領域ヌクレオチド配列、m1-αサブユニットヌクレオチド配列、m1-βサブユニットヌクレオチド配列、およびm2-βサブユニットヌクレオチド配列の少なくとも1つ、任意で、1つまたは複数の標的細胞において望ましく発現される自殺遺伝子またはレポーター遺伝子を含む、関心対象の遺伝子を含む。関心対象の遺伝子は、5' LTR配列と3' LTR配列の間に位置付けられうる。さらに、関心対象の遺伝子は、特に、他の遺伝的要素、例えばプロモーターおよび/またはエンハンサーのような転写調節配列と機能的な関係にあって、遺伝子が標的細胞に組み込まれると、特定の形で関心対象の遺伝子の発現を調節しうる。ある種の態様において、有用な転写調節配列は、時間的および空間的の両方で、活性に関して高度に調節されるものである。
いくつかの態様において、関心対象の遺伝子は、内部プロモーター/エンハンサー調節配列と機能的な関係にある。「内部」プロモーター/エンハンサーは、ウイルスコンストラクト中の5' LTR配列と3' LTR配列の間に位置し、望ましく発現される遺伝子に機能的に連結されているものである。
内部プロモーター/エンハンサーは、それが機能的関係にある遺伝子の発現を増加させることが知られている任意のプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター/エンハンサーの組み合わせでありうる。「機能的関係」および「機能的に連結された」とは、非限定的に、プロモーターおよび/またはエンハンサーが適切な分子と接触される場合に遺伝子の発現が影響を受けるプロモーターおよび/またはエンハンサーに関して正しい位置および配向に遺伝子があることを意味する。
内部プロモーター/エンハンサーは、関心対象の遺伝子の所望の発現パターンおよび既知のプロモーター/エンハンサーの特定の特性に基づいて選択されうる。したがって、内部プロモーターは構成性プロモーターでありうる。使用されうる構成性プロモーターの非限定的な例としては、ユビキチンのプロモーター, CMV (Karasuyama et al., 1989. J. Exp. Med. 169:13, これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)、β-アクチン(Gunning et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831-4835, これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)ならびにpgk (例えば、Adra et al., 1987. Gene 60:65-74; Singer-Sam et al., 1984. Gene 32:409-417; およびDobson et al., 1982. Nucleic Acids Res. 10:2635-2637を参照されたく, 前記の各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)が挙げられる。
さらに、プロモーターは、遺伝子の誘導性発現を可能にするように選択されうる。テトラサイクリン応答システムおよびlacオペレーター−リプレッサーシステムを含めて、誘導性発現のためのいくつかのシステムが当技術分野において公知である。プロモーターの組み合わせを用いて、関心対象の遺伝子の所望の発現を得ることができることも企図される。当業者は、関心対象の生物および/または標的細胞における遺伝子の所望の発現パターンに基づいてプロモーターを選択することができるであろう。
D. キメラ抗原受容体
本明細書において用いられる「キメラ抗原受容体」(CAR)は、T細胞およびNK細胞のような、免疫エフェクター細胞に抗原に対する所望の特異性を移植することができる操作された受容体をいう。典型的には、CARタンパク質は、所望の特異性を導入する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫エフェクター細胞が抗原に結合するときに免疫エフェクター細胞にシグナルを伝達する細胞内ドメインを含む。ある種の態様において、細胞外ドメインは、リーダーペプチド、抗原認識領域およびスペーサー領域を含む。ある種の態様において、抗原認識領域は、抗原に特異的に結合する抗体に由来する。ある種の態様において、抗原認識領域は、抗体に由来する一本鎖可変断片(scFv)である。ある種の態様において、一本鎖可変断片は、柔軟なリンカーを通して軽鎖可変領域に融合された重鎖可変領域を含む。
本明細書において言及される「リーダーペプチド」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味にしたがって用いられ、約5〜30アミノ酸の長さを有するペプチドをいう。リーダーペプチドは、分泌経路の一部を形成する新しく合成されたタンパク質のN末端に存在する。分泌経路のタンパク質には、ある種の細胞小器官(小胞体、ゴルジもしくはエンドソーム)内に存在するタンパク質、細胞から分泌されるタンパク質、または細胞膜に挿入されるタンパク質が含まれるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、リーダーペプチドは、タンパク質の膜貫通ドメインの一部を形成する。
1つの局面において、本開示は、本明細書において記載される抗原に結合するCARタンパク質を提供する。いくつかの態様において、CARタンパク質はN末端からC末端の方向に、リーダーペプチド、抗抗原重鎖可変ドメイン、リンカードメイン、抗抗原軽鎖可変ドメイン、CD8αヒンジ領域、CD8α膜貫通ドメイン(またはCD28膜貫通ドメイン)、4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン(またはCD28細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、もしくはCD28細胞内共刺激シグナル伝達ドメインとそれに続く4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン)、およびCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、タンパク質はN末端からC末端の方向に、CD8aリーダーペプチド、抗原HuCAR scFV、ヒトCD8aヒンジドメイン、CD28膜貫通ドメイン、ヒトCD3複合体T細胞シグナル伝達ドメインのゼータ(ζ)鎖を含む。
他の態様において、タンパク質はN末端からC末端の方向に、CD8aリーダーペプチド、抗原HuCAR scFV、ヒトCD8aヒンジドメイン、4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよびヒトCD3複合体T細胞シグナル伝達ドメインのゼータ(ζ)鎖を含む。
代替の態様において、タンパク質はN末端からC末端の方向に、CD8aリーダーペプチド、抗原HuCAR scFV、ヒトCD8aヒンジドメイン、4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、CD28膜貫通ドメインおよびヒトCD3複合体T細胞シグナル伝達ドメインのゼータ(ζ)鎖を含む。
別の態様において、タンパク質はN末端からC末端の方向に、リーダーペプチド、抗原重鎖可変ドメイン、リンカードメイン、抗原軽鎖可変ドメイン、ヒトIgG1-CH2-CH3ドメイン、スペーサー領域、CD28膜貫通ドメイン、4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよびヒトCD3複合体T細胞シグナル伝達ドメインのゼータ(ζ)鎖を含む。
いくつかの態様において、核酸は、抗原に結合する抗体からの抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインをコードする。
別の局面において、その態様を含む本明細書において提供される核酸を含む発現ベクターが提供される。別の局面において、その態様を含む本明細書において提供される発現ベクターを含むTリンパ球が提供される。別の局面において、その態様を含む本明細書において提供される発現ベクターを含む哺乳動物細胞が提供される。別の局面において、組み換えタンパク質が提供される。組み換えタンパク質は、(i) 重鎖可変(VH)領域および軽鎖可変(VL)領域により形成される中央空洞であって、フレームワーク領域アミノ酸残基を含むペプチド結合部位を形成する該中央空洞を含む抗体領域; ならびに(ii) 膜貫通ドメインを含む。
別の局面において、組み換えタンパク質が提供される。組み換えタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインを含む第1の部分ならびに抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む第2の部分を含み、ここで第1の部分は膜貫通ドメインをさらに含み、かつここで抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメイン、および抗体軽鎖定常ドメインが一緒になって抗体領域を形成する。
別の局面において、組み換えタンパク質が提供される。組み換えタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインを含む第1の部分ならびに抗体軽鎖可変ドメインを含む第2の部分を含み、ここで第1の部分は膜貫通ドメインをさらに含み、かつここで抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインが一緒になって抗体領域を形成する。
別の局面において、組み換えタンパク質が提供される。組み換えタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体重鎖定常ドメインを含む第1の部分、ならびに抗体軽鎖可変ドメインを含む第2の部分を含み、ここで第1の部分は膜貫通ドメインをさらに含み、かつここで抗体重鎖可変ドメイン、抗体重鎖定常ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインが一緒になって抗体領域を形成する。
別の局面において、組み換えタンパク質が提供される。組み換えタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインを含む第1の部分ならびに抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインを含む第2の部分を含み、ここで第2の部分は膜貫通ドメインをさらに含み、かつここで抗体重鎖可変ドメイン、抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖定常ドメインが一緒になって抗体領域を形成する。
別の局面において、組み換えタンパク質が提供される。組み換えタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインを含む第1の部分および抗体軽鎖可変ドメインを含む第2の部分を含み、ここで第2の部分は膜貫通ドメインをさらに含み、かつここで抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインが一緒になって抗体領域を形成する。
別の局面において、その態様を含めて本明細書において提供される組み換えタンパク質を含む哺乳動物細胞が提供され、ここで膜貫通ドメインは哺乳動物細胞の細胞膜内にある。
いくつかの態様において、膜貫通ドメインはCD8α膜貫通ドメインである。本明細書において提供される「CD8α膜貫通ドメイン」という用語は、CD8αの膜貫通ドメインの組み換え型または天然型のいずれかを含む。いくつかの局面において、変種または相同体は、天然に存在するCD8α膜貫通ドメインポリペプチドと比較して配列の全体または配列の一部分にわたって少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの態様において、CD8α膜貫通ドメインは、
Figure 2021517810
のポリペプチド配列を有する。いくつかの態様において、CD8α膜貫通ドメインは、
Figure 2021517810
の核酸配列によってコードされるタンパク質である。
いくつかの態様において、膜貫通ドメインはCD28膜貫通ドメインである。本明細書において提供される「CD28膜貫通ドメイン」という用語は、CD28の膜貫通ドメインの組み換え型もしくは天然型のいずれか、またはCD28膜貫通ドメイン活性を維持するその変種もしくは相同体を含む。いくつかの局面において、変種または相同体は、天然に存在するCD28膜貫通ドメインポリペプチドと比較して配列の全体または配列の一部分にわたって少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの態様において、CD28膜貫通ドメインは、
Figure 2021517810
のポリペプチド配列を有する。いくつかの態様において、CD28膜貫通ドメインは、
Figure 2021517810
の核酸配列によってコードされるタンパク質である。
いくつかの態様において、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、CD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインである。いくつかの態様において、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3複合体のゼータ(ζ)鎖のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、CD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインである。いくつかの態様において、細胞内T細胞シグナル伝達ドメインは、
Figure 2021517810
の核酸配列によってコードされるタンパク質である。
いくつかの態様において、本明細書において提供される単離された核酸は、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインをコードする細胞内共刺激シグナル伝達配列を含む。本明細書において提供される「細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン」は、その態様を含めて本明細書において提供される抗体領域への抗原の結合に応答して共刺激シグナル伝達を提供することができるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達ドメインのシグナル伝達は、サイトカインの産生およびそれを発現するT細胞の増殖をもたらす。いくつかの態様において、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメインである。いくつかの態様において、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、CD28細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、ICOS細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、OX-40細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、CD28共刺激ドメインは、
Figure 2021517810
のポリペプチド配列を有する。いくつかの態様において、CD28細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、
Figure 2021517810
の核酸配列によってコードされるタンパク質である。いくつかの態様において、4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、
Figure 2021517810
のポリペプチド配列を有する。いくつかの態様において、4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメインは、
Figure 2021517810
の核酸配列によってコードされるタンパク質である。
いくつかの態様において、本明細書において提供される単離された核酸は、スペーサー領域をコードするスペーサー配列を含む。本明細書において提供される「スペーサー領域」は、抗体領域を膜貫通ドメインと接続するか、または抗体領域のさまざまな成分を接続するポリペプチドである。いくつかの態様において、スペーサー領域は、抗体領域と膜貫通ドメインとの間にある。いくつかの態様において、スペーサー領域は、重鎖可変領域を膜貫通ドメインと接続する。いくつかの態様において、スペーサー領域は、重鎖定常領域を膜貫通ドメインと接続する。いくつかの態様において、スペーサー領域は、軽鎖可変領域を膜貫通ドメインと接続する。いくつかの態様において、スペーサー領域は、軽鎖定常領域を膜貫通ドメインと接続する。いくつかの態様において、抗原に対する抗体領域の結合親和性は、スペーサー領域が存在しない場合と比較して増加する。いくつかの態様において、抗体領域と抗原との間の立体障害は、スペーサー領域の存在下で減少する。
いくつかの態様において、スペーサー領域はヒンジ領域を含む。いくつかの態様において、ヒンジ領域はCD8αヒンジ領域である。いくつかの態様において、ヒンジ領域はCD28ヒンジ領域である。
いくつかの態様において、スペーサー領域はFc領域を含む。本明細書において提供される組成物および方法について企図されるスペーサー領域の例としては、非限定的に、免疫グロブリン分子またはその断片(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)およびFc受容体結合に影響を与える変異を含む免疫グロブリン分子またはその断片(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)が挙げられる。いくつかの態様において、スペーサー領域はIgG (例えば、IgG4)の断片であり、ここで該断片はCH2ドメインの欠失を含む。スペーサー領域はペプチドリンカーでありうる。いくつかの態様において、核酸は、スペーサー領域をコードするスペーサー配列を含まない。
いくつかの態様において、スペーサー領域は、抗体領域のさまざまな成分を接続する。いくつかの態様において、スペーサー領域は、重鎖可変領域を軽鎖可変領域と接続する。
いくつかの態様において、本明細書において提供される単離された核酸は、リンカードメインをコードするリンカー配列を含む。いくつかの態様において、リンカードメインはscFvのVHとVLの間に挿入される。いくつかの態様において、リンカードメインは膜貫通ドメインと細胞内T細胞シグナル伝達ドメインとの間にある。いくつかの態様において、リンカードメインは細胞内T細胞シグナル伝達ドメインと細胞内共刺激シグナル伝達ドメインとの間にある。いくつかの態様において、リンカードメインは配列
Figure 2021517810
を含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される単離された核酸は、リンカードメインをコードするリンカー配列を含まない。
いくつかの態様において、核酸は、(i) 重鎖ドメインが可変重鎖ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、タンパク質の重鎖ドメインをコードする重鎖配列; ならびに(ii) 軽鎖ドメインが可変軽鎖ドメインを含む、タンパク質の軽鎖ドメインをコードする軽鎖配列を含み、ここで可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインが一緒になって抗体領域の少なくとも一部分を形成する。
いくつかの態様において、核酸は、(i) 重鎖ドメインが可変重鎖ドメインを含む、タンパク質の重鎖ドメインをコードする重鎖配列; ならびに(ii) 軽鎖ドメインが可変軽鎖ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、タンパク質の軽鎖ドメインをコードする軽鎖配列を含み、ここで可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインが一緒になって抗体領域の少なくとも一部分を形成する。
本明細書において提供される「重鎖配列」は、本明細書において提供される重鎖ドメインをコードする核酸配列をいう。本明細書において提供される重鎖ドメインは、重鎖可変(VH)領域および/または重鎖定常領域(CH)を含みうる。本明細書において提供される「軽鎖配列」は、本明細書において提供される軽鎖ドメインをコードする核酸配列をいう。本明細書において提供される軽鎖ドメインは、軽鎖可変(VL)領域および/または軽鎖定常領域(CL)を含みうる。本明細書にて言及される「重鎖ドメイン」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味にしたがって用いられ、重鎖可変(VH)領域および重鎖定常領域(CH)を含むポリペプチドをいう。本明細書にて言及される「軽鎖ドメイン」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味にしたがって用いられ、軽鎖可変(VL)領域および軽鎖定常領域(CL)を含むポリペプチドをいう。いくつかの態様において、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインは、ヒト化されている。
いくつかの態様において、その態様を含む本明細書において提供されるタンパク質または抗体領域は、抗原に結合する抗体の、例えば、重鎖CDR 1、2、および/もしくは3、ならびに/または軽鎖CDR 1、2、および/もしくは3を含めて、1つの、複数の、または全てのCDR (あるいはCDRと少なくともまたは少なくとも約75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%の同一性を含むCDR)と同じ抗原もしくはエピトープと抗原結合について競合し、その抗原もしくはエピトープに特異的に結合し、および/またはその抗原もしくはエピトープを含む。
いくつかの態様において、核酸は、抗原に結合する抗体からの抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインをコードする。
いくつかの態様において、タンパク質は、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよびCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、タンパク質はアミノ末端からカルボキシル末端の方向に、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよびCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、タンパク質は、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよびCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、タンパク質はアミノ末端からカルボキシル末端の方向に、軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、組み換えタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインを含む第1の部分および抗体軽鎖可変ドメインを含む第2の部分を含む。いくつかの態様において、第1の部分は、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよびCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、第1の部分はアミノ末端からカルボキシル末端の方向に、重鎖可変ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、組み換えタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインを含む第1の部分、ならびに抗体軽鎖可変ドメインを含む第2の部分を含む。いくつかの態様において、第1の部分は、細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよびCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、第1の部分はアミノ末端からカルボキシル末端の方向に、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、タンパク質は、CD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインおよび細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、タンパク質はアミノ末端からカルボキシル末端の方向に、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン、膜貫通ドメイン、CD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン、および細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、組み換えタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインを含む第1の部分および抗体軽鎖可変ドメインを含む第2の部分を含む。いくつかの態様において、第1の部分は、CD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインおよび細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、第1の部分はアミノ末端からカルボキシル末端の方向に、重鎖可変ドメイン、膜貫通ドメイン、CD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン、および細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、組み換えタンパク質は、抗体重鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインを含む第1の部分、ならびに抗体軽鎖可変ドメインを含む第2の部分を含む。いくつかの態様において、第1の部分は、CD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインおよび細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、第1の部分はアミノ末端からカルボキシル末端の方向に、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン、膜貫通ドメイン、CD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメイン、および細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの態様において、単離された核酸はN末端からC末端の方向にタンパク質: リーダーペプチド、抗抗原重鎖可変ドメイン、リンカードメイン、抗抗原軽鎖可変ドメイン、ヒトIgG1-CH2-CH3ドメイン、スペーサー領域、CD28ドメイン、4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインをコードする。
いくつかの態様において、単離された核酸はN末端からC末端の方向にタンパク質: リーダーペプチド、抗抗原重鎖可変ドメイン、リンカードメイン、抗抗原軽鎖可変ドメイン、スペーサー領域、CD28ドメイン、4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインをコードする。
いくつかの態様において、単離された核酸はN末端からC末端の方向にタンパク質: リーダーペプチド、抗抗原重鎖可変ドメイン、リンカードメイン、抗抗原軽鎖可変ドメイン、スペーサー領域、CD28膜貫通、および共刺激ドメイン、ならびにCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインをコードする。
いくつかの態様において、単離された核酸はN末端からC末端の方向にタンパク質: リーダーペプチド、抗抗原重鎖可変ドメイン、リンカードメイン、抗抗原軽鎖可変ドメイン、スペーサー領域、CD8α膜貫通ドメイン(またはCD28膜貫通ドメイン)、4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、およびCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインをコードする。
いくつかの態様において、タンパク質は、N末端からC末端の方向に、
Figure 2021517810
の核酸によってコードされるリーダーペプチド、抗抗原重鎖可変ドメインコード領域、
Figure 2021517810
の核酸によってコードされるリンカードメイン、抗抗原軽鎖可変ドメインコード領域、
Figure 2021517810
の核酸によってコードされるヒンジ領域、SEQ ID NO: 16の核酸によってコードされるCD28ドメイン; SEQ ID NO: 18の核酸によってコードされる4-1BB細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、およびSEQ ID NO: 14の核酸によってコードされるCD3-ζ細胞内T細胞シグナル伝達ドメインを含む。
ある種の態様において、本明細書において提供される抗原CARタンパク質は、抗原に対して高い親和性を実証する。ある種の態様において、本明細書において提供されるCARタンパク質は、1 nM、0.9 nM、0.8 nM、0.7 nM、0.6 nM、0.5 nM、0.4 nM、0.3 nM、0.2 nM、0.1 nM、0.09 nM、0.08 nM、0.07 nM、0.06 nM、または0.05 nM未満の抗原に対する結合親和性(ELISAによって測定されるEC50)を有する。この適用の目的で、ELISA EC50値は次のように判定されうる。抗原-4細胞外ドメインタンパク質(C末端に6 HISタグ付き)をHEK293細胞で組み換え産生し、高結合96ウェルクリアプレート(Corning-Costar, Fisher Scientific)に1 μg/mlの濃度(100 μl/ウェル)で4℃にて14〜16時間コーティングした。コーティングされたプレートをPBS, pH 7.4で簡単に洗浄し、200 μl/ウェルのPBS中5%の脱脂乳で37℃にて2時間ブロッキングした。10 μg/mlから開始して12段階3倍減の用量設定で、試験用モノクローナル抗体(IgGまたはscFv断片)の連続希釈液を結合のため、アッセイプレート上にカバーを付けて37℃で45分インキュベートすることにより96ウェルプレートに加えた。次に、Tween 20 (0.05%濃度)を含有するPBSで3回およびPBSで1回プレートを洗浄した。HRPコンジュゲートを有する抗ヒトもしくは抗ウサギ、または他種IgG特異的抗体の二次抗体(Jackson ImmunoResearch)を製造元が推奨する希釈率にしたがって1時間室温でインキュベーションするために加えた。検出は、HRP基質TMB (ThermoFisher)を10分間添加して行い、50 μl/ウェルの2N H2SO4を添加して停止させた。プレートリーダー(SpectraMax M4, Molecular Devices)を用いて、450 nmの吸光度についてプレートを読み取った。データは、EC50計算のためGrapPad Prism 7ソフトウェアで4パラメータ適合曲線を用いて収集およびグラフ化した。
別の局面において、その態様を含めて本明細書において提供される組み換えタンパク質を含むTリンパ球が提供され、ここで膜貫通ドメインはTリンパ球の細胞膜内にある。
E. ワクチン
がんワクチンは、表1に開示されている抗原のような、抗原性ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または自己もしくは同種の腫瘍細胞組成物もしくは「ワクチン」が対象に投与される能動免疫療法の一形態である。ワクチンは全身に、例えば静脈内にまたは皮内に投与されうる。ワクチンはまた、投与された抗原に対する免疫応答を増強するために複数回投与されうる。
1. アジュバント
同じく当技術分野において周知のように、特定の免疫原性組成物の免疫原性を、アジュバントとして公知の非特異的免疫応答刺激物質の使用によって強化することができる。アジュバントは、免疫原性に乏しい抗原に対する免疫の全般的増加を促進するために実験的に使用されている(例えば、米国特許第4,877,611号)。免疫プロトコルは、長年、応答を刺激するためにアジュバントを使用しており、そのように、アジュバントは、当業者に周知である。一部のアジュバントは、抗原が提示される方法に影響を与える。例えば、免疫応答は、タンパク質抗原をアラムに吸着させると増加する。抗原の乳化も抗原提示の持続期間を延長し、自然免疫応答を開始させる。適当な分子アジュバントには、サイトカイン、毒素または合成組成物などの全ての許容される免疫刺激化合物が含まれる。
いくつかの局面において、本明細書において記載される組成物は、別のアジュバントをさらに含みうる。ミョウバンは、ヒトに対して承認されたアジュバントであるものの、実験動物におけるアジュバントには、フロイント完全アジュバント(結核(Mycobacterium tuberculosis)死菌を含有する、免疫応答の非特異的刺激物質)、フロイント不完全アジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。同じく動物および時にはヒトに使用されうる他のアジュバントには、インターロイキン(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、インターフェロン、カルメット-ゲラン桿菌(Bacillus Calmette-Guerin; BCG)、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド(MDP) (N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン MDP)化合物、例えばthur-MDPおよびnor-MDPなど、リピドA、ならびにモノホスホリルリピドA (MPL)が含まれる。細菌から抽出された3つの成分、MPL、トレハロースジミコレート(TDM)および細胞壁骨格(CWS)を2%スクアレン/Tween 80エマルション中に含有するRIBIも、企図される。MHC抗原でさえ使用されうる。
ヒトに対して承認されている1つの局面において、リン酸緩衝食塩水中に約0.05から約0.1%溶液として使用される、ミョウバンなどの薬剤の使用によってアジュバント効果が達成される。あるいは、実験動物において、抗原は、約0.25%溶液として使用される糖の合成重合体(Carbopol (登録商標))との混合物として作製される。アジュバント効果は、約70℃から約101℃の間の範囲の温度でそれぞれ30秒から2分間熱処理することによってワクチン中の抗原を凝集させることによっても達成されうる。アルブミンに対するペプシン処理(Fab)抗体を用いた再活性化による凝集、C.パルバム(C. parvum)などの細菌細胞、グラム陰性細菌の内毒素もしくはリポ多糖成分との混合、マンニドモノオレエート(Aracel A)などの生理学的に許容される油性ビヒクル中での乳化、またはブロック代替物(block substitute)として使用されるパーフルオロカーボン(Fluosol-DA (登録商標))の20%溶液を用いた乳化も採用されうる。
一部のアジュバント、例えば、細菌から得られたある特定の有機分子は、抗原よりもむしろ宿主に作用する。例は、細菌ペプチドグリカンであるMDPである。大部分のアジュバントのようにMDPの効果は完全には理解されていないとはいえ、現在、MDPが自然免疫系の細胞、例えば樹状細胞、マクロファージ、好中球、NKT細胞、NK細胞などを活性化することが理解され始めている。MDPは、マクロファージを刺激するが、B細胞を直接刺激するようにも見える。したがって、アジュバントの効果は、抗原に非特異的である。しかし、アジュバントが精製抗原と一緒に投与されるならば、それらを、抗原に対する応答を選択的に促進するために使用することができる。
ある種の態様において、ヘモシアニンおよびヘモエリトリンも本開示の組成物において用いられうる。キーホールリンペット由来ヘモシアニン(KLH)の使用は、ある種の態様において用いられるとはいえ、他の軟体動物および節足動物のヘモシアニンおよびヘモエリトリンが採用されうる。
さまざまな多糖アジュバントも使用されうる。例えば、マウスの抗体応答に関するさまざまな肺炎球菌多糖アジュバントの使用が記載されている(Yin et al., 1989)。最適な応答を産生する用量、またはさもなければ抑制を生じない用量を表示のように採用すべきである(Yin et al., 1989)。脱アセチル化キチンを含めたキチンおよびキトサンなどの、多糖のポリアミン異種が特に企図される。
別の群のアジュバントは、ムラミルジペプチド(MDP、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン)群の細菌ペプチドグリカンである。アミノ酸誘導体トレオニル-MDPなどのムラミルジペプチド誘導体、および脂肪酸誘導体ムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミン(MTPPE)も企図される。
米国特許第4,950,645号は、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールから形成される人工リポソームにおける使用について記載されている、ムラミルジペプチドの親油性二糖-トリペプチド誘導体を記載している。これは、ヒト単球の活性化および腫瘍細胞の破壊に有効であるが、一般的に高用量で無毒である。米国特許第4,950,645号およびPCT特許出願である国際公開公報第91/16347号の化合物は、本開示の細胞担体および他の態様での使用のために企図される。
トレハロースジミコレートを有するまたは有さないBCGおよびBCG-細胞壁骨格(CWS)もまた、アジュバントとして使用されうる。トレハロースジミコレート自体が使用されうる。トレハロースジミコレートの投与は、マウスにおけるインフルエンザウイルス感染に対する耐性増強と相関することが示されている(Azuma et al., 1988)。トレハロースジミコレートは、米国特許第4,579,945号に記載されているように調製されうる。BCGは、その免疫刺激特性のおかげで、重要な臨床ツールである。BCGは、細網内皮系(RES)を刺激するように作用し、ナチュラルキラー(NK)細胞を活性化し、造血幹細胞の増殖を増加させる。BCGの細胞壁抽出物は、優れた免疫アジュバント活性を有することが証明されている。マイコバクテリアのための分子遺伝学的ツールおよび方法は、BCGに外来遺伝子を導入するための手段を提供した(Jacobs et al., 1987; Snapper et al., 1988; Husson et al., 1990; Martin et al., 1990)。BCG生菌は、結核を予防するために世界中で使用されている有効で安全なワクチンである。BCGおよび他のマイコバクテリアは、高度に有効なアジュバントであり、マイコバクテリアに対する免疫応答は、広く研究されている。20億回近くの免疫処置が行われて、BCGは、ヒトにおける安全な使用の長期記録を有する(Luelmo, 1982; Lotte et al., 1984)。BCGは、誕生時に与えることができる数少ないワクチンの1つであり、わずか1回の投与で長期間持続する免疫応答を生み、BCGワクチン接種に経験がある世界的流通網がある。例示的なBCGワクチンは、TICE BCG (Organon Inc., West Orange, NJ)として販売されている。
両親媒性薬剤および表面活性薬剤、例えば、QS21 (Cambridge Biotech)などのサポニンおよび誘導体は、本開示の免疫原での使用のための、なお別の群のアジュバントを形成する。非イオン性ブロック共重合体界面活性剤(Rabinovich et al., 1994)も採用されうる。オリゴヌクレオチドは、別の有用な群のアジュバントである(Yamamoto et al., 1988)。Quil Aおよびレンチネン(lentinen)は、本開示のある特定の態様に使用されうる他のアジュバントである。
別の群のアジュバントは、米国特許第4,866,034号の精製および解毒された内毒素などの解毒された内毒素である。これらの精製および解毒された内毒素は、哺乳動物においてアジュバント応答を産生するのに有効である。もちろん、解毒された内毒素を他のアジュバントと組み合わせて、複数のアジュバントを組み入れた細胞が調製されうる。例えば、米国特許第4,435,386号に記載されているように、解毒された内毒素とトレハロースジミコレートとの組み合わせが、特に企図される。解毒された内毒素と、トレハロースジミコレートおよび内毒素性糖脂質との組み合わせも企図されており(米国特許第4,505,899号)、米国特許第4,436,727号、第4,436,728号および第4,505,900号に記載されているような解毒された内毒素と、cCWSまたはCWSおよびトレハロースジミコレートとの組み合わせも同様である。米国特許第4,520,019号に記載されているように、解毒された内毒素を有さないCWSとトレハロースジミコレートとだけの組み合わせも有用であると予想されている。
当業者は、本開示にしたがってワクチンにコンジュゲートすることができ、実験的使用と比べてヒトについて承認されている、異なる種類のアジュバントを知っている。これらには、とりわけ、アルキルリゾリン脂質(ALP); BCG; およびビオチン(ビオチン化誘導体を含む)が含まれる。使用のために特に企図されるある種のアジュバントは、グラム陰性細菌細胞からのテイコ酸である。これらには、リポテイコ酸(LTA)、リビトールテイコ酸(RTA)、およびグリセロールテイコ酸(GTA)が含まれる。それらの合成対応物の活性形態が、本開示の組成物とともに採用される場合もある(Takada et al., 1995)。
さまざまなアジュバントが、ヒトにおいて通例使用されないものであっても、動物においてなお採用されうる。アジュバントは、核酸(例えばDNAまたはRNA)によってコードされうる。そのようなアジュバントは、抗原をコードしている核酸(例えば発現ベクター)または異なるベクターもしくは他のコンストラクトにコードされうることも企図される。アジュバントをコードする核酸を、例えば脂質またはリポソームなどを用いて直接送達することができる。
2. 生物学的応答調節物質(BRM)
アジュバントに加えて、T細胞免疫を上方制御する、またはサプレッサー細胞活性を下方制御することが示されているBRMを同時投与することが望ましい場合がある。そのようなBRMには、シメチジン(CIM；1200 mg/d) (Smith/Kline, PA); 低用量シクロホスファミド(CYP; 300 mg/m2) (Johnson/ Mead, NJ)、サイトカイン、例えばインターフェロン、IL-2、もしくはIL-12、またはB-7などの免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されることはない。さらなる生物学的応答調節物質には、両方とも参照により本明細書に組み入れられるGupta and Kanodia, 2002およびBisht, et al., 2010に記載されているものが含まれる。
3. ケモカイン
ケモカイン、ケモカインをコードする核酸、および/またはそれを発現する細胞も、ワクチン成分として用いられうる。ケモカインは、一般的に、ケモカインの発現部位に免疫エフェクター細胞を動員するための化学誘引物質として作用する。特定のケモカインコード配列を、例えばサイトカインコード配列とともに発現させて、処置部位への他の免疫系成分の動員を強化することが有利でありうる。そのようなケモカインには、例えば、RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β、IP-10、およびその組み合わせが含まれる。ある種のサイトカインは化学誘引効果も有することが公知であり、ケモカインという用語の下に分類することもできることを、当業者は認識するであろう。
4. 免疫原性担体タンパク質
いくつかの態様において、本明細書において記載されるワクチン抗原を担体と化学結合させる、または免疫原性担体ペプチドもしくはポリペプチド(例えば、抗原-担体融合ペプチドもしくはポリペプチド)とともに組み換え発現させて、免疫反応を増強させてもよい。例示的な免疫原性担体アミノ酸配列には、B型肝炎表面抗原(HBSA)、破傷風トキソイド(TT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、およびBSAが含まれる。ヒトでは、TTが、既に承認されたタンパク質ワクチンであるので、有利である。実験動物については、OVA、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンなどの他のアルブミンも、免疫原性担体タンパク質として使用することができる。ポリペプチドまたはペプチドを免疫原性担体タンパク質とコンジュゲートするための手段は、当技術分野において周知であり、それには、例えば、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、およびビス-二アゾ化ベンジジン(bis-biazotized benzidine)が含まれる。
5. 操作された樹状細胞
いくつかの態様において、本開示は樹状細胞(DC)ワクチンに関する。DCワクチンには特定のT細胞免疫を誘導できる抗原提示細胞が含まれ、これは患者またはドナーから採取される。次にDCを、患者においてT細胞が作製されることになる表1のペプチド抗原にインビトロで曝露することができる。次に、抗原が負荷された樹状細胞を患者に注入し戻す。必要に応じて、免疫を複数回繰り返してもよい。樹状細胞を採取、拡張、および投与するための方法は、例えば、Fong et al. (2001)に記載されているように、当技術分野において周知である。DCワクチンは他所に、例えば2006年9月8日付で出願され、「METHOD FOR THE GENERATION OF ANTIGEN-SPECIFIC LYMPHOCYTES」と題された米国特許出願第11/517,814号; 2005年3月2日付で出願され、「ANTIGEN SPECIFIC T CELL THERAPY」と題された米国特許出願第11/071,785号; および2006年6月1日付で出願され、「METHOD OF TARGETED GENE DELIVERY USING VIRAL VECTORS」と題された米国特許出願第11/446,353号にさらに記載されており、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。患者に投与されるDCの典型的な用量には、少なくとも約1000万個の細胞が含まれる。
6. MHCクラスI抗原
MHCクラスIペプチドが細胞性免疫応答を誘引(誘発)するには、MHC分子にも結合する必要がある。このプロセスは、MHC分子の対立遺伝子とペプチドのアミノ酸配列の特定の多型に依存している。したがって、この種のワクチンを検討する場合、MHC抗原プロファイルを患者のMHCプロファイルに一致させることが重要である。
MHCクラスI結合ペプチドは、通常、長さが8〜12アミノ酸残基であり、通常、MHC分子の対応する結合溝と相互作用する2つの保存された残基(「アンカー」)をその配列中に含む。このように、各MHC対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝に特異的に結合できるかを決定する「結合モチーフ」を有する。MHCクラスI依存性免疫反応では、ペプチドは腫瘍細胞によって発現されるある種のMHCクラスI分子に結合できる必要があるだけでなく、その後、特定のT細胞受容体(TCR)を担持するT細胞によって認識される必要もある。
V. 宿主細胞
本開示のある種の態様は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現する免疫細胞に関する。免疫細胞は、T細胞(例えば、調節性T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、もしくはγ-δT細胞)、ナチュラルキラー(NK)細胞、インバリアントNK細胞、またはNKT細胞でありうる。免疫細胞を産生および操作する方法、ならびに養子細胞療法のために細胞を使用および投与する方法も本明細書において提供され、この場合、細胞は自家または同種異系でありうる。したがって、免疫細胞は、がん細胞を標的とするなどの免疫療法として用いられうる。
免疫細胞は、対象、特にヒト対象から単離されうる。免疫細胞は、特定の疾患もしくは状態を有することが疑われる対象、特定の疾患もしくは状態に対する素因を有することが疑われる対象、特定の疾患もしくは状態の治療を受けている対象、健常ボランティアもしくは健常ドナーである対象のような、関心対象の対象から、または血液バンクから得ることができる。免疫細胞は、限定されるものではないが、血液、臍帯血、脾臓、胸腺、リンパ節、および骨髄を含む、対象中に存在する任意の場所から集めることができる。単離された免疫細胞は、直接使用されてもよく、または例えば凍結によって、所定期間保存することができる。
免疫細胞は、限定されるものではないが、血液(血液バンクまたは臍帯血バンクから集められた血液を含む)、外科手術中に除去および/または露出した脾臓、骨髄、組織、ならびに生検手順によって得られた組織を含め、免疫細胞が存在する任意の組織から濃縮/精製されうる。免疫細胞が濃縮され、単離され、および/または精製される組織/臓器は、生物対象および非生物対象の両方から単離されてもよく、ここで非生物対象は臓器ドナーである。特定の態様において、免疫細胞は末梢血または臍帯血のような、血液から単離される。いくつかの局面において、臍帯血から単離される免疫細胞は、CD4陽性またはCD8陽性のT細胞抑制によって測定されるように、向上した免疫調節能を有する。具体的な局面において、免疫細胞は、免疫調節能の増強のために、プールされた血液から、特にプールされた臍帯血から単離される。プールされた血液は、3、4、5、6、7、8、9、10名、またはそれ以上の供給源(例えば、ドナー対象)のような、2名またはそれ以上の供給源に由来しうる。
免疫細胞の集団は、治療を必要とする対象、または免疫細胞活性の低減に関連する疾患を患う対象から得ることができる。したがって、細胞は、治療を必要とする対象に対して自家であろう。あるいは、免疫細胞の集団は、組織適合性が一致したドナーのような、ドナーから得ることができる。免疫細胞集団は、末梢血、臍帯血、骨髄、脾臓、または免疫細胞が対象もしくはドナーに存在する任意の他の臓器/組織から採取することができる。免疫細胞は、対象および/またはドナーのプールから、例えばプールされた臍帯血から単離することができる。
免疫細胞の集団が対象とは異なるドナーから得られる場合、ドナーは同種異系でありうるが、ただし得られた細胞は、対象に導入できるという点で対象に適合性である。同種異系ドナー細胞は、ヒト白血球抗原(HLA)適合性であってもよく、または適合性でなくてもよい。対象に適合させるために、同種異系細胞を処理して免疫原性を低減させることができる。
A. T細胞
いくつかの態様において、免疫細胞はT細胞である。機能的な抗腫瘍エフェクター細胞の誘導、活性化および拡張のためのいくつかの基本的なアプローチが、過去20年間に記載されてきた。これらには、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のような、自家細胞; 自家DC、リンパ球、人工抗原提示細胞(APC)またはT細胞リガンドおよび活性化抗体でコーティングされたビーズ、または標的細胞膜を捕捉することによって単離された細胞を用いてエクスビボで活性化されたT細胞; 抗宿主腫瘍T細胞受容体(TCR)を天然に発現する同種異系細胞; ならびに「Tボディ」として知られる抗体様腫瘍認識能を示す腫瘍反応性TCRまたはキメラTCR分子を発現するように遺伝的に再プログラム化または「再指令された」腫瘍特異的ではない自家細胞または同種異系細胞が含まれる。これらのアプローチは、本明細書において記載される方法で用いることができるT細胞の調製および免疫化のための多数のプロトコルを生み出した。
いくつかの態様において、T細胞は、血液、骨髄、リンパ、臍帯、またはリンパ器官に由来する。いくつかの局面において、細胞はヒト細胞である。細胞は典型的には、対象から直接単離されたもの、および/または対象から単離されて凍結されたものなどの初代細胞である。いくつかの態様において、細胞には、T細胞または他の細胞型の1つまたは複数のサブセット、例えば全T細胞集団、CD4+細胞、CD8+細胞、およびそれらの亜集団、例えば機能、活性化状態、成熟度、分化、拡張、再循環、局在化の可能性および/もしくは持続能、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の臓器もしくは区画における存在、マーカーもしくはサイトカイン分泌プロファイル、ならびに/または分化の程度によって定義されるものが含まれる。処置される対象に関して、細胞は同種異系および/または自家でありうる。いくつかの局面において、例えば既製の技術の場合、細胞は多能性および/または多分化能であり、例えば、人工多能性幹細胞(iPSC)のような、幹細胞である。いくつかの態様において、この方法は、本明細書において記載されるように、対象から細胞を単離する段階、それらを調製する段階、処理する段階、培養する段階、および/または操作する段階、ならびに凍結保存の前または後に、それらを同じ患者に再導入する段階を含む。
T細胞(例えば、CD4+および/またはCD8+ T細胞)のサブタイプおよび亜集団の中には、ナイーブT (TN)細胞、エフェクターT細胞(TEFF)、記憶T細胞およびそれらのサブタイプ、例えば幹細胞記憶T (TSCM)、中央記憶T (TCM)、エフェクター記憶T (TEM)、または最終分化エフェクター記憶T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、未成熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT (MAIT)細胞、自然発生および適応調節性T (Treg)細胞、ヘルパーT細胞、例えばTH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞、アルファ/ベータT細胞、ならびにデルタ/ガンマT細胞がある。
いくつかの態様において、1つまたは複数のT細胞集団は、表面マーカーのような、特定のマーカーに対して陽性であるか、または特定のマーカーに対して陰性である細胞が濃縮されているか、または枯渇している。場合によっては、そのようなマーカーは、T細胞のある種の集団(例えば、非記憶細胞)に存在しないか、または比較的低いレベルで発現されるが、しかしT細胞のある種の他の集団(例えば、記憶細胞)に存在するか、または比較的高いレベルで発現されるものである。
いくつかの態様において、T細胞は、B細胞、単球、またはCD14のような、他の白血球などの、非T細胞上に発現されるマーカーの陰性選択によってPBMCサンプルから分離される。いくつかの局面において、CD4+またはCD8+選択段階は、CD4+ヘルパーおよびCD8+細胞傷害性T細胞を分離するために用いられる。そのようなCD4+およびCD8+集団は、1つまたは複数のナイーブ、記憶、および/またはエフェクターT細胞亜集団にて発現されるまたは比較的高度に発現されるマーカーの陽性または陰性選択により亜集団にさらに分類することができる。
いくつかの態様において、CD8+ T細胞は、例えばそれぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく陽性または陰性選択によって、ナイーブ、中央記憶、エフェクター記憶、および/または中央記憶幹細胞の濃縮または枯渇がさらに行われる。いくつかの態様において、中央記憶T (TCM)細胞の濃縮は、投与後の長期生存、拡張、および/または生着を改善するためになど、有効性を高めるために実行され、これはいくつかの局面において、そのような亜集団で特に確かである。Terakura et al. (2012); Wang et al. (2012)を参照されたい。
いくつかの態様において、T細胞は自家T細胞である。この方法では、腫瘍サンプルが患者から得られ、単細胞懸濁液が得られる。単細胞懸濁液は、任意の適当な方法で、例えば、機械的に(例えば、gentleMACS(商標) Dissociator, Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.を用いて腫瘍をバラバラにする)または酵素的に(例えば、コラゲナーゼもしくはDNase)得ることができる。腫瘍酵素消化物の単細胞懸濁液を、インターロイキン-2 (IL-2)中で培養する。細胞はコンフルエントまで(例えば、約2×106個のリンパ球)、例えば、約5〜約21日、例えば約10日〜約14日培養される。例えば、細胞は5日、5.5日または5.8日〜21日、21.5日または21.8日、例えば10日、10.5日または10.8日〜14日、14.5日または14.8日培養されうる。
培養されたT細胞をプールし、急速に拡張させることができる。急速な拡張は、約10日〜約14日の期間にわたり、少なくとも約50倍(例えば、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、もしくは100倍またはそれ以上)の抗原特異的T細胞の数の増加を提供する。急速な拡張は、約10日〜約14日の期間にわたり、少なくとも約200倍(例えば、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、またはそれ以上)の増加を提供することができる。
拡張は、当技術分野において公知であるように、いくつかの方法のいずれかによって達成することができる。例えば、T細胞は、フィーダーリンパ球およびインターロイキン-2 (IL-2)またはインターロイキン-15 (IL-15)のいずれかの存在下で非特異的T細胞受容体刺激を用いて急速に拡張させることができ、IL-2が特に企図されている。非特異的T細胞受容体刺激は、30 ng/ml前後のOKT3、つまりマウスモノクローナル抗CD3抗体(Ortho-McNeil(登録商標), Raritan, N.J.から入手可能)を含むことができる。あるいは、T細胞は、がんの1つまたは複数の抗原(エピトープのような、その抗原部分、または細胞を含む)でのインビトロにおける末梢血単核細胞(PBMC)の刺激により急速に拡張させることができ、これは、例えばヒト白血球抗原A2 (HLA-A2)結合ペプチドなど、300 IU/ml IL-2またはIL-15のような、T細胞成長因子の存在下において、ベクターから任意で発現されてもよく、IL-2が企図されている。インビトロで誘導されたT細胞は、HLA-A2を発現する抗原提示細胞にパルスされたがんの同じ抗原での再刺激によって急速に拡張される。あるいは、T細胞は、例えば照射された自家リンパ球で、または照射されたHLA-A2+同種異系リンパ球およびIL-2で再刺激することができる。
自家T細胞は、自家T細胞の成長および活性化を促進するT細胞成長因子を発現するように改変することができる。適当なT細胞成長因子には、例えば、インターロイキン(IL)-2、IL-7、IL-15、およびIL-12が含まれる。適当な改変方法は、当技術分野において公知である。例えば、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001; およびAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994を参照されたい。特定の局面において、改変された自家T細胞は、T細胞成長因子を高レベルで発現する。IL-12のものなどの、T細胞成長因子コード配列は、プロモーターと同様に、当技術分野において容易に利用可能であり、そのプロモーターのT細胞成長因子コード配列への機能的な連結は、高レベルの発現を促進する。
B. NK細胞
いくつかの態様において、免疫細胞はナチュラルキラー(NK)細胞である。ナチュラルキラー(NK)細胞は、種々の腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、および骨髄と胸腺の一部の正常細胞に対して自発的な細胞毒性を有するリンパ球の亜集団である。NK細胞は、形質転換細胞およびウイルス感染細胞に対する初期の自然免疫応答の重要なエフェクターである。NK細胞はヒト末梢血中のリンパ球の約10%を構成する。リンパ球をインターロイキン2 (IL-2)の存在下において培養すると、強い細胞毒性反応性が発現する。NK細胞は、サイズが大きく、細胞質に特徴的なアズール顆粒が存在するため、大顆粒リンパ球として知られるエフェクター細胞である。NK細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、および胸腺において分化および成熟する。NK細胞は、ヒトにおいてCD16、CD56、およびCD8のような、特定の表面マーカーによって検出することができる。NK細胞は、T細胞抗原受容体、pan TマーカーCD3、または表面免疫グロブリンB細胞受容体を発現しない。
NK細胞の刺激は、細胞表面の活性化受容体および阻害性受容体に由来するシグナルのクロストークによって達成される。NK細胞の活性化状態は、一連の生殖細胞系列にコードされた活性化受容体および阻害性受容体から受けた細胞内シグナルのバランスによって調節される。NK細胞が異常な細胞(例えば、腫瘍またはウイルス感染細胞)に遭遇し、活性化シグナルが優位である場合、NK細胞は、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒の直接的分泌またはデスドメインを含有する受容体の関与を通じて、標的細胞のアポトーシスを迅速に誘導することができる。活性化されたNK細胞は、インターフェロン-γ、腫瘍壊死因子-α、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)のような、I型サイトカインを分泌することもでき、これによって自然免疫細胞と適応免疫細胞の両方、ならびに他のサイトカインを活性化する。初期の自然免疫応答におけるNK細胞によるこれらの可溶性因子の産生は、他の造血細胞の動員と機能に大きく影響する。また、NK細胞は、物理的な接触とサイトカインの産生を通じて、免疫応答を促進または抑制する樹状細胞および好中球との調節クロストークネットワークの中心的なプレーヤーでもある。
ある種の態様において、NK細胞は、当技術分野において周知の方法によりヒト末梢血単核細胞(PBMC)、刺激されていない白血球アフェレーシス産物(PBSC)、ヒト胚性幹細胞(hESC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、骨髄、または臍帯血に由来する。特に、臍帯CBはNK細胞を導出するために用いられる。ある種の局面において、NK細胞は、NK細胞のエクスビボ拡張の既述された方法によって単離および拡張される(Spanholtz et al., 2011; Shah et al., 2013)。この方法では、CB単核細胞は、フィコール密度勾配遠心分離により単離され、IL-2および人工抗原提示細胞(aAPC)を有するバイオリアクタ内で培養される。7日後、細胞培養物は、CD3を発現する細胞が枯渇し、さらに7日間再培養される。細胞は再びCD3が枯渇し、CD56+/CD3-細胞またはNK細胞の割合を決定するために特徴付けられる。他の方法では、臍帯CBを用いて、CD34+細胞の単離ならびにSCF、IL-7、IL-15、およびIL-2を含有する培地中で培養することによるCD56+/CD3-細胞への分化によりNK細胞を導出する。
C. 宿主細胞の操作
免疫細胞(例えば、自家または同種異系T細胞(例えば、調節性T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞またはγ-δT細胞)、NK細胞、インバリアントNK細胞、またはNKT細胞は、操作されたTCRおよび/またはキメラ抗原受容体(CAR)のような抗原受容体を発現するように遺伝子操作することができる。例えば、宿主細胞(例えば、自家または同種異系T細胞)は、がん抗原に対する抗原特異性を有するT細胞受容体(TCR)を発現するように改変される。特定の態様において、NK細胞は、TCRを発現するように操作される。NK細胞は、CARを発現するようにさらに操作されうる。異なる抗原などに対する複数のCARおよび/またはTCRは、T細胞またはNK細胞のような、単一の細胞型に加えられうる。
適当な改変方法は当技術分野において公知である。例えば、Sambrook and Ausubel, 前記を参照されたい。例えば、細胞は、Heemskerk et al. (2008)およびJohnson et al. (2009)に記載されている形質導入技法を用いて、がん抗原に対する抗原特異性を有するT細胞受容体(TCR)を発現するように形質導入されうる。
いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の抗原受容体をコードする遺伝子操作を介して導入された1つまたは複数の核酸/発現コンストラクト/ベクター、ならびにそのような核酸の遺伝子操作された産物を含む。いくつかの態様において、核酸は異種であり、すなわち、通常、細胞または細胞から得られたサンプル、例えば、操作されている細胞および/またはそのような細胞が由来する生物には通常見られない、別の生物または細胞から得られたものには存在しない。いくつかの態様において、核酸は、自然界には見られない核酸(例えば、キメラ)など、天然には存在しない。
T細胞へのベクターの送達は上で論じられており、その議論は参照により本明細書に含まれる。
VI. 使用方法
A. 処置
いくつかの態様において、本開示は、本開示の免疫細胞の有効量を投与する段階を含む免疫療法のための方法を提供する。1つの態様において、医学的疾患または障害は、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の移入によって処置される。本開示のある種の態様において、がんは、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の移入によって処置される。本明細書において提供されるのは、抗原特異的細胞療法の有効量を個体に投与する段階を含む、個体におけるがんの進行を処置するまたは遅延させるための方法である。本発明の方法は、免疫障害、固形がん、または血液がんの処置に適用されうる。
本開示のある種の態様において、免疫細胞は、がんを有する個体のような、それを必要とする個体に送達される。この細胞はその後、個体の免疫系を増強して、それぞれのがん細胞を攻撃する。場合によっては、個体に免疫細胞の1回または複数回の用量が提供される。個体に免疫細胞の2回またはそれ以上の用量が提供される場合、投与間の期間は、個体における増殖のための時間を与えるのに十分でなければならず、具体的な態様において、用量間の期間は1、2、3、4、5、6、7、またはそれ以上の日数である。
ある種の態様において、免疫細胞の成長および活性化を促進する成長因子が、免疫細胞と同時に、または免疫細胞の後に対象に投与される。免疫細胞成長因子は、免疫細胞の成長および活性化を促進する任意の適当な成長因子でありうる。適当な免疫細胞成長因子の例としては、インターロイキン(IL)-2、IL-7、IL-15、およびIL-12が挙げられ、これらは単独でまたはさまざまな組み合わせで、例えばIL-2およびIL-7、IL-2およびIL-15、IL-7およびIL-15、IL-2、IL-7およびIL-15、IL-12およびIL-7、IL-12およびIL-15、またはIL-12およびIL2で用いることができる。
治療的有効量の免疫細胞は、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、または関節内注射、または注入を含むいくつかの経路によって投与することができる。
免疫細胞集団は、疾患と一致する処置レジメン、例えば、疾患状態を改善するための1日から数日間にわたる単回もしくは数回の用量、または疾患の進行を阻害し、疾患の再発を予防するための長期間にわたる定期的な用量で投与することができる。処方物において採用される正確な用量は、投与の経路、および疾患または障害の重症度にも依存し、実践者の判断および各患者の状況に応じて判定されるべきである。治療的に有効な免疫細胞数は、処置される対象、苦痛の重症度およびタイプ、ならびに投与の方法に依存するであろう。いくつかの態様において、ヒト対象の処置において使用できる用量は、少なくとも3.8×104、少なくとも3.8×105、少なくとも3.8×106、少なくとも3.8×107、少なくとも3.8×108、少なくとも3.8×109、または少なくとも3.8×1010個の免疫細胞/m2に及ぶ。ある種の態様において、ヒト対象の処置において用いられる用量は、約3.8×109から約3.8×1010個の免疫細胞/m2に及ぶ。さらなる態様において、治療的に有効な免疫細胞数は、体重1 kgあたり約5×106個の細胞から体重1 kgあたり約7.5×108個の細胞、例えば体重1 kgあたり約2×107個の細胞から約5×108個の細胞、または体重1 kgあたり約5×107個の細胞から約2×108個の細胞まで変化しうる。免疫細胞の正確な数は、対象の年齢、体重、性別、および生理学的状態に基づき当業者によって容易に判定される。有効な用量は、インビトロまたは動物モデルの試験システムから得られた用量応答曲線から推定することができる。
B. 薬学的組成物
免疫細胞(例えばT細胞、CAR-T細胞、樹状細胞またはNK細胞)および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物および処方物も本明細書において提供される。
本明細書に記載される薬学的組成物および処方物は、所望の程度の純度を有する活性成分(例えば抗体またはポリペプチド)を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012)と混合することにより、調製することができる。薬学的に許容される担体は、一般的に、使用される用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、緩衝液、例えばホスフェート、シトレート、および他の有機酸; アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤; 防腐剤、例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド; ヘキサメトニウムクロリド; 塩化ベンザルコニウム; 塩化ベンゼトニウム; フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール; アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン; カテコール; レゾルシノール; シクロヘキサノール; 3-ペンタノール; およびm-クレゾール); 低分子量(約10残基未満)ポリペプチド; タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン; 親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン; アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン; グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物; キレート化剤、例えばEDTA; 糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール; 塩形成対イオン、例えばナトリウム; 金属錯体(例えば亜鉛-タンパク質錯体); および/または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(PEG)を含むが、これらに限定されることはない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば可溶性中性-活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、ヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrHuPH20 (HYLENEX(登録商標), Baxter International, Inc.)をさらに含む。rHuPH20を含む、ある種の例示的なsHASEGPおよび使用方法は、米国特許出願公開第2005/0260186号および同第2006/0104968号に記載されている。1つの局面において、sHASEGPはコンドロイチナーゼのような1つまたは複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
C. 併用療法
ある種の態様において、本発明の態様の組成物および方法は、少なくとも1つのさらなる治療法と組み合わせた免疫細胞集団を伴う。さらなる治療法は、放射線療法、手術(例えば、乳腺腫瘍摘出術および乳房切除術)、化学療法、遺伝子治療法、DNA療法、ウイルス療法、RNA療法、免疫療法、骨髄移植、ナノセラピー、モノクローナル抗体療法、または前記の組み合わせでありうる。さらなる治療法は、アジュバントまたはネオアジュバント療法の形態でありうる。
いくつかの態様において、さらなる治療法は、小分子酵素阻害剤または転移抑制剤の投与である。いくつかの態様において、さらなる治療法は、副作用を減じる薬剤(例えば、制吐剤などのような、処置の副作用の発生および/または重篤度を減少させることを意図した薬剤)の投与である。いくつかの態様において、さらなる治療法は、放射線療法である。いくつかの態様において、さらなる治療法は手術である。いくつかの態様において、さらなる治療法は、放射線療法および手術の組み合わせである。いくつかの態様において、さらなる治療法はγ線照射である。いくつかの態様において、さらなる治療法は、PBK/AKT/mTOR経路を標的とする治療法、HSP90阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、および/または化学予防剤である。さらなる治療法は、当技術分野において公知の1つまたは複数の化学療法剤でありうる。
免疫細胞療法は、免疫チェックポイント治療法のような、さらなるがん療法前に、途中に、後に、またはさまざまな組み合わせで投与されうる。投与は、同時から数分、数日、数週までの範囲の間隔でなされうる。免疫細胞療法が、さらなる治療剤とは別に、患者へ提供されるいくつかの態様において、一般に、2種の化合物が患者において有利に組み合わせられた効果を発揮することができるよう、各送達の時間の間に有意な期間が経過しないことが確実にされるであろう。そのような状況において、相互に約12〜24または72時間以内、より具体的には、相互に約6〜12時間以内に、抗体療法および抗がん療法が患者に提供されうることが企図される。いくつかの状況において、処置の期間を有意に延長し、数日(2日、3日、4日、5日、6日、または7日)〜数週(1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、または8週)がそれぞれの投与の間に空くことが望ましい場合もある。
さまざまな組み合わせが利用されうる。下記の例について、免疫細胞療法は「A」であり、抗がん療法は「B」である。
Figure 2021517810
本発明の態様のいずれかの化合物または治療法の患者への投与は、もしあれば、薬剤の毒性を考慮に入れて、そのような化合物の投与のための一般プロトコルに従うであろう。従って、いくつかの態様において、組み合わせ治療に起因する毒性をモニタリングする段階が存在する。
1. 化学療法
多様な化学療法剤が、本発明の態様によって用いられうる。「化学療法」という用語は、がんを処置するための薬物の使用をいう。「化学療法剤」とは、がんの処置において投与される化合物または組成物を暗示するために用いられる。これらの薬剤または薬物は、細胞内での活性モード、例えば、細胞周期に影響を与えるか否か、およびどの期において影響を与えるかによって分類される。あるいは、薬剤は、DNAを直接架橋する能力、DNAへインターカレートする能力、または核酸合成に影響を与えることによって染色体および有系分裂の異常を誘導する能力に基づき、特徴決定されうる。
化学療法剤の例としては、チオテパおよびシクロホスファミドのようなアルキル化剤; ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンのようなアルキルスルホネート; ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ(meturedopa)、およびウレドパ(uredopa)のようなアジリジン; アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチロールメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン(methylamelamine); アセトゲニン(具体的には、ブラタシンおよびブラタシノン); カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む); ブリオスタチン; カリスタチン; CC-1065(その合成類似体アドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシンを含む); クリプトフィシン(具体的には、クリプトフィシン1およびクリプトフィシン8); ドラスタチン; デュオカルマイシン(合成類似体KW-2189およびCB1-TM1を含む); エリュテロビン; パンクラチスタチン; サルコジクチイン; スポンギスタチン; クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード; カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンのようなニトロソウレア; エンジイン抗生物質(例えば、カリチアマイシン、具体的には、カリチアマイシンγ1IおよびカリチアマイシンωI1)のような抗生物質; ジネミシンAを含むジネミシン; クロドロン酸のようなビスホスホネート; エスペラミシン; ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンCのようなマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシン; メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル(5-FU)のような代謝拮抗薬; デノプテリン、プテロプテリン(pteropterin)、およびトリメトトレキサートのような葉酸類似体; フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニンのようなプリン類似体; アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジンのようなピリミジン類似体; カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトンのようなアンドロゲン; ミトタンおよびトリロスタンのような抗副腎薬; フォリン酸のような葉酸補充薬; アセグラトン; アルドホスファミド配糖体; アミノレブリン酸; エニルウラシル; アムサクリン; ベストラブシル; ビサントレン; エダトレキサート; デフォファミン(defofamine); デメコルチン; ジアジクオン; エルフォルミチン(elformithine); エリプチニウム酢酸塩; エポチロン; エトグルシド; ガリウム硝酸塩; ヒドロキシ尿素; レンチナン; ロニダミン; マイタンシンおよびアンサミトシンのようなマイタンシノイド; ミトグアゾン; ミトキサントロン; モピダンモール(mopidanmol); ニトラクリン; ペントスタチン; フェナメット; ピラルビシン; ロソキサントロン; ポドフィリン酸; 2-エチルヒドラジド; プロカルバジン; PSK多糖複合体; ラゾキサン; リゾキシン; シゾフィラン; スピロゲルマニウム; テヌアゾン酸; トリアジコン; 2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン; トリコテシン(具体的には、T-2毒素、ベラキュリン(verracurin)A、ロリジンA、およびアングイジン); ウレタン; ビンデシン; ダカルバジン; マンノムスチン; ミトブロニトール; ミトラクトール; ピポブロマン; ガシトシン(gacytosine); アラビノシド(「Ara-C」); シクロホスファミド; タキソイド、例えば、パクリタキセル、ドセタキセルゲムシタビン; 6-チオグアニン; メルカプトプリン; シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンのような白金配位化合物; ビンブラスチン; 白金; エトポシド(VP-16); イホスファミド; ミトキサントロン; ビンクリスチン; ビノレルビン; ノバントロン; テニポシド; エダトレキサート; ダウノマイシン; アミノプテリン; ゼローダ; イバンドロン酸; イリノテカン(例えば、CPT-11); トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000; ジフルオロメチルオルニチン(DMFO); レチノイン酸のようなレチノイド; カペシタビン; カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン(plicomycin)、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナム(transplatinum)、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
2. 放射線療法
広範囲に使用されているDNA傷害を引き起こす他の因子には、γ線、X線として一般的に公知のもの、および/または放射性同位体の腫瘍細胞への定方向送達が含まれる。マイクロ波、陽子線照射(米国特許第5,760,395号および同第4,870,287号)、ならびにUV照射のようなDNA傷害因子の他の型も企図される。これらの因子は、全て、DNA、DNAの前駆物質、DNAの複製および修復、ならびに染色体の組み立ておよび維持に対して広範囲の傷害を与えるであろう。X線の線量範囲は、長期間(3〜4週)にわたる50〜200レントゲンの1日線量から、2000〜6000レントゲンの単回線量までの範囲である。放射性同位体の投与量範囲は、広く変動し、同位体の半減期、放射される放射線の強度および型、ならびに新生物細胞による取り込みに依る。
3. 免疫療法
当業者は、本態様の方法と組み合わせてまたは併せて、さらなる免疫療法が使用されてもよいことを理解するであろう。がん処置の状況において、免疫療法薬は、一般に、がん細胞を標的とし破壊するため、免疫エフェクター細胞および免疫エフェクター分子の使用に頼る。リツキシマブ(リツキサン(RITUXAN)(登録商標))は、一つのそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体でありうる。抗体は、単独で、治療のエフェクターとして機能することもできるし、または細胞死滅に実際に影響を与える他の細胞を動員することもできる。抗体は、薬物または毒素(化学療法薬、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等)にコンジュゲートされ、ターゲティング剤として機能することもできる。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を保持するリンパ球でありうる。さまざまなエフェクター細胞には、細胞傷害性T細胞およびNK細胞が含まれる。
抗体-薬物コンジュゲートは、がん治療法の開発への画期的なアプローチとして出現した。がんは世界中において、主な死因の1つである。抗体-薬物コンジュゲート(ADC)は、細胞を死滅させる薬物に共有結合したモノクローナル抗体(MAb)を含む。このアプローチは、MAbのそれらの抗原標的に対する高い特異性と、高度に強力な細胞傷害性薬物とを組み合わせており、ペイロード(薬物)を豊富なレベルの抗原とともに腫瘍細胞に送達する「武装した」MAbをもたらす。薬物の標的指向性送達はまた、正常組織中への薬物の曝露を最小限にし、毒性の軽減および治療指標の改善をもたらす。2つのADC薬物の認可、FDAにより2011年に認可されたADCETRIS(登録商標)(ブレンツキシマブベドチン)および2013年に認可されたKADCYLA(登録商標)(トラスツズマブエムタンシンまたはT-DM1)は、このアプローチを確証している。現在、30種を超えるADC薬物候補が、がん処置のための臨床試験のさまざまな段階にある(Leal et al., 2014)。抗体工学およびリンカー−ペイロード最適化がますます成熟しているために、新たなADCの創薬および開発は、このアプローチとターゲティングMAbの作製とに適した新たな標的の同定および検証に大いに依存する。ADC標的についての2つの基準は、腫瘍細胞における上方制御された/高いレベルの発現および頑強な内部移行である。
免疫療法の1つの局面において、腫瘍細胞は、ターゲティングが可能な、すなわち、他の細胞の大部分に存在しない、何らかのマーカーを保持していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在しており、これらのいずれかは、本発明の態様の状況においてターゲティングのために適当でありうる。一般的な腫瘍マーカーには、CD20、がん胎児性抗原、チロシナーゼ(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、ラミニン受容体、erb B、およびp155が含まれる。免疫療法の別の局面は、抗がん効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。以下のものを含む免疫刺激分子も存在する: IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γIFNのようなサイトカイン、MIP-1、MCP-1、IL-8のようなケモカイン、およびFLT3リガンドのような増殖因子。
現在調査中または使用中の免疫治療の例は、免疫アジュバント、例えば、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物(米国特許第5,801,005号および同第5,739,169号; Hui and Hashimoto,1998; Christodoulides et al.,1998); サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、およびγ、IL-1、GM-CSF、ならびにTNF (Bukowski et al.,1998; Davidson et al.,1998; Hellstrand et al.,1998); 遺伝子治療法、例えば、TNF、IL-1、IL-2、およびp53 (Qin et al.,1998; Austin-Ward and Villaseca,1998; 米国特許第5,830,880号および同第5,846,945号); ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗CD20、抗ガングリオシドGM2、および抗p185 (Hollander,2012; Hanibuchi et al.,1998; 米国特許第5,824,311号)である。1種または複数種の抗がん療法は、本明細書に記載された抗体療法とともに利用されうることが企図される。
いくつかの態様において、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤でありうる。免疫チェックポイントは、シグナル(例えば、共刺激分子)を上げるか、またはシグナルを下げる。免疫チェックポイント遮断によって標的とされうる阻害性免疫チェックポイント分子には、アデノシンA2A受容体(A2AR)、B7-H3 (CD276としても公知)、BおよびTリンパ球アテニュエータ(BTLA)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4、CD152としても公知)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)、キラー細胞免疫グロブリン(KIR)、リンパ球活性化遺伝子-3 (LAG3)、プログラム細胞死1 (PD-1)、T細胞免疫グロブリンドメイン、およびムチンドメイン3 (TIM-3)、ならびにT細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)が含まれる。具体的には、免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1 軸および/またはCTLA-4を標的とする。
免疫チェックポイント阻害剤は、低分子などの薬物、リガンドもしくは受容体の組み換え形態、またはヒト抗体などの抗体であってもよい(例えば、国際特許公開第WO2015016718号; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12（4）: 252-64, 2012を参照、これら両方とも参照により本明細書に組み入れられる)。免疫チェックポイントタンパク質またはその類似体の公知の阻害剤が用いられてもよく、特に、抗体のキメラ化形態、ヒト化形態、またはヒト形態が用いられうる。当業者は、代替名および/または同等名が本開示において言及されたある特定の抗体について使われてもよいことを理解している。そのような代替名および/または同等名は、本発明の文脈において互換可能である。例えば、ランブロリズマブは代替名および同等名MK-3475およびペムブロリズマブでも知られていることが公知である。
いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストは、PD-1の、そのリガンド結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の局面において、PD-1リガンド結合パートナーは、PDL1および/またはPDL2である。別の態様において、PDL1結合アンタゴニストは、PDL1の、その結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の局面において、PDL1結合パートナーはPD-1および/またはB7-1である。別の態様において、PDL2結合アンタゴニストは、PDL2の、その結合パートナーとの結合を阻害する分子である。特定の局面において、PDL2結合パートナーはPD-1である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであってもよい。例示的抗体は、それらの全てが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,735,553号、同第8,354,509号、および同第8,008,449号に記載される。本明細書において提供される方法で使用するための他のPD-1軸アンタゴニストは、それらの全てが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第20140294898号、同第2014022021号、および同第20110008369号に記載されるものなど、当技術分野において公知である。
いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストは抗PD-1抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)である。いくつかの態様において、抗PD-1抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびCT-011からなる群より選択される。いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン(例えば、定常領域(例えば、免疫グロブリン配列のFc領域)に融合させたPDL1またはPDL2の細胞外部分またはPD-1結合部分を含むイムノアドヘシン)である。いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストはAMP-224である。ニボルマブは、MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558、およびOPDIVO(登録商標)としても公知である、WO2006/121168に記載の抗PD-1抗体である。ペムブロリズマブは、MK-3475、Merck 3475、ランブロリズマブ、KEYTRUDA(登録商標)、およびSCH-900475としても公知である、WO2009/114335に記載の抗PD-1抗体である。CT-011は、hBATまたはhBAT-1としても公知である、WO2009/101611に記載の抗PD-1抗体である。AMP-224は、B7-DCIgとしても公知である、WO2010/027827およびWO2011/066342に記載のPDL2-Fc融合可溶性受容体である。
本明細書において提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントは、CD152としても公知の細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)である。ヒトCTLA-4の完全なcDNA配列は、Genbankアクセッション番号L15006を有する。CTLA-4は、T細胞の表面上に認められ、抗原提示細胞の表面上のCD80またはCD86に結合すると「オフ」スイッチとして機能する。CTLA4は、ヘルパーT細胞の表面上に発現しかつ阻害性シグナルをT細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。CTLA4は、T細胞共刺激タンパク質であるCD28と類似しており、両分子とも、抗原提示細胞上にある、それぞれB7-1およびB7-2とも呼ばれる、CD80およびCD86に結合する。CTLA4はT細胞に阻害性シグナルを伝達するのに対して、CD28は刺激性シグナルを伝達する。細胞内CTLA4は調節性T細胞においても認められ、その機能に重要である可能性がある。T細胞受容体およびCD28によるT細胞活性化は、B7分子に対する阻害性受容体であるCTLA-4の発現の増大をもたらす。
いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体(例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体)、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴヌペプチドである。
本発明の方法で用いるのに適した抗ヒトCTLA-4抗体(またはそれに由来するVHおよび/またはVLドメイン)は、当技術分野において周知の方法を用いて作製することができる。あるいは、当技術分野において認識されている抗CTLA-4抗体が用いられうる。例えば、米国特許第8,119,129号、WO 01/14424、WO 98/42752; WO 00/37504 (CP675,206、トレメリムマブとしても公知; 以前にはチシリムマブ)、米国特許第6,207,156号; Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (抗体CP-675206); およびMokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304において開示される抗CTLA-4抗体は、本明細書に開示される方法において用いることができる。上述の刊行物のそれぞれの教示は、参照により本明細書に組み入れられる。CTLA-4への結合についてこれらの当技術分野において認識される抗体のいずれかと競合する抗体もまた、用いることができる。例えば、ヒト化CTLA-4抗体は、これらの全てが参照により本明細書に組み入れられる、国際特許出願第WO2001014424号、同第WO2000037504号、および米国特許第8,017,114号において記載される。
例示的な抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ(10D1、MDX-010、MDX-101、およびYervoy(登録商標)としても公知)または抗原結合断片およびそれらの変種(例えば、WO 01/14424を参照)である。他の態様において、抗体は、イピリムマブの重鎖および軽鎖のCDRまたはVRを含む。したがって、1つの態様において、抗体は、イピリムマブのVH領域のCDR1ドメイン、CDR2ドメイン、およびCDR3ドメイン、ならびにイピリムマブのVL領域のCDR1ドメイン、CDR2ドメイン、およびCDR3ドメインを含む。別の態様において、抗体は、上述の抗体と同じCTLA-4上のエピトープとの結合について競合するおよび/または該同じエピトープに結合する。別の態様において、抗体は、上述の抗体と少なくとも約90%の可変領域アミノ酸配列同一性(例えば、イピリムマブと少なくとも約90%、95%、または99%の可変領域同一性)を有する。
CTLA-4を調節するための他の分子には、これらの全てが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5844905号、同第5885796号、ならびに国際特許出願第WO1995001994号および同第WO1998042752号に記載されているようなCTLA-4リガンドおよび受容体、ならびに参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8329867号に記載されているようなイムノアドヘシンが含まれる。
4. 手術
がんを有する者のおよそ60%が、防止、診断またはステージ決定、根治、および緩和のための手術を含む、何らかの型の手術を受けるであろう。根治的な手術は、がん性組織の全部または一部が物理的に除去され、切り出され、かつ/または破壊される切除を含み、本発明の態様の処置、化学療法、放射線治療、ホルモン治療、遺伝子治療、免疫治療、および/または代替治療のような他の治療と併せて使用されうる。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物質的な除去をいう。腫瘍切除に加えて、手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡下手術(モース術)が含まれる。
がん性の細胞、組織、または腫瘍の一部または全部の切り出しによって、腔が体内に形成されうる。処置は、付加的な抗がん治療のその区域への灌流、直接注射、または局所適用によって達成されうる。例えば、そのような処置は、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、もしくは7日毎、または1週毎、2週毎、3週毎、4週毎、および5週毎、または1ヶ月毎、2ヶ月毎、3ヶ月毎、4ヶ月毎、5ヶ月毎、6ヶ月毎、7ヶ月毎、8ヶ月毎、9ヶ月毎、10ヶ月毎、11ヶ月毎、もしくは12ヶ月毎に繰り返されてもよい。これらの処置は、変動する投薬量でなされてもよい。
5. その他の薬剤
処置の治療効力を改善するため、その他の薬剤が本発明の態様のある種の局面と組み合わせて用いられ得ることが企図される。これらの付加的な薬剤には、細胞表面受容体およびギャップ結合の上方制御に影響を与える薬剤、細胞分裂阻害剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、過剰増殖性細胞のアポトーシス誘導剤に対する感受性を増加させる薬剤、またはその他の生物学的薬剤が含まれる。ギャップ結合の数を上昇させることによる細胞間シグナリングの増加は、近隣の過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させるであろう。他の態様において、処置の抗過剰増殖効力を改善するため、細胞分裂阻害剤または分化剤が、本発明の態様のある種の局面と組み合わせて用いられうる。細胞接着の阻害剤は、本発明の態様の効力を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ(FAK)阻害剤およびロバスタチンである。処置効力を改善するため、抗体c225のような、過剰増殖性細胞のアポトーシスに対する感受性を増加させるその他の薬剤が、本発明の態様のある種の局面と組み合わせて用いられうることが、さらに企図される。
VII. 製造品またはキット
免疫細胞を含む製造品またはキットも本明細書において提供される。製造品またはキットは、免疫細胞を用いて個体におけるがんの進行を処置もしくは遅延させるため、またはがんを有する個体の免疫機能を増強するための説明書を含む添付文書をさらに含むことができる。本明細書において記載される抗原特異的免疫細胞のいずれも、製造品またはキットに含まれうる。適当な容器には、例えば、ボトル、バイアル、バッグ、および注射器が含まれる。容器は、ガラス、プラスチック(ポリ塩化ビニルもしくはポリオレフィンなど)、または金属合金(ステンレス鋼もしくはハステロイなど)のような種々の材料から形成されうる。いくつかの態様において、容器は処方物を保持し、容器上のまたは容器に付随のラベルは、使用の指示を示しうる。製造品またはキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、注射針、注射器、および使用説明書付きの添付文書を含めて、商業的視点および利用者視点から望ましい他の材料をさらに含みうる。いくつかの態様において、製造品は、1つまたは複数の別の薬剤(例えば、化学療法剤、および抗腫瘍剤)をさらに含む。1つまたは複数の薬剤に適した容器は、例えば、ボトル、バイアル、バッグおよび注射器を含む。
VIII. 実施例
以下の実施例のセクションでは、さまざまな態様の例に関するさらなる詳細を提供する。以下の実施例において開示される技法は、うまく機能することが本発明者らにより発見された技法および/または組成物を表すことが当業者には理解されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の態様において多くの変更がなされてもよく、それでも、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解するはずである。これらの例は、本明細書において記載される方法およびシステムの例示であり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。そのような非限定的な例には、以下に提示されるものが含まれるが、これらに限定されることはない。
実施例1
本発明者らは、陰性選択を用いてHLA適合ドナーから精製されたCD8+細胞を収集した。ペプチド/MHC多量体(デキストラマー)は、関心対象の抗原ごとに合成され、CCR7、CD14、CD19、CD4、CD8、CD45RO、CD27、CD3、パーフォリン、グランザイムB、T-bet、Eomesに対する抗体とともにCD8細胞を染色するために、および/または生/死の染色に用いられた。CD3およびCD8を発現しかつ非特異的なデキストラマー染色で混入リンパ球を除外したデキストラマー陽性集団について、細胞を流動選別した。抗原特異的CD8+細胞を10×Genomics V(D)J単細胞TCR配列決定プラットフォームに負荷し、増幅されたペアのアルファ/ベータTCR DNAを、MiSeq次世代配列決定装置を用いて配列決定した。TCR内の相同CDR3超可変ループドメインをコードするTCR配列に優先順位を付けるために、単細胞バーコードを計算によりデコンボリューションし、TCRdistパイプライン(Nature, 2017 doi:10.1038/nature22383)を用いて分析した。P2Aリボソームスキッピングペプチドを用いてアルファおよびベータ定常ドメインと可変ドメインの両方をコードする2シストロン性の発現カセットをコードするDNAを合成し、pMP71 TCR発現ベクターにクローニングする。TCRコンストラクトはJurkat/MA細胞株へのトランスデューサであり、NFAT駆動ルシフェラーゼレポーターを含んでおり、これにより、同族の腫瘍抗原を発現することが知られている腫瘍細胞または合成腫瘍抗原ペプチドでパルスされた抗原提示に欠陥のあるT2細胞との共培養後に、ルシフェラーゼアッセイ法を用いて、コンストラクトを腫瘍抗原特異性についてスクリーニングすることが可能となる。抗原特異的応答を誘導することが見出されたTCRコンストラクトを、抗原発現細胞との共培養後にIL-2およびIFN-γについてのELISAにより測定されるサイトカイン放出アッセイ法を用いてさらにスクリーニングする。
（表１）抗原のリスト
Figure 2021517810
（表２）HLAクラスIおよびIIにおけるPDXおよび原発腫瘍全体でリガンドミクスによって検出されたNPYペプチド
Figure 2021517810
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Figure 2021517810
実施例2
A. 材料および方法
免疫親和性精製によるHLAリガンドの単離
8つの患者由来の異種移植腫瘍および8つの原発患者腫瘍を、1×プロテアーゼ阻害剤(Complete; Roche, Basel, Switzerland)を含有する10 mM CHAPS/PBS (AppliChem /Lonza)中で溶解した。マウスMHC分子を、CNBr活性化セファロース(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)に共有結合されたH-2K特異的mAb 20-8-4Sでの1時間の免疫親和性精製を用いて還元した。残りのHLA分子は、CNBr活性化されたものに共有結合された、pan-HLAクラスI特異的mAb W6/32またはpan-HLAクラスII特異的mAb Tu39およびHLA-DR特異的mAb L243の混合物を用いて終夜精製した。MHC-ペプチド複合体を、0.2%トリフルオロ酢酸(Merck)の繰り返し添加によって溶出させた。溶出画分E1〜E4をプールし、遠心フィルタユニット(Amicon; Merck Millipore)を用いた限外ろ過によって、遊離MHCリガンドを単離した。MHCリガンドを、ZipTip C18ピペットチップ(Merck Millipore)を用いて、ろ液から抽出および脱塩した。抽出されたペプチドをアセトニトリル(Merck)/0.1%トリフルオロ酢酸35 μl中に溶出し、遠心分離して完全に乾かし、1%アセトニトリル/0.05%トリフルオロ酢酸25 μl中に再懸濁した。サンプルをLC-MS/MSによる分析まで-20℃で保存した。
LC-MS/MSによるHLAリガンドの分析
ペプチドサンプルを逆相液体クロマトグラフィー(nanoUHPLC, UltiMate 3000 RSLCnano, Dionex)によって分離し、その後、オンライン結合Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Fisher Scientific)で分析した。サンプルを3つの技術的な複製物で分析した。サンプル量5 μl (サンプルシェア20%)を5.75分間4 μl/分で、75 μm×2 cmのトラッピングカラム(Acclaim PepMap RSLC, Dionex)に注入した。ペプチド分離をその後、50 μm×25 cmの分離カラム(Acclaim PepMap RSLC, Dionex)にて50℃および流速300 nl/分で90分にわたり、アセトニトリル2.4〜32.0%に及ぶ勾配を適用して実施した。溶出ペプチドをナノスプレイイオン化によってイオン化し、TopSpeed法を実装した質量分析計で分析した。サーベイスキャンは、Orbitrapで120,000の解像度で作成された。前駆体イオンを四重極で分離し、MHCクラスI精製ペプチドの二重圧力線形イオントラップでの衝突誘起解離(CID)、またはイオンルーティング多重極でのMHCクラスII精製ペプチドの高エネルギー衝突解離(HCD)のいずれかによって断片化した。最後に、断片イオンをOrbitrapに記録した。断片化のため、質量範囲は、それぞれ、MHCクラスIの場合には電荷状態が2+および3+で400〜650 m/zに制限され、またはMHCクラスIIの場合には電荷状態が2+〜5+で300〜1500 m/zに制限された。
データベース検索およびスペクトル注釈
データはProteome Discoverer (v1.3, ThermoFisher)ソフトウェアのSequestHTアルゴリズムを用い、Swiss-Protデータベース(world-wide-web at uniport.org, release: September 27, 2013; 20,279例の再検討されたタンパク質配列が含まれた)に含まれるヒトプロテオームに対して処理された。非標準ペプチド検索の場合、データはRNA-Seq読み取りから作成されたサンプル固有のfastaファイルに対して処理された。前駆体の質量許容値を5 ppmに設定し、断片の質量許容値を0.02 Daに設定した。検索は酵素特異性に制限されなかった。酸化されたメチオニンが動的改変として認められた。偽発見率(FDR)は、シャッフルされた配列からなるデコイデータベースに対する処理に基づきPercolatorアルゴリズムによって判定された。FDRは、q≦0.05 (5% FDR)の目標値に設定された。q≦0.05のペプチド-スペクトル一致(PSM)は、スペクトルの品質と妥当性を確保するために、さらなる直交パラメータによってフィルタ処理された。ペプチドの長さは、MHCクラスIでは8〜12アミノ酸およびMHCクラスIIでは8〜25アミノ酸に限定された。HLA注釈は、それぞれ、HLAクラスIの場合にはSYFPEITHIおよびNetMHC-4.0またはHLAクラスIIの場合にはNetMHCIIpanを用いて実施された。
B. 結果
保護されていないタンパク質ドメインから生じるタンパク質の免疫回避を理解することに加えて、本発明者らは、患者の最も広い集団にわたって広く治療的に適用できる臨床的に関連するがん遺伝子に由来する共有腫瘍エピトープを同定するために、局所HLA提示を適用しようとした。本発明者らは、16例の神経芽細胞腫腫瘍に対して質量分析を行い、リガンドームを特徴付け、タンパク質のスパン全体にわたるHLA局所スコアリングの予測能力を試験した。本発明者らは、神経芽細胞腫リガンドームで最も高度に表されるタンパク質であるNPY (16例の神経芽細胞腫で検出された29個のMHCクラスIペプチド)の局所提示スコアをマッピングし(図6A; p=0.000011)、経験的に検出されたペプチドと高度に提示されることが期待されるタンパク質の領域との間に非常に有意な一致を見出し、全長プロNPYタンパク質から切断されるシグナルペプチド領域(aa 1〜28)に由来するリガンドーム中にはペプチドを見出さなかった。68/84のHLA対立遺伝子にわたるNPYタンパク質全体の高度な提示、その高レベルの差次的発現(図7)、および腫瘍成長の促進におけるその役割(Tilan and Kitlinska, 2016)に基づいて、本発明者らは、NPYがワクチン接種戦略の有望な候補であると仮定している。驚いたことに、本発明者らは、高度に提示された領域での集団提示スコアの上昇にもかかわらず、これらの領域で提示されたペプチドのいずれもHLA-A＊02:01に結合すると予測されないことを見出し、HLA-A＊02:01による提示の欠如のために見逃されうる広く提示されたエピトープを同定する際のHLA提示の集団規模分析の有用性を強調するものである。本発明者らは次に、神経芽細胞腫における主要ながんドライバーであるMYCNがん遺伝子に由来するペプチドについて作製した神経芽細胞腫免疫ペプチドミクスデータセットを検索し、比較的稀有なHLA-C＊16:01に提示された単一のペプチド(KATEYVHSL; (SEQ ID NO: 26))のみを見出した(図6B)。HLAタンパク質スコアリングマップを適用し、本発明者らは、このペプチドが10/84のHLA対立遺伝子に強く結合すると予測され、集団の31.9%に相当することを見出し(集団結合スコアで456ペプチドの15位にランク付け)、これは、このペプチドがこの小児がん集団での治療標的として幅広い用途を持ちうることを示唆している。このペプチドは、既報の免疫原性HLA-A＊02:01ペプチドVILKKATEYV (SEQ ID NO: 163) (Himoudi et al., 2008)と重複しており、MYCNのこの領域を用いた免疫化が、HLA-A＊02:01患者を超えてもっと大きな影響を持ちうることを示唆している。この分析を用いて、本発明者らは、最高スコアのMYCNペプチド(TVRPKNAAL; (SEQ ID NO: 25))により、集団の58.1%に相当する9つのHLA対立遺伝子への結合が予測されることを見出し、より多くの神経芽細胞腫腫瘍標本の分析により、この予測が検証されることを期待している。本発明者らは、17-merおよび33-merにわたる領域スコアをさらに分析し、これらの領域が、それぞれ、集団の73.1%および85.4%に結合するペプチドを生成すると予測されることを見出した(図6BF)。本発明者らは、これらのツールを用いて、特にリガンドミクスデータと組み合わせた場合に、より広く適用可能ながんの治療標的およびワクチンをデザインし、優先順位を付けることができると示唆するものである。個々のタンパク質および特定の新抗原のスパンに沿った集団規模の提示の分析は、Shiny-NAP webアプリケーション(reslnmaris01.research.chop.edu:3838/shinyNAP/)を通じて利用可能である。
C. 考察
ここで、本発明者らは、ヒトのがんで観察される再発性体細胞変異ホットスポットへの免疫学的寄与、ならびにがん感受性への免疫学的寄与への洞察を提供する、初期腫瘍形成中の免疫編集を定量化するためのモデルについて記載する。本明細書において記載されるモデルは、TCGAコホートでの免疫編集の証拠を実証するうえでの最近の研究と直交する方法を採用している(Rech et al., 2018; Marty et al., 2017 and Rooney et al., 2015)。HLAに基づく仮説を用いて、本発明者らは、一般的なドライバー変異が免疫系を回避し、ヒトがんにおけるそれらの過剰提示についての集団規模のHLA中心的な基盤を提供するという結論に収束する。これらの研究の各々において、免疫編集プロセスは不完全であることが実証されており、免疫応答におけるこの相違点を理解する必要性を促すものである。ここで、本発明者らは、HLA対立遺伝子、患者、個々の変種、および他のゲノムまたは臨床的特徴にわたる免疫編集を解明するために採用できる方法を提供する。本発明者らは、HLA中心的な集団規模のモデルが、免疫編集の程度を推定できる比較のベースラインを提供し、これらの特徴間の相違点のいくつかの例が本明細書において強調されるものと考えている。
これは、本発明者らが一般的なHLA対立遺伝子全体に既知のドライバー新抗原をマッピングすることを意識し、非常に驚くべきことに、ヒトがんで最も再発するホットスポット変異が、適応免疫系に関与するのに十分高い親和性で一般的なHLA対立遺伝子に結び付かないと予測されるという最初の報告であり、それらの発がん能に加えて、一般的な変異の進化的利点の根底にある免疫機構を強調するものである。これはまた、本発明者らが、がんの免疫編集プロセスに対する個々のHLA対立遺伝子の寄与を定量化することを意識した最初の報告であり、HLA対立遺伝子全体のがんに対する免疫保護の大きな相違点を明らかにしている。これらのデータは、がん新抗原に高い親和性で結合する個々のHLA対立遺伝子の能力が、がんの免疫編集に寄与するその能力と強く関連していることを示唆している。これらのデータはがんの免疫編集理論を支持しているが、本発明者らおよび他者らは、免疫編集プロセスが、初期のドライバー変異から生じる新抗原の不完全な排除につながることを示している。本発明者らは、かなりの程度の免疫回避が免疫原性サイレント変異に起因しうることを実証するが、免疫原性サイレント変異を持たない患者における完全な免疫編集の欠如は、腫瘍内因性免疫回避、MHCの下方制御、適切な大きさと質のT細胞応答の欠如、乏しいTCRレパートリー、組織からのT細胞の排除、または末梢寛容を含む因子に起因しうる。本発明者らは、それらのモデルをこれらの特徴のゲノミックサロゲートと組み合わせて、腫瘍ゲノムデータを用いた将来の研究においてこれらの変動を調べることができると考えている。
ここで、本発明者らは、全てのHLA対立遺伝子が、それらが提示する新抗原に対して有意に保護的であることが見出されているわけではないことを示す。本発明者らは、免疫編集に有意に関与することが見出されていない対立遺伝子が、致死下のT細胞応答を誘導し、またはTCRの生殖細胞系列にコードされた結合領域との準最適な相互作用を与える生物物理学的および/もしくは幾何学的特性を保有しうるものと仮定している。がんドライバータンパク質の特定の領域がHLA対立遺伝子全体での結合の相違点と組み合わせてHLA提示により保護されていないという所見は、HLA対立遺伝子が進化して、がんタンパク質に見られるモチーフと一致する特定のウイルスドメインに対する保護を与えるかどうか、およびこれらのモチーフに対する進化的圧力の欠如のために、提示されていない領域が保護されないままであるかどうかという問題を提起している。これらの結果はまた、群2新抗原のHLA提示が、アンカー残基でより好ましい結合特性を有する変異体を作製する特定のDNA損傷群から生じる変異シグネチャと関連しているかどうかという問題を提起している(Alexandrov et al., 2013)。本発明者らは、その他の研究者が、これらのおよびその他の仮説を試験するためのツールを利用可能にした(reslnmaris01.research.chop.edu:3838/shinyNAP/)。
本発明者らはまた、集団内の任意の所与のタンパク質のスパン全体にわたって提示スコアをマッピングするためのツールを提示する。本発明者らは、さまざまなHLA対立遺伝子を持つ16例の神経芽細胞腫腫瘍の複合リガンドームで経験的に検出されたペプチドと、集団全体でHLAによって最も高度に提示されると予測されるNPYタンパク質の領域との間に非常に有意な一致を見出した。高レベルの差次的発現と対になったこれらの結果、および腫瘍成長の促進におけるその役割に基づいて、本発明者らは、NPYが神経芽細胞腫患者のためのワクチン開発の有望な候補であることを示唆するものである。このツールを用いて、本発明者らはまた、MYCNに対して使用されている現在のワクチン接種戦略が、集団全体にわたってより広い適用を有しうることを示唆するものである。
がん患者からのゲノムデータへのアクセスが拡張し続け、ペプチド/MHC結合およびT細胞エピトープ予測ツールが改善されるにつれて、このモデルは、より小さな亜集団で発生する分子的特徴に基づいて患者集団のサブセットを層別化する際にさらなる統計的検出力の恩恵を受けるであろう。このモデルは、KRAS G12D変異に由来する新抗原に結合するHLA対立遺伝子を予測しなかったという事実にもかかわらず、KRAS G12D新抗原GADGVGKSA (SEQ ID NO: 164)がHLA-C＊08:02との関連でT細胞応答を媒介できることが、Tranおよびその同僚らにより最近になって報告された。この抗原は、弱いHLA結合因子(15,390 nM)であると予測され、特に訓練データが限られている稀有な対立遺伝子では、このアルゴリズムを用いてT細胞エピトープが必ずしも予測されるとは限らないという事実、および新たな方法が、非標準的なモチーフを有する新抗原を同定するのに役立つという事実を強調している(Abelin et al., 2017)。ここで、本発明者らは、9-mer抗原のみのMHCクラスI提示を介してCD8 T細胞による免疫編集の分析を制限し、さまざまな長さの他のクラスI抗原、クラスII抗原、またはNK細胞もしくはマクロファージからの自然免疫系の活動によって引き起こされうる免疫編集を考慮しなかった。というのは、本発明者らが、一般的なHLA対立遺伝子および最も一般的なクラスIペプチド長を用いることによって統計的検出力を維持することに焦点を合わせたためである。将来的には、本発明者らは、分析をさらなるペプチド長に拡張し、Shiny-NAPアプリケーションへさらなる特徴をリリースする予定である。
本発明者らは、統計的に最も有意な免疫編集が膠芽細胞腫で行われるのに対し、総合すれば、肉腫、膵臓腫瘍、卵巣、副腎皮質腫瘍、およびリンパ腫は、免疫編集の有意な証拠を示さないことを見出した。免疫原的にサイレントなKRAS G12D変異が膵臓がんに特徴的であることを考えると、これらの所見は、膵臓がんにおけるチェックポイント阻害剤のような処置の有効性の欠如(Winograd et al., 2015)および本発明者らの分析で観察された免疫編集の欠如を説明するのに役立ちうる。というのは、これらの腫瘍が、主に免疫原的にサイレントな変異によって推進されるためである。本発明者らは、それらの方法を最終的に用いて、チェックポイント阻害剤のような免疫療法に応答する可能性が最も高い患者群の層別化を通知し、患者HLAおよび抗原免疫原性に基づいてペプチドワクチンに優先順位を付けることができるものと示唆する。このモデルを用いて、個体のHLAプロファイルが、発生または保護される可能性が最も高い変異のタイプをどのように判定できるかを予測することもできる。
本明細書において記載される免疫原性のモデルを用いて、提示されるが免疫系によって排除されない他の新抗原と比較して高い免疫編集を誘発する新抗原の物理的特性を推測し、さまざまな程度の免疫編集に寄与する腫瘍タイプ全体のおよび個々の患者全体の、ならびに特定のHLA対立遺伝子が、がんの保護および素因に寄与しうる機構を探索するための基礎としての、さまざまな分子経路の寄与を研究することが可能でありうる。HLA-A＊68:01のような対立遺伝子はその免疫編集スコアが不釣り合いに高いとして浮上したものであるため、本発明者らは、初期の免疫編集へのHLA対立遺伝子の寄与が、患者の腫瘍新抗原に対するT細胞応答を誘導する能力の改善につながるかどうか、およびそのような対立遺伝子が現代の免疫療法で処置された患者の転帰の改善に関連するかどうかを確認することに関心がある。本発明者らは、本明細書に含まれる免疫原性マップ、HLAタイピングデータ、および免疫編集モデルが、HLA対立遺伝子、変異、患者、組織学のレベルでの新抗原免疫原性の調査を容易にし、治療法の開発のための共有腫瘍エピトープの優先順位付け、さらには腫瘍の進化における免疫回避に関する本発明者らの機構的理解を支援することを示唆するものである。
（表Ｓ１）ドライバーがん遺伝子および腫瘍抑制遺伝子
Figure 2021517810
細胞の運命、細胞の生存、およびゲノムの維持を調節するがん遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を含む、発がんに関与する125種のがんドライバー遺伝子のリスト(Vogelstein et al., 2013)。
（表Ｓ３）HLAジェノタイピングの検証
Figure 2021517810
増幅されたHLA遺伝子座の次世代配列決定を用いて実施された臨床ジェノタイピングと比較した3つの神経芽細胞腫細胞株のエクソーム配列決定データからPHLATアルゴリズムによって推測される15個のHLA対立遺伝子にわたるHLA予測の比較。
（表Ｓ５）TCGAからの免疫編集された変種
Figure 2021517810
変種に由来する新抗原に結合すると予測されるHLA対立遺伝子を持つ患者の集団で測定した場合に、最も過小提示されている変種のリスト(p≦0.05)。結合因子を有する集団の割合は、特定の変種に由来する新エピトープに結合できるHLA対立遺伝子を持つTCGA対象の確率である。観察された変異は、変種に結合できる患者のセットから少なくとも1つのHLA対立遺伝子を有する患者の数より計算された頻度である。
（表Ｓ６）TCGAからの免疫編集された対象
Figure 2021517810
TCGAで免疫編集の程度が最も高い対象のリスト(p≦0.05)。各患者における全ての個々の変種がTCGAにおけるHLA対立遺伝子に結合する確率を合計することによって計算された予想される結合因子。観察された結合因子は、各変種全体で少なくとも1つのエピトープを作製する変種/HLAペアの合計数である。観察された/期待されたものは、各患者における提示された新抗原の過小提示の程度を表す(0は完全な免疫編集である)。免疫編集の重要性が最も低いとランク付けされているにもかかわらず、子宮がんは、免疫編集の程度が最も高い上位10人の患者のうち5人を表す。最も有意に免疫編集された対象はまた、免疫原的にサイレントな変異の数のなかで7300中3位にランク付けされている。
本明細書において開示され、主張される方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく、構築および実施することができる。本開示の組成物および方法は、好ましい態様に関連して記載されてきたが、当業者には、本開示の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書において記載された方法および段階、または方法の段階の順序に変更が適用されてもよいことが、明らかであろう。より具体的には、化学的および生理的に関連する特定の薬剤が本明細書に記載の薬剤の代わりに用いられてもよく、それらが同じまたは同様の結果に到達しうることは、明らかであろう。当業者には明らかである全てのかかる同様の置換および修飾は、添付の特許請求の範囲により定義される本開示の趣旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
IX. 参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載された参考文献を補足する例示的な手順的なまたは他の詳細を提供するものであり、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
Figure 2021517810
Figure 2021517810
Figure 2021517810
Figure 2021517810
Figure 2021517810
Figure 2021517810

Claims (57)

  1. 表1もしくは2または図6Bに記載の抗原に結合する、キメラ抗原受容体(CAR)タンパク質。
  2. Figure 2021517810
    に結合する、請求項1記載のCARタンパク質。
  3. FLDETLRSLA (SEQ ID NO: 2)に結合する、請求項1記載のCARタンパク質。
  4. QYNPIRTTF (SEQ ID NO: 3)に結合する、請求項1記載のCARタンパク質。
  5. SYQKVIELF (SEQ ID NO: 4)に結合する、請求項1記載のCARタンパク質。
  6. IYPDITYSL (SEQ ID NO: 5)に結合する、請求項1記載のCARタンパク質。
  7. FLIENLLAA (SEQ ID NO: 6)に結合する、請求項1記載のCARタンパク質。
  8. ALLSGVRQV (SEQ ID NO: 7)に結合する、請求項1記載のCARタンパク質。
  9. VLFENTDSVHL (SEQ ID NO: 8)に結合する、請求項1記載のCARタンパク質。
  10. SAAMVFSAL (SEQ ID NO: 9)に結合する、請求項1記載のCARタンパク質。
  11. 請求項1〜10のいずれか一項記載のCARタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド分子。
  12. 真核細胞において活性なプロモーターをさらに含む、請求項11記載のポリヌクレオチド分子。
  13. 発現ベクターとしてさらに定義される、請求項11記載のポリヌクレオチド分子。
  14. 表1もしくは2または図6Bに記載の抗原に結合する、T細胞受容体タンパク質。
  15. Figure 2021517810
    に結合する、請求項14記載のT細胞受容体タンパク質。
  16. FLDETLRSLA (SEQ ID NO: 2)に結合する、請求項14記載のT細胞受容体タンパク質。
  17. QYNPIRTTF (SEQ ID NO: 3)に結合する、請求項14記載のT細胞受容体タンパク質。
  18. SYQKVIELF (SEQ ID NO: 4)に結合する、請求項14記載のT細胞受容体タンパク質。
  19. IYPDITYSL (SEQ ID NO: 5)に結合する、請求項14記載のT細胞受容体タンパク質。
  20. FLIENLLAA (SEQ ID NO: 6)に結合する、請求項14記載のT細胞受容体タンパク質。
  21. ALLSGVRQV (SEQ ID NO: 7)に結合する、請求項14記載のT細胞受容体タンパク質。
  22. VLFENTDSVHL (SEQ ID NO: 8)に結合する、請求項14記載のT細胞受容体タンパク質。
  23. SAAMVFSAL (SEQ ID NO: 9)に結合する、請求項14記載のT細胞受容体タンパク質。
  24. 請求項14〜23のいずれか一項記載のT細胞受容体タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド分子。
  25. 真核細胞において活性なプロモーターをさらに含む、請求項24記載のポリヌクレオチド分子。
  26. 発現ベクターとしてさらに定義される、請求項24記載のポリヌクレオチド分子。
  27. 表1もしくは2または図6Bの抗原に結合するT細胞受容体をコードするポリヌクレオチド分子を含む、操作されたT細胞。
  28. ポリヌクレオチド分子が請求項15〜23のいずれか一項記載のT細胞受容体タンパク質をコードする、請求項27記載の細胞。
  29. T細胞である、請求項27記載の細胞。
  30. NK細胞である、請求項27記載の細胞。
  31. トランスポザーゼをさらに含む、請求項27記載の細胞。
  32. 請求項14〜18または27〜31のいずれか一項記載の1つまたは複数の細胞を含む細胞療法の有効量を対象に投与する段階を含む、その必要があるヒト対象においてがんを処置する方法。
  33. 第2のがん療法をヒト対象に投与する段階をさらに含む、請求項32記載の方法。
  34. 第2のがん療法が、化学療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、または手術である、請求項33記載の方法。
  35. 第2のがん療法が細胞療法と同時に投与される、請求項33記載の方法。
  36. 第2のがん療法が細胞療法の前または後に投与される、請求項33記載の方法。
  37. 請求項14〜18または27〜31のいずれか一項記載の1つまたは複数の細胞の有効量の第2の投与をヒト対象に施す段階をさらに含む、請求項32記載の方法。
  38. がんが、転移性、再発性、または薬剤耐性のがんである、請求項32記載の方法。
  39. 細胞療法が、がん部位の局所、がん部位の領域、または全身に投与される、請求項32記載の方法。
  40. がんが神経芽細胞腫である、請求項32記載の方法。
  41. がんが、肺がん(小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、および肺扁平上皮がんを含む)、腹膜がん、胃(gastric)または胃(stomach)がん(胃腸がんおよび消化管間質がんを含む)、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜または子宮がん、唾液腺がん、腎臓(kidney)または腎臓(renal)がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、さまざまなタイプの頭頸部がん、ならびに黒色腫である、請求項32記載の方法。
  42. (a) 腫瘍サンプルから腫瘍RNAおよび/またはDNAを得る段階;
    (b) 該RNAおよび/またはDNAを配列決定する段階;
    (c) 腫瘍遺伝子発現データをTARGET/TCGA vs. GTExの腫瘍特異的差異分析と比較し、それによって腫瘍に特異的でありかつ正常組織には存在しないことが知られている高度に発現された遺伝子を同定する段階;
    (d) 該腫瘍サンプルからMHC分子を得る段階;
    (e) 溶出およびLC/MS/MSプロテオミクスによってMHC結合リガンドを特徴付ける段階;
    (f) 腫瘍における差次的発現に基づいて同定されたMHCリガンドをフィルタリングする段階;
    (g) 段階(f)からの残りのリガンドを、正常リガンドームのデータベースにそれらが存在しないことに基づいてフィルタリングする段階; ならびに
    (h) 経験的に特徴付けられたリガンドを、標準タンパク質にマッピングされないRNA配列決定読み取りと照合することにより、非標準腫瘍抗原を同定する段階
    を含む、非標準腫瘍抗原を同定する方法。
  43. ニューラルネットワーク機械学習を適用して、ペプチド/MHC結合親和性に基づく腫瘍抗原、LC/MS/MSによって判定されるMHC表面上の腫瘍リガンドの量的な存在度、腫瘍タイプとの生物学的関連性、他の腫瘍に及ぶ再発、提示HLA対立遺伝子の集団頻度、および/または複数の腫瘍に及ぶ抗原の再発に優先順位を付ける段階をさらに含む、請求項42記載の方法。
  44. (i) 腫瘍抗原/MHCデキストラマーを調製し、健常なHLA適合ドナーから抗原特異的CD8細胞を選別すること;
    (j) 選別された抗原特異的T細胞に対し単一細胞配列決定を実施して、ペアのα/βTCR配列を得ること
    により、同定された抗原を検証する段階をさらに含む、請求項42記載の方法。
  45. α/β TCR配列をマウス定常領域とペアリングし、それに続いてコドン最適化を行う段階、および哺乳動物細胞においてコドン最適化されたコンストラクトを発現させる段階をさらに含む、請求項42記載の方法。
  46. 哺乳動物細胞を腫瘍細胞と共培養する段階をさらに含む、請求項45記載の方法。
  47. (i) 表1における抗原に選択的に結合する第1の一本鎖抗体; および
    (ii) TまたはB細胞に結合する第2の一本鎖抗体
    を含む融合タンパク質。
  48. 第2の一本鎖抗体がCD3に結合する、請求項47記載の融合タンパク質。
  49. 第2の一本鎖抗体がT細胞に結合する、請求項47記載の融合タンパク質。
  50. 第2の一本鎖抗体がB細胞に結合する、請求項47記載の融合タンパク質。
  51. 融合タンパク質が標識または治療部分をさらに含む、請求項47記載の融合タンパク質。
  52. 表1または図6Bに記載される1つまたは複数の抗原を含む、ワクチン組成物。
  53. アジュバントをさらに含む、請求項52記載のワクチン組成物。
  54. 生物学的応答修飾因子をさらに含む、請求項52記載のワクチン組成物。
  55. ケモカインをさらに含む、請求項52記載のワクチン組成物。
  56. 1つまたは複数の抗原が無傷の樹状細胞で送達される、請求項42記載のワクチン組成物。
  57. 請求項52記載のワクチン組成物を対象に投与する段階を含む、対象において抗がん免疫応答を生じさせる方法。
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