CN113912701B - Tcr及其在诊断/治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了TCR及其在诊断/治疗中的应用，所述TCR包括α链和β链中的至少一者，本发明还提供了包含编码所述TCR的多核苷酸、载体、细胞以及组合物。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及TCR及其在诊断/治疗中的应用。
背景技术
细胞免疫治疗是当前肿瘤生物治疗的研究热点。细胞恶性转化是由于肿瘤发生相关基因的突变造成，包括癌基因的激活，抑癌基因的失活及基因调控的改变等。基因突变造成蛋白异常表达，异常表达的蛋白作为肿瘤抗原能够被免疫系统的细胞识别，因此肿瘤的发生和进展过程是肿瘤细胞和免疫系统相互作用的过程。免疫系统的效应细胞能够识别肿瘤抗原，通过直接杀伤肿瘤细胞或分泌细胞因子，控制肿瘤的发生和进展。虽然肿瘤的最终发生意味着肿瘤细胞已经通过各种途径逃避了免疫系统的作用，但是大量的实验证明免疫系统的抗肿瘤机制可以被激活利用，控制肿瘤的进展。单克隆抗体在肿瘤治疗领域的价值已经显现，多个抗体类药物如曲妥珠、西妥昔单抗和贝伐单抗等在乳腺癌和结肠癌中已成功应用。免疫细胞，尤其T细胞，能够识别特异性抗原，主动的浸入组织，精确识别和杀伤肿瘤细胞，因此细胞免疫治疗更受到肿瘤免疫治疗领域的关注与期望。
肿瘤特异T细胞过继细胞治疗(adoptive cell therapy,ACT)是肿瘤免疫治疗的最新进展[3]。细胞免疫尤其是CD8+T细胞介导的特异性MHC-I类分子限制性细胞免疫功能在抗肿瘤免疫中起决定作用。T淋巴细胞通过特异性T细胞受体(Tcell receptor,TCR)识别肿瘤细胞表面抗原肽-MHC复合物而被激活。活化的T胞可以直接溶解肿瘤细胞，或通过分泌细胞因子，如干扰素和肿瘤坏死因子，抑制肿瘤生长，阻止肿瘤血管生成。应用现代免疫学技术，可以将自体肿瘤特异性T细胞进行体外扩增，再回输给肿瘤患者进行治疗。当前技术的进展已经能够在体外扩增过程中维持T细胞的特异性和功能，然后回输到患者体内用于治疗。但由于大多数肿瘤抗原是自体抗原，不仅表达于肿瘤组织，通过体外诱导获得的多克隆T细胞对抗原的亲和力很低。同时，肿瘤在发生过程中己诱导机体产生了一定程度的免疫耐受，患者体内的肿瘤特异性T细胞比例很低，上述方法难以诱导足够数量的T细胞，限制了其应用。
分子生物学技术的进步使制备转基因T细胞成为可能，可以克隆特异的TCR基因并导入多克隆T细胞。研究高效、低毒及可操控的TCR-T细胞免疫法在肿瘤治疗中具有理想的应用前景。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了分离的结合蛋白(T细胞受体，TCR)以及与该受体相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞或工程化细胞。本发明还提供了用于治疗或预防肿瘤和/或癌症、或用于检测宿主的肿瘤和/或癌症的包含T细胞受体的药物组合物。本发明提供的T细胞受体及其相关的产品具有较好的杀伤效果。
本发明提供了如下内容：
本发明第一方面提供了一种结合蛋白，包括：
(a)TCRα链可变结构域Vα，该结构域具有SEQ ID NO:3所示的CDR3氨基酸序列，或SEQ ID NO：3所示的以多达五个氨基酸替代、插入和/或删除的CDR3氨基酸序列，以及TCRβ链可变结构域Vβ；
(b)Vα结构域，和Vβ结构域，该Vβ结构域具有SEQ ID NO:9-11中任一个所示的CDR3氨基酸序列，或SEQ ID NO:9-11中任一个所示的以多达五个氨基酸替代、插入和/或删除的CDR3氨基酸序列；或
(c)(a)的Vα结构域和(b)的Vβ结构域。
进一步，所述Vα结构域包括SEQ ID NO:3的CDR3氨基酸序列，所述Vβ结构域包括SEQ ID NO:9的CDR3氨基酸序列；或
所述Vα结构域包括SEQ ID NO:3的CDR3氨基酸序列，所述Vβ结构域包括SEQ IDNO:10的CDR3氨基酸序列；或
所述Vα结构域包括SEQ ID NO:3的CDR3氨基酸序列，所述Vβ结构域包括SEQ IDNO:11的CDR3氨基酸序列。
进一步，所述Vα结构域包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的CDR1和CDR2氨基酸序列；所述Vβ结构域包括SEQ ID NO:5所示的CDR1和SEQ ID NO:6-8任一所示的CDR2氨基酸序列。
进一步，所述Vα结构域包括与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少90％的一致性；所述Vβ结构域包括SEQ ID NO:12-20中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％的一致性。
进一步，所述Vα结构域包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
进一步，所述Vβ结构域包括SEQ ID NO:12-20任一个所示的氨基酸序列。
进一步，所述Vα结构域的序列如SEQ ID NO:3所示，Vβ结构域的序列如SEQ ID NO:12所示。
进一步，所述结合蛋白是TCR、TCR的抗原结合片段，或嵌合抗原受体。
进一步，所述TCR的抗原结合片段，包括单链TCR。
进一步，所述结合蛋白是嵌合抗原受体。
进一步，其中TCR、TCR的抗原结合片段，或嵌合抗原受体是嵌合的、人源化的或人源的。
进一步，所述结合蛋白为TCR。
进一步，所述TCR包括α链恒定结构域和/或β链恒定结构域；
进一步，所述结合蛋白与可检测标记物、治疗剂相关联。
本发明第二方明提供了一种融合分子，包括第一分子和第二分子，所述第一分子为本发明第一方面所述的结合蛋白。
本发明第三方面提供了本发明第一方面所述的编码结合蛋白的分离的多核苷酸。
进一步，编码结合蛋白的多核苷酸是优化的密码子。
本发明第四方面提供了表达载体，包含本发明第三方面所述的多核苷酸；
进一步，所述多核苷酸可操作地连接表达控制序列；
进一步，所述载体能够将所述多核苷酸递送至宿主细胞；
进一步，所述载体是病毒载体；
进一步，所述病毒载体是慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
本发明第五方面提供了宿主细胞，包括本发明第三方面所述的多核苷酸，或本发明第四方面所述的表达载体；
进一步，所述宿主细胞是造血祖细胞或免疫系统细胞。
进一步，所述免疫系统细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞或其任何结合。
进一步，所述免疫系统细胞为CD4+T细胞。
进一步，述T细胞为幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、效应记忆T细胞，或其任何结合。
进一步，与内源的TCR相比，结合蛋白或TCR在T细胞上的表面表达更高。
本发明第六方面提供了一种非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的细胞，所述细胞呈递本发明第一方面所述的结合蛋白，或本发明第二方面所述的融合分子；
进一步，所述细胞为T细胞。
本发明第七方面提供了嵌合分子，包含与非细胞底物、毒素和/或抗体缀合的本发明第一方面所述的结合蛋白或其一部分。
进一步，所述非细胞底物选自下组：纳米颗粒、外泌体和其他非细胞底物。
本发明第八方面提供了一种组合物，包括本发明第一方面所述的结合蛋白，本发明第二方面所述的融合分子、本发明第三方面所述的多核苷酸，本发明第四方面所述的表达载体，本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面所述的细胞或本发明第七方面所述的嵌合分子。
进一步，所述组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明第九方面提供了一种生产根据本发明第一方面所述的结合蛋白或本发明第二方面所述的融合分子的方法，所述方法包括a)使根据本发明第五方面所述的宿主细胞保持在用于表达本发明第一方面所述的结合蛋白或本发明第二方面所述的融合分子的最优条件下，以及b)分离所述结合蛋白或融合分子。
本发明第十方面提供了如下任一项所述的应用：
(a)本发明第一方面所述的结合蛋白或本发明第二方面所述的融合分子在制备过继细胞转移治疗药物中的应用。
进一步，所述过继细胞转移为过继T细胞转移。
进一步，所述过继T细胞转移是同种异体过继T细胞转移、自体过继T细胞转移或通用的非同种异体反应性过继T细胞转移。
(b)本发明第一方面所述的结合蛋白在制备产品中的应用，所述产品用于肿瘤细胞中的肽/MHC的诊断评价，或将治疗分子引导至肿瘤部位；
(c)本发明第一方面所述的结合蛋白，本发明第二方面所述的融合分子、本发明第三方面所述的多核苷酸，本发明第四方面所述的表达载体，本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面所述的细胞、本发明第七方面所述的嵌合分子或本发明第八方面所述的组合物在制备增强免疫力的产品中的应用。
(d)本发明第一方面所述的结合蛋白，本发明第二方面所述的融合分子、本发明第三方面所述的多核苷酸，本发明第四方面所述的表达载体，本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面所述的细胞、本发明第七方面所述的嵌合分子或本发明第八方面所述的组合物在制备治疗和/或预防疾病的药物中的应用；
进一步，所述疾病为癌症。
进一步，所述癌症为血液肿瘤。
进一步，所述血液肿瘤为白血病。
进一步，所述白血病为急性白血病。
进一步，所述白血病为急性髓系白血病。
(e)本发明第一方面所述的结合蛋白，本发明第二方面所述的融合分子、本发明第三方面所述的多核苷酸，本发明第四方面所述的表达载体，本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面所述的细胞、本发明第七方面所述的嵌合分子或本发明第八方面所述的组合物在制备抗原检测产品中的应用。
附图说明
图1是TCR-T杀伤白血病细胞MV4-11功能检测图。
发明详述
在权利要求书中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确表明仅仅表示替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅表示替代方案和“和/或”的定义。
在本说明书和权利要求书中使用的词语“包含”(和包含的任意形式，诸如“包括”和“含有”)、“具有”(和具有的任意形式，诸如“有”和“带有”)、“包括”(和包括的任意形式，诸如“包含”和“含有”)或“含有”(和含有的任意形式，诸如“包含”和“包含有”)是包含性的或开放式的，并且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
在本发明中，“免疫系统细胞”是指在免疫系统中来源于骨髓造血干细胞的任何细胞，它产生了两个主要的谱系，骨髓祖细胞(其产生骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞，巨核细胞和粒细胞)和淋巴祖细胞(其产生淋巴细胞，如T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞，包括自然杀伤T(NK-T)细胞)。示例性的免疫系统细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、调节性T细胞、自然杀伤性T细胞、自然杀伤T细胞和树突状细胞。巨噬细胞和树突状细胞可被称为“抗原递呈细胞”或“APC”，其是当APC表面的主要组织相容性复合物(MHC)受体与T细胞表面的TCR相互作用时，能够激活T细胞的特殊细胞。
“主要组织相容性复合物”(MHC)是指将肽抗原递送到细胞表面的糖蛋白。MHC的Ⅰ类分子是具有跨膜α链(具有三个α结构域)和非共价结合的β2微球蛋白的异二聚体。MHC的Ⅱ类分子由两种跨膜糖蛋白α和β组成，它们都跨越膜。每个链有两个结构域。MHC的Ⅰ类分子将来源于胞浆的肽递送到细胞表面，其中肽:MHC复合物经CD8+T细胞识别。MHC的Ⅱ类分子将源于囊泡系统的肽递送到细胞表面，其中肽:MHC复合物经CD4+T细胞识别。人类MHC被称为人类白细胞抗原(HLA)。HLA-II类型包括DP、DM、DOA、DOB、DQ和DR。许多编码不同HLA类型的亚单位的等位基因是已知的，例如，包括HLA-DQA1*03、HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0302、HLA-DQB1*0303。
“T细胞”或“T淋巴细胞”是在胸腺成熟，并产生T细胞受体(TCR)的免疫系统细胞。T细胞可以是幼稚的，记忆T细胞(TM)(抗原经历和寿命长的)，和效应细胞(有抗原经历的细胞毒性)。TM可进一步地分为以下亚组:中央记忆T细胞(TCM)；效应记忆T细胞(TEM)。
“T细胞受体”(TCR)是指免疫球蛋白超家族的成员，能够与结合了MHC受体的抗原肽特异性结合。TCR可以在细胞表面或以可溶性形式存在，并且通常地由具有α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)，或γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)的异二聚体组成。类似免疫球蛋白，TCR链的胞外部分(例如α-链，β-链)包括两个免疫球蛋白结构域：一个可变结构域(例如α-链可变结构域，或Vα，β-链可变结构域或Vβ；典型的基于在N-末端的基于Kabat编号的氨基酸1到116(Kabat et al.,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDept.Health and Human Services,Public Health Service National Institutes ofHealth,1991,5th ed.)；与细胞膜相邻的一个恒定结构域(例如，α-链恒定结构域或Cα，通常是基于Kabat的氨基酸117到259，β-链恒定结构域或Cβ，通常是基于Kabat的氨基酸117到295)。此外，类似免疫球蛋白，可变结构域包括由框架区(FR)分隔的互补决定区(CDR)。TCR可变结构域序列可与编号方案(例如，Kabat、EU、国际免疫遗传学信息系统(IMGT)和Aho)对齐，所述编号方案可以使用抗原受体编号和受体分选(ANARCI)软件工具，对相同的残基位置进行注释，并对不同的分子进行比较。编号方案提供了TCR可变结构域中框架区域和CDR的标准化描述。
在某些实施例中，在T细胞(或T淋巴细胞)表面发现TCR并与CD3复合物相关。本公开中使用的TCR的来源，可以来自各种动物物种，例如人类、小鼠、大鼠、兔子或其他哺乳动物。
术语“可变区”或“可变结构域”是指TCRα-链或β-链(或用于γδTCR的γ-链和δ-链)的域，其参与TCR与抗原的结合。天然TCR的α-链或β-链的可变结构域(分别为Vα和Vβ)，通常地，具有相似的结构，每个结构域包括四个通常地保守的框架区(FR)和三个CDR。Vα结构域由两个独立的DNA片段编码，可变基因片段和连接基因片段(V-J)；Vβ结构域由三个独立的DNA片段编码，可变基因片段、多样性基因片段和连接基因片段(V-D-J)。单个Vα或Vβ结构域可以足以赋予抗原结合的特异性。此外，结合特定抗原的TCR可使用Vα或Vβ结构域，从结合抗原的TCR中分离，以筛选分别互补的Vα或Vβ结构域的库。
术语“互补决定区”和“CDR”是“高变区”或“HVR”的同义词，并且在本领域中，已知是指TCR可变区内的非邻接氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。一般地，每个α-链可变区(αCDR1、αCDR2、αCDR3)有三个CDR，每个β-链可变区(βCDR1、βCDR2、βCDR3)有三个CDR。CDR3被认为是用于识别经处理的抗原的主要CDR。CDR1和CDR2主要与MHC相互作用。在某些实施例中，本公开的结合蛋白，包括如SEQ ID NO:1-3中的任一个所述的，Vα结构域的αCDR1、αCDR2和/或αCDR3氨基酸序列。在某些实施例中，本公开的结合蛋白包括如SEQ IDNO:5-11中任一个所示的，Vβ结构域的βCDR1、βCDR2和/或βCDR3氨基酸序列。
在某些实施例中，“增强的亲和力”，其指所选的或工程化的受体或结合结构域，其与目标抗原结合力强于野生型(或亲本)结合结构域。例如，增强的亲和力可能是由于目标抗原的Ka(平衡缔合常数)高于野生型结合结构域，由于目标抗原的Kd(离解常数)低于野生型结合结构域，由于目标抗原的失活率(koff)小于野生型结合结构域，或其结合。在某些实施例中，增强的亲和TCR可以是优化的密码子，以增强特定宿主细胞(例如T细胞)中的表达。
如本文所使用的，“核酸”或“核酸分子”或“多核苷酸”可互换使用，指的是任何一种脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸，例如通过聚合酶链反应(PCR)或体外翻译产生的片段，和通过任何连接，分裂，核酸内切酶作用或核酸外切酶作用产生的片段。在某些实施例中，本发明的核酸通过PCR产生。核酸可以由天然产生的核苷酸的单体(例如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)、天然产生的核苷酸的类似物(如天然产生的核苷酸的α-异构体形式)，或两者的结合所组成。修改的核苷酸可以修改或替换糖部分，或嘧啶或嘌呤基部分。核酸单体可通过磷酸二酯键或此类键的类似物连接。磷酸二酯连接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、亚磷酸硒代酯、二硒代磷酸酯、苯硫基磷酸酯、苯胺基磷酸酯、氨基磷酸酯等。核酸分子可以是单链或双链。
术语“分离的”是指材料从其原始环境中移除(例如，如果是天然产生的自然环境)。例如，存在于活动物中的天然产生的核酸或多肽不是分离的，但是从自然系统中某些或所有共存物质中分离出的相同核酸或多肽，是分离的。这种核酸可以是载体的一部分和/或这种核酸或多肽可以是组合物(例如，细胞裂解物)的一部分，并且在这种载体或组合物不是核酸或多肽的自然环境的一部分的情况下，仍然是分离的。
“载体”是能够运输另一个核酸分子的核酸分子。载体可以是，例如质粒、粘粒、病毒、RNA载体或线形或圆形的DNA或RNA分子，其可以包括染色体、非染色体、半合成或合成核酸分子。示例性的载体是那些能够自主复制或表达与其相连的核酸分子的载体(表达载体)。
病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒，例如正粘病毒(如流感病毒)、横纹肌病毒(例如狂犬病和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒，例如小角病毒和α病毒、双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒1类和2类、爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒、巨细胞病毒)，和痘病毒(例如痘苗、鸡痘和金丝雀痘)。其他病毒包括例如诺瓦克(Norwalk)病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、丘疹病毒、肝炎病毒(hepadnavirus)和肝炎病毒(hepatitisvirus)。逆转录病毒的例子包括禽白血病肉瘤、哺乳动物C类、B类病毒、D类病毒、HTLV-BLV群、慢病毒、泡沫病毒。
术语“可操作地连接”指的是两个或多个核酸分子在单个核酸片段上的关联，从而使一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列在启动子的转录控制下)，启动子与编码序列可操作地连接。“未连接”是指相关的遗传因素彼此之间没有紧密的关联，一方的功能不会影响另一方。
如本文所使用的，“表达载体”是指含有核酸分子的DNA结构物，其含有核酸分子，所述核酸分子可操作地连接至能够影响核酸分子在合适宿主中表达的合适控制序列。这种控制序列包括影响转录的启动子、控制这种转录的可选操作序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，以及控制转录终止和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、病毒，或者仅仅是潜在的基因组插入。一旦转化为合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组，进行复制和发挥作用，或者在某些情况下，可以整合到基因组本身中。在本说明书中，“粘粒”、“表达粘粒”、“病毒”和“载体”经常可以互换地使用。
术语“表达”是指基于核酸分子(例如基因)的编码序列产生多肽的过程。该过程可包括转录、转录后控制、转录后修改、翻译、翻译后控制、翻译后修改，或其任何结合。
如本文所使用的，“序列一致性”指的是一个序列中氨基酸残基的百分比，所述氨基酸残基与另一个参考多肽序列中的氨基酸残基，在对准序列并引入间隙之后相一致，如果需要的话，以达到最大百分比序列一致性，并且不考虑任何保守的替换作为序列标识的一部分。
如本文所使用的，“造血祖细胞”是一种可以从造血干细胞或胎儿组织中衍生的细胞，并且其能够进一步分化为成熟细胞类型(例如免疫系统细胞)。示例性的造血祖细胞包括那些具有CD24LoLin–CD117+表型的细胞，或那些在胸腺中发现的细胞(称为祖细胞胸腺细胞)。
结合蛋白/TCR
基于本发明的目的，本发明TCR是具有至少一个TCRα和/或TCRβ链可变域的部分。它们通常同时包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域。它们可以是αβ异质二聚体或是单链形式或是其他任何能够稳定存在的形式。在过继性免疫治疗中，可将αβ异质二聚TCR的全长链(包含胞质和跨膜结构域)进行转染。本发明TCR可用作将治疗剂递送至抗原呈递细胞的靶向剂或与其他分子结合制备双功能多肽来定向效应细胞，此时TCR优选为可溶形式。
对于稳定性而言，现有技术中公开了在TCR的α与β链恒定域之间引入人工链间二硫键能够获得可溶且稳定的TCR分子，如专利文献PCT/CN2015/093806中所述。因此，本发明TCR可以是在其α和β链恒定域的残基之间引入人工链间二硫键的TCR。半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域间形成人工链间二硫键。半胱氨酸残基可以取代在天然TCR中合适位点的其他氨基酸残基以形成人工链间二硫键。
在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。因此，本发明TCR还包括本发明TCR的至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸(尤其是位于CDR区之外的氨基酸)，被性质相似或相近的氨基酸所替换，并仍能够保持其功能性的TCR。
本发明还包括对本发明TCR略作修饰后的TCR。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：本发明TCR的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在本发明TCR的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的TCR。这种修饰可以通过将TCR暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的TCR。
多核苷酸/核酸
本发明提供了编码本发明所述结合蛋白的分离的多核苷酸。
作为一种优选的实施方式，本发明的核酸的核苷酸序列进行编码子优化以增加基因表达、蛋白翻译效率以及蛋白表达，从而增强TCR识别抗原的能力。编码子优化包括但不限于翻译启动区域的修饰、改变mRNA结构片段、以及使用编码同一氨基酸的不同密码子。
在其它的实施方案中，可以对上述TCR编码核酸的序列进行突变，包括去除、插入和/或置换一个或多个氨基酸密码子，使得所表达的TCR识别抗原的功能不变或者增强。例如，在一个实施方案中，进行保守氨基酸置换，包括对上述TCRα链和/或β链的可变区中的一个氨基酸用结构和/或化学属性相似的另一个氨基酸进行置换。术语“相似的氨基酸”是指具有相似的极性、电负荷、可溶性、疏水性、亲水性等属性的氨基酸残基。突变后的TCR仍具有识别上述被靶细胞提呈的抗原多肽的生物活性。
本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明TCR(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
表达载体
本发明提供了一种包含本发明所述的多核苷酸/核酸序列的表达载体，所述多核苷酸可操作地连接表达控制序列。
作为一种优选的实施方式，在所述重组表达载体中，本发明所述的DNA合适地与启动子、增强子、终止子和/或polyA信号序列有效连接。本发明的重组表达载体的上述作用元件的组合能够促进DNA的转录和翻译，并增强mRNA的稳定性。
在一个实施方案中，重组表达载体上的α链和β链基因的表达可以由两个不同的启动子所驱动，启动子包括各种已知的类型，例如强表达的、弱表达的、可诱导的、组织特异性的、和分化特异性的启动子。启动子可以是病毒来源的或者非病毒来源的，例如CMV启动子、MSCV的LTR上的启动子、EF1-α启动子、和PGK-1启动子。两个启动子的驱动方向可以是同向也可以是反向的。
在另一个实施方案中，重组表达载体上的α链和β链基因的表达可以由同一个启动子所驱动，例如编码单链嵌合T细胞受体的情况，α链的核苷酸序列和β链的核苷酸序列由Furin-F2A多肽编码序列相连接。
在另一些实施方案中，重组表达载体除了包含α链和β链基因外，还可以包含其它功能分子的编码序列。一个实施方案包括表达自发荧光蛋白(如GFP或其它荧光蛋白)以用于体内追踪成像。另一个实施方案包括表达可诱导的自杀基因系统。
本发明对表达载体没有特别的限制，但可以是能在包括哺乳动物细胞(例如，人、猴、兔、大鼠、仓鼠或小鼠细胞)、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞(如大肠杆菌(E.coli))在内的真核或原核细胞内复制和/或表达多核苷酸的载体。较佳地，它可以是载体，包括至少一选择性标记，可操作地连接到合适的启动子，以致可以在宿主细胞内表达多核苷酸。例如，载体可以包括导入噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或反转录病毒载体的多核苷酸。
细胞
本发明提供了包含本发明所述的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。
如本文所使用的，术语“宿主是指，靶向异源核酸分子进行遗传修改，以产生目标多肽(例如，TCR)的细胞(例如T细胞)或微生物。在某些实施例中，宿主细胞可以可选地经处理或被修改，以包括其他基因的修改，所述基因的修改，赋予与例如异源蛋白质的生物合成(例如，包括可检测标记；删除、改变或截断内源的TCR；或增加的共同刺激因子表达)，相关或无关的所期望的特性。在某些实施例中，宿主细胞是一种人类造血祖细胞。
本发明提供宿主细胞，其包括根据本公开的多核苷酸，其中宿主细胞在其细胞表面，表达通过多核苷酸编码的结合蛋白(即，表达根据本公开的结合蛋白)。在特定实施例中，将表达载体递送至适当的细胞，例如T细胞或抗原呈递细胞，即在其细胞表面显示肽/MHC复合物的细胞(例如树突状细胞)。在某些实施例中，宿主细胞是造血祖细胞或人类免疫系统细胞。例如，免疫系统细胞可以是CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、树突状细胞或其任何结合。在一些实施例中，编码的结合蛋白，包括MHCII限制性TCR结合域，并且宿主细胞(例如CD8+T细胞)包括编码异源CD4+共受体的多核苷酸。
在某些实施例中，其中T细胞是宿主，T细胞可以是幼稚的、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、干细胞记忆T细胞或其任何结合。在某些实施例中，T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞或两者兼有。导入宿主细胞的表达载体还可以包括，例如淋巴组织特异性转录调节元素(TRE)，例如B淋巴细胞、T淋巴细胞，或树突状细胞特异性TRE。
宿主细胞可以包括任何单个细胞或细胞培养物，其可接收载体，或核酸或表达蛋白的结合。这个术语还包括宿主细胞的后代，无论是遗传上的还是表型上的相同或不同。适合的宿主细胞可能取决于载体，并且可能包括哺乳动物细胞、动物细胞、人类细胞、猿猴细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。可通过使用病毒载体、经磷酸钙沉淀转化、DEAE-葡聚糖、电穿孔、微量注射或其他方法，诱导这些细胞与载体或其他材料结合。
本发明提供了一种非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的细胞，所述细胞呈递本发明所述的结合蛋白，或本发明所述的融合分子。
在一个实施方案中，通过基因转染使细胞表达有本发明所述的T细胞受体，即，所述T细胞受体通过跨膜区锚定在所修饰的细胞的细胞膜上，并具有识别抗原多肽的功能。
作为优选的实施方案，所述细胞为T细胞，细胞可以通过本领域已知的方法分离得到。例如，T细胞可以从不同组织器官获得，包括外周血、骨髓、淋巴组织、脾脏、脐带血、肿瘤组织。作为一种可选择的实施方式，T细胞可以来自造血干细胞(HSCs)，包括来自骨髓、外周血或者脐带血，通过干细胞标记分子例如CD34而分离获得。
作为另一种可选择的实施方式，T细胞可以来自诱导性多功能干细胞(iPScells)，包括把特定基因或特定基因产物导入体细胞，使该体细胞转化为干细胞后，体外诱导分化成T细胞或其前体细胞。T细胞可以通过常用方法如密度梯度离心法而获得，密度梯度离心法的例子包括Ficoll或者Percoll密度离心。
作为一种实施方案，是利用血浆分离置换法(apheresis)或白细胞去除法(leukapheresis)从外周血获得富集的T细胞的产物。
作为另一种实施方案，是用抗体标记特定细胞群后，通过磁珠分离的方式(如系统(Miltenyi Biotec))、或流式细胞分离的方式获得富集的CD8+或CD4+T细胞。
作为另一种实施方案，所述T细胞前体细胞为造血干细胞。可以将本发明所述TCR的编码基因直接引入造血干细胞，然后转输到体内，进一步分化成为成熟T细胞；也可以将编码基因引入在体外特定条件下由造血干细胞分化成熟的T细胞中。
嵌合分子
本发明提供了嵌合分子，包含与非细胞底物、毒素和/或抗体缀合的本发明所述的结合蛋白或其一部分，缀合可以是共价的或非共价的。本发明的嵌合分子可以是可溶的。
作为一种实施方案，所述嵌合分子包含与非细胞底物缀合的本发明所述的结合蛋白(TCR)或其一部分，非细胞底物可以是纳米颗粒、外泌体或本领域已知的任何非细胞底物。
作为一种实施方案，本发明提供了嵌合分子，其包含与毒素或抗体缀合的本发明的结合蛋白(TCR)、由本发明的多核苷酸编码的TCR或其部分。毒素或抗体可以是细胞毒性的。毒素可以是细胞毒性分子或化合物，例如放射性分子或化合物。嵌合分子的TCR部分可以赋予识别表达抗原蛋白或肽的细胞的能力。因此，嵌合分子可以特异性识别和/或结合表达抗原的肿瘤细胞。因此，本发明的嵌合分子可以提供细胞毒性毒素、抗体和/或化合物的抗原靶向性递送。
组合物或药物组合物
一种药物组合物，包括本发明所述的结合蛋白。融合分子、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、、细胞或嵌合分子；及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
可用于将本发明组合物配制为液体溶液形式的药学上可接受的载体包括生理盐水，无菌水，林格氏溶液，缓冲盐溶液，葡萄糖溶液，麦芽糊精溶液，甘油，乙醇，和其中两种或更多种的混合物。如果需要，本发明的组合物也可含有其它常规添加剂，如抗氧化剂，缓冲剂和抑菌剂。此外，本发明组合物还可包含稀释剂，分散剂，表面活性剂，粘合剂和润滑剂，以将它配置成可注射制剂，如水性溶液，悬浮液和乳剂，丸剂，胶囊剂，颗粒剂和片剂。
药物组合物可以是各种口服或胃肠外制剂形式。使用包括填料，填充剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂，和表面活性剂在内的常规稀释剂或赋形剂配制药物组合物。固体口服制剂包括片剂，丸剂，粉剂，颗粒剂，胶囊等。这些固体制剂可通过将至少一种化合物与一种或多种赋形剂，例如，淀粉，碳酸钙，蔗糖，乳糖，明胶等混合来制备。除了简单的赋形剂，也可使用润滑剂如硬脂酸镁或滑石。此外，液体口服制剂包括悬浮液，溶液，乳剂和糖浆等。除了通常用作简单稀释剂的水和液体石蜡外，还可包括各种赋形剂，例如，润湿剂，甜味剂，香料，防腐剂等。肠胃外给药的制剂包括灭菌水溶液，非水溶剂，悬浮剂，乳剂，冻干剂，栓剂等。丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射酯如油酸乙酯等可以用作非水溶剂和悬浮剂。栓剂主要成分可以包括witepsol，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂脂，甘油明胶等。
药物组合物可具有选自下组的任意一种制剂：片剂，丸剂，粉末，颗粒，胶囊，悬浮液，溶液，乳剂，糖浆，灭菌水溶液，非水溶液，悬浮液，乳液，冻干制剂和栓剂。
在本发明中，癌症可以是实体瘤或液体肿瘤。优选的，癌症可以是乳腺癌(包括三阴性)、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、肺癌(NSCLC和SCLC)、膀胱癌或头颈癌。替代地或另外地，癌症可以是白血病或淋巴瘤。在这些癌症中，白血病是优选的。本发明的结合蛋白(TCR)、融合分子、核酸、组合物或细胞可以通过注射给药，例如静脉内或直接肿瘤内注射。
治疗方法可进一步包括分开、联合或依次给药另外的抗肿瘤剂。这种试剂的实例是本领域已知的，并且可以包括免疫激活剂和/或T细胞调节剂。
本发明的每个方面的优选特征在细节上作必要修改后用于每个其他方面。本文提到的现有技术文件在法律允许的最大范围内并入本文。
具体实施方式
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用生物工程领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。
实施例1高通量测序筛选TCR序列
1、RNA提取及质控
收集急性髓系白血病患者的外周血样本，患者无甲肝，乙肝，丙肝，戊肝，艾滋病，梅毒，淋病和结核感染。
在5mL Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min，磁珠分选T细胞。采用TRIzol法对处理的细胞样本进行RNA的提取，对提取后的RNA质量使用Qubit RNA HS Assay kits，经2100生物分析仪(安捷伦)检测RNA完整性。
2、反转录及文库制备
用Repertoire Analysis Kit(Human TCR alpha,beta)进行建库。将所有试剂置于冰上解冻，在配置mix之前，混匀和离心这些试剂。在冰上配置杂交引物需用的mix(表1)。充分混匀后离心，加热反转录引物杂交mix，65℃5min，冰上孵育至少2min。在冰上准备配制反转录mix(表2)，混匀后离心mix。
表1反应体系
| 组分 | 体积 |
| RT dNTP Mixture | 1μl |
| RT Primer H TCRα/β | 1μl |
| RNA样本(100pg-1000ng) | 最多到6.2μl |
| Nuclease-free water | 补足至8.2μl |
表2反转录体系
| 组分 | 体积 |
| RT buffer A | 4μl |
| RT buffer B | 1μl |
| RT buffer C | 3.8μl |
| RT Universal primer | 1μl |
| RNase inhibitor | 1μl |
| Reverse Transcriptase | 1μl |
| 总体积 | 11.8μl |
将11.8μl的杂交buffer加到上一步反应的杂交RNA中混匀，然后离心，在15PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序(表3)：
表3反应条件
3、第一步PCR
准备第一步PCR需用的试剂(表4)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第一步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。
表4第一步PCR反应体系
每管中加入41μl的第一步PCR mix，加入9μl的第一链cDNA产物中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：
表5第一步PCR反应条件
4、第二步PCR
准备第二步PCR需用的试剂(表6)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。
表6第二步PCR反应体系
准备一个新的PCR管，每管中加入1μl的第二步PCR引物，hTCRα#1-18
(编号：A1-A18)，或者hTCRβ#1-18(编号：B1-B18)。加入39μl第二步反应的mix和10μl的第一步PCR产物混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：
表7第二步PCR反应条件
5、第三步PCR
准备第三步PCR需用的试剂在冰上解冻(表9)，混匀后瞬时离心。在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。
表8第三步PCR反应体系
准备一个新的PCR管，每管中加入45μl的第三步PCR mix，加入5μl的第二步PCR产物中，用手指肚弹匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：
表9第三步PCR反应条件
6、琼脂糖凝胶电泳
配置1.5％的琼脂糖胶，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。hTCRɑ/β片段在650bp左右。
7、用AGENCOURT AMPure XP(BEACKMAN)磁珠纯化
准备nuclease-free 0.2mL的8连管，按照表10稀释文库。
表10稀释体系
| 组分 | 体积 |
| 第三步PCR产物 | 30μl |
| Nuclease-free water | 20μl |
| 总体积 | 50μl |
配置DNase-free 70％乙醇(sigma)。磁珠使用前室温平衡30min，将22.5μl的磁珠加到稀释后文库中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单的离心。将8连管放置在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。将所有的上清转移到新的8连管中。再次混匀未使用过的磁珠，加17.5μl的磁珠到上清中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单离心。将8连管放在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。弃85μl的上清，保留5μl的上清以免吸到磁珠。不要将磁珠与磁力架分离。加200μl的70％的乙醇漂洗。室温30s，弃酒精，重复酒精洗涤步骤。弃所有上清，加30μl的10mM Tris-HCl到每个PCR管中，用移液器混匀至少10次。室温孵育2min然后简单离心。将离心管放置在磁力架上室温5min，分离液体和磁珠。将上清20μl转移至新的PCR管中。
8、文库浓度定量及质控
测定文库浓度用Qubit dsDNA HS kit(英潍捷基)，使用设备Qubit 2.0(life)，取2μl的样本用于测定。通常文库浓度集中在5-40ng/μl。如果样本浓度≥1.72ng/μl可用于Miseq测序。
9、文库目标片段质控
人的TCRα/β文库目标片段集中在650bp，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对文库片段进行质控，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。
10、文库混库及质控
文库混样，是按此批次浓度最低的文库为标准，浓度最低文库乘以10μl为基准纳克数，其他文库按照此纳克数进行取样，确保每个文库的总量是一致的，混样后按照纳克与摩尔数之间的换算，稀释到8.58ng/μl(20nM，650bp)。
11、高通量测序
文库使用Miseq(Illumina)进行2×300bp双端测序，对上述混合完成的文库再次使用设备Qubit 2.0(life)进行文库定量，最终稀释到10pM，与10pM denatured PhiX进行混合(PhiX占比30％)，混合后的600μl进行上机测序。
12、数据分析
采用MiXCR进行初级分析，可以对高度个性化的TCR和免疫球蛋白序列进行分析。MiXCR可以针对不同的数据类型在参数上进行调整，并对分析结果和输出进行优化。进一步高级分析多个多样性指数，如香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)、Inverse-Simpson指数和基尼指数(Gini)等。采用VDJtools用于二级TCR profiling分析以及多样性评估。
13、噬菌体展示技术筛选高亲和力的TCR序列。
14、结果
通过噬菌体展示技术筛选出高亲和力的TCR，其α链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示，其中CDR1-3的序列分别如SEQ ID NO：1-3所示。
TCR的β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12-20任一所示，其中，CDR1的序列如SEQ ID NO：5所示，CDR2的序列如SEQ ID NO：6-8任一所示，CDR3的序列如SEQ ID NO：9-11任一项所示。
实施例2 TCR-T的构建
1、利用高通量测序和数据分析结果，全合成相关序列，通过XbaI/SalI限制内切酶切点，连接到pCDH载体中。
2、TCR-T细胞制备
采集健康人外周血，在Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min。磁珠分选T细胞。同时加入CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激，24h及48h后加入病毒感染2次，病毒感染时加入IL-2，培养3-20天，获得TCR-T细胞。
实施例3 TCR-T杀伤功能检测
从本研究中所述的序列构建的TCR-T中任选一个进行功能检测。
计数靶细胞(MV4-11)和阴性参照靶细胞(Daudi)，分别标记Celltrace far red和CFSE染色。计数TCR-T(Vβ可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)细胞作为效应细胞。按照计划效靶比(3：1，9：1，18：1)，重悬效应细胞和靶细胞至相应浓度。
圆底96孔板中每个效靶比分别铺入铺入组1效应细胞、组2靶细胞和组3效应细胞+靶细胞，每组4个复孔。培养2-24h，收细胞样本，分别收管A：组1效应细胞+组2靶细胞，管B：组3效应细胞+靶细胞，多聚甲醛液固定，流式上机。作Killing Rate与E:T Ratio曲线图。其中，×100％
结果，如图1所示，相比对照组，本申请的TCR-T具有较好的杀伤效果。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 深圳大学总医院
<120> TCR及其在诊断/治疗中的应用
<141> 2021-10-14
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu Phe Trp
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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Pro
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<400> 12
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
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<210> 15
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<400> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
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Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg Ala Asn Ala Met
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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100 105 110
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
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Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg Ala Asn Ala Met
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Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr
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85 90 95
Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
100 105 110
Claims (25)
1.一种T细胞受体，其特征在于，包括：T细胞受体 α链可变结构域Vα，T细胞受体β链可变结构域Vβ；
所述Vα包括SEQ ID NO:3的CDR3氨基酸序列，所述Vβ包括SEQ ID NO:9的CDR3氨基酸序列；和所述Vα包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的CDR1和CDR2氨基酸序列；所述Vβ包括SEQ ID NO:5所示的CDR1和SEQ ID NO:6所示的CDR2氨基酸序列；所述Vα的序列如SEQ IDNO:4所示，Vβ的序列如SEQ ID NO:12所示。
2.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体是嵌合的、人源化的或人源的。
3.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体包括α链恒定结构域和/或β链恒定结构域。
4.根据权利要求1-3任一项所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体与可检测标记物、治疗剂相连接。
5.一种融合分子，其特征在于，包括第一部分和第二部分，所述第一部分为权利要求1-4任一项所述的T细胞受体。
6.编码权利要求1-4任一项所述的T细胞受体的分离的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，编码T细胞受体的多核苷酸是优化的密码子。
8.表达载体，其特征在于，包含权利要求6或7所述的多核苷酸。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述多核苷酸可操作地连接表达控制序列。
10.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体能够将所述多核苷酸递送至宿主细胞。
11.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是病毒载体。
12.根据权利要求11所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体是慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
13.宿主细胞，其特征在于，包括权利要求6或7所述的多核苷酸，或权利要求8-12任一项所述的表达载体。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是造血祖细胞或免疫系统细胞。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于，所述免疫系统细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞或其任何结合。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其特征在于， 所述免疫系统细胞为CD4+T细胞。
17.根据权利要求15所述的宿主细胞，其特征在于，所述T细胞为幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、效应记忆T细胞，或其任何结合。
18.根据权利要求13-17任一项所述的宿主细胞，其特征在于，与内源的T细胞受体相比，T细胞受体在T细胞上的表面表达更高。
19.一种非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的细胞，其特征在于，所述细胞呈递权利要求1-4任一项所述的T细胞受体，或权利要求5所述的融合分子。
20.根据权利要求19所述的细胞，其特征在于，所述细胞为T细胞。
21.嵌合分子，其特征在于，包含与非细胞底物、毒素和/或抗体缀合的权利要求1-4任一项所述的T细胞受体，所述非细胞底物为纳米颗粒、外泌体。
22.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的T细胞受体，权利要求5所述的融合分子，权利要求6或7所述的多核苷酸，权利要求8-12任一项所述的表达载体，权利要求13-18任一项所述的宿主细胞，权利要求19或20所述的细胞或权利要求21所述的嵌合分子。
23.根据权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
24.一种生产根据权利要求1-4任一项所述的T细胞受体或权利要求5所述的融合分子的方法，所述方法包括a)使根据权利要求13-18任一项所述的宿主细胞保持在用于表达权利要求1-4任一项所述的T细胞受体或权利要求5所述的融合分子的最优条件下，以及b)分离所述T细胞受体或融合分子。
25.权利要求1-4任一项所述的T细胞受体，权利要求5所述的融合分子，权利要求6或7所述的多核苷酸，权利要求8-12任一项所述的表达载体，权利要求13-18任一项所述的宿主细胞，权利要求19或20所述的细胞，权利要求21所述的嵌合分子或权利要求22或23所述的组合物在制备治疗和/或预防急性髓系白血病的药物中的应用。
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