CN113286815A - 间皮素特异性t细胞受体及其在免疫治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本文提供了对Msln20‑28或Msln530‑538肽具有特异性的结合蛋白。还提供了编码结合蛋白的多核苷酸，以及包含结合蛋白或多核苷酸的组合物和重组宿主细胞。组合物和重组宿主细胞可用于治疗患有间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、其中Msln20‑28肽在癌症的肿瘤细胞上表达的癌症或其中Msln530‑538肽在癌症的肿瘤细胞上表达。

Description

间皮素特异性T细胞受体及其在免疫治疗中的应用
相关申请
与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且在此通过引用将其并入说明书中。包含序列表的文本文件的名称为360056_475WO_SEQUENCE_LISTING.txt。文本文件为115KB，创建于2019年11月8日，并通过EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
本公开涉及生物医学领域，并且具体地，涉及用于治疗其中细胞表达间皮素的疾病或病症的方法和组合物，例如在癌症治疗中。特别地，本公开的实施例涉及对肿瘤相关抗原间皮素具有高亲和力的TCR的方法和组合物，表达这种高亲和力的抗原特异性TCR的T细胞，编码其的核酸以及用于进行包括工程改造的T细胞的细胞免疫疗法的使用方法。
背景技术
肿瘤-特异性T细胞的过继转移是消除现有肿瘤的诱人策略，并且需要在体内建立强大的抗原特异性T细胞种群以消除现有肿瘤并预防复发(参见Stromnes,et al.,Immunol.Rev.257:145,2014)。尽管转移肿瘤特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是安全的，并且可以在特定患者中介导直接的抗肿瘤活性(参见Chapuis et al.,Cancer Res.72:LB-136,2012；Chapuis et al.,Sci.Transl.Med.5:174ral27,2013；和Chapuis et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.09:4592,2012)，从每个患者或供体分离的CTL亲和力的可变性限制了抗临床试验中的抗肿瘤功效(参见Chapuis et al.,2013)。由于TCR亲和力是CTL亲和力的重要决定因素(请参见Zoete et al.,Frontiers Immunol.4:26％,2013)，因此已开发出使用高亲和力TCRα/β基因重定向供体或患者T细胞抗原特异性的策略从特异于肿瘤特异性抗原的充分表征的T细胞克隆中分离得到(参见Stromnes et al.,Immunol.Rev.257:145,2014和Robbins et al.,J.Clin.Oncol.29:917,2011)。
这种高亲和力的自我/肿瘤反应性T细胞很少见，因为表达自我/肿瘤反应性TCR的T细胞会受到中枢和外周耐受性(参见Stone and Kranz,Frontiers Immunol.4:244,2013)，捐助者之间的相对TCR亲和力差异很大。因此，必须筛选许多匹配的供体以鉴定足够高亲和力的肿瘤特异性T细胞克隆，从中可以产生TCRα/β基因治疗构建体。例如，分离具有单个HLA等位基因高功能亲和力的自然引发的Wilms肿瘤抗原1(WT1)特异性TCR，需要从外周筛选数百个WT-特异性T细胞系，它们代表成千上万个单独的T细胞克隆超过75个正常供体的库，这是一个非常费时费力的过程(参见Chapuis et al.,2013；Schmitt et al.,Hum.Gene Ther.20:1240,2009；和Ho et al.,J.Immunol.Methods 310:40,2006)。
需要针对多种癌症例如实体瘤的替代性抗原特异性免疫疗法。当前公开的实施例解决了这些需求并提供了其他相关的优点。
附图说明
结合附图，从以下描述和所附根据权利要求书中，本文公开的实施例将变得更加清楚。
图1A描绘了基于TCR对肽：HLA四聚体结合的倍数富集对Msln20(SEQ ID NO:31)特异的TCR的鉴定和选择。圈出选择用于进一步研究的TCR。
图1B描绘了基于来自与Msln530：HLA四聚体结合的TCR池的四聚体的倍富集，鉴定和选择对Msln530(SEQ ID NO:32)特异的TCR。圈出选择用于进一步研究的TCR。
图2描绘了在测定存在或不存在CD8共受体的情况下，测定细胞表达的TCR(按亲和力排序，基于四聚体结合)是否能够检测Msln530肽：HLA复合物的测定中Msln530特异性TCR与四聚体的结合。不依赖于CD8的结合与各个T细胞克隆的高亲和力相关。
图3A-3C显示了Msln特异性TCR的进一步功能测试。(A)通过表达Nur77-tdTomato转基因的报告细胞系，通过流式细胞术测定的抗原驱动的活化的T细胞克隆的代表性数据。Nur77是人T细胞中抗原受体信号转导的指标(参见例如，Ashouri and Weiss,J.Immunol.198(2):657-658(2017))。在该测定中，如所示，将T细胞克隆与T2靶细胞孵育，所述T2靶细胞用增加浓度的肽脉冲处理。(B)TCR的Nur77报告基因活性，根据在指定浓度下对用肽脉冲的T2细胞的敏感性进行排名。(C)基于Nur77报告基因活性肽的EC50，对TCR的亲和力排名。在所测试的TCR克隆中，“B11”(在本文中也称为11B)具有最低的EC50。
图4显示了基于Nur77 tomato报道基因活性的TCR克隆响应肽的功能评估。尽管表现出较低的四聚体结合，包括“B9”和“A11”(在本文中也称为“11A”)的几种TCR仍具有高抗原特异性。根据四聚体结合对TCR进行排序(从左到右，从上到下)。
图5A-5C显示了在原代CD8+T细胞中异源表达的TCR的功能评估。从供体PBMC中纯化CD8+T细胞，并用每个TCR进行慢病毒转导。8天后，将分选高四聚体阳性的细胞进一步分选并进一步扩增8-10天。
图6A-6C显示了用指示的Msln特异性TCR转导的原代CD8+T细胞的特征，并在与肽脉冲的T2细胞孵育后评估了功能活性，如通过干扰素-γ产生(A，B)所测量的。基于脉冲进入T2细胞(C)的肽量，通过EC50对TCR进行排名。
图7A-7D显示了通过指示的Msln530特异性TCR或Msln20特异性TCR在存在或不存在外源IFN-γ的情况下转导的CD8+T细胞对两种代表性的Msln-阳性肿瘤细胞系((A,B)MDA-MB-468和(C,D)MDA-MB-231)的特异性裂解。
图8涉及丙氨酸诱变扫描实验，以评估靶Msln20肽(SEQ ID NO:31)的哪些氨基酸对于通过示例性MsIn20特异性TCR有效结合和杀死是必不可少的。产生了一系列变体肽，其中丙氨酸被替换为沿SEQ ID NO:31的肽的每个连续位置，并且通过表达指定的MsIn20特异性TCR的CD8+T细胞评估了每个变体肽的IFN-γ产生。这些数据表明，SEQ ID NO:31的3-6位对于TCR结合是必不可少的。在共有序列SEQ ID NO:60中，“X”表示SEQ ID NO:31中所示残基向丙氨酸的取代突变不影响或基本上不影响TCR与其同源肽靶标的功能结合。
图9A-9D显示了使用对Msln20(SEQ ID NO:31)或Msln530(SEQ ID NO:32)具有特异性的TCR的丙氨酸诱变扫描实验的结果。x轴显示响应于每种丙氨酸取代的肽的IFN-γ+T细胞的百分比。y轴显示测试的肽的序列，其中X指示该残基对于TCR特异性不是必需的，如与野生型肽相比接近正常的功能活性所指示。
图10显示了人肽(SEQ ID NO:63-77)，其基于通过丙氨酸扫描实验确定的TCR的特异性而与靶Msln530肽(SEQ ID NO:32)进行了潜在的交叉反应。表格左侧显示了编码所示肽的基因。如实施例8中所述，将包含通过丙氨酸扫描鉴定的必需残基的共有序列输入预测算法。
图11A和11B描绘了在人蛋白质组中与Msln530具有潜在同源性的合成肽的分析。如实施例9中所述，通过IFN-γ测量两个Msln530特异性TCR(图11A，图11B)(与用高剂量(10μM)的肽脉冲的T2细胞一起温育后的功能活性)。(B)对于显示与测试的TCR有交叉反应性的肽，进行剂量依赖性滴定以确定EC50。基于脉冲进入T2细胞的肽量，通过EC50对TCR进行排名。肽#10来自称为EHF的基因。该基因编码一种蛋白质，该蛋白质属于以上皮-特异性表达为特征的ETS转录因子亚家族。ETS充当转录抑制因子，并可能参与上皮分化和致癌作用。
图12A-12I描绘了实验，其通过在不存在野生型肽的情况下靶向多种供体来源的淋巴母细胞样细胞系(LCL)，来研究表达本公开的示例性Msln特异性TCR的T细胞(Meso20-3B，Meso530-11A或Meso530-11B)的同种异体性的潜力。
图13A-13H描绘了通过靶向不同的供体来源的LCL以评估与其他HLA亚型没有交叉反应的同种反应性的其他分析，如实施例10中所述。如对于细胞系FAH和GIM所示，Meso530-11B表明在存在的情况下潜在的反应性非HLA-A2等位基因的肽段(如表中突出显示)。
具体实施方式
在一些方面，本公开提供结合蛋白，其包含TCRα链可变域(Vα)和TCRβ链可变域(Vβ)，并且能够特异性结合Msln20-28或Msln530-538表位和/或肽(Msln20-28(SLLFLLFSL；SEQ IDNO:31))和Msln530-538(SEQ ID NO:32(VLPLTVAEV))在本文中也分别称为Msln20和M530)；例如，在肽:HLA复合物中。在任何当前公开的实施例中，Msln特异性结合蛋白能够结合Msln肽:HLA复合物，其中Msln肽包含SEQ ID NO:31或32所示的氨基酸序列，并且其中HLA是或包含HLA-A2，例如HLA-A*02:01。
在某些实施例中，Msln特异性20-28特异性结合蛋白包含：(a)TCRVα，其包含SEQ IDNO:33或35所示的CDR3氨基酸序列，和TCRVβ，其中任选地，TCRVβ具有至少约85％(即，至少约85％、86％、87％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)与SEQ ID NO:95或97所示的氨基酸序列具有相同的同一性；(b)TCRVβ，其包含如SEQ IDNO:34或36所示的CDR3氨基酸序列，和(b)TCRVα，其中任选地，TCRVα与SEQ ID NO:96或98所示的氨基酸序列具有至少约85％(即，至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)的同一性；(c)TCRVα，其包含如SEQID NO:33或35所示的CDR3氨基酸序列，其中任选地，TCRVα与SEQ ID NO:96或98所示的氨基酸序列具有至少约85％的同一性；和TCRVβ，其包含SEQ ID NO:34或36所示的CDR3氨基酸序列，其中任选地，TCRVβ与SEQ ID NO:95或97所示的氨基酸序列具有至少约85％的同一性。
除非另有明确说明，否则如本文所用，“至少约”指示百分数的序列同一性包括其指示百分数±20％，以及高于该特定百分数的每个整数和非整数百分数。因此，与参考序列(例如，SEQ ID NO:1-123中的任何一个)“至少约85％”的同一性包括约85％、86％、87％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％与参考序列具有同一性，并且还包括介于两个整数百分比之间的所有非整数百分比(例如92.5％、99.1％等等)。
在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白包含如SEQ ID NO:33所示的CDR3α氨基酸序列和如SEQ ID NO:34所示的CDR3β氨基酸序列。在进一步的实施例中，结合蛋白包含如SEQ ID NO:80所示的CDR1α氨基酸序列，如SEQ ID NO:81或118所示的CDR2α氨基酸序列，如SEQ ID NO:78、82、83或84的序列中的任一项所述的CDR1β氨基酸序列，以及SEQ ID NO:79所示的CDR2β氨基酸序列。在某些实施例中，Vα包含与SEQ ID NO:96所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和/或Vβ包含与SEQ ID NO:95具有至少约85％同一性的氨基酸序列，其中任选地CDR1α、CDR2α、CDR1β和/或CDR2β没有变化。
在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白包含(i)TCRVβ，该TCRVβ包含(a)与TRBV12-4*01(例如，TRBV12-4*01编码的氨基酸序列的长度为至少约为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或108个连续氨基酸)编码的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；和/或(b)与TRBJ2-7*01(例如，具有至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸长的TRBJ2-7*01编码的氨基酸序列)编码的氨基酸序列具有至少约85％的同一性的氨基酸序列；和/或(ii)TCRVα，其包含(a)与由TRAV1-1*01编码的氨基酸序列(例如，具有至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或107的连续氨基酸的TRAV1-1*01编码的氨基酸序列)具有至少约85％的同一性的氨基酸序列和/或(b)与TRAJ3*01(例如，至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19或20的氨基酸长的TRAJ3*01编码的氨基酸序列)编码的氨基酸序列。
在任何当前公开的实施例中，TCRVβ可包含与由TRBD1*01或TRBD2*02编码的氨基酸序列至少约85％相同的氨基酸序列。
这些和其他TCR基因编码的氨基酸序列是已知的，可以在例如imgt.org上找到，该数据库提供了人类TRAV、TRBV、TRAJ、TRBJ、TRBD、TRAC和TRBD的基因表以及核苷酸和氨基酸序列。
在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白包含如SEQ ID NO:36所示的CDR3α氨基酸序列和如SEQ ID NO:35所示的CDR3β氨基酸序列。在一些实施例中，结合蛋白还包含SEQID NO:85所示的CDR1α氨基酸序列，SEQ ID NO:86或119所示的CDR2α氨基酸序列，SEQIDNO:82、83或84中的任一项所示的CDR1β氨基酸序列，以及SEQ ID NO:79所示的CDR2β氨基酸序列。在某些实施例中，Vα包含与SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和/或Vβ包含与SEQ ID NO:97具有至少约85％同一性的氨基酸序列，其中CDR1α，CDR2α、CDR1β和/或CDR2β任选地没有变化。
在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白包含TCRVα，其包含(a)与TRAV12-3*01(例如，至少长度约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或108的连续氨基酸的TRAV12-3*01编码的氨基酸序列)编码的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。和/或(b)与TRA29*01编码的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列(例如，至少长度约5、6、7、8、9、10、11、12、12、14、15、16、17、18、或19的连续氨基酸的TRAJ29*01编码的氨基酸序列。
在某些实施例中，SEQ ID NO:31的残基1、2、7、8或9中任一个或多个的丙氨酸诱变不会消除或基本不损害Msln20-28特异性结合蛋白的结合。在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白能够结合包含SEQ ID NO:60所示的共有氨基酸序列或由其组成的肽，例如在本文公开的肽:HLA复合物中。
在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白包含：(a)包含如SEQ ID NO:37或39所示的CDR3氨基酸序列的TCRVα，和TCRVβ，其中TCRVβ任选地与SEQ ID NO:99或101所示的氨基酸序列具有至少约85％的同一性；(b)TCRVβ，其包含如SEQ ID NO:34或36所示的CDR3氨基酸序列，和(b)TCRVα，其中该TCRVα任选地与SEQ ID NO:100或102所示的氨基酸序列组具有至少约85％的同一性；或(c)包含如SEQ ID NO:37或39所示的CDR3氨基酸序列的TCRVα和包含如SEQ ID NO:38或40所示的CDR3氨基酸序列的TCRVβ。
在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白包含如SEQ ID NO:37所示的CDR3α氨基酸序列和如SEQ ID NO:38所示的CDR3β氨基酸序列。在一些实施例中，结合蛋白还包含如SEQ ID NO:89所示的CDR1α氨基酸序列，如SEQ ID NO:90所示的CDR2α氨基酸序列，如SEQID NO:83或87所示的CDR1β氨基酸序列，以及SEQ ID NO:88所示的CDR2β氨基酸序列。在某些实施例中，Vα包含与SEQ ID NO:100所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和/或Vβ包含与SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，其中任选地CDR1α、CDR2α、CDR1β和/或CDR2β没有变化。
在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白包含如SEQ ID NO:39所示的CDR3α氨基酸序列和如SEQ ID NO:40所示的CDR3β氨基酸序列。在一些实施例中，结合蛋白进一步包含如SEQ ID NO:93所示的CDR1α氨基酸序列，如SEQ ID NO:94所示的CDR2α氨基酸序列，如SEQ ID NO:83、84或91所示的CDR1β氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:92所示的CDR2β氨基酸序列。在某些实施例中，Vα包含与SEQ ID NO:102所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和/或Vβ包含与SEQ ID NO:101具有至少约85％同一性的氨基酸序列，其中CDR1α、CDR2α、CDR1β和/或CDR2β任选地没有变化。
在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白包含TCRVβ，该TCRVβ包含与由TRBJ2-3*01编码的氨基酸序列(例如，长度至少约为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或15个连续氨基酸编码的氨基酸序列TRBJ2-3*01)具有至少约85％同一性的氨基酸序列。
在某些实施例中，SEQ ID NO:32的残基3、5、6或9中的任一个或多个的丙氨酸诱变不会消除或基本不损害Msln530-538特异性结合蛋白的结合。在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白能够结合包含SEQ ID NO:61所示的共有氨基酸序列或由其组成的肽，例如在本文公开的肽:HLA复合物中。
在某些实施例中，SEQ ID NO:32的残基1、5或9中的任一个或多个的丙氨酸诱变不会消除或基本不损害Msln530-538特异性结合蛋白的结合。在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白能够结合包含SEQ ID NO:62所示的共有氨基酸序列或由其组成的肽，例如在本文公开的肽:HLA复合物中。
在某些实施例中，本公开的Msln530-538特异性结合蛋白不结合或相对于Msln530-538不特异性结合至肽：HLA复合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76和77中任何一项或多项所示的序列氨基酸或由其组成，以及其中HLA任选地包含HLA-A2，例如HLA-A:02*01。
在任何当前公开的实施例中，在没有或独立于CD8的情况下，Msln特异性结合蛋白(即，Msln20-28特异性结合蛋白，Msln530-538特异性结合蛋白)能够结合本文公开的Msln肽:HLA复合物。在某些实施例中，结合蛋白(例如，当在人T细胞的细胞表面上表达时)具有约9μM、约8μM、约7μM、约6μM、约5μM、约4μM、约3μM、约2μM、约1μM、约0.9μM、约0.8μM、约0.7μM、约0.6μM、约0.5μM、约0.4μM、约0.3μM、约0.2μM或更小的Msln肽EC50。
在没有Msln肽抗原的情况下，Msln特异性结合蛋白对各种人类HLA类型没有同种反应力。在某些实施例中，当不存在本文提供的Msln肽时，当与表达以下物质的细胞接触时：(i)HLA-C6:02:01；(ii)没有HLA-B13:02:01的HLA-B13:01:01；(iii)HLA-A3；(iv)HLA-A29；(v)HLA-B40；(vi)HLA-B44；(vii)HLA-C3；(viii)HLA-C16；(ix)HLA-A1；(x)HLA-24；(xi)HLA-B7；(xii)HLA-B57；(xiii)HLA-C7；(xiv)HLA-A11；(xv)HLA-B15；(xvi)HLA-C4；(xvii)HLA-C12；(xviii)HLA-B8；(xix)HLA-B49；(xx)HLA-B51；(xxi)HLA-C15；(xxii)HLA-A30；(xxiii)HLA-A68；(xxiv)HLA-C2；(xxv)HLA-A32；(xxvi)HLA-A33；(xxvii)HLA-B55；(xxviii)HLA-C1；(xxvix)HLA-C5；(xxix)HLA-B8；(xxx)HLA-B35；或(xxxi)(i)-(xxx)的任何组合，表达本公开的Msln特异性结合蛋白的免疫细胞(例如，T细胞)不产生IFN-γ和/或不表现出活化(例如，CD8表达、CD3表达、Nur77表达)和/或细胞毒性活性(例如，穿孔素和/或颗粒酶的特异性杀伤、产生和释放)。
还提供了包括，编码和/或表达结合蛋白的组合物和重组宿主细胞(例如，免疫细胞，例如T细胞)。在任何当前公开的实施例中，结合蛋白能够被宿主T细胞在细胞表面表达。在任何当前公开的实施例中，通过在免疫细胞(例如，T细胞)表面表达的Msln特异性结合蛋白与Msln肽:HLA复合物的结合激活免疫细胞，其中任选地确定通过Nur77的表达和/或活性来激活。
目前公开的结合蛋白对同源Mlsn肽抗原高度敏感。在某些实施例中，当免疫细胞存在约10-2μM肽、约10-1μM肽、约1μM肽或约101μM肽时、Nur77表达增加，其中所述肽任选地由抗原肽呈递，即在肽:HLA复合物中。
另一方面，提供了编码如本文所述的间皮素特异性结合蛋白的多核苷酸。在某些实施例中，编码结合蛋白的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1-5、9-13、17-21、25-27和120中的任一种多核苷酸序列具有至少约50％序列同一性(即，至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的多核苷酸。还提供了包含多核苷酸的载体。
目前公开的结合蛋白，重组宿主细胞和相关组合物可用于治疗患有与间皮素表达和/或活性有关的疾病或病症的受试者，例如癌症。在某些实施例中，癌症是实体癌。在某些实施例中，实体癌是或包括胆汁癌、膀胱癌、骨和软组织癌、脑肿瘤、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、结肠直肠腺癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、胚胎癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、头颈鳞状细胞癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、恶性黑素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、原发性星形细胞肿瘤、原发性甲状腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、尿路上皮癌、子宫肉瘤或子宫癌。在某些实施例中，本文公开的组合物和重组宿主细胞可用于治疗其中Msln20-28肽在癌症的肿瘤细胞上表达的癌症，或其中Msln530-538肽在肿瘤细胞上表达的癌症，例如间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌或肺癌。
本文还提供了编码如本文提供的结合蛋白的多核苷酸，包含编码结合蛋白的多核苷酸的载体和包含载体的宿主细胞。
在更详细地阐述本公开之前，提供本文中使用的某些术语的定义可能有助于其理解。除非另有明确定义，否则本文所用的技术术语具有其在本领域中所理解的正常含义。在整个本公开中阐述了附加的定义。
在本说明书中，任何浓度范围，百分比范围，比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，以及在适当时其分数(例如十分之一和一个)。整数的百分之一)，除非另有说明。同样，除非另有说明，否则本文所叙述的与任何物理特征，例如聚合物亚基，尺寸或厚度有关的任何数值范围应理解为包括所叙述的范围内的任何整数。当涉及可测量的值，范围或结构时，本文所用的“大约”是指与规定值相差±20％、±10％、±5％、±1％或±0.1％，除非另有说明。
应该理解的是，本文所用的术语“一”和“一种”是指所列举的组分中的“一个或多个”。替代方案(例如“或”)的使用应理解为是指替代方案中的任何一个，全部或任何组合。如本文所用，术语“包括”，“具有”和“包含”是同义使用的，这些术语和其变体旨在被解释为非限制性的。
“可选”或“可选”是指随后描述的元素、组件、事件或情况可能会或可能不会发生，并且该描述包括其中发生元素、组件、事件或情况的情况以及未发生的情况。
此外，应该理解，本申请公开了衍生自本文所述的结构和亚基的各种组合的单个构建体或构建体组，其程度与每个构建体或每个构建体组相同。构建体是单独提出的。因此，特定结构或特定亚单元的选择在本公开的范围内。
术语“基本上由...组成”并不等同于“包含”，而是指根据权利要求的指定材料或步骤，或不实质上影响所要求保护的主题的基本特征的材料或步骤。例如，蛋白质结构域，区域或模块(例如结合结构域，铰链区或接头)或蛋白质(可能具有一个或多个结构域，区域或模块)“基本上”由特定氨基酸组成当结构域、区域、模块或蛋白质的氨基酸序列包括延伸、缺失、突变或其组合(例如，氨基酸或羧基末端或结构域之间的氨基酸)共同构成的序列时最多至域、区域、模块或蛋白质长度的20％(例如，至多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)并且不会实质性影响(即减少的活性不超过50％、例如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)域、区域、模块或蛋白质的活性(例如结合蛋白的靶结合亲和力)。
如本文所用，“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然氨基酸相似的方式起作用的化合物。
如本文所用，“突变”是指分别与参考或野生型核酸分子或多肽分子相比，核酸分子或多肽分子的序列变化。突变可导致几种不同类型的序列变化，包括核苷酸或氨基酸的取代，插入或缺失。在某些实施例中，突变是一个或三个密码子或氨基酸的取代，一个至约5个密码子或氨基酸的缺失或其组合。
“保守取代”是指不显着影响或改变特定蛋白质的结合特性的氨基酸取代。通常，保守取代是其中取代的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的取代。保守取代包括在以下组之一中发现的取代：组1：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)；组2：天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或Z)；组3：天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)；组4：精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)；组5：异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、蛋氨酸(Met或M)、缬氨酸(Val或V)；组6：苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Trp或W)。另外或替代地，可以通过相似的功能，化学结构或组成(例如，酸性、碱性、脂族、芳族或含硫)将氨基酸分组为保守取代基。例如，出于取代的目的，脂族基团可包括Gly、Ala、Val、Leu和Ile。其他保守取代基包括：含硫：Met和半胱氨酸(Cys或C)；酸性的：Asp、Glu、Asn和Gln；小脂肪族，非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；极性，带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；极性带正电荷的残基：His、Arg和Lys；大的脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及较大的芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。其它信息可以在Creighton(1984)蛋白中找到，W.H.弗里曼和公司。在某些实施例中，本公开的变体蛋白、肽、多肽和氨基酸序列可以包含相对于参考氨基酸序列的一个或多个保守取代。
如本文所用，“蛋白质”或“多肽”是指氨基酸残基的聚合物。蛋白质适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸聚合物的人工化学模拟物的氨基酸聚合物。
如本文所用，“融合蛋白”是指在单链中具有至少两个不同的结构域或基序的蛋白，其中所述结构域或基序不是自然地一起存在的(例如，以指定的排列，顺序，或数字或根本没有)。在某些实施例中、融合蛋白包含至少两个不同的结构域或基序、所述结构域或基序不是在单个肽或多肽中一起自然存在的。可以使用PCR，重组工程等来构建编码融合蛋白的多核苷酸，或者可以合成这样的融合蛋白。融合蛋白可进一步包含其他成分，例如标签、接头或转导标记。在某些实施例中，由宿主细胞(例如，T细胞)表达或产生的融合蛋白位于细胞表面，其中融合蛋白锚定在细胞膜上(例如，通过跨膜结构域)，并包含细胞外部分或细胞内部分或组分(例如，包含结合结构域，并且在某些实施例中，包含接头、间隔子或两者)和细胞内部分或组分。
“连接氨基酸”或“连接氨基酸残基”是指多肽的两个相邻基序，区域或结构域之间的一个或多个(例如，约2-10)个氨基酸残基，例如在结合结构域之间在TCR链和相邻的自切割肽之间的相邻恒定结构域。连接氨基酸可以由融合蛋白的构建体设计产生(例如，在编码融合蛋白的核酸分子的构建过程中，由于使用限制酶位点而产生的氨基酸残基)。
“核酸分子”或“多核苷酸”是指包括共价连接的核苷酸的聚合化合物，其可以由天然亚基(例如嘌呤或嘧啶碱基)或非天然亚基(例如吗啉环)组成。嘌呤碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤，以及嘧啶碱基包括尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。核酸分子包括聚核糖核酸(RNA)、聚脱氧核糖核酸(DNA)，其可以是单链或双链的cDNA，基因组DNA和合成DNA。如果是单链，则核酸分子可以是编码链或非编码链(反义链)。编码氨基酸序列的核酸分子包括编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。核苷酸序列的某些形式还可以包括内含子，以至于内含子将通过共转录或转录后机制被除去。换句话说，由于遗传密码的冗余或简并或通过剪接，不同的核苷酸序列可编码相同的氨基酸序列。
也考虑了本公开内容的核酸分子的变体。变体核酸分子与本文定义的或参考的多核苷酸的核酸分子至少70％、75％、80％、85％、90％，并且优选95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同，或在严格杂交条件下与多核苷酸杂交的条件：0.015M氯化钠，在约65-68℃的0.0015M柠檬酸钠或0.015M氯化钠，0.0015M柠檬酸钠和在约42℃的50％甲酰胺。核酸分子变体保留编码具有本文所述功能性(例如特异性结合靶分子)的融合蛋白或其结合结构域的能力。
“序列同一性百分比”是指通过比较序列确定的两个或更多个序列之间的关系。确定序列同一性的优选方法被设计为在所比较的序列之间给出最佳匹配。例如，为了最佳比较目的而对序列进行比对(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入缺口)。此外，出于比较目的，可以忽略非同源序列。除非另外指出，否则本文所参考的序列同一性百分比是在参考序列的长度上计算的。确定序列同一性和相似性的方法可以在可公开获得的计算机程序中找到。序列比对和百分比同一性计算可以使用BLAST程序(例如，BLAST 2.0，BLASTP，BLASTN或BLASTX)进行。在BLAST程序中使用的数学算法可以在Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)中找到。在本公开的上下文中，将理解的是，在将序列分析软件用于分析的情况下，分析的结果基于所引用程序的“默认值”。“默认值”是指首次初始化时最初随软件加载的任何一组值或参数。
如本领域中所理解的，两个多肽之间的“相似性”是通过比较该多肽的氨基酸序列和保守氨基酸取代基与第二个多肽的序列来确定的(例如，使用GENEWORKSTM，Align、ClustalTM、BLAST算法等)。在某些实施例中，BLAST算法是优选的。
术语“分离的”是指将材料从其原始环境(例如，如果是天然存在的自然环境)中除去。例如，没有分离出存在于活体动物中的天然存在的核酸或多肽，而是分离了与天然系统中的一些或全部共存物质分离的相同核酸或多肽。这样的核酸可以是载体的一部分和/或这样的核酸或多肽可以是组合物(例如细胞裂解物)的一部分，并且仍然被分离，因为对于核酸或多肽来说，这样的载体或组合物不是该载体的天然环境的一部分。术语“基因”是指与产生多肽链有关的DNA片段。它包括编码区之前和之后的区域(“前导区和尾区”)以及各个编码段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
在某些情况下，本文所用的术语“变体”是指全长序列的至少一个片段，更具体地讲是指相对于全长而言的一个或多个氨基酸或核酸序列序列，在一个或两个末端被一个或多个氨基酸截短。这样的片段包括或编码具有原始序列或其变体的至少6、7、8、10、12、15、20、25、50、75、100、150或200个连续氨基酸的肽。变体的总长度可以是至少6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸。
在一些实施例中，术语“变体”不仅涉及至少一个片段，而且涉及包括其与参考氨基酸序列或其片段至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的氨基酸序的多肽或其片段，其中除生物学活性或多肽的折叠或结构所必需的氨基酸以外的氨基酸被缺失或取代，一种或多种此类必需氨基酸以保守的方式被替换，和/或氨基酸为添加这样的多肽以保持多肽的生物学活性。现有技术包括可用于比对两个给定的核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种方法(参见例如，Arthur Lesk(2008),Introduction to bioformatics,Oxford UniversityPress,2008,3rd edition)。在某些实施例中，可以使用默认设置来使用Clustal W软件(Larkin,M.A,et al.(2007).Clustal W and Clustal X verision 2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)。
在某些实施例中，变体可以另外包括化学修饰，例如同位素标记或共价修饰，例如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧、瓜氨酸化、羟基化等。修饰多肽的方法是已知的，并且通常将被采用以便不消除或基本上不降低多肽的期望活性。
在一实施例中，术语核酸分子的“变体”包括其互补链例如在严格条件下与参照或野生型核酸杂交的核酸。杂交反应的严格性可由本领域普通技术人员容易地确定，并且通常是取决于探针长度，洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长的探针需要较高的温度才能进行适当的退火，而较短的探针则需要较少的温度。杂交通常取决于变性DNA与低于其解链温度的环境中存在的互补链退火的能力：探针和可杂交序列之间所需的同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。结果，较高的相对温度倾向于使反应条件更严格，而较低的温度则不太严格。有关杂交反应的严格性的其他细节和解释，请参见Ausubel，F.M.(1995),Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley&Sons,Inc。此外，本领域技术人员可以按照手册(Boehringer Mannheim GmbH(1993)The DIG System Users Guide forFilter Hybridization,Boehringer MannheimGmbH,Mannheim,Germany and in Liebl,W.,Ehrmann,M.,Ludwig,W.,and Schleifer,K.H.(1991)International Journal ofSystematic Bacteriology 41:255-260)给出的关于如何通过杂交识别DNA序列的指导。在一实施例中，严格条件适用于任何杂交，即，仅当探针与靶序列具有70％或更高的同一性时才发生杂交。相对于靶序列具有较低同一性的探针可以杂交，但是这种杂交体是不稳定的，并且将在严格的条件下(例如，将盐的浓度降低至2×SSC，或者任选地并随后至0.5×SSC，当温度为例如，大约50℃–68℃、大约52℃–68℃、大约54℃–68℃、大约56℃–68℃、大约58℃–68℃、大约60℃–68℃、大约62℃–68℃、大约64℃–68℃或大约66℃–68℃)在洗涤步骤中被去除。在一实施例中、温度为约64℃-68℃或约66℃-68℃。可以将盐的浓度调整为0.2×SSC或甚至0.1×SSC。相对于参考或野生型序列具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％可以隔离。在一实施例中，如本文所用，术语核酸序列的变体是指根据遗传密码的简并性而编码与参考核酸序列相同的氨基酸序列及其变体的任何核酸序列。
“功能变体”是指多肽或多核苷酸，其与本公开的亲本或参考化合物在结构上相似或基本在结构上相似，但是在某些情况下在组成上略有不同(例如，一个碱基，原子或官能团是不同的，添加的或去除的；或者一个或多个氨基酸被突变，插入或删除)，这样多肽或编码的多肽能够以至少50％的功能执行编码的亲本多肽的至少一种功能效率，优选至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的活性水平亲本多肽的片段。换句话说，当功能变体在所选测定中表现出不超过50％的性能降低时，本发明的多肽或编码的多肽的功能变体具有“相似的结合”，“相似的亲和力”或“相似的活性”。与亲本或参考多肽相比，例如用于测量结合亲和力的测定(例如，
Figure BDA0003151581420000141
或四聚体染色，用于测量缔合(Ka)或解离(KD)常数)，亲和力或宿主细胞的活化。如本文所用，“功能部分”或“功能片段”是指仅包含亲本或参考化合物的结构域，基序，部分或片段的多肽或多核苷酸，并且该多肽或编码的多肽保留至少50％的活性。与母体或参考化合物的结构域，部分或片段相关的，优选至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、或100％亲本多肽的活性水平，或提供生物学益处(例如效应子功能)。
当本发明的多肽或编码的多肽的“功能部分”或“功能片段”的功能降低不超过50％时，具有“相似的结合”或“相似的活性”。与亲本或参考多肽相比的选择性检测(相对于亲和性而言，优选不超过20％或10％，或与亲本或参考相比不超过对数差异)，例如用于测量结合亲和力或测量效应子功能(例如，细胞因子释放)。在某些实施例中，功能部分是指效应分子，效应域，共刺激分子或共刺激域的“信号传导部分”。
“改变的结构域”或“改变的蛋白质”是指基序，区域，结构域，肽，多肽或蛋白质，其与野生型基序，区域，结构域，肽，多肽或蛋白质(例如野生型TCRα链，TCRβ链，TCRα恒定域或TCRβ恒定域)具有至少85％(例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％)的不同的序列同一性。
如本文所用，“异源的”或“非内源的”或“外源的”是指不是宿主细胞或受试者非天然的任何基因，蛋白质，化合物，核酸分子或活性，或任何基因，蛋白质，化合物，核酸分子或宿主细胞或已改变的受试者的天然活性。异源，非内源或外源包括基因，蛋白质，化合物或核酸分子，这些基因，蛋白质，化合物或核酸分子已被突变或以其他方式改变，使得结构，活性或两者在天然和改变后的基因，蛋白质，化合物或核酸分子。在某些实施例中，异源，非内源或外源基因，蛋白质或核酸分子(例如受体，配体等)对于宿主细胞或受试者而言可能不是内源的，而是编码此类基因的核酸，蛋白质或核酸分子可能已经通过缀合，转化，转染，电穿孔等方法添加到宿主细胞中，其中添加的核酸分子可以整合到宿主细胞基因组中或可以作为染色体外遗传物质存在(例如作为质粒或其他自我复制载体)。应当理解，在包含异源多核苷酸的宿主细胞的情况下，无论该后代本身是否被操纵(例如转导)以包含该多核苷酸，该多核苷酸与宿主细胞的后代“异源”。
术语“同源的”或“同源的”是指在宿主细胞，物种或菌株中发现或衍生自宿主细胞，物种或菌株的基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性。例如，编码多肽的异源或外源多核苷酸或基因可以与天然多核苷酸或基因同源并编码同源多肽或活性，但是该多核苷酸或多肽可以具有改变的结构、序列、表达水平或其任何组合。非内源性多核苷酸或基因以及编码的多肽或活性可以来自相同物种，不同物种或其组合。
如本文所用，术语“内源的”或“天然的”是指通常存在于宿主细胞或受试者中的多核苷酸、基因、蛋白质、化合物、分子或活性。
如本文所用，术语“表达”是指基于核酸分子例如基因的编码序列生产多肽的过程。该过程可以包括转录，转录后控制，转录后修饰，翻译，翻译后控制，翻译后修饰或其任何组合。表达的核酸分子通常可操作地连接至表达控制序列(例如，启动子)。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上两个或更多个核酸分子的缔合，从而一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响该编码序列的表达时(即，该编码序列在该启动子的转录控制下)，该启动子与该编码序列可操作地连接。“无关联的”是指相关的遗传要素彼此之间不紧密关联，并且其中一个的功能不影响另一个。
在将核酸分子插入细胞中的上下文中的术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括提及将核酸分子掺入真核或原核生物中。细胞，其中可以将核酸分子掺入细胞的基因组中(例如染色体，质粒，质体或线粒体DNA)，转化为自主复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。如本文所用，术语“工程的”，“重组的”或“非天然的”或“修饰的”是指包括至少一种遗传改变或已被修饰的生物，微生物，细胞，核酸分子或载体。引入外源核酸分子，其中这种改变或修饰是通过基因工程(即人为干预)引入的。遗传改变包括，例如，引入编码蛋白质，融合蛋白或酶的可表达核酸分子的修饰，或其他核酸分子对细胞遗传物质的添加，缺失，取代或其他功能破坏。另外的修饰包括例如非编码调节区，其中所述修饰改变多核苷酸，基因或操纵子的表达；例如，内源核酸分子或基因的表达被控制，去调节或组成型，其中这样的改变或修饰可以通过基因工程引入。遗传改变可以包括例如引入编码一种或多种蛋白质或酶的核酸分子(其可以包括表达控制元件，例如启动子)的修饰，或其他核酸分子的添加，缺失，取代，或细胞遗传物质的其他功能破坏或补充。示例性修饰包括来自参考或亲本分子的异源或同源多肽的编码区或其功能片段中的修饰。
如本文所述，可以将不止一个异源核酸分子作为单独的核酸分子，作为多个单独控制的基因，作为多顺反子核酸分子，作为编码核酸的单个核酸分子引入宿主细胞。融合蛋白或其任何组合。当将两个或更多个异源核酸分子引入宿主细胞时，应理解，两个或更多个异源核酸分子可作为单个核酸分子(例如，在单个载体上)，在分开的载体上，整合在单个位点或多个位点或其任何组合中进入宿主染色体。所提及的异源核酸分子或蛋白质活性的数目是指编码核酸分子的数目或蛋白质活性的数目，而不是引入宿主细胞中的分开的核酸分子的数目。
术语“构建体”是指含有重组核酸分子的任何多核苷酸。构建体可以存在于载体(例如细菌载体，病毒载体)中或可以整合到基因组中。“载体”是能够转运另一个核酸分子的核酸分子。载体可以是例如质粒，粘粒，病毒，RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，其可以包括染色体，非染色体，半合成或合成的核酸分子。本公开的载体还包括转座子系统(例如，睡美人，参见例如，Geurts et al.,Mol.Ther.8:108,2003:Mátés et al.,Nat.Genet.41:753,2009)。示例性载体是能够自主复制的载体(附加载体)，能够将多核苷酸递送至细胞基因组的载体(例如病毒载体)或能够表达与其连接的核酸分子的载体。
如本文所用，术语“宿主”是指以异源核酸分子进行遗传修饰以产生目的多肽的细胞(例如，本文所述的免疫系统细胞)或微生物。在某些实施例中，宿主细胞可以任选地已经拥有或被修饰以包括赋予与例如异源蛋白质的生物合成相关或不相关的所需特性的其他遗传修饰(例如，包含可检测的标记；缺失，改变或截短的内源性)TCR；或增加的共刺激因子表达)。
如本文所用，“结合结构域”(也称为“结合区”或“结合部分”)是指具有以下能力的分子，例如肽，寡肽，多肽或蛋白质。在某些实施例中，与靶分子(例如，Msln20-28肽(SEQ IDNO:31)或Msln530-538肽(SEQ ID NO:32))特异性地且非共价地结合，联合或结合，与HLA分子)。结合结构域包括任何天然存在的，合成的，半合成的或重组产生的针对生物学分子或其他目标靶标的结合伴侣。在一些实施例中，结合结构域是抗原结合结构域，例如抗体或TCR或其功能性结合结构域或抗原结合片段。示例性结合结构域包括单链抗体可变区(例如，单结构域抗体，sFv，scFv和Fab)，受体胞外域(例如TNF-α)，配体(例如细胞因子和趋化因子)，TCR的抗原结合区，例如单链TCR(scTCR)，根据结合生物分子的特异性能力而选择的合成多肽，适体或单域抗体(例如骆驼科或鱼类衍生的单域抗体；参见Arbabi-Ghahroudi M(2017)Front.Immunol.8:1589)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指TCR的α-链或β-链(或对于γδTCR为γ-链和δ-链)，或抗体重链或轻链的结构域，其参与与抗原的结合(即，包含氨基酸和/或与抗原接触并导致结合的其他结构)。天然TCR的α链和β链的可变结构域(分别为Vα和Vβ)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个通常保守的框架区(FR)和三个CDR。抗体重链(VH)和轻链(VL)的可变域通常也通常包含四个通常保守的框架区(FR)和三个CDR。在TCR和抗体中，构架区分开的CDR，并且CDR位于构架区之间(即，在一级结构中)。
天然TCR的α链和β链的可变结构域(分别为Vα和Vβ)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。Vα结构域由两个分开的DNA片段，可变基因片段和连接基因片段(V-J)编码。Vβ结构域由三个5个独立的DNA片段(可变基因片段，多样性基因片段和连接基因片段(V-D-J))编码。人TCR V，D和J等位基因，包括其核苷酸和编码的氨基酸序列，是本领域已知的。单个Vα或Vβ结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用Vα或Vβ结构域从结合抗原的TCR中分离结合特定抗原的TCR，以分别筛选互补的Vα或Vβ结构域的文库。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，并且在本领域中已知是指TCR或抗体可变区中的氨基酸序列，通常，赋予抗原特异性和/或结合亲和力，并且在一级结构中通过构架序列彼此分开。在某些情况下，构架氨基酸也可有助于结合，例如也可接触抗原或含抗原的分子。通常，在每个可变区中存在三个CDR(即，在TCRα链和β链可变区中的每个具有三个CDR；在抗体重链和轻链可变区中的每个中具有3个CDR)。对于TCR，CDR3被认为是负责识别加工抗原的主要CDR。CDR1和CDR2主要或在某些情况下仅与MHC相互作用。可变域序列可以与编号方案(例如，Kabat，欧盟，国际免疫遗传学信息系统(IMGT)和Aho(Kabat,EU,International Immunogenetics Information System(IMGT)and Aho))比对，并可以使用抗原受体编号和受体分类(ANARCI)软件工具(2016，Bioinformatics 15：298-300)对等效残基位置进行注释并比较不同的分子。在本文的某些实施例中，根据IMGT编号系统对CDR编号。
如本文所用，“特异性结合”是指结合结构域或包含该结合结构域的蛋白质以亲和力或Ka(即，特定结合的平衡缔合常数)与靶分子的缔合或结合。与等于或大于105M-1的1/M单位的分子相互作用，而不会与样品中的任何其他分子或组分显着缔合或结合。结合结构域(或其融合蛋白)可分类为“高亲和力”结合域(或其融合蛋白)或“低亲和力”结合域(或其融合蛋白)。“高亲和力”结合结构域是指具有至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1或至少1013M-1。“低亲和力”结合结构域是指具有最高107M-1、最高106M-1或最高105M-1的Ka的那些结合结构域。或者，亲和力可以定义为与M单元(例如10-5M至10-13M)的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)。在某些实施例中，结合结构域可具有“增强的亲和力”，其是指与野生型(或亲本)结合结构域相比对靶抗原具有更强结合的选择或工程化的结合结构域。例如，增强的亲和力可能是由于对靶抗原的Ka(平衡缔合常数)高于野生型结合域，或由于对靶抗原的Kd小于野生型结合域的Ka，或由于靶抗原的解离速率(Koff)小于野生型结合域的解离速率。已知多种测定法可用于鉴定与特定靶标特异性结合的本发明的结合域，以及测定结合域或融合蛋白的亲和力，例如western blot，ELISA和
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分析(也参见例如Scatchard,et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.57:660,1949；以及美国专利No.5,283,173、5,468,614，或等价物)。
用于评估亲和力或表观亲和力或相对亲和力的测定法是已知的。在某些实例中，通过评估与各种浓度的四聚体的结合来测量对TCR的表观亲和力，例如，通过使用标记的四聚体的流式细胞术。在一些实例中，使用在一定浓度范围内的标记四聚体(即肽:MHC四聚体)的2倍稀释液，测量TCR的表观Kd，然后通过非线性回归确定结合曲线，将表观Kd确定为产生最大结合一半的配体的浓度。在某些实施例中，Msln20-28-或Msln530-538-特异性结合蛋白分别包括Msln20-28-或Msln530-538-特异性免疫球蛋白超家族结合蛋白或其结合部分。
“MHC肽四聚体染色”是指用于检测抗原特异性T细胞的测定法，其特征在于MHC分子的四聚体，每个分子都包含具有同源氨基酸序列的相同肽(例如，相同或相关)至少一个表位(例如，Msln20-28或Msln530-538)，其中该复合物能够结合对同源表位特异的TCR。每个MHC分子可以用生物素分子标记。通过添加可被荧光标记的抗生蛋白链菌素，将生物素化的MHC/肽四聚化。可以通过荧光标记通过流式细胞术检测四聚体。在某些实施例中，MHC-肽四聚体测定法用于检测或选择本公开的增强的亲和力TCR。可以根据本文所述和本领域中实践的方法确定细胞因子的水平，包括例如ELISA，ELISpot，细胞内细胞因子染色和流式细胞术及其组合(例如，细胞内细胞因子染色和流式细胞术)。可以通过分离淋巴细胞，例如外周血细胞样品中的循环淋巴细胞或淋巴结细胞中的循环淋巴细胞，用抗原刺激细胞，并测量抗原，来确定由抗原特异性引发或刺激免疫应答引起的免疫细胞增殖和克隆扩增。细胞因子的产生，细胞增殖和/或细胞活力，例如通过掺入氚化的胸苷或非放射性测定，例如MTT测定等。可以例如通过确定Th1细胞因子的水平来检查本文所述的免疫原对Th1免疫应答和Th2免疫应答之间的平衡的作用，例如IFN-γ、IL-12、IL-2和TNF-β和2型细胞因子，例如IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13。
如本文所用，“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的免疫原性分子。这种免疫应答可能涉及抗体的产生，特定免疫学上具有活性的细胞(例如，T细胞)的激活或两者。抗原(免疫原性分子)可以是例如肽、糖肽、多肽、糖多肽、多核苷酸、多糖、脂质等。显而易见，抗原可以合成，重组产生或衍生自生物学样品。可以包含一种或多种抗原的示例性生物样品包括组织样品，肿瘤样品，细胞，生物液或其组合。抗原可以由经过修饰或基因工程改造以表达抗原的细胞化学合成或产生。
术语“表位”或“抗原表位”包括被关联结合分子例如免疫球蛋白，T细胞受体(TCR)，嵌合体识别并特异性结合的任何分子，结构，氨基酸序列或蛋白质决定簇。抗原受体或其他结合分子，结构域或蛋白质。抗原决定簇通常包含分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或糖侧链，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
如本文所用，“Msln20-28”和“Msln20-28肽”和“Msln20肽”是指包含SEQ ID NO:50的间皮素氨基酸20-28或由其组成的肽(人间皮素，同种型1)；即SLLFLLFSL(SEQ ID NO:31)，该肽可与HLA-A*201缔合。
如本文所用，“Msln530-538”和“Msln530-538肽”，“Msln530肽”是指包含SEQ ID NO:50的间皮素氨基酸530-538或由其组成的肽；例如VLPLTVAEV(SEQ ID NO:32)，该肽可以与HLA-A*201结合。
术语“Msln20-28特异性结合蛋白”是指与Msln20-28肽特异性结合和/或对其具有特异性和/或具有高亲和力的蛋白或多肽。在一些实施例中，蛋白质或多肽与Msln20-28结合，例如与MHC或HLA分子在细胞表面复合的Msln20-28肽，具有或至少具有约特定的亲和力。Msln20-28特异性结合蛋白可以与Msln20-28肽，其变体或其片段结合。例如，Msln20-28特异性结合蛋白可结合至SEQ ID NO:31的氨基酸序列(SLLFLLFSL)，或与SEQ ID NO:31具有至少90％、91％、92％、93％、94％。95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白以约与至少约相同的亲和力结合Msln20-28肽:HLA复合物(或Msln20-28衍生的肽：MHC复合物)，或大于或等于本文提供的示例性Msln20-28特异性结合蛋白，例如本文提供的任何Msln20-28特异性TCR所表现出的亲和力，例如，如通过相同的测定所测量的。在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白可以结合如本文提供的Msln20-28表位；例如，根据SEQ ID NO:60的共有表位序列。如本文所公开的，Msln特异性结合蛋白不结合或基本上不结合与SEQ ID NO:60具有高度序列同源性或同一性的非Msln人蛋白或肽。
术语“Msln530-538特异性结合蛋白”是指与Msln530-538肽特异性结合和/或对其具有特异性和/或具有高亲和力的蛋白或多肽。在一些实施例中，结合至Msln530-538的蛋白质或多肽，例如Msln530-538肽与MHC或HLA分子例如在细胞表面上以特定亲和力或至少大约特定亲和力复合。Msln530-538特异性结合蛋白可以与Msln530-538肽，其变体或其片段结合。例如，Msln530-538特异性结合蛋白可结合至SEQ ID NO:32的氨基酸序列(VLPLTVAEV)，或与SEQID NO:32具有至少90％、91％、92％、93％、94％的、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白以约与至少约相同的亲和力结合Msln530-538肽:HLA复合物(或Msln530-538衍生的肽:MHC复合物)，或大于或等于本文提供的示例性Msln530-538特异性结合蛋白(例如本文提供的任何Msln530-538特异性TCR)所表现出的亲和力，例如，如通过相同的测定所测量的。在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白可以结合如本文提供的Msln530-538表位；例如，根据SEQ ID NO:61或62的共有表位序列。如本文所公开的，Msln特异性结合蛋白不结合或基本上不结合与SEQ ID NO:61或62具有同源性或相同的非Msln人蛋白质或肽或。
被本公开的结合结构域特异性结合的靶分子可以在目的细胞(“靶细胞”)上或与之相关联。示例性靶细胞包括癌细胞，与自身免疫疾病或病症或炎性疾病或病症相关的细胞，以及感染性生物或细胞(例如细菌，病毒或病毒感染的细胞)。传染性生物的细胞，例如哺乳动物的寄生虫，也被认为是靶细胞。
术语“功能亲和力”是指体外免疫细胞(例如，T细胞，NK细胞，NK-T细胞)对给定浓度的配体的反应的生物学量度或活化阈值，其中所述生物学量度可以包括细胞因子的产生(例如，IFNγ的产生，IL-2的产生等)，细胞毒性活性和增殖。例如，通过产生细胞因子，具有细胞毒性或增殖作用，在体外对低抗原剂量产生生物学(免疫)反应的T细胞被认为具有高功能亲和力，而具有较低功能亲和力的T细胞在免疫前需要更高量的抗原。引起类似于高亲和力T细胞的应答。将理解，功能亲和力不同于亲和力和亲和力。亲和力是指结合蛋白与其抗原/配体之间任何给定键的强度。一些结合蛋白是多价的，可以结合多种抗原——在这种情况下，整体连接的强度就是亲和力。
在功能亲和力和免疫应答的有效性之间存在许多相关性。一些离体研究表明，可以在不同的阈值下触发不同的T细胞功能(例如，增殖，细胞因子产生等)(参见，例如Bettset al.,J.Immunol.172:6407,2004Langenkamp et al.,Eur.J.Immunol.32:2046,2002)。影响功能亲和力的因素包括(a)TCR对pMHC复合物的亲和力，即TCR与pMHC之间相互作用的强度(Cawthon et al.,J.Immunol.167:2577,2001)，(b)TCR和CD4或CD8 co受体的表达水平，以及(c)信号分子的分布和组成(Viola and Lanzavecchia,Science 273:104,1996)，以及使T减弱的分子的表达水平细胞功能和TCR信号传导。
在指定的暴露时间后，在基线和最大反应之间引起半数最大反应所需的抗原浓度被称为“半最大有效浓度”或“EC50”。EC50值通常以摩尔(摩尔/升)量表示，但通常将其转换为对数值，如下所示——log10(EC50)。例如，如果EC50等于1μM(10-6M)，则log10(EC50)值为-6。使用的另一个值是pEC50，定义为EC50的负对数(-log10(EC50))。在以上示例中，等于1μM的EC50的pEC50值为6。在某些实施例中，本发明结合蛋白的功能亲和力将衡量其促进T细胞产生IFNγ的能力，可以测量使用本文所述的测定法。“高功能亲和力”TCR或其结合结构域是指EC50为至少10-4M，至少约10-5M或至少约10-6M的那些TCR或其结合结构域。
在某些实施例中，如本文所述的间皮素特异性结合蛋白或结构域可以由宿主T细胞表达，并且可以根据用于分析T细胞活性，包括确定T的许多本领域公认的方法中的任一种来进行功能表征。细胞结合，激活或诱导，还包括确定抗原特异性的T细胞反应。在某些实施例中，结合蛋白能够以I类HLA限制的方式促进针对人间皮素的抗原特异性T细胞应答。在进一步的实施例中，I类HLA限制的应答与转运蛋白相关且与抗原加工(TAP)无关。在某些实施例中，抗原特异性T细胞应答包括CD4+辅助T淋巴细胞(Th)应答和CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答中的至少一种。在相关的实施例中，CTL应答针对间皮素过度表达的细胞。用于测定T细胞活性的方法的其他示例包括确定T细胞增殖，T细胞细胞因子释放，抗原特异性T细胞刺激，MHC限制性T细胞刺激，CTL活性(例如，通过检测预载靶细胞的51Cr释放)，T细胞表型标记物表达的变化以及T细胞功能的其他衡量指标。例如，可以在Lefkovits中找到进行这些和类似测定的程序(Immunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebookof Techniques，1998)。另见Current Protocols in Immunology；Weir,Handbook ofExperimental Immunology,Blackwell Scientific,Boston,MA(1986)；Mishell andShigii(eds.)Selected Methods in Cellular Immunology,Freeman Publishing,SanFrancisco,CA(1979)；Green and Reed,Science 281:1309(1998)以及其中引用的参考文献。
如本文所用，“免疫系统细胞”是指免疫系统中源自骨髓造血干细胞的任何细胞，其产生两个主要谱系，即髓系祖细胞(其产生髓样细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、巨核细胞和粒细胞)和淋巴样祖细胞(产生淋巴样细胞，例如T细胞，B细胞和自然杀伤(NK)细胞)。示例性免疫系统细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、调节性T细胞、干细胞记忆T细胞、天然杀伤细胞(例如NK细胞或NK-T细胞)、B细胞和树突状细胞。巨噬细胞和树突状细胞可以称为“抗原呈递细胞”或“APC”，它们是当与肽复合的APC表面上的主要组织相容性复合物(MHC)受体与T细胞表面的TCR相互作用时可以激活T细胞的专门细胞。
“T细胞”或“T淋巴细胞”是一种在胸腺中成熟并产生TCR的免疫系统细胞。T细胞可以是幼稚的(不暴露于抗原；与TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA的表达增加，而CD45RO的表达减少)，记忆性T细胞(TM)(经历过抗原且时间长-存活的细胞)和效应细胞(经历过抗原的细胞毒性)。TM可以进一步分为中央记忆T细胞(TCM，与原始T细胞相比，CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和CD95的表达增加，以及CD54RA的表达减少)和效应记忆T细胞(TEM，与原始T细胞或TCM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD45RA的表达降低，而CD127的表达增加)。
效应T细胞(TE)是指抗原经历的CD8+细胞毒性T淋巴细胞，与TCM相比，其CD62L、CCR7、CD28的表达降低，并且对颗粒酶和穿孔素呈阳性。其他示例性T细胞包括调节性T细胞，例如CD4+CD25+(Foxp3+)调节性T细胞和Treg17细胞，以及Tr1、Th3、CD8+CD28-和Qa-1限制性T细胞。
辅助性T细胞(TH)是CD4+细胞，通过释放细胞因子来影响其他免疫细胞的活性。CD4+T细胞可以激活和抑制适应性免疫反应，而这两种功能中的哪一种被诱导将取决于其他细胞和信号的存在。可以使用已知技术收集T细胞，并且可以通过已知技术，例如通过与抗体的亲和结合，流式细胞术或免疫磁选择来富集或消除各种亚群或其组合。
“T细胞谱系的细胞”是指显示T细胞的至少一种表型特征的细胞，或将所述细胞与其他淋巴样细胞以及红系或髓系谱系的细胞区分开的前体或祖细胞。这样的表型特征可以包括对T细胞特异的一种或多种蛋白质(例如，CD3+、CD4+、CD8+)或对T细胞特异的生理，形态，功能或免疫学特征的表达。例如，T细胞谱系的细胞可以是定型为T细胞谱系的祖细胞或前体细胞。CD25+未成熟和灭活的T细胞；已经历CD4或CD8线性承诺的细胞；CD4+CD8+双阳性的胸腺细胞祖细胞；单阳性CD4+或CD8+；TCRαβ或TCRγδ；或成熟的功能性或活化的T细胞。
“造血祖细胞”是源自造血干细胞(HSC)或胎儿组织的细胞，其能够进一步分化成成熟细胞类型(例如，T细胞谱系的细胞)。在某些实施例中，CD24loLin-CD117+造血祖细胞是有用的。如本文所定义，造血祖细胞可包括能够进一步分化为T细胞谱系细胞的胚胎干细胞。造血祖细胞可以来自各种动物，包括人，小鼠，大鼠或其他哺乳动物。“胸腺细胞祖细胞”或“胸腺细胞”是存在于胸腺中的造血祖细胞。
“造血干细胞”或“HSC”是指未分化的造血细胞，其能够在体内自我更新，在体外基本上无限制地增殖，并且能够分化为其他细胞类型，包括T细胞谱系的细胞。HSC可以例如但不限于从胎儿肝脏，骨髓和脐带血中分离。
“胚胎干细胞”，“ES细胞”或“ESC”是指未分化的胚胎干细胞，具有整合到发育中的胚胎的种系中并成为其一部分的能力。胚胎干细胞能够分化为造血祖细胞和任何组织或器官。适用于本文的胚胎干细胞包括来自J1ES细胞系，129JES细胞系，鼠类干细胞系D3(美国典型培养物保藏中心)的细胞，源自129/Sv小鼠的R1或E14K细胞系，细胞系衍生自Balb/c和C57B1/6小鼠，以及人类胚胎干细胞(例如，来自
Figure BDA0003151581420000231
的研究所；或来自澳大利亚墨尔本的ES细胞国际组织)。
术语“T细胞受体”(TCR)是指免疫球蛋白超家族成员(具有可变的结合结构域，恒定的结构域，跨膜区域和短的细胞质尾；参见，例如，Janeway,et al.,Immunobiology:TheImmune System in Health and Disease,3rd Ed.,Current Biology Publications,p.4:33,1997)，其能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽。TCR可以发现在细胞表面或呈可溶性形式，通常由具有α和β链(分别称为TCRα和TCRβ)或γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)的异二聚体组成。像免疫球蛋白一样，TCR链的细胞外部分(例如α链和β链)包含两个免疫球蛋白结构域，一个可变域(例如α链可变域或Vα，β链可变域或Vβ)；通常是在N-处基于末端Kabat编号(Kabat,et al.,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”USDept.Health and Human Services,Public Health Service National Institutes ofHealth,1991,5th ed.)的编号从1到116的氨基酸，和与细胞膜相邻的一个恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常基于Kabat 117至259的氨基酸，β链恒定结构域或Cβ，通常基于Kabat 117至295的氨基酸)。也像免疫球蛋白一样，可变域包含由框架区(FRs)隔开的互补决定区(CDRs)(参见，例如Jores,et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.57:9138,1990；Chothia,et al.,EMBO J.7:3745,1988；see also Lefranc,et al.,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在某些实施例中，TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现并与CD3复合物缔合。如本公开中所使用的TCR的来源可以来自各种动物物种，诸如人，小鼠，大鼠，猫，狗，山羊，马或其他哺乳动物。
“CD3”是具有六个链的多蛋白复合物(参见，Borst J,et al.,J Biol Chem,258(8):5135-41,1983and Janeway,et al.,p.172and 178,1999，同上)。在哺乳动物中，复合物包括CD3γ链，CD3δ链，两条CD3ε链和CD3ζ链的同二聚体。CD3γ，CD3δ和CD3ε链是包含单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的相关细胞表面蛋白。CD3γ，CD3δ和CD3ε链的跨膜区域带负电，这被认为是允许这些链与TCR链带正电的区域缔合的特征。CD3γ，CD3δ和CD3ε链的细胞内尾巴每个都包含一个保守的基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM，而每个CD3ζ链都有三个。不受任何理论的束缚，相信ITAM对于TCR复合体的信号传递能力是重要的。如本公开中使用的CD3可以来自各种动物物种，包括人，小鼠，大鼠或其他哺乳动物。
如本文所用，“TCR复合物”是指通过CD3与TCR的缔合形成的复合物。例如，TCR复合物可以由CD3γ链，CD3δ链，两个CD3ε链，CD3ζ链的同二聚体，TCRα链和TCRβ链组成。或者，TCR复合物可以由CD3γ链，CD3δ链，两条CD3ε链，CD3ζ链的同二聚体，TCRγ链和TCRδ链组成。
如本文所用，“TCR复合物的组分”是指TCR链(即TCRα，TCRβ，TCRγ或TCRδ)，CD3链(即CD3γ，CD3δ，CD3ε或CD3ζ)，或由两条或更多条TCR链或CD3链形成的复合物(例如，TCRα和TCRβ的复合物，TCRγ和TCRδ的复合物，CD3ε和CD3δ的复合物，CD3γ和CD3ε的复合物，或亚TCR复合物(TCRα，TCRβ，CD3γ，CD3δ和两条CD3ε链)。
“主要组织相容性复合物”(MHC)是指将肽抗原递送至细胞表面的糖蛋白。MHC I类分子是异质二聚体，具有跨α链的膜(具有三个α结构域)和非共价结合的β2微球蛋白。MHCII类分子由两个跨膜糖蛋白α和β组成，两者都跨膜。每个链都有两个域。MHC I类分子将起源于胞质溶胶的肽传递到细胞表面，其中CD8+T细胞可识别肽：MHC复合物。MHC II类分子将起源于囊泡系统的肽传递到细胞表面，在此处被CD4+T细胞识别。人MHC被称为人白细胞抗原(HLA)。
间皮素特异性结合蛋白
在某些方面，本公开提供了能够与本文所述的间皮素肽抗原特异性结合的结合蛋白(例如，包含，由或基本上由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列组成的肽)。本文的结合蛋白包括TCRα链可变域(Vα)和TCRβ链可变域(Vβ)。在任何当前公开的实施例中，间皮素特异性结合蛋白能够特异性结合间皮素肽:HLA复合物，例如间皮素肽:HLA-A*02:01复合物。
在某些实施例中，提供了一种Msln-530-538特异性结合蛋白，其包含：(a)包含如SEQID NO:37或39所示的CDR3氨基酸序列的TCRVα，和TCRVβ，其中TCRVβ任选地包含与SEQ IDNO:99或101所示的氨基酸序列具有至少约85％(即，至少约86％、85％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)的氨基酸序列％的同一性氨基酸序列；(b)TCRVβ，其包含如SEQ ID NO:38或40所示的CDR3氨基酸序列，和(b)TCRVα，其中TCRVα任选地包含与SEQ ID NO:100或102所示的氨基酸序列至少约85％(即，至少约86％、85％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)相同的氨基酸序列；或(c)包含SEQ ID NO:37或39所示的CDR3氨基酸序列的TCRVα，其中TCRVα任选地包含与SEQ ID NO:100或102所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，以及TCRVβ，其包含SEQ ID NO:38或40所示的CDR3氨基酸序列，其中TCRVβ任选地包含与SEQID NO:99或101所示的氨基酸序列至少约85％同一性的氨基酸序列。
在本文描述的任何实施例中，本公开的编码的多肽(例如，TCR可变结构域或TCR链)可包含“信号肽”(也称为前导序列，前导肽或转运肽)。信号肽将新合成的多肽靶向细胞内或细胞外的适当位置。在定位或分泌完成期间或完成之后，可以从多肽中去除信号肽。具有信号肽的多肽在本文中被称为“前蛋白”，而其信号肽被去除的多肽在本文中被称为“成熟”蛋白或多肽。代表性的信号肽包括SEQ ID NO:6、14、22、28或29中任一个的从位置1至位置19的那些氨基酸序列；SEQ ID NO:7的从位置1至位置17；SEQ ID NO:15的1至22位；SEQID NO:23的位置1至位置21。示例性成熟多肽序列在SEQ ID NO:95-119中提供。
在任何当前公开的实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白可包含TCRVα，该TCRVα包含与SEQ ID NO:100或102所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；和/或TCRVβ，其包含与SEQ ID NO:99或101所示氨基酸序列具有至少约85％的同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，结合蛋白包含参考TCR变量的变体结构域序列，前提是结合蛋白的至少三个或四个CDR根据参考的TCR可变结构域序列在序列上没有变化，其中具有序列变化的CDR仅具有最多两个氨基酸取代，最多连续的五个氨基酸缺失，或其组合。
在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白包含如SEQ ID NO:39所示的CDR3α氨基酸序列和如SEQ ID NO:40所示的CDR3β氨基酸序列。在一些实施例中，结合蛋白进一步包含如SEQ ID NO:93所示的CDR1α氨基酸序列，如SEQ ID NO:94所示的CDR2α氨基酸序列，如SEQ ID NO:83、84或91任一项所述的CDR1β氨基酸序列，和/或如SEQ ID NO:92所示的CDR2β氨基酸序列。在进一步的实施例中，Vα包含与SEQ ID NO:102所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和/或Vβ包含具有与SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列至少约85％同一性的氨基酸序列，其中CDR1α，CDR2α，CDR1β和/或CDR2β任选地没有变化。
在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白包含TCRVβ，其包含与由TRBJ2-3*01编码的氨基酸序列(例如，与由TRBJ2-3*01编码的长度至少约为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或15个连续氨基酸的氨基酸序列))具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和/或与由TRAV21*01或TRAV21*02编码的氨基酸序列(例如，与由TRAV21*01或TRAV21*02编码的长度为至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或107个连续氨基酸的氨基酸序列)具有至少85％同一性的氨基酸序列，和/或具有与TRBV5-4*01(例如，与由TRBV5-4*01编码的长度至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或108连续氨基酸的氨基酸序列)编码的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，和/或与由TRAJ57*01编码的氨基酸序列(例如，与由TRAJ57*01编码的长度至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20连续氨基酸的氨基酸序列)具有至少约85％的同一性的氨基酸序列。
在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白包含TCRVα，其包含或由SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列组成，以及TCRVβ，其包含或由SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列组成。
在其他实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白包含如SEQ ID NO:37所示的CDR3α氨基酸序列和SEQ ID NO:38所示的CDR3β氨基酸序列。在一些实施例中，结合蛋白还包含如SEQ ID NO:89所示的CDR1α氨基酸序列，如SEQ ID NO:90所示的CDR2α氨基酸序列，如SEQID NO:83或87所示的CDR1β氨基酸序列，以及SEQ ID NO:88所示的CDR2β氨基酸序列。在某些实施例中，Vα包含与SEQ ID NO:100所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和/或Vβ包含与SEQ ID NO:99具有至少约85％同一性的氨基酸序列。其中CDR1α，CDR2α，CDR1β和/或CDR2β任选地没有变化。
在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白包含具有与由TRAV4-1*01(例如，与TRAV4-1*01编码的长度至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或108个氨基的序列编码的氨基酸序列)编码的至少约85％的同一性的氨基酸序列和/或与TRAJ18*01(例如，与TRAJ18*01编码的长度至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个氨基酸的序列)编码的至少约85％的同一性的氨基酸序列和/或与TRBJ1-1*01(例如，与TRBJ1-1*01编码的长度至少约为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列)编码的至少约85％的同一性的氨基酸序列和/或与由TRBJ2-3*01(例如，与TRBJ2-3*01编码的长度至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸)编码的至少约85％的同一性的氨基酸序列。
在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白包含TCRVα，其包含或由SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列组成；以及TCRVβ，其包含或由SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，SEQ ID NO:32的残基3、5、6或9中的任一个或多个的丙氨酸诱变不会消除或基本上不损害Msln530-538特异性结合蛋白的结合。在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白能够结合包含SEQ ID NO:61所示的共有氨基酸序列或由其组成的肽。例如在本文公开的肽:HLA复合物中。
在某些实施例中，SEQ ID NO:32的残基1、5或9中的任一个或多个的丙氨酸诱变不会消除或基本不损害Msln530-538特异性结合蛋白的结合。在某些实施例中，Msln530-538特异性结合蛋白能够结合包含SEQ ID NO:62所示的共有氨基酸序列或由其组成的肽。例如在本文公开的肽:HLA复合物中。
目前公开的Msln特异性结合蛋白有利地表现出对非Msln靶标的低至无同种反应性的风险；例如在健康组织中表达。简而言之，本公开显示Msln特异性结合蛋白不与具有与本文提供的Msln肽抗原的序列同源性的人蛋白反应或基本不反应。因此，结合蛋白对Msln肽抗原具有高度特异性。
例如，在某些实施例中，本发明的Msln530-538特异性结合蛋白不结合或相对于与Msln530-538的结合不特异性结合至肽：HLA复合物，其中所述肽包含或由SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76和77中的任何一个或多个示出的氨基酸序列组成，并且其中HLA任选地包含HLA-A2，例如HLA-A:02*01。
在某些实施例中，提供了一种Msln20-28特异性结合蛋白，其包含：(a)包含如SEQ IDNO:33或35所示的CDR3氨基酸序列的TCRVα，和TCRVβ，其中TCR Vβ任选地具有与SEQ ID NO:95或97所示氨基酸序列具有至少约85％(即，至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)同一性；(b)TCRVβ，其包含如SEQ ID NO:34或36所示的CDR3氨基酸序列，和(b)TCRVα，其中该TCRVα任选地与SEQ ID NO:96或98所示的氨基酸序列具有至少约85％的同一性；或者(c)包含SEQ ID NO:33或35所示的CDR3氨基酸序列的TCRVα和包含SEQ ID NO:34或36所示的CDR3氨基酸序列的TCRVβ，其中TCRVα任选地包含与SEQ ID NO:95或97所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，并且其中TCRVβ任选地包含与SEQ ID NO:96或98所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。
在任何当前公开的实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白可包含TCRVα，其包含与SEQID NO:96或SEQ ID NO:98所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和/或TCRVβ，其包含与SEQ ID NO:95或97所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，结合蛋白包含参考TCR可变结构域序列的变体，前提是结合蛋白的至少三个或四个CDR根据参考的TCR可变结构域序列在序列上没有变化，其中具有序列变化的CDR仅具有最多两个氨基酸取代，最多连续的五个氨基酸缺失，或其组合。
在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白包含如SEQ ID NO:33所示的CDR3α氨基酸序列和如SEQ ID NO:34所示的CDR3β氨基酸序列。在一些实施例中，结合蛋白还包含SEQID NO:80所示的CDR1α氨基酸序列，SEQ ID NO:81或118所示的CDR2α氨基酸序列，SEQ IDNO:78、83或84中任一项所示的CDR1β氨基酸序列，以及SEQ ID NO:79所示的CDR2β氨基酸序列。在某些实施例中，Vα包含与SEQ ID NO:96所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和/或Vβ包含与SEQ ID NO:95氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，其中任选地CDR1α，CDR2α，CDR1β和/或CDR2β没有变化。
在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白包含(i)TCRVβ，其包含(a)具有与由TRBV12-4*01(例如，与由TRBV12-4*01编码的长度列至少约为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或108个连续氨基酸的氨基酸序)编码的氨基酸序列具有至少约85％(即，至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)同一性氨基酸序列；和/或(b)与由TRBJ2-7*01(例如，与由TRBJ2-7*01编码的长度至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸的氨基酸序列)编码的氨基酸序列具有至少约85％的同一性的氨基酸序列；和/或(ii)TCRVα，其包含(a)与由TRAV1-1*01(例如，与由TRAV1-1*01编码的长度至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105或107个连续氨基酸的氨基酸序列)编码的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列和/或(b)与由TRAJ3*01(例如，与由TRAJ3*01编码的长度至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长的氨基酸序列)编码的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和/或(c)与由TRBJ2-3*01(例如，与TRBJ2-3*01编码的长度至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸的氨基酸序列)编码的氨基酸序列具有85％的同一性的氨基酸序列。
在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白包含TCRVα，其包含或由SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列组成，以及TCRVβ，其包含或由SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白，如SEQ ID NO:35所示的CDR3α氨基酸序列和如SEQ ID NO:36所示的CDR3β氨基酸序列。在一些实施例中，结合蛋白还包含SEQ IDNO:85所示的CDR1α氨基酸序列，SEQ ID NO:86或119所示的CDR2α氨基酸序列，SEQ ID NO:82、83或84中任一项所示的CDR1β氨基酸序列，以及SEQ ID NO:79所示的CDR2β氨基酸序列。在某些实施例中，Vα包含与SEQ ID NO:98所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和/或Vβ包含与SEQ ID NO:97氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，其中CDR1α，CDR2α，CDR1β和/或CDR2β任选地没有变化。
在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白包含TCRVα，其包含(a)与由TRAV12-3*01(例如，与由TRAV12-3*01编码的长度至少约为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100,105,或108连续氨的基酸氨基酸序列)编码的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和/或(b)与由TRAJ29*01(例如，与由TRAJ29*01编码的长度至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个氨基酸的氨基酸序列)编码的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列和/或(c)和/或与由TRBJ2-3*01编码的氨基酸序列(例如，与由TRBJ2-3*01编码的长度至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸的氨基酸序列)具有至少约85％的同一性的氨基酸序列。
在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白包含TCRVα，其包含或由SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列组成；和TCRVβ，其包含或由SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列组成。
在某些实施例中，SEQ ID NO:31的残基1、2、7、8或9中任一个或多个的丙氨酸诱变不会消除或基本不损害Msln20-28特异性结合蛋白的结合。在某些实施例中，Msln20-28特异性结合蛋白能够结合包含SEQ ID NO:60所示的共有氨基酸序列或由其组成的肽。例如在本文公开的肽:HLA复合物中。
在任何当前公开的实施例中，Msln特异性结合蛋白能够结合Msln肽：HLA复合物，其中所述Msln肽包含SEQ ID NO:31或32所示的氨基酸序列，并且其中HLA是或包含HLA-A2，例如HLA-A*02:01。
在任何当前公开的实施例中，表达本公开的Msln特异性结合蛋白的免疫细胞(例如，T细胞)不产生IFN-γ和/或不表现出活化(例如，CD8表达，CD3表达，Nur77表达)和/或当与表达以下细胞的细胞接触时，细胞毒性活性(例如穿孔素和/或颗粒酶的特异性杀伤，产生和释放)：(i)HLA-C6:02:01；(ii)没有HLA-B13:02:01的HLA-B13:01:01；(iii)HLA-A3；(iv)HLA-A29；(v)HLA-B40；(vi)HLA-B44；(vii)HLA-C3；(viii)HLA-C16；(ix)HLA-A1；(x)HLA-24；(xi)HLA-B7；(xii)HLA-B57；(xiii)HLA-C7；(xiv)HLA-A11；(xv)HLA-B15；(xvi)HLA-C4；(xvii)HLA-C12；(xviii)HLA-B8；(xix)HLA-B49；(xx)HLA-B51；(xxi)HLA-C15；(xxii)HLA-A30；(xxiii)HLA-A68；(xxiv)HLA-C2；(xxv)HLA-A32；(xxvi)HLA-A33；(xxvii)HLA-B55；(xxviii)HLA-C1；(xxvix)HLA-C5；(xxix)HLA-B8；(xxx)HLA-B35；或(xxxi)(i)-(xxx)的任何组合，当不存在本文提供的Msln肽时。
在任何当前公开的实施例中，当在宿主细胞表面表达时，Msln特异性结合蛋白能够在不存在或不依赖于CD8的情况下与本文公开的Msln肽：HLA复合物结合。
在某些实施例中，根据本发明的结合蛋白具有约9μM、约8μM、约7μM、约6μM、约5μM、约4μM、约3μM、2μM、约1μM、约0.9μM、约0.8μM、约0.7μM、约0.6μM、约0.5μM、约0.4μM、约0.3μM、约0.2μM或更小的Msln肽EC50。
在任何当前公开的实施例中，当Msln特异性结合蛋白在宿主T细胞或NK-T细胞中表达时，Msln特异性结合蛋白能够更有效地与CD3蛋白结合，和/或相对于内源TCR在细胞表面具有增加的表达。
在某些实施例中，结合蛋白是TCR，单链TCR(scTCR)或CAR。
在一些实施例中，结合蛋白是TCR。在某些实施例中，结合蛋白包含TCR Vβ，TCR Cβ，TCR Vα和TCR Cα，其中Vβ和Cβ一起包含TCRβ链(TCRβ)，并且其中Vα和Cα一起包含TCRα链(TCRα)，并且其中TCRβ和TCRα能够缔合以形成二聚体。在进一步的实施例中，TCRCβ在氨基酸位置57处(例如，GV(S→C)TD)包含半胱氨酸氨基酸代替天然丝氨酸，而TCRCα在氨基酸位置48处(例如DK(T→C)VL；参见例如Cohen et al.,Cancer Res.67(8):3898-3903(2007))包含半胱氨酸氨基酸代替天然苏氨酸。
在其他实施例中，Msln特异性结合蛋白是包含TCRβ和TCRα的TCR，其中TCRβ和TCRα分别包含与SEQ ID NO:(i)103或6(TCRβ)和104或7(TCRα)；(ii)105或14(TCRβ)和106或15(TCRα)；(iii)107或22(TCRβ)和108或23(TCRα)；或(iv)109或28(TCRβ)和110或29(TCRα)所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的氨基酸序列。
在某些实施例中，结合蛋白是可溶性TCR，其任选地包括或偶联至细胞毒性和/或可检测的元件或试剂。(参见例如Walseng et al.,PLoS One doi:10.1371/journal.pone.0119559(2015))。举例来说，用于分离和纯化重组产生的可溶性TCR的方法可以包括从合适的宿主细胞/载体系统获得上清液，所述宿主细胞/载体系统将重组可溶性TCR分泌到培养基中，然后使用市售的过滤器浓缩培养基。浓缩后，可将浓缩物施用于单一合适的纯化基质或一系列合适的基质，例如亲和基质或离子交换树脂。可以采用一个或多个反相HPLC步骤来进一步纯化重组多肽。从自然环境中分离免疫原时，也可以使用这些纯化方法。大规模生产本文所述的一种或多种分离/重组可溶性TCR的方法包括分批细胞培养，对其进行监测和控制以维持合适的培养条件。可溶性TCR的纯化可以根据本文所述和本领域已知的方法进行，并与国内外监管机构的法律和准则相符。
在一些实施例中，两个或更多不同的多肽结构域或序列通过接头(例如，在scTCR或CAR的情况下，TCRVα和TCRVβ)连接。“接头”是指连接两个蛋白质，多肽，肽，结构域，区域或基序的氨基酸序列，并且可以提供与两个亚结合域的相互作用相容的间隔子功能，从而使得所得的多肽保持特异性结合。对靶分子的亲和力(例如，scTCR)或保留信号传导活性(例如，TCR复合物)。在某些实施例中，接头包含约2至约35个氨基酸，约4至约20个氨基酸，约8至约15个氨基酸，约15至约25个氨基酸或其他合适数量的氨基酸。通常，接头优选是化学惰性的，柔性的和非免疫原性的或最低免疫原性的。可以重复接头序列，以达到所需的长度，例如以促进所需的蛋白质通过连接域或在连接域之间的相互作用。示例性的接头(包括甘氨酸-丝氨酸接头)和接头的性质在例如Chen et al.,Adv.Drug Deliv Rev,65(10):1357-1369(2013)，和in van Rosmalen et al.,Biochemistry 56(60):6565-6574(2017)中有讨论，其接头氨基酸序列和设计特性通过引用并入本文。
在特定的实施例中，Msln特异性结合蛋白是或包含scTCR(例如，单链αβTCR蛋白，例如Vα-L-Vβ，Vβ-L-Vα，Vα-Cα-L-Vα或Vα-L-Vβ-Cβ，其中Vα和Vβ分别是TCRα和β可变域，Cα和Cβ分别是TCRα和β恒定域，L是连接子)。
在某些实施例中，Msln特异性结合蛋白是或包含CAR。“嵌合抗原受体”(CAR)是指经工程改造以包含不自然发生或不自然发生在宿主中的方式连接在一起的两个或更多个天然存在的(或工程化的)氨基酸序列的本发明的融合蛋白。当存在于细胞表面时，该融合蛋白可以起受体的作用。本公开的CAR包括包含抗原结合结构域的细胞外部分(例如，得自或衍生自免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，诸如得自对癌症抗原特异的抗体或TCR的scFv或scTCR，或抗原结合结构域，它来自杀伤免疫受体，来自NK细胞，或来自具有或经工程改造具有与抗原特异性结合的能力的另一种蛋白(天然，重组或合成)，该蛋白与跨膜连接结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域(可选地包含共刺激结构域)(参见例如Sadelainet al.,Cancer Discov.,3(4):388(2013)；另外参见Harris and Kranz,TrendsPharmacol.Sci.,37(3):220(2016)；Stone et al.,Cancer Immunol.Immunother.,63(11):1163(2014))。在某些实施例中，结合蛋白包含含有抗原特异性TCR结合域的CAR(参见例如Walseng et al.,Scientific Reports 7:10713,2017；TCR CAR构建体和方法通过引用完整地并入本文)。
多核苷酸，矢量和宿主细胞
本文还提供了编码本发明的Msln特异性结合蛋白或其一部分(例如，TCR可变结构域)的多核苷酸。本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，如本文所述，存在许多编码结合蛋白或其部分的核苷酸序列。一些这样的多核苷酸与天然，原始或鉴定的多核苷酸序列的核苷酸序列具有有限或最小的序列同一性。但是，由于本公开内容明确考虑了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。
在某些实施例中，特别考虑了经密码子优化以在宿主细胞例如哺乳动物细胞中表达的序列。密码子优化可以使用已知的技术和工具来执行，例如，使用
Figure BDA0003151581420000321
OptimumGeneTM工具。密码子优化的序列包括至少部分密码子优化的序列(即，一种或多种密码子被优化以在宿主细胞中表达)和完全密码子优化的序列。在某些免疫宿主细胞中表达的密码子优化描述于例如Scholten et al.,Clin.Immunol.119:135,2006。
编码本发明的TCR链的示例性多核苷酸序列在SEQ ID NO:1-4、9-12、17-20、25和26中提供。因此，在某些实施例中，编码Msln特异性的多核苷酸结合蛋白包含具有与SEQ IDNO:1-4、9-12、17-20、25和26中任何一个所示的多核苷酸序列至少约50％(即，至少约50％、55％、60％、65％70％、75％、80％、85％、86％、87％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)同一性的多核苷酸。
在某些实施例中，提供了编码TCRα链的多核苷酸和编码TCRβ链的多核苷酸，它们分别与以下所示的多核苷酸序列具有至少约50％的同一性：SEQ ID NO:(i)1和3，分别地；(ii)2和4，分别地；(iii)分别为9和11，分别地；(iv)分别为10和12，分别地；(v)分别为17和19，分别地；(vi)分别为18和20，分别地；或(vii)25和26，分别地。
在某些实施例中，编码本公开内容的结合蛋白或TCR的两个或更多个组分或部分的多核苷酸包含在单个开放阅读框中可操作地结合的两个或更多个编码序列。这样的布置可以有利地允许所需基因产物的协同表达，例如，TCR的α和β链的同时表达，使得它们以约1:1的比例产生。在某些实施例中，本公开内容的结合蛋白的两个或更多个取代基基因产物，例如TCR(例如，α和β链)，被表达为分开的分子并且在翻译后结合。在进一步的实施例中，本公开的结合蛋白的两个或更多个取代基基因产物表达为单个肽，其部分由可裂解或可去除的片段隔开。
例如，自切割肽(也称为“核糖体跳跃元件”)可用于表达由单个多核苷酸或载体编码的可分离多肽，这在本领域中是已知的，包括例如P2A肽，其是由具有SEQ ID NO:41-46中任一项所示核苷酸序列的多核苷酸编码的肽；东亚西亚病毒2A(T2A)肽(Thoseaasignavirus 2A(T2A)peptide)，其是由具有SEQ ID NO:47中所示核苷酸序列的多核苷酸编码的肽；马甲鼻炎病毒(ERAV)2A(E2A)肽(Equine rhinitis A virus(ERAV)2A(E2A)peptide)，例如由具有SEQ ID NO:48所示核苷酸序列的多核苷酸编码的肽，以及口蹄疫病毒2A(F2A)肽(Foot-and-Mouth disease virus 2A(F2A)peptide)，例如由具有SEQ ID NO:49所示核苷酸序列的多核苷酸编码的肽。自切割肽的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:113-117中提供。
编码本发明的Msln特异性TCR的示例性多核苷酸，其中将编码自切割肽的多核苷酸置于编码TCRβ链的多核苷酸和编码TCRα链的多核苷酸之间，包括编码如SEQ ID NO:8、16、24和30中任一项所示氨基酸序列的那些多核苷酸。示例性的此类多核苷酸具有如SEQID NO:5、13、21、27和120中任一项所示的多核苷酸序列；在某些实施例中，提供了与SEQ IDNO:5、13、21、27和120中任何一个所示的多核苷酸序列具有至少约50％的同一性的多核苷酸。
在进一步的实施例中，结合蛋白表达为编码的转基因构建体的一部分，和/或含有编码结合蛋白的多核苷酸的宿主免疫细胞可以进一步编码：一种或多种另外的辅助蛋白，例如安全开关蛋白；标签，选择标记；CD8 co受体β链；CD8共受体α链或两者兼有；或其任何组合。在公开的PCT申请no.WO 2018/058002里描述了可用于编码和表达结合蛋白和辅助成分(例如，安全开关蛋白，选择标记，CD8共同受体β链或CD8共同受体α链中的一个或多个)的多核苷酸和转基因构建体，多核苷酸，转基因构建体和辅助组分，包括其核苷酸和氨基酸序列，通过引用并入本文。应当理解，本公开的结合蛋白，安全开关蛋白，标签，选择标记，CD8共受体β链或CD8共受体α链的任何或全部可以由单独的核酸分子编码或可以由存于或存在于分开的多核苷酸序列编码。
例如，示例性的安全开关蛋白包括截短的EGF受体多肽(huEGFRt)，其缺乏细胞外N末端配体结合域和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但是保留其天然氨基酸序列，具有I型跨膜细胞表面定位，并且具有药学级抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗(Erbitux)tEGF受体的构象上完整的结合表位(tEGFr；Wang et al.,Blood 118:1255-1263,2011)；半胱天冬酶多肽(例如，iCasp9；Straathof et al.,Blood 105:4247-4254,2005；Di Stasi et al.,N.Engl.J.Med.365:1673-1683,2011；Zhou and Brenner,Exp.Hematol.pii:S0301-472X(16)30513-6.doi:10.1016/j.exphem.2016.07.011)，RQR8(Philip et al.,Blood 124:1277-1287,2014)；源自人c-myc蛋白(Myc)的10-氨基酸标签(Kieback et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:623-628,2008)；和标记/安全开关多肽，例如RQR(CD20+CD34；Philip et al.,2014)。
可用于本公开的重组宿主细胞的其他辅助成分包括标签或选择标记，其允许对细胞进行鉴定，分选，分离，富集或追踪。例如，可以将具有所需特性的标记细胞(例如，抗原特异性TCR和安全开关蛋白)从样品中未标记的细胞中分选出来，并更有效地活化和扩增以包含在所需纯度的产物中。
如本文所用，术语“选择标记”包括赋予细胞可识别变化的核酸构建体(和编码的基因产物)，从而允许检测和阳性选择被包含选择标记的多核苷酸转导的免疫细胞。RQR是一种选择标记，其包括一个主要的CD20细胞外环和两个最小的CD34结合位点。在一些实施例中，编码RQR的多核苷酸包含编码16个氨基酸的CD34最小表位的多核苷酸。在一些实施例中，将CD34最小表位掺入CD8共受体茎结构域(Q8)的氨基末端位置。在进一步的实施例中，CD34最小结合位点序列可以与CD20的靶表位结合以形成T细胞(RQR8)的致密标记/自杀基因(Philip et al.,2014,通过引用并入本文)。该构建体允许选择表达该构建体的免疫细胞，例如结合至磁珠(Miltenyi)的CD34特异性抗体，并利用临床接受的药物抗体利妥昔单抗，从而可以选择性删除表达转基因的工程化T细胞(Philip et al.,2014)。
其他示例性选择标记还包括通常在T细胞上不表达的几种截短的I型跨膜蛋白：截短的低亲和性神经生长因子，截断的CD19和截断的CD34(参见例如，Di Stasi et al.,N.Engl.J.Med.365:1673-1683,2011；Mavilio et al.,Blood 83:1988-1997,1994；Fehseet al.,Mol.Ther.1:448-456,2000；各自以其各自的内容并入本文)。CD19和CD34的有用功能是可以使用现成的Miltenyi CliniMACsTM选择系统，该系统可以将这些标记物用于临床级分选。但是，CD19和CD34是相对较大的表面蛋白，可能会增加载体包装能力和整合载体的转录效率。也可以使用含有细胞外非信号结构域或各种蛋白质(例如，CD19，CD34，LNGFR)的表面标记。可以采用任何选择标记，并且对于良好生产规范应该是可以接受的。在某些实施例中，选择标记与编码目的基因产物(例如，本公开的结合蛋白，例如TCR或CAR)的多核苷酸一起表达。选择标记的其他实例包括，例如，报道分子(reporter)，例如GFP，EGFP，β-gal或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。在某些实施例中，选择标记，例如，CD34由细胞表达，并且CD34可用于选择富集或分离(例如，通过免疫磁选择)感兴趣的转导的目的细胞，以用于本文所述方法中。如本文所用，CD34标记与抗CD34抗体或例如与CD34结合的scFv，TCR或其他抗原识别部分有所区别。
在某些实施例中，选择标记包括RQR多肽，截短的低亲和性神经生长因子(tNGFR)，截短的CD19(tCD19)，截短的CD34(tCD34)或其任何组合。
在实践本公开的各种实施例中，标准技术可用于重组DNA，肽和寡核苷酸的合成；免疫测定；组织培养；和转化(例如电穿孔和脂质转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书或本领域通常完成的或如本文所述的进行。这些及相关技术和程序通常可以按照本领域公知的常规方法进行，并且如微生物学，分子生物学，生物化学，分子遗传学，细胞生物学，病毒学和免疫学技术中的各种一般性和更具体参考引用于或公开贯穿于本说明书。(参见，例如,Sambrook,et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3d ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons,updated July 2008)；Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover,DNA Cloning:APractical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford Univ.Press USA,1985)；CurrentProtocols in Immunology(Edited by:John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,DavidH.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober 2001John Wiley&Sons,NY,NY)；Real-Time PCR:Current Technology and Applications,Edited by Julie Logan,KirstinEdwards and Nick Saunders,2009,Caister Academic Press,Norfolk,UK；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Guthrie and Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(AcademicPress,New York,1991)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,Ed.,1984)；Nucleic AcidHybridization(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1985)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney,Ed.,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Next-Generation GenomeSequencing(Janitz,2008Wiley-VCH)；PCR Protocols(Methods in Molecular Biology)(Park,Ed.,3rd Edition,2010Humana Press)；Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress,1986)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,ColdSpring Harbor Laboratory)；Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)；Immunochemical Methods In CellAnd Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and CC Blackwell,eds.,1986)；Roitt,Essential Immunology,6th Edition,(Blackwell ScientificPublications,Oxford,1988)；Embryonic Stem Cells:Methods and Protocols(Methodsin Molecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2002)；Embryonic Stem CellProtocols:Volume I:Isolation and Characterization(Methods in MolecularBiology)(Kurstad Turksen,Ed.,2006)；Embryonic Stem Cell Protocols:Volume II:Differentiation Models(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2006)；Human Embryonic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kursad Turksen Ed.,2006)；Mesenchymal Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Darwin J.Prockop,Donald G.Phinney,and BruceA.Bunnell Eds.,2008)；Hematopoietic Stem Cell Protocols(Methods in MolecularMedicine)(Christopher A.Klug,and Craig T.Jordan Eds.,2001)；以及HematopoieticStem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kevin D.Bunting Ed.,2008)Neural Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(LeslieP.Weiner Ed.,2008))。
还提供了包含根据本发明的多核苷酸的载体。可以使用任何合适的表达载体，包括本文公开的示例性表达载体。此外，表达载体可以被配置为或能够将多核苷酸递送至宿主细胞。
典型的载体可以包括能够转运与其连接的另一核酸或能够在宿主生物体中复制的核酸分子。如本文所述，载体的一些实例包括质粒，病毒载体，粘粒和其他。
一些载体可能能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)，而其他载体可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。另外，一些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达(这些载体可以称为“表达载体”)。根据相关实施例，还应理解，如果将一种或多种试剂(例如，如本文所述的编码Msln特异性结合蛋白或其变体的多核苷酸)共同施用给受试者，则每种试剂可以驻留在分开的或相同的载体，可以将多个载体(每个包含不同的试剂或相同的试剂)引入细胞或细胞群体或施用于受试者。
如本文所用，“表达载体”是指含有核酸分子的DNA构建体，该核酸分子可操作地连接至能够影响核酸分子在合适宿主中表达的合适控制序列。此类控制序列包括实现转录的启动子，控制此类转录的任选操纵子序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、病毒或仅是潜在的基因组插入物。一旦转化成合适的宿主，载体就可以独立于宿主基因组复制和发挥作用，或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。在本说明书中，“质粒”、“表达质粒”、“病毒”和“载体”经常互换使用。
在某些实施例中，病毒载体用于引入编码靶标特异性多肽的非内源性核酸序列。病毒载体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体。病毒载体还可以包括编码转导标记的核酸序列。
适合与本发明的组合物一起使用的病毒载体包括已鉴定用于人类基因治疗应用的那些(参见Pfeifer and Verma,Ann.Rev.Genomics Hum.Genet.2:177,2001)。合适的病毒载体包括基于RNA病毒的载体，例如逆转录病毒来源的载体，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)来源的载体，并且包括更复杂的逆转录病毒来源的载体，例如慢病毒来源的载体。HIV-1衍生的载体属于这一类。
病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒，细小病毒(如腺相关病毒)，冠状病毒，负链RNA病毒(如正粘病毒(如流感病毒)，弹状病毒(如狂犬病和水疱性口炎病毒)，副粘病毒(如，麻疹和仙台病毒)，正链RNA病毒(例如小核糖核酸病毒和甲型病毒)以及双链DNA病毒，包括腺病毒，疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒和爱泼斯坦-巴尔病毒和巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘，鸡痘和金丝雀痘)。其他病毒包括但不限于诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒、肝炎病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的例子包括禽类白血病肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒和泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,ThirdEdition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。
“逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒，其使用逆转录酶逆转录成DNA，然后将逆转录的DNA掺入宿主细胞基因组中。“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科的属。γ逆转录病毒的例子包括小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮病病毒。
如本文所用，“慢病毒载体”是指用于基因递送的基于HIV的慢病毒载体，其可以是整合的或非整合的，具有相对大的包装能力，并且可以转导多种不同的细胞类型。慢病毒载体通常是在将三个或多个质粒(包装，包膜和转移)瞬时转染到生产细胞后产生的。像HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面受体的相互作用进入靶细胞。进入时，病毒RNA经历逆转录，该逆转录由病毒逆转录酶复合体介导。逆转录产物是双链线性病毒DNA，是病毒整合到感染细胞DNA中的底物。“慢病毒”是指能够感染分裂和非分裂细胞的逆转录病毒属。慢病毒的几个例子包括HIV(人类免疫缺陷病毒：包括HIV1型和HIV2型)；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。其他实例包括衍生自HIV-2、FIV、马传染性贫血病毒、SIV和维斯纳病毒(绵羊慢病毒)的慢病毒载体。
使用逆转录病毒和慢病毒载体和包装细胞以用含有嵌合抗原受体转基因的病毒颗粒转导哺乳动物宿主细胞的方法在本领域中是已知的，并且先前已描述在例如美国专利NO.8,119,772；Walchli,et al.,PLoS One 6:327930,2011；Zhao,et al.,J.Immunol.174:4415,2005；Engels,et al.,Hum.Gene Ther.14:1155,2003；Frecha,et al.,Mol.Ther.75:1748,2010；以及Verhoeyen,et al.,Methods Mol.Biol.506:91,2009。逆转录病毒和慢病毒载体构建体和表达系统也可商购获得。
在某些实施例中，病毒载体可以是γ逆转录病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)衍生的载体。在其他实施例中，病毒载体可以是更复杂的逆转录病毒来源的载体，例如慢病毒来源的载体。HIV-1衍生的载体属于这一类。其他实例包括衍生自HIV-2，FIV，马传染性贫血病毒，SIV和维斯纳病毒(绵羊慢病毒)的慢病毒载体。使用逆转录病毒和慢病毒载体和包装细胞，用含有TCR或CAR转基因的病毒颗粒转导哺乳动物宿主细胞的方法是本领域已知的，并且先前已描述于例如美国专利8,119,772；Walchli et al.,PLoS One 6:327930,2011；Zhao et al.,J.Immunol.174:4415,2005；Engels et al.,Hum.Gene Ther.14:1155,2003；Frecha et al.,Mol.Ther.18:1748,2010；以及Verhoeyen et al.,MethodsMol.Biol.506:97,2009。逆转录病毒和慢病毒载体构建体和表达系统也是商购可得的。其他病毒载体也可用于多核苷酸递送，包括DNA病毒载体，包括例如基于腺病毒的载体和基于腺相关病毒(AAV)的载体；源自单纯疱疹病毒(HSV)的载体，包括扩增子载体、复制缺陷型HSV和减毒HSV(Krisky et al.,Gene Ther.5:1517,1998)。
为基因治疗用途而开发的其他载体也可以与本公开的组合物和方法一起使用。这样的载体包括衍生自杆状病毒和α-病毒的那些载体(Jolly,D J.1999.Emerging ViralVectors.pp 209-40in Friedmann T.ed.The Development of Human Gene Therapy.NewYork:Cold Spring Harbor Lab)，或质粒载体(例如睡美人或其他转座子载体)。
当病毒载体基因组包含多个将在宿主细胞中表达为单独转录物的多核苷酸时，病毒载体还可在两个(或更多个)转录物之间包含允许双顺反子或多顺反子表达的附加序列。在病毒载体中使用的此类序列的实例包括内部核糖体进入位点(IRES)，弗林蛋白酶切割位点，病毒2A肽或其任何组合。
在某些实施例中，可以将编码Msln特异性结合蛋白的多核苷酸可操作地连接至载体的一个或多个特定元件。例如，可以有效地连接影响它们所连接的编码序列的表达和加工所需的多核苷酸序列。表达控制序列可以包括适当的转录起始，终止，启动子和增强序列；有效的RNA处理信号，例如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及可能增强蛋白质分泌的序列。如果表达控制序列与目的基因和表达控制序列邻接，则它们可被有效连接，所述表达控制序列以反式或远距离作用来控制目的基因。在一些实施例中，病毒或质粒载体还包括转导标记(例如，绿色荧光蛋白，tEGFR，tCD19，tNGFR等)。
在某些实施例中，载体能够将多核苷酸构建体递送至宿主细胞(例如，造血祖细胞或人免疫系统细胞)。在特定的实施例中，载体能够将构建体递送至人免疫系统细胞，例如CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞或其任何组合。在其他实施例中，载体能够将构建体递送至幼稚T细胞，中央记忆T细胞，干细胞记忆T细胞，效应记忆T细胞或其任何组合。在一些实施例中，编码本公开内容的构建体的载体可以进一步包含编码核酸酶的多核苷酸，该核酸酶可用于在宿主细胞中进行染色体敲除(例如，CRISPR-Cas核酸内切酶或本文公开的另一种核酸内切酶)，或可用于在基因疗法替代或基因修复疗法中将治疗性转基因或其部分传递到宿主细胞中。或者，可将用于染色体敲除或基因替代或基因修复疗法的核酸酶递送至独立于编码本公开内容的构建体的载体的宿主细胞。
用于重组产生Msln特异性结合蛋白的表达载体的构建可以通过使用本领域已知的任何合适的分子生物学工程技术来完成，包括使用限制性核酸内切酶消化，连接，转化，质粒纯化，和DNA测序，例如描述于Sambrook,et al.(1989and 2001editions；MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY)和Ausubel,et al.(Current Protocols in Molecular Biology(2003))。为了获得有效的转录和翻译，每个重组表达构建体中的多核苷酸包括至少一个合适的表达控制序列(也称为调节序列)，例如前导序列，特别是与编码目的的蛋白质或肽的核苷酸序列可操作(即可操作地)连接的启动子。
在某些实施例中，编码对Msln20-28或Msln530-538肽特异的结合蛋白的核酸分子用于转染/转导宿主细胞(例如T细胞)以用于过继转移疗法。已经描述了TCR测序的进展(例如，Robins,et al,2009Blood 114:4099；Robins,et al,2010Sci.Translat.Med.2:47ra64,PMID:20811043；Robins,et al.2011(Sept.10)J.lmm.Meth.Epub ahead of print,PMID:21945395；和Warren,et al.,2011Genome Res.21:790)，并且可以在实践根据本公开的实施例的过程中使用。
类似地，已经描述了用期望的核酸转染/转导T细胞的方法(例如，US2004/0087025)，以及使用具有期望的抗原特异性的T细胞的过继转移程序(例如，Schmitt,etal.,Hum.Gen.20:1240,2009；Dossett,et al.,Mol.Ther.77:742,2009；Till et al,Blood112:2261,2008；Wang,et al.,Hum.Gene Ther.18:112,2007；Kuball et al,Blood109:2331,2007；US 2011/0243972；US 2011/0189141；以及Leen,et al.,Ann.Rev.Immunol.25:243,2007)，以使这些方法学适应基于本文的教导，设想了本公开的实施例的“结合”，包括针对结合与HLA受体复合的Msln20-28(SEQ ID NO:31)或Msln530-538(SEQ ID NO:32)肽特异的结合蛋白的蛋白。
重组表达载体可包括例如淋巴组织特异性转录调节元件(TRE)，例如B淋巴细胞，T淋巴细胞或树突细胞特异性TRE。淋巴组织特异性TRE是本领域已知的(参见，例如，Thompson,et al.,Mol.Cell.Biol.72:1043,(1992)；Todd et al,J.Exp.Med.177:1663,(1993)；以及Penix,et al.,J.Exp.Med.775:1483,(1993))。
还提供了编码(例如，包含编码的异源多核苷酸)和/或表达如本文所公开的Msln特异性结合蛋白的重组(例如，修饰的)宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞可以是如本文公开的造血祖细胞或免疫系统细胞，例如人免疫系统细胞。在任何当前公开的实施例中，免疫系统细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、天然杀伤细胞、天然杀伤T细胞、巨噬细胞、树突状细胞或其任何组合。另外，T细胞可以是幼稚T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、干细胞记忆T细胞或其任何组合。在某些实施例中，使用本文公开的载体将宿主细胞修饰为包含或含有异源多核苷酸。
重组宿主细胞可以是同种异体的，同基因的或自体的(例如对于接受该宿主细胞进行治疗的受试者)。在其中宿主细胞编码内源TCR的某些实施例中，与内源TCR相比，由T细胞表达的异源结合蛋白或TCR能够更有效地与CD3蛋白缔合。在一些实施例中，由宿主T细胞表达的Msln特异性结合蛋白能够与CD3复合物缔合并且显示功能性表面表达和免疫活性，例如细胞因子的产生和/或表达抗原的靶细胞的杀死。在某些实施例中，与内源TCR相比，Msln特异性结合蛋白可以具有更高的细胞表面表达。
在任何当前公开的实施例中，宿主细胞，例如宿主免疫细胞，可以包含内源性免疫细胞蛋白的染色体基因敲除，例如PD-1、TIM3、LAG3、CTLA4、TIGIT、HLA组件或TCR组件或其任何组合。如本文所用，术语“染色体基因敲除”是指宿主细胞中的遗传改变或引入的抑制剂，其阻止(例如，减少，延迟，抑制或消除)宿主细胞产生功能活性的内源性多肽产物。导致染色体基因敲除的改变可以包括，例如，引入的无义突变(包括过早终止密码子的形成)，错义突变，基因缺失和链断裂，以及抑制内源性基因在宿主细胞中的表达的抑制性核酸分子的异源表达。
使用敲除程序或试剂后，可通过宿主免疫细胞的DNA测序直接确认染色体基因敲除。染色体基因敲除也可以从敲除之后不存在基因表达(例如，不存在由该基因编码的mRNA或多肽产物)中推断出来。
在某些实施例中，染色体基因敲除或基因敲入通过宿主细胞的染色体编辑来进行。可以使用例如核酸内切酶进行染色体编辑。如本文所用，“核酸内切酶”是指能够催化多核苷酸链内的磷酸二酯键裂解的酶。在某些实施例中，核酸内切酶能够切割靶基因，从而使靶基因失活或“敲除”。核酸内切酶可以是天然存在的，重组的，基因修饰的或融合的核酸内切酶。核酸内切酶引起的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的独特机制修复。在同源重组期间，供体核酸分子可用于供体基因“敲入”，用于靶基因“敲除”，并任选地通过供体基因敲入或靶基因敲除事件使靶基因失活。NHEJ是易于出错的修复过程，通常会导致切割位点的DNA序列发生变化，例如，至少一个核苷酸的取代，缺失或添加。NHEJ可用于“敲除”靶基因。核酸内切酶的实例包括锌指核酸酶，TALE核酸酶，CRISPR-Cas核酸酶，大范围核酸酶和megaTAL。
如本文所用，“锌指核酸酶”(ZFN)是指包含与非特异性DNA切割域融合的锌指DNA结合域的融合蛋白，例如Fok1核酸内切酶。每个约30个氨基酸的锌指基序与约3个碱基对的DNA结合，并且某些残基处的氨基酸可以改变，以改变三联体序列的特异性(例如，参见Desjarlais et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.90:2256-2260,1993；Wolfe et al.,J.Mol.Biol.285:1917-1934,1999)。多个锌指基序可以串联连接以产生对所需DNA序列的结合特异性，例如长度范围为约9至约18个碱基对的区域。作为背景，ZFN通过催化基因组中位点特异性DNA双链断裂(DSB)的形成来介导基因组编辑，并且通过以下方式促进了转基因的靶向整合：该转基因包含与DSB位置的基因组同源的侧翼序列同源性指导修复。或者，由ZFN产生的DSB可以通过非同源末端连接(NHEJ)的修复作用导致靶基因的敲除，这是一个容易出错的细胞修复途径，会导致核苷酸在切割位点处插入或缺失。在某些实施例中，基因敲除包含使用ZFN分子进行的插入，缺失，突变或其组合。
如本文所用，“转录激活物样效应子核酸酶”(TALEN)是指包含TALE DNA结合结构域和DNA切割结构域的融合蛋白，例如FokI核酸内切酶。“TALE DNA结合结构域”或“TALE”由一个或多个TALE重复结构域/单元组成，每个通常具有高度保守的33-35个氨基酸序列以及不同的第12和第13个氨基酸。TALE重复结构域参与TALE与靶DNA序列的结合。不同的氨基酸残基，称为重复可变残基(RVD)，与特异性核苷酸识别相关。确定了这些TALE的DNA识别的天然(规范)代码，以使TALE的12和13位上的HD(组氨酸-天冬氨酸)序列导致TALE与胞嘧啶(C)，NG(天冬酰胺-甘氨酸)结合)结合至T核苷酸，NI(天冬酰胺-异亮氨酸)结合至A，NN(天冬酰胺-天冬酰胺)结合至G或A核苷酸，而NG(天冬酰胺-甘氨酸)结合至T核苷酸。非经典(非典型)RVD也是已知的(参见，例如，美国专利公开No.US 2011/0301073，非典型RVD通过引用整体并入本文)。TALENs可用于指导T细胞基因组中的位点特异性双链断裂(DSB)。非同源末端连接(NHEJ)从双链断裂的两侧连接DNA，在双链断裂中几乎没有或没有序列重叠用于退火，从而引入了敲除基因表达的错误。或者，如果转基因中存在同源侧翼序列，则直接进行同源性修复可将转基因引入DSB位点。在某些实施例中，基因敲除包含插入，缺失，突变或其组合，并使用TALEN分子制备。
如本文所用，“成簇的规则间隔的短回文重复序列/Cas”(CRISPR/Cas)核酸酶系统是指采用CRISPR RNA(crRNA)引导的Cas核酸酶通过碱基配对的互补性来识别基因组(称之为原间隔区)内靶位，然后在紧随其后的短的，保守的与原间隔物相关的基序(PAM)时切割DNA序列的3’的系统。根据Cas核酸酶的序列和结构，将CRISPR/Cas系统分为三种类型(即I型，II型和III型)。I型和III型的crRNA指导的监视复合体需要多个Cas亚基。研究最多的II型系统至少包含三个组件：RNA引导的Cas9核酸酶，crRNA和反式crRNA(tracrRNA)。tracrRNA包含双链体形成区。crRNA和tracrRNA形成双链体，该双链体能够与Cas9核酸酶相互作用，并通过crRNA间隔区和在PAM上游的原间隔区之间的Watson-Crick碱基配对将Cas9/crRNA:tracrRNA复合体引导至目标DNA上的特定位点。Cas9核酸酶在crRNA间隔区定义的区域内切割双链断裂。NHEJ修复导致插入和/或缺失，从而破坏了目标基因座的表达。或者，可以通过同源性指导的修复将具有同源侧翼序列的转基因引入DSB的位点。可以将crRNA和tracrRNA工程化成单个指导RNA(sgRNA或gRNA)(参见，例如，Jinek et al.,Science 337:816-21,2012)。此外，可以改变或编程与靶位点互补的指导RNA的区域以靶向所需序列(Xie et al.,PLOS One 9:e100448,2014；美国专利公开No.US 2014/0068797，美国专利公开No.US 2014/0186843；美国专利公开No.8,697,359，以及PCT公开No.WO 2015/071474；它们各自通过引用并入本文)。在某些实施例中，基因敲除包括插入，缺失，突变或其组合，并使用CRISPR/Cas核酸酶系统制备。
示例性的gRNA序列和使用该gRNA序列敲除编码免疫细胞蛋白的内源基因的方法包括描述在Ren et al.,Clin.Cancer Res.23(9):2255-2266(2017)、gRNA、CAS9 DNA、载体和基因敲除技术的那些方法，其在此全文引入作为参考。
如本文所用，“大范围核酸酶”，也称为“归巢内切核酸酶”，是指以大的识别位点(约12至约40个碱基对的双链DNA序列)为特征的内脱氧核糖核酸酶。根据序列和结构基序分为五个家族：LAGLIDADG(SEQ ID NO:121)、GIY-YIG(SEQ ID NO:122)、HNH、His-Cys box和PD-(D/E)XK(SEQ ID NO:123)。示例性的大范围核酸酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII，其识别序列是已知的(参见，例如，美国专利No.5,420,032和No.6,833,252；Belfort et al.,Nucleic Acids Res.25:3379-3388,1997；Dujon et al.,Gene 82:115-118,1989；Perler et al.,Nucleic Acids Res.22:1125-1127,1994；Jasin,TrendsGenet.12:224-228,1996；Gimble et al.,J.Mol.Biol.263:163-180,1996；Argast etal.,J.Mol.Biol.280:345-353,1998)。
在某些实施例中，天然存在的大范围核酸酶可以用于促进选自PD-1，LAG3，TIM3，CTLA4，TIGIT，HLA编码基因或TCR组分编码基因的靶标的位点特异性基因组修饰。
在其他实施例中，将对靶基因具有新结合特异性的工程化大范围核酸酶用于位点特异性基因组修饰(参见，例如，Porteus et al.,Nat.Biotechnol.23:967-73,2005；Sussman et al.,J.Mol.Biol.342:31-41,2004；Epinat et al.,Nucleic Acids Res.31:2952-62,2003；Chevalier et al.,Molec.Cell 10:895-905,2002；Ashworth et al.,Nature441:656-659,2006；Paques et al.,Curr.Gene Ther.7:49-66,2007；美国专利公开No.US 2007/0117128；US 2006/0206949；US 2006/0153826；US 2006/0078552；以及US2004/0002092)。在进一步的实施例中，使用归巢内切核酸酶产生染色体基因敲除，所述归巢内切核酸酶已经用TALEN的模块化DNA结合结构域修饰以制备称为megaTAL的融合蛋白。当与编码目的多肽的外源供体模板结合使用时，MegaTALs不仅可用于敲除一个或多个靶基因，还可用于引入(敲除)异源或外源多核苷酸。
在某些实施例中，染色体基因敲除包含被引入宿主细胞(例如免疫细胞)的抑制性核酸分子，该宿主细胞包含编码与肿瘤相关抗原特异性结合的抗原特异性受体的异源多核苷酸，其中抑制性核酸分子编码靶标特异性抑制剂，并且其中所编码的靶标特异性抑制剂抑制在宿主免疫细胞的内源基因表达(即，PD-1、TIM3、LAG3、CTLA4、TIGIT、HLA组分或TCR组分，或其任何组合)。
在某些实施例中，可以将目的结合蛋白敲入宿主细胞；或将其结合到宿主细胞中。例如，使用可用于将目的多核苷酸敲入宿主细胞的任何当前公开的技术或试剂。在一些实施例中，将编码结合蛋白的多核苷酸敲入宿主细胞并且不整合入内源染色体，例如在细胞核中。在一些实施例中，将编码结合蛋白的多核苷酸在内源基因座敲入宿主细胞，任选地破坏内源基因座的编码序列。在某些实施例中，将编码结合蛋白的多核苷酸敲入内源TCR基因座，从而敲除内源TCR并敲入目的蛋白质。参见，例如，Eyquem et al.,Nature 543(7643):113–117(2017)。
在一些实施例中，编码间皮素特异性结合蛋白的多核苷酸(例如包含，组成或基本上由SEQ ID NO:6-8、14-16、22-24、28-40、78-110、118、119中任一个或多个氨基酸序列组成的多肽)被敲入宿主细胞。本文的结合蛋白包括TCRα链可变域(Vα)和TCRβ链可变域(Vβ)。在任何当前公开的实施例中，间皮素特异性结合蛋白能够特异性结合间皮素肽:HLA复合物，例如间皮素肽:HLA-A*02:01复合物。
在一些实施例中，基因敲入可用于引入编码能够与本文所述的间皮素肽抗原特异性结合的结合蛋白的多核苷酸(例如，包含，组成或基本上由与以下任何之一氨基酸序列具有至少约85％(即，至少约86％、85％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的)同一性的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:6-8、14-16、22-24、28-40、78-110、118或119)。
在某些实施例中，将编码间皮素特异性结合蛋白(例如，TCR)的多核苷酸敲入宿主细胞，并且宿主细胞进一步包含编码不同结合蛋白的多核苷酸。在一些实施例中，不同的结合蛋白与宿主细胞是异源的。在其他实施例中，不同的结合蛋白对于宿主细胞是内源的。在某些实施例中，将编码不同结合蛋白的多核苷酸敲入宿主细胞。在某些实施例中，不同的结合蛋白是对不同的抗原(例如，不同的Msln抗原，或来自不同的蛋白质或靶标的抗原，例如BCMA、CA19-9、BRAF、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰GD2、O-乙酰GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis A、Lewis Y、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A(例如，包括MAGE-A1，MAGE-A3和MAGE-A4)，KRAS、HER2、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、HLA、与HLA结合的肿瘤或病原体相关肽、与HLA结合的hTERT肽、与HLA结合的酪氨酸酶肽、LTβR、LIFRβ、LRP5、MUC1、OSMRβ、TCRα、TCRβ、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、HA1-H、Robo1、α-甲胎蛋白(AFP)、卷曲、OX40、PRAME和SSX-2等)的特异性的结合蛋白。例如，宿主细胞可包含编码特异性结合Msln抗原:HLA复合物的结合蛋白的敲入多核苷酸和编码结合蛋白(例如TCR或CAR)的(例如敲入)多核苷酸。与CA19-9抗原特异性结合的蛋白。
在某些实施例中，编码和/或表达本公开的Msln特异性结合蛋白的宿主免疫细胞能够在体内优先迁移或定位于表达同源Msln抗原的靶组织，例如肿瘤，但是在相同类型的非相邻组织中以统计学上显着减少的量存在。通过说明的方式，宿主免疫细胞可以存在于肺肿瘤中(例如，如使用编码的结合蛋白的TCR V区的深度测序所确定的那样)，但是在与肿瘤不相邻的同一肺组织中以较低水平或根本不存在。在一些实施例中，非相邻组织包括或指从患病或恶性组织中去除至少3cm的组织。
在某些实施例中，宿主细胞富含细胞组合物，例如可以施用于受试者。如本文所用，相对于混合物中的细胞类型的量，“富集”或“耗尽”是指在一个或多个富集或耗竭过程或步骤中产生的细胞混合物中，“富集”类型的数量增加，“贫化”细胞的数量减少或两者兼而有之。因此，取决于经历富集过程的原始细胞群的来源，混合物或组合物可包含30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的(数目或数量)的“富集”的细胞。经受消耗过程的细胞可导致混合物或组合物包含50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％或更少(数量或计数)的“耗尽”细胞。在某些实施例中，混合物中某种细胞类型的数量将被富集，另一种细胞类型的数量将被耗尽，例如在消耗CD8+细胞的同时富集CD4+细胞，或者在消耗CD62L–细胞的同时富集CD62L+细胞，或者它们的组合。
用途
另一方面，本公开提供了通过向对象施用有效量的本文描述的组合物(例如结合蛋白、重组宿主细胞、多核苷酸、载体或相关组合物)来治疗需要其的对象(即患有或怀疑患有与间皮素抗原相关的疾病或病症的)的方法。还提供了用于治疗此类疾病或制备用于治疗此类疾病的药物的此类组合物。这些疾病包括各种形式的增生性或过度增生性疾病，例如实体癌和血液系统恶性肿瘤。
“治疗”或“医治”或“改善”是指对象(例如人类或非人类哺乳动物，例如灵长类、马、猫、狗、山羊、小鼠或大鼠)的疾病，病症或病状的医学管理。通常，通常，包含表达本公开内容的结合蛋白的宿主细胞和任选的佐剂的合适剂量或治疗方案以足以引起治疗或预防益处的量施用。治疗或预防/预防益处包括改善临床预后；减轻或减轻与疾病有关的症状；减少症状的发生；改善生活质量；更长的无病状态；疾病程度的减少；稳定疾病状态；疾病进展延迟；缓解；生存；延长生存期；或其任何组合。
如本文所用，术语“过继免疫疗法”或“过继免疫疗法”和“过继细胞疗法”是指施用天然存在的或基因工程的疾病-抗原特异性免疫细胞(例如，T细胞)。过继细胞免疫疗法可以是自体的(免疫细胞来自受体)，同种异体的(免疫细胞来自相同物种的供体)或同基因的(免疫细胞来自与受体基因上相同的供体)。
本公开内容的结合蛋白或宿主细胞的“治疗有效量”或“有效量”是指足以产生治疗效果，包括改善的临床结果的结合蛋白或宿主细胞的量；减轻或减轻与疾病有关的症状；减少症状的发生；改善生活质量；更长的无病状态；疾病程度的减少，疾病状态的稳定；疾病进展延迟；缓解；生存或以统计学上显着的方式延长生存期。当涉及单独施用的单独的活性成分或表达单一活性成分的细胞时，治疗有效量是指该成分或单独表达该成分的细胞的作用。当提及组合时，治疗有效量是指活性成分或组合的辅助活性成分与表达导致治疗效果的细胞的组合量，无论是连续施用还是同时施用。组合也可以是表达一种以上活性成分的细胞，例如特异性结合抗原的两种不同的结合蛋白，或本公开的融合蛋白。
如本文所用，“统计显着性”是指当使用学生的t检验计算时的p值等于或小于0.050，并且表示不太可能偶然发生特定事件或测量结果。
如本文所用，“过度增殖性疾病”是指与正常或未患病的细胞相比过度生长或增殖。典型的过度增殖性疾病包括肿瘤、癌症、肿瘤组织、癌、肉瘤、恶性细胞、恶性前细胞、以及非肿瘤性或非恶性过度增殖性疾病(例如，腺瘤、纤维瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、血管瘤、纤维化、再狭窄以及自身免疫疾病、例如类风湿关节炎、骨关节炎、牛皮癣、炎症性肠病等)。与过度增生性疾病相比，某些涉及异常或过度生长的疾病发生得比缓慢增生性疾病更慢的疾病，可以称为“增生性疾病”，包括某些肿瘤、癌症、赘生性组织、癌、肉瘤、恶性细胞、恶性前细胞以及非肿瘤或非恶性疾病。
此外，“癌症”可以指细胞的任何加速增殖，包括实体瘤、腹水瘤、血液或淋巴瘤或其他恶性肿瘤；结缔组织恶性肿瘤；转移性疾病；器官或干细胞移植后残留的疾病极少；多药耐药性癌症，原发性或继发性恶性肿瘤，与恶性肿瘤相关的血管生成或其他形式的癌症。
目前公开的结合蛋白、宿主细胞、多核苷酸、载体和组合物可用于治疗或制备用于治疗癌症的药物，其中Msln20-28肽在癌症的肿瘤细胞上表达，和/或其中Msln530-538肽在癌症的肿瘤细胞上表达；用于治疗的示例性癌症包括间皮瘤，胰腺癌，卵巢癌和肺癌。
在某些实施例中，当前公开的结合蛋白、宿主细胞、多核苷酸、载体和组合物可用于治疗和/或制备用于治疗癌症的药物，例如实体癌或血液恶性肿瘤。在某些实施例中，所述实体癌选自或包括胆道癌、膀胱癌、骨和软组织癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠腺癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、胚胎癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、头颈鳞状细胞癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、原发性星形细胞性肿瘤原发性甲状腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、睾丸生殖细胞瘤、尿路上皮癌、子宫肉瘤或子宫癌。
在某些实施例中，根据当前公开的方法和用途可治疗的癌症包括癌、肉瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或其任何组合。在某些实施例中，癌症包括头或颈癌、黑素瘤、胰腺癌、胆管癌、肝细胞癌、包括三阴性乳腺癌(TNBC)的乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、食道癌、间皮瘤、小细胞肺癌、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤或其任何组合。在某些实施例中，癌症包括阿斯金氏(Askin's)肿瘤、葡萄状肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏(Ewing's)肉瘤、PNET、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、肺泡软组织肉瘤、血管肉瘤、叶囊状肉瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤、骨骼外软骨肉瘤、骨骼外骨肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、血管周细胞瘤、血管肉瘤、卡波西氏(Kaposi’s)肉瘤、平滑肌肉肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴结肉瘤、未分化的多形性肉瘤、恶性周围神经鞘膜瘤(MPNST)、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、未分化的多形性肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、塑料性皮炎、血管活性肠肽瘤、胆管癌、肝细胞癌、腺样囊性癌、肾细胞癌、Grawitz肿瘤、室管膜瘤、星形细胞瘤、胶质细胞瘤、脑干神经胶质瘤、视神经胶质瘤、混合神经胶质瘤、霍奇金(Hodgkin’s)淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫原性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤、
Figure BDA0003151581420000471
巨球蛋白血症、CD37+树突状细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、结外黏膜相关性(MALT)淋巴组织的边缘区B细胞淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发渗出性淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻腔类型、与肠病相关T细胞淋巴瘤、肝脾性T细胞淋巴瘤、原始性NK细胞淋巴瘤、Sezary综合征、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤或其任意组合。
在某些实施例中，癌症包括实体瘤。在一些实施例中，实体瘤是肉瘤或癌。在某些实施例中，实体瘤选自：软骨肉瘤；和纤维肉瘤(成纤维细胞肉瘤)；隆突性皮肤肉瘤(DFSP)；骨肉瘤横纹肌肉瘤尤因氏肉瘤；胃肠道间质瘤；平滑肌肉瘤；血管肉瘤(血管肉瘤)；卡波济肉瘤；脂肪肉瘤多形性肉瘤或滑膜肉瘤。
在某些实施例中，实体瘤选自肺癌(例如，腺癌，鳞状细胞癌(类鳞癌)；鳞状细胞癌；腺癌；腺鳞癌；间变性癌；大细胞癌；小细胞癌；和乳腺癌(例如，原位导管癌(非侵入性)，原位小叶癌(非侵入性)，侵袭性导管癌，侵袭性小叶癌，非侵入性癌)；肝癌(例如，肝细胞癌，胆管癌或胆管癌)；大细胞未分化癌，支气管肺泡癌)；卵巢癌(例如表面上皮间质瘤(腺癌)或卵巢上皮癌(包括浆液性肿瘤，子宫内膜样肿瘤和粘液性囊腺癌)，表皮样(鳞状细胞癌)，胚胎癌和绒毛膜癌(生殖细胞肿瘤))；肾癌(例如，肾腺癌，肾上腺癌，移行细胞癌(肾盂)，鳞状细胞癌，贝里尼导管癌，透明细胞腺癌，移行细胞癌，肾盂类癌)；肾上腺癌(例如，肾上腺皮质癌)，睾丸癌(例如，生殖细胞癌(精原细胞瘤，绒毛膜癌，胚胎性癌，畸胎瘤)，浆液性癌)；胃癌(例如腺癌)；肠癌(例如十二指肠腺癌)；大肠癌；或皮肤癌(例如基底细胞癌，鳞状细胞癌)。在某些实施例中，实体瘤是卵巢癌，卵巢上皮癌，宫颈腺癌或小细胞癌，胰腺癌，结肠直肠癌(例如，腺癌或鳞状细胞癌)，肺癌，乳腺导管癌癌或前列腺腺癌。
在任何当前公开的实施例中，宿主细胞是同种异体细胞，同系细胞或自体细胞。可以通过本发明治疗的对象通常是人类和其他灵长类对象，例如用于兽医学目的的猴子和猿。在任何上述实施方式中，受试者可以是人类受试者。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿，少年，青少年，成人和老年受试者。如本领域技术人员所确定的，可以以适合于待治疗的疾病，病症或失调的方式施用根据本发明的细胞。在任何上述实施例中，将包含本文所述的融合蛋白的细胞静脉内，腹膜内，肿瘤内地施用至骨髓，淋巴结或脑脊髓液中，以便遇到要消融的标记细胞。组合物的合适剂量，合适的持续时间和施用频率将由诸如患者的状况等因素来确定；这些因素包括：疾病、病症或障碍的大小、类型和严重程度；标记细胞的不良类型或水平或活性，活性成分的特定形式；和给药方法。
通常，适当的剂量和治疗方案以足以提供益处的量提供活性分子或细胞。与未治疗的受试者相比，可以通过在治疗的受试者中建立改善的临床结果(例如，更频繁的缓解，完全或部分或更长的无病生存期)来监测这种反应。预先存在的对肿瘤蛋白的免疫反应增加通常与改善的临床结果相关。通常可以使用常规的标准增殖，细胞毒性或细胞因子测定法评估此类免疫应答。
为了预防性使用，剂量应足以预防，延迟与疾病或病症有关的疾病的发作或减轻其严重性。可以通过进行临床前(包括体外和体内动物研究)和临床研究，并分析通过适当的统计，生物学和临床方法及技术从中获得的数据，来确定根据本文所述方法施用的免疫原性组合物的预防益处，所有这些都可以由本领域技术人员容易地实践。
在过继细胞疗法的情况下，有效剂量是在过继转移中使用的编码或表达Msln特异性结合蛋白的宿主细胞的量，且能够在治疗的人类或非人类哺乳动物中产生临床上期望的结果(即，以统计学上显着的方式足以诱导或增强针对表达Msln特异性抗原应答(例如细胞毒性T细胞应答)的细胞的特异性T细胞免疫应答)。在特定实施例中，T细胞是幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、效应记忆T细胞或其任何组合。
还考虑了包含本文公开的Msln特异性结合蛋白，宿主(即，修饰的)免疫细胞，多核苷酸或载体以及药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂的药物组合物(组合物)。术语“药学上可接受的赋形剂或载体”或“生理上可接受的赋形剂或载体”是指适用于人类或其他非人类哺乳动物的生物相容性载体，例如生理盐水，在本文中有更详细的描述。且通常被认为是安全的或不会引起严重不良事件的受试者。合适的赋形剂包括水，盐水，右旋糖，甘油等及其组合。在实施例中，包含本文公开的融合蛋白或宿主细胞的组合物还包含合适的输注介质。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水，Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)，5％葡萄糖水溶液，可以使用林格氏乳酸盐。输注介质可以补充人血清白蛋白或其他人血清成分。
药物组合物可以按照医学领域技术人员确定的适合于待治疗(或预防)的疾病或病状的方式施用。组合物的合适剂量和合适的给药持续时间和频率将取决于以下因素：患者的健康状况、患者的体型(即体重，质量或体表面积)、患者状况的类型和严重程度、活性成分的特定形式、和给药方法。通常，适当的剂量和治疗方案以足以提供治疗和/或预防益处的量提供组合物(如本文所述，包括改善的临床结果，例如更频繁的完全或部分缓解，或更长的无病和/或总生存期，或症状严重程度的减轻)。
本文还提供了包含有效量的修饰的免疫细胞或包含修饰的免疫细胞的组合物的单位剂量。在某些实施例中，单位剂量包括(i)包含至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的修饰的CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的修饰的CD8+T细胞的组合物组合，以约1:1的比例，其中单位剂量包含减少的量或基本没有幼稚T细胞(即，与具有相当数量的PBMC的患者样本相比，具有在单位剂量中存在的原始T细胞的百分比少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％或少于约1％)。
在一些实施例中，单位剂量包含(i)以约1:1的比例包含至少约50％的修饰的CD4+T细胞的组合物，和(ii)包含至少约50％的修饰的CD8+T细胞的组合物，其中单位剂量包含的T细胞数量减少或基本不存在。在进一步的实施例中，单位剂量以约1:1的比例包括(i)包含至少约60％的修饰的CD4+T细胞的组合物，以及(ii)包含至少约60％的修饰的CD8+T细胞的组合物，其中单位剂量包含减少的量或基本上没有幼稚的T细胞。在另外的实施例中，单位剂量包括(i)包含至少约70％的工程CD4+T细胞的组合物，以及(ii)包含至少约70％的工程CD8+T细胞的组合物，其比例为约1:1，其中单位剂量包含的T细胞数量减少或基本没有。在一些实施例中，单位剂量包含(i)包含至少约80％的修饰的CD4+T细胞的组合物，以及(ii)包含至少约80％的修饰的CD8+T细胞的组合物，其比例为约1:1，其中单位剂量包含减少的量或基本上没有幼稚的T细胞。在一些实施例中，单位剂量包含(i)包含至少约85％的修饰的CD4+T细胞的组合物，以及(ii)包含至少约85％的修饰的CD8+T细胞的组合物，其比例为约1:1，其中单位剂量包含减少的量或基本上没有幼稚的T细胞。在一些实施例中，单位剂量包含(i)包含至少约90％的修饰的CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约90％的修饰的CD8+T细胞的组合物，以约1:1的比例，其中单位剂量包含减少的量或基本上没有幼稚的T细胞。
组合物或单位剂量中的细胞数量为至少一个细胞(例如，一个重组CD8+T细胞亚群(例如，任选地包含记忆和/或幼稚的CD8+T细胞)；一个重组CD4+T细胞亚群((例如，任选地包含内存和/或朴素的CD4+T细胞))，或者通常大于102个细胞，例如，最多104个、最多105个、最多106个、最多107个、最多108个、最多109个、或超过1010个细胞。在某些实施例中，以约104至约1010细胞/m2的范围，优选以约105至约109细胞/m2的范围施用细胞。在一些实施例中，施用剂量包括至多约3.3×105细胞/kg。在一些实施例中，施用剂量包括至多约1×106细胞/kg。在一些实施例中，施用剂量包括至多约3.3×106细胞/kg。在一些实施例中，施用剂量包括至多约1×107细胞/kg。在某些实施例中，向受试者施用重组宿细胞的施用剂量包含至多约5x104细胞/kg、5x105细胞/kg、5x106细胞/kg或至多约5x107细胞/kg。在某些实施例中，向受试者施用重组宿主细胞的施用剂量包含至少约5×104细胞/kg、5×105细胞/kg、5×106细胞/kg或至多约5×107细胞/kg。细胞的数量将取决于组合物所预期的最终用途以及其中所包括的细胞的类型。例如，经修饰以表达或编码结合蛋白的细胞将包含含有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多此类细胞。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为1升或更小，500ml或更小，250ml或更小或100ml或更小。在实施例中，所需细胞的密度通常大于104细胞/ml，并且通常大于107细胞/ml，通常为108细胞/ml或更高。可以在一段时间内以单次输注或多次输注的形式给予细胞。在某些实施例中，可将临床相关数目的细胞分配为多次输注，这些输注累积等于或超过106、107、108、109、1010或1011个细胞。在某些实施例中，单位剂量的细胞可以与来自同种异体供体的造血干细胞共同施用(例如，同时或同时)。在一些实施例中，单位剂量中包含的一种或多种细胞对受试者是自体的。
应当理解，本公开的单位剂量、组合物或治疗方案可以包含如本文所述的Msln特异性结合蛋白或重组宿主细胞，并且还包含表达对以下的不同抗原具有特异性的结合蛋白的(例如，修饰的)免疫细胞：例如，不同的Msln抗原或来自不同蛋白质或靶标的抗原，例如BCMA、CA19-9、BRAF、CD3、CEACAM6、c-Met、EGFR、EGFRvIII、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰GD2、O-乙酰GD3、GHRHR、GHR、FLT1、KDR、FLT4、CD44v6、CD151、CA125、CEA、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis A、Lewis Y、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、HVEM、MAGE-A(例如，包括MAGE-A1，MAGE-A3和MAGE-A4)、KRAS、HER2、NY-ESO-1、PSMA、RANK、ROR1、TNFRSF4、CD40、CD137、TWEAK-R、HLA、与HLA结合的肿瘤或病原体相关肽、与HLA结合的hTERT肽、与HLA结合的酪氨酸酶肽、LTβR、LIFRβ、LRP5、MUC1、OSMRβ、TCRα、TCRβ、CD19、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD52、CD56、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86、CD123、CD171、CD276、B7H4、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、HA1-H、Robo1、α-甲胎蛋白(AFP)、卷曲蛋白、OX40、PRAME和SSX-2等)。例如，单位剂量或治疗方案可包含表达与Msln抗原：HLA复合物特异性结合的结合蛋白的修饰的CD4+T细胞和表达与CA19-9抗原特异性结合的结合蛋白(例如，TCR或CAR)的修饰的CD4+T细胞(和/或修饰的CD8+T细胞)。
在本文所述的任何实施例中，单位剂量包含相等或近似相等的工程CD45RA-CD3+CD8+和修饰的CD45RA-CD3+CD4+TM细胞的数量。
本文所述的药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶或小瓶中。可以将这样的容器冷冻以保持制剂的稳定性，直到将其输注到患者体内为止。
如本文所用，组合物的施用是指将其递送至受试者，而不论递送途径或方式如何，例如静脉内，口服阴道，直肠，皮下等。给药可以连续或间歇地和胃肠外进行。给药可以用于治疗已经被证实具有公认的病状，疾病或疾病状态的受试者，或者用于治疗易患或处于形成这种病状，疾病或疾病状态的受试者。与辅助疗法的共同给药可能包括同时和/或顺序地以任何顺序和按任何给药方案递送多种药物(例如，具有一种或多种细胞因子的重组宿主细胞；免疫抑制疗法，例如钙调神经磷酸酶抑制剂，皮质类固醇，微管抑制剂，低剂量的麦考酚酸前药，或其任何组合)。
如果本发明的组合物肠胃外给药，则该组合物还可包含无菌的水性或油性溶液或悬浮液。合适的无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂包括水，林格氏溶液，等渗盐溶液，1，3-丁二醇，乙醇，丙二醇或与水混合的聚乙二醇。水溶液或悬浮液可进一步包含一种或多种缓冲剂，例如乙酸钠，柠檬酸钠，硼酸钠或酒石酸钠。当然，用于制备任何剂量单位制剂的任何材料应该是药学上纯的，并且在所使用的量上基本上是无毒的。另外，可以将活性化合物掺入缓释制剂和制剂中。如本文所用，剂量单位形式是指物理上离散的单位，其适合于作为待治疗对象的单位剂量；每个单元可包含预定量的重组细胞或活性化合物，所述重组细胞或活性化合物经计算可与合适的药物载体结合产生期望的治疗效果。
在某些实施例中，向受试者施用多种剂量的本文所述的组合物(例如重组宿主细胞)，其可以在施用约两周至约四周之间的间隔施用。
本公开的治疗或预防方法可以作为治疗过程或方案的一部分施用于受试者，其可以包括在施用立即公开的单位剂量，细胞或组合物之前或之后的另外的治疗。例如，在某些实施例中，接受单位剂量的HCT的受试者(例如，重组宿主细胞正在接受或先前已经接受过造血细胞移植(HCT；包括清髓性和非清髓性HCT)。在本领域中是已知的，并且可以包括任何合适的供体细胞的移植，例如来自脐带血，骨髓或外周血的细胞，造血干细胞，动员的干细胞或羊水细胞。在某些实施例中，本发明的重组宿主细胞可以在改良的HCT疗法中与造血干细胞一起施用或在造血干细胞之后不久施用。在一些实施例中，HCT包含供体造血细胞，其包含编码HLA组分的基因的染色体敲除、编码TCR组分的基因的染色体敲除或两者。
CTL免疫应答的水平可以通过本文所述和本领域常规实践的多种免疫学方法中的任何一种来确定。可以在施用本文描述的任何一种Msln特异性结合蛋白(或编码和/或表达相同蛋白的宿主细胞)或免疫原性组合物之前和之后确定CTL免疫应答的水平。可以使用本领域常规实践的几种技术和方法中的任何一种来进行用于确定CTL活性的细胞毒性测定(参见，例如，Henkart,et al.,"Cytotoxic T-Lymphocytes"in Fundamental Immunology,Paul(ed.)(2003Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA),pages 1127–50，以及其中引用的参考文献)。
抗原特异性T细胞应答通常通过根据本文所述的任何T细胞功能参数(例如，增殖，细胞因子释放，CTL活性，改变的细胞表面标志物表型等)通过观察的T细胞应答的比较来确定。在适当情况下暴露于同源抗原的T细胞(例如，当由免疫相容性抗原呈递细胞呈递时用于引发或激活T细胞的抗原)与来自相同来源群体的T细胞之间产生的而是暴露于结构上不同或不相关的对照抗原。具有统计学显着性的对同源抗原的应答大于对对照抗原的应答表示抗原特异性。
可从受试者获得生物学样品，用于确定针对如本文所述的Msln肽的免疫应答的存在和水平。本文所用的“生物样品”可以是血液样品(可以从中制备血清或血浆)，活检样品，体液(例如肺灌洗液，腹水，粘膜清洗液，滑液等)，骨髓，淋巴结，组织外植体，器官培养物或受试者或生物学来源的任何其他组织或细胞制剂。也可以在接受任何免疫原性组合物之前从受试者获得生物样品，该生物样品可用作建立基线(即免疫前)数据的对照。
在一些实施例中，接受对象组合物的对象先前已接受化学疗法，例如淋巴结吞噬化学疗法。在进一步的实施例中，所述去淋巴细胞化疗包括环磷酰胺，氟达拉滨，抗胸腺细胞球蛋白，奥沙利铂或其组合。在一些实施例中，受试者组合物先前已接受放射疗法，包含细胞因子，抗体，抗体-药物缀合物或Fc融合蛋白的免疫疗法，反义核苷酸疗法，基因疗法，疫苗或手术或其任何组合。
根据本公开的方法和用途可以进一步包括在联合疗法中施用一种或多种其他试剂来治疗疾病或病症。例如，在某些实施例中，组合疗法包括给予(同时，同时或依次)免疫检查点抑制剂的组合物(例如，任何一种或多种结合蛋白，编码和/或表达相同的多核苷酸，载体的修饰的宿主细胞)。在一些实施例中，组合疗法包括将本发明的组合物与刺激性免疫检查点剂的激动剂一起施用。在进一步的实施例中，组合疗法包括将本发明的组合物与二级疗法一起施用，所述二级疗法例如化学治疗剂、放射疗法、手术、抗体、抗体药物缀合物、细胞因子、反义疗法、基因疗法、疫苗或其任何组合。
如本文所用，术语“免疫抑制剂”或“免疫抑制剂”是指提供抑制信号以帮助控制或抑制免疫应答的一种或多种细胞、蛋白质、分子、化合物或复合物。例如，免疫抑制剂包括那些部分或全部阻断免疫刺激的分子；例如：减少，预防或延迟免疫激活；或增加，激活或上调免疫抑制。靶向的示例性免疫抑制剂(例如，带有免疫检查点抑制剂)包括PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、CTLA4、B7-H3、B7-H4、CD244/2B4、HVEM、BTLA、CD160、TIM3、GAL9、KIR、PVR1G(CD112R)、PVRL2、腺苷、A2aR、免疫抑制细胞因子(例如IL-10、IL-4、IL-1RA、IL-35)、IDO、精氨酸酶、VISTA、TIGIT、LAIR1、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、Treg细胞或其任何组合。
免疫抑制剂抑制剂(也称为免疫检查点抑制剂)可以是化合物、抗体、抗体片段或融合多肽(例如Fc融合蛋白，例如CTLA4-Fc或LAG3-Fc)，反义分子，核酶或RNAi分子或低分子量有机分子。在本文公开的任何实施例中，方法可以单独或以任何组合包含具有以下免疫抑制组分中任一种的一种或多种抑制剂的本公开的组合物。
因此，在某些实施例中，根据本发明的治疗方法可以进一步包括向受试者施用PD-1抑制剂。PD-1抑制剂可以包括尼伏鲁单抗
Figure BDA0003151581420000541
派姆单抗
Figure BDA0003151581420000542
伊匹木单抗+尼武单抗
Figure BDA0003151581420000543
西米普利单抗；IBI-308；nivolumab+relatlimab；BCD-100；卡米单抗；JS-001；斯巴达珠单抗；替雷利珠单抗；AGEN-2034；BGBA-333+替雷利珠单抗；CBT-501；dostarlimab；durvalumab+MEDI-0680；JNJ-3283；盐酸帕唑帕尼+派姆单抗；pidilizumab；REGN-1979+西米普利单抗；ABBV-181；ADUS-100+斯巴达珠单抗；AK-104；AK-105；AMP-224；BAT-1306；BI-754091；CC-90006；西米普单抗+REGN-3767；CS-1003；GLS-010；LZM-009；MEDI-5752；MGD-013；PF-06801591；Sym-021；替雷利珠单抗+帕米帕尼；XmAb-20717；AK-112；ALPN-202；AM-0001；对抗PD-1的阿尔茨海默氏病抗体；BH-2922；BH-2941；BH-2950；BH-2954；对抗CTLA-4和PD-1的实体瘤生物制剂；针对肿瘤的靶向PD-1和LAG-3的双特异性单克隆抗体；BLSM-101；CB-201；CB-213；CBT-103；CBT-107；细胞免疫疗法+PD-1抑制剂；CX-188；HAB-21；HEISCOIII-003；IKT-202；JTX-4014；MCLA-134；MD-402；mDX-400；MGD-019；拮抗PDCD1肿瘤的单克隆抗体；拮抗PD-1肿瘤的单克隆抗体；抑制PD-1肿瘤的溶瘤病毒；OT-2；PD-1拮抗剂+绳索干扰素α-2b；PEGMP-7；PRS-332；RXI-762；STIA-1110；TSR-075；靶向HER2和PD-1肿瘤的疫苗；针对肿瘤和自身免疫性疾病的针对PD-1的疫苗；XmAb-23104；抑制PD-1用于肿瘤学的反义寡核苷酸；AT-16201；抑制PD-1肿瘤学的双特异性单克隆抗体；IMM-1802；拮抗PD-1和CTLA-4的实体瘤和血液肿瘤单克隆抗体；尼伏鲁单抗生物仿制药；用于拮抗CD278和CD28并拮抗PD-1用于肿瘤学的重组蛋白；用于激动PD-1的自身免疫疾病和炎性疾病的重组蛋白；SNA-01；SSI-361；YBL-006；AK-103；JY-034；AUR-012；BGB-108；抑制PD-1，Gal-9和TIM-3的实体瘤药物；ENUM-244C8；ENUM-388D4；MEDI-0680；单克隆抗体，拮抗PD-1转移性黑色素瘤和转移性肺癌；抑制PD-1肿瘤学的单克隆抗体；针对肿瘤的靶向CTLA-4和PD-1的单克隆抗体；拮抗PD-1对NSCLC的单克隆抗体；抑制PD-1和TIM-3肿瘤的单克隆抗体；抑制PD-1肿瘤学的单克隆抗体；抑制PD-1和VEGF-A用于血液系统恶性肿瘤和实体瘤的重组蛋白；用于对抗PD-1肿瘤的小分子；Sym-016；inebilizumab+MEDI-0680；针对转移性黑色素瘤的针对PDL-1和IDO的疫苗；抗PD-1单克隆抗体+胶质母细胞瘤的细胞免疫疗法；拮抗PD-1用于肿瘤学的抗体；抑制PD-1/PD-L1的血液恶性肿瘤和细菌感染的单克隆抗体；抑制PD-1感染HIV的单克隆抗体；和/或抑制PD-1的实体瘤的小分子。
在某些实施例中，本公开的组合物与LAG3抑制剂例如LAG525，IMP321，IMP701、9H12、BMS-986016或其任何组合来组合使用。
在某些实施例中，本发明的组合物与CTLA4的抑制剂组合使用。在特定的实施例中，组合物与CTLA4特异性抗体或其结合片段组合使用，所述抗体或其结合片段例如ipilimumab、tremelimumab、CTLA4-Ig融合蛋白(例如，abatacept，belatacept)或其任何组合。
在某些实施例中，本发明的组合物与B7-H3特异性抗体或其结合片段，例如依诺单珠单抗(MGA271)、376.96或两者结合使用。B7-H4抗体结合片段可以是scFv或其融合蛋白，如例如Dangaj et al.,Cancer Res.73:4820,2013，以及美国专利No.9,574,000和PCT专利公开No.WO/201640724A1和WO 2013/025779A1所描述的。
在某些实施例中，本公开的组合物与CD244的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，本发明的组合物与BLTA，HVEM，CD160或其任何抑制剂的抑制剂组合使用。抗CD-160抗体描述于例如PCT公开号WO 2010/084158。
在某些实施例中，本发明的组合物与TIM3的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，本发明的组合物与Gal9的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，本公开内容的组合物与腺苷信号传导抑制剂，例如诱饵腺苷受体结合使用。
在某些实施例中，本发明的组合物与A2aR抑制剂组合使用。
在某些实施例中，本公开内容的组合物与KIR的抑制剂例如利立单抗(BMS-986015)组合使用。
在某些实施例中，本发明的组合物与抑制性细胞因子(通常是除TGFβ以外的细胞因子)或Treg发育或活性的抑制剂联合使用。
在某些实施例中，本公开内容的组合物与IDO抑制剂组合使用，例如，左-1-甲基色氨酸、依帕克司他(INCB024360；Liu et al.,Blood 115:3520-30,2010)、ebselen(Terentis et al.,Biochem.49:591-600,2010)、吲哚西莫德、NLG919(Mautino et al.,American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013；Apr 6-10,2013)、1-甲基色氨酸(1-MT)-tira-pazamine或其任何组合。
在某些实施例中，本公开的组合物与精氨酸酶抑制剂组合使用，例如N(omega)-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、N-omega-羟基-nor-L-精氨酸(nor-NOHA)、L-NOHA、2(S)-氨基-6-硼己酸(ABH)、S-(2-硼乙基)-L-半胱氨酸(BEC)或其任意组合。
在某些实施例中，本公开的组合物与VISTA的抑制剂例如CA-170(Curis，Lexington，Mass.)组合使用。
在某些实施例中，本公开内容的组合物与TIGIT抑制剂例如COM902(Compugen，多伦多，加拿大安大略省)，CD155抑制剂例如COM701(Compugen)结合使用，或两者一起结合使用。
在某些实施例中，本发明的组合物与PVRIG，PVRL2或两者的抑制剂组合使用。抗PVRIG抗体在例如PCT公开号No.WO 2016/134333中描述。抗PVRL2抗体在例如PCT公开No.WO2017/021526中描述。
在某些实施例中，本发明的组合物与LAIR1抑制剂组合使用。
在某些实施例中，本发明的组合物n与CEACAM-1，CEACAM-3，CEACAM-5或其任何组合的抑制剂组合使用。
在某些实施例中，本公开的组合物与增加刺激性免疫检查点分子的活性(即，是激动剂)的试剂组合使用。例如，组合物可以与CD137(4-1BB)激动剂(例如，urelumab)、CD134(OX-40)激动剂(例如，MEDI6469，MEDI6383或MEDI0562)、来那度胺、泊马利度胺、CD27激动剂(例如CDX-1127)、CD28激动剂(例如TGN1412，CD80或CD86)、CD40激动剂(例如CP-870,893，rhuCD40L或SGN-40)、CD122激动剂(例如IL-2)、GITR激动剂(例如PCT专利公开No.WO2016/054638中所述的人源化单克隆抗体)、ICOS(CD278)(例如GSK3359609、mAb 88.2、JTX-2011、Icos 145-1、Icos 314-8或其任何组合)的激动剂组合使用。在本文公开的任何实施例中，一种方法可以包括将本公开的组合物与一种或多种刺激性免疫检查点分子的激动剂一起施用，包括上述任何一种，单独或以任何组合。
在在某些实施例中，联合疗法包含本公开的组合物和包含以下一种或多种的二级疗法：对非炎症实体瘤表达的癌抗原特异的抗体或其抗原结合片段、放射治疗、手术、化学治疗剂、细胞因子、RNAi或其任何组合。
在某些实施例中，联合治疗方法包括给予本发明的组合物并进一步给予放射治疗或手术。放射疗法在本领域中是众所周知的，并且包括X射线疗法，例如γ射线疗法和放射性药物疗法。适用于治疗受试者中给定癌症的手术和外科技术是本领域普通技术人员众所周知的。
可用于促进免疫抗癌或抗肿瘤反应的细胞因子包括，例如，IFN-α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-24和GM-CSF单独或与本发明的组合物任意组合。在进一步的实施例中，如果在给予细胞因子之前至少向受试者给予Msln特异性组合物至少三或四次，则依次给予细胞因子。在某些实施例中，将细胞因子皮下施用。在一些实施例中，受试者可以已经或正在接受免疫抑制疗法，例如钙调神经磷酸酶抑制剂，皮质类固醇，微管抑制剂，低剂量的霉酚酸前药或其任何组合。在另外的实施例中，被治疗的受试者已经接受了非清髓性或造血性细胞移植，其中可以在所述非清髓性的造血细胞移植后至少2到至少3个月施用所述治疗。
在某些实施例中，联合治疗方法包括施用根据本发明的本发明的组合物和进一步施用化学治疗剂。化学治疗剂包括但不限于染色质功能抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、微管抑制药物、DNA损伤剂、抗代谢物(例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和糖修饰的类似物))、DNA合成抑制剂、DNA相互作用剂(例如嵌入剂)和DNA修复抑制剂。示例性化学治疗剂包括但不限于以下组：抗代谢物/抗癌剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶，氟尿苷，卡培他滨，吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物，叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤，硫鸟嘌呤，喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂(包括天然产物，例如长春花生物碱(长春碱，长春新碱和长春瑞滨))，微管干扰物(例如紫杉烷(紫杉醇，多西他赛))，长春新碱，长春花碱，诺考达唑，埃博霉素和萘维滨，表鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷)，DNA损伤剂(放线菌素，氨苯磺酸，蒽环类药物，博来霉素，白消安，喜树碱，卡铂，苯丁酸氮芥，顺铂，环磷酰胺，环磷酰胺，放线菌素，柔红霉素，阿霉素，表柔比星，六甲基三聚氰胺草胺甲氧嘧啶，草胺嘧啶，草甘膦，草甘膦，草甘膦，草甘膦，草甘膦，草甘膦，草甘膦，草甘膦，原草胺紫杉醇，泰索帝，替莫唑胺，替尼泊苷，三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素(如放线菌素(放线菌素D))，柔红霉素，阿霉素(阿霉素)，伊达比星，蒽环类，米托蒽醌，博来霉素，普卡霉素(线霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，全身性代谢L-天冬酰胺，使没有能力合成自己的天冬酰胺的细胞剥夺)；抗血小板药；抗增殖/抗有丝分裂的烷基化剂(例如氮芥子气(甲乙胺，环磷酰胺及其类似物，美法仑，苯丁酸氮芥))，乙炔亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替帕)，烷基磺酸盐-环丁硫烷，亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物，链脲佐菌素)、芴——达卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物，(例如叶酸类似物(甲氨蝶呤))；铂配位配合物(顺铂，卡铂)，丙卡巴嗪，羟基脲，米托坦，氨基谷氨酰胺；激素，激素类似物(雌激素，他莫昔芬，戈舍瑞林，比卡鲁胺，尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑，阿那曲唑)；抗凝剂(肝素，合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(例如组织纤溶酶原激活剂，链激酶和尿激酶)，阿司匹林，双嘧达莫，噻氯匹定，氯吡格雷，阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢霉素，他克莫司(FK-506)，西罗莫司(雷帕霉素)，硫唑嘌呤，霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(TNP470，染料木黄酮)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗，利妥昔单抗)；嵌合抗原受体；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂，拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、放线菌素、艾尼泊苷、表柔比星、依托泊苷、伊达比星、伊立替康(CPT-11)和米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基潘尼松龙、泼尼松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂、霍乱毒素、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素、百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶毒素或白喉毒素等毒素和半胱天冬酶激活剂；和染色质干扰物。
在一些实施例中，治疗还包括施用可以使用的基于T细胞的疫苗(参见，例如，PCT公开号No.WO 2017/192924，其中T细胞疫苗，免疫原性增强剂，转座子表达构建体和相关方法全文以引用方式并入本文)。在某些实施例中，疫苗组合物包含脂质体RNA制品(参见，例如，Kreiter,et al,Nature 520:692,2015，其制备和制作方法通过引用将其整体并入本文)。在某些实施例中，疫苗组合物用于制备肽脉冲的树突细胞或其他抗原呈递细胞，其可以离体，体外或体内进行。
本公开还提供了制备抗原脉冲的抗原呈递细胞的方法。在一些实施例中，所述方法包括在足以进行抗原呈递细胞进行抗原加工和呈递的条件和时间下进行体外接触，(i)与受试者免疫相容的抗原呈递细胞群，和(ii)如本文所述的多核苷酸，肽，免疫原性组合物和/或表达载体，从而获得能够引发如本文所述的对Msln肽的抗原特异性T细胞应答的抗原脉冲抗原呈递细胞。该方法可以进一步包括在一定条件下和一段时间内使抗原刺激的抗原呈递细胞与一个或多个免疫相容性T细胞接触，所述时间足以产生Msln特异性T细胞。
在某些实施例中，该方法进一步包括用包含如此确定的编码结合蛋白的核酸序列的多核苷酸在体外或离体转染或转导免疫细胞群，从而获得工程化的Msln特异性免疫群细胞，任选以当将细胞施用于受试者时有效地过继转移或赋予针对Msln抗原的抗原特异性T细胞应答的量。
在一些实施例中，可以如Ho等人所述制备免疫细胞系。(参见2006J ImmunolMethods 310(1-2):40-52))。例如，树突细胞(DC)可以通过在补充有GM-CSF(800U/ml)和IL-4(1000U/ml)的DC培养基中培养两天(第-2至0天)从PBMC的塑料粘附部分(GELLGENIXTM，弗莱堡，德国)。在第-1天，可以添加成熟细胞因子TNFα(1100U/ml)，IL-1β(2000U/ml)，IL-6(1000U/ml)和PGE2(1μg/ml)。在第0天，可以在无血清DC培养基中在2到4个小时内收获DC，洗涤DC，并用肽(10μg/ml的单个肽或2μg/ml的肽库)脉冲处理。可以使用抗CD8微珠(MILTENYI BIOTECTM，Auburn，Calif)从PBMC中分离CD8 T细胞，并在存在IL-21(30ng/ml)的情况下以1:5至1:10的效应靶(E:T)比率用DC刺激CD8 T细胞。在第3天，可以添加IL-2(12.5U/ml)、IL-7(5ng/ml)和IL-15(5ng/ml)。在受到IL-21肽脉冲作用2小时后，可以使用辐射的自体PBMC的塑性粘附部分作为抗原呈递细胞(APC)对细胞进行第10天到第14天的再刺激。重新刺激后，可从第1天开始向细胞补充IL-2(25U/ml)，IL-7(5ng/ml)和IL-15(5ng/ml)。T细胞克隆可通过以有限稀释度铺板细胞并用涂有OKT3(ORTHOBIOTECHTM，Bridgewater，NJ)的TM-LCL和所描述的作为饲养细胞(REP方案)的同种异体PBMC扩增而产生(参见Ho等，2006J Immunol Methods 310(1-2):40-52)。
除其他实施例外，本公开提供以下实施例。
在一实施例中，存在一种结合蛋白，其包含T细胞受体(TCR)α链可变域(Vα)和TCRβ链可变域(Vβ)，其中：(a)所述Vα包含CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:39或37所示，并且Vβ任选地包含与SEQ ID NO:101或99所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；(b)Vβ包含SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:38所示的CDR3氨基酸序列，并且Vα任选地包含与SEQ IDNO:102或100所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；和/或(c)Vα包含SEQID NO:39或37所示的CDR3氨基酸序列，并且Vβ包含SEQ ID NO:40或38所示的CDR3氨基酸序列，其中结合蛋白为能够特异性结合间皮素(Msln)肽:HLA复合物。在一实施例中，(i)如本文公开的结合蛋白的(a)，(b)和/或(c)的Vα包含与SEQ ID NO:102或100所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，条件是至少三个或四个CDR没有序列变化，其中具有序列变化的CDR仅具有最多两个氨基酸取代，最多连续五个氨基酸缺失，或其组合；和/或(ii)如本文公开的结合蛋白的(a)，(b)和/或(c)的Vβ包含与SEQ ID NO:101或99所示氨基酸序列中所述氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，条件是至少三个或四个CDR的序列没有变化，其中确实具有序列变化的CDR仅具有最多两个氨基酸取代，最多连续五个氨基酸缺失，或其组合。此外，关于一实施例的结合蛋白可包含：(a)SEQ ID NO:93所示的CDR1α氨基酸序列；(b)SEQ ID NO:94所示的CDR2α氨基酸序列；(c)SEQ ID NO:39所示的CDR3α氨基酸序列；(d)SEQ ID NO:83所示的CDR1β氨基酸序列，可选地如SEQ ID NO:84所示，进一步可选地如SEQ ID NO:91所示；(e)SEQ ID NO:92所示的CDR2β氨基酸序列；(f)SEQ ID NO:40所示的CDR3β氨基酸序列。更进一步，关于一实施例的结合蛋白可包含与由以下各项编码的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列：(a)TRBJ2-3*01；和(b)TRAV21*01或TRAV21*02；(c)TRBV5-4*01；(d)TRAJ57*01；和/或(e)TRBD1*01或TRBD2*02。更进一步，关于一实施例的结合蛋白可以包含Vα，其包含与SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，以及Vβ，其包含与SEQ ID NO:101所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，实施例可以包含结合蛋白，其中Vα包含或由SEQID NO:102所示的氨基酸序列组成，并且其中Vβ包含或由SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列组成。更进一步，在一实施例的结合蛋白可包含TCRα链(TCRα)和TCRβ链(TCRβ)，其中TCRα包含与SEQ ID NO:110或29氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成的氨基酸序列，和/或其中TCRβ包含与SEQ ID NO:109或28中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成的氨基酸序列。一些实施例可包含结合蛋白，其中TCRα包含或由SEQ ID NO:110或29所示的氨基酸序列组成，并且其中TCRβ包含或由SEQ ID NO:109或28所示的氨基酸序列组成。在进一步的实施例中，结合蛋白包含：(a)如SEQ ID NO:89所示的CDR1α氨基酸序列；和(b)如SEQ ID NO:90所示的CDR2α氨基酸序列；(c)SEQ ID NO:37所示的CDR3α氨基酸序列；(d)SEQ ID NO:83所示的CDR1β氨基酸序列，任选地如SEQ ID NO:87所示；(e)SEQ ID NO:88所示的CDR2β氨基酸序列；(f)SEQ ID NO:38所示的CDR3β氨基酸序列。在一实施例中，结合蛋白可包含与由以下各项编码的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列：(a)TRBJ1-1*01或TRBJ2-3*01；(b)TRAV4-1*01；(c)TRAJ18*01；和/或(d)TRBD1*01或TRBD2*02。在一实施例中，结合蛋白可包含Vα，其包含与SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，并且Vβ包含具有与SEQ ID NO:99所示氨基酸序列至少约85％同一性的氨基酸序列。在一实施例中，结合蛋白可包含Vα，其包含或由SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列组成，并且其中Vβ包含或由SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列组成。在一些实施例中，结合蛋白包含TCRα链(TCRα)和TCRβ链(TCRβ)，其中TCRα包含与SEQ ID NO:108或23所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成，和/或其中TCRβ包含与SEQ ID NO:107或22所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，结合蛋白包含SEQ ID NO:108或23所示的氨基酸序列或由其组成，并且其中TCRβ包含SEQ ID NO:107或22所示的氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，所述结合蛋白包含能够特异性结合SEQ ID NO:32：人白细胞抗原(HLA)复合物的结合蛋白，并且在一些这样的情况下，所述HLA包含HLA-A*201。在一些实施例中，SEQ IDNO:32的残基3、5、6或9中的任一个或多个的丙氨酸诱变不会消除或基本不削弱结合蛋白与Msln肽:HLA复合物的结合。在一些实施例中，结合蛋白能够结合肽:HLA复合物，其中该肽包含SEQ ID NO:61所示的共有氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，SEQ ID NO:32的残基1、5或9中的任一个或多个的丙氨酸诱变不会消除或基本不削弱结合蛋白与Msln肽:HLA复合物的结合。在一些实施例中，结合蛋白能够结合肽：HLA复合物，其中该肽包含SEQ IDNO:62所示的共有氨基酸序列或由其组成。在一些实施例中，结合蛋白不结合或不特异性结合肽:HLA复合物，其中该肽包含SEQ ID NO:63-77中的任何一个或多个所示的氨基酸序列或由其组成，并且其中HLA任选地为HLA-A:02*01。
在一实施例中，结合蛋白包含T细胞受体(TCR)α-链可变域(Vα)和TCRβ-链可变域(Vβ)，其中：(a)Vα包含SEQ ID NO所示的CDR3氨基酸序列:33或35，并且Vβ任选地包含与SEQID NO:95或97中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；(b)Vβ包含SEQID NO:34或36所示的CDR3氨基酸序列，并且Vα任选地包含与SEQ ID NO:96或98所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；和/或(c)Vα包含SEQ ID NO:33或35所示的CDR3氨基酸序列，并且Vβ包含SEQ ID NO:40或38所示的CDR3氨基酸序列，其中结合蛋白能够特异性结合间皮素(Msln)肽:HLA复合物。在一实施例中，(i)(a)，(b)和/或(c)的Vα包含与SEQ ID NO:96或98所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，条件是至少三个或四个CDR没有序列变化，其中具有序列变化的CDR仅具有最多两个氨基酸取代，最多连续的五个氨基酸缺失或其组合；和/或(ii)(a)，(b)和/或(c)的Vβ包含与SEQ ID NO:95或97所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，条件是，至少三个或四个CDR的序列没有变化，其中具有序列变化的CDR仅具有最多两个氨基酸取代，最多连续五个氨基酸缺失或它们的组合。在一实施例中，结合蛋白包含：(a)SEQ ID NO:80所示的CDR1α氨基酸序列；(b)SEQ ID NO:81或118所示的CDR2α氨基酸序列；(c)SEQ ID NO:33所示的CDR3α氨基酸序列；(d)SEQ ID NO:83所示，任选地如SEQ ID NO:84所示，进一步任选地如SEQ ID NO:78所示的CDR1β氨基酸序列；(e)SEQ ID NO:79所示的CDR2β氨基酸序列；(f)SEQ ID NO:34所示的CDR3β氨基酸序列。在一实施例中，结合蛋白包含与由以下各项编码的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列：(a)TRBJ2-7*01或TRBJ2-3*01；(b)TRAV1-1*01；(c)TRBV12-4*01；(d)TRAJ3*01；和/或(e)TRBD1*01或TRBD2*02。在一实施例中，结合蛋白包含：Vα，其包含与SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列具有至少约85％的同一性的氨基酸序列；以及Vβ，其包含与SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列具有85％的同一性具有至少约35％的氨基酸序列的氨基酸序列。在一实施例中，结合蛋白包含Vα，其包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列或由其组成，和Vβ，其包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列或由其组成。在一实施例中，结合蛋白包含TCRα链(TCRα)和TCRβ链(TCRβ)，其中TCRα包含与SEQ ID NO:104或7所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成，和/或其中TCRβ包含与SEQ ID NO:103或6所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一实施例中，结合蛋白包含TCRα，其包含SEQ ID NO:104或7所示的氨基酸序列组成或由其组成，并且其中TCRβ包含SEQ ID NO:103或106所示的氨基酸序列或由其组成。在一实施例中，结合蛋白包含：(a)SEQ ID NO:85所示的CDR1α氨基酸序列；和(b)SEQ ID NO:86或119所示的CDR2α氨基酸序列；(c)SEQ ID NO:35所示的CDR3α氨基酸序列；(d)SEQ ID NO:83所示的CDR1β氨基酸序列，可选地如SEQ ID NO:84所示，进一步可选地如SEQ ID NO:82所示；(e)SEQ IDNO:79所示的CDR2β氨基酸序列；(f)SEQ ID NO:36所示的CDR3β氨基酸序列。在一实施例中，结合蛋白包含与由以下各项编码的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列：(a)TRBJ2-3*01；(b)TRAV12-3*01；(c)TRBV12-3*01；(d)TRAJ29*01；和/或(e)TRBD1*01或TRBD2*02。在一实施例中，结合蛋白包含：Vα，其包含与SEQ ID NO:98所示氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；以及Vβ，其包含与SEQ ID NO:97所示氨基酸序列具有至少约％85同一性的氨基酸序列。在一实施例中，结合蛋白包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列或由其组成的Vα，以及包含或组成为SEQ ID NO:97的氨基酸序列的Vβ。在一实施例中，结合蛋白包含TCRα链(TCRα)和TCRβ链(TCRβ)，其中TCRα包含与SEQ ID NO:106或15所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成，和/或其中TCRβ包含与SEQ IDNO:105或14所示的氨基酸序列具有至少约85％的同一性的氨基酸序列或由其组成。在一实施例中，结合蛋白包含TCRα，其包含或由SEQ ID NO:106或15所示的氨基酸序列组成；和TCRβ，其包含或由SEQ ID NO:105或14所示的氨基酸序列组成。在一实施例中，结合蛋白能够特异性结合SEQ ID NO:31:人白细胞抗原(HLA)复合物，并且其中所述HLA任选地是HLA-A*201。在一实施例中，结合蛋白是或包含TCR，其中TCR任选地是可溶的，TCR，scTCR或CAR的抗原结合片段。在一实施例中，结合蛋白是人的，人源化的或嵌合的。在一实施例中，在不存在或不依赖于CD8的情况下，结合蛋白能够结合间皮素:HLA复合物。
在一实施例中，结合蛋白具有约9μM、约8μM、约7μM、约6μM、约5μM、约4μM、约3μM、约2μM、约1μM、约0.9μM、约0.8μM、约0.7μM、约0.6μM、约0.5μM、约0.4μM、约0.3μM、约0.2μM或更小的Msln肽EC50。
在一实施例中，提供了一种组合物，其包含本文所述的结合蛋白和药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。
在一实施例中，多核苷酸编码本文所述的结合蛋白。在一些实施例中，对多核苷酸进行密码子优化以在宿主细胞中表达，其中所述宿主细胞任选地是人免疫系统细胞，优选T细胞。同样，在一些实施例中，多核苷酸与SEQ ID NO:1-4、9-12、17-20、25和26中任一项所示的多核苷酸序列具有至少约50％的同一性。所述多核苷酸包含分别与以下所示的多核苷酸序列具有至少约50％同一性的编码TCRα链的多核苷酸和编码TCRβ链的多核苷酸：SEQ IDNO:(i)1和3，分别地；(ii)2和4，分别地；(iii)分别为9和11，分别地；(iv)分别为10和12，分别地；(v)17和19，分别地；(vi)18和20，分别地；或(vii)25和26，分别地。在一些实施例中，多核苷酸包含编码位于TCRβ链编码多核苷酸和TCRα链编码多核苷酸之间的自切割肽的多核苷酸。在一些实施例中，编码的多肽包含如SEQ ID NO:8、16、24和30中任一项所述的氨基酸序列。在一些实施例中，编码结合蛋白的多核苷酸与SEQ ID NO:5、13、21、27和120中任一项所述的多核苷酸序列具有至少约50％的同一性。在特定实施例中，编码结合蛋白的多核苷酸包含或由SEQ ID NO:120所示的多核苷酸序列组成。
在一些实施例中，提供了表达载体，其包含可操作地连接至表达控制序列的本文所述的多核苷酸。在一些实施例中，表达载体能够将多核苷酸递送至宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞是造血祖细胞或人免疫系统细胞。在一些实施例中，免疫系统细胞是CD4+T细胞，CD8+T细胞，CD4-CD8-双重阴性T细胞，γδT细胞，天然杀伤细胞，天然杀伤T细胞，巨噬细胞，树突状细胞，或其任何组合。在一些实施例中，免疫系统细胞是幼稚T细胞，中央记忆T细胞，干细胞记忆T细胞，效应记忆T细胞或其任何组合。在一些实施例中，表达载体是病毒载体。在一些实施例中，病毒载体是慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
在一实施例中，重组宿主细胞包含编码如本文所述的结合蛋白和/或如本文所述的表达载体的异源多核苷酸，其中所述重组宿主细胞能够在其细胞表面表达编码的结合蛋白。在一些实施例中，重组宿主细胞是造血祖细胞或人免疫系统细胞。在一些实施例中，重组宿主细胞是CD4+T细胞，CD8+T细胞，CD4-CD8-双阴性T细胞，γδT细胞，天然杀伤细胞，天然杀伤T细胞，巨噬细胞，树突状细胞，或其任何组合。在一些实施例中，重组宿主细胞是T细胞。在一些实施例中，重组宿主细胞是幼稚T细胞，中央记忆T细胞，干细胞记忆T细胞，效应记忆T细胞或其任何组合。在一些实施例中，重组宿主细胞是编码内源TCR的T细胞或NK-T细胞，并且其中，与内源性TCR相比，异源多核苷酸编码的间皮素特异性结合蛋白与CD3蛋白相比能够更有效地与CD3蛋白缔合。在一些实施例中，当宿主细胞在被编码的结合蛋白结合的Msln肽的存在下，Nur77表达在重组宿主细胞中增加，其浓度为约10-2μM肽，约10-1μM肽，约1μM肽或约101μM肽，其中该肽任选地通过抗原呈递细胞呈递给宿主细胞。在一些实施例中，重组宿主细胞是这样的重组宿主细胞，其中当与表达以下的细胞接触时，该重组宿主细胞不产生IFN-γ和/或不表现出活化和/或细胞毒性活性：(i)HLA-C6:02:01；(ii)没有HLA-B13:02:01的HLA-B13:01:01；(iii)HLA-A3；(iv)HLA-A29；(v)HLA-B40；(vi)HLA-B44；(vii)HLA-C3；(viii)HLA-C16；(ix)HLA-A1；(x)HLA-24；(xi)HLA-B7；(xii)HLA-B57；(xiii)HLA-C7；(xiv)HLA-A11；(xv)HLA-B15；(xvi)HLA-C4；(xvii)HLA-C12；(xviii)HLA-B8；(xix)HLA-B49；(xx)HLA-B51；(xxi)HLA-C15；(xxii)HLA-A30；(xxiii)HLA-A68；(xxiv)HLA-C2；(xxv)HLA-A32；(xxvi)HLA-A33；(xxvii)HLA-B55；(xxviii)HLA-C1；(xxvix)HLA-C5；(xxix)HLA-B8；(xxx)HLA-B35；或(xxxi)(i)-(xxx)的任何组合，条件是不存在被编码的结合蛋白结合的间皮素肽。在一些实施例中，重组宿主细胞包含编码内源TCR的T细胞或NK-T细胞，其中与内源TCR相比，由异源多核苷酸编码的结合蛋白具有更高的细胞表面表达。
在一实施例中，提供了一种细胞组合物，其包含本文所述的重组宿主细胞和药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂。
在一实施例中，提供了包含有效量的本文所述的重组宿主细胞或细胞组合物的单位剂量。
在一实施例中，提供了一种在受试者中治疗与间皮素表达和/或活性相关的疾病或病症的方法，其中该方法包括：对受试者施用有效量的本文所述的结合蛋白，重组体本文所述的宿主细胞，本文所述的组合物或本文所述的单位剂量。在一实施例中，该方法包括在受试者中治疗与间皮素表达和/或活性相关的疾病或病症的方法，其中该疾病或病症是过度增生性疾病或增生性疾病。在一实施例中，该方法包括在受试者中治疗与间皮素表达和/或活性相关的疾病或病症的方法，其中该疾病或病症是癌症，并且任选地，该癌症是实体癌或血液系统恶性肿瘤。在一实施例中，该方法包括在受试者中治疗与间皮素表达和/或活性相关的疾病或病症的方法，其中该疾病或病症是胆道癌、膀胱癌、骨和软组织癌、脑瘤、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、结直肠腺癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、胚胎癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、头颈鳞状细胞癌、肝癌、肺癌癌症、间皮瘤、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、原发性星形细胞肿瘤、原发性甲状腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、尿路上皮癌、子宫肉瘤或子宫癌。在一实施例中，该方法包括在受试者中治疗与间皮素表达和/或活性相关的疾病或病症的方法，其中该疾病或病症是胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、间皮瘤或肺癌。在一实施例中，肠胃外或静脉内施用结合蛋白，宿主细胞，组合物或单位剂量。在一实施例中，该方法包括向受试者施用多剂量的结合蛋白，宿主细胞，组合物或单位剂量，并且任选地，在约两周至约四周的施用间隔内施用多剂量。在一实施例中，方法进一步包括向受试者施用细胞因子。在一实施例中，该方法包括施用IL-2，IL-15，IL-21或其任何组合。在一个实施方案中，该方法包括进一步接受或已经接受免疫检查点抑制剂、刺激性免疫检查点试剂的激动剂、放射疗法、抗体、抗体-药物偶联物、Fc融合蛋白、反义核苷酸疗法、基因疗法、疫苗、手术、化学疗法或其任何组合。
在一实施例中，本文所述的结合蛋白，本文所述的组合物，本文所述的多核苷酸，本文所述的表达载体，本文所述的重组宿主细胞，本文所述的细胞组成或本文所述的单位剂量是用于治疗以间皮素表达和/或活性为特征的疾病或病症。
在一实施例中，本文所述的结合蛋白，本文所述的组合物，本文所述的多核苷酸，本文所述的表达载体，本文所述的重组宿主细胞，本文所述的细胞组成或本文所述的单位剂量是用于以间皮素表达和/或活性为特征的疾病或病症的过继免疫疗法中。
在一实施例中，本文所述的结合蛋白，本文所述的组合物，本文所述的多核苷酸，本文所述的表达载体，本文所述的重组宿主细胞，本文所述的细胞组成或本文所述的单位剂量是用于制造用于治疗以间皮素表达和/或活性为特征的疾病或病症的药物。
在一实施例中，用于本文所述的结合蛋白，组合物，多核苷酸，表达载体，重组宿主细胞，细胞组合物或单位剂量，其中以间皮素表达和/或活性为特征的疾病或病症是间皮瘤，胰腺癌，卵巢癌，肺癌，其中Msln20-28肽在癌症的肿瘤细胞上表达的癌症或其中Msln530-538肽在癌症的肿瘤细胞上表达的癌症。
在一实施例中，用于本文所述的结合蛋白，组合物，多核苷酸，表达载体，重组宿主细胞，细胞组成或单位剂量，其中以间皮素表达和/或活性为特征的疾病或病症是胰腺癌，卵巢癌，乳腺癌，胃癌，大肠癌，间皮瘤或肺癌。
在一实施例中，提供了分离的多核苷酸，其编码能够特异性结合SEQ ID NO:32:HLA-A:02*01复合物的结合蛋白，其中多核苷酸包含或由SEQ ID NO:120多核苷酸序列组成。在一实施例中，提供了表达载体，其包含编码能够与SEQ ID NO:32:HLA-A:02*01复合物特异性结合的结合蛋白的多核苷酸，其中多核苷酸包含或由多核苷酸序列组成可操作地连接至表达控制序列的SEQ ID NO:120中所示的序列。在这样的实施例中，表达载体能够将多核苷酸递送至宿主细胞。在这样的实施例中，宿主细胞是造血祖细胞或人免疫系统细胞。在这样的实施例中，表达载体免疫系统细胞是CD4+T细胞，CD8+T细胞，CD4-CD8-双阴性T细胞，γδT细胞，天然杀伤细胞，天然杀伤T细胞，巨噬细胞，树突状细胞或其任何组合。在这样的实施例中，表达载体免疫系统细胞是幼稚T细胞，中央记忆T细胞，干细胞记忆T细胞，效应记忆T细胞或其任何组合。根据权利要求86-90中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。在这样的实施方案中，表达载体是病毒载体，其是慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
在一实施例中，是一种重组宿主细胞，其包含本文所述的多核苷酸和/或本文所述的表达载体，其中所述重组宿主细胞能够在其细胞表面表达编码的结合蛋白。在这样的实施例中，重组宿主细胞是造血祖细胞或人免疫系统细胞。在这样的实施例中，重组宿主细胞是免疫系统细胞，是CD4+T细胞，CD8+T细胞，CD4-CD8-双阴性T细胞，γδT细胞，天然杀伤细胞，天然杀伤T细胞，巨噬细胞，树突状细胞或其任何组合。在这样的实施例中，重组宿主细胞是T细胞。在这样的实施例中，重组宿主细胞是幼稚T细胞，中央记忆T细胞，干细胞记忆T细胞，效应记忆T细胞或其任何组合。
示例
实施例1
针对MSLN20或MSLN530的TCR的标识和选择。
对Msln20或Msln530具有特异性的示例性TCR克隆在图1至图4中示出。分别参照图1A和1B，将本文提出的基于下一代测序(NGS)的TCR分离方法中每种TCR克隆型的富集得分与T细胞频率进行比较。y轴上的富集得分与与肽：HLA四聚体的结合程度相关。合成所有TCR，并在报告T细胞和原代CD8+PBMC中表达时测试其功能。当转移到受体CD8+T细胞中时，具有最高功能亲和力的TCR被圈起来。这些数据表明，被鉴定为具有最高功能活性的TCRs没有最高的四聚体结合程度，并且在肽扩增的T细胞群体中很少见。不受理论的束缚，这可能部分归因于这些高度狂热的克隆型的TCR表面表达降低。合成和评估了100多个TCR构建体(Msln20＝合成了60个TCR；Msln530＝合成了42个TCR)。从18个供体产生间皮素特异性T细胞系。细胞用滴定浓度的四聚体染色，分选并通过单细胞TCR测序进行分析(总共约8个分选实验)。
实施例2
通过MSLN530 TCR进行四聚物结合
Msln530特异性的TCR编码构建体被慢病毒转导至缺少内源性TCRα/β链的CD8-Jurkat T细胞(Jurkat76–深灰色图)或Jurkat76细胞被转导以表达CD8αβ(Jurkat76-CD8αβ–浅灰色图)(参见图2)。在没有TCRα/β链的情况下，CD3不能在细胞表面表达。因此，CD3表达是这些细胞中TCR表面表达的替代物，从而允许相对于TCR表面表达评估四聚体结合。在图2中，TCR以相对于CD3表达的四聚体结合的顺序出现，并且指示线以上的TCR被认为是CD8非依赖性的，具有高亲和力的特征。
实施例3
抗原特异性T细胞反应的评估
使用具有tdTomato转基因敲入Nur77基因座的报告子Jurkat T细胞系，评估表现出最高水平的四聚体结合的四个TCR的抗原特异性功能。用滴定浓度的肽对T2靶细胞进行脉冲处理，并评估表达TCR的T细胞的tdTomato表达，如图3A2所示。将在每种肽浓度下检测到的tdTomato阳性细胞的百分比作图，并通过非线性回归拟合到剂量-反应曲线(图3B)。绘制每个TCR的计算出的EC50，并且将TCR B11(在本文中也称为11B)识别为最平均的TCR(参见图3B和3C中的箭头)。发现具有最高四聚体结合水平的两个TCR(A16和A3，分别也称为16A和3A)具有较低的抗原敏感性，并且在图3B中也由箭头指示。
实施例4
MSLN530专用TCR的功能评估
由于功能与前四种四聚体结合剂的四聚体结合无关，因此评估所有选定的Msln530特异性TCR对tdTomato的表达，以响应较低浓度的肽(0.1μm)作为抗原敏感性的替代(见图4)发现在较低水平上结合四聚体的两个TCR(B9和A11)响应抗原而介导高水平的tdTomato表达。来自这些和其他TCR的数据在图4的框中示出；这些已包括在TCR集中以供进一步研究。尽管四聚体结合率较低，但包括B9和A11在内的几种TCR仍具有较高的抗原特异性活性。在图4中，TCR以四聚体结合的等级顺序给出。
实施例5
所选TCR的功能评估
参考图5A-5C，从供体PBMC中纯化CD8+T细胞，并用对Msln530或Msln20具有特异性的TCR慢病毒转导(通过与实施例3和4中所述类似的方法选择)。8天后，将四聚体细胞分选并进一步扩增8-10天。转导的T细胞用四聚体和CD8染色，以确认纯度和均匀的高水平CD8表达。
如图6A-6C，将Msln20(A)或Msln530(B)特异的TCR转导的效应CD8+T细胞与肽脉冲的T2目标细胞孵育，并通过流式细胞术分析细胞内IFN-γ评估剂量依赖性IFN-γ的产生(效应细胞＝TCR转导的原代CD8+T细胞(已分选)；靶标＝肽脉冲的T2细胞)。将在每种肽浓度下检测到的IFN-γ阳性细胞的百分比作图，并通过非线性回归拟合到剂量反应曲线。绘制了每个TCR的计算得出的EC50。在图6C中，用箭头指示针对每个表位(分别为“20-B3”和“530-B11”)的最亲和的TCR。
实施例6
通过TCR转化的CD8+T细胞杀死肿瘤细胞
两种表达Msln的肿瘤细胞系，MDA-MB-231和MDA-MB-468，通过分选纯化的Msln特异性TCR转导的CD8+T细胞的滴定比使用铬释放测定法测量特异性肿瘤细胞裂解(参见图7A-7C)。TCR Msln530-B11的结果，即鉴定的最高亲和力TCR，用箭头表示。
实施例7
丙氨酸扫描MSLN20和MSLN530肽的表观分析
图8描述表位分析测定法，其中Mlsn靶标肽序列的每个连续氨基酸被丙氨酸替代，并且TCR转导的T细胞与用变体肽脉冲的HLA-A2+靶标细胞一起温育。在图的底部显示了由Msln20特异性TCR响应每种变体肽而产生的IFN-γ的代表性数据。
丙氨酸扫描测定的结果，显示了对于四个测试的TCR中的每一个，响应于每个丙氨酸取代的肽的IFN-γ+T细胞的百分比，如图9A-9D所示。必需残基由一个字母的氨基酸代码标识，非必需残基由X表示。
实施例8
蛋白质组中MSLN530的表位同源性分析
使用ScanProsite工具，通过在人蛋白质组中搜索每个指示的Msln530-特异性TCR(A11和B11)的指示的共有表位基序，鉴定了预计与Msln-特异性TCR具有潜在的交叉反应性的人肽，如10图所示。使用三种不同的预测算法对所得肽的HLA-A2结合进行了分析：SITHPATHI，PanMHCnet和IEDB。每种方法的建议临界值在算法名称旁边的括号中列出。潜在的交叉反应肽如图所示，并合成后用于进一步分析。
实施例9
蛋白质组中具有潜在同源性的合成肽对MSLN530的分析
T2靶细胞用具有与Msln530-A11和-B11 TCR交叉反应的潜力的肽进行脉冲处理，并与被转导以表达这些TCR并进行纯度分选的T细胞一起孵育。(参见图11A-11B；效应T细胞＝四聚体分选的TCR转导的CD8+T细胞；靶细胞＝用10μM肽脉冲的T2细胞)。为了检测潜在的反应性，使用了大剂量的肽(10μM)。Msln530-11A和Msln530-11B的IFN-γ阳性TCR转导的T细胞的百分比显示在图11A中。图的右侧显示了10μM野生型Msln530肽的响应以及非特异性T细胞活化混合物获得的最大响应。只有一种肽(#10)在10μM肽下引起了TCR Msln530-11B转导的T细胞的低水平(<20％)应答。图11B显示了Msln530-11B转导的T细胞对Msln530肽的反应性与几种潜在的交叉反应肽(包括肽#10)的剂量-反应曲线，以确定在生理水平的反应性。通过非线性回归将百分比的IFN-γ+数据拟合到剂量反应曲线，并计算EC50值并显示在图表下方。这些数据表明，肽#10的Msln530-11B EC50比Msln530高3000倍以上。因此，Msln530-11B对Msln530的特异性比对10号肽更大。
实施例10
通过定位不同的供体来源的LCL进行同化反应性分析
为了确定表达Msln20-3B或Msln530-11A或-11B的T细胞的潜在同种异体反应性，将TCR转导的T细胞与天然表达不同HLA等位基因的同种异体LCL一起培养，包括许多更常见的等位基因。LCL线和相应的HLA等位基因表达在图12A的表中列出。对于每个细胞系(图12B-12I)，当T细胞和LCL细胞在添加的Msln530肽存在或不存在的情况下共培养时，显示了IFN-γ表达的百分比(当LCL细胞系缺乏HLA-A2表达时，由转导的T细胞呈递)。
不同的LCL细胞系对T细胞的靶向性的进一步分析显示在图13A-13H中。为了确定表达Msln20-3B或Msln530-11A或-11B的T细胞的潜在同种异体反应性，将TCR转导的T细胞与自然表达多种HLA等位基因(包括许多更常见等位基因)的同种异体LCL一起培养。LCL线和相应的HLA等位基因表达在图13A的表中列出。对于每个细胞系，在存在或不存在添加的Msln530肽的情况下共培养靶细胞和效应细胞后，显示了IFN-γ表达百分比(当LCL细胞系缺乏HLA-A2表达时，由转导的T细胞呈递)。第二组LCL包含数个表达HLA-C6和HLA-B13的品系，它们表现出连锁不平衡并且通常一起发现。这些LCL中的几个引发了Msln530-11B转导的T细胞的应答。这些数据表明，HLA-B13:02:01是等位反应等位基因，因为只有表达HLA-B13:02:01的细胞才引起应答，而表达HLA-C6:02:01或HLA-B13:01:01的细胞如果没有HLA-B13:02:01，则不会引发响应。
表1显示了在不同人群中HLA-B13:02:01和HLA-A2:01:01共表达的频率。检测到一些特定于HLA-B13:02:01的同种异体反应。但是，鉴于群体中单倍型的频率很小，患者出现交叉反应的等位基因是罕见的事件。
表1：HLA A2：01/B13：02单倍型频率
欧美人 0.845％(B13:02) (29.6％A2:01)
非洲裔美国人 0.177％(B13:02) (12.5％A2:01)
亚洲人和太平洋岛民 0.110％(B13:02) (9.5％A2:01)
西班牙裔美国人 0.129％(B13:02) (19.4％A2:01)
可以将上述各种实施例组合以提供其他实施例。本规范中提及和/或在应用数据表中所示的所有美国专利，美国专利申请出版物，美国专利申请，外国专利，外国专利申请和非专利出版物，包括于2018年11月9日提交的美国临时专利申请号62/758,397，通过引用整体并入本文。如果需要采用各种专利，申请和出版物的概念以提供其他实施例，则可以修改实施例的各方面。
可以根据以上详细描述对实施例进行这些和其他改变。通常，在以下根据权利要求书中，所使用的术语不应解释为将根据权利要求书限制为说明书和根据权利要求书中公开的特定实施例，而应解释为包括所有可能的实施例以及等同物的根据权利要求的全部范围。因此，根据权利要求不受公开内容的限制。
序列表
<110> 弗雷德哈钦森癌症研究中心
朱诺治疗学股份有限公司
T·M·施米特
A·G·沙皮伊
P·D·格林伯格
<120> 间皮素特异性T细胞受体及其在免疫治疗中的应用
<130> 360056.475WO
<140> PCT
<141> 2019-11-08
<150> US 62/758,397
<151> 2018-11-09
<160> 123
<170> 用于Windows Version 4.0的FastSEQ
<210> 1
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B WT- TCR β
<400> 1
atgggctcct ggaccctctg ctgtgtgtcc ctttgcatcc tggtagcaaa gcacacagat 60
gctggagtta tccagtcacc ccggcacgag gtgacagaga tgggacaaga agtgactctg 120
agatgtaaac caatttcagg acacgactac cttttctggt acagacagac catgatgcgg 180
ggactggagt tgctcattta ctttaacaac aacgttccga tagatgattc agggatgccc 240
gaggatcgat tctcagctaa gatgcctaat gcatcattct ccactctgaa gatccagccc 300
tcagaaccca gggactcagc tgtgtacttc tgtgccagca gttttactag cgggagctac 360
gagcagtact tcgggccggg caccaggctc acggtcacag aggacctgaa aaacgtgttc 420
ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc 480
acactggtgt gcctggccac aggcttctac cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg 540
aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc agcccctcaa ggagcagccc 600
gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga gggtctcggc caccttctgg 660
cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac 720
gagtggaccc aggatagggc caaacctgtc acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt 780
agagcagact gtggcttcac ctccgagtct taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc 840
ctctatgaga tcttgctagg gaaggccacc ttgtatgccg tgctggtcag tgccctcgtg 900
ctgatggcca tggtcaagag aaaggattcc agaggctag 939
<210> 2
<211> 950
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B 密码子优化 -TCR
β
<400> 2
ggcgcgccac catgggaagc tggacactgt gttgcgttag cctgtgtatc ctggtggcca 60
aacacacaga tgctggagtg attcagagcc ctagacacga ggtgacagag atgggacagg 120
aagtgacact gagatgtaag cccattagcg gacacgacta cctgttctgg tacaggcaga 180
ccatgatgag aggactggaa ctgctgatct acttcaacaa caacgtgccc atcgacgata 240
gcggcatgcc tgaggacaga tttagcgcca agatgcctaa tgccagcttt tctaccctga 300
agatccagcc ctctgagccc agagattctg ccgtgtactt ttgtgccagc agctttacat 360
ctggctctta tgagcagtac ttcggcccag gcacaaggct gacagtgaca gaggacctga 420
agaacgtgtt ccccccagag gtggccgtgt tcgagcctag cgaggccgag atcagccaca 480
cccagaaagc caccctcgtg tgcctggcca ccggctttta ccccgaccac gtggaactgt 540
cttggtgggt caacggcaaa gaggtgcaca gcggcgtctg caccgacccc cagcccctga 600
aagagcagcc cgccctgaac gacagccggt actgtctgag cagcagactg agagtgtccg 660
ccaccttctg gcagaacccc cggaaccact tcagatgcca ggtgcagttc tacggcctga 720
gcgagaacga cgagtggacc caggaccggg ccaagcccgt gacccagatc gtgtctgctg 780
aggcctgggg cagagccgat tgcggcttca ccagcgagag ctaccagcag ggcgtgctga 840
gcgccaccat cctgtacgag atcctgctgg gcaaggccac cctgtacgcc gtgctggtgt 900
ccgccctggt gctgatggcc atggtcaagc ggaaggacag ccggggctga 950
<210> 3
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B WT-TCR α
<400> 3
atgtggggag ctttccttct ctatgtttcc atgaagatgg gaggcactgc aggacaaagc 60
cttgagcagc cctctgaagt gacagctgtg gaaggagcca ttgtccagat aaactgcacg 120
taccagacat ctgggtttta tgggctgtcc tggtaccagc aacatgatgg cggagcaccc 180
acatttcttt cttacaatgc tctggatggt ttggaggaga caggtcgttt ttcttcattc 240
cttagtcgct ctgatagtta tggttacctc cttctacagg agctccagat gaaagactct 300
gcctcttact tctgcgctgt gaatgatgct tccaagataa tctttggatc agggaccaga 360
ctcagcatcc ggccaaatat ccagaaccct gaccctgccg tgtaccagct gagagactct 420
aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc accgattttg attctcaaac aaatgtgtca 480
caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg 540
gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac 600
gccttcaaca acagcattat tccagaagac accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt 660
gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa acagatacga acctaaactt tcaaaacctg 720
tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg 780
ctgcggctgt ggtccagctg a 801
<210> 4
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B 密码子优化 -TCR
α
<400> 4
atgtggggcg cttttcttct gtatgtgagc atgaagatgg gcggaacagc tggacagtct 60
ctggaacagc ctagcgaggt tacagctgtt gaaggagcta ttgtgcagat caactgcacc 120
taccagacaa gcggcttcta cggcctgagc tggtatcaac agcacgatgg aggagctcct 180
acatttctga gctataatgc cctggatggc ctggaggaga caggcagatt tagcagcttc 240
ctgagcagat ctgactctta cggatatctg ctgctgcagg agctgcagat gaaggatagc 300
gccagctact tttgtgccgt gaatgatgcc tctaagatca tcttcggcag cggcaccaga 360
ctgagcatca ggcccaatat ccagaatcca gatcctgctg tgtaccagct gcgggacagc 420
aagagcagcg acaagagcgt gtgcctgttc accgacttcg acagccagac caacgtgtcc 480
cagagcaagg acagcgacgt gtacatcacc gataagtgcg tgctggacat gcggagcatg 540
gacttcaaga gcaacagcgc cgtggcctgg tccaacaaga gcgacttcgc ctgcgccaac 600
gccttcaaca acagcattat ccccgaggac acattcttcc caagccccga gagcagctgc 660
gacgtgaagc tggtggaaaa gagcttcgag acagacacca acctgaactt ccagaacctc 720
agcgtgatcg gcttccggat cctgctgctg aaggtggccg gcttcaacct gctgatgacc 780
ctgcggctgt ggtccagctg a 801
<210> 5
<211> 1820
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B CO-TCR β-P2A-TCR
α
<400> 5
ggcgcgccac catgggaagc tggacactgt gttgcgttag cctgtgtatc ctggtggcca 60
aacacacaga tgctggagtg attcagagcc ctagacacga ggtgacagag atgggacagg 120
aagtgacact gagatgtaag cccattagcg gacacgacta cctgttctgg tacaggcaga 180
ccatgatgag aggactggaa ctgctgatct acttcaacaa caacgtgccc atcgacgata 240
gcggcatgcc tgaggacaga tttagcgcca agatgcctaa tgccagcttt tctaccctga 300
agatccagcc ctctgagccc agagattctg ccgtgtactt ttgtgccagc agctttacat 360
ctggctctta tgagcagtac ttcggcccag gcacaaggct gacagtgaca gaggacctga 420
agaacgtgtt ccccccagag gtggccgtgt tcgagcctag cgaggccgag atcagccaca 480
cccagaaagc caccctcgtg tgcctggcca ccggctttta ccccgaccac gtggaactgt 540
cttggtgggt caacggcaaa gaggtgcaca gcggcgtctg caccgacccc cagcccctga 600
aagagcagcc cgccctgaac gacagccggt actgtctgag cagcagactg agagtgtccg 660
ccaccttctg gcagaacccc cggaaccact tcagatgcca ggtgcagttc tacggcctga 720
gcgagaacga cgagtggacc caggaccggg ccaagcccgt gacccagatc gtgtctgctg 780
aggcctgggg cagagccgat tgcggcttca ccagcgagag ctaccagcag ggcgtgctga 840
gcgccaccat cctgtacgag atcctgctgg gcaaggccac cctgtacgcc gtgctggtgt 900
ccgccctggt gctgatggcc atggtcaagc ggaaggacag ccggggcggt tccggagcca 960
cgaacttctc tctgttaaag caagcaggag acgtggaaga aaaccccggt cccatgtggg 1020
gcgcttttct tctgtatgtg agcatgaaga tgggcggaac agctggacag tctctggaac 1080
agcctagcga ggttacagct gttgaaggag ctattgtgca gatcaactgc acctaccaga 1140
caagcggctt ctacggcctg agctggtatc aacagcacga tggaggagct cctacatttc 1200
tgagctataa tgccctggat ggcctggagg agacaggcag atttagcagc ttcctgagca 1260
gatctgactc ttacggatat ctgctgctgc aggagctgca gatgaaggat agcgccagct 1320
acttttgtgc cgtgaatgat gcctctaaga tcatcttcgg cagcggcacc agactgagca 1380
tcaggcccaa tatccagaat ccagatcctg ctgtgtacca gctgcgggac agcaagagca 1440
gcgacaagag cgtgtgcctg ttcaccgact tcgacagcca gaccaacgtg tcccagagca 1500
aggacagcga cgtgtacatc accgataagt gcgtgctgga catgcggagc atggacttca 1560
agagcaacag cgccgtggcc tggtccaaca agagcgactt cgcctgcgcc aacgccttca 1620
acaacagcat tatccccgag gacacattct tcccaagccc cgagagcagc tgcgacgtga 1680
agctggtgga aaagagcttc gagacagaca ccaacctgaa cttccagaac ctcagcgtga 1740
tcggcttccg gatcctgctg ctgaaggtgg ccggcttcaa cctgctgatg accctgcggc 1800
tgtggtccag ctgagtcgac 1820
<210> 6
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B 蛋白质 TCRβ -
含信号肽
<400> 6
Met Gly Ser Trp Thr Leu Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala
1 5 10 15
Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr
20 25 30
Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His
35 40 45
Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro
65 70 75 80
Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
130 135 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145 150 155 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
165 170 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
180 185 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys
195 200 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg
210 215 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
225 230 235 240
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
245 250 255
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln
260 265 270
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
275 280 285
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met
290 295 300
Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 7
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B 蛋白质 TCRα -
含信号肽
<400> 7
Met Trp Gly Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr
1 5 10 15
Ala Gly Gln Ser Leu Glu Gln Pro Ser Glu Val Thr Ala Val Glu Gly
20 25 30
Ala Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Tyr Gly
35 40 45
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln His Asp Gly Gly Ala Pro Thr Phe Leu Ser
50 55 60
Tyr Asn Ala Leu Asp Gly Leu Glu Glu Thr Gly Arg Phe Ser Ser Phe
65 70 75 80
Leu Ser Arg Ser Asp Ser Tyr Gly Tyr Leu Leu Leu Gln Glu Leu Gln
85 90 95
Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Val Asn Asp Ala Ser Lys
100 105 110
Ile Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Ser Ile Arg Pro Asn Ile Gln
115 120 125
Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp
130 135 140
Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser
145 150 155 160
Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp
165 170 175
Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn
180 185 190
Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro
195 200 205
Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu
210 215 220
Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu
225 230 235 240
Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn
245 250 255
Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265
<210> 8
<211> 600
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B 蛋白质 CO-TCR
β-P2A-TCR α
<400> 8
Met Gly Ser Trp Thr Leu Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala
1 5 10 15
Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr
20 25 30
Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His
35 40 45
Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro
65 70 75 80
Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
130 135 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145 150 155 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
165 170 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
180 185 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys
195 200 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg
210 215 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
225 230 235 240
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
245 250 255
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln
260 265 270
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
275 280 285
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met
290 295 300
Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
305 310 315 320
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Trp
325 330 335
Gly Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr Ala Gly
340 345 350
Gln Ser Leu Glu Gln Pro Ser Glu Val Thr Ala Val Glu Gly Ala Ile
355 360 365
Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Tyr Gly Leu Ser
370 375 380
Trp Tyr Gln Gln His Asp Gly Gly Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr Asn
385 390 395 400
Ala Leu Asp Gly Leu Glu Glu Thr Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu Ser
405 410 415
Arg Ser Asp Ser Tyr Gly Tyr Leu Leu Leu Gln Glu Leu Gln Met Lys
420 425 430
Asp Ser Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Val Asn Asp Ala Ser Lys Ile Ile
435 440 445
Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Ser Ile Arg Pro Asn Ile Gln Asn Pro
450 455 460
Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser
465 470 475 480
Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser
485 490 495
Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg
500 505 510
Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser
515 520 525
Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp
530 535 540
Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu
545 550 555 560
Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val
565 570 575
Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu
580 585 590
Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600
<210> 9
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B - WT-TCR β
<400> 9
atggactcct ggaccttctg ctgtgtgtcc ctttgcatcc tggtagcgaa gcatacagat 60
gctggagtta tccagtcacc ccgccatgag gtgacagaga tgggacaaga agtgactctg 120
agatgtaaac caatttcagg ccacaactcc cttttctggt acagacagac catgatgcgg 180
ggactggagt tgctcattta ctttaacaac aacgttccga tagatgattc agggatgccc 240
gaggatcgat tctcagctaa gatgcctaat gcatcattct ccactctgaa gatccagccc 300
tcagaaccca gggactcagc tgtgtacttc tgtgccagca gttcgcctga caggctgggc 360
gagcagtact tcgggccggg caccaggctc acggtcacag aggacctgaa aaacgtgttc 420
ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc 480
acactggtgt gcctggccac aggcttctac cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg 540
aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc agcccctcaa ggagcagccc 600
gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga gggtctcggc caccttctgg 660
cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac 720
gagtggaccc aggatagggc caaacctgtc acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt 780
agagcagact gtggcttcac ctccgagtct taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc 840
ctctatgaga tcttgctagg gaaggccacc ttgtatgccg tgctggtcag tgccctcgtg 900
ctgatggcca tggtcaagag aaaggattcc agaggctag 939
<210> 10
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B - CO-TCRβ
<400> 10
atggatagct ggaccttctg ttgcgtgagc ctgtgtatcc tggtggccaa acacacagat 60
gctggagtga ttcagagccc tagacatgag gtgaccgaaa tgggacagga ggtgacactg 120
agatgtaagc ccatttctgg ccacaacagc ctgttctggt acagacagac catgatgagg 180
ggactggaac tgctgatcta cttcaacaac aacgtgccca tcgacgatag cggcatgcct 240
gaggacagat ttagcgccaa gatgcctaat gccagctttt ctaccctgaa gatccagccc 300
tctgagccca gagattctgc cgtgtacttt tgtgccagct cttctcctga tagactggga 360
gagcagtact ttggccctgg cacaagactg acagtgacag aggacctgaa gaacgtgttc 420
cccccagagg tggccgtgtt cgagcctagc gaggccgaga tcagccacac ccagaaagcc 480
accctcgtgt gcctggccac cggcttttac cccgaccacg tggaactgtc ttggtgggtc 540
aacggcaaag aggtgcacag cggcgtctgc accgaccccc agcccctgaa agagcagccc 600
gccctgaacg acagccggta ctgtctgagc agcagactga gagtgtccgc caccttctgg 660
cagaaccccc ggaaccactt cagatgccag gtgcagttct acggcctgag cgagaacgac 720
gagtggaccc aggaccgggc caagcccgtg acccagatcg tgtctgctga ggcctggggc 780
agagccgatt gcggcttcac cagcgagagc taccagcagg gcgtgctgag cgccaccatc 840
ctgtacgaga tcctgctggg caaggccacc ctgtacgccg tgctggtgtc cgccctggtg 900
ctgatggcca tggtcaagcg gaaggacagc cggggctga 939
<210> 11
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B - WT-TCR α
<400> 11
atgatgaaat ccttgagagt tttactggtg atcctgtggc ttcagttaag ctgggtttgg 60
agccaacaga aggaggtgga gcaggatcct ggaccactca gtgttccaga gggagccatt 120
gtttctctca actgcactta cagcaacagt gcttttcaat acttcatgtg gtacagacag 180
tattccagaa aaggccctga gttgctgatg tacacatact ccagtggtaa caaagaagat 240
ggaaggttta cagcacaggt cgataaatcc agcaagtata tctccttgtt catcagagac 300
tcacagccca gtgattcagc cacctacctc tgtgcaggag ggggaaacac acctcttgtc 360
tttggaaagg gcacaagact ttctgtgatt gcaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 420
taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 480
tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 540
ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 600
gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 660
agcccagaaa gttcctgtga tgtcaagctg gtcgagaaaa gctttgaaac agatacgaac 720
ctaaactttc aaaacctgtc agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg 780
tttaatctgc tcatgacgct gcggctgtgg tccagctga 819
<210> 12
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B - CO-TCR α
<400> 12
atgatgaaga gcctgcgagt cctcctggtg attctgtggt tacagctgtc ttgggtgtgg 60
tctcagcaga aagaagtgga gcaggatcct ggacctctgt ctgtgcctga aggagctatt 120
gtgagcctga attgcaccta cagcaatagc gccttccagt acttcatgtg gtaccggcag 180
tacagcagaa agggccctga actgctgatg tacacctact ctagcggcaa taaggaagat 240
ggccggttta cagctcaggt ggacaagagc agcaagtaca tcagcctgtt catcagggat 300
tctcagccta gcgattctgc cacctacctg tgtgctggag gcggaaatac acctctggtt 360
tttggaaaag gcaccagact gtctgtgatc gccaacatcc agaaccccga ccctgctgtg 420
taccagctgc gggacagcaa gagcagcgac aagagcgtgt gcctgttcac cgacttcgac 480
agccagacca acgtgtccca gagcaaggac agcgacgtgt acatcaccga taagtgcgtg 540
ctggacatgc ggagcatgga cttcaagagc aacagcgccg tggcctggtc caacaagagc 600
gacttcgcct gcgccaacgc cttcaacaac agcattatcc ccgaggacac attcttccca 660
agccccgaga gcagctgcga cgtgaagctg gtggaaaaga gcttcgagac agacaccaac 720
ctgaacttcc agaacctcag cgtgatcggc ttccggatcc tgctgctgaa ggtggccggc 780
ttcaacctgc tgatgaccct gcggctgtgg tccagctga 819
<210> 13
<211> 1838
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成 Meso20-16B - CO-TCR β-P2A-
TCR α
<400> 13
ggcgcgccac catggatagc tggaccttct gttgcgtgag cctgtgtatc ctggtggcca 60
aacacacaga tgctggagtg attcagagcc ctagacatga ggtgaccgaa atgggacagg 120
aggtgacact gagatgtaag cccatttctg gccacaacag cctgttctgg tacagacaga 180
ccatgatgag gggactggaa ctgctgatct acttcaacaa caacgtgccc atcgacgata 240
gcggcatgcc tgaggacaga tttagcgcca agatgcctaa tgccagcttt tctaccctga 300
agatccagcc ctctgagccc agagattctg ccgtgtactt ttgtgccagc tcttctcctg 360
atagactggg agagcagtac tttggccctg gcacaagact gacagtgaca gaggacctga 420
agaacgtgtt ccccccagag gtggccgtgt tcgagcctag cgaggccgag atcagccaca 480
cccagaaagc caccctcgtg tgcctggcca ccggctttta ccccgaccac gtggaactgt 540
cttggtgggt caacggcaaa gaggtgcaca gcggcgtctg caccgacccc cagcccctga 600
aagagcagcc cgccctgaac gacagccggt actgtctgag cagcagactg agagtgtccg 660
ccaccttctg gcagaacccc cggaaccact tcagatgcca ggtgcagttc tacggcctga 720
gcgagaacga cgagtggacc caggaccggg ccaagcccgt gacccagatc gtgtctgctg 780
aggcctgggg cagagccgat tgcggcttca ccagcgagag ctaccagcag ggcgtgctga 840
gcgccaccat cctgtacgag atcctgctgg gcaaggccac cctgtacgcc gtgctggtgt 900
ccgccctggt gctgatggcc atggtcaagc ggaaggacag ccggggcggt tccggagcca 960
cgaacttctc tctgttaaag caagcaggag acgtggaaga aaaccccggt cccatgatga 1020
agagcctgcg agtcctcctg gtgattctgt ggttacagct gtcttgggtg tggtctcagc 1080
agaaagaagt ggagcaggat cctggacctc tgtctgtgcc tgaaggagct attgtgagcc 1140
tgaattgcac ctacagcaat agcgccttcc agtacttcat gtggtaccgg cagtacagca 1200
gaaagggccc tgaactgctg atgtacacct actctagcgg caataaggaa gatggccggt 1260
ttacagctca ggtggacaag agcagcaagt acatcagcct gttcatcagg gattctcagc 1320
ctagcgattc tgccacctac ctgtgtgctg gaggcggaaa tacacctctg gtttttggaa 1380
aaggcaccag actgtctgtg atcgccaaca tccagaaccc cgaccctgct gtgtaccagc 1440
tgcgggacag caagagcagc gacaagagcg tgtgcctgtt caccgacttc gacagccaga 1500
ccaacgtgtc ccagagcaag gacagcgacg tgtacatcac cgataagtgc gtgctggaca 1560
tgcggagcat ggacttcaag agcaacagcg ccgtggcctg gtccaacaag agcgacttcg 1620
cctgcgccaa cgccttcaac aacagcatta tccccgagga cacattcttc ccaagccccg 1680
agagcagctg cgacgtgaag ctggtggaaa agagcttcga gacagacacc aacctgaact 1740
tccagaacct cagcgtgatc ggcttccgga tcctgctgct gaaggtggcc ggcttcaacc 1800
tgctgatgac cctgcggctg tggtccagct gagtcgac 1838
<210> 14
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B - 蛋白质 TCR β -
含信号肽
<400> 14
Met Asp Ser Trp Thr Phe Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala
1 5 10 15
Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr
20 25 30
Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His
35 40 45
Asn Ser Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro
65 70 75 80
Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Ser Pro Asp Arg Leu Gly Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
130 135 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145 150 155 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
165 170 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
180 185 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys
195 200 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg
210 215 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
225 230 235 240
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
245 250 255
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln
260 265 270
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
275 280 285
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met
290 295 300
Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 15
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B - 蛋白质 TCR α
- 含信号肽
<400> 15
Met Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ser Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro
20 25 30
Leu Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser
35 40 45
Asn Ser Ala Phe Gln Tyr Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys
50 55 60
Gly Pro Glu Leu Leu Met Tyr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Lys Glu Asp
65 70 75 80
Gly Arg Phe Thr Ala Gln Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu
85 90 95
Phe Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala
100 105 110
Gly Gly Gly Asn Thr Pro Leu Val Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu Ser
115 120 125
Val Ile Ala Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg
130 135 140
Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr
165 170 175
Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser
180 185 190
Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe
195 200 205
Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser
210 215 220
Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn
225 230 235 240
Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu
245 250 255
Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 16
<211> 606
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B - 蛋白质 TCR
β-P2A-TCR α
<400> 16
Met Asp Ser Trp Thr Phe Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala
1 5 10 15
Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr
20 25 30
Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His
35 40 45
Asn Ser Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro
65 70 75 80
Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Ser Pro Asp Arg Leu Gly Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
130 135 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145 150 155 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
165 170 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
180 185 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys
195 200 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg
210 215 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
225 230 235 240
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
245 250 255
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln
260 265 270
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
275 280 285
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met
290 295 300
Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
305 310 315 320
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Met
325 330 335
Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser Trp
340 345 350
Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Leu Ser
355 360 365
Val Pro Glu Gly Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Ser
370 375 380
Ala Phe Gln Tyr Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys Gly Pro
385 390 395 400
Glu Leu Leu Met Tyr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Lys Glu Asp Gly Arg
405 410 415
Phe Thr Ala Gln Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu Phe Ile
420 425 430
Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Gly Gly
435 440 445
Gly Asn Thr Pro Leu Val Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu Ser Val Ile
450 455 460
Ala Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
465 470 475 480
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
485 490 495
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
500 505 510
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
515 520 525
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
530 535 540
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
545 550 555 560
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
565 570 575
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
580 585 590
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600 605
<210> 17
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A WT-TCR β
<400> 17
atgggctgca ggctgctctg ctgtgcggtt ctctgtctcc tgggagcagt tcccatagac 60
actgaagtta cccagacacc aaaacacctg gtcatgggaa tgacaaataa gaagtctttg 120
aaatgtgaac aacatatggg gcacagggct atgtattggt acaagcagaa agctaagaag 180
ccaccggagc tcatgtttgt ctacagctat gagaaactct ctataaatga aagtgtgcca 240
agtcgcttct cacctgaatg ccccaacagc tctctcttaa accttcacct acacgccctg 300
cagccagaag actcagccct gtatctctgc gccagcagcc acgggtccct gaacactgaa 360
gctttctttg gacaaggcac cagactcaca gttgtagagg acctgaacaa ggtgttccca 420
cccgaggtcg ctgtgtttga gccatcagaa gcagagatct cccacaccca aaaggccaca 480
ctggtgtgcc tggccacagg cttcttcccc gaccacgtgg agctgagctg gtgggtgaat 540
gggaaggagg tgcacagtgg ggtcagcacg gacccgcagc ccctcaagga gcagcccgcc 600
ctcaatgact ccagatactg cctgagcagc cgcctgaggg tctcggccac cttctggcag 660
aacccccgca accacttccg ctgtcaagtc cagttctacg ggctctcgga gaatgacgag 720
tggacccagg atagggccaa acccgtcacc cagatcgtca gcgccgaggc ctggggtaga 780
gcagactgtg gctttacctc ggtgtcctac cagcaagggg tcctgtctgc caccatcctc 840
tatgagatcc tgctagggaa ggccaccctg tatgctgtgc tggtcagcgc ccttgtgttg 900
atggccatgg tcaagagaaa ggatttctga 930
<210> 18
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A CO-TCR β
<400> 18
atgggctgta gactgctgtg ttgtgctgtg ctttgtctgc ttggagctgt gcctatcgat 60
acagaggtga cccagacacc taagcatctg gtgatgggca tgaccaacaa gaagagcctg 120
aagtgtgaac agcacatggg ccatagggcc atgtactggt acaagcagaa ggccaagaaa 180
cctcctgagc tgatgttcgt gtacagctac gagaagctga gcatcaacga gagcgtgccc 240
agcagatttt ctcctgagtg ccctaatagc tctctgctga atctgcacct gcatgctctg 300
cagcctgagg attctgctct gtacctgtgt gcttcttctc acggatctct gaatacagag 360
gccttcttcg gccagggcac aagactgaca gtggttgagg atctgaacaa ggtgttcccc 420
ccagaggtgg ccgtgttcga gccttctgag gccgagatct cccacaccca gaaagccacc 480
ctcgtgtgcc tggccaccgg ctttttcccc gaccacgtgg aactgtcttg gtgggtcaac 540
ggcaaagagg tgcactccgg cgtgtgcacc gatccccagc ctctgaaaga acagcccgcc 600
ctgaacgaca gccggtactg cctgagcagc agactgagag tgtccgccac cttctggcag 660
aacccccgga accacttcag atgccaggtg cagttctacg gcctgagcga gaacgacgag 720
tggacccagg acagagccaa gcccgtgaca cagatcgtgt ctgccgaagc ctggggcaga 780
gccgattgcg gctttacctc cgtgtcctat cagcagggcg tgctgagcgc cacaatcctg 840
tacgagatcc tgctgggcaa ggccaccctg tacgccgtgc tggtgtctgc cctggtgctg 900
atggccatgg tcaagcggaa ggacttctga 930
<210> 19
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A WT-TCR α
<400> 19
atgaagacat ttgctggatt ttcgttcctg tttttgtggc tgcagctgga ctgtatgagt 60
agaggagagg atgtggagca gagtcttttc ctgagtgtcc gagagggaga cagctccgtt 120
ataaactgca cttacacaga cagctcctcc acctacttat actggtataa gcaagaacct 180
ggagcaggtc tccagttgct gacgtatatt ttttcaaata tggacatgaa acaagaccaa 240
agactcactg ttctattgaa taaaaaggat aaacatctgt ctctgcgcat tgcagacacc 300
cagactgggg actcagctat ctacttctgt gcagagaccc cggggtatgg tggtgctaca 360
aacaagctca tctttggaac tggcactctg cttgctgtcc agccaaatat ccagaaccct 420
gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc 480
accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca 540
gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg 600
agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac 660
accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa 720
acagatacga acctaaactt tcaaaacctg tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg 780
aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagctg a 831
<210> 20
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A CO-TCR α
<400> 20
atgaagacct ttgccggctt cagcttcctg tttctgtggc tgcagctgga ttgtatgagc 60
agaggcgaag atgtggaaca gagcctgttc ctgagcgtta gagagggcga tagctctgtg 120
atcaattgca cctacaccga tagcagcagc acctacctgt actggtacaa gcaggagcct 180
ggagctggat tacagctgct gacatacatc ttcagcaaca tggacatgaa gcaggaccag 240
aggctgaccg tgctgctgaa caagaaggac aagcacctgt ctctgagaat tgccgataca 300
cagacaggcg atagcgccat ctacttctgt gccgagacac ctggctatgg aggagctacc 360
aataagctga ttttcggcac aggcacactg ttagctgtgc agcccaacat ccagaatccc 420
gatcctgctg tgtaccagct gcgggacagc aagagcagcg acaagagcgt gtgcctgttc 480
accgacttcg acagccagac caacgtgtcc cagagcaagg acagcgacgt gtacatcacc 540
gataagtgcg tgctggacat gcggagcatg gacttcaaga gcaacagcgc cgtggcctgg 600
tccaacaaga gcgacttcgc ctgcgccaac gccttcaaca acagcattat ccccgaggac 660
acattcttcc caagccccga gagcagctgc gacgtgaagc tggtggaaaa gagcttcgag 720
acagacacca acctgaactt ccagaacctc agcgtgatcg gcttccggat cctgctgctg 780
aaggtggccg gcttcaacct gctgatgacc ctgcggctgt ggtccagctg a 831
<210> 21
<211> 1841
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A CO-TCR β-P2A-TCR
α
<400> 21
ggcgcgccac catgggctgt agactgctgt gttgtgctgt gctttgtctg cttggagctg 60
tgcctatcga tacagaggtg acccagacac ctaagcatct ggtgatgggc atgaccaaca 120
agaagagcct gaagtgtgaa cagcacatgg gccatagggc catgtactgg tacaagcaga 180
aggccaagaa acctcctgag ctgatgttcg tgtacagcta cgagaagctg agcatcaacg 240
agagcgtgcc cagcagattt tctcctgagt gccctaatag ctctctgctg aatctgcacc 300
tgcatgctct gcagcctgag gattctgctc tgtacctgtg tgcttcttct cacggatctc 360
tgaatacaga ggccttcttc ggccagggca caagactgac agtggttgag gatctgaaca 420
aggtgttccc cccagaggtg gccgtgttcg agccttctga ggccgagatc tcccacaccc 480
agaaagccac cctcgtgtgc ctggccaccg gctttttccc cgaccacgtg gaactgtctt 540
ggtgggtcaa cggcaaagag gtgcactccg gcgtgtgcac cgatccccag cctctgaaag 600
aacagcccgc cctgaacgac agccggtact gcctgagcag cagactgaga gtgtccgcca 660
ccttctggca gaacccccgg aaccacttca gatgccaggt gcagttctac ggcctgagcg 720
agaacgacga gtggacccag gacagagcca agcccgtgac acagatcgtg tctgccgaag 780
cctggggcag agccgattgc ggctttacct ccgtgtccta tcagcagggc gtgctgagcg 840
ccacaatcct gtacgagatc ctgctgggca aggccaccct gtacgccgtg ctggtgtctg 900
ccctggtgct gatggccatg gtcaagcgga aggacttcgg ttccggagcc acgaacttct 960
ctctgttaaa gcaagcagga gacgtggaag aaaaccccgg tcccatgaag acctttgccg 1020
gcttcagctt cctgtttctg tggctgcagc tggattgtat gagcagaggc gaagatgtgg 1080
aacagagcct gttcctgagc gttagagagg gcgatagctc tgtgatcaat tgcacctaca 1140
ccgatagcag cagcacctac ctgtactggt acaagcagga gcctggagct ggattacagc 1200
tgctgacata catcttcagc aacatggaca tgaagcagga ccagaggctg accgtgctgc 1260
tgaacaagaa ggacaagcac ctgtctctga gaattgccga tacacagaca ggcgatagcg 1320
ccatctactt ctgtgccgag acacctggct atggaggagc taccaataag ctgattttcg 1380
gcacaggcac actgttagct gtgcagccca acatccagaa tcccgatcct gctgtgtacc 1440
agctgcggga cagcaagagc agcgacaaga gcgtgtgcct gttcaccgac ttcgacagcc 1500
agaccaacgt gtcccagagc aaggacagcg acgtgtacat caccgataag tgcgtgctgg 1560
acatgcggag catggacttc aagagcaaca gcgccgtggc ctggtccaac aagagcgact 1620
tcgcctgcgc caacgccttc aacaacagca ttatccccga ggacacattc ttcccaagcc 1680
ccgagagcag ctgcgacgtg aagctggtgg aaaagagctt cgagacagac accaacctga 1740
acttccagaa cctcagcgtg atcggcttcc ggatcctgct gctgaaggtg gccggcttca 1800
acctgctgat gaccctgcgg ctgtggtcca gctgagtcga c 1841
<210> 22
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A 蛋白质 CO-TCR β
- 含信号肽
<400> 22
Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Val Pro Ile Asp Thr Glu Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Val Met
20 25 30
Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Met Gly His
35 40 45
Arg Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Lys Ala Lys Lys Pro Pro Glu Leu
50 55 60
Met Phe Val Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu Ser Ile Asn Glu Ser Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser Leu Leu Asn Leu His
85 90 95
Leu His Ala Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser His Gly Ser Leu Asn Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg
115 120 125
Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Phe
305
<210> 23
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A 蛋白质 CO-TCR
α - 含信号肽
<400> 23
Met Lys Thr Phe Ala Gly Phe Ser Phe Leu Phe Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Asp Cys Met Ser Arg Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser
20 25 30
Val Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser
35 40 45
Ser Ser Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu
50 55 60
Gln Leu Leu Thr Tyr Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Leu Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg
85 90 95
Ile Ala Asp Thr Gln Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu
100 105 110
Thr Pro Gly Tyr Gly Gly Ala Thr Asn Lys Leu Ile Phe Gly Thr Gly
115 120 125
Thr Leu Leu Ala Val Gln Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
130 135 140
Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145 150 155 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
165 170 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
180 185 190
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
195 200 205
Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro
210 215 220
Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225 230 235 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg
245 250 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
260 265 270
Leu Trp Ser Ser
275
<210> 24
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A 蛋白质
Vβ-P2A-Vα
<400> 24
Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Val Pro Ile Asp Thr Glu Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Val Met
20 25 30
Gly Met Thr Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Met Gly His
35 40 45
Arg Ala Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Lys Ala Lys Lys Pro Pro Glu Leu
50 55 60
Met Phe Val Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu Ser Ile Asn Glu Ser Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser Leu Leu Asn Leu His
85 90 95
Leu His Ala Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser His Gly Ser Leu Asn Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg
115 120 125
Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Phe Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
305 310 315 320
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Lys Thr Phe Ala
325 330 335
Gly Phe Ser Phe Leu Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp Cys Met Ser Arg
340 345 350
Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser Val Arg Glu Gly Asp
355 360 365
Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Ser Thr Tyr Leu
370 375 380
Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu Gln Leu Leu Thr Tyr
385 390 395 400
Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln Arg Leu Thr Val Leu
405 410 415
Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg Ile Ala Asp Thr Gln
420 425 430
Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu Thr Pro Gly Tyr Gly
435 440 445
Gly Ala Thr Asn Lys Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Leu Leu Ala Val
450 455 460
Gln Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp
465 470 475 480
Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser
485 490 495
Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp
500 505 510
Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala
515 520 525
Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn
530 535 540
Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
545 550 555 560
Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu
565 570 575
Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys
580 585 590
Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600 605
<210> 25
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B CO-TCR β
<400> 25
atgggacctg gactgttatg ttgggttctg ctgtgtctgc ttggagctgg atctgtggaa 60
acaggcgtta cacagtcccc tacacacctg atcaagacaa gaggacagca ggtgaccctg 120
agatgttcta gccagtctgg ccacaataca gtgagctggt atcagcaggc tttaggacag 180
ggaccccagt tcatcttcca gtactaccgg gaggaagaga atggcagagg caattttcca 240
cccagattta gcggcctgca gttccccaat tacagcagcg agctgaacgt gaatgccctt 300
gaactggacg attctgctct gtacctgtgt gccagctctt ttgctggcgg aagaagcgat 360
acccagtatt ttggacctgg aaccagactg acagtgctgg aggacctgaa gaacgtgttc 420
cccccagagg tggccgtgtt cgagcctagc gaggccgaga tcagccacac ccagaaagcc 480
accctcgtgt gcctggccac cggcttttac cccgaccacg tggaactgtc ttggtgggtc 540
aacggcaaag aggtgcacag cggcgtctgc accgaccccc agcccctgaa agagcagccc 600
gccctgaacg acagccggta ctgtctgagc agcagactga gagtgtccgc caccttctgg 660
cagaaccccc ggaaccactt cagatgccag gtgcagttct acggcctgag cgagaacgac 720
gagtggaccc aggaccgggc caagcccgtg acccagatcg tgtctgctga ggcctggggc 780
agagccgatt gcggcttcac cagcgagagc taccagcagg gcgtgctgag cgccaccatc 840
ctgtacgaga tcctgctggg caaggccacc ctgtacgccg tgctggtgtc cgccctggtg 900
ctgatggcca tggtcaagcg gaaggacagc cggggctga 939
<210> 26
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B CO-TCR α
<400> 26
atggagacac tgctgggact actgattctg tggctgcaac tgcaatgggt gagcagcaaa 60
caggaggtta cccagattcc tgctgctctg tctgttcctg aaggcgagaa tctggtgctg 120
aactgcagct tcacagatag cgccatctac aacctgcagt ggttcagaca ggatcctgga 180
aaaggcctga caagcctgct gctgattcag agctctcaga gagagcagac atctggaaga 240
ctgaatgcta gcctggacaa gtctagcggc agaagcaccc tgtatattgc cgcctctcaa 300
cctggagatt ctgccacata cctgtgtgct gttaggctgc tgtttgccca aggaggaagc 360
gagaaactgg tgtttggaaa gggcacaaag ctgaccgtga atccctacat ccagaaccct 420
gatcctgccg tgtaccagct gcgggacagc aagagcagcg acaagagcgt gtgcctgttc 480
accgacttcg acagccagac caacgtgtcc cagagcaagg acagcgacgt gtacatcacc 540
gataagtgcg tgctggacat gcggagcatg gacttcaaga gcaacagcgc cgtggcctgg 600
tccaacaaga gcgacttcgc ctgcgccaac gccttcaaca acagcattat ccccgaggac 660
acattcttcc caagccccga gagcagctgc gacgtgaagc tggtggaaaa gagcttcgag 720
acagacacca acctgaactt ccagaacctc agcgtgatcg gcttccggat cctgctgctg 780
aaggtggccg gcttcaacct gctgatgacc ctgcggctgt ggtccagctg a 831
<210> 27
<211> 1843
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B -TCR β-P2A-TCR
α
<400> 27
caccatggga cctggactgt tatgttgggt tctgctgtgt ctgcttggag ctggatctgt 60
ggaaacaggc gttacacagt cccctacaca cctgatcaag acaagaggac agcaggtgac 120
cctgagatgt tctagccagt ctggccacaa tacagtgagc tggtatcagc aggctttagg 180
acagggaccc cagttcatct tccagtacta ccgggaggaa gagaatggca gaggcaattt 240
tccacccaga tttagcggcc tgcagttccc caattacagc agcgagctga acgtgaatgc 300
ccttgaactg gacgattctg ctctgtacct gtgtgccagc tcttttgctg gcggaagaag 360
cgatacccag tattttggac ctggaaccag actgacagtg ctggaggacc tgaagaacgt 420
gttcccccca gaggtggccg tgttcgagcc tagcgaggcc gagatcagcc acacccagaa 480
agccaccctc gtgtgcctgg ccaccggctt ttaccccgac cacgtggaac tgtcttggtg 540
ggtcaacggc aaagaggtgc acagcggcgt ctgcaccgac ccccagcccc tgaaagagca 600
gcccgccctg aacgacagcc ggtactgtct gagcagcaga ctgagagtgt ccgccacctt 660
ctggcagaac ccccggaacc acttcagatg ccaggtgcag ttctacggcc tgagcgagaa 720
cgacgagtgg acccaggacc gggccaagcc cgtgacccag atcgtgtctg ctgaggcctg 780
gggcagagcc gattgcggct tcaccagcga gagctaccag cagggcgtgc tgagcgccac 840
catcctgtac gagatcctgc tgggcaaggc caccctgtac gccgtgctgg tgtccgccct 900
ggtgctgatg gccatggtca agcggaagga cagccggggc ggttccggag ccacgaactt 960
ctctctgtta aagcaagcag gagacgtgga agaaaacccc ggtcccatgg agacactgct 1020
gggactactg attctgtggc tgcaactgca atgggtgagc agcaaacagg aggttaccca 1080
gattcctgct gctctgtctg ttcctgaagg cgagaatctg gtgctgaact gcagcttcac 1140
agatagcgcc atctacaacc tgcagtggtt cagacaggat cctggaaaag gcctgacaag 1200
cctgctgctg attcagagct ctcagagaga gcagacatct ggaagactga atgctagcct 1260
ggacaagtct agcggcagaa gcaccctgta tattgccgcc tctcaacctg gagattctgc 1320
cacatacctg tgtgctgtta ggctgctgtt tgcccaagga ggaagcgaga aactggtgtt 1380
tggaaagggc acaaagctga ccgtgaatcc ctacatccag aaccctgatc ctgccgtgta 1440
ccagctgcgg gacagcaaga gcagcgacaa gagcgtgtgc ctgttcaccg acttcgacag 1500
ccagaccaac gtgtcccaga gcaaggacag cgacgtgtac atcaccgata agtgcgtgct 1560
ggacatgcgg agcatggact tcaagagcaa cagcgccgtg gcctggtcca acaagagcga 1620
cttcgcctgc gccaacgcct tcaacaacag cattatcccc gaggacacat tcttcccaag 1680
ccccgagagc agctgcgacg tgaagctggt ggaaaagagc ttcgagacag acaccaacct 1740
gaacttccag aacctcagcg tgatcggctt ccggatcctg ctgctgaagg tggccggctt 1800
caacctgctg atgaccctgc ggctgtggtc cagctgagtc gac 1843
<210> 28
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B 蛋白质 CO-TCR β
- 含信号肽
<400> 28
Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp Val Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Ser Val Glu Thr Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys
20 25 30
Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Ser Gln Ser Gly His
35 40 45
Asn Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe
50 55 60
Ile Phe Gln Tyr Tyr Arg Glu Glu Glu Asn Gly Arg Gly Asn Phe Pro
65 70 75 80
Pro Arg Phe Ser Gly Leu Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Val Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Phe Ala Gly Gly Arg Ser Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
130 135 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145 150 155 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
165 170 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
180 185 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys
195 200 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg
210 215 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
225 230 235 240
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
245 250 255
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln
260 265 270
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
275 280 285
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met
290 295 300
Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 29
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B 蛋白质 CO-TCR
α - 含信号肽
<400> 29
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val
20 25 30
Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala
35 40 45
Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr
50 55 60
Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile
85 90 95
Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg
100 105 110
Leu Leu Phe Ala Gln Gly Gly Ser Glu Lys Leu Val Phe Gly Lys Gly
115 120 125
Thr Lys Leu Thr Val Asn Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
130 135 140
Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145 150 155 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
165 170 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
180 185 190
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
195 200 205
Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro
210 215 220
Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225 230 235 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg
245 250 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
260 265 270
Leu Trp Ser Ser
275
<210> 30
<211> 610
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B 蛋白质 CO-TCR
β-P2A-TCR α
<400> 30
Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp Val Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Ser Val Glu Thr Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys
20 25 30
Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Ser Gln Ser Gly His
35 40 45
Asn Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe
50 55 60
Ile Phe Gln Tyr Tyr Arg Glu Glu Glu Asn Gly Arg Gly Asn Phe Pro
65 70 75 80
Pro Arg Phe Ser Gly Leu Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Val Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Phe Ala Gly Gly Arg Ser Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val
130 135 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145 150 155 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu
165 170 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp
180 185 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys
195 200 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg
210 215 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
225 230 235 240
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
245 250 255
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln
260 265 270
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
275 280 285
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met
290 295 300
Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
305 310 315 320
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu
325 330 335
Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp Val Ser
340 345 350
Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu
355 360 365
Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr
370 375 380
Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu
385 390 395 400
Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn
405 410 415
Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala
420 425 430
Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Leu Leu
435 440 445
Phe Ala Gln Gly Gly Ser Glu Lys Leu Val Phe Gly Lys Gly Thr Lys
450 455 460
Leu Thr Val Asn Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
465 470 475 480
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
485 490 495
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
500 505 510
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
515 520 525
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
530 535 540
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
545 550 555 560
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
565 570 575
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
580 585 590
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
595 600 605
Ser Ser
610
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln20-28
<400> 31
Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln530-538
<400> 32
Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val
1 5
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B CDR3 α
<400> 33
Cys Ala Val Asn Asp Ala Ser Lys Ile Ile Phe
1 5 10
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B CDR3 β
<400> 34
Cys Ala Ser Ser Phe Thr Ser Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B CDR3 α
<400> 35
Cys Ala Gly Gly Gly Asn Thr Pro Leu Val Phe
1 5 10
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B CDR3 β
<400> 36
Cys Ala Ser Ser Ser Pro Asp Arg Leu Gly Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A CDR3 α
<400> 37
Cys Ala Glu Thr Pro Gly Tyr Gly Gly Ala Thr Asn Lys Leu Ile Phe
1 5 10 15
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A CDR3 β
<400> 38
Cys Ala Ser Ser His Gly Ser Leu Asn Thr Glu Ala Phe Phe
1 5 10
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence Meso530-11B CDR3 alpha
<400> 39
Cys Ala Val Arg Leu Leu Phe Ala Gln Gly Gly Ser Glu Lys Leu Val
1 5 10 15
Phe
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B CDR3 β
<400> 40
Cys Ala Ser Ser Phe Ala Gly Gly Arg Ser Asp Thr Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 41
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 猪捷申病毒
自裂解肽 P2A-1
<400> 41
ggaagtggag ctacgaattt ttctttatta aaacaagcag gagatgttga ggagaatccc 60
ggtcca 66
<210> 42
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 猪捷申病毒
自裂解肽 P2A-2
<400> 42
agcggcgcca ccaacttcag cctgctgaaa caggccggcg acgtggaaga gaaccctggc 60
cct 63
<210> 43
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 猪捷申病毒
自裂解肽 P2A-3
<400> 43
gaagcggcgc cacaaatttc agcctgctga agcaggccgg cgacgtggaa gagaaccctg 60
gccct 65
<210> 44
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 猪捷申病毒
自裂解肽 P2A-4
<400> 44
ggctccggcg ccaccaactt ttcactgctg aaacaggctg gggatgtgga agaaaatccc 60
ggccca 66
<210> 45
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 猪捷申病毒
自裂解肽 P2A-5
<400> 45
ggcagcggcg ccaccaactt tagcctgctg aaacaggctg gcgacgtgga agagaacccc 60
ggacct 66
<210> 46
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 猪捷申病毒
自裂解肽 P2A-6
<400> 46
ggctctggcg ccaccaactt tagcctgctg aaacaggctg gcgacgtgga agagaacccc 60
ggacct 66
<210> 47
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 明脉扁刺蛾病毒 2A T2A
<400> 47
ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga 60
cct 63
<210> 48
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 马鼻炎A病毒 E2A
<400> 48
ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60
cctggacct 69
<210> 49
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 口蹄疫病毒 2
F2A
<400> 49
ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60
tccaaccctg gacct 75
<210> 50
<211> 630
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 人MSLN, 同种型 1
<400> 50
Met Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Val Gln
20 25 30
Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu
35 40 45
Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr Glu
65 70 75 80
Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu
85 90 95
Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro
100 105 110
Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn Pro
115 120 125
Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile
130 135 140
Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln
145 150 155 160
Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu
165 170 175
Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu
180 185 190
Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu
195 200 205
Val Ser Cys Pro Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg
210 215 220
Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp
225 230 235 240
Ser Val Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly
245 250 255
Gln Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg
260 265 270
Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr Ile
275 280 285
Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser
290 295 300
Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys
305 310 315 320
Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met
325 330 335
Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu
340 345 350
Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val
355 360 365
Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile
370 375 380
Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu
385 390 395 400
Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Ala Pro Arg Arg Pro Leu
405 410 415
Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln
420 425 430
Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr
435 440 445
Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser
450 455 460
Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln
465 470 475 480
Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn
485 490 495
Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro
500 505 510
Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu
515 520 525
Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val
530 535 540
Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala
545 550 555 560
Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln
565 570 575
Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn
580 585 590
Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser Met Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr
595 600 605
Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu
610 615 620
Leu Ala Ser Thr Leu Ala
625 630
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln20-28 丙氨酸 变型 1
<400> 51
Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln20-28 丙氨酸 变型 2
<400> 52
Ser Ala Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln20-28 丙氨酸 变型 3
<400> 53
Ser Leu Ala Phe Leu Leu Phe Ser Leu
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln20-28 丙氨酸 变型 4
<400> 54
Ser Leu Leu Ala Leu Leu Phe Ser Leu
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln20-28 丙氨酸 变型 5
<400> 55
Ser Leu Leu Phe Ala Leu Phe Ser Leu
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln20-28 丙氨酸 变型 6
<400> 56
Ser Leu Leu Phe Leu Ala Phe Ser Leu
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln20-28 丙氨酸 变型 7
<400> 57
Ser Leu Leu Phe Leu Leu Ala Ser Leu
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln20-28 丙氨酸 变型 8
<400> 58
Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ala Leu
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln20-28 丙氨酸 变型 9
<400> 59
Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ala
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln20-28 TCR 表位 共有
序列
<220>
<221> 变型
<222> 1,2,7,8,9
<223> Xaa = 任何氨基酸, 任选地丙氨酸
<400> 60
Xaa Xaa Leu Phe Leu Leu Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln530-538 TCR 表位
共有序列 1
<220>
<221> 变型
<222> 3,5,6,9
<223> Xaa = 任何氨基酸, 任选地丙氨酸
<400> 61
Val Leu Xaa Leu Xaa Xaa Ala Glu Xaa
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Msln530-538 TCR 表位
共有序列 2
<220>
<221> 变型
<222> 1,5,9
<223> Xaa = 任何氨基酸, 任选地丙氨酸
<400> 62
Xaa Leu Pro Leu Xaa Val Ala Glu Xaa
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 EHF 肽
<400> 63
Val Leu Leu Leu Ser Leu Ala Glu Ile
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 YN010 肽
<400> 64
Val Leu Ala Leu Trp Glu Ala Glu Val
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 MLEC 肽
<400> 65
Val Leu Val Leu Lys Phe Ala Glu Val
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 CHPF2 肽
<400> 66
Val Leu Pro Leu Leu Val Ala Glu Ala
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 ULK1 肽
<400> 67
Val Leu Tyr Leu Lys Val Ala Glu Leu
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列OR2J2 肽
<400> 68
Val Leu Ala Leu Gly Ile Ala Glu Cys
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 DNHD1 肽
<400> 69
Val Leu Glu Leu Leu Leu Ala Glu Leu
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 AL1L1 肽
<400> 70
Val Leu Glu Leu Thr Glu Ala Glu Leu
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 GALP 肽
<400> 71
Val Leu Leu Leu Ser Leu Ala Glu Thr
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 OR2J1 肽
<400> 72
Val Leu Ala Leu Gly Thr Ala Glu Cys
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 ADPRH 肽
<400> 73
Val Met His Leu Ala Thr Ala Glu Ala
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 CHPF2 肽
<400> 74
Val Leu Pro Leu Ile Val Ala Glu Ala
1 5
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 LRCH3 肽
<400> 75
Asp Leu Pro Leu Arg Val Ala Glu Ile
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 IN80B 肽
<400> 76
Met Leu Pro Leu Pro Val Ala Glu Gly
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 CEAM3 肽
<400> 77
Ser Met Pro Leu Ser Val Ala Glu Gly
1 5
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B CDR1 β
<400> 78
Ser Gly His Asp Tyr
1 5
<210> 79
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B, Meso20-16B CDR2 β
<400> 79
Phe Asn Asn Asn Val Pro
1 5
<210> 80
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B CDR1 α
<400> 80
Thr Ser Gly Phe Tyr Gly
1 5
<210> 81
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B CDR2 α v1
<400> 81
Asn Ala Leu Asp Gly
1 5
<210> 82
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列Meso20-16B CDR1 β
<400> 82
Ser Gly His Asn Ser
1 5
<210> 83
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B / Meso20-3B /
Meso530 -11A / Meso530 -11B CDR1 β 一致
<220>
<221> 变型
<222> 1
<223> Xaa = M, S, or T
<220>
<221> 变型
<222> 4
<223> Xaa = D, E, N, Q, R or K
<220>
<221> 变型
<222> 5
<223> Xaa = Y, S, A, V, I, L, or T
<400> 83
Xaa Gly His Xaa Xaa
1 5
<210> 84
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B / Meso20-3B /
Meso530 CDR2 β 一致
<220>
<221> 变型
<222> 4
<223> Xaa = D or N
<220>
<221> 变型
<222> 5
<223> Xaa = Y, S, or T
<400> 84
Ser Gly His Xaa Xaa
1 5
<210> 85
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B CDR1 α
<400> 85
Asn Ser Ala Phe Gln Tyr
1 5
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B CDR2 α v1
<400> 86
Thr Tyr Ser Ser Gly
1 5
<210> 87
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A CDR1 β
<400> 87
Met Gly His Arg Ala
1 5
<210> 88
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A CDR2 β
<400> 88
Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu
1 5
<210> 89
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A CDR1 α
<400> 89
Ser Ser Ser Thr Tyr Leu
1 5
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A CDR2 α
<400> 90
Ile Phe Ser Asn Met Asp Met
1 5
<210> 91
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B CDR1 β
<400> 91
Ser Gly His Asn Thr
1 5
<210> 92
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B CDR2 β
<400> 92
Tyr Tyr Arg Glu Glu Glu
1 5
<210> 93
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B CDR1 α
<400> 93
Asp Ser Ala Ile Tyr Asn
1 5
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B CDR2 α
<400> 94
Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu
1 5
<210> 95
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B V β (成熟)
<400> 95
Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly
1 5 10 15
Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln
65 70 75 80
Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Phe
85 90 95
Thr Ser Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Thr
<210> 96
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B V α (成熟)
<400> 96
Gly Gln Ser Leu Glu Gln Pro Ser Glu Val Thr Ala Val Glu Gly Ala
1 5 10 15
Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Tyr Gly Leu
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln His Asp Gly Gly Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr
35 40 45
Asn Ala Leu Asp Gly Leu Glu Glu Thr Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu
50 55 60
Ser Arg Ser Asp Ser Tyr Gly Tyr Leu Leu Leu Gln Glu Leu Gln Met
65 70 75 80
Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Val Asn Asp Ala Ser Lys Ile
85 90 95
Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Ser Ile Arg Pro
100 105
<210> 97
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B V β (成熟)
<400> 97
Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly
1 5 10 15
Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asn Ser Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln
65 70 75 80
Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Ser
85 90 95
Pro Asp Arg Leu Gly Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Thr
<210> 98
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B V α (成熟)
<400> 98
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Ser Ala Phe Gln Tyr
20 25 30
Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys Gly Pro Glu Leu Leu Met
35 40 45
Tyr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Gly Gly Gly Asn Thr Pro
85 90 95
Leu Val Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu Ser Val Ile Ala
100 105
<210> 99
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A V β (成熟)
<400> 99
Asp Thr Glu Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Val Met Gly Met Thr
1 5 10 15
Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Met Gly His Arg Ala Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Lys Gln Lys Ala Lys Lys Pro Pro Glu Leu Met Phe Val
35 40 45
Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu Ser Ile Asn Glu Ser Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser Leu Leu Asn Leu His Leu His Ala
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser His Gly
85 90 95
Ser Leu Asn Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Thr Val
100 105 110
Val
<210> 100
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A V α (成熟)
<400> 100
Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser Val Arg Glu Gly Asp
1 5 10 15
Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Ser Thr Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu Gln Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln Arg Leu Thr Val Leu
50 55 60
Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg Ile Ala Asp Thr Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu Thr Pro Gly Tyr Gly
85 90 95
Gly Ala Thr Asn Lys Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Leu Leu Ala Val
100 105 110
Gln Pro
<210> 101
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B V β (成熟)
<400> 101
Glu Thr Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys Thr Arg Gly
1 5 10 15
Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Ser Gln Ser Gly His Asn Thr Val
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile Phe Gln
35 40 45
Tyr Tyr Arg Glu Glu Glu Asn Gly Arg Gly Asn Phe Pro Pro Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Leu Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn Val Asn Ala
65 70 75 80
Leu Glu Leu Asp Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe Ala
85 90 95
Gly Gly Arg Ser Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Leu
<210> 102
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B V α (成熟)
<400> 102
Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn
20 25 30
Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu
35 40 45
Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala
50 55 60
Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser
65 70 75 80
Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Leu Leu Phe
85 90 95
Ala Gln Gly Gly Ser Glu Lys Leu Val Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Thr Val Asn Pro
115
<210> 103
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B TCR β (成熟)
<400> 103
Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly
1 5 10 15
Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln
65 70 75 80
Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Phe
85 90 95
Thr Ser Gly Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe
115 120 125
Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val
130 135 140
Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
145 150 155 160
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro
165 170 175
Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser
180 185 190
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe
195 200 205
Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr
210 215 220
Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp
225 230 235 240
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val
245 250 255
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
260 265 270
Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg
275 280 285
Lys Asp Ser Arg Gly
290
<210> 104
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-3B TCR α (成熟) -
半胱氨酸模块
<400> 104
Gly Gln Ser Leu Glu Gln Pro Ser Glu Val Thr Ala Val Glu Gly Ala
1 5 10 15
Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Tyr Gly Leu
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln His Asp Gly Gly Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr
35 40 45
Asn Ala Leu Asp Gly Leu Glu Glu Thr Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu
50 55 60
Ser Arg Ser Asp Ser Tyr Gly Tyr Leu Leu Leu Gln Glu Leu Gln Met
65 70 75 80
Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Val Asn Asp Ala Ser Lys Ile
85 90 95
Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Ser Ile Arg Pro Asn Ile Gln Asn
100 105 110
Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys
115 120 125
Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln
130 135 140
Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met
145 150 155 160
Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys
165 170 175
Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu
180 185 190
Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val
195 200 205
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser
210 215 220
Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
225 230 235 240
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245
<210> 105
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B TCR β (成熟) -
半胱氨酸模块
<400> 105
Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly
1 5 10 15
Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asn Ser Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln
65 70 75 80
Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Ser
85 90 95
Pro Asp Arg Leu Gly Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe
115 120 125
Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val
130 135 140
Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
145 150 155 160
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro
165 170 175
Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser
180 185 190
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe
195 200 205
Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr
210 215 220
Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp
225 230 235 240
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val
245 250 255
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
260 265 270
Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg
275 280 285
Lys Asp Ser Arg Gly
290
<210> 106
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso20-16B TCR α (成熟) -
半胱氨酸模块
<400> 106
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asp Pro Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Val Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asn Ser Ala Phe Gln Tyr
20 25 30
Phe Met Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Arg Lys Gly Pro Glu Leu Leu Met
35 40 45
Tyr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Val Asp Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ser Leu Phe Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Gly Gly Gly Asn Thr Pro
85 90 95
Leu Val Phe Gly Lys Gly Thr Arg Leu Ser Val Ile Ala Asn Ile Gln
100 105 110
Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp
115 120 125
Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser
130 135 140
Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp
145 150 155 160
Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn
165 170 175
Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro
180 185 190
Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu
195 200 205
Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu
210 215 220
Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn
225 230 235 240
Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250
<210> 107
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A TCR β (成熟) -
半胱氨酸模块
<400> 107
Asp Thr Glu Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Val Met Gly Met Thr
1 5 10 15
Asn Lys Lys Ser Leu Lys Cys Glu Gln His Met Gly His Arg Ala Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Lys Gln Lys Ala Lys Lys Pro Pro Glu Leu Met Phe Val
35 40 45
Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu Ser Ile Asn Glu Ser Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Pro Glu Cys Pro Asn Ser Ser Leu Leu Asn Leu His Leu His Ala
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser His Gly
85 90 95
Ser Leu Asn Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Thr Val
100 105 110
Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
115 120 125
Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
130 135 140
Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
145 150 155 160
Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
165 170 175
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg
180 185 190
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
195 200 205
Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
210 215 220
Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
225 230 235 240
Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu
245 250 255
Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr
260 265 270
Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys
275 280 285
Asp Phe
290
<210> 108
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11A TCR α (成熟)
- 半胱氨酸模块
<400> 108
Gly Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser Val Arg Glu Gly Asp
1 5 10 15
Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Ser Thr Tyr Leu
20 25 30
Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu Gln Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln Arg Leu Thr Val Leu
50 55 60
Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg Ile Ala Asp Thr Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu Thr Pro Gly Tyr Gly
85 90 95
Gly Ala Thr Asn Lys Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Leu Leu Ala Val
100 105 110
Gln Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp
115 120 125
Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser
130 135 140
Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp
145 150 155 160
Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala
165 170 175
Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn
180 185 190
Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu
210 215 220
Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys
225 230 235 240
Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250 255
<210> 109
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B TCR β (成熟) -
半胱氨酸模块
<400> 109
Glu Thr Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys Thr Arg Gly
1 5 10 15
Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Ser Gln Ser Gly His Asn Thr Val
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile Phe Gln
35 40 45
Tyr Tyr Arg Glu Glu Glu Asn Gly Arg Gly Asn Phe Pro Pro Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Leu Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn Val Asn Ala
65 70 75 80
Leu Glu Leu Asp Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe Ala
85 90 95
Gly Gly Arg Ser Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
100 105 110
Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe
115 120 125
Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val
130 135 140
Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
145 150 155 160
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro
165 170 175
Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser
180 185 190
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe
195 200 205
Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr
210 215 220
Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp
225 230 235 240
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val
245 250 255
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
260 265 270
Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg
275 280 285
Lys Asp Ser Arg Gly
290
<210> 110
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B TCR α (成熟)
- 半胱氨酸模块
<400> 110
Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn
20 25 30
Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu
35 40 45
Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala
50 55 60
Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser
65 70 75 80
Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Leu Leu Phe
85 90 95
Ala Gln Gly Gly Ser Glu Lys Leu Val Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu
100 105 110
Thr Val Asn Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu
115 120 125
Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
130 135 140
Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile
145 150 155 160
Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn
165 170 175
Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
180 185 190
Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu
195 200 205
Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
210 215 220
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
225 230 235 240
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
245 250 255
Ser
<210> 111
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B WT TCR α
<400> 111
atggagaccc tcttgggcct gcttatcctt tggctgcagc tgcaatgggt gagcagcaaa 60
caggaggtga cgcagattcc tgcagctctg agtgtcccag aaggagaaaa cttggttctc 120
aactgcagtt tcactgatag cgctatttac aacctccagt ggtttaggca ggaccctggg 180
aaaggtctca catctctgtt gcttattcag tcaagtcaga gagagcaaac aagtggaaga 240
cttaatgcct cgctggataa atcatcagga cgtagtactt tatacattgc agcttctcag 300
cctggtgact cagccaccta cctctgtgct gtgaggctat tattcgctca gggcggatct 360
gaaaagctgg tctttggaaa gggaacgaaa ctgacagtaa acccatatat ccagaaccct 420
gaccctgccg tgtaccagct gagagactct aaatccagtg acaagtctgt ctgcctattc 480
accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg attctgatgt gtatatcaca 540
gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg 600
agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac 660
accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa 720
acagatacga acctaaactt tcaaaacctg tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg 780
aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg ctgcggctgt ggtccagctg a 831
<210> 112
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 Meso530-11B WT TCR β
<400> 112
atgggccctg ggctcctctg ctgggtgctg ctttgtctcc tgggagcagg ctcagtggag 60
actggagtca cccaaagtcc cacacacctg atcaaaacga gaggacagca agtgactctg 120
agatgctctt ctcagtctgg gcacaacact gtgtcctggt accaacaggc cctgggtcag 180
gggccccagt ttatctttca gtattatagg gaggaagaga atggcagagg aaacttccct 240
cctagattct caggtctcca gttccctaat tatagctctg agctgaatgt gaacgccttg 300
gagctggacg actcggccct gtatctctgt gccagcagct tcgcgggggg gcgatcagat 360
acgcagtatt ttggcccagg cacccggctg acagtgctcg aggacctgaa aaacgtgttc 420
ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc 480
acactggtgt gcctggccac aggcttctac cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg 540
aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc acagacccgc agcccctcaa ggagcagccc 600
gccctcaatg actccagata ctgcctgagc agccgcctga gggtctcggc caccttctgg 660
cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa gtccagttct acgggctctc ggagaatgac 720
gagtggaccc aggatagggc caaacctgtc acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt 780
agagcagact gtggcttcac ctccgagtct taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc 840
ctctatgaga tcttgctagg gaaggccacc ttgtatgccg tgctggtcag tgccctcgtg 900
ctgatggcca tggtcaagag aaaggattcc agaggctag 939
<210> 113
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 猪捷申病毒
自裂解肽 P2A-1
<400> 113
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 114
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 猪捷申病毒
自裂解肽 P2A-2
<400> 114
Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 115
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 明脉扁刺蛾病毒2A T2A
<400> 115
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 116
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 马鼻炎A病毒 E2A
<400> 116
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 117
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 口蹄疫病毒 2
F2A
<400> 117
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 118
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - Meso20-3B CDR2 α v2
<400> 118
Asn Ala Leu Asp Gly Leu
1 5
<210> 119
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - Meso20-16B CDR2 α v2
<400> 119
Thr Tyr Ser Ser Gly Asn
1 5
<210> 120
<211> 1833
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - Meso530-11B
CO-β-P2A-α: (替代优化)
<400> 120
atgggacctg gattgctttg ttgggtgctg ctgtgtctgc tcggagccgg atctgtggaa 60
acaggcgtga cacagagccc cacacacctg atcaagacca gaggccagca agtgaccctg 120
agatgcagct ctcagagcgg ccacaatacc gtgtcctggt atcagcaggc cctcggacag 180
ggccctcagt tcatcttcca gtactacaga gaggaagaga acggcagagg caacttccca 240
cctagattca gcggcctgca gttccccaac tacagcagcg agctgaacgt gaacgccctg 300
gaactggatg acagcgccct gtacctgtgc gccagttctt ttgccggcgg aagaagcgac 360
acccagtact ttggacctgg caccagactg accgtgctgg aagatctgaa gaacgtgttc 420
ccacctgagg tggccgtgtt cgagccttct gaggccgaga tcagccacac acagaaagcc 480
acactcgtgt gtctggccac cggcttctat cccgatcacg tggaactgtc ttggtgggtc 540
aacggcaaag aggtgcacag cggcgtctgt accgatcctc agcctctgaa agagcagccc 600
gctctgaacg acagcagata ctgcctgagc agcagactga gagtgtccgc caccttctgg 660
cagaacccca gaaaccactt cagatgccag gtgcagttct acggcctgag cgagaacgat 720
gagtggaccc aggatagagc caagcctgtg actcagatcg tgtctgccga agcctggggc 780
agagccgatt gtggctttac cagcgagtct taccagcagg gcgtgctgtc tgccaccatc 840
ctgtatgaga tcctgctggg caaagccact ctgtacgccg tgctggtttc tgccctggtg 900
ctgatggcca tggtcaagcg gaaggatagc agaggcggaa gcggcgccac aaacttctca 960
ctgctgaaac aggccggcga cgtggaagag aatcccggac ctatggaaac actgctggga 1020
ctgctgatcc tgtggctgca gcttcagtgg gtgtccagca agcaagaagt gacccagatt 1080
cctgccgcac tgtctgtgcc tgagggcgag aatctggtcc tgaactgctc cttcaccgac 1140
agcgccatct acaacctgca gtggttcaga caggaccccg gcaagggact gacaagcctg 1200
ctgctgattc agagcagcca gagagagcag accagcggca gactgaatgc cagcctggat 1260
aagtcctccg gcagaagcac cctgtatatc gccgcttctc agcctggcga tagcgccaca 1320
tatctgtgtg ccgtgcggct gctgtttgcc caaggcggat ctgagaagct ggtgttcggc 1380
aagggcacca agctgacagt gaacccctac attcagaacc ccgatcctgc cgtgtaccag 1440
ctgagagaca gcaagagcag cgacaagagc gtgtgcctgt tcaccgactt cgacagccag 1500
accaacgtgt cccagagcaa ggacagcgac gtgtacatca ccgataagtg cgtgctggac 1560
atgcggagca tggacttcaa gagcaacagc gccgtggcct ggtccaacaa gagcgatttc 1620
gcctgcgcca acgccttcaa caacagcatt atccccgagg acacattctt cccaagtcct 1680
gagtccagct gcgacgtgaa actggtggaa aagagcttcg agacagacac caacctgaac 1740
ttccagaacc tgagcgtgat cggcttccgg atcctgctcc tgaaagtggc cggcttcaac 1800
ctgctgatga ccctgcgact gtggtccagc taa 1833
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 大范围核酸酶序列
<400> 121
Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly
1 5
<210> 122
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 大范围核酸酶序列
<400> 122
Gly Ile Tyr Tyr Ile Gly
1 5
<210> 123
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列 - 大范围核酸酶序列
<220>
<221> 变型
<222> 3
<223> Xaa = D 或 E
<220>
<221> 变型
<222> 4
<223> Xaa = 任何氨基酸
<400> 123
Pro Asp Xaa Xaa Lys
1 5

Claims (97)

1.一种结合蛋白，其包含T细胞受体(TCR)α链可变域(Vα)和TCRβ链可变域(Vβ)，其中：
(a)Vα包含SEQ ID NO:39或37中所示的CDR3氨基酸序列，并且Vβ任选地包含与SEQ IDNO:101或99所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列：
(b)Vβ包含SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:38所示的CDR3氨基酸序列，并且Vα任选地包含与SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；和/或
(c)Vα包含在SEQ ID NO:39或37所示的CDR3氨基酸序列，并且Vβ包含在SEQ ID NO:40或38所示的CDR3氨基酸序列，
其中结合蛋白能够特异性结合间皮素(Msln)肽：HLA复合物。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中：
(i)(a)、(b)和/或(c)的Vα包含与SEQ ID NO:102或100中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，条件是至少三个或四个CDR没有序列改变，其中确实有序列改变的CDR只有最多两个氨基酸取代、最多五个连续的氨基酸缺失或其组合；和/或
(ii)(a)、(b)和/或(c)的Vβ包含与SEQ ID NO:101或99中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，条件是至少三个或四个CDR没有序列改变，其中确实有序列改变的CDR只有最多两个氨基酸取代、最多五个连续的氨基酸缺失或其组合。
3.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，包括：
(a)SEQ ID NO:93所示的CDR1α氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:94所示的CDR2α氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:39所示的CDR3α氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:83所示的CDR1β氨基酸序列，任选地如SEQ ID NO:84所示，进一步任选地如SEQ ID NO:91所示；
(e)SEQ ID NO:92中所示的CDR2β氨基酸序列；和
(f)SEQ ID NO:40中所示的CDR3β氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的结合蛋白，其包含与由以下编码的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列：
(a)TRBJ2-3*01；
(b)TRAV21*01或TRAV21*02；
(c)TRBV5-4*01；
(d)TRAJ57*01；和/或
(e)TRBD1*01或TRBD2*02。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的结合蛋白，其中所述Vα包含与SEQ ID NO:102中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，并且其中所述Vβ包含与SEQ ID NO:101中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求5的结合蛋白，其中Vα包含或由SEQ ID NO:102中所示的氨基酸序列组成，并且其中Vβ包含或由SEQ ID NO:101中所示的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的结合蛋白，其包含TCRα链(TCRα)和TCRβ链(TCRβ)，其中所述TCRα包含与SEQ ID NO:110或29所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成，和/或其中TCRβ包含与SEQ ID NO:109或28所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
8.根据权利要求7的结合蛋白，其中TCRα包含或由SEQ ID NO:110或29中所示的氨基酸序列组成，并且其中TCRβ包含或由SEQ ID NO:109或28中所示的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求1或2的结合蛋白，包括：
(a)如SEQ ID NO:89所示的CDR1α氨基酸序列；
(b)如SEQ ID NO:90所示的CDR2α氨基酸序列；
(c)如SEQ ID NO:37所示的CDR3α氨基酸序列；
(d)如SEQ ID NO:83中所示的CDR1β氨基酸序列，任选地如SEQ ID NO:87中所示；
(e)如SEQ ID NO:88所示的CDR2β氨基酸序列；和
(f)如SEQ ID NO:38所示的CDR3β氨基酸序列。
10.根据权利要求1、2或9中任一项所述的结合蛋白，其包含与由以下各项编码的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列：
(a)TRBJ1-1*01或TRBJ2-3*01；
(b)TRAV4-1*01；
(c)TRAJ18*01；和/或
(d)TRBD1*01或TRBD2*02。
11.根据权利要求1、2、9或10中任一项所述的结合蛋白，其中所述Vα包含与SEQ ID NO:100中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和所述Vβ包含与SEQ IDNO:99中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。
12.根据权利要求11的结合蛋白，其中Vα包含或由SEQ ID NO:100中所示的氨基酸序列组成，并且其中Vβ包含或由SEQ ID NO:99中所示的氨基酸序列组成。
13.根据权利要求1、2或9-12中任一项所述的结合蛋白，包含TCRα链(TCRα)和TCRβ链(TCRβ)，其中所述TCRα包含具有至少与SEQ ID NO:108或23中所示的氨基酸序列具有约85％的同一性，和/或其中TCRβ包含与SEQ ID NO:107或22中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
14.根据权利要求13所述的结合蛋白，其中所述TCRα包含或由SEQ ID NO:108或23中所示的氨基酸序列组成，并且其中所述TCRβ包含或由SEQ ID NO:107或22所示的氨基酸序列组成。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够与SEQ IDNO:32：人白细胞抗原(HLA)复合物特异性结合。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的结合蛋白，其中所述HLA包含HLA-A*201。
17.根据权利要求15或16所述的结合蛋白，其中对SEQ ID NO:32的残基3、5、6或9中的任何一个或多个的丙氨酸诱变不消除或基本上不削弱所述结合蛋白与Msln肽：HLA复合物的结合。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合肽：HLA复合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:61中所示的共有氨基酸序列或由其组成。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的结合蛋白，其中对SEQ ID NO:32的残基1、5或9中的任何一个或多个的丙氨酸诱变不消除或基本上不削弱所述结合蛋白与Msln肽：HLA复合物的结合。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够结合肽：HLA复合物，其中所述肽包含SEQ ID NO:62中所示的共有氨基酸序列或由其组成。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白不结合或不特异性结合肽:HLA复合物，其中所述肽包含或由SEQ ID NO:63-77中任何一个或多个所示的氨基酸序列组成，并且其中HLA任选地是HLA-A：02*01。
22.一种结合蛋白，其包含T细胞受体(TCR)α-链可变域(Vα)和TCRβ-链可变域(Vβ)，其中：
(a)Vα包含SEQ ID NO:33或35中所示的CDR3氨基酸序列，并且Vβ任选地包含与SEQ IDNO:95或97所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；
(b)Vβ包含SEQ ID NO:34或36中所示的CDR3氨基酸序列，并且Vα任选地包含与SEQ IDNO:96或98所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列；和/或
(c)Vα包含SEQ ID NO:33或35所示的CDR3氨基酸序列，Vβ包含SEQ ID NO:40或38所示的CDR3氨基酸序列，
其中结合蛋白能够特异性结合间皮素(Msln)肽:HLA复合物。
23.根据权利要求22所述的结合蛋白，其中：
(i)(a)、(b)和/或(c)的Vα包含与SEQ ID NO:96或98中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，条件是至少三个或四个CDR没有序列改变，其中确实有序列改变的CDR只有最多两个氨基酸取代、最多五个连续的氨基酸缺失或其组合；和/或
(ii)(a)、(b)和/或(c)的Vβ包含与SEQ ID NO:95或97中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，条件是至少三个或四个CDR没有序列变化，其中确实有序列变化的CDR仅具有最多两个氨基酸取代、最多五个连续的氨基酸缺失或其组合。
24.根据权利要求22或23所述的结合蛋白，包括：
(a)SEQ ID NO:80所示的CDR1α氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:81或118中所示的CDR2α氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:33所示的CDR3α氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:83中所示的CDR1β氨基酸序列，任选地如SEQ ID NO:84中所示，进一步任选地如SEQ ID NO:78中所示；
(e)SEQ ID NO:79中所示的CDR2β氨基酸序列；和
(f)SEQ ID NO:34中所示的CDR3β氨基酸序列。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的结合蛋白，其包含与由以下各项编码的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列：
(a)TRBJ2-7*01或TRBJ2-3*01；
(b)TRAV1-1*01；
(c)TRBV12-4*01；
(d)TRAJ3*01；和/或
(e)TRBD1*01或TRBD2*02。
26.根据权利要求22-25中任一项的结合蛋白，其中Vα包含与SEQ ID NO:96中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，并且其中Vβ包含氨基与SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。
27.根据权利要求26的结合蛋白，其中Vα包含或由SEQ ID NO:96中所示的氨基酸序列组成，并且其中Vβ包含或由SEQ ID NO:95中所示的氨基酸序列组成。
28.根据权利要求22-27中任一项所述的结合蛋白，其包含TCRα链(TCRα)和TCRβ链(TCRβ)，其中所述TCRα包含与SEQ ID NO:104或7所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成，和/或其中TCRβ包含与SEQ ID NO:103或6中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
29.根据权利要求28所述的结合蛋白，其中所述TCRα包含或由SEQ ID NO:104或7中所示的氨基酸序列组成，并且其中所述TCRβ包含或由SEQ ID NO:103或106所示的氨基酸序列组成。
30.根据权利要求22或23所述的结合蛋白，其包含：
(a)SEQ ID NO:85所示的CDR1α氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:86或119中所示的CDR2α氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:35所示的CDR3α氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:83所示的CDR1β氨基酸序列，任选地如SEQ ID NO:84所示，进一步任选地如SEQ ID NO:82所示；
(e)SEQ ID NO:79中所示的CDR2β氨基酸序列；和
(f)SEQ ID NO:36中所示的CDR3β氨基酸序列。
31.根据权利要求22、23或30中任一项所述的结合蛋白，其包含与由以下各项编码的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列：
(a)TRBJ2-3*01；
(b)TRAV12-3*01；
(c)TRBV12-3*01；
(d)TRAJ29*01；和/或
(e)TRBD1*01或TRBD2*02。
32.根据权利要求22、23、30或31中任一项所述的结合蛋白，其中所述Vα包含与SEQ IDNO:98中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列，和所述Vβ包含与SEQ IDNO:97中所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。
33.根据权利要求32的结合蛋白，其中Vα包含或由SEQ ID NO:98中所示的氨基酸序列组成，并且其中Vβ包含或由SEQ ID NO:97中所示的氨基酸序列组成。
34.根据权利要求22、23或30-33中任一项所述的结合蛋白，包含TCRα链(TCRα)和TCRβ链(TCRβ)，其中所述TCRα包含具有至少与SEQ ID NO:106或15所示的氨基酸序列具有约85％的同一性，和/或其中TCRβ包含与SEQ ID NO:105或14所示的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列或由其组成。
35.根据权利要求34所述的结合蛋白，其中所述TCRα包含或由SEQ ID NO:106或15中所示的氨基酸序列组成，并且其中所述TCRβ包含或由SEQ ID NO:105或14所示的氨基酸序列组成。
36.根据权利要求22-35中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够与SEQ IDNO:31：人白细胞抗原(HLA)复合物特异性结合。
37.根据权利要求22-35中任一项所述的结合蛋白，其中所述HLA包含HLA-A*201。
38.根据权利要求1-35中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白是或包含TCR，其中所述TCR任选地是可溶的，TCR、scTCR或CAR的抗原结合片段。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白是人的、人源化的或嵌合的。
40.根据权利要求1-38中任一项所述的结合蛋白，其中在不存在或不依赖CD8的情况下，所述结合蛋白能够与间皮素:HLA复合物结合。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白具有约9μM、约8μM、约7μM、约6μM、约5μM、约4μM、约3μM、约2μM、约1μM、约0.9μM、约0.8μM、约0.7μM、约0.6μM、约0.5μM、约0.4μM、约0.3μM、约0.2μM或更少的Msln肽EC50。
42.一种组合物，其包含根据权利要求1-41中任一项的结合蛋白和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
43.一种编码根据权利要求1-41中任一项的结合蛋白的多核苷酸。
44.根据权利要求43所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是针对在宿主细胞中表达而优化的密码子，其中所述宿主细胞任选地为人免疫系统细胞，优选地为T细胞。
45.根据权利要求43或44的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:1-4、9-12、17-20、25和26的多核苷酸序列具有至少50％的同一性的多核苷酸。
46.根据权利要求43-45中任一项所述的多核苷酸，其包含与如下SEQ ID NO所示的多核苷酸序列具有至少约50％同一性的TCRα链编码多核苷酸和TCRβ链编码多核苷酸：
(i)1和3，分别地；
(ii)2和4，分别地；
(iii)9和11，分别地；
(iv)10和12，分别地；
(v)17和19，分别地；
(vi)18和20，分别地；或者
(vii)25和26，分别地。
47.根据权利要求43-46中任一项所述的多核苷酸，其包含编码位于TCRβ链编码多核苷酸和TCRα链编码多核苷酸之间的自切割肽的多核苷酸。
48.根据权利要求47所述的多核苷酸，其中所述编码的多核苷酸包SEQ ID NO:8、16、24和30中任一所示的氨基酸序列。
49.根据权利要求47或48的多核苷酸，其中编码结合蛋白的多核苷酸与SEQ ID NO:5、13、21、27和120中任一所示的多核苷酸序列具有至少约50％的同一性。
50.一种表达载体，包含可操作地连接至表达控制序列的根据权利要求43-49中任一项的多核苷酸。
51.根据权利要求50所述的表达载体，其中所述表达载体能够将所述多核苷酸递送至宿主细胞。
52.根据权利要求51的表达载体，其中宿主细胞是造血祖细胞或人免疫系统细胞。
53.根据权利要求52所述的表达载体，其中所述免疫系统细胞是CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、树突细胞或其任何组合。
54.根据权利要求53所述的表达载体，其中所述T细胞是幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、效应记忆T细胞或其任何组合。
55.根据权利要求50-54中任一项所述的表达载体，其中该表达载体是病毒载体。
56.根据权利要求55的表达载体，其中病毒载体是慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
57.一种包含根据权利要求43-49任一项的异源多核苷酸和/或根据权利要求50-56任一项的表达载体的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞能够在其细胞表面表达编码的结合蛋白。
58.根据权利要求57所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞是造血祖细胞或人免疫系统细胞。
59.根据权利要求58所述的重组宿主细胞，其中所述免疫系统细胞是CD4+ T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、树突细胞或其任何组合。
60.根据权利要求58或59所述的重组宿主细胞，其中所述免疫系统细胞是T细胞。
61.根据权利要求60所述的重组宿主细胞，其中所述T细胞是幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、效应记忆T细胞或其任何组合。
62.根据权利要求57-61中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是编码内源性TCR的T细胞或NK-T细胞，并且其中，如与内源性TCR相比，所述结合蛋白能够更有效地与CD3蛋白结合。
63.根据权利要求57-62中任一项所述的重组宿主细胞，其中当所述宿主细胞存在由所述结合蛋白结合的浓度为约10-2μM的Msln肽时，所述宿主细胞中的Nur77表达增加肽、约10-1μM肽、约1μM肽或约101μM肽，其中肽任选地由抗原呈递细胞呈递给宿主细胞。
64.根据权利要求57-63中任一项所述的重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞在与表达以下的细胞接触时不产生IFN-γ和/或不表现出活化和/或细胞毒活性：
(i)HLA-C6:02:01；
(ii)无HLA-B13:02:01的HLA-B13:01:01；
(iii)HLA-A3；
(iv)HLA-A29；
(v)HLA-B40；
(vi)HLA-B44；
(vii)HLA-C3；
(viii)HLA-C16；
(ix)HLA-A1；
(x)HLA-24；
(xi)HLA-B7；
(xii)HLA-B57；
(xiii)HLA-C7；
(xiv)HLA-A11；
(xv)HLA-B15；
(xvi)HLA-C4；
(xvii)HLA-C12；
(xviii)HLA-B8；
(xix)HLA-B49；
(xx)HLA-B51；
(xxi)HLA-C15；
(xxii)HLA-A30；
(xxiii)HLA-A68；
(xxiv)HLA-C2；
(xxv)HLA-A32；
(xxvi)HLA-A33；
(xxvii)HLA-B55；
(xxviii)HLA-C1；
(xxvix)HLA-C5；
(xxix)HLA-B8；
(xxx)HLA-B35；或者
(xxxi)(i)-(xxx)的任意组合，
前提是不存在由编码的结合蛋白结合的间皮素肽。
65.根据权利要求57-64中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是编码内源性TCR的T细胞或NK-T细胞，其中，由所述异源多核苷酸编码的结合蛋白与内源性TCR相比具有更高的细胞表面表达。
66.一种细胞组合物，包含根据权利要求57-65中任一项所述的重组宿主细胞和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
67.一种单位剂量，包含根据权利要求57-65任一项所述的重组宿主细胞或根据权利要求66所述的组合物。
68.一种治疗受试者中与间皮素表达和/或活性相关的疾病或病症的方法，该方法包括：
向受试者施用有效量的根据权利要求1-41任一项所述的结合蛋白、根据权利要求57-65中任一项所述的重组宿主细胞、根据权利要求66所述的组合物或根据权利要求67所述的单位剂量。
69.根据权利要求68所述的方法，与间皮素表达和/或活性相关的疾病或病症是过度增殖性疾病或增殖性疾病。
70.根据权利要求68或69所述的方法，其中与间皮素表达和/或活性相关的疾病或病症是癌症。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述癌症是实体癌或血液恶性肿瘤。
72.根据权利要求70或71所述的方法，其中所述癌症包括胆管癌、膀胱癌、骨和软组织癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠腺癌、结肠直肠癌、硬纤维瘤、胚胎癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、胃腺癌、多形性胶质母细胞瘤、妇科肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、原发性星形细胞癌肿瘤、原发性甲状腺癌、前列腺癌、肾癌、肾细胞癌、横纹肌肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、尿路上皮癌、子宫肉瘤或子宫癌。
73.根据权利要求70或71所述的方法，其中所述癌症包括胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、间皮瘤或肺癌。
74.根据权利要求68-73中任一项所述的方法，其中所述结合蛋白、宿主细胞、组合物，或单位剂量经肠胃外或静脉内施用。
75.根据权利要求68-74中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用多个剂量的所述结合蛋白、宿主细胞、组合物或单位剂量。
76.根据权利要求75所述的方法，其中以约两周至约四周的施用之间的间隔施用所述多个剂量。
77.根据权利要求68-76中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用细胞因子。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-21或其任何组合。
79.根据权利要求78中任一项所述的方法，其中所述受试者进一步接受或已经接受免疫检查点抑制剂、刺激性免疫检查点试剂的激动剂、放射疗法、抗体、抗体-药物偶联物、Fc融合蛋白、反义核苷酸疗法、基因疗法、疫苗、手术、化学疗法或其任何组合。
80.根据权利要求1-41中任一项所述的结合蛋白、根据权利要求42所述的组合物、根据权利要求43-49中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求50-56中任一项所述的表达载体、根据权利要求57-65中任一项所述的重组宿主细胞、根据权利要求66所述的细胞组合物或根据权利要求67所述的单位剂量，用于治疗以间皮素表达和/或活性为特征的疾病或病症。
81.根据权利要求1-41中任一项所述的结合蛋白、根据权利要求42所述的组合物、根据权利要求43-49中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求50-56中任一项所述的表达载体、根据权利要求57-65中任一项所述的重组宿主细胞、根据权利要求66中所述的细胞组合物或根据权利要求67所述的单位剂量，用于以间皮素表达和/或活性为特征的疾病或病症的过继免疫疗法。
82.根据权利要求1-41中任一项所述的结合蛋白、根据权利要求42所述的组合物、根据权利要求43-49中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求50-56中任一项所述的表达载体、根据权利要求57-65中任一项所述的重组宿主细胞、根据权利要求66所述的细胞组合物，或根据权利要求67所述的单位剂量，用于制备治疗以间皮素表达和/或活性为特征的疾病或病症的药物。
83.根据权利要求80-82中任一项使用的结合蛋白、组合物、多核苷酸、表达载体、重组宿主细胞、细胞组合物或单位剂量，其中以间皮素表达和/或活性为特征的疾病或病症是间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、其中Msln20-28肽在癌症的肿瘤细胞上表达的癌症、或其中Msln530-538肽在癌症的肿瘤细胞上表达的癌症。
84.根据权利要求80-83中任一项使用的结合蛋白、组合物、多核苷酸、表达载体、重组宿主细胞、细胞组合物或单位剂量，其中以间皮素表达和/或活性为特征的疾病或病症是胰腺癌癌症、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、间皮瘤或肺癌。
85.一种编码结合蛋白的分离的多核苷酸，所述结合蛋白能够与SEQ ID NO:32:HLA-A:02*01复合物特异性结合，其中所述多核苷酸包含或由SEQ ID NO:120所示的多核苷酸序列组成。
86.一种表达载体，包含与表达控制序列可操作地连接的根据权利要求85所述的多核苷酸。
87.根据权利要求86所述的表达载体，其中所述表达载体能够将所述多核苷酸递送至宿主细胞。
88.根据权利要求87的表达载体，其中所述宿主细胞是造血祖细胞或人免疫系统细胞。
89.根据权利要求88所述的表达载体，其中所述免疫系统细胞是CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、树突细胞或其任何组合。
90.根据权利要求89所述的表达载体，其中所述T细胞是幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、效应记忆T细胞或其任何组合。
91.根据权利要求86-90中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
92.根据权利要求91的表达载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
93.一种包含根据权利要求85所述的多核苷酸和/或根据权利要求86-92中任一项所述的表达载体的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞能够在其细胞表面上表达编码的结合蛋白。
94.根据权利要求83的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞是造血祖细胞或人免疫系统细胞。
95.根据权利要求94所述的重组宿主细胞，其中所述免疫系统细胞是CD4+ T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、树突细胞或其任何组合。
96.根据权利要求94或95的重组宿主细胞，其中所述免疫系统细胞是T细胞。
97.根据权利要求96所述的重组宿主细胞，其中所述T细胞是幼稚T细胞、中央记忆T细胞、干细胞记忆T细胞、效应记忆T细胞或其任何组合。
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