KR20180053744A - 면역 요법을 위한 flt3 유도된 car 세포 - Google Patents

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지안후아 유
마이클 칼리주리
스티븐 디바인
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사이토이뮨 테라퓨틱스 엘엘씨
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Abstract

종양 괴사 요법(tumor necrosis therapy) 관련 항원을 타겟으로 하는 CAR 세포는 암 치료의 새로운 방법으로 설명된다. FLT3 CAR 세포가 환자에게서 안전하고 효율적이며 인간 종양 및 암을 치료하는 데 사용될 수 있다고 제안된다.

Description

면역 요법을 위한 FLT3 유도된 CAR 세포
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 9월 23일자로 출원된 미국 가출원 번호 제 62/222,695호에 대해 35 U.S.C.§119(e) 하에서 우선권을 주장하며, 상기 출원은 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 인간 면역의 영역, 구체적으로 면역 요법에 관한 것이다.
배경 기술
본 발명의 배경에 대한 하기의 논의는 단지 본 발명을 기술적으로 돕기 위하여 제공된다.
2016년 미국 전역에서, 백혈병의 새로운 사례가 60,140 건 (모든 새로운 암(cancer) 사례의 3.5 %)일 것이며 이 질병으로 사망할 것으로 추산되는 사람이 24,400명 (모든 암 사망의 4.1 %)일 것이다. 백혈병은 백혈구를 포함하여 많은 종류의 세포들에서 시작되는 초기 혈액 형성 세포의 포괄적인 암이다. 그러므로, 백혈병은 많은 카테고리를 포함한다 : 급성 또는 만성; 골수 또는 임파선(2016). 백혈병의 상이한 종류는 상이한 치료 및 전망(outlook)을 갖는다. 화학요법 및 동종이형 조혈 줄기세포 이식(HSCT, hematological stem cell transplantation)이 백혈병에 성공적으로 적용되었다. 그러나, HSCT는 이식 관련 이환(morbitdity) 및 면역 거부로 인한 사망(mortality), 감염 및 GVHD(graft versus host disease) 에 의해 제한된다(Kenderian et al. (2016) Biol Blood Marrow Transplant pii:S1083-8791(16)30328-7, ePub (doi: 10.1016/j.bbmt.2016.09.002).) 화학요법은 또한 불응성 암(refractory cancer)을 초래한다. 그러므로, 새롭고 효과적인 요법의 개발이 절박하게 필요하다.
급성 골수성 백혈병(AML)은 조혈모세포(HSC) 또는 계통 특이적 전구 세포로부터 유래된 이종 클론성 질환(heterogeneous clonal disorder)이다. 14,590명의 사람이 2013년 미국에서 AML이라고 진단받은 것으로 추산되며, 10,370명이 AML으로 사망했다. Siegel et al. (2013) CA Cancer J Clin. 63(1):11-30을 참고하라. AML의 발생률은 연령에 따라 증가하며, 고령 환자(65세 이상)의 5년생존율은 10% 미만이다. Dores et al. (2012) Blood 119(1):34-43을 참고하라. 이 질병의 분자 및 유전적 복잡성에 대한 폭넓은 이해에도 불구하고, 동종 조혈줄기세포이식(HSCT)만이 임상 환자에게 상당한 개선을 제공했다. 그러나, 나이든 환자들은 HSCT에 적합하지 않을 수 있고, 이 방법은 또한 GVHD(graft-versus-host disease)와 같이 이환 및 사망으로 이어지는 합병증과 관련이 있다. 뿐만 아니라, FLT3 ITD(internal tandem duplication) 돌연변이를 갖는 환자들은 특히 불리한 예후와 높은 재발 가능성을 갖는다. 그러므로, AML의 치료를 위한 새로운 접근은 치료법적 요구가 충족되지 못한 것으로 보인다.
최근, 혈액 악성 종양(hematologic malignancies)의 세포 요법에 상당한 개선이 있었다. 혈액 악성 종양 치료의 한 가지 흥미로운 새로운 방법은 종양-관련(tumor-associated) 항원을 직접적으로 타겟으로 하는 CARs(chimeric antigen receptors)를 이용한 면역 세포의 유전적 변형을 포함한다. CAR T 세포는 ALL (acute lymphoblastic leukemia) 및 CLL(chronic lymphocytic leukemia)에 있어 CD19를 타겟팅하는 임상에서 성공적임이 증명되었다. 예를 들어, Porter et al. (2011) NJEM 365(8):725-733; Grupp et al. (2013) NJEM 368(16):1509-1518; Brentjens et al. (2013) Sci Transl Med. 5(177):177ra38; and Papapetrou et al. (2011) Nature Biotechnol. 29(1):73-78를 참고하라. 그러나, MM(multiple myeloma) 및 AML과 같은 CD19- 혈액 악성 종양의 치료를 위해 CAR 면역 세포에 의해 타겟이 될 수 있는 종양-관련 표면 항원을 동정하는 것은 매우 어려운 것으로 증명되었다.
백혈병에 대한 CAR T 세포의 보고는 화학 요법 및 HSCT 이후의 재발 및 불응성을 가지는 질병에 대한 실마리를 던졌다. CAR는 단일 클론 항체로부터 얻은 scFv(single chain variable fragment)를 면역 세포의 수용체에서 온 세포내 도메인에 통합(integrate)함으로써 얻어진다. CAR 조작된 T 세포는 세포독성(cytotoxic) T 림프구의 특이적 항종양 활성을 갖는 단일 클론 항체의 특이성을 이식하여 종양 표면 항원 인식 활성을 획득하며 유전적으로 변형된 T 세포가 공자극 분자 및 ITAM(immunorecepor tyrosine-based activation motif)의 협동 효과에 의해 활성화되면 특정 악성 종양을 살해한다(Grada et al. (2013) Molecular Therapy Nucleic Acids 2:e105). 그러나, 백혈병 환자의 CAR T 세포 치료는 사이토카인 폭풍(cytokine storm)으로 이어질 수 있다(Morgan et al. (2010) Mol Ther 18:843-851; Porter et al. (2011) NJEM 365:725-733.). CAR T 세포에 비하여, CAR NK(natural killer)세포는 동종이형 환경(allogenic settings)의 환자에게 있어서 GVHD(graft-versus-host disease)뿐만 아니라 사이토카인 폭풍, 종양 용해 증후군(tumor lysis syndrome)을 유도할 위험성이 낮을 수 있고, 이것은 CAR NK 세포가 클론 확장이 결핍되어 있기 때문이다(Han et al. (2015) Scientific Reports 5:11483; Uherek et al. (2002) Blood 100:1265-1273). 성공적인 CAR NK 세포의 적용에 있어서 가장 중요한 것은 타겟이 될 수 있는 적절한 세포 표면 항원을 찾는 것이다. FLT3(FMS-like tyrosine kinase 3)은 백혈병 발달 과정에서 그 돌연변이가 수용체의 리간드-비의존적 활성화 및 다운스트림 시그널링 경로의 활성화를 일으키기 때문에 정상적으로는 낮은 농도를 유지하는 반면, 백혈병, 특히 급성 골수성 백혈병(AML)에서 고도로 발현되는 표면 단백질이다(Lagunas-Rangelet al. (2016) Hematol Oncol. ePub (doi:10.1002/hon.2330).
CD19-CAR는 AML 세포가 CD19의 표면 발현을 갖지 않기 때문에 AML의 치료로 사용될 수 없다. CD33, CD44v6, LeY, 및CD123은 AML 치료를 위한 CAR T 세포의 타겟이 되는 AML-관련 항원으로 제시되어 왔다. 예를 들어, Dinndorf et al. (1986) Blood 67(4):1048-1053; Griffin et al. (1984) Leuk Res. 8(4):521-534; Casucci et al. (2013) Blood. 122(20):3461-3472; Peinert et al. (2010) Gene Therapy 17(5):678-686를 참고하라. 그러나, 전임상 또는 임상 연구는 이 마커들이 조혈 줄기/전구 세포, 골수 세포 및 다른 성숙 세포와 같은 정상 세포에 광범위하게 발현되기 때문에, 그들이 종양 제거에 비효율적이거나 정상 세포의 파괴 때문에 매우 독성이 강하다는 것을 나타냈다. 예를 들어, Hernandez-Caselles et al. (2006) J. Leukocyte Biol. 79(1):46-58; Ritchie et al. (2013) Molecular Therapy 21(11):2122-2129; Gill et al. (2014) Blood. 123(15):2343-2354를 참고하라. 특히, CD33(SIGLEC-3)은 AML 환자 85% 내지 90%에서의 백혈병 모세포(leukemic blast)에서 발현된다. 예를 들어, Dinndorf et al. (1986) and Griffin et al. (1984)을 참고하라. 그러나, CD33은 T 세포 및 NK 세포의 하위 집합에서 발현되며, 골수 세포 및 장기(long-term) 정상 HSC에서 광범위하게 발현된다. Hernandez-Caselles et al. (2006)을 참고하라.
HSC에 존재하지 않는 CD44v6도 CAR T 세포의 타겟이 되었다; 그러나, 이것은 활성화된 T세포, 단핵 세포 및 케라틴 생성 세포(keratinocyte)에서 발현되며, CD44v6의 주입은 단핵구 감소증(monocytopenia)으로 이어졌다. LeY 또한 AML 치료를 위해 CAR T 세포의 타겟이 되었으나, 임상 데이터는 가능성 있는 결과를 나타내지 않았다. 예를 들어, Peinert et al. (2010) 및 Ritchie et al. (2013)를 참조하라. 최근, 다양한 군으로부터의 전임상 연구는 CD123-CAR T 세포가 효과적으로 AML을 제거한다는 것을 증명했으나, 이 CAR T 세포들은 또한 심한 골수억제(myeloablation)를 유도하였으며 최근의 임상 데이터는 이들이 고도로 독성임을 나타냈고, 이것은 아마도 CD123은 정상 HSC, 다양한 성숙 면역 세포, 심지어 내피세포(endothelial cell)에서도 발현된다는 사실 때문일 것이다. 예를 들어, Gill et al. (2014); Tettamanti et al. Oncoimmunol. 3:e28835 (2014); Pizzitola et al (2014) Leukemia 28(8):1596-1605; Mardiros et al. (2013) Blood 122(18):3138-3148; Tettamanti et al. (2013) British Journal of Haematol. 161(3):389-401; Ehninger et al. (2014) Blood Cancer Journal. 4:e218; Gilliet et al. (2004) Archives of Dermatol. 140(12):1490-1495 를 참고하라.
이 연구들은 AML에서 CAR 면역 세포에 의해 안전하게 타겟이 될 수 있는 이상적인 종양 항원이 아직 동정되지 않았음을 나타낸다. AML 치료를 위한 AML 종양-관련 항원을 타겟으로 하는 새로운 CAR 접근은 환자 생존 및 AML 재발 예방을 증진할 수 있는 가능성을 갖는다.
요약
본원의 한 실시 양태는 (a) FLT3 항체의 항원 결합 도메인; (b) 힌지 도메인; (c) 막 관통 도메인; 및 (d) 세포내 도메인을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor)에 관한 것이다. 본원의 추가적인 실시 양태는 (a) FLT3 항체의 항원 결합 도메인; (b) 힌지 도메인; (c) CD28 막 관통 도메인; (d) CD28 공자극 시그널링 영역, 4-1BB 공자극 시그널링 영역, ICOS 공자극 시그널링 영역, 및 OX40 공자극 영역;중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 공자극 영역, 및 (e) CD3 제타 시그널링 도메인을 포함하는 CAR에 관한 것이다.
특정 구현예에서, FLT3 항체의 항원 결합 도메인은 FLT3 중쇄 가변 영역 및 FLT3 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 포함한다.
일부 구현예에서, FLT3 중쇄 가변 영역은 서열번호 21 내지 23, 서열번호 29 내지 31, 또는 그 각각의 등가물을 포함하는 CDR 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 포함한다. 일부 구현예에서, FLT3 중쇄 가변 영역은 서열번호 19, 서열번호 27, 또는 그 각각의 등가물 중 어느 하나에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 포함한다.
일부 구현예에서, FLT3 경쇄 가변 영역은 서열번호 24 내지 26, 서열번호 32 내지 34, 또는 그 각각의 등가물을 포함하는 CDR 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, FLT3 경쇄 가변 영역은 서열번호 20, 서열번호 28, 또는 그 각각의 등가물 중 어느 하나에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 포함한다.
특정 구현예에서, CAR는 FLT3 중쇄 가변 영역 및 FLT 경쇄 가변 영역 사이에 위치한 링커 폴리펩티드를 추가로 포함하거나, 대안으로 추가로 구성된다. 특정 구현예에서, 링커는 글리신(glycine)-세린(serine)링커다. 추가적인 구현예에서, 링커 폴리펩티드는 글리신 및 세린 서열, 예를 들어, (G4S)n으로 표시하기도 하며 상기 n은 1,2,3,4,5 또는 6과 같은 1부터 6까지의 정수로, (GGGGS)n 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 포함한다.
특정 구현예에서, CAR는 CAR에 부착된 검출 가능한 마커 또는 정제 마커(purification marker)를 추가로 더 포함하거나, 또는 대안으로 추가로 구성된다.
본원의 추가적인 실시 양태는 상기 설명한 CAR를 코딩하는 분리된 핵산 서열, 또는 그의 상보적 서열(complement), 또는 그들 각각의 등가물에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 분리된 핵산 서열은 FLT3 항체의 FLT3 항원 결합 도메인의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림(upstream)에 위치한 폴리뉴클레오티드 프로모터 서열을 추가로 더 포함하거나, 또는 추가로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 또 필수적으로 구성된다.
특정 구현예에서, 분리된 핵산 서열은 FLT3 항체의 FLT3 항원 결합 도메인의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림 또는 다운스트림(downstream)에 위치하는 폴리뉴클레오티드 시퀀스를 코딩하는 iCasp(inducible caspase) 또는 다른 “자살 유전자(suicide gene)”을 추가로 더 포함하거나, 또는 추가로 필수적으로 구성되거나, 또는 또 추가로 구성된다.
특정 실시 양태에서, 분리된 핵산 서열은 FLT3 항체의 FLT3 항원 결합 도메인의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림 또는 다운스트림에 위치한 2A 펩티드(T2A) 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 더 포함하거나, 추가로 필수적으로 구성되거나, 또는 또 추가로 구성된다.
특정 구현예에서, 분리된 핵산 서열은 FLT3 항체의 FLT3 항원 결합 도메인의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림에 위치한 시그널 펩티드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 더 포함하거나, 추가로 필수적으로 구성되거나, 또는 또 추가로 구성된다.
특정 실시 양태에서, 분리된 핵산 서열은 분리된 핵산 서열에 작동 가능하게 결합된 항생제 저항성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 더 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 포함한다.
본원의 실시 양태는 상기 설명한 분리된 핵산을 하나 또는 그 이상 포함하는 벡터에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 벡터는 플라스미드 또는 레트로바이러스성 벡터, 렌티바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 및 아데노-관련(adeno-associated) 바이러스성 벡터로 이루어진 군 중에서 선택된 바이러스성 벡터이다. 분리된 핵산 서열 및 그들을 포함하는 벡터는 본원에서 설명한 것과 같은 CAR를 제조하는 데 유용하다.
본원의 추가적인 실시 양태는 상기 설명한 조성물인 FLT3 CAR, CAR를 코딩하는 분리된 핵산 또는 이의 보체, 또는 분리된 핵산을 포함하는 벡터의 하나 또는 그 이상을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 포함하는 분리된 세포에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 분리된 세포는 박테리아 세포, 예를 들어 E.coli 와 같은 원핵세포, 또는 진핵세포일 수 있다. 특정 구현예에서 분리된 진핵세포는 동물 세포, 포유류 세포, 소(bovine) 세포, 고양이(feline) 세포, 개(canine) 세포, 쥐(murine) 세포, 말(equine) 세포 또는 인간 세포로부터 선택된 것이다. 추가적인 구현예에서, 분리된 세포는 면역세포이다. 또 다른 구현예에서, 분리된 면역세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상(dendritic) 세포, 골수(myeloid)세포, 또는 임의의 다른 면역세포이다.
본원의 실시 양태는 예를 들어, CAR, 분리된 핵산, 세포, 또는 벡터 및 담체(carrier)와 같은 상기 설명한 조성물을 하나 또는 그 이상 포함하거나, 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가적으로 더 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본원의 실시 양태는 CAR 또는 FLT3 또는 그의 단편(fragment)에 결합한 CAR를 포함하는 세포, 및/또는 FLT3 관련 항원을 발현하는 세포를 포함하는 분리된 복합체에 관한 것이다. 한 실시 양태에서, 항원 결합 도메인은 세포 표면에 발현된다. 다른 실시 양태에서, FLT3 관련 항원은 암/종양에서 발현된다. 암의 비제한적 실시예는 급성 골수성 백혈병이다. 한 실시 양태에서 FLT3 CAR를 포함하거나 발현하는 세포는 면역세포이다. 추가적인 실시 양태에서, FLT3 CAR를 포함하거나 발현하는 세포는 NK 세포, B 세포, T 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 또는 임의의 다른 면역세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 유전적 또는 다른 방법으로 변형된 것일 수 있다. 예를 들어, T세포는 환자의 동종이형 T 세포로 사용되기 위하여 변형된 T 세포 수용체(TCRs)를 포함할 수 있다.
본원의 실시 양태 일부는 본원에 설명된 CAR를 코딩하는 핵산 서열로 분리된 세포를 형질도입(transduce)시키는 것을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 포함하는, FLT3 CAR 발현 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
추가적인 실시 양태에서, 상기 방법은 CAR를 발현하는 세포를 선별 및 분리하는 것을 추가로 더 포함한다. 추가적인 실시 양태에서, 세포는 포유류 세포, 예를 들어 면역 세포와 같은 인간 세포인 진핵세포일 수 있다 - 비제한적 실시예는 NK 세포, B 세포, T 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 또는 임의의 다른 면역세포를 포함한다. 세포는 본원에서 설명한 것과 같은 바이러스성 벡터를 이용하여 형질도입되거나, 또는, Riet et al. (2013) Meth. Mol. Biol. 969:187-201의 “Nonviral RNA transfection to transiently modify T cell with chimeric antigen receptors for adoptive therapy.”에 설명된 기술을 대안으로 이용하여 형질도입될 수 있다.
특정 구현예에서, FLT3 CAR 발현 세포를 제조하는 방법은 FLT3 CAR 발현 세포의 개체군(population)을 활성화 및 증식시키는 것을 추가로 더 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 구성된다. 본원의 특정 실시 양태는 FLT3 CAR를 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 또 추가로 구성되는, 분리되어 활성화된 세포의 개체군에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 세포들은 면역 세포들이다. 추가적인 구현예에서, 면역 세포는 NK 세포, B 세포, T 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 또는 임의의 다른 면역 세포 중에서 하나 또는 그 이상일 수 있다.
본원의 실시 양태는, 상기 개시된 조성물 또는 분리된 세포의 유효량을 종양/암과 접촉시킴으로써, FLT3을 발현하는 종양/암의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 접촉은 in vitro 또는 in vivo 일 수 있다. 접촉이 in vitro일 때, 상기 방법은 환자의 종양/암에 대한 개인화된 요법을 테스트하거나 병용 요법을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 접촉이 in vivo일 때, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에서 종양/암의 성장을 억제하는 데 유용하며, 환자는 유효량의 세포를 수용한다. 특정 구현예에서, 타겟이 되는 종양/암은 혈액 및/또는 골수에 영향을 미치는 암이다. 특정 구현예에서, 분리된 세포는 치료 대상의 자가 유래인(autologous) 것이다. 다른 실시 양태에서, 상기 방법은 예를 들어 화학 요법, 방사선 요법, 및/또는 종양분해성 바이러스 요법(oncolytic viral therapy) 과 같은 종양 축소 요법(cytoreductive therapy)의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하거나, 또는 필수적으로 구성되거나, 또 추가적으로 구성된다. 추가적인 실시 양태에서, 상기 방법은 대상에게 투여될 세포를 분리하는 단계, 상기 세포를 본원에 설명된 유효량의 CAR를 코딩하는 분리된 핵산으로 형질도입하는 단계, 세포를 배양하여 CAR 코딩 세포의 개체군을 얻어 선택적(옵션)으로 이를 확장 및 활성화하여 상기 세포를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 더 포함한다.
또한 본원의 개시 내용은 상기 기재된 하나 또는 그 이상의 조성물 및 본원의 개시 내용과 같은 방법에서의 그것들을 사용하기 위한 설명을 포함하는 키트이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 CAR 벡터 구조의 비제한적 실시예의 개략도이다.
도 2A 내지 2F는 급성 골수성 백혈병 세포주의 세포 표면 FLT3 발현에 대한 유세포 분석을 나타낸다. 모든 그래프에서, x축은 FLT3에 대한 결합 항체의 형광 강도에 기반한 FLT3 표면 발현을 나타내며, y축은 세포 수를 나타낸다. 도 2A 내지 2D는 증진된 FLT3 표면 발현에 양성인 반면, 도 2E 내지 2F는 동종(isotype) 대조군에 비해 FLT3 발현이 크지 않은 것으로 증명되었다.
도 3은 AML MOLM-13 세포의 용해에 대한 표준 4 시간 크롬 방출 분석 결과를 나타낸다; 빈 벡터 대조군 및 CD19 CAR T 세포는 AML 세포의 용해를 나타내지 않은 반면, FLT3-1(CAR 1) 및 FLT3(CAR2)로 제조된 FLT3 CAR T 세포는 AML 세포의 제거를 급격히 증진시키는 것으로 나타났다.
도 4A 내지 4C는 FLT3-CAR를 발현하는 T 세포 발생(generation)을 도시한 것이다. (도 4A) FLT3 CAR 렌티바이러스 구조를 개략적으로 나타낸 것이다. iCasp9, 유도성 카스파제(caspase)9; T2A, 자가-절단하는(self-cleaving) 2A 유전자; SP, 시그널 펩티드(signal peptide); VH, 가변 H 쇄(variable H chain); L, 링커(linker); VL, 가변 L 쇄(variable L chain); MyC, MyC 유전자 서열; Hinge, 힌지 쇄; CD28, CD3ζ, 공자극 도메인. (도 4B) 1차 T(Primary T), 1차 T-EV, 1차 T-FLT3 세포들이 바이오틴-표지된 염소 항-마우스(goat anti-mouse) Fab-특이적 또는 IgG 대조군으로 염색된 후 유세포 분석된 것이다. (도 4C) 항- CD3ζ 면역블로팅은 1차 T 및 FLT3-CAR 구조체(Primary T-FLT3) 또는 빈 벡터 구조체(EV) 로 형질도입된 1차 T세포 표면의 키메릭 FLT3 scFv의 발현을 나타냈다.
도 5A 내지 5C는 FLT3+ 백혈병 세포의 인식이 대조군 T 세포에 비해 FLT3-CAR T 세포의 강한 반응을 유도한다는 것을 나타낸다. (도 5A) 항-FLT3으로 세포들이 염색된 후 백혈병 세포주 표면에서 FLT3 발현을 유세포 분석한 것이다. (도5B) MOLM-13, EOL-1 또는 U-937의 존재 또는 부존재 하에 Indirect ELISA 분석으로 1차 T, FLT3-CAR 구조(T-FLT3) 또는 빈 벡터로 형질도입된 T 세포(T-EV)의 IFN-γ 분비를 분석한 것이다. (도 5C) Real-time PCR은 1차 T, 1차 T-EV 및 1차 T-FLT3의 IFN-γ 방출을 나타낸다. 대조군은 타겟 세포와 공동배양하지 않았다는 것을 의미한다.
도 6A 내지 도 6B는 FLT3-CAR T 세포가 환자의 1차 인간 백혈병 세포의 제거를 증진한다는 것을 나타낸다. (도 6A) Indirect ELISA 분석으로 환자 및 정상 대조군으로부터 분리한 PBMC(peripheral blood mononuclear cells)와 공동배양한 후 1차 T세포 및 FLT3-CAR 구조체(T-FLT3) 또는 빈 벡터 구조체(T-EV)로 형질도입한 1차 T세포에서 IFN-γ 및 IL-2 분비를 분석한 것이다. T-FLT3은 FLT3+ 환자 백혈병 세포의 존재 하에 강한 반응을 유도한다. (도 6B) T세포와 타겟 PBMC의 공동배양으로부터 전체 RNA를 추출한 후 Q-PCR을 수행하고 역전사는 환자 및 정상 인간으로부터 유래한 PBMC의 존재 하에 1차 T, 1차 T-EV 및 1차 T-FLT3의 IFN-γ 분비를 나타냈다. 대조군은 타겟 PBMC와 공동배양하지 않았다는 것을 의미한다.
도 7A 내지 7B는 FLT3-CAR T 세포가 in vivo에서 백혈병을 억제하고 백혈병 보유 마우스의 생존을 연장한 것을 나타낸다. (도 7A) 백혈병 보유 마우스의 복부 및 등 부위(dorsal) 생물 발광 이미징이다. NSG 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 루시퍼라제(luciferase) 발현 백혈병 세포를 접종하였다(0일차). 접종 후 9일차 및 16일차에, 마우스의 꼬리 정맥에 빈 벡터-형질도입 T세포(모의 T세포, PCDH 벡터), FLT3-CAR-형질도입 1차 T 세포(T-FLT3, CAR) 또는 PBS를 한 번 주입하였다. (도 7B) Kaplan-Meier 생존 곡선(각 군마다 n = 5)에 의해 결정된 것처럼, T-FLT3-CAR 세포로 처리된 백혈병 보유 마우스는 1차 T 세포 또는 1차 T-PCDH로 처리한 마우스에 비해 상당한 생존 증가를 나타냈다(** p < 0.01),
도 8A 내지 8C는 FLT3-CAR의 생성 및 이의 CAR-형질도입된 NK 세포에서의 발현 테스트를 도시한 것이다. (도 8A) FLT3 CAR 렌티바이러스 구조를 개략적으로 나타낸 것이다. iCasp9, 유도성 카스파제(caspase)9; T2A, 자가-절단하는(self-cleaving) 2A 유전자; SP, 시그널 펩티드(signal peptide); VH, 가변 H 쇄(variable H chain); L, 링커(linker); VL, 가변 L 쇄(variable L chain); MyC, MyC 유전자 서열; Hinge, 힌지 쇄; CD28, CD3ζ, 공자극 도메인. (도 8B) NK-92 및 FLT3-CAR 구조(NK-92-FLT3-CAR) 또는 빈 벡터 구조(EV)로 형질도입한 NK-92 세포의 표면에서 키메릭 FLT3 scFv의 발현이다. (도 8C) NK-92, NK-92-EV, NK-92-FLT3 세포들을 바이오틴-표지된 염소 항-마우스 Fab 특이적 또는IgG 대조군으로 염색하여 유세포 분석하였다.
도 9A 내지 9D는 FLT3-CAR-NK-92 세포들이 FLT3+ 백혈구 세포주를 인식하고 살해를 촉진하는 것을 나타낸다. (도 9A) 백혈구 세포주 표면의 FLT3 발현의 유세포 분석이다. (도 9B) 크롬-51 방출 분석을 이용한 MOLM-13, EOL-1 또는 U937 세포에 대한 EV(empty vector)-형질도입 또는 FLT3-CAR-형질도입 NK-92 세포의 세포독성 활성이다. (도 9C) ELISA 분석을 이용해 MOLM-13, EOL-1 또는 U937 세포의 존재 또는 부존재 하에, NK-92 세포 또는 FLT3-CAR 구조체(NK-92-FLT3-CAR) 또는 빈 벡터 구조체(EV)로 형질도입시킨 NK-92 세포의 IFN-γ 분비를 분석한 것이다. (도 9D) Q-PCR로 MOLM-13, U937의 존재 및 대조군에서 NK-92, NK92-EV 및 NK92-FLT3의 IFN-γ 분비를 나타낸다.
도 10A 내지 10C는 FLT3-CAR-NK-92 세포가 환자의 1차 인간 백혈구 세포 살해를 증진시킨다는 것을 나타낸다. (도 10A) 크롬-51 방출 분석을 이용한 환자의 백혈구 세포에 대한 EV(empty vector)-형질도입 또는 FLT3-CAR-형질도입 NK-92 세포의 세포독성 활성이다. (도 10B) ELISA 분석으로 환자 백혈병 세포 또는 정상 대조군의 PBMC에서 NK-92, FLT3-CAR 구조체 또는 빈 벡터 구조체로 형질도입한 NK-92 세포의 IFN-γ 분비를 분석한 것이다. (도 10C) 환자 백혈병 세포 및 대조군에서 NK-92, NK92-EV 및 NK92-FLT3의 IFN-γ 방출을 Q-PCR로 나타낸 것이다.
도 11A 내지 도 11B는 FLT3-CAR로 형질도입한 1차 NK가 환자의 종양 세포 및 백혈병 세포주 살해를 효율적으로 증진시킨다는 것을 나타낸다. (도 11A) in vitro에서 1차 NK-FLT3 CAR 세포는 FLT3+ 백혈병 세포주 MOLM13을 살해한다. (도 11B) 1차 NK-FLT3 CAR 세포는 환자의 종양 세포를 살해한다.
도 12A 내지 도 12D는 AP1903(약제)이 iCasp9로 NK92-FLT3의 아폽토시스(apoptosis)를 효율적으로 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. (도 12A) NK-92-FLT3-형질도입 세포에서의 iCasp9 발현이다. (도 12B) AP1903 처리는 유도 48시간 이후 NK-92-FLT3의 세포사멸을 유도한다. (도 12C) AP1903 처리 이후 NK92-FLT3의 상당한 아폽토시스를 나타내는 유세포 계측 Annexin V 분석(Flow cytometry Annexin V analysis)이다. (도 12D) AP1903(약제) 처리 이후 NK-92-FLT3의 절단된 카스파제-3(cleaved caspase-3)의 증가를 나타내는 면역블로팅 분석이다.
도 13은 NK-92-FLT3-CAR 세포가 in vivo에서 백혈병의 성장을 억제하고, 백혈병 보유 마우스의 생존을 연장한다는 것을 나타낸다. 백혈병 보유 마우스의 두뇌 생물 발광 이미징이다. 꼬리 정맥 주사를 통해 NSG 마우스에 루시퍼라제-발현 백혈병 세포를 접종하였다(0일차). 접종 7일 후, 마우스의 꼬리 정맥에 빈 벡터-형질도입 NK92세포(NK-92-EV), FLT3-CAR-형질도입 NK-92 세포(NK-92-FLT3) 또는 NK-92 세포를 한 번 주입하였다.
도 14는 환자로부터 분리한 AML 세포 표면의 FLT3 발현의 유세포 분석을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본원은 설명된 특정 실시 양태에 한정되지 않으며, 당연히 다양할 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 측면을 설명하기 위한 것이며, 본원의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되므로, 한정하려는 것이 아님이 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 기술이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 설명된 것과 유사 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 기술의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있으나, 본원에서 바람직한 방법, 장치 및 재료를 설명한다. 본원에 인용된 모든 기술 및 특허 공보는 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다. 본원의 어떠한 내용도 본 발명이 선행발명에 의한 개시보다 앞서지 않는다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 범위 내에 있는 조직배양, 면역학, 분자생물학, 미생물학, 세포생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 예를 들어, Green and Sambrook eds. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition; the series Ausubel et al. eds. (2015) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (2015) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; McPherson et al. (2006) PCR: The Basics (Garland Science); Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Greenfield ed. (2014) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2010) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 6th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; 미국특허 제4,683,195호; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Herdewijn ed. (2005) Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Buzdin and Lukyanov ed. (2007) Nucleic Acids Hybridization: Modern Applications; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Grandi ed. (2007) In Vitro Transcription and Translation Protocols, 2nd edition; Guisan ed. (2006) Immobilization of Enzymes and Cells; Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition; Miller and Calos eds, (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Lundblad and Macdonald eds. (2010) Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 4th edition; 및 Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th edition를 참고하라.
범위를 포함하는 pH, 온도 시간, 농도, 및 분자량과 같은 모든 수치 표기는, 적절하게 1.0 또는 0.1의 증가량에 의해 (+) 또는 (-), 또는 대안으로 +/- 15%, 또는 대안으로 10%, 또는 대안으로 5%, 또는 대안으로 2%의 편차만큼 변동될 수 있다. 항상 명확하게 언급되지 않더라도, 모든 수치 표기에는 “약”이라는 용어가 선행된다는 것이 이해될 것이다. 또한 항상 언급되지는 않았으나, 본원에 기재된 반응물은 단지 예시적인 것이며, 그들의 균등물은 당업계에 잘 알려져 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 기술이 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 항체와 관련된 경우, 본 기술의 범위 내에 그의 등가물(equivalent) 또는 생물학적 등가물이 의도된다는 것이 다른 의도가 없는 한 명확한 설명 없이도 추론된다.
정의
본 명세서 및 청구항에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 “하나(a)”, “하나(an)” 및 “그(the)”는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수 기준을 포함한다. 예를 들어, “세포(a cell)”라는 용어는 그의 혼합물을 포함하는 복수의 세포를 포함한다.
본원에 사용된 용어 “동물(animal)”은 예를 들어, 포유류 및 조류를 포함하는 카테고리인 살아있는 다세포 척추 동물을 지칭한다. 용어 “포유류(mammal)”는 인간 및 비인간 포유류 모두를 포함한다.
용어 “대상(subject)", “숙주(host)”, “개체(individual)” 및 “환자(patient)”는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 인간 및 수의적 대상(veterinary subject), 예를 들어, 인간, 동물, 비인간 영장류, 개, 고양이, 양, 쥐, 말, 및 소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상은 인간이다.
본원에 사용된 용어 "항체" 는 집합적으로, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 그들의 조합, 및 임의의 척추동물, 예를 들어 인간, 염소, 토끼, 및 마우스 뿐만 아니라 상어 면역글로불린과 같은 비포유류 종에서 면역반응 동안 생산되는 유사한 분자를 예시로서 포함하며 이에 한정되지 않는, 면역글로불린 또는 면역글로불린 유사 분자를 지칭한다. 달리 기재하지 않는 한, 용어 "항체"는 손상되지 않은(intact) 면역글로불린 및, 다른 분자와의 결합을 실질적으로 배제하기 위해 관심 분자(또는 관심 분자와 고도로 유사한 군)에 특이적으로 결합하는 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편" (예를 들어, 생물학적 샘플에서 관심 분자에 대한 결합 상수가 다른 분자에 대한 결합 상수보다 적어도 103 M-1 큰, 적어도 104 M-1 큰 또는 적어도 105 M-1 큰 항체 또는 항체 단편) 을 포함한다. 용어 "항체"는 또한 키메릭 항체(예를 들어, 뮤린(murine) 또는 인간화된 비영장류 항체), (이중특이적(bispecific) 항체와 같은) 이성접합체(heteroconjugate) 항체와 같은 유전적으로 조작된 형태를 포함한다. Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Owen et al., Kuby Immunology, 7th Ed., W.H. Freeman & Co., 2013; Murphy, Janeway's Immunobiology, 8th Ed., Garland Science, 2014; Male et al., Immunology (Roitt), 8th Ed., Saunders, 2012; Parham, The Immune System, 4th Ed., Garland Science, 2014 또한 참고하라.
본원에 사용된 용어 “단일클론 항체(monoclonal antibody)”는 B-림프구의 단일클론 또는 단일 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자가 형질도입된 세포에 의해 생성된 항체를 말한다. 단일클론 항체는 당업자에게 알려진 방법을 통해, 예를 들어 면역 비장 세포(spleen cell)와 골수종(myeloma) 세포의 융합으로 하이브리드 항체 형성 세포를 제조함으로써 제조될 수 있다. 단일클론 항체는 인간화된 단일클론 항체를 포함한다.
항체 구조의 관점에서, 면역글로불린은 다이설파이드 결합에 의해 연결된 중쇄(H) 및 경쇄(L)를 갖는다. 경쇄에는 λ(lambda) 및 κ(kappa) 두 종류가 있다. 항체분자의 기능적 활성을 결정하는 다섯 개의 주요 중쇄 클래스(또는 동종(isotype))로 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE가 있다. 각 중쇄 및 경쇄는 불변 영역(constant region) 및 가변 영역(variable region)을 포함한다(영역은 또한 “도메인”으로 알려져 있다). 조합하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 항원에 특이적으로 결합한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 3개의 초 가변(hypervariable), “상보성 결정 영역(complementarity-determining regions)”또는 “CDRs” 라고도 불리는 영역이 삽입되는 “프레임워크”영역을 포함한다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위는 정의되어 왔다(본원에 참고로 포함되는 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991를 참고하라). Kabat 데이터베이스는 현재 온라인에 유지되어 있다. 상이한 경쇄 또는 중쇄 프레임워크 영역의 서열은 종(species) 내에 비교적 보존되어 있다. 구성요소인 경쇄 및 중쇄의 프레임워크 영역이 결합한 항체의 프레임워크 영역은 주로 β-시트 구조를 채택하며, CDR은 β-시트를 연결하는 루프를 형성하고 어떤 경우에는 β-시트의 일부를 형성한다. 그러므로, 프레임워크 영역은 쇄 간(inter-chain), 비공유결합 상호작용에 의해 CDR을 정확한 배향으로 포지셔닝하는 것을 제공하는 스캐폴드를 형성하도록 작용한다.
CDR은 주로 항원의 에피토프에 결합하는 역할을 한다. 각 쇄의 CDR은 전형적으로 N 말단에서 시작하여 차례로 번호를 붙인 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭되며, 또한 일반적으로 특정 CDR이 위치한 쇄에 의해 식별된다(중쇄 영역은 CDHR, 경쇄 영역은 CDLR이라 한다). 그러므로, CDLR1은 그 항체의 경쇄 가변 도메인에 있는 CDR1인 반면, CDHR3은 그 항체의 중쇄 가변 도메인에 있는 CDR3이다. FLT3 항체는 FLT3 관련 항원에 고유한 특이적 VH 영역 및 VL 영역 서열을 가질 것이며, 그러므로 특이적인 CDR 서열을 가질 것이다. 상이한 특이성(즉, 상이한 항원에 대한 상이한 결합 부위)을 갖는 항체는 상이한 CDR을 갖는다. 비록 항체마다 다양한 CDR이 있지만, CDR 내의 한정된 수의 아미노산 위치만이 항원 결합에 직접 관련되어 있다. CDR내의 이 위치를 SDRs(specificity determining residues)라고 부른다.
본원에 사용된 용어 “항원(antigen)”은 항체 분자 또는 T세포 수용체와 같은 특정 체액성(humoral) 또는 세포성 면역의 생성물에 특이적으로 결합될 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질을 지칭한다. 항원은 예를 들어, 복합 탄수화물(complex carbohydrates)(예를 들어, 폴리사카라이드), 인지질(phospholipids), 및 단백질 뿐만 아니라, 합텐(haptens), 단순 중간대사산물, 당(예를 들어, 올리고사카라이드), 지질, 및 호르몬과 같은 임의의 종류의 분자일 수 있다. 항원의 일반적 카테고리는, 바이러스성 항원, 박테리아성 항원, 진균성(fungal) 항원, 원생동물(protozoa) 및 다른 기생성(parasitic) 항원, 종양 항원, 자가면역질환에 관련된 항원, 알레르기 및 이식편거부반응(graft rejection), 독소, 및 다른 여러 가지 종류의 항원을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 “항원 결합 도메인(antigen binding domain)”은 항원 타겟에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드 도메인을 지칭한다.
본원에 사용된 세포와 관련된 용어 “자가 유래인(autologous)” 것은 동일한 대상(수용자 또는 숙주)으로부터 분리되고 다시 주입되는 세포를 지칭한다. “동종이형 (allogeneic)”은 비-자가유래 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 “B 세포”는 후천적 면역 체계(adaptive immune system)의 체액성 면역 림프구의 종류를 지칭한다. 항원 상호작용에 의한 활성화 이후 B 세포는 주로 항체를 만들고, 항원제시세포의 역할을 하고, 사이토카인을 방출하고, 기억 B세포를 만드는 기능을 한다. B 세포는 세포 표면의 B세포 수용체의 존재에 의해 T 세포와 같은 다른 림프구와 구별된다. B세포는 분리되거나 상업적으로 이용가능한 공급원에 의해 얻을 수 있다. 상업적으로 이용가능한 B세포주의 비제한적 예시는 AHH-1 (ATCC® CRL-8146™), BC-1 (ATCC® CRL-2230™), BC-2 (ATCC® CRL-2231™), BC-3 (ATCC® CRL-2277™), CA46 (ATCC® CRL-1648™), DG-75 [D.G.-75] (ATCC® CRL-2625™), DS-1 (ATCC® CRL-11102™), EB-3 [EB3] (ATCC® CCL-85™), Z-138 (ATCC #CRL-3001), DB (ATCC CRL-2289), Toledo (ATCC CRL-2631), Pfiffer (ATCC CRL-2632), SR (ATCC CRL-2262), JM-1 (ATCC CRL-10421), NFS-5 C-1 (ATCC CRL-1693); NFS-70 C10 (ATCC CRL-1694), NFS-25 C-3 (ATCC CRL-1695), 및 SUP-B15 (ATCC CRL-1929)를 포함한다. 추가적인 예시는 역행성 및 대세포림프종(anaplastic and large cell lymphomas)으로부터 유래된 세포주, 예를 들어 DEL, DL-40, FE-PD, JB6, Karpas 299, Ki-JK, Mac-2A Ply1, SR-786, SU-DHL-1, -2, -4,-5,-6,-7,-8,-9,-10, 및 -16, DOHH-2, NU-DHL-1, U-937, Granda 519, USC-DHL-1, RL; 호지킨 림프종(Hodgkin’s lymphomas), 예를 들어 DEV, HD-70, HDLM-2, HD-MyZ, HKB-1, KM-H2, L 428, L 540, L1236, SBH-1, SUP-HD1, SU/RH-HD-l를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 비제한적 예시적 상업적으로 이용가능한 세포주 공급원의 예시는 American Type Culture Collection, 또는 ATCC, (www.atcc.org/) 및 the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.
본원에 사용된 “암(cancer)”은 비정상적인 통제되지 않은 복제를 나타내는 세포의 대상에서의 존재를 특징으로 하는 질병 상태이다. 일부 구현예에서, 암은 백혈병이다. 특정 구현예에서, 암은 급성 골수성 백혈병이다. 본원에 사용된 “백혈병”은 미성숙 백혈구의 비정상적인 증가를 특징으로 하는 혈액 또는 골수의 암이다. 급성 골수 백혈병(acute myelogenous leukemia) 또는 급성 골수아구성백혈병(acute myeloblastic leukemia)이라고도 지칭하는 AML(acute myeloid leukemia)의 특정한 상태는 골수에 축적되고 정상 혈액 세포의 생성을 방해하는 골수 세포의 비정상적인 빠른 성장을 특징으로 하는 골수 기원 혈액 세포(myeloid origin blood cells)의 암이다.
본원에 사용된 용어 “키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor)”(CAR)는, 항원에 결합 가능한 세포외 도메인, 세포외 도메인이 유래된 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드로부터 유래한 막 관통 도메인, 및 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함하는, 융합된 단백질을 지칭한다. “CAR(chimeric antigen receptor)”는 종종 “키메릭 수용체”, “T-바디(body)”, 또는 “CIR(chimeric immune receptor)”로 지칭된다. “항원에 결합 가능한 세포외 도메인”은 특정 항원에 결합할 수 있는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. “세포내 도메인(intracellular domain)” 또는 “세포내 시그널링 도메인”은 세포 내에서 생물학적 과정(process)의 활성화 또는 억제를 일으키는 신호를 전송하는 도메인으로 기능하는 것으로 알려진 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 특정 구현예에서, 세포내 도메인은 주요 시그널링 도메인에 더하여 하나 또는 그 이상의 공자극(costimulatory) 시그널링 도메인을 포함하거나, 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성될 수 있다. “막 관통(transmembrane) 도메인”은 세포막을 가로지르며 세포외 및 시그널링 도메인을 연결하는 기능을 할 수 있는 것으로 알려진 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 키메릭 항원 수용체는 선택적으로 세포외 및 막 관통 도메인 간의 링커 역할을 하는 “힌지 도메인(hinge domain)”을 포함할 수 있다. 각 도메인의 구성요소를 코딩하는 비제한적 예시적 폴리뉴클레오티드 서열을 본원에 개시하였다 :
힌지 도메인 : IgG1 중쇄 힌지 서열, 서열번호 1 :
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG
막 관통 도메인 : CD28 막 관통 영역, 서열번호 2 :
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
세포내 도메인 : 4-1BB 공자극 시그널링 영역, 서열번호 3 :
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
세포내 도메인 : CD28 공자극 시그널링 영역, 서열번호 4 :
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
세포내 도메인 : CD3 제타 시그널링 영역, 서열번호 5 :
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
각 도메인 구성 요소 예시의 추가적 구현예는 상기 개시된 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질과 적어도 70%, 또는 대안으로 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는, 유사한 생물학적 기능을 갖는 다른 단백질을 포함한다. 추가로, 그러한 도메인의 비제한적 예시가 본원에 제공된다.
본원에 사용된 용어 "CD8α 힌지 도메인"은 이 이름과 관련된 특정 단백질 단편 및, 본원에 개시된 CD8α 힌지 도메인 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 지칭한다. 인간, 마우스, 및 다른 종의 CD8α 힌지 도메인 서열의 예시는 Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177에 제공되어 있다. CD8α 힌지 도메인에 관련된 서열은 Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177에 제공되어 있다. 이의 비제한적 실시예는 다음을 포함한다 :
인간 CD8 알파 힌지 도메인, 서열번호 6 :
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
마우스 CD8 알파 힌지 도메인, 서열번호 7 :
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY
고양이 CD8 알파 힌지 도메인, 서열번호 8 :
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY
본원에 사용된 용어 “CD8α 막 관통 도메인”은 이 이름과 관련된 특정 단백질 단편 및, 본원에 개시된 CD8α 막 관통 도메인 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 지칭한다. 인간 T세포 표면 당단백질 CD8 알파 쇄의 아미노산 위치 183 내지 203(GenBank Accession No: NP_001759.3), 또는 마우스 T세포 표면 당단백질 CD8 알파 쇄의 아미노산 위치 197 내지 217(GenBank Accession No: NP_001074579.1), 및 래트 T세포 표면 당단백질 CD8 알파 쇄의 아미노산 위치 190 내지 210(GenBank Accession No: NP_ 113726.1) 과 관련된 단편 서열은 CD8α 막 관통 도메인의 추가적인 예시 서열을 제공한다. 기재된 접근 번호(accession number) 각각에 관련된 서열은 다음과 같이 제공된다 :
인간 CD8 알파 막 관통 도메인, 서열번호 9 :
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
마우스 CD8 알파 막 관통 도메인, 서열번호 10 :
IWAPLAGICVALLLSLIITLI
래트 CD8 알파 막 관통 도메인, 서열번호 11 :
IWAPLAGICAVLLLSLVITLI
본원에 사용된 용어 "4-1BB 공자극 시그널링 영역"은 이 이름과 관련된 특정 단백질 단편 및, 본원에 개시된 4-1BB 공자극 시그널링 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 지칭한다. 4-1BB 공자극 시그널링 영역의 비제한적 예시적 서열은 미국공개특허공보 제20130266551A1호 (미국특허출원 제13/826,258호로 출원됨) 및 하기 제공된 예시적 서열 및 서열번호 3에 의해 코딩되는 서열과 같다 :
4-1BB 공자극 시그널링 영역, 서열번호 12:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
본원에 사용된 용어 “ICOS 공자극 시그널링 영역”은 이 이름과 관련된 특정 단백질 단편 및, 본원에 개시된 ICOS 공자극 시그널링 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 지칭한다. ICOS 공자극 시그널링 영역의 비제한적 예시적 서열은 미국특허출원공보 제2015/0017141A1호 및 하기에 제공된 예시적 폴리뉴클레오티드 서열에 제공되어 있다.
ICOS 공자극 시그널링 영역, 서열번호 13:
ACAAAAAAGA AGTATTCATC CAGTGTGCAC GACCCTAACG GTGAATACAT GTTCATGAGA GCAGTGAACA CAGCCAAAAA ATCCAGACTC ACAGATGTGA CCCTA
본원에 사용된 용어 “OX40 공자극 시그널링 영역”은 이 이름과 관련된 특정 단백질 단편 및, 본원에 개시된 OX40 공자극 시그널링 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 지칭한다. OX40 공자극 시그널링 영역의 비제한적 예시적 서열은 미국특허출원공보 제2012/20148552A1호에 개시되어 있으며, 하기에 제공된 예시적 서열을 포함한다.
OX40 공자극 시그널링 영역, 서열번호 14 :
AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGAC CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC
본원에 사용된 용어 “CD28 막 관통 도메인”은 이 이름과 관련된 특정 단백질 단편 및, 본원에 개시된 CD28 막 관통 도메인 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 지칭한다. GenBank 접근 번호 XM_006712862.2 및 XM_009444056.1과 관련된 단편 서열은 CD28 막 관통 도메인의 추가적 비제한적 예시적 서열이다. 나열된 접근 번호 각각에 관련된 서열은 서열번호 2에 의해 코딩된 서열과 같이 제공된다.
본원에 사용된 용어 “CD28 공자극 시그널링 영역”은 이 이름과 관련된 특정 단백질 단편 및, 본원에 개시된 CD28 공자극 시그널링 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 지칭한다. CD28 공자극 시그널링 도메인의 예시적 서열은 미국특허 제5,686,281호; Geiger, T.L. et al. (2001) Blood 98: 2364-2371; Hombach, A. et al. (2001) J Immunol 167: 6123-6131; Maher, J. et al. (2002) Nat Biotechnol 20: 70-75; Haynes, N.M. et al. (2002) J Immunol 169: 5780-5786 (2002); Haynes, N.M. et al. (2002) Blood 100: 3155-3163에 제공되어 있다. 비제한적 실시예는 하기의 114-220번 잔기 및 서열번호 4에 의해 코딩되는 서열을 포함한다 :
CD28 서열 :
MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS (서열번호 15), 및 그의 등가물.
본원에 사용된 용어 “CD3 제타 시그널링 도메인”은 이 이름과 관련된 특정 단백질 단편 및, 본원에 개시된 CD3 제타 시그널링 도메인 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 지칭한다. CD3 제타 시그널링 도메인의 비제한적 예시적 서열은 미국특허출원 제13/826,258호에 제공되어 있으며, 예를 들어 :
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열번호 16) 및 서열번호 5에 의해 코딩되는 서열.
“조성물(composition)”은 전형적으로 활성 작용물(agent), 예를 들어, 화합물 또는 합성물(composition), 및 어쥬번트, 희석제, 바인더, 안정제, 버퍼, 염, 친지질성(lipophilic) 용매, 방부제, 어쥬번트 또는 그와 유사한 것 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 불활성(inert)(예를 들어, 검출 가능한 작용물 또는 라벨) 또는 활성, 자연발생 또는 비자연발생 담체의 조합을 의미한다. 또한 담체는 단독으로 또는 조합하여 1-99.9 중량 % 또는 부피를 단독으로 또는 조합하여 포함하는 형태로 존재할 수 있는 의약품 부형제(pharmaceutical excipients)및 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물(예를 들어, 모노사카라이드(monosaccharide), 다이(di-), 트라이(tri-), 테트라(tetra) 올리고사카라이드를 포함하는 당(sugar) 및 올리고사카라이드; 알디톨(alditol), 알돈산(aldonic acid), 에스테르화된 당(esterified sugars) 및 그와 유사한 것; 및 폴리사카라이드 또는 당 폴리머) 첨가제를 포함한다. 예시적인 단백질 부형제는 HSA(human serum albumin), rHA(recombinant human albumin), 젤라틴(gelatin), 카세인(casein) 및 그와 유사한 것과 같은 혈장 알부민을 포함한다. 버퍼링(buffering) 능력에서 또한 기능할 수 있는 대표적 아미노산/항체 구성요소는, 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine), 글리신(glycine), 아르기닌, 베타인(betaine), 히스티딘(histidine), 글루탐산(glutamic acid), 아스파르트산(aspartic acid), 시스테인(cysteine), 라이신(lysine), 류신(leucine), 이소류신(isolucine), 발린(valine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 아스파탐(aspartame) 및 그와 유사한 것을 포함한다. 탄수화물 부형제 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도되며, 그 예시는 프럭토스(fructose), 말토오스(maltose), 갈락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), D-만노스(mannose), 소르보스(sorbose) 및 그와 유사한 것과 같은 모노사카라이드; 락토오스(lactose), 수크로오스(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 셀로비오스(cellobiose) 및 그 유사체와 같은 다이사카라이드; 라피노스(raffinose), 멜레지토스(melezitose), 말토덱스트린(maltodextrin), 덱스트란(dextran), 녹말(starches), 및 그와 유사한 것과 같은 폴리사카라이드; 만니톨(mannitol), 자일리톨(xylitol), 말티톨(maltitol), 락티톨(lactitol), 자일리톨 소르비톨(xylitol sorbitol) (글루시톨(glucitol)) 및 미오이노시톨(myoinositol)과 같은 알디톨을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 “포함하는” 은 조성물 및 방법이 개시된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않는다는 것을 의미한다. 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용된 “필수적으로 구성되는(consisting essentially of)” 은 의도된 용도로의 조합에 필수적인 임의의 요소의 다른 요소를 배제한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에 정의된 요소로 필수적으로 구성되는 조성물은 인산으로 버퍼된 식염수, 방부제 및 그와 유사한 것과 같은 약학적으로 허용되는 담체 및 분리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염 물질을 배제하지 않을 것이다. “구성되는”은 본원에 개시된 조성물을 투여하기 위한 다른 성분의 미량 원소 및 실질적인 방법 단계를 배제하는 것을 의미한다. 각 구(transition terms)에 의해 정의된 실시 양태는 본원의 범위 내에 있다.
본원에 사용된 용어 “공통서열(consensus sequence)”은 일련의 다중 서열을 정렬시킴으로써 결정되고 다중 서열의 각 상응하는 위치에서 아미노산 또는 염기의 우세한 선택을 나타내는 이상화된(idealized) 서열을 정의하는 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다. 일련의 다중 서열의 서열에 따라, 일련의 공통 서열은 0개, 1개, 몇 개, 또는 그 이상의 치환에 의해 각 서열과 달라질 수 있다. 또한, 일련의 다중 서열의 서열에 따라, 일련의 서열에 대한 하나 이상의 공통 서열이 결정될 수 있다. 공통 서열의 생성은 집중적인 수학적 분석의 대상이 되었다. 공통 서열을 결정하기 위해 다양한 소프트웨어 프로그램이 이용될 수 있다.
본원에 사용된 "종양 축소 요법(Cytoreductive therapy)"은 화학요법(chemotherapy), 냉동요법(cryotherapy) 및 방사선 요법(radiation therapy)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 세포 증식을 감소시키는 작용물은 당업계에 알려져 있으며 널리 사용된다. 암세포들이 분열할 때만 그들을 살해하는 화학요법 약제는 세포 주기 특이적(cell-cycle specific)이라고 한다. 상기 약제는 토포이소머라아제(topoisomerase) 억제제 및 대사길항물질(anti-metabolites)을 포함하는 S-페이즈에서 작용하는 작용물을 포함한다.
토포이소머라이제 억제제는 토포이소머라아제 효소(토포이소머라아제 I 및 II)의 활동을 방해하는 약제를 말한다. 화학 요법 치료 과정 동안, 토포이소머라아제 효소는 복제에 필수적인 DNA 구조의 조작을 제어하며, 그러므로 세포주기특이적이다. 토포이소머라아제 I 억제제의 예시는 상기 기재된 캄토테칸(camptothecan) 유사체, 이리노테칸(irinotecan) 및 토포테칸(topotecan)을 포함한다. 토포이소머라아제 II 억제제는 암사크린(irinotecan), 에토포시드(etoposide), 인산 에토포시드(etoposide phosphate), 및 테니포시드(teniposide)를 포함한다.
일반적으로 대사길항물질은 정상 대사 기질의 유사체로, 종종 염색체 복제에 관련된 과정을 방해한다. 그것들은 주기의 매우 특정한 단계에서 세포를 공격한다. 대사길항물질은 엽산 길항제, 예를 들어 메토트렉세이트(methotrexate); 피리미딘(pyrimidine) 길항제, 예를 들어 5-플루오로우라실(fluorouracil), 폭스우리딘(foxuridine), 시타라빈, 카페시타빈(capecitabine), 및 젬시타빈(gemcitabine); 퓨린(purine) 길항제, 예를 들어 6-머캅토퓨린(mercaptopurine) 및 6-티오구아닌(thioguanine); 아데노신 데아미나아제(adenosine deaminase) 억제제, 예를 들어 클라드리빈(cladribine), 플루다라빈(fludarabine), 넬라라빈(nelarabine) 및 펜토스타틴(pentostatin); 및 그와 유사한 것을 포함한다.
식물 알칼로이드는 특정 종류의 식물로부터 유래한 것이다. 빈카(vinca) 알칼로이드는 페리윙클 식물(Catharanthus rosea)로부터 만들어진다. 탁산(taxane)은 태평양 주목나무(Pacific Yew tree : taxus)의 껍질로부터 만들어진다. 빈카 알칼로이드 및 탁산은 또한 미세소관 억제 작용물(antimicrotubule agent)로 알려져 있다. 포도필로톡신(podophyllotoxins)은 메이 애플(May apple) 식물로부터 유래한다. 캄토테칸 유사체는 아시아의 “행운목”(Camptotheca acuminata)으로부터 유래한다. 포도필로톡신 및 캠토테칸 유사체는 또한 토포이소머라아제 억제제로 분류된다. 식물 알칼로이드는 일반적으로 세포주기특이적이다.
이 작용물의 예시는 빈카 알칼로이드, 예를 들어, 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 및 비노렐빈(vinorelbine); 탁산, 예를 들어, 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel); 포도필로톡신, 예를 들어 에토포시드 및 테니포시드; 및 캄토테칸 유사체, 예를 들어 이리노테칸 및 토포테칸을 포함한다.
냉동요법은 온도를 떨어뜨리는 방법을 포함하는 요법, 예를 들어 저체온 요법(hypothermic therapy)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
방사선 요법은 이온화 방사선(ionizing radiation), 자외선(UV radiation)과 같은 방사선에 노출되는 것을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 투여량은 적어도 약 2 Gy 내지 약 10 Gy 이하의 범위의 이온화 방사선의 투여량 및/또는 약 5 J/㎡ 이상 약 50 J/㎡ 이하, 일반적으로 약 10 J/㎡ 의 범위의 자외선 투여량을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 “검출 가능한 마커(detectable marker)”는 직접적 또는 간접적으로 검출 가능한 시그널을 생성 가능한, 적어도 하나의 마커를 지칭한다. 이 마커의 비한정적 리스트는 예를 들어, 색소 측정법, 형광, 발광, 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase), 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase), β-갈락토오스 분해효소(galactosidase), 글루코오스-6-인산 탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 형광, 발광 염료와 같은 발색단(chromophores), 전자 현미경 또는 전도성, 전류 측정, 전압 전류, 임피던스와 같은 그들의 전기적 특성에 의해 전자 밀도가 검출되는 군, 예를 들어 그의 물리적 및/또는 화학적 특징의 검출 가능한 변형을 유도하기에 충분한 크기인 분자의 검출 가능한 군 등의, 검출 가능한 시그널을 생성하는 효소를 포함하며, 그러한 검출은 회절(diffraction), 표면 플라즈몬 공명(surface Plasmon resonance), 표면 변화(surface variation), 접촉각 변화 또는 원자력 분광학(atomic force spectroscopy), 터널링 효과(tunnel effect) 또는 32P, 35S 또는 125I와 같은 방사성 분자와 같은 광학적 방법에 의해 달성될 수 있다. 한 실시 양태에서, 검출 가능한 마커는 자연적 형광 폴리뉴클레오티드를 배제한다.
“유효량(effective amount)” 또는 “유효량(efficacious amount)”은 포유류 또는 다른 대상의 치료를 위해 투여되었을 때, 질병의 치료에 효과를 나타내기에 충분한 한 작용물의 양, 또는 둘 또는 그 이상의 작용제의 조합된 양을 지칭한다. “유효량”은 작용물, 질병 및 그 심각도(severity) 및 치료 대상의 연령, 무게, 기타 등에 따라 다를 수 있다.
핵산 서열에 적용되는 용어 “코딩”은 천연 상태에서 또는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩티드 및/또는 그의 단편에 대한 mRNA를 제조하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있는 경우, 폴리펩티드를 “코딩”한다고 언급되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 안티센스(antisense) 가닥은 그러한 핵산의 상보적 가닥이며, 코딩 서열은 이로부터 추론될 수 있다.
본원에 사용된 용어 “인핸서(enhancer)”는, 발현되는 핵산 서열과 관련하여 핵산 서열의 위치 및 배향과 무관하게 핵산 서열의 전사를 증가, 개선 또는 개량하는 서열 요소를 말한다. 인핸서는 단일 프로모터 또는 동시에 하나 이상의 프로모터로부터의 전사를 증가시킬 수 있다. 전사를 향상시키는 이러한 기능이 유지되거나 실질적으로 유지되는 한(예를 들어, 완전한 길이의(full-length) 서열의 활성인 야생형 활성의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%), 야생형 인핸서 서열의 잘린, 돌연변이된, 또는 변형된 변이체도 상기 정의 내에 포함된다.
한 실시 양태에서, 항체의 “등가물” 또는 “생물학적 등가물”은 그 기준(reference) 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 펩티드, 항체 단편, 항체 변이체, 항체 유도체 및 항체 모조체(mimetic)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본원 발명이 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 항체와 관련된 경우, 본원 발명의 범위 내에 그의 등가물 또는 생물학적 등가물이 의도된다는 것이 다른 의도가 없는 한 명확한 설명 없이도 추론된다. 본원에 사용된 용어 “그의 생물학적 등가물”은 “그의 등가물”과 동의어로 의도되며, 기준 단백질, 항체, 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭할 때, 원하는(desired) 구조 또는 기능성을 여전히 유지하면서 최소한의 상동성을 갖는 것을 의도한다. 본원에 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 또한 그의 등가물을 포함한다. 예를 들어, 등가물은 적어도 70%의 상동성 또는 동일성, 또는 적어도 80%의 상동성 또는 동일성 및 대안으로, 또는 적어도 약 85%, 또는 대안으로 적어도 약 90%, 또는 대안으로 적어도 약 95%, 또는 대안으로 98% 퍼센트의 상동성 또는 동일성을 의도하며, 기준 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 대안으로, 폴리뉴클레오티드를 지칭할 때, 그의 등가물은 엄격한 조건 하에서 기준 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 서열(complement)과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이다.
다른 서열과 “서열 동일성”의 특정한 비율(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)은, 정렬(align)했을 때, 염기(또는 아미노산)의 그 비율이 두 서열을 비교할 때 동일한 것을 의미한다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 당업계에 알려진 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1.에 설명된 것들을 이용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 파라미터가 정렬에 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 구체적으로, 바람직한 프로그램은 BLASTN 및 BLASTP이며, 다음과 같은 디폴트 파라미터를 사용한다: Genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이 프로그램들의 세부 사항은 다음 인터넷 주소에서 찾을 수 있다 : ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
본원에 사용된 용어 “발현(expression)”은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 이어서 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래한 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 수준은 세포 또는 조직 샘플에서의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 한 실시 양태에서, 한 샘플로부터의 유전자의 발현 수준은 대조 또는 참조군(reference sample)으로부터 그 유전자의 발현 레벨과 직접적으로 비교될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 한 샘플로부터의 유전자의 발현 수준은 화합물 투여 후 동일한 샘플로부터의 그 유전자의 발현 수준과 직접적으로 비교될 수 있다.
용어 “FKBP”, 또는 FK506 결합 단백질은 프롤릴 아이소머라아제(prolyl isomerase) 활성을 가지며 기능적으로 사이클로필린(cyclophilin)과 관련된 단백질 군을 지칭한다. FKBP는 효모에서 인간에 이르기까지 많은 진핵동물들에서 동정되었으며 프롤린(proline) 잔기를 포함하는 단백질의 단백질 접힘 샤페론으로 기능한다. 사이클로필린과 함께, FKBP는 이뮤노필린(immunophilin) 군에 속한다. FKBP의 비제한적 실시예는 인간 FKBP12(FKBP1A라고도 지칭함), UniProt Ref. No. P62942이다. FKBP의 비제한적 추가적 실시예는 GenBank 접근 번호 AH002818, BC119732.1, NM_001199786.1, 및 NM_054014.3에 의해 제공되는 것을 포함한다.
“1 차(first line)” 또는 “2차(second line)” 또는 “3차(third line)” 라는 구(phrase)는 환자에 의해 수용되는 치료(treatment)의 순서를 지칭한다. 1차 요법은 처음으로 주어지는 치료이고, 2차 또는 3차 요법은 각각 1차 요법 이후에 또는 2차 요법 이후에 주어지는 것이다. National Cancer Institute는 1차 요법을 “질병 또는 상태(condition)에 대한 첫 번째 처리”라고 정의한다. 암 환자에 있어서, 1차(primary) 치료 방법은 수술, 화학 요법, 방사선 요법, 또는 이들 요법의 조합일 수 있다. 1차 요법은 또한 당업계 종사자에게 “1차(primary) 요법 및 1차 치료”로 지칭된다. 2008년 5월 1일에 마지막으로 방문한 National Cancer Institute 웹사이트(www.cancer.gov)를 참고하라. 전형적으로, 1차 요법 또는 1차 요법이 중단된 데에 환자가 양성적인 임상적 또는 잠재적(subclinical) 반응을 나타내지 않았기 때문에, 환자는 후속적인 화학 요법을 받는다.
본원에 사용된 용어 “FLT3”은 이 이름과 관련된 수용체 유형 타이로신-단백질 인산화효소(receptor-type tyrosine-protein kinase) FLT3, 임의의 그 대체 이름 또는 UniProt 접근 번호 P36888 및 FLT와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 또는 대안으로 적어도 95%의 서열 동일성을 공유하는 동일한 생물학적 기능을 갖는 임의의 다른 분자 및 임의의 변이체 또는 그의 이소폼(isoform)을 지칭한다. FLT3의 비제한적 실시예는 다음을 포함한다:
인간 FLT3 이소폼 1, 서열번호 17:
MPALARDGGQLPLLVVFSAMIFGTITNQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESP
EDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNISFYATIGVCLLFIVVLTLLICHKYKKQFRYESQLQMVQVTGSSDNEYFYVDFREYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGKVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSSEREALMSELKMMTQLGSHENIVNLLGACTLSGPIYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQSHPNSSMPGSREVQIHPDSDQISGLHGNSFHSEDEIEYENQKRLEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSCVHRDLAARNVLVTHGKVVKICDFGLARDIMSDSNYVVRGNARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQNGFKMDQPFYATEEIYIIMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLADAEEAMYQNVDGRVSECPHTYQNRRPFSREMDLGLLSPQAQVEDS
인간 FLT3 이소폼 2, 서열번호 18:
MPALARDGGQLPLLVVFSAMIFGTITNQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESP
EDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNISFYATIGVCLLFIVVLTLLICHKYKKQFRYESQLQMVQVTGSSDNEYFYVDFREYEYDLKWEFPRENLEFGKVLGSGAFGKVMNATAYGISKTGVSIQVAVKMLKEKADSSEREALMSELKMMTQLGSHENIVNLLGACTLSGPIYLIFEYCCYGDLLNYLRSKREKFHRTWTEIFKEHNFSFYPTFQSHPNSSMPGSREVQIHPDSDQISGLHGNSFHSEDEIEYENQKRLEEEEDLNVLTFEDLLCFAYQVAKGMEFLEFKSARLPVKWMAPESLFEGIYTIKSDVWSYGILLWEIFSLGVNPYPGIPVDANFYKLIQNGFKMDQPFYATEEIYIIMQSCWAFDSRKRPSFPNLTSFLGCQLADAEEAMYQNVDGRVSECPHTYQNRRPFSREMDLGLLSPQAQVEDS
본원에 사용된 용어 FLT3-1은 하기에 개시된 중쇄 및 경쇄 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 임의의 한 CDR과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 CDR을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체를 지칭하며, 바람직하게는 CDR3 영역 중 적어도 하나, 가장 바람직하게는 CDR3 영역의 양 쪽 모두, 하기에 개시된 서열이다. 상기 CDR 영역의 아미노산 서열은 하기에 개시되어 있다.
FLT3-1 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 19 :
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCATTGAAGCTGTCCTGCAAGTCTTCCGGGTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTCTGACAGTTATAAAGACTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTGGACAGATCCTCCAACACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGCGATTACGACGACCCCCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
FLT3-1 경쇄 가변 영역 서열, 서열번호 20 :
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAGTGTATTTCTGTCAACAGAGTAACACCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG
FLT3-1 CDHR1, 서열번호 21:
SYWMH
FLT3-1 CDHR2, 서열번호 22:
EIDPSDSYKDYNQKFKD
FLT3-1 CDHR3, 서열번호 23:
AITTTPFDF
FLT3-1 CDLR1, 서열번호 24:
RASQSISNNLH
FLT3-1 CDLR2, 서열번호 25:
YASQSIS
FLT3-1 CDLR3, 서열번호 26:
QQSNTWPYT
본원에 사용된 용어 FLT3-2는 하기에 개시된 중쇄 및 경쇄 폴리뉴클레오티드 시퀀스에 의해 코딩되는 임의의 한 CDR과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 CDR을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 항체를 지칭하며, 바람직하게는 CDR3 영역 중 적어도 하나, 가장 바람직하게는 CDR3 영역의 양 쪽 모두, 하기에 개시된 서열이다. 상기 CDR 영역의 아미노산 서열은 하기에 개시되어 있다.
FLT3-2 중쇄 가변 영역 서열, 서열번호 27:
CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTTTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAGCACAGACTATAATGCAGCTTTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAGGCTGATGACACAGCCATATACTACTGTGCCAGAAAAGGAGGGATCTACTATGCTAACCATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
FLT3-2 경쇄 가변 영역 서열, 서열번호 28:
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTATATGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
FLT3-2 CDHR1, 서열번호 29:
NYGLH
FLT3-2 CDHR2, 서열번호 30:
VIWSGGSTDYNAAFIS
FLT3-2 CDHR3, 서열번호 31:
GGIYYANHYYAMDY
FLT3-2 CDLR1, 서열번호 32:
KSSQSLLNSGNQKNYM
FLT3-2 CDLR2, 서열번호 33:
GASTRES
FLT3-2 CDLR3, 서열번호 34:
QNDHSYPLT
2개 또는 그 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 사용될 때, 본원에 사용된 용어 “상동성(homology)” 또는 “동일한(identical)”, 퍼센트 “동일성(identity)” 또는 “유사성(similarity)”은 특정 영역(예를 들어, 본원에 개시된 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 본원에 설명된 항체의 아미노산 서열)에 대해 동일하거나 또는 예를 들어, 적어도 60% 동일성, 바람직하게는 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더 높은 동일성 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 비율을 갖는 2개 또는 그 이상의 서열 또는 부분서열(subsequence)을 지칭한다. 상동성은 비교를 위해 정렬될 수 있는 각 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유될 때, 그 분자들은 그 위치에서 상동이다(homologous). 서열 사이의 상동성 정도는 서열에 의해 공유되는 일치하는 또는 상동성인 위치의 숫자에 관한 함수이다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 당업계에 알려진 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1. 을 이용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 파라미터가 정렬에 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 구체적으로, 바람직한 프로그램은 BLASTN 및 BLASTP이며, 다음과 같은 디폴트 파라미터를 사용한다: Genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이 프로그램들의 세부 사항은 다음 인터넷 주소에서 찾을 수 있다 : ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST. 용어 “상동성(homology)” 또는 “동일한(identical)”, 퍼센트 “동일성(identity)” 또는 “유사성(similarity)”은 또한 테스트 서열의 상보적 서열을 지칭하거나, 또는 적용될 수 있다. 이 용어들은 또한 치환을 갖는 것 뿐만 아니라 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열을 포함한다. 본원에 설명된 것과 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 및 그 유사한 것을 설명할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 약 25개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역, 또는 더 바람직하게는 적어도 50-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드 길이의 영역에 동일성이 존재한다. “관련이 없는(unrelated)” 또는 “비상동성(non-homologous)” 서열은 본원에 개시된 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 또는 대안으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.
“혼성화(hybridization)”는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기들의 염기 사이에 수소결합을 통해 안정화되는 복합체(complex)를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소결합은 왓슨-크릭 염기쌍 형성, 후그스타인(Hoogstein) 결합 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 또는 그 이상의 가닥, 단일의 자가 혼성화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR의 개시, 또는 리보자임(ribozyme)에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소적(enzymatic) 절단과 같은, 더 광범위한 과정에서 하나의 단계를 이룰 수 있다.
엄격한 혼성화 조건(stringent hybridization conditions)의 예시는 약 25℃ 내지 약 37℃의 인큐베이션 온도; 약 6x SSC 내지 약 10x SSC의 혼성화 버퍼 농도; 약 0% 내지 약 25%의 포름아마이드 농도; 및 약 4x SSC내지 약 8x SSC의 세척 용액을 포함하는 것이다. 적당한(moderate) 혼성화 조건의 예시는 약 40℃ 내지 약 50℃의 인큐베이션 온도; 약 9x SSC 내지 약 2x SSC의 버퍼 농도; 약 30% 내지 약 50%의 포름아마이드 농도; 및 약 5x SSC 내지 약 2x SSC의 세척 용액을 포함하는 것이다. 높은 엄격도 조건(high stringency) 조건의 예시는 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 버퍼 농도; 약 55%내지 약 75%의 포름아마이드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함하는 것이다. 일반적으로, 혼성화 인큐베이션 시간은 1,2 또는 그 이상의 세척 단계에 더불어 5분에서 24시간,이며, 세척 인큐베이션 시간은 약 1,2, 또는 15분이다. SSC는 0.15M NaCl과 15mM 시트르산염(citrate) 버퍼이다. 다른 버퍼 시스템을 사용하는 SSC의 등가물이 사용될 수 있다는 것이 이해된다.
본원에 사용된 용어 “분리된(isolated)” 은 실질적으로 다른 물질이 없는 분자 또는 생물학적 또는 세포 물질을 의미한다. 한 실시 양태에서, 용어 “분리된” 은 자연 공급원에 존재하는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산, 또는 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 그의 유도체), 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 기관으로부터 각각 분리된, DNA 또는 RNA와 같은 핵산, 또는 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 그의 유도체), 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 기관을 지칭한다. 용어 “분리된”은 또한 실질적으로 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 재조합 DNA테크닉에 의해 제조된 경우 배양 배지, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 없는 핵산 또는 펩티드를 지칭한다. 또한, “분리된 핵산”은 단편으로서 자연 발생하지 않으며 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 “분리된” 은 또한 다른 세포 단백질로부터 분리된 폴리펩티드를 지칭하는 것이며, 정제된 것 및 재조합 폴리펩티드 전부를 포함하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 “분리된”은 또한 다른 세포 또는 조직으로부터 분리된 세포 또는 조직을 칭하며 배양된 또는 조작된 세포 또는 조직을 모두 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 “분리된 세포”는 일반적으로 실질적으로 조직의 다른 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다.
“면역 세포”는, 예를 들어, 골수에서 생성된 HSC(hematopoietic stem cells)로부터 유래한 백혈구(white blood cells, leukocytes), 림프구(T 세포, B 세포, NK(natural killer)세포 및 골수-유래 세포(호중구(neutrophil), 호산구(eosinophil), 호염기구(basophil), 단핵구(monocyte), 대식 세포(macrophage), 수지상 세포(dendritic cells))를 포함한다.
본원에 사용된 용어 “링커(linker) 서열”은 1 내지 10, 또는 대안으로 약 8, 또는 대안으로 약 6, 또는 대안으로 약 5, 또는 4, 또는 대안으로 3, 또는 대안으로 2 번 반복 될 수 있는, 1 내지 10, 또는 대안으로, 8 아미노산, 또는 대안으로 6 아미노산, 또는 대안으로 5 아미노산을 포함하는 임의의 아미노산 서열에 관한 것이다. 예를 들어, 링커는 3번 반복된 펜타펩티드(pentapeptide)로 구성된 15개 이하의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 한 실시 양태에서, 링커 서열은 (글리신4세린)3 유연한(flexible) 폴리펩티드 링커로, 1문자 서열 표시로는GGGGS와 같이 나타나는 gly-gly-gly-gly-ser의 3개의 카피를 포함한다.
“암 조직 타입(type)에 상응하는 정상 세포”는 암 조직과 동일한 조직 타입으로부터 유래한 정상 세포를 지칭한다. 비제한적 예시는 환자로부터 유래한 정상 백혈구이다.
본원에 사용된 용어 “NK 세포”는 자연살해세포(natural killer cell)로도 알려져 있으며, 선천성 면역 체계(innate immune system)에서 중요한 역할을 하는, 골수에서 유래한 림프구의 종류를 지칭한다. 세포 표면에 주요 조직 적합 유전자 복합체(major histocompatibility complex) 또는 항체가 없어도, NK 세포는 바이러스 감염된 세포, 종양 세포 또는 다른 스트레스를 받은 세포(stressed cell)에 대한 빠른 면역 반응을 제공한다. 상업적 NK 세포주의 비제한적 예시는 NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)을 포함한다. 추가적인 예시는 NK 세포주HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, 및 YT를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 상업적으로 이용가능한 세포주의 비제한적 예시적 공급원은 American Type Culture Collection, 또는 ATCC, (http://www.atcc.org/) 및 the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.
조절(regulatory) 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에 사용된 용어 “작동 가능하게 연결된(operatively linked)”은 특정 단백질이 조절 폴리뉴클레오티드에 결합할 때, 연결된 폴리뉴클레오티드가 전사되도록 하는 조절 폴리뉴클레오티드와 상기 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 결합을 의미한다.
세포, 조직, 또는 기관과 관련하여 본원에 사용된 용어 "과발현(overexpress)"은 대조군 세포, 대조군 조직, 대조군 장기에서 생산되는 양에 비해 더 많은 양의 단백질을 발현하는 것을 말한다. 과발현되는 단백질은 숙주 세포에 내인성이거나 또는 외인성(exogenous)일 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되고 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 그의 유사체 중 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 삼차원 구조를 가질 수 있으며, 알려지거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예시들이다 : 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브(probe), 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, mRNA(messenger RNA), 운반 RNA(transfer RNA), 리보솜 RNA(ribosomal RNA), RNAi, 리보자임(ribozyme), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형(branched) 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같이 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오티드의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 구성요소에 의해 방해될 수 있다. 리뉴클레오티드는 폴리머화 이후, 예를 들어 라벨링 구성요소와의 결합(conjugation)에 의해 추가로 더 변형될 수 있다. 본 용어는 또한 이중 및 단일 가닥 분자 모두를 지칭한다. 달리 특정되거나 요구되지 않는 한, 본 기술의 임의의 실시 양태는 폴리뉴클레오티드의 이중가닥 형태 및 이중가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예측되는 두 개의 상보적인 단일 가닥 형태의 각각을 포괄한다.
본원에 사용된 용어 “핵산 서열(nucleic acid sequence)” 및 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 상호교환적으로 사용되며 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드 중 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태를 지칭한다. 그러므로, 본 용어는 단일, 이중, 또는 다중가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드(hybrid), 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 자연적, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비자연적, 또는 유도체화된(derivatized) 뉴클레오티드 염기를 포함하는 폴리머를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 “프로모터”는 유전자와 같은 코딩 서열의 발현을 조절하는 임의의 서열을 지칭한다. 프로모터는 구성적(constitutive), 유도(inducible), 억제(repressible) 또는 조직-특이적일 수 있다. “프로모터”는 전사의 개시 및 속도가 조절되는 폴리뉴클레오티드 서열의 영역인 조절 서열이다. 이는 조절 단백질 및 분자가 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 결합할 수 있는 유전 요소(genetic element)를 포함할 수 있다.
용어 “단백질”, “펩티드” 및 “폴리펩티드”는 상호교환적으로 사용되며, 최광의로 2개 또는 그 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드 모조체(peptidomimetic)의 화합물을 지칭하는 것이다. 서브유닛은 펩티드 결합으로 연결될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 서브유닛은 에스테르(ester), 에테르(ether) 결합 등 다른 결합으로 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 포함하며, 단백질 또는 펩티드의 서열에 포함되는 아미노산의 최대 숫자는 한정되지 않는다. 본원에 사용된 용어 “아미노산”은 자연적 및/또는 비자연적 또는 합성 아미노산을 지칭하며, 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체 모두와, 아미노산 유사체 및 펩티드 모조체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 “정제된(purified)”은 절대적인 순도(purity)를 요구하지 않는다; 대신, 그것은 상대적인 용어로 의도된다. 그러므로, 예를 들어, 정제된 핵산, 펩티드, 단백질, 생물학적 복합체 및 다른 활성 화합물은 전체 또는 그 부분이 단백질 또는 다른 오염물질로부터 분리된 화합물이다. 일반적으로, 본원에서 사용하기 위한 실질적으로 정제된 펩티드, 단백질, 생물학적 복합체, 또는 다른 활성 화합물은 펩티드, 단백질, 생물학적 복합체 또는 다른 활성 화합물을 약학적 담체, 부형제, 버퍼, 흡수 강화 작용물, 안정제, 방부제, 어쥬번트 또는 요법적 투여를 위한 완전한 약학적 제제의 다른 보조 성분(co-ingredient)과 혼합하거나 제제화하기 전에 제제에 존재하는 모든 거대분자 종의 80% 이상을 구성한다. 더 전형적으로, 펩티드, 단백질, 생물학적 복합체 또는 다른 활성 화합물은 다른 제제 성분들과 혼합하기 전의 정제된 제제에 존재하는 모든 거대 분자 종의 90% 이상, 종종 95% 이상으로 존재한다. 다른 경우에서, 정제된 제제는 필수적으로 균질(homogeneous)할 수 있으며, 상기 다른 거대 분자 종은 통상적인 기술로 검출할 수 없는 것이다.
본원에 사용된 용어 “정제 마커(purification marker)”는 정제 또는 동정에 유용한 적어도 하나의 마커를 지칭한다. 이 마커의 비제한적 목록은 His, lacZ, GST, 말토오스(maltose)-결합 단백질, NusA, BCCP, c-myc, CaM, FLAG, GFP, YFP, 체리(cherry), 싸이오리독신(thioredoxin), poly(NANP), V5, Snap, HA, 키틴(chitin)-결합 단백질, Softag 1, Softag 3, Strep, 또는 S-단백질을 포함한다. 적합한 직접 또는 간접 형광 마커는 FLAG, GFP, YFP, RFP, dTomato, cherry, Cy3, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7, DNP, AMCA, 비오틴(Biotin), 디옥시제닌(Digoxigenin), 타므라(Tamra), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민(rhodamine), 알렉사 플루오르(Alexa fluors), FITC, TRITC 또는 임의의 다른 형광 염료 또는 합텐을 포함한다.
본원에 사용된 용어 “재조합 단백질”은 재조합 DNA 테크닉에 의해 제조된 폴리펩티드를 지칭하며, 일반적으로 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 이종 단백질을 생산하도록 숙주세포를 형질전환하는 데 차례대로 사용되는 적합한 발현 벡터에 삽입된다.
본원에 사용된 용어 “시그널 펩티드”는 예를 들어, 소포체(endoplasmic reticulum)와 같은 특정 세포 소기관 및/또는 세포 표면과 같이 세포 내에서 단백질의 수송 및 위치를 지정하는 펩티드 서열을 지칭한다. 예를 들어 다음 핵산 서열에 의해 코딩되는 펩티드와 같은 시그널 펩티드의 비제한적 실시예는 본원에 개시되어 있다:
본원에 사용된 용어 “특이적 결합(specific binding)”은 항체 및 항원 간에 적어도 10-6 M의 결합 친화도로 접촉하는 것을 말한다. 특정 실시 양태에서, 항체는 적어도 약 10-7 M, 및 바람직하게 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 또는 10-12 M의 친화도로 결합한다.
“고형 종양(solid tumor)” 은 일반적으로 낭종이나 액체 부위를 포함하지 않는 비정상 조직 덩어리이다. 고형 종양은 양성(benign) 또는 악성, 전이성(metastatic) 또는 비전이성일 수 있다. 상이한 종류의 고형 종양들이 그들을 형성하는 세포의 종류로 이름붙여진다. 고형 종양의 예시는 육종(sarcoma), 암종(carcinoma), 및 림프종(lymphoma)이다.
본원에 사용된 용어 “자살 유전자” 는 세포 아폽토시스를 유도할 수 있는 유전자이다; 비제한적 실시예는 HSV-TK(Herpes simplex virus thymidine kinase), 시토신(cytosine) 데아미나아제, 니트로리덕타아제, 카르복실에스터라아제(carboxylesterase), 시토크롬(cytochrome) P450 또는 PNP(Purine nucleoside phosphorylase), 잘린 EGFR, 또는 유도성 카스파제(“iCasp”)를 포함한다. 자살 유전자는 다양한 경로로 작용할 수 있으며, 일부의 경우, 소분자와 같은 유도성 작용물로 유도할 수 있다. 예를 들어, iCasp 자살유전자는 유도 작용물을 결합하기에 최적화된 단백질에 작동 가능하게 연결된 카스파제 단백질의 일부분을 포함한다; 세포 내에 자살 유전자를 포함하는 유도성 작용물의 도입은 카스파제의 활성 및 뒤따르는 상기 세포의 아폽토시스를 유발한다.
본원에 사용된 용어 “T2A” 및 “2A 펩티드”는 상호교환적으로 사용되며 임의의 2A 펩티드 또는 그의 단편, 임의의 2A-유사 펩티드 또는 그의 단편, 또는 공통 폴리펩티드(consensus polypeptide) 모티프 D-V/I-E-X-N-P-G-P (서열번호 35) (여기서 X는 자가 절단하는 것으로 생각되는 임의의 아미노산임)를 포함하는 상대적으로 짧은 펩티드 서열 내의 필수 아미노산(기원이 되는 바이러스에 따라 20개 아미노산 길이와 비슷한) 인공 펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 “T 세포” 는 흉선에서 성숙하는 림프구의 종류를 지칭한다. T 세포는 세포-매개 면역에서 중요한 역할을 하며, 세포 표면에 T 세포 수용체의 존재에 의해 B 림프구와 같은 다른 림프구와 구별된다. T 세포는 또한 분리되거나 상업적으로 이용가능한 공급원으로부터 얻을 수 있다. “T 세포”는 헬퍼 T 세포(CD4+ 세포), 세포독성(cytotoxic) T 세포(CD8+ cells), 자연살해 T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함하여 CD3을 발현하는 모든 종류의 면역세포를 포함한다. “세포독성 세포”는 세포독성 반응을 매개할 수 있는 CD8+ T 세포, NK(natural-killer) 세포, 및 호중구를 포함한다. 상업적으로 이용가능한 T세포주의 비제한적 예시는 BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™), BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™), BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™), BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™), Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™), TALL-104 cytotoxic human T cell line (ATCC # CRL-11386)를 포함한다. 추가적인 예시는 예를 들어, Deglis, EBT-8, HPB-MLp-W, HUT 78, HUT 102, Karpas 384, Ki 225, My-La, Se-Ax, SKW-3, SMZ-1 and T34와 같은 성숙 T세포주; 및 예를 들어, ALL-SIL, Be13, CCRF-CEM, CML-T1, DND-41, DU.528, EU-9, HD-Mar, HPB-ALL, H-SB2, HT-1, JK-T1, Jurkat, Karpas 45, KE-37, KOPT-K1, K-T1, L-KAW, Loucy, MAT, MOLT-1, MOLT 3, MOLT-4, MOLT 13, MOLT-16, MT-1, MT-ALL, P12/Ichikawa, Peer, PER0117, PER-255, PF-382, PFI-285, RPMI-8402, ST-4, SUP-T1 to T14, TALL-1, TALL-101, TALL-103/2, TALL-104, TALL-105, TALL-106, TALL-107, TALL-197, TK-6, TLBR-1, -2, -3, and -4, CCRF-HSB-2 (CCL-120.1), J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153), J45.01 (ATCC CRL-1990), J.CaM1.6 (ATCC CRL-2063), RS4;11 (ATCC CRL-1873), CCRF-CEM (ATCC CRM-CCL-119)와 같은 미성숙 T 세포주; 및 예를 들어, HuT78 (ATCC CRM-TIB-161), MJ[G11] (ATCC CRL-8294), HuT102 (ATCC TIB-162)와 같은 피부 T 세포 림프종 라인을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. REH, NALL-1, KM-3, L92-221를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 눌 백혈병 세포주는 K562 적백혈병(erythroleukemia), THP-1단핵구성 백혈병(monocytic leukemia), U937 림프종, HEL 적백혈병, HL60 백혈병, HMC-1 백혈병, KG-1 백혈병, U266 골수종(myeloma)과 같은 다른 백혈병 및 림프종에서 유래된 세포주와 마찬가지로, 면역 세포의 다른 상업적으로 이용가능한 공급원이다. 이러한 상업적으로 이용가능한 세포주의 비제한적 예시적 공급원은 American Type Culture Collection, 또는 ATCC, (http://www.atcc.org/) 및 the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.
키메릭 항원 수용체 세포의 제조에 적용되는 용어 “형질도입시키다(transduce)” 또는 “형질도입(transduction)”은 이로써 외래 뉴클레오티드 서열이 세포 내로 도입되는 과정이다. 일부 구현예에서, 상기 형질도입은 벡터를 통해 이루어진다.
본원에 사용된 용어, 대상에서의 질병의 “치료하는(treating)” 또는 “치료(treatment)”는 (1) 질병의 증상을 나타내기 쉽거나 또는 아직 나타내지 않은 대상에서 증상 또는 질병을 예방하는 것; (2) 질병을 억제하거나 이의 발달을 정지시키는 것; 또는 (3) 질병 또는 그 질병의 증상의 퇴화를 일으키거나 또는 개선하는 것을 지칭한다. 당업계에서 이해되는 것과 같이, “치료”는 임상적 결과를 포함하여 이로운 또는 원하는 결과를 얻는 접근 방법이다. 본 기술의 목적에 따라, 이로운 또는 원하는 결과는 검출 가능하거나 또는 검출 불가능한, 하나 또는 그 이상의 증상의 완화 또는 개선, 상태(질병을 포함)의 정도의 감소, 안정화된(즉, 나빠지지 않는) 상태(질병을 포함), 상태(질병을 포함)의 지연 또는 완화, 상태(질병을 포함)의 진행, 개선 또는 완화, 상태(states) 및 차도(부분적이거나 전체적인)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 개시된 조성물 및 방법을 포함하는 치료는 1차, 2차, 3차, 4차, 5차 요법일 수 있으며, 단일 치료요법 또는 다른 적절한 치료요법과 함께 사용될 수 있는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 “벡터”는 상이한 숙주 사이에 이동(transfer)을 위해 제조된 핵산 구조를 지칭하며, 플라스미드, 바이러스, 코스미드(cosmid), 파지, BAC, YAC, 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 플라스미드 벡터는 상업적으로 이용가능한 벡터로부터 제조될 수 있다. 다른 구현예에서, 바이러스 벡터들은 당업계에 알려진 테크닉에 따라 바큘로바이러스(baculoviruse), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), AAV, 등으로부터 제조될 수 있다. 한 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스성 벡터이다.
상기 나열된 서열과 관련된 GenBank 접근 번호, UniProt 참조 번호, 및 참고문헌은 본원에 참고문헌으로 포함된다.
약어 목록
AML: 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)
CAR: 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor)
iCasp: 유도성 카스파제(induced caspase)
발명을 실시하기 위한 구체적 내용
최근 유전적으로 조작된 키메릭 항원 수용체(CAR) T 세포로 자가치료법(autologous treatment)을 사용하여 B 세포 림프종 및 백혈병에서 전례 없는 결과를 얻었기 때문에, 많은 연구실들이 이 접근법을 난소암, 전립선암 및 췌장 종양을 포함하는 고형종양(solid tumor)에 적용하기 시작했다(Maude, S.L. et al. (2014) New Engl. J. Med. 371:1507-1517; Porter, D.L. et al. (2011) New Engl. J. Med. 365:725-733). CAR 변형된 T 세포는 단일클론항체의 HLA-독립적 타겟 특이성과 T 세포의 세포 용해 활성(cytolytic activity), 증식, 및 호밍(homing) 특성을 결합하지만, 체크포인트 억제에는 반응하지 않는다. 항원 발현 타겟을 직접 살해하는 그들의 능력 때문에, CAR-T 세포들은 항원 양성 세포나 조직에 고도로 독성이 있어 높은 종양 특이적인 항체를 갖는 CAR를 만들 필요가 있다. 현재까지, 인간 고형종양에 대한 CAR 변형된 T 세포들이 α-엽산 수용체, 메소텔린(mesothelin), 및 MUC-CD, PSMA, 및 다른 타겟에 대해 구축되었으나 대부분이 정상 조직에서 오프-타겟 발현을 갖는다. 이 구조들은 환자에게 동일한 예외적인 결과를 보이지 않아 고형종양에 대해 사용될 수 있는 CAR T-세포 구조의 새로운 타겟과 방법을 동정하는 추가적인 연구에 대한 필요성을 강조하였다.
그러므로, 본원은 FLT3에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 CAR(chimeric antigen receptor), 일부 실시 양태에서는 FLT3 항체의 항원 결합 도메인 및 그의 이용 및 제조에 관련된 방법 및 조성물을 제공한다.
키메릭 항원 리셉터 및 그의 이용
I. 구성요소
본원은 FLT3에 결합하는 CAR(chimeric antigen receptors)를 제공하며, CAR는 세포외, 막 관통, 및 세포내 도메인을 포함하는 세포 활성 모이어티(moiety)를 포함하거나, 또는 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 세포외 도메인은 항원 결합 도메인이라고도 지칭하는 타겟 특이적 결합 요소를 포함한다. 세포내 도메인 또는 세포질 도메인은 공자극(co-stimulatory) 시그널링 영역 및 제타 쇄 부분을 포함한다. CAR는 선택적으로 300개 아미노산 이하, 바람직하게는 10에서 100개 아미노산, 더 바람직하게는 25에서 50개 아미노산의 스페이서 도메인을 추가로 더 포함할 수 있다.
스페이서 도메인. CAR는 선택적으로 300개 아미노산 이하, 바람직하게는 10에서 100개 아미노산, 더 바람직하게는 25에서 50개 아미노산의 스페이서 도메인을 추가로 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 아미노산일 수 있다. 스페이서 도메인은 예를 들어, 인간 Fc 도메인, CH3 도메인, 또는 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM, 또는 그들의 변이체와 같은 임의의 면역글로불린의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 (Kabat numbering에 따르면) S228P, L235E, 및/또는 N297Q 돌연변이가 존재하거나 부존재하는 IgG4 힌지를 포함할 수 있다. 추가적인 스페이서는 CD4, CD8, 및 CD28 힌지 영역을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
항원 결합 도메인. 특정 실시 양태에서, 본원은 FLT3 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성되는 CAR를 제공한다.
일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 FLT3에 결합하는 항체 또는 FLT3 항체의 항원 결합 도메인을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 이 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 예를 들면, Becton Dickinson Biosciences 및 www.biocompare.com/Search-Antibodies/?search=FLT3&said=0의 목록에 있는 상업적 출처로부터 이용할 수 있다.
한 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 FLT3 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 비제한적 구현예에서, FLT3 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 FLT3 항체의 항원 결합 도메인을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 도메인은 예를 들어, scFv와 같은 타겟-특이적 항체(즉, 항-FLT3 항체)의 단편(fragment)을 포함하거나, 구성되거나 또는 필수적으로 구성된다. scFv 영역은 짧은 링커 펩티드로 연결된 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 포함할 수 있다. 링커 펩티드는 1에서 50개 아미노산일 수 있으며, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 아미노산이다. 일부 구현예에서, 링커에는 글리신(glycin)이 풍부하며, 그럼에도 불구하고 그것은 세린 또는 트레오닌 또한 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 19에 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성된다 : CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCATTGAAGCTGTCCTGCAAGTCTTCCGGGTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTCTGACAGTTATAAAGACTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTGGACAGATCCTCCAACACAGCCTACATGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGATGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGCGATTACGACGACCCCCTTTGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 27에 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성된다 : CAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACCTGCACAGTCTCTGGTTTCTCATTAACTAACTATGGTTTACACTGGGTTCGCCAGTCTCCAGGAAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGAGTGGTGGAAGCACAGACTATAATGCAGCTTTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTTAAAATGAACAGTCTGCAGGCTGATGACACAGCCATATACTACTGTGCCAGAAAAGGAGGGATCTACTATGCTAACCATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA.
특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 SYWMH(서열번호 21), NYGLH(서열번호 29) 또는, 이들 각각의 등가물로 시작하여 카복시 말단에 추가적으로 50개 아미노산, 또는 대안으로 약 40개 아미노산, 또는 대안으로 약 30개 아미노산, 또는 대안으로 약 20개 아미노산, 또는 대안으로 약 10개 아미노산, 또는 대안으로 약 5개 아미노산, 또는 대안으로 약 4, 또는 3, 또는 2, 또는 1개 아미노산이 뒤따르는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 또 추가적으로 더 구성되는 CDRH1 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 EIDPSDSYKDYNQKFKD (서열번호 22), VIWSGGSTDYNAAFIS (서열번호 30), 또는 이들 각각의 등가물로 시작하여 카복시 말단에 추가적으로 50개 아미노산, 대안으로 약 40개 아미노산, 또는 대안으로 약 30개 아미노산, 또는 대안으로 약 20개 아미노산, 또는 대안으로 약 10개 아미노산, 또는 대안으로 약 5개 아미노산, 또는 대안으로 약 4, 또는 3, 또는 2, 또는 1개 아미노산이 뒤따르는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 또 추가적으로 더 구성되는 CDRH2 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 AITTTPFDF (서열번호 23), GGIYYANHYYAMDY (서열번호 31) 또는 이들 각각의 등가물로 시작하여 카복시 말단에 추가적으로 50개 아미노산, 대안으로 약 40개 아미노산, 또는 대안으로 약 30개 아미노산, 또는 대안으로 약 20개 아미노산, 또는 대안으로 약 10개 아미노산, 또는 대안으로 약 5개 아미노산, 또는 대안으로 약 4, 또는 3, 또는 2, 또는 1개 아미노산이 뒤따르는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 또 추가적으로 더 구성되는 CDRH3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 20에 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 또 추가적으로 구성된다 :
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAGAGTATTAGCAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAGTGTATTTCTGTCAACAGAGTAACACCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG
일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 28에 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 항원 결합 단편 또는 그들 각각의 등가물을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성된다 :
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTATATGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 RASQSISNNLH (서열번호 24), KSSQSLLNSGNQKNYM (서열번호 32), 또는 이들 각각의 등가물로 시작하여 카복시 말단에 추가적으로 50개 아미노산, 또는 대안으로 약 40개 아미노산, 또는 대안으로 약 30개 아미노산, 또는 대안으로 약 20개 아미노산, 또는 대안으로 약 10개 아미노산, 또는 대안으로 약 5개 아미노산, 또는 대안으로 약 4개, 또는 3, 또는 2, 또는 1개 아미노산이 뒤따르는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가적으로 더 구성되는 CDRL1 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 YASQSIS (서열번호 25), GASTRES (서열번호 33), 또는 이들 각각의 등가물로 시작하여 카복시 말단에 추가적으로 50개 아미노산, 또는 대안으로 약 40개 아미노산, 또는 대안으로 약 30개 아미노산, 또는 대안으로 약 20개 아미노산, 또는 대안으로 약 10개 아미노산, 또는 대안으로 약 5개 아미노산, 또는 대안으로 약 4, 또는 3, 또는 2, 또는 1개 아미노산이 뒤따르는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가적으로 더 구성되는 CDRL2 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 QQSNTWPYT (서열번호 26), QNDHSYPLT (서열번호 34), 또는 이들 각각의 등가물로 시작하여 카복시 말단에 추가적으로 50 아미노산, 또는 대안으로 약 40개 아미노산, 또는 대안으로 약 30개 아미노산, 또는 대안으로 약 20 아미노산, 또는 대안으로 약 10 아미노산, 또는 대안으로 약 5 아미노산, 또는 대안으로 약 4, 또는 3, 또는 2, 또는 1 아미노산이 뒤따르는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가적으로 더 구성되는 CDRL3 서열을 포함한다.
본원의 또 다른 실시 양태에서, FLT3 항체의 항원 결합 도메인은 다음의 특성 중 하나 또는 그 이상을 포함한다:
(a) 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열은 임의의 개시된 경쇄 서열의 경쇄 가변 도메인의 CDR과 적어도 80% 동일한 하나 또는 그 이상의 CDR을 포함한다;
(b) 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열은 임의의 개시된 중쇄 서열의 중쇄 가변 도메인의 CDR과 적어도 80% 동일한 하나 또는 그 이상의 CDR을 포함한다;
(c) 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열은 임의의 개시된 경쇄 서열의 경쇄 가변 도메인과 적어도 80% 동일하다;
(d) HC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 임의의 개시된 경쇄 서열의 중쇄 가변 도메인과 적어도 80% 동일하다; 및
(e) 항체는 임의의 개시된 서열에 의해 결합된 에피토프(epitope)와 중첩하는 에피토프에 결합한다.
등가물의 추가적인 예시는 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열(complement)에 높은 엄격도 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드와 적어도 85%, 또는 대안으로 적어도 90%, 또는 대안으로 적어도 95%, 또는 대안으로 적어도 97%의 아미노산 동일성을 갖는 펩티드를 포함하며, 상기 높은 엄격도 조건은 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 버퍼 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아마이드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함하는 것이다.
예시적인 항원 결합 도메인은 하기에 기재한 하나 또는 그 이상의 펩티드를 포함할 수 있으며, 한 실시 양태에서 표 1 및 표 2에 각각 개시된 특정 항원에 대한 기재된 HC 및 LC의 3개의 CDR 전부를 포함할 수 있다.
항-FLT3
항체		 CDRH1 CDRH2 CDRH3 CDRL1 CDRL2 CDRL3
FLT3-1 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26
FLT3-2 서열번호 29 서열번호 30 서열번호 31 서열번호 32 서열번호 33 서열번호 34
항-FLT3 항체 중쇄 가변 영역 경쇄 가변 영역
FLT3-1 서열번호 19 서열번호 20
FLT3-2 서열번호 27 서열번호 28
한 실시 양태에서, 본원은 FLT3-1과 적어도 80%, 또는 대안으로 85%, 또는 대안으로 90%, 또는 대안으로 95% 동일한 항체의 항원 결합 도메인을 제공한다. 등가물의 추가적인 예시는 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열에 높은 엄격도 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 높은 엄격도 조건은 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 버퍼 농도; 약 55%내지 약 75%의 포름아마이드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함하는 것이다.
본원에 제공된 항체의 실시 양태 일부에서, HC 가변 도메인 서열은 FLT3-1의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 FLT3-1의 가변 도메인 서열을 포함한다.
한 실시 양태에서, 본원은 FLT3-1의 CDR을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본원은 FLT3의 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열에 높은 엄격도 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 FLT3-1의 CDR과 적어도 85%, 또는 대안으로 80%, 또는 대안으로 85%, 또는 대안으로 90%, 또는 대안으로 95%, 또는 대안으로 적어도 97% 동일한 항체의 항원 결합 도메인을 제공하며, 상기 높은 엄격도 조건은 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 버퍼 농도; 약 55%내지 약 75%의 포름아마이드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함하는 것이다.
한 실시 양태에서, 본원은 FLT3-2와 적어도 80%, 또는 대안으로 85%, 또는 대안으로 90%, 또는 대안으로 95%, 또는 대안으로 적어도 97% 동일한 항체의 항원 결합 도메인을 제공한다. 동등물의 추가적인 예시는 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열에 높은 엄격도 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 높은 엄격도 조건은 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 버퍼 농도; 약 55%내지 약 75%의 포름아마이드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함하는 것이다.
본원에 제공된 항체의 실시 양태 일부에서, HC 가변 도메인 서열은 FLT3-2의 가변 도메인 서열을 포함하고, LC 가변 도메인 서열은 FLT3-2의 가변 도메인 서열을 포함한다.
한 실시 양태에서, 본원은 FLT3-2의 CDR을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 제공한다. 한 실시 양태에서, 본원은 FLT3의 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열에 높은 엄격도 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 FLT3-2의 CDR과 적어도 85%, 또는 대안으로 80%, 또는 대안으로 85%, 또는 대안으로 90%, 또는 대안으로 95%, 또는 대안으로 적어도 97% 동일한 항체의 항원 결합 도메인을 제공하며, 상기 높은 엄격도 조건은 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1x SSC 내지 0.1x SSC의 버퍼 농도; 약 55%내지 약 75%의 포름아마이드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함하는 것이다.
막 관통 도메인. 막 관통 도메인은 자연 혹은 합성 공급원으로부터 유래한 것일 수 있다. 공급원이 자연일 경우, 도메인은 막-결합 또는 막 관통 단백질로부터 유래한 것일 수 있다. 본원에서 특히 이용한 막 관통 영역은 CD8, CD28, CD3, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154, TCR로부터 유래한 것일 수 있다. 선택적으로 막 관통 영역은 합성물일 수 있으며, 이 경우 주로 류신(leucine) 및 발린(valine)과 같은 소수성 잔기를 주로 포함할 것이다. 바람직하게는 합성 막 관통 도메인의 각 끝에서 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan) 및 발린의 삼중체(triplet)가 발견될 것이다. 대안으로, 짧은 올리고-또는 폴리펩티드 링커는 바람직하게는 2 내지 10개 아미노산 길이가 CAR의 세포질 시그널링 도메인 및 막 관통 도메인 간의 연결을 형성할 것이다. 글리신-세린 이중체(doublet)는 특히 적합한 링커를 제공한다.
세포질 도메인. CAR의 세포질 도메인 또는 세포내 시그널링 도메인은 CAR 세포가 위치한 곳에서 면역 세포의 전형적인 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 세포내 시그널링 도메인은 이펙터 기능 시그널을 변환(transduce)하고 면역 세포에 그의 특이적 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 말한다. 전체 시그널링 도메인 또는 절단된 부분이 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분하다면 절단된 부분이 사용될 수 있다. TCR 및 공수용체(co-receptors) 및 세포내 시그널링 도메인으로 기능할 수 있는 이의 유도체 또는 변이체의 세포내 서열은 CAR에 이용될 수 있다. 본원에 특히 사용된 세포내 시그널링 도메인은 FcR, TCR, CD3, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d로부터 유래한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, CAR의 시그널링 도메인은 CD3ζ 시그널링 도메인을 포함할 수 있다.
TCR을 통해 생성되는 시그널만으로는 T 세포의 완전한 활성화를 일으키기에 충분하지 않기 때문에, 2차 또는 공자극 시그널이 또한 요구될 수 있다. 그러므로, 단백질 CD27, CD28, 4-IBB(CD 137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS LFA-1(lymphocyte function-associated antigen-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 또는 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 의 세포내 도메인을 포함하나 이에 한정되지는 않는 공자극 시그널링 분자의 세포내 영역은 CAR의 세포내 도메인에 또한 포함될 수 있다. 예를 들어, CAR는 시그널링 도메인에 더하여 하나, 둘, 또는 그 이상의 공자극 도메인을 포함할 수 있다(예를 들어, CD3ζ 시그널링 도메인).
일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체의 세포 활성 모이어티는 CD8 단백질, CD28 단백질, 4-1BB 단백질, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, CD27, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD3-제타 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질 또는 그의 단편을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성되는 T-세포 시그널링 도메인이다.
구체적인 구현예에서, CAR는 FLT3 항체(예를 들어, scFv)의 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, CD28 막 관통 도메인, 공자극 시그널링 영역, 및 CD3 제타 시그널링 도메인을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 또 구성된다. 추가적인 구현예에서, 공자극 시그널링 영역은 CD28 공자극 시그널링 영역 및 4-1BB 공자극 시그널링 영역 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
스위치 메커니즘. 일부 구현예에서, CAR는 CAR의 활성 및/또는 발현을 조절하는 스위치 메커니즘을 또한 포함할 수 있다. CAR는 예를 들어, 세포외, 막관통, 세포내 도메인을 포함하거나, 구성되거나, 또는 필수적으로 구성될 수 있으며, 여기서, 세포외 도메인은 표적 세포상에 또는 표적 세포에 의해 발현되는 표적 항원 외의 분자에 특이적인 라벨, 결합 도메인 또는 태그에 결합하는 표적 특이적 결합 요소를 포함한다. 이러한 구현예에서, 타겟 항원 결합 도메인(예를 들어, 항-FLT3 항체 또는 그의 단편 또는 FLT3 및 CAR 상의 라벨 또는 태그에 결합하는 이중 특이적 항체) 및 CAR 상의 라벨, 결합 도메인 또는 태그에 의해 인식되거나 결합하는 도메인을 포함하거나, 구성되거나, 필수적으로 포함되는 2차 구조에 의해 CAR의 특이성이 제공될 수 있다. 예를 들어, WO 2013/044225, WO 2016/000304, WO 2015/057834, WO 2015/057852, WO 2016/070061, US 9,233,125, US 2016/0129109을 참조하라. 이러한 방식으로, CAR를 발현하는 T 세포는 대상에게 투여될 수 있으나, FLT3 특이적 결합 도메인을 포함하는 제2 조성물이 투여될 때까지 그의 표적 항원(즉, FLT3)에 결합할 수 없다.
본원의 CAR 역시 그들의 기능(예를 들어, US 2015/0368342, US 2016/0175359, US 2015/0368360를 참고하라) 을 활성화하기 위해 멀티머화(multimerization) 및/또는 T 세포 반응을 제거하기 위해 소분자 약제와 같은 외인성 시그널을 요구할 수 있다.
여기에 더하여, 개시된 CAR는 처리에 이어 CAR 세포 사멸을 유도하거나 또는 타겟 항원에의 결합에 이어 CAR 발현을 하향 조절(downregulate)하기 위한 “자살 스위치”(“자살 유전자”라고 표현하기도 한다)를 포함할 수 있다. 자살 스위치 또는 자살 유전자의 비제한적 예시는 iCasp이다.
일부 구현예에서, CAR는 검출 가능한 마커 또는 정제 마커(purification marker)를 추가로 더 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 본원에 설명한 CAR는 예를 들면 진단 또는 치료를 위한 약리학적으로 허용 가능한 담체와 같은 조성물에 포함된다.
Ⅱ. FLT3 항체 제조 프로세스
본원에서 사용되는 항체는 당업계에 알려진 방법 및 본원에 간략히 설명한 방법을 사용하여 제조하거나 구입할 수 있다. 그들의 제조 및 사용은 예를 들어 Greenfield (2014) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 등에 개시되어 있으며 잘 알려져 있다. 항체들은 당업계에 알려진 표준 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 항체의 예시는 단일클론, 단일 쇄, 및 항체의 기능적 단편을 포함한다(하지만 이에 제한되지는 않는다).
항체는 예를 들어 염소, 토끼, 래트, 마우스, 인간 및 다른 다양한 범위의 숙주로부터 제조될 수 있다. 그들은 FLT3의 C-말단 단편 또는 분리된 폴리펩티드와 같은 면역원성 특징을 갖는 타겟 항원 또는 이의 단편 올리고펩티드 또는 이의 단편을 주사하여 면역화되었을 수 있다. 숙주 종(species)에 따라, 다양한 어쥬번트(adjuvant)가 첨가되고 면역 반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 그러한 어쥬번트는 프로인트(Freund’s), 알루미늄 하이드록시드(aluminium hydroxide)와 같은 무기물 겔, 및 리소레시틴(lysolecitin), 플루로닉 폴리올(pluronic polyols), 폴리어나이온(polyanion), 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin) 및 다이니트로페놀(dinitrophenol)과 같은 표면 활성 물질을 포함할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 인간에 사용되는 어쥬번트 중에서, BCG(Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파붐(Corynebacterium parvum)는 특히 유용하다. 본원 또한 분리된 폴리펩티드 및 어쥬번트를 제공한다.
특정 실시 양태에서, 본원의 항체는 다클론성의(polyclonal), 즉 상이한 아미노산 서열을 갖는 FLT3 항체의 복수의 종류의 혼합물이다. 한 실시 양태에서, 다클론성의 항체는 상이한 CDR을 갖는 FLT3 항체의 복수의 종류의 혼합물을 포함한다. 이와 같이, 상이한 항체를 생산하는 세포의 혼합물을 배양하고, 제조된 배양물로부터 정제된 항체를 사용할 수 있다(WO 2004/061104를 참고하라).
단일클론 항체 제조. FLT3 관련 항원에 대한 단일클론항체는 배양체 내의 연속 세포주에 의한 항체 분자의 제조를 제공하는 임의의 테크닉을 이용하여 제조될 수 있다. 그러한 테크닉은 인간 단일클론 항체를 제조하는 테크닉인 하이브리도마(hybridoma)테크닉(예를 들어, Kohler & Milstein (1975) Nature 256: 495-497을 참고하라); 트리오마(trioma) 테크닉; 인간 B-세포 하이브리도마 테크닉(예를 들어, Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4: 72을 참고하라) 및 EBV 하이브리도마 테크닉(예를 들어, Cole et al. (1985) in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96를 참고하라). 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 인간 단일클론 항체는 본 기술의 실시에 이용될 수 있으며 인간 하이브리도마를 이용하거나(예를 들어, Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030를 참고하라) 인간 B-세포를 in vitro에서 Epstein Barr Virus로 형질전환함으로써(예를 들어, Cole et al. (1985) in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96를 참고하라) 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 영역을 코딩하는 핵산의 개체군이 분리될 수 있다. 항체의 보존 영역을 코딩하는 서열로부터 유래한 프라이머를 이용하는 PCR은 개체군으로부터 온 항체 부분을 코딩하는 서열을 증폭하는 데 이용될 수 있으며 그리고 나서 증폭된 서열로부터 가변 도메인과 같은 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA를 재구성한다. 증폭된 서열은 또한 다른 단백질- 예를 들어, 박테리오파지 외피(coat), 또는 박테리아 세포 표면 단백질-을 코딩하는 DNA에 융합하여 파지 또는 박테리아에 융합 폴리펩티드를 발현하고 디스플레이할 수 있다. 증폭된 서열은 그리고 나서 FLT3 관련 항원 폴리펩티드 상에 존재하는 항원 또는 에피토프에 대한 발현된 항체 또는 그의 단편에 대한 친화력에 기반하여 선별 또는 분리된다. 대안으로, FLT3 단일클론항체를 발현하는 하이브리도마는 예를 들어, FLT3 관련 항원 또는 그의 단편을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성되는 분리된 폴리펩티드로 대상을 면역화하고, 그리고 나서 일반적인 방법을 사용하여 대상의 비장(spleen)으로부터 하이브리도마를 분리함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, Milstein et al., (Galfre and Milstein (1981) Methods Enzymol 73:3-46)를 참고하라. 표준 방법을 이용하여 하이브리도마를 스크리닝하는 방법은 다양한 특이성(즉, 상이한 에피토프에 대한 것) 및 친화성을 만든다. 예를 들어 FLT3 관련 항원에 결합하는, 원하는 특성을 갖는 선별된 단일클론항체는 (i) 하이브리도마에 의해 발현된 대로 사용되거나, (ii) 그 특성을 변경하기 위해 PEG(polyethylene glycol)과 같은 분자에 결합하거나, 또는 (iii) 다양한 방법으로 분리, 시퀀싱 및 조작될 수 있는 단일클론 항체를 코딩하는 cDNA가 될 수 있다. 한 실시 양태에서, FLT3 단일클론항체는 예를 들어 불멸화된 세포에 융합한 인간 중쇄 트랜스진(transgene) 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스와 같은 트랜스제닉(transgenic) 비-인간 동물로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 제조될 수 있다. 하이브리도마 테크닉은 당업계에 잘 알려진 것과 Greenfield (2014) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Hammerling et al. (1981) Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas:563-681 에서 발표된 것을 포함한다.
파지 디스플레이 테크닉. 상기 기술한 것과 같이, 본원의 항체는 재조합 DNA 및 파지 디스플레이 기술의 적용을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, FLT3 항체는 당업계에 잘 알려진 다양한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에 있어서, 기능적 항체 도메인은 그것들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면에 디스플레이된다. 원하는 결합 특성을 갖는 파지는 전형적으로는 고체 표면 또는 비드에 결합하거나 포획된(captured) 항원과 같은 항원을 레파토리(repertoire)또는 조합성(combinatorial) 항체 라이브러리(예를 들어, 인간 또는 뮤린(murine))로부터 직접적으로 선별함으로써 선별될 수 있다. 이러한 방법에 사용된 파지는 전형적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질 중 어느 하나에 재조합적으로 결합하는 Fab, Fv 또는 다이설파이드(disulfide) 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 fd 및 M13을 포함하는 필라멘터스(filamentous) 파지이다. 여기에 더하여, 방법들은 예를 들어 폴리펩티드 또는 그의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체와 같은 FLT3 폴리펩티드에 대한 원하는 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편의 빠르고 효율적인 동정을 허용하는 방법은 Fab 발현 라이브러리 제조에 적용될 수 있다. 본원의 분리된 항체를 제조하는 데 사용된 다른 파지 디스플레이 방법의 예시는 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883; Chaudhary et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:1066-1070; Brinkman et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al. (1997) Gene 187: 9-18; Burton et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280; PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; WO 96/06213; WO 92/01047 (Medical Research Council et al.); WO 97/08320 (Morphosys); WO 92/01047 (CAT/MRC); WO 91/17271 (Affymax); 및 미국특허 제 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727 및 5,733,743호에 개시된 것을 포함한다.
다이설파이드 결합을 통해 폴리펩티드를 부착함으로써 박테리오파지 입자의 표면에 폴리펩티드를 디스플레이하는 데 유용한 방법은 Lohning, 미국특허 제 6,753,136호에 설명되어 있다. 상기 참고문헌에 설명된 바와 같이, 파지 선별 이후, 파지로부터의 항체 코딩 영역은 분리되고 인간 항체, 또는 임의의 다른 원하는 항체 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 제조하는 데 사용될 수 있으며, 또한 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, WO 92/22324; Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12:864-869; Sawai et al. (1995) AJRI 34:26-34; 및 Better et al. (1988) Science 240:1041-1043에 개시된 것과 같은 당업계에 알려진 방법을 이용하여, Fab, Fab′ 및 F(ab′)2 단편을 재조합적으로 제조하는 테크닉이 사용될 수도 있다.
일반적으로, 디스플레이 벡터에 클로닝된 하이브리드 항체 또는 하이브리드 항체 단편은 상기 항체 또는 항체 단편이 파지 또는 플라스미드 입자의 표면에 존재하기 때문에, 좋은 결합 활성을 유지하는 변이체를 동정하기 위해 적합한 항원에 대해 선별될 수 있다. 예를 들어, Barbas III et al. (2001) Phage Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).를 참고하라. 그러나, 항체 단편 라이브러리를 용해성 파지(lytic phage) 벡터(변형된 T7 또는 Lambda Zap 시스템)에 클로닝하는 것과 같은 다른 벡터 형식은 이 과정을 위해 사용될 수 있다.
항체 제조의 대체 방법. 항체는 또한 림프구 개체군에서 in vivo 제조를 유도하거나 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 고도로 특이적인 결합 반응물의 패널을 스크리닝함으로써 제조될 수 있다(Orlandi et al. (1989) PNAS 86:3833-3837; Winter, G. et al. (1991) Nature 349:293-299).
대안으로, 단일쇄 항체 제조의 테크닉이 이용될 수 있다. 단일쇄항체(scFvs)는 (전형적으로 약 5내지 25개 아미노산 길이의)링커 펩티드로 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. scFv 에서, 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 동일한 항체 또는 상이한 항체로부터 유래한 것일 수 있다. scFv는 재조합 테크닉을 이용해, 예를 들면 E. coli.와 같은 숙주 생물 내에 scFv 를 코딩하는 벡터의 발현에 의해, 합성될 수 있다. 상기 기술한 항체의 중쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA 및 그의 경쇄 또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 주형으로 하여 그의 양 말단을 정의하는 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하고, 링커의 양 말단을 각각 중쇄 및 경쇄에 라이게이션하기 위해 폴리펩티드 링커 부분을 코딩하는 DNA및 그의 양 말단을 정의하는 프라이머를 결합하는 증폭을 추가로 더 수행하여 이로부터 선별된 DNA의 전체 또는 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA의 부분을 이용하는 증폭을 수행함으로써 scFv를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다. scFv를 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 벡터 및 그 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주는 당업계에 알려진 전형적인 방법에 따라 얻을 수 있다.
예를 들어 항체 분자의 펩신 소화에 의해 제조될 수 있는 F(ab′)2 단편 및 F(ab′)2 단편의 다이설파이드 브리지(bridge)를 제거함으로써 제조할 수 있는 Fab 단편 등의 항원 결합 단편 또한 생성될 수 있다. 대안으로, 원하는 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편(Huse et al., Science, 256: 1275-1281 (1989))의 빠르고 용이한 동정을 위해 Fab 발현 라이브러리가 제조될 수 있다.
상업적으로 이용 가능한 항체. 항체는 또한 상업적으로 이용 가능한 공급원으로부터 구입될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 FLT3 항체의 예시는 Proteintech Group Inc., eBioscience, Abgent, Aviva Systems Biology, Becton Dickinson (Biosciences), Cell Signaling Technology, Fitzgerald Industries International, United States Biological, Biorbyt, Abbexa, Abgent, LifeSpan BioSciences, antibodies-online, Rockland Immunochemicals, Inc., OriGene Technologies, GeneTex, Raybiotech, Inc., Acris Antibodies GmbH, Sino Biological, MyBioSource.com, Bioss Inc., St. John’s Laboratory, Source BioScicne, Abcam, ProSci, Inc., Clinic Sciences, Novus Biologicals, Creative Diagnostics, Thermo Scientific Pierce Antibodies, PeproTech, MBL International, Miltenyi Biotec, GenWay Biotech, Inc., LifeSpan Biosciences, Bioworld Technology, EXBIO Praha, a.s., Novus Biologicals, BioVision, Bethyl Laboratories, Santa Crus Biotechnology Inc., AbD Serotec, BioRad, BioLegend, Thermo Fisher Scientific, EMD Milipore, R&D Systems, Cell Sciences, Progen Biotechnik GmbH, Spring Bioscience, Atlas Antibodies, Abbiotec, Bostrebio, Nordic BioSite, 및 다른 통상적으로 알려진 항체 제조업자와 같은 공급자에 의해 제조되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상업적으로 이용가능한 FLT3 항체의 비제한적 실시예는 BV10 및 4G8 클론 생물학적 등가물이나 그들의 변형된 형태를 포함하며, 이어지는 상업적으로 이용가능한 항체의 공급자 및 카탈로그 번호 목록을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다 : antibodies-online ABIN487499, antibodies-online ABIN487500, LifeSpan Biosciences LS-C179623-100, LifeSpan Biosciences LS-C179624-50, Acris Antibodies AM20042AF-N, Acris Antibodies AM20042FC-N, MBL International K0107-3, MBL International K0107-4, Novus Biologicals NBP1-54522-0.05mg, Novus Biologicals NBP1-54414, Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-21788, Becton Dickinson Biosciences 564708, Becton Dickinson Biosciences 563494. 상업적으로 이용가능한 항체의 추가적인 예시는 Biocompare 또는 상업적으로 이용가능한 항체의 다른 데이터베이스에 인간 FLT3에 반응하는 항체 목록을 모두 포함한다; 비제한적 실시예는 본원에 개시된, 항체의 공급자 및 카탈로그 번호 목록 Proteintech Group Inc. 21049-1-AP, Proteintech Group Inc. 15827-1-AP, Proteintech Group Inc. 15826-1-AP, eBioscience 17-1357-41, eBioscience 12-1357-41, eBioscience 14-1357-80, eBioscience 17-1357-42, eBioscience 12-1357-42, eBioscience 14-1357-82, Abgent AP7644a, Abgent AP3068a, Aviva Systems Biology OAAB17159, Aviva Systems Biology OAAF00442, Aviva Systems Biology ARP30009_T100, Aviva Systems Biology ARP30010_P050, Cell Signaling Technology 3462S, Cell Signaling Technology 3464S, Cell Signaling Technology 3474S, Cell Signaling Technology 3466S, Cell Signaling Technology 3461S, Cell Signaling Technology 3461L, Cell Signaling Technology 3463S, Cell Signaling Technology 4577S, Fitzgerald Industries International 20R-2351, Fitzgerald Industries International 70R-12259, Fitzgerald Industries International 70R-17325을 포함한다.
항체 등가물. 본원은 상기 개시된 항체의 “등가물” 또는 “생물학적 등가물”을 제공하며, 상기 항체의 항원 결합 도메인은 상기 개시된 임의의 항체의 항원 결합 도메인과 적어도 80%, 또는 대안으로 85%, 또는 대안으로 90%, 또는 대안으로 95%, 또는 대안으로 최소한 97% 동일한 것으로 상기 개시된 항체의 생물학적 등가물을 제공한다. 등가물의 추가적인 예시는 상기 개시된 항체의 임의의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열에 높은 엄격도 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 높은 엄격도 조건은 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 버퍼 농도; 약 55%내지 약 75%의 포름아마이드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함하는 것이다.
항체 변형. 본원의 항체는 항원에 대한 친화도를 높이기 위해 멀티머화될 수 있다. 멀티머화되는 항체는 동일한 항원의 복수의 에피토프를 인식하는 항체의 한 종류 또는 복수의 항체일 수 있다. 항체의 멀티머화의 방법으로써, scFv 분자 2개에 IgG CH3 도메인의 결합, 스트렙타비딘(sterptavidin)에 결합, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프의 도입 및 그와 유사한 것들을 예로 들 수 있다.
본원에 개시된 항체 조성물은 이 항체들 중 임의의 것과 또 다른 작용물 사이에 결합한 형태로 존재할 수 있다(immunoconjugate). 한 실시 양태에서, 본원에 개시된 항체들은 방사성 물질에 결합한다. 다른 실시 양태에서, 본원에 개시된 항체들은 PEG(polyethylene glycol)과 같은 다양한 종류의 분자에 결합할 수 있다.
항체 스크리닝. 다양한 면역분석은 원하는 특성을 갖는 항체를 동정하기 위한 스크리닝에 사용될 수 있다. 확립된 특이성을 갖는 다클론성 또는 단일클론 항체를 이용한 경쟁적 결합 또는 면역방사성분석(imunoradiometric assay)에 대한 많은 프로토콜이 당업계에 잘 알려져 있다. 그러한 면역분석법은 전형적으로 FLT3 관련 항원, 또는 임의의 단편 또는 그의 올리고펩티드 및 이의 특정 항체사이의 복합체 형성을 측정하는 것을 포함한다. 2개의 비간섭성(non-interfering) FLT3 관련 항원 에피토프에 특이적인 단일클론 항체를 이용한 2부위, 단일클론-기반의 면역분석이 이용될 수 있으나, 경쟁적 결합 분석 또한 이용될 수 있다(Maddox et al. (1983) J. Exp. Med. 158:1211-1216).
항체 정제. 본원에 개시된 항체는 동종성(homogeneity)에 대해 정제될 수 있다. 항체의 분리 및 정제는 전형적인 단백질 분리 및 정제 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
단지 예로서, 항체는 크로마토그래피 컬럼(column), 필터, 한외여과(ultrafiltration), 염 침전(salt precipitation), 투석(dialysis), 예비 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(preparative polyacrylamide gel electrophoresis), 등전점 전기영동(isoelectric focusing electrophoresis), 및 그와 유사한 것의 이용을 결합 및 선별함으로써 적절하게 분리 및 정제될 수 있다. Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).
크로마토그래피의 예시는 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성(hydrophobic) 크로마토그래피, 겔 여과(gel filtration) 크로마토그래피, 역상(reverse phase) 크로마토그래피 및 흡착(adsorption) 크로마토그래피 등을 포함한다. 한 실시 양태에서, 크로마토그래피는 HPLC 또는 FPLC와 같은 액체 크로마토그래피를 이용하여 수행될 수 있다.
한 실시 양태에서, 단백질 A 컬럼(Protein A column) 또는 단백질 G 컬럼(Protein G column)은 친화성 크로마토그래피에 이용될 수 있다. 다른 예시적 컬럼은 단백질 A 컬럼, Hyper D, PORPS, 세파로오스(Sepharose) F. F. (Pharmacia) 및 그와 유사한 것을 포함한다.
Ⅲ. 분리된 핵산 및 CAR의 제조 방법
본원의 실시 양태는 FLT3 CAR를 포함하는 분리된 세포 및 그러한 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 세포는 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. 한 실시 양태에서, 상기 세포는 T 세포, B 세포, 또는 NK 세포일 수 있다. 진색세포는 임의의 바람직한 종, 예를 들어, 동물 세포, 인간, 고양이 또는 개 세포와 같은 포유류 세포로부터 온 것일 수 있다.
특정 구현예에서, 분리된 세포는 FLT3 항체의 항원 결합 도메인; 힌지 도메인; 막 관통 도메인 - 예를 들어, CD28 막 관통 도메인; 하나 또는 그 이상의 공자극 영역 - 예를 들어, CD28 공자극 시그널링 영역, 4-1BB 공자극 시그널링 영역, ICOS 공자극 시그널링 영역, 및 OX40 공자극 영역; 및 CD3 제타 시그널링 도메인을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가적으로 더 구성되는, 외인성 CAR를 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가적으로 더 구성된다. 특정 구현예에서, 분리된 세포는 T-세포, 예를 들어, 동물 T세포, 포유류 T세포, 고양이 T 세포, 개 T 세포 또는 인간 T 세포이다. 특정 구현예에서, 분리된 세포는 NK세포, 예를 들어, 동물 NK세포, 포유류 NK세포, 고양이 NK세포, 개 NK세포 또는 인간 NK세포이다.
특정 구현예에서, FLT3 CAR 발현 세포를 제조하는 방법은 분리된 세포의 개체군을 FLT3 CAR를 코딩하는 핵산 서열로 형질도입하는 방법을 포함하거나, 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나 또는 추가로 더 구성된다. 일부 구현예에서, 이것은 FLT3 CAR 구조를 코딩하는 벡터를 이용하여 이루어진다. 일부 구현예에서, 이것은 전기천공을 통해 차례로 세포에 도입되는 FLT3 CAR 구조를 코딩하는 mRNA를 이용하여 이루어진다. 예를 들어, Choi et al. (2010) Biomed Microdevices 12(5):855-863을 참고하라. 추가적인 실시 양태에서, 상기 핵산 서열로 성공적으로 형질도입된 세포의 부차 집단(subpopulation)이 선별된다. 일부 구현예에서, 분리된 세포는 그로 인하여 FLT3 CAR T-세포를 제조하는, T 세포, 동물 T세포, 포유류 T 세포, 고양이 T 세포, 개 T 세포 또는 인간 T 세포이다. 특정 구현예에서, 분리된 세포는 그로 인하여 FLT3 CAR NK-세포를 제조하는, NK 세포, 예를 들어, 동물 NK 세포, 포유류 NK 세포, 고양이 NK 세포, 개 NK 세포 또는 인간 NK 세포이다. 일부 구현예에서, 분리된 세포는 그로 인하여 FLT3 CAR B-세포를 제조하는, B 세포, 동물 B세포, 포유류 B 세포, 고양이 B 세포, 개 B 세포 또는 인간 B 세포이다.
일부 구현예에서, 개시된 CAR를 발현하는 T 세포는 내인성 TCR의 발현을 감소 또는 제거시키도록 추가로 더 변형된 것일 수 있다. 내인성 TCR의 감소 또는 제거는 오프-타겟 효과를 감소시키고 T 세포의 효율을 증가시킬 수 있다. 기능성 TCR의 발현이 안정적으로 결핍된 T세포는 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다. T 세포는 복합체로서 전체 T세포 수용체를 내화(internalize), 분류 및 분해하며, 휴식 중인 T세포에서 약 10시간 및 자극된 T 세포에서 3시간의 반감기를 갖는다(von Essen, M. et al. (2004) J. Immunol. 173:384-393). TCR 복합체의 적절한 기능을 위해서는 TCR 복합체를 구성하는 단백질의 적절한 화학 양론 비(stoichiometric ratio)가 필요하다. TCR 기능은 또한 ITAM 모티프를 갖는 2개의 기능적(functioning) TCR 제타 단백질을 필요로 한다. MHC-펩티드 리간드의 집합(engagement) 시 TCR의 활성화는 모두 적절하게 시그널링해야 하는 동일한 T 세포 상의 다수의 TCR 집합을 필요로 한다. 그러므로, 만약 TCR 복합체가 적절하게 집합하지 않거나 적합하게 시그널링할 수 없는 단백질로 불안정해진다면, T세포는 세포성 반응을 시작하기에 충분하도록 활성화되지 않을 것이다.
따라서, 일부 구현예에서, 1차 T세포에서 CD3 쇄 및/또는 특정 TCR(예를 들어, TCR-α 및 TCR-β)을 코딩하는 핵산을 타겟으로 하는 RNA 간섭(예를 들어, shRNA, siRNA, miRNA, 기타), CRISPR, 또는 다른 방법을 이용하여 TCR 발현을 제거할 수 있다. 이들 단백질의 하나 또는 그 이상의 발현을 억제함으로써, T세포는 TCR 복합체의 주요 구성요소의 하나 또는 그 이상을 더 이상 생성하지 못할 것이며, 그로 인하여 TCR 복합체를 불안정화하고 기능성 TCR의 표면 발현을 억제할 것이다. 비록 일부 TCR 복합체는 RNA 간섭이 이용될 경우 세포 표면에 재활용될 수 있으나, 상기 RNA(예를 들어, shRNA, siRNA, miRNA, 기타)는 TCR 단백질의 새로운 생성을 억제하여 전체 TCR 복합체의 분해 및 제거로 이어질 것이며, 이것은 기능성 TCR 발현의 안정적인 결핍을 갖는 T세포의 생성으로 이어진다.
1차 T세포에서 억제성(inhibitory) RNA(예를 들어, shRNA, siRNA, miRNA, 기타)의 발현은 임의의 전형적인 발현 시스템, 예를 들어 렌티바이러스 발현 시스템을 이용하여 이루어질 수 있다. 렌티바이러스는 휴식 중인 1차 T 세포를 타겟으로 하는 데 유용하지만, 모든 T세포가 shRNA를 발현하지는 않을 것이다. 이들 T 세포 중 일부는 T 세포의 기능적 활성을 변화시키기에 충분한 TCR 발현 억제를 허용하기에 충분한 양의 RNA를 발현하지 않을 수 있다. 따라서, 예를 들면 세포 분류 또는 분리 테크닉에 의해, 바이러스 형질 도입 후 중등도 내지 고도의 TCR 발현을 유지하는 T 세포는 제거될 수 있으며, 나머지 T 세포는 기능적 TCR 또는 CD3의 발현이 결핍된 T 세포의 분리된 개체군의 확장을 가능하게 하는 세포 표면 TCR 또는 CD3가 결핍된다.
분리된 세포의 공급원. 본원에 개시된 세포의 확장 및 유전적 변형에 앞서서, 세포들은 대상 - 예를 들어, 자가 요법을 포함하는 실시예 - 또는 상업적으로 이용가능한 배양액으로부터 얻을 수 있다.
세포는 말초혈액단핵세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염된 부위로부터의 조직, 복수(ascites), 흉수액(pleural effusion), 비장(spleen) 조직, 및 종양을 포함하는 대상의 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다.
관련 세포를 분리하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본원에 쉽게 적용될 수 있다; 예시적 방법은 하기 예시에 설명되어 있다. 본원과 관련하여 사용되는 분리 방법에는 STEMcell Technologies EasySep™, RoboSep™, RosetteSep™, SepMate™; Miltenyi Biotec MACS™ 세포 분리 키트, 그 밖에 상업적으로 이용가능한 세포 분리 및 격리(isolation) 키트를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 고유한 세포 표면 마커에 특이적인 키트에서 이용 가능한 비드 또는 다른 결합 작용물의 이용을 통해 면역세포의 특정 부차 집단을 분리할 수 있다. 예를 들어, MACS™ CD4+ 및 CD8+ MicroBeads는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 분리하는 데에 이용될 수 있다.
대안으로, 세포는 상업적으로 이용 가능한 세포 배양체로부터 얻을 수 있으며, T 세포에 대해, BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™), BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™), BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™), BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™), Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™) 라인; B세포에 대해, AHH-1 (ATCC® CRL-8146™), BC-1 (ATCC® CRL-2230™), BC-2 (ATCC® CRL-2231™), BC-3 (ATCC® CRL-2277™), CA46 (ATCC® CRL-1648™), DG-75 [D.G.-75] (ATCC® CRL-2625™), DS-1 (ATCC® CRL-11102™), EB-3 [EB3] (ATCC® CCL-85™), Z-138 (ATCC #CRL-3001), DB (ATCC CRL-2289), Toledo (ATCC CRL-2631), Pfiffer (ATCC CRL-2632), SR (ATCC CRL-2262), JM-1 (ATCC CRL-10421), NFS-5 C-1 (ATCC CRL-1693); NFS-70 C10 (ATCC CRL-1694), NFS-25 C-3 (ATCC CRL-1695), 및 SUP-B15 (ATCC CRL-1929) 라인; 및 NK세포에 대해, NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408™) 라인을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 추가적인 예시는 성숙 T 세포주, 예를 들어, Deglis, EBT-8, HPB-MLp-W, HUT 78, HUT 102, Karpas 384, Ki 225, My-La, Se-Ax, SKW-3, SMZ-1및 T34; 미성숙 T 세포주, 예를 들어, ALL-SIL, Be13, CCRF-CEM, CML-T1, DND-41, DU.528, EU-9, HD-Mar, HPB-ALL, H-SB2, HT-1, JK-T1, Jurkat, Karpas 45, KE-37, KOPT-K1, K-T1, L-KAW, Loucy, MAT, MOLT-1, MOLT 3, MOLT-4, MOLT 13, MOLT-16, MT-1, MT-ALL, P12/Ichikawa, Peer, PER0117, PER-255, PF-382, PFI-285, RPMI-8402, ST-4, SUP-T1 내지 T14, TALL-1, TALL-101, TALL-103/2, TALL-104, TALL-105, TALL-106, TALL-107, TALL-197, TK-6, TLBR-1, -2, -3, 및 -4, CCRF-HSB-2 (CCL-120.1), J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153), J45.01 (ATCC CRL-1990), J.CaM1.6 (ATCC CRL-2063), RS4;11 (ATCC CRL-1873), CCRF-CEM (ATCC CRM-CCL-119); 피부 T 세포 림프종, 예를 들어, HuT78 (ATCC CRM-TIB-161), MJ[G11] (ATCC CRL-8294), HuT102 (ATCC TIB-162); 역행성 및 대세포림프종(anaplastic and large cell lymphomas), 예를 들어, DEL, DL-40, FE-PD, JB6, Karpas 299, Ki-JK, Mac-2A Ply1, SR-786, SU-DHL-1, -2, -4,-5,-6,-7,-8,-9,-10, 및 -16, DOHH-2, NU-DHL-1, U-937, Granda 519, USC-DHL-1, RL; 호지킨 림프종(Hodgkin’s lymphomas), 예를 들어, DEV, HD-70, HDLM-2, HD-MyZ, HKB-1, KM-H2, L 428, L 540, L1236, SBH-1, SUP-HD1, 및 SU/RH-HD-l; 및 HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, 및 YT와 같은 NK 라인으로부터 유래된 B세포주를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. K562 적백혈병(erythroleukemia), THP-1단핵구성 백혈병(monocytic leukemia), U937 림프종, HEL적백혈병, HL60 백혈병, HMC-1 백혈병, KG-1 백혈병, U266 골수종(myeloma)과 같은 다른 백혈병 및 림프종으로부터 유래한 세포주들과 같이, REH, NALL-1, KM-3, L92-221를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 널(Null) 백혈병 세포주는 면역 세포의 또 다른 상업적으로 이용가능한 공급원이다. 이러한 상업적으로 이용가능한 세포주에 대한 비제한적 예시적 공급원은 American Type Culture Collection, 또는 ATCC(http://www.atcc.org/) 및 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.
벡터. CAR 세포는 벡터를 이용해 제조될 수 있다. 본원의 실시 양태는 FLT3 CAR를 코딩하는 분리된 핵산 서열 또는 그의 상보적 서열 또는 등가물을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR를 코딩하는 분리된 핵산 서열은 FLT3 항체의 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, CD28 막 관통 도메인, CD28 공자극 시그널링 영역, 4-1BB 공자극 시그널링 영역, ICOS 공자극 시그널링 영역, 및 OX40 공자극 영역에서 선택된 하나 또는 그 이상의 공자극 영역, 및 CD3 제타 시그널링 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성된다. 특정 구현예에서, 분리된 핵산 서열은 (a) FLT3 항체의 항원 결합 도메인, 다음에 이어지는 (b) 힌지 도메인, (c) CD28 막 관통 도메인, 다음에 이어지는 (d) CD28 공자극(costimulatory) 시그널링 영역, 4-1BB 공자극 시그널링 영역, ICOS 공자극 시그널링 영역, 및 OX40 공자극 시그널링 영역으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 공자극 영역, 다음에 이어지는 (e) CD3 제타 시그널링 도메인을 코딩하는 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성된다.
특정 구현예에서, 분리된 핵산 서열은 FLT3 항체의 FLT3 항원 결합 도메인의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림(upstream)에 위치한 폴리뉴클레오티드 프로모터 서열을 추가로 더 포함하거나, 또는 추가로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 또 필수적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 상기 프로모터는 CMV(cytomegalovirus) 프로모터 서열, MND(myeloproliferative sarcoma virus enhancer) 프로모터, 또는 EF1 알파 프로모터이다. 상기 프로모터의 비제한적 예시적 서열이 본원에 개시되어 있다 :
CMV 프로모터 서열, 서열번호 36:
TAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAG
CMV 프로모터 서열, 서열번호 37:
GCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTTTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATC
MND 프로모터 서열, 서열번호 38:
AACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTCTAGAGGATC
EF1 알파 프로모터 서열, 서열번호 39:
AAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC
특정 구현예에서, 분리된 핵산 서열은 FLT3 항체의 FLT3 항원 결합 도메인의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림에 위치한 유도성 카스파제(“iCasp”) 또는 다른 “자살 유전자” 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 더 포함하거나, 추가로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성된다; 상기 iCasp 유전자의 비제한적 예시적 폴리뉴클레오티드 서열이 본원에 개시되어 있다 :
iCasp 서열, 서열번호 40:
Figure pct00001
일부 구현예에서, iCasp 유전자 구조는 FKBP 단백질 도메인에 작동가능하게 연결된 카스파제(Caspase) 9의 일부분을 포함한다. 상기 비제한적 예시적 서열에서, 이 요소들은 분명히 표시되어 있다 - 볼드체는 FKBP 단백질 도메인 및 카스파제 9 단백질 도메인 사이의 링커이다; 박스된 부분은 추가된 제한 부위(restriction site)이다. CASP9 유전자(GenBank 접근 번호 NM001229)에 의해 코딩되는 카스파제 9는, 개시 카스파제(initiator caspase)의 비제한적 예시이며 미토콘드리아 아폽토시스 경로(mitochondrial apoptotic pathway)에서 역할을 한다; 그의 일부분은 상기 개시된 비제한적 예시적 서열에 존재한다. 상기 개시된 비제한적 예시적 서열의 FKBP 단백질 도메인은 유도성 작용물, 구체적으로는 CID(chemical inducer of dimerization)에 결합하기에 최적화되어 있다. 상기 개시된 서열에서, 화학적 유도제는 AP1903으로, 건강한 실험 참가자 (volunteers) 에서 안전한 것으로 증명된 합성 약제이다. FKBP 도메인 및 다이머화(dimerization)의 화학적 유도제 모두의 등가물(예를 들어, AP1903 또는 FKBP의 변형된 형태)이 기재된 예시적 구현예 대신 사용될 수 있을 것이라고 예상된다. 일부 실시 양태에서, 다이머화는 카스파제 9의 다이머화를 촉진하는 것으로 알려진 임의의 소분자에 의해 유도될 수 있다. 상기 소분자의 투여는 iCasp 유전자를 발현하는 세포의 아폽토시스를 차례로 유도하는 카스파제 9의 가교 결합(cross-linking) 및 활성화로 이어진다.
특정 구현예에서, 분리된 핵산 서열은 FLT3 항체의 FLT3 항원 결합 도메인의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림에 위치한 2A 펩티드(T2A) 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 더 포함하거나, 또는 추가로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성된다; 기재된 T2A 코딩 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예시적 서열은 본원에 개시되어 있다 :
T2A 서열, 서열번호 41:
GCCGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT
T2A를 포함하는 구현예에서, T2A-매개의 “자가-절단”은 2개의 분리된 단백질의 1:1 비율을 야기할 수 있다.
특정 구현예에서, 분리된 핵산 서열은 FLT3 항체의 FLT3항원 결합 도메인의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림에 위치한 시그널 펩티드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 더 포함하거나, 또는 추가로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성된다 ; 기재된 시그널 펩티드의 폴리뉴클레오티드 코딩 비제한적 예시적 서열은 본원에 개시되어 있다 :
시그널 펩티드 서열, 서열번호 42:
ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCAC.
시그널 펩티드 서열, 서열번호 43:
MGWSCIILFLVATATGVHS
시그널 펩티드 서열, 서열번호 44:
MDWIWRILFLVGAATGAHS
일부 구현예에서, 분리된 핵산은 검출 가능한 라벨 및/또는 항생제 저항성을 부여하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시 양태에서, 라벨 또는 폴리뉴클레오티드는 분리된 핵산으로 성공적으로 형질도입된 세포를 선별하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 상기 검출 가능한 라벨은 “myc tag”이라고 알려진 c-myc 유전자로부터 유래한 단백질 태그이다. 기재된 myc tag을 코딩하는 비제한적 예시적 서열을 하기에 개시하고 있다 :
"myc"서열, 서열번호 45:
GAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTG
일부 구현예에서, 분리된 핵산 서열은 벡터에 포함되어 있다. 특정 구현예에서, 벡터는 플라스미드이다. 다른 구현예에서, 벡터는 바이러스성 벡터이다. 그러한 비제한적 예시는 레트로바이러스성 벡터, 렌티바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터 및 아데노-관련 바이러스성 벡터를 한정 없이 포함한다. 구체적인 구현 예에서, 벡터는 렌티바이러스성 벡터이다.
예시적인 벡터의 제조 및 기재된 벡터를 이용하여 CAR 발현 세포를 제조하는 방법을 하기 예시에 자세히 설명하고 있다. CAR 또는 면역 조절 분자(immunoregulatory molecules)를 코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩티드 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하고, 그 구조를 발현 벡터에 융합함으로써 이루어진다. 면역 조절 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 서열을 제조하는 데 유사한 방법이 사용될 수 있다. 벡터는 진핵생물 복제 및 통합(integration)에 적합 할 수 있다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 제조하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)를 참고하라.
한 실시 양태에서, “벡터”라는 용어는 분열하지 않는(non-dividing) 및/또는 느리게 분열하는(slowly-dividing) 세포들을 감염 및 형질도입시키고 타겟 세포의 게놈에 통합시키는 능력을 보유한 재조합 벡터를 의미한다. 몇몇 실시 양태에서, 벡터는 야생형 바이러스로부터 유래하거나 그에 기반한 것이다. 추가적 실시 양태에서, 벡터는 야생형 렌티바이러스로부터 유래하거나 그에 기반한 것이다. 그러한 예시는 HIV(human immunodeficiency virus), EIAV(equine infectious anemia virus), SIV(simian immunodeficiency virus) 및 FIV(feline immunodeficiency virus)을 한정 없이 포함한다. 대안으로, MLV(murine leukemia virus)와 같은 다른 레트로바이러스가 벡터 백본의 기반으로 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 본원에 따른 바이러스성 벡터가 특정 바이러스의 구성요소에 한정될 필요는 없다는 것이 명백할 것이다. 바이러스성 벡터는 2개 또는 그 이상의 상이한 바이러스로부터 유래한 구성 요소를 포함할 수 있고, 합성 구성요소 또한 포함할 수 있다. 벡터 구성요소는 타겟 세포 특이성과 같은 원하는 특성을 갖기 위해 조작될 수 있다.
본원의 재조합 벡터는 영장류 및 비영장류로부터 유래한 것이다. 영장류 렌티바이러스의 예시는 HIV(human immunodeficiency virus), 인간 AIDS(acquired immunodeficiency syndrome)의 원인이 되는 작용물, 및 SIV(simian immunodeficiency virus)를 포함한다. 비영장류 렌티바이러스군은 프로토타입 “느린 바이러스” VMV(visna/maedi virus), 및 관련된 CAEV(caprine arthritis-encephalitis virus), EIAV(equine infectious anemia virus), 및 더욱 최근에 설명된 FIV(feline immunodeficiency virus) 및 BIV(bovine immunodeficiency virus)를 포함한다, 선행기술의 재조합 렌티바이러스성 벡터는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국특허 제6,924,123; 7,056,699; 7,419,829 및 7,442,551호를 참고하라.
미국특허 제6,924,123호는 특정한 레트로바이러스 서열이 타겟 세포 게놈에 통합을 촉진한다고 개시하고 있다. 상기 특허는 비리온(virion) 단백질 및 효소를 코딩하는 gag, pol 및 env라 불리는 유전자를 포함하는 레트로바이러스 게놈에 대해 교시하고 있다. 이 유전자들은 LTR(long terminal repeat)이라 불리는 영역의 양 끝에 인접하고(flanked) 있다. LTR은 프로바이러스(proviral) 통합 및 전사를 담당한다. 이들은 또한 인핸서-프로모터 서열의 역할을 한다. 다시 말해, LTR은 바이러스 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 레트로바이러스 RNA의 캡시드화(encapsidation)는 바이러스 게놈의 5’ 말단에 위치한 psi 서열에 의해 발생한다. LTR 자체는 U3, R 및 U5라 불리는 3개의 요소로 나눌 수 있는 동일한 서열이다. U3은 RNA의 3’ 말단의 고유한 서열로부터 유래한다. R은 RNA의 양 끝에서 반복되는 서열로부터 유래하고, U5는 RNA의 5’ 말단의 고유한 서열로부터 유래한다. 3개의 요소의 크기는 상이한 레트로바이러스 사이에서 상당히 다양할 수 있다. 바이러스 게놈, 및 폴리(A) 추가(종결(termination)) 부위는 LTR 오른쪽의 R 및 U5 사이의 경계에 있다. U3은 세포 및 일부의 경우 바이러스 전사 활성화 단백질에 반응하는 프로모터 및 다중 인핸서 서열을 포함하는 프로바이러스의 전사 조절 요소의 대부분을 포함한다.
구조 유전자 gag, pol 및 env와 관련하여, gag는 바이러스의 내부 구조 단백질을 코딩한다. gag 단백질은 단백질 분해로 성숙 단백질인 MA(matrix), CA(capsid) 및 NC(nucleocapsid)이 된다. pol 유전자는 게놈 복제를 매개하는 DNA 폴리머라제, 결합한 RNase H 및 IN(intergarse)를 포함하는 RT(reverse transcriptase)를 코딩한다.
바이러스성 벡터 입자를 제조하기 위해, 벡터 RNA 게놈은 숙주 세포에서 이를 코딩하는 DNA 구조로부터 발현된다. 벡터 게놈에 의해 코딩되지 않는 입자의 구성요소는 숙주 세포에서 발현되는 추가적인 핵산 서열에 의해 트랜스로(in trans) 만들어진다(일반적으로 gag/pol 및 env 유전자의 어느 하나 또는 모두를 포함하는 “패키징 시스템”). 바이러스 벡터 입자의 제조에 필요한 일련의 서열은 일시적인 형질전환에 의해 숙주세포에 도입되거나, 또는 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있으며, 또는 여러 가지 방법으로 제조될 수 있다. 관련된 테크닉은 당업자에게 알려져 있다.
본원 발명을 사용하기 위한 레트로바이러스 벡터는 Lentigen Corp에 의해 제조된 Invitrogen’s pLenti series versions 4, 6, and 6.2 “ViraPower” system; 실험실에서 제조되어 the City of Hope Research Institute에 의해 사용된 pHIV-7-GFP; Clontech에 의해 제조되는 “Lenti-X” 렌티바이러스성 벡터 pLVX; Sigma-Aldrich에 의해 제조된 pLKO.1-puro; Open Biosystems에 의해 제조된 pLemiR; 및 실험실에서 제조되어 Charite Medical School, Institute of Virology (CBF), Berlin, Germany에 의해 사용된 pLV를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
외인성 핵산을 숙주세포에 도입하거나 또는 세포를 본원 발명의 저해제에 노출시키는 다른 방법에 관계 없이, 숙주 세포 내에 재조합 DNA 서열을 확인하기 위해, 다양한 분석이 수행될 수 있다. 그러한 분석은, 예를 들어, 써던 및 노던 블롯팅, RT PCR 및 PCR과 같은 당업자에게 잘 알려진 “분자생물학적” 분석; 및 예를 들어, 본원의 범위에 포함되는 작용물을 동정하기 위해 본원에 설명된 분석 또는 면역적 방법(ELISA 및 웨스턴 블롯팅)에 의해 특정 펩티드의 존재 또는 부존재를 검출하는 “생화학적” 분석을 포함한다.
벡터 및 세포주 패키징. 분리된 핵산은 또한 패키징 벡터 및 세포주를 이용하여 레트로바이러스 패키징 시스템에 패키징될 수 있다. 패키징 벡터는 레트로바이러스성 벡터, 렌티바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 및 아데노-관련 바이러스성 벡터를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 패키징 벡터는 세포에 유전 물질을 전달하도록 하는 요소 및 서열을 포함하고 있다. 레트로바이러스 구조는 복제 가능(replication-competent) 헬퍼 바이러스의 생성 없이 높은 역가에서 복제 불가능한 레트로바이러스 벡터를 패키징하는 것이 가능한 비리온 단백질을 생성하고 복제 불가능 레트로바이러스 벡터를 패키징하기 위해 필요한 모든 비리온 단백질을 트랜스로 코딩하는 복제 불가능(replication-incompetent) 레트로바이러스 게놈으로부터 유래한 적어도 하나의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함하는 패키징 벡터이다.레트로바이러스 DNA 서열은 바이러스의 바이러스성 5'LTR의 원래의(native) 인핸서 및/또는 프로모터를 코딩하는 영역이 결핍되며, 3'LTR 및 헬퍼 게놈을 패키징하는 역할을 하는 psi 기능 서열의 양쪽이 모두 결핍되지만, 예를 들어 SV40 폴리아데닐화(polyadenylation) 부위와 같은 폴리아데닐화 부위, 및 바이러스 생성이 원하는 세포 타입에서 효율적인 전사를 지시하는 외래 인핸서 및/또는 프로모터는 코딩하는 것이다. 레트로바이러스는 MMLV(Moloney Murine Leukemia Virus), HIV(Human Immunodeficiency Virus), 또는 GALV(Gibbon Ape Leukemia virus)와 같은 백혈병 바이러스이다. 외래 인핸서 및 프로모터는 HCMV(human cytomegalovirus) IE(immediate early) 인핸서 및 프로모터, MMSV의 인핸서 및 프로모터(U3 영역), RSV(Rous Sarcoma Virus)의 U3영역, SFFV(Spleen Focus Forming Virus)의 U3 영역, 또는 MMLV의 원래의 프로모터에 연결된 HCMV IE 인핸서일 수 있다. 레트로바이러스 패키징 벡터는, 예를 들어, 제1 헬퍼 서열은 자기지향성(ecotropic) MMLV 또는 GALV의 gag 및 pol을 코딩하는 cDNA를 포함하고 제2 헬퍼 서열은 env 단백질을 코딩하는 cDNA를 포함하는 것과 같이 플라스미드 기반 발현 벡터에 의해 코딩되는 2개의 레트로바이러스 헬퍼 DNA로 구성될 수 있다. 숙주 범위를 결정하는 Env 유전자는 이종향성(xenotropic), 양종향성(amphotropic), 자기지향성, 다중지향성(polytropic)(밍크 포커스 형성) 또는 10A1 뮤린 백혈병 바이러스 env 단백질, 또는 GALV(Gibbon Ape Leukemia Virus) env 단백질, 인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus) env(gp160)단백질, VSV(Vesicular Stomatitus Virus) G 단백질, HTLV(Human T cell leukemia) I 및 II종 env 유전자 산물, 전술한 env 유전자의 하나 또는 그 이상의 조합에서 유래한 키메릭 외피(envelope)유전자 또는 전술한 env 유전자 산물의 세포질 및 막 관통 부위를 코딩하는 키메릭 외피 유전자 및 원하는 타겟 세포의 특정 표면 분자를 타겟으로 하는 단일클론 항체를 코딩하는 유전자로부터 유래할 수 있다.
패키징 과정에서, 패키징 벡터 및 레트로바이러스 벡터는 더 높은 역가의 재조합 레트로바이러스 함유 상청액을 생산하기 위하여, 예를 들어 293(ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.) 세포인 인간 배아 신장 세포와 같이 바이러스 생산이 가능한 포유류 세포의 제1 개체군에 일시적으로 공동 형질전환된다(co-transfected). 본원 발명의 다른 방법으로서, 상기 동시에 형질전환된 세포의 제1개체군은 그리고 나서 높은 효율로 타겟 세포를 외래 유전자로 형질도입하기 위해, 예를 들어 인간 림프구인 타겟 세포와 공동배양된다. 본 발명의 다른 방법으로서, 상기 설명한 상청액으로부터, 일시적으로 형질전환된 세포의 제1개체군은 높은 효율로 타겟 세포를 외래 유전자로 형질도입하기 위하여, 예를 들어 인간 림프구 또는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)와 같은 포유류 타겟 세포와 함께 배양된다.
다른 실시 양태에서, 패키징 벡터는 예를 들어 293 세포인 인간 배아 신장 세포와 같은 바이러스 생산이 가능한 포유류 세포의 제1개체군에서 안정적으로 발현된다. 선별 가능한 마커와 공동 형질도입하거나 또는 슈도타입(psuedotype) 바이러스로 감염시킴으로써, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 세포에 도입한다. 양 쪽 경우 모두 벡터가 통합된다. 대안으로, 벡터는 에피솜이 유지된 플라스미드로 도입될 수 있다. 높은 역가의 재조합 레트로바이러스 함유 상청액이 생성된다.
CAR 세포의 활성화 및 확장. 바람직한 CAR를 발현하기 위한 세포의 유전적 변형의 전 또는 후에, 세포는 미국 특허 제6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681 ; 7, 144,575; 7,067,318; 7, 172,869; 7,232,566; 7, 175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041호 및 Lapateva et al. (2014) Crit Rev Oncog 19(1-2):121-132; Tam et al. (2003) Cytotherapy 5(3):259-272; Garcia-Marquez et al. (2014) Cytotherapy 16(11):1537-1544와 같은 참고문헌에 설명된 것과 같이 일반적으로 알려진 방법을 이용하여 활성화되고 확장될 수 있다. ex vivo에서 FLT3 관련 항원으로의 자극은 선별된 CAR 발현 세포 부차 집단을 활성화하고 확장할 수 있다. 대안으로, 세포들은 in vivo에서 FLT 관련 항원과의 상호작용에 의해 활성화될 수 있다.
특정 면역 세포의 경우, 추가적인 세포 개체군, 가용성(soluble) 리간드 및/또는 사이토카인, 또는 자극 작용물이 세포를 활성화하고 확장하는 데 필요할 수 있다. 관련 반응물은 당업계에 알려져 있으며 알려진 면역학적 원리에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 가용성 CD-40 리간드는 특정 B 세포 개체군을 활성화 및 확장시키는 데 유용할 수 있다; 유사하게, 조사된(irradiated) 피더(feeder) 세포들은 NK 세포의 활성화 및 확장을 위한 절차에 사용될 수 있다.
관련 세포를 활성화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 본 출원에 용이하게 적용될 수 있다; 예시적인 방법이 하기의 실시예에 설명되어 있다. 본 발명과 관련하여 사용되는 분리 방법은 Life Technologies Dynabeads® system activation and expansion kits; BD Biosciences Phosflow™ activation kits, Miltenyi Biotec MACS™ activation/expansion kits, 및 관련 세포의 모이어티를 특이적으로 활성화하기 위한 다른 상업적으로 이용가능한 세포 키트를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 면역 세포의 특정 부차 집단은 그러한 키트에서 이용 가능한 비드 또는 기타 작용물을 이용함으로써 활성화 또는 확장될 수 있다. 예를 들어, α-CD3/α-CD28 Dynabeads®는 분리된 T세포의 개체군을 활성화 및 확장하는 데 이용될 수 있다.
Ⅳ. 사용 방법
요법 적용. 본원 발명의 방법 실시 양태는 그를 필요로 하는 대상에서 종양/암을 억제하는 방법 및/또는 그를 필요로 하는 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 암은 혈액 및/또는 골수에 영향을 주는 암이다; 일부 구현예에서, 암은 급성 골수성 백혈병이다. 특정 실시 양태에서, 종양/암 세포는 FLT3을 발현하거나 또는 과발현한다. 특정 실시 양태에서, 이 방법들은 분리된 세포의 유효량을 대상 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 그것으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성된다. 추가적인 구현예에서, 분리된 세포들은 FLT3 CAR를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 분리된 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, 분리된 세포는 치료되는 대상 또는 환자의 자가 유래인 것이다. 추가적인 실시 양태에서, 종양/암은 FLT3을 발현하며 대상은 본원에 설명된 것과 같은 진단에 의해 치료를 위해 선택되었다. 대상은 동물, 포유류, 소, 개, 소, 말, 쥐, 또는 인간 환자이다.
본원에 개시된 것과 같은 FLT3 CAR 세포는 단독으로 또는 희석제, 알려진 항암치료제, 및/또는 사이토카인 또는 면역 조절제인 다른 세포 개체군과 같은 다른 구성요소와 함께 투여될 수 있다. 이들은 1차 요법, 2차 요법, 3차 요법, 또는 추가적 요법으로서 투여될 수 있다. 추가적 요법의 비제한적 예시는 조혈모세포 이식과 같은 생물학적 제제(biologic), 화학 요법, 냉동 요법, 방사선 요법과 같은 종양 축소 요법을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 조혈모세포 이식 전 또는 방사선 요법 또는 화학 요법 이후와 같이, FLT3 CAR 세포는 이러한 비제한적 예시적 요법 중 임의의 하나의 전 또는 후에 투여될 수 있다. 추가적인 비제한적 예시는, 변형되지 않은 면역세포, 하나 또는 그 이상의 면역 조절 분자를 발현하는 벡터를 포함하는 변형된 면역세포, 본원에 개시된 것과 상이한 항원에 특이적인 CAR 세포와 같은 다른 관련된 세포 종류를 포함한다. 본원 발명의 CAR 세포에서와 같이, 이 세포들은 자가유래이거나 또는 동종이형일 수 있다. 적절한 치료법은 치료 담당 의사 또는 수의사에 의해 결정될 것이다.
본원 발명의 약학적 조성물은 질병 치료 또는 예방을 위해 적절한 방법으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는 적절한 용량이 임상 실험을 통해 결정될 수 있음에도 불구하고, 환자의 상태, 환자의 질병의 심각도 및 종류와 같은 요소에 따라 결정될 것이다. 한 실시 양태에서, 그들은 직접 주사로 직접 또는 정맥 주사(intravenous injection) 또는 주입(infusion)과 같이 전신적으로(systemically)투여될 수 있다.
CAR 발현 세포의 총 용량(dose)은 예를 들어, 상기 개시된 요소에 따라 다양할 것이다. 일부 구현예에서, 용량은 1 내지 1010개 세포일 수 있으며, 예를 들어, 적어도 10, 적어도 101, 적어도 102, 적어도 103, 적어도 104, 적어도 105, 적어도 106, 적어도 107, 많아도 108, 많아도 109, 많아도 1010, 102 내지 1010 사이, 103 내지 109사이, 104 내지 108개 사이일 수 있다. 일부 구현예에서, 용량은 10의 정수 계수 승으로, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9의 범위로 추가로 제한될 수 있으며, 그로 인해 다음의 비제한적 예시에 따른 용량 범위를 나열하였다: 5 x 104 내지 1 x 108.
자살 유전자. CAR를 코딩하는 분리된 핵산 서열의 일부로서 자살유전자를 포함하는 구현예에서, 자살유전자는 요법의 마지막에 CAR 발현 세포를 종결시키기 위해 이용될 수 있다. 자살유전자를 포함하는 CAR 발현 세포를 포함하는 방법 실시 양태에서, 자살 유전자는 FLT3 특이적 CAR 세포 반응이 더 이상 필요하지 않은 시점에 유도 분자(inducer molecule)의 도입을 통해 유도될 수 있다. 자살 유전자의 유도는 CAR 세포의 아폽토시스로 이어진다. 그러므로 유도성 자살유전자를 포함하는 CAR 구조의 이용은 CAR 발현 세포를 유도된 아폽토시스를 통해 제거함으로써 CAR 세포 적용의 안전성을 증진시킨다. 소분자와 같지만 이에 한정되지는 않는, 유도성 작용물이 사용되는 구현예에서, 자살 발현 유도에 적용되는 유도성 작용물의 용량은 0.001 내지 10.0 mg/kg 체중, 또는 대안으로 0.01 내지 1.0 mg/kg, 및 그 사이의 범위일 수 있다.
진단 적용. 본원 발명의 실시 양태는 환자가 FLT3 CAR 요법에 반응할 가능성이 있는지, 또는 반응하지 않을 가능성이 있는지 결정하는 예시적 방법을 제공한다. 구체적인 구현예에서, 이 방법은 환자로부터 분리된 생물학적 샘플을 항-FLT3 항체와 접촉시키고, 종양 샘플에 결합하는 항체의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 추가적인 구현예에서, 종양 샘플에 결합한 항체의 존재는 환자가 FLT3 CAR 요법에 반응할 가능성이 있다는 것을 나타내며, 종양 샘플에 결합한 항체의 부존재는 환자가 FLT3 CAR 요법에 반응하지 않을 것임을 나타낸다. 일부 구현예에서, 방법은 종양 또는 암과 관련된 유전자 발현 프로파일(profile) 또는 진단 마커를포함할 수 있다 - 사용된 마커의 비제한적 실시예는 AML에 대한 CD45dimSSCmedium 이다. 일부 구현예에서, 방법은 FLT3 CAR 요법에 반응할 가능성이 있다고 결정된 환자에게 유효량의 FLT3 CAR 발현 세포를 투여하는 추가적인 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 FLT3 발현 암/종양을 가지고 있거나 및/또는 이를 진단받았다. 일부 구현예에서, 암/종양은 AML이다.
Ⅴ . 담체
본원 발명의 추가적 실시 양태는 담체 및 본원에 개시되어 설명된 하나 또는 그 이상의 산물 - 예를 들어, FLT3 CAR, FLT3 CAR를 포함하는 분리된 세포, 분리된 핵산, 벡터, FLT3 CAR를 포함하는 분리된 세포 및 면역 조절 분자 및/또는 그들을 코딩하는 핵산 - 을 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성되는 조성물에 관한 것이다.
간략하게, 본원 발명의 약학적 조성물은 약학적 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 하나 또는 그 이상과 함께, 본원에 설명된 청구 조성물 중 임의의 하나를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 그러한 조성물은 중성 버퍼된 식염수, 인산 버퍼된 식염수 및 그 유사한 것을 포함하는 버퍼; 글루코오스, 만노스, 수크로오스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 글리신과 같은 아미노산 또는 폴리펩티드; 항산화제; EDTA 또는 글루타치온(glutathione)과 같은 킬레이팅 작용물; 어쥬번트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide)); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본원 발명의 조성물은 경구(oral), 정맥 내(intravenous), 국소(topical), 장내(enteral), 및/또는 비경구 투여를 위해 제제화 될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원 발명의 조성물은 비경구 투여를 위해 제제화된다.
세포 또는 조성물의 투여는 치료 과정 동안 연속적으로 또는 단속적으로(intermittently), 1회 복용에 의해 효과가 있을 수 있다. 투여의 가장 효과적인 방법 및 복용량을 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 요법을 위해 사용되는 조성물, 요법의 목적 및 치료를 받는 대상에 따라 다양할 것이다. 의사에 의해 선택된 복용 수준 및 패턴에 따라 단일 또는 다중 투여가 수행될 수 있다. 적합한 복용 제제 및 작용물 투여 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 추가적인 실시 양태에서, 본원 발명의 세포 및 조성물은 다른 치료와 함께 투여될 수 있다.
세포 및 세포의 개체군은 예를 들어 PCT 국제출원 제PCT/US2011/064191호에 설명된 것 및 당업계에 알려진 방법을 이용해 숙주에게 투여된다. 이러한 본원의 세포 또는 조성물의 투여는 원하는 질병, 질환(disorder), 또는 상태에 대한 실험 및 스크리닝 분석을 위한 동물 모델을 제조하기 위해 수행될 수 있다.
Ⅵ. 키트
본원에 기재된 바와 같이, 본원 발명은 FLT3 CAR 세포를 제조 및 투여하는 방법을 제공한다. 한 구체적 실시 양태에서, 본원 발명은 이러한 방법을 수행하기 위한 키트뿐만 아니라 세포 및/또는 조직을 수집하거나, 및/또는 스크리닝/형질도입/등을 수행하거나, 및/또는 결과를 분석하는 것과 같은 본원 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서를 제공한다.
한 실시 양태에서, 키트는 본원에 개시된 분리된 핵산 중 임의의 하나 및/또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 및/또는 분리된 동종이형 세포, 바람직하게는 T 세포 또는 NK 세포, 및/또는 환자로부터 자가 유래의 세포를 조달하는 사용 설명서(instruction)를 포함하거나, 또는 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성된다. 그러한 키트는 또한 본원에 개시된 것과 같은 FLT3 CAR 발현 세포의 형질도입 및/또는 선별 및/또는 활성화 및/또는 확장에 적합한 배지 및 다른 반응물을 포함하거나, 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성된다.
한 실시 양태에서 키트는 분리된 CAR 발현 세포 또는 그의 개체군을 포함하거나, 대안으로 필수적으로 구성되거나, 또는 추가로 더 구성된다. 일부 구현예에서, 키트의 세포들은 그를 필요로 하는 대상에 투여되기 전에 활성화 및/또는 확장을 필요로 할 수 있다. 추가적인 구현예에서, 키트는 분리된 CAR 발현 세포를 활성화 및/또는 확장하기 위해 본원의 상기에 개시한 것과 같은 배지 또는 반응물을 추가로 더 포함하거나, 또는 그것으로 필수적으로 구성된다. 일부 구현예에서, 세포는 FLT3 CAR 요법에 이용될 수 있다. 추가적인 구현예에서, 키트는 FLT3 CAR 요법을 필요로 하는 환자에 분리된 세포를 투여하는 방법에 관한 설명서를 포함한다.
본원 발명의 키트는 또한 버퍼 작용물, 방부제 또는 단백질-안정화 작용물 등을 포함할 수 있다. 키트는 예를 들어 효소 또는 기질과 같은, 검출 가능한 라벨을 검출하는 데 필수적인 구성 요소를 추가로 더 포함할 수 있다. 키트는 또한 분석되고 테스트 샘플에 비교될 수 있는 대조군 샘플 또는 일련의 대조군 샘플을 포함할 수 있다. 키트의 각 구성 요소는 개별 용기(container)에 포장될 수 있으며, 다양한 용기는 키트를 이용하여 수행되는 어세이의 결과를 해석하는 설명서와 함께 하나의 패키지에 있을 수 있다. 본원 발명의 키트는 키트 용기의 내부에 글로 설명된 생성물(written product)을 포함할 수 있다. 글로 설명된 생성물은 키트에 포함된 반응물을 어떻게 사용하는지 설명한다.
바람직하게, 이들 제안된 키트 구성요소는 당업자가 통상적으로 사용하는 방법으로 포장될 수 있다. 예를 들어, 제안된 키트 구성요소는 용액 또는 액체 분산액(liquid dispersion) 및 이와 유사한 것으로 제공될 수 있다.
다음의 실시예는 본원 발명의 개시 내용을 수행하는 데 있어 다양한 경우에 사용될 수 있는 절차의 예시이다.
실시예 1 - FLT3 CAR 발현 T 세포의 제조
FLT3 CAR 발현 T세포를 제조하기 위해, FLT3 CAR를 코딩하는 렌티바이러스성(lentivral) 벡터가 제조되었다. 각 CAR는 도 1의 구조에 따라 디자인되었다. 건강한 공여자로부터의 1차 T세포는 CD3 및 CD28 항체를 이용하여 증식(expand)되었으며 도 1의 구조로 형질도입되었다. CAR-발현 T 세포는 FACSAria II로 분리되었다.
실시예 2 - in vitro에서 급성 골수성 백혈병(Acute Myloid leukemia) 세포를 타겟으로 하는 FLT3 CAR 발현 T 세포
1차 AML 세포를 살해하는 FLT3-특이적 T 세포의 능력을 측정하기 위해, 쌍을 지어 매치된(pair-matched) CD19-CAR 및 FLT3 CAR 발현 T 세포 및 빈 벡터 형질도입된 대조군이 표준 4시간 방출 분석에서 MOLM-13 AML 세포와 공동배양되었다. CD19-CAR 발현 T 세포와 대조군 모두와 대조적으로, FLT3 CAR T 세포주는 테스트한 MOLM-13 세포를 강력하게 용해시켰다(도 3). 이 결과는 p<0.01에서 유의하다.
실시예 3 - CAR T 세포 효율의 in vivo 평가
(예를 들어, MOLM-13 AML인 세포주, 또는 AML 환자로부터 추출한) 1 x 107개의 AML 세포들은 NSG(NOD SCID Gamma) 마우스에 주사된다. In vivo 이미징과 같은 진단 방법을 이용하여 마우스의 AML 세포 성장을 모니터한다. AML이 마우스 내에 발생하면, 마우스들은 처리군(treatment groups)으로 나눠지고 단일 시간 또는 여러 시간 간격에 걸쳐 주입되는 1 x 106 에서1 x 108 개 세포 사이의 용량으로 FLT3 CAR 발현 세포가 투여된다. 종양 억제가 모니터되며 생존 데이터가 모인다.
FLT3 CAR 발현 세포는 AML 양성 마우스에 요법적 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4 - FLT3-발현 T 세포의 제조
재료 및 방법
세포 배양 : 모든 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입된 것이며DNA 프로파일링을 통해 증명되었다.
마우스 : 6주에서 8주 연령의 수컷 NSG(NOD-scid IL-2R gamma null) 마우스를 The Jackson Laboratory에서 구매하였다. 마우스는 백혈병에 대해 자주 모니터되었다. 모든 동물 실험은 오하이오주립대학 동물실험윤리위원회(Ohio State University Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다.
iCasp9-T2A 카세트를 갖는 FLT3-특이적 CAR 렌티바이러스성 구조체 제조 : 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 가변 영역에 대한 FLT3 코딩 도메인 서열은 개별적으로 증폭되어 링커를 이용하여 PCR 중첩 반응(overlapping PCR reaction)에 의해 재결합되었다. VH-링커-VL 단편은 CD28-CD3z 부분과 인프레임으로 융합되었다. 전체 항-FLT3-scFv-CD28-CD3z 단편은 그리고 나서 pCDH라고 명명된 렌티바이러스성 벡터에 라이게이션되어 pCDH-FLT3-CAR 구조체를 제조하였다. 그리고 나서, iCasp9-T2A 카세트는 pCDH-FLT3-CAR에 통합되어 완전한 iCasp9-T2A-pCDH-FLT3-CAR 를 형성했다.
T림프구의 렌티바이러스성 형질도입 : 1차 T림프구는 우리의 종전 리포트에 설명한 것과 같이 인간 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 분리되었다; 렌티바이러스성 형질주입(transfection) 및 감염 프로토콜은 우리의 종전 리포트에서 변형되었다(Chu et al. (2014) Leukemia 28:917-927; Han et al. (2015) Scientific Reports 5:11483.).
유세포 분석법 : 세포 표면의 FLT3-CAR 발현을 검출하기 위해, FLT3-CAR로 형질도입된 1차 T세포는 세척 버퍼(4% 소(vovine) 혈청 알부민을 포함한 PBS)으로 세척되었고, 바이오틴-표지된 염소 항-마우스 (Fab)2 다클론 항체 또는 동종 대조군으로서 정상 다클론 염소 IgG(immunoglobulin G) (Jackson ImmunoResearch)로 염색하였다. 그리고 나서, APC-결합 스트렙타비딘(allophycocyanin(APC)-conjugated streptavidin)(Jackson ImmunoResearch) 및 V450에 결합된 항-CD3 ζ 항체(BD Bioscences)와 세포를 인큐베이션한 후 추가적으로 BD LSRII 유세포 계측을 수행한다. 이에 더하여, 종양 세포를 피코에리트린(PE, phycoerythrin)-결합 마우스 항-FLT3 mAb(eBiosciences)로 염색한 후, 백혈병 세포 표면의 FLT3 발현 또한 BD LSRII 유세포 계측기로 분석한다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star Inc.)를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.
면역블로팅(Immunoblotting) : 면역블로팅은 우리 실험실의 변형된 프로토콜을 따라 수행하였다. 상세히는, 세포는 먼저 laemmli 버퍼에서 용해되었다. 그리고 나서, 용해물은 SDS-PAGE 겔에 의해 분리되어 PVDF 멤브레인(Millipore)으로 이동되었다. 상기 멤브레인은 마우스 항-인간 CD3ζ mAb (BD Pharmingen)로, 그리고 나서 호스래디쉬 과산화효소(horseradish peroxidase)-결합 염소 항-마우스 IgG 항체로 탐지되었다. 항체 결합은 강화 화학 발광체(enhanced chemiluminescence reagent) (Thermo scientific Inc.)를 이용하여 검출되었다.
세포 독성 분석 : 전술한 것과 같이 표준 4시간 51Cr 방출 분석을 수행하였다(Yu et al. Blood 115:274-281 (2010)). 간략하게, 타겟 세포는 51Cr 으로 표지되어, 1차 T 세포 또는 FLT3-CAR로 형질도입된 T세포 또는 다양한 이펙터/타겟 비율(E/T)의 모의 벡터로 형질도입된 T 세포와 37℃에서 4시간 동안 96-well V-bottom plate의 well내에서 공동배양되었다. 상청액을 수확하여 액체 신틸레이션(scintillation) 칵테일(Fischer Scientific)을 포함하는 신틸레이션 바이알에 옮겼고, TopCount counter(Canberra Packard)에서 51Cr의 방출을 측정하였다. 완전 배지 또는 1% SDS에 배양된 타겟 세포들은 자연 또는 최대 51Cr 방출을 검출하는 데 이용되었다. 특이적 용해 비율은 표준 공식을 이용하여 계산되었다 : 100 ×(cpm 실험 방출 - cpm 자연 방출)/(cpm 최대 방출 - cpm 자연 방출).
사이토카인 방출 분석 : 타겟 세포들은 동일한 수의 이펙터 세포와 함께 96-well V-bottom plate에서 37℃ 에서 24시간 동안 공동배양되었다. 무세포 상청액을 수확하여 R&D system의 상응하는 ELISA 키트를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 ELISA에 의해 IFN-gamma 및 인터루킨(IL)-2 분비를 평가하였다.
백혈병 보유 마우스 및 생체발광(bioluminescene)이미징의 in vivo 처리(treatment) : 반딧불이 루시퍼라제(firefly luciferase)를 발현하는 Pinco-pGL3-luc/GFP 바이러스로 MOLM13 세포들을 레트로바이러스성 형질도입하였고, 전술한 방법을 이용하여 GFP-양성 세포들을 분류하여, MOLM13-GL3 세포를 제조하였다. 0일차에, 수컷 NSG 마우스의 꼬리 정맥을 통해 400mL의 PBS 내에 8 ×106 개의 MOLM13-GL3 세포를 정맥주사하여 이종이식 동소(xenograft orthotopic) 백혈병 모델을 제조하였다. 9일 및 16일차에, 마우스의 꼬리 정맥을 통해 400mL의 PBS 내에 이펙터 세포 1.0 ×106 개, 즉 FLT3-CAR-형질도입된 T 세포 또는 모의-형질도입된 대조군 세포를 정맥주사로 투여하였다. 백혈병 세포 접종 5주 후, 마우스에 D-루시페린(luciferin)을 복강내 주사하고(150 mg/kg 체중; Gold Biotechnology), 아이소플루레인(isoflurane)으로 마취하고, IVIS(In Vivo Imaging System)와 Living Image software (PerkinElmer)를 이용하여 이미지화하였다.
통계적 분석 : unpaired Student t test를 이용하여 정규분포인 것처럼 연속적인 종단점에 대해 두 개의 독립적인 그룹을 비교하였다. 일원분산분석이 세 개 또는 그 이상의 독립 그룹을 비교하는 데에 이용되었다. 생존 데이터에 대해, Kaplan-Meier 커브를 플로팅하여 log-rank 테스트를 이용하여 비교하였다. 모든 검정은 양측검정이다. Bonferroni 방법을 이용하여 다중 비교를 위해 P값을 조정하였다. 0.05 미만의 P값은 통계적으로 유의미한 것으로 간주된다.
결과는 도 4 내지 도 7에 도시되어 있다.
실시예 5 - FLT-3 발현 NK 세포의 제조
NK 세포를 조작하여 CD28-CD3ζ와 같은 공자극 시그널링 도메인을 포함하는 FLT3-특이적 CAR를 발현시켰다. 부작용을 피하기 위해, iCasp9-T2A 카세트는 암을 사멸시킨 이후 CAR 변형된 NK 세포를 제거하기 위해 FLT3-특이적 CAR에 통합되었다. FLT3-특이적 CAR 조작된 NK 세포의 항-백혈병 능력은 in vitro 및 in vivo에서 이종이식 동소 마우스 모델에서 측정되었다. 결과는 FLT3-CAR의 발현이 in vitro 및 in vivo에서 FLT3 발현 백혈병 세포에 반응하여 특이적으로 강화된 사이토카인 방출 및 세포 독성으로 NK 세포를 재유도할 수 있다는 것과 이 사건은 FLT3 의존적이라는 것을 입증하였다. 여기에 더하여, 동소 백혈병 마우스 모델에서, FLT3-지향성 NK 세포는 마우스 생존을 상당히 연장하였다. 더불어, 우리 데이터는 FLT3-재유도 NK 세포(FLT3-redirected NK cell)는 백혈병 재발에 대한 유망한 요법을 나타낸다는 것을 시사한다.
재료 및 방법
세포 배양 : 모든 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입된 것이며 DNA 프로파일링을 통해 증명되었다.
마우스 : 6주에서 8주 연령의 수컷 NSG(NOD-scid IL-2R gamma null) 마우스를 The Jackson Laboratory에서 구매하였다. 마우스는 백혈병에 대해 자주 모니터되었다. 모든 동물 실험은 오하이오주립대학 동물실험윤리위원회(Ohio State University Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다.
중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 가변 영역에 대한 FLT3 코딩 도메인 서열은 개별적으로 증폭되어 링커를 이용하여 PCR 중첩 반응에 의해 재결합되었다. VH-링커-VL 단편은 CD28-CD3z 부분과 인프레임으로 통합되었다. 전체 항-FLT3-scFv-CD28-CD3z 단편은 그리고 나서 pCDH라고 명명된 렌티바이러스성 벡터에 라이게이션되어 pCDH-FLT3-CAR 구조체를 제조하였다. 그리고 나서, iCasp9-T2A 카세트는 pCDH-FLT3-CAR에 통합되어 완전한 iCasp9-T2A-pCDH-FLT3-CAR를 형성했다.
NK 림프구의 렌티바이러스성 형질도입 : 렌티바이러스성 형질주입(transfection) 및 감염 프로토콜은 우리의 종전 리포트에서 변형되었다(Chu et al. (2014) Leukemia 28:917-927; Han et al. (2015) Scientific Reports 5:11483).
유세포 분석법 : 세포 표면의 FLT3-CAR 발현을 검출하기 위해, FLT3-CAR로 형질도입된 1차 T세포는 세척 버퍼(4% 소 혈청 알부민을 포함한 PBS)으로 세척되었고, 바이오틴-표지된 염소 항-마우스 (Fab)2 다클론 항체 또는 동종 대조군으로서 정상 다클론 염소 IgG (Jackson ImmunoResearch)로 염색하였다. 그리고 나서, APC-결합 스트렙타비딘 및 V450에 결합된 항-CD3 ζ 항체(BD Bioscences)와 세포를 인큐베이션한 후 추가적으로 BD LSRII 유세포 계측을 수행한다. 이에 더하여, 종양 세포를 피코에리트린(PE, phycoerythrin)-결합 마우스 항-FLT3 mAb(eBiosciences)로 염색한 후, 백혈병 세포 표면의 FLT3 발현 또한 BD LSRII 유세포 계측기로 분석한다. FlowJo 소프트웨어(Tree Star Inc.)를 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.
면역블로팅(Immunoblotting) : 세포는 먼저 laemmli 버퍼에서 용해되었다. 그리고 나서, 용해물은 SDS-PAGE 겔에 의해 분리되어 PVDF 멤브레인(Millipore)으로 이동되었다. 상기 멤브레인은 마우스 항-인간 CD3ζ mAb (BD Pharmingen)로, 그리고 나서 호스래디쉬 과산화효소-결합 염소 항-마우스 IgG 항체로 탐지되었다. 항체 결합은 강화 화학 발광체(Thermo scientific Inc.)를 이용하여 검출되었다.
FLT3을 안정적으로 발현하는 NK-92세포의 제조 : 렌티바이러스성 형질주입 및 감염 프로토콜은 우리의 종전 레포트에서 변형되었다(Chu et al. (2014) Leukemia 28:917-927; Han et al. (2015) Scientific Reports 5:11483).
세포 독성 분석 : 전술한 것과 같이 표준 4시간 51Cr 방출 분석을 수행하였다(Yu et al. Blood 115:274-281 (2010)). 간략하게, 타겟 세포는 51Cr 으로 표지되어, 1차 T 세포 또는 FLT3-CAR로 형질도입된 T세포 또는 다양한 이펙터/타겟 비율(E/T)의 모의 벡터로 형질도입된 T 세포와 37℃에서 4시간 동안 96-well V-bottom plate의 well내에서 공동배양되었다. 상청액을 수확하여 액체 신틸레이션 칵테일(Fischer Scientific)을 포함하는 신틸레이션 바이알에 옮겼고, TopCount counter(Canberra Packard)에서 51Cr의 방출을 측정하였다. 완전 배지 또는 1% SDS에 배양된 타겟 세포들은 자연 또는 최대 51Cr 방출을 검출하는 데 이용되었다. 특종 용해 비율은 표준 공식을 이용하여 계산되었다 : 100 ×(cpm 실험 방출 - cpm 자연 방출)/(cpm 최대 방출 - cpm 자연 방출).
사이토카인 방출 분석 : 사이토카인 타겟 세포들은 동일한 수의 이펙터 세포와 함께 96-well V-bottom plate에서 37 ℃에서 24시간 동안 공동배양되었다. 무세포 상청액을 수확하여 R&D system의 상응하는 ELISA 키트를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 ELISA에 의해 IFN-gamma 및 IL-2 분비를 평가하였다.
백혈병 보유 마우스 및 생체발광(bioluminescene) 이미징의 in vivo 처리(treatment) : 반딧불이 루시퍼라제(firefly luciferase)를 발현하는 Pinco-pGL3-luc/GFP 바이러스로 MOLM13 세포들을 레트로바이러스성 형질도입하였고, 전술한 방법을 이용하여 GFP-양성 세포들을 분류하여, MOLM13-GL3 세포를 제조하였다. 0일차에, 수컷 NSG 마우스의 꼬리 정맥을 통해 400mL의 PBS 내에 8 ×106 개의 MOLM13-GL3 세포를 정맥주사하여 이종이식 동소 (xenograft orthotopic) 백혈병 모델을 제조하였다. 7일 및 14일차에, 마우스의 꼬리 정맥을 통해 400mL의 PBS 내에 예를 들어 FLT3-CAR-형질도입된 NK세포 또는 모의-형질도입된 대조군 세포와 같은 이펙터 세포 10×106 개를 정맥주사로 투여하였다. 백혈병 세포 접종 5주 후, 마우스에 D-루시페린을 복강내 주사하고(150 mg/kg 체중; Gold Biotechnology), 아이소플루레인으로 마취하고, IVIS(In Vivo Imaging System)와 Living Image software (PerkinElmer)를 이용하여 이미지화하였다.
통계적 분석 : unpaired Student t test를 이용하여 정규분포인 것처럼 연속적인 종단점에 대해 두 개의 독립적인 그룹을 비교하였다. 일원분산분석이 세 개 또는 그 이상의 독립 그룹을 비교하는 데에 이용되었다. 생존 데이터에 대해, Kaplan-Meier 커브를 플로팅하여 log-rank 테스트를 이용하여 비교하였다. 모든 검정은 양측검정이다. Bonferroni 방법을 이용하여 다중 비교를 위해 P값을 조정하였다. 0.05 미만의 P값은 통계적으로 유의미한 것으로 간주된다.
결과
FLT3-CAR의 제조 및 CAR-형질도입된 NK 세포에서 그의 발현 : PCDH 렌티바이러스 벡터 백본을 이용하여, iCasp9-T2A 카세트, 시그널 펩티드(SP), 중쇄 가변 영역(VH), 링커, 경쇄 가변 영역(VL), Myc태그, 힌지, CD28 및 CD3ζ(도 8A)를 포함하는 특이적 FLT3-CAR 구조가 제조되었다. 그리고 나서, NK-92 세포주는 CAR 구조 및 대조군인 빈 벡터로 형질도입되었다. 이에 더하여, 형질도입된 NK-92 세포주는 벡터에 의해 발현된 형광 마커인 GFP의 발현에 대해 분류되었다. 분류된 세포 및 오리지널 NK-92 세포를 항-CD3ζ로 면역블로팅한 결과 FLT3-CAR이 성공적으로 도입되고 발현되었다는 것을 증명하였다. 도 8B에 나타난 것처럼, 키메릭 FLT3- ScFv 수용체는 오리지널 및 대조군 벡터 형질도입된 세포보다는 CAR-형질도입된 NK-92 세포에서 발현되었다. 여기에 더하여, 유세포 분석은 오리지널 및 형질도입된 NK-92세포를 항-마우스 Fab 항체로 염색하여 오리지널 및 모의-형질도입된 NK-92 세포에서 ScFv 발현이 거의 검출 불가능한 수준으로 나타난 반면, FLT3-CAR로 형질 감염된 NK-92 세포의 89.4 %에서 ScFv의 발현을 검출하여, FLT3-CAR의 세포 표면에서의 발현을 증명하였다(도 8C).
모의-형질도입된 NK-92 세포보다 FLT3-CAR 변형된 NK-92 세포는 FLT3 + 백혈병 세포를 인식하며 더 효율적으로 살해한다 : FLT3-CAR NK-92세포가 특이적으로 FLT3- 보다 FLT3+ 백혈구 세포를 더 잘 제거하는지 증명하기 위해, 백혈병 세포주 MOLM13 및 EOL-1은 FLT3을 일관되게 발현하는 반면 FLT3의 발현은 U937에서 검출 불가능한 수준으로 나타나는 것을 확인하였다(도 9A). 그리고 나서, 오리지널 및 모의-형질도입된 NK-92 세포에 비하여 FLT3-CAR로 형질도입된 NK-92 세포가 특이적으로 FLT3+ 백혈병 세포주 MOLM13 및 EOL-1을 제거하는 능력에 상당한 개선이 있었음을 증명하는 크롬-51 방출 분석을 수행하였다. 그러나, 백혈병 세포 살해의 증진은 FLT3+ 의존적이다. FLT3-CAR로 형질도입된 NK-92 세포는 FLT3-세포주 U937를 살해하는 능력에 있어서 검출 가능한 차이를 보이지 않았다(도 9B). 여기에 더하여, 오리지널 및 모의-형질도입된 NK92 세포에 비해, CAR-FLT3으로 형질도입된 NK-92 세포주에 의한 FLT3+백혈구 세포 인식은 강한 IFN-γ 방출을 유도했다. 오리지널 및 모의-형질도입된 NK-92 세포에 비해, CAR-FLT3으로 형질도입된 NK-92 세포에 의한 IFN-γ 방출의 강한 유도는 FLT3-세포주 U937에서는 나타나지 않았다(도 9C). 대조 세포주, U937 및 FLT3+ MOLM13과 공동배양되었을 때, 오리지널 NK-92 세포 및 FLT3-CAR 구조체 또는 모의로 형질전환된 NK-92 세포에서 유사한 결과가 IFN-γ mRNA 수준에 의해 증명되었다.
FLT3-CAR 조작된 NK-92 세포가 ex vivo에서 1차 백혈병을 더 효율적으로 제거한다 : FLT3-CAR로 형질도입된 NK-92세포가 오리지널 및 모의-형질도입된 NK-92 세포에 비해 더 강한 항-종양 반응을 유도하는지 증명하기 위해, 환자들로부터 백혈병 세포가 분리되었으며, 이 종양 세포들에서 FLT3의 발현이 확인되었다(도 10A). 그리고 나서, 두 환자로부터 분리된 FLT3+ 종양 세포에 대해 크롬-51 방출 분석을 수행하였다. 오리지널 및 모의-형질도입된 NK-92 세포에 비해, FLT3-CAR 변형된 NK-92 세포는 FLT3 발현으로 더 강한 종양 세포 용해 능력을 나타냈다(도 10B). 그러나, FLT3-CAR NK-92세포는 정상 대조군 사람들로부터 분리한 일반 PBMC 에 대해서는 세포 용해 활성(cytolytic activity)의 약간의 증가만을 나타냈다(도 10B). 이에 더하여, ELISA에 의해 측정되는 IFN-γ의 분비를 테스트하기 위해 사이토카인 방출 분석을 수행하였다. 세포 용해 활성에 관한 데이터와 일치하게, 환자로부터 분리한 FLT3+ PBMCs와 공동배양했을 때 오리지널 또는 모의-형질도입된 NK-92 세포에 비하여 FLT3-CAR 변형된 NK-92 세포는 더 많은 IFN-γ을 방출하였다. 여기에 더하여, FLT3-CAR 조작된 NK-92로부터 생성되는 사이토카인 반응의 증가는 정상 대조군 사람에서 유래한 PBMC와 공동배양하였을 때 사라졌다(도 10C). 돌연변이 및 높은 수준의 FLT3을 갖는 환자로부터 분리한 PBMC와 공동배양한 이후 FLT3-CAR 변형된 NK-92 세포가 오리지널 및 모의-형질도입된 NK-92에 비하여 mRNA 수준에서 더 많은 IFN-γ를 생성하였다는 점을 추가적인 real-time PCR 실험을 통해 확인하였다(도 10C). FLT3- CAR 조작된 NK-92에 의한 환자의 종양 세포에서의 FLT3 발현의 인식은 NK 세포의 세포 용해 활성 및 사이토카인 분비를 증진하였다.
FLT3-CAR로 형질도입된1 차 NK는 FLT3 + 종양 세포의 인식 및 살해를 증진한다 : FLT3-CAR가 임상에 도입될 수 있는지 결정하기 위해, FLT3-CAR로 형질도입된 1차 NK세포가 효율적으로 백혈병 세포주, 특히 FLT3+ 백혈병 세포주를 인식하고 살해할 수 있었으며, 백혈병 환자로부터 새로 분리된 종양 세포가 조사되었다. D1, D2, 및 D3으로 명명한 3개의 공여자로부터 온 1차 NK들을 분리하였다. 그리고 나서, 렌티바이러스성 형질주입을 이용하여 이 1차 NK에 FLT3-CAR를 도입하고 통합시켰다. 확장 이후, 이 유전적으로 변형된 1차 NK들은 크롬-51 방출 분석에 사용되었다. 세포독성 분석은 모의-변형된 것에 비해 5와 동등한 E/T 비율로 FLT3-CAR 변형된 1차 NK가 효율적으로 FLT3+ 백혈병 MOLM13 세포주를 살해할 수 있다는 것을 증명하였다(도 11A). FLT3-CAR로 형질 전환된 1차 NK의 제거 활성을 좀 더 임상적으로 관련있는 맥락에서 추가로 더 테스트하기 위해, 환자로부터 새로 분리한 백혈병 세포에 대해 유전적으로 변형된 1차 NK의 세포 독성 또한 크롬-51 방출 분석에 의해 측정되었다. FLT3-CAR로 형질도입된 세포 용해 활성에 대한 전술한 데이터와 일치하게, 백혈병 환자로부터 새롭게 분리한 종양 세포에 반응하여 모의-변형된 1차 NK 세포에 비해 FLT3-CAR 변형된 1차 NK에서 세포독성이 더 큰 정도로 나타났다(도 11B).
AP1903 간섭이 FLT3-CAR-NK92를 iCasp9로 효율적으로 제거한다: CAR-매개의 면역요법의 단점을 극복하기 위해, 안전성 스위치라고 불리기도 하는 유도성 카스파제 9(iCasp9)가 유전적으로 변형된 CAR에 도입되며 부적절하게 활성화된 CAR 세포를 제거하는 것을 가능하게 한다. Gargett et al. Front Pharmacol 5:235 (2014)를 참고하라. 여기, iCasp9를 또한 우리의 FLT3-CAR에 도입하였다(도 8A). AP1903 간섭이 CAR-변형된 NK 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도할 수 있는지 테스트하기 위해, 우리는 먼저 오리지널, 모의 및 FLT3-CAR-형질도입된 NK-92 세포에서 iCasp9의 발현을 측정하였다. 오리지널 및 모의-형질도입된 NK-92 세포에 비해, iCasp9가 실제로 CAR-변형된 NK-92에서 발현되는 것을 Real-time PCR을 통해 증명하였다(도12A). AP1903의 투여 48시간 이후, AP1903 간섭이 CAR-변형된 NK-92 세포의 사멸을 상당한 수준으로 유도하는 것이 가능하다는 것을 7-AAD 염색으로 나타냈다(도 12B). 추가로 Annexin V 및 7-ADD 이중 염색 및 유세포 분석을 통해 48시간의 AP1903이 오리지널보다 CAR-조작된 NK-92 세포의 아폽토시스를 상당히 유도한다는 것을 확인하였다(도 12D). 오리지널 NK-92 세포에 비해 CAR-변형된 NK-92의 아폽토시스는 또한 절단 카스파제 3의 발현에 의해 추가적으로 증명되었다(도 12D). 이 데이터는 AP1903 간섭이 CAR-변형된 NK-92 세포를 면역요법 동안 효율적으로 제거하는 데 사용될 수 있음을 증명하였다.
FLT3-CAR 조작된 NK-92 세포가 이종이식 동소 백혈병 모델에서 백혈병 종양 성장을 억제하고 백혈병 보유 마우스의 생존을 연장한다 : FLT3-CAR 변형된 NK-92 세포의 잠재적인 요법 적용은 이종이식된 백혈병 NSG 마우스 모델에서 평가되었다. 백혈병 세포주는 반딧불이 루시퍼라제를 발현하도록 유전적으로 변형되었다. 그리고 나서 GFP-기반 분류를 수행하여 유전적으로 변형된 백혈병 종양 세포를 분리하였으며 분류된 세포를 NSG 마우스에 정맥 내 접종하여 종양 성장을 시작하게 하였다. 그리고 나서, 이 마우스들에 FLT3-CAR 변형된 NK-92 세포, 모의-형질도입된 NK-92 세포 및 오리지널 NK-92 세포를 정맥주사하였다. IVIS를 이용한 생체발광 이미징은 오리지널 및 모의-형질도입된 NK-92 세포에 비해 FLT3-CAR 형질도입된 NK-92 세포의 주입이 종양의 양을 급격히 감소시켰음을 나타낸다(도 13A). 여기에 더하여, 오리지널 및 모의-형질도입된 NK-92 세포에 비해 FLT3-CAR 조작된 NK-92 세포들의 처리는 종양 보유 마우스의 생존을 두드러지게 연장하였다(도 13B).
실시예 6 - 상이한 공자극 도메인을 포함하는 FLT3 CAR 구조의 비교
CD28 공자극 도메인을 포함하는 FLT3 CAR를 발현하는 면역 세포 및 4-1BB 공자극 도메인을 포함하는 FLT3 CAR를 발현하는 면역 세포에 대한 크롬 방출 분석을 수행하여 CD28 공자극 도메인이 사용된 FLT3 CAR 세포의 항-종양 효율을 비교한다.
등가물
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 기술이 속하는 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 예시적으로 설명된 본 발명은 여기에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 한정 또는 한정들이 없는 경우 적합하게 실시될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, “포함하는(comprising)”, “포함하는(including)”, “함유하는(containing)” 등은 제한 없이 그리고 넓은 범위로 해석되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어 및 표현은 한정을 위한 것이 아니라 설명의 용어로 사용된 것이며, 그러한 용어 및 표현의 사용에 있어 기재되고 설명된 특징의 동등물을 배제하려는 의도는 없으며, 청구된 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경이 가능하다는 것이 인정된다.
따라서, 본원에 제공된 재료, 방법, 및 예시는 바람직한 실시 양태를 나타내는 것이며, 예시적인 것이고, 본원 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니라는 것이 이해되어야 한다.
본원 발명은 본 명세서에서 광범위하고 일반적으로 설명되었다. 일반적 개시 내용에 속하는 더 좁은 종 및 준-일반 그룹의 각각 또한 본원 발명의 일부를 형성한다. 여기에는 삭제된 물질이 본원에서 구체적으로 인용되는지 여부에 관계 없이, 속(genus)으로부터 온 임의의 물질을 제거하는 단서 또는 부정적 한정을 갖는 본원 발명의 일반적인 설명이 포함된다.
이에 더하여, 본원 발명이 마쿠쉬 군으로 설명된 특징 또는 실시 양태에서, 본원 발명이 또한 그로써 그 마쿠쉬 그룹의 구성요소의 아군(subgroup) 또는 각각의 구성요소의 용어로 설명될 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 인식될 것이다.
본원에 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 각각이 개별적으로 참고로 포함된 것과 동일한 정도로 전체적으로 참고문헌으로서 명확하게 포함된다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서 내용이 우선한다.
다른 실시 양태는 다음의 청구범위 내에 있다.

Claims (40)

  1. (a) FLT3 항체의 항원 결합 도메인; (b) 힌지(hinge) 도메인; (c) 막 관통 도메인(transmembrane domain); 및 (d) 세포내 도메인(intracellular domain); 를 포함하는, 키메릭 항원 수용체(CAR).
  2. 제 1항의 CAR에 있어서, (a)FLT3 항체의 항원 결합 도메인; (b) 힌지 도메인; (c) CD28 막 관통 도메인; (d) CD28 공자극(costimulatory) 시그널링 영역, 4-1BB 공자극 시그널링 영역, ICOS 공자극 시그널링 영역, 및 OX40 공자극 시그널링 영역으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 공자극 영역; 및 (e) CD3 제타 시그널링 도메인을 포함하는, CAR.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 FLT3 항체의 항원 결합 도메인은 FLT3 중쇄 가변 영역 및 FLT 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, CAR.
  4. 제3항에 있어서, FLT3 중쇄 가변 영역 및 FLT3 경쇄 가변 영역 사이에 위치한 링커 폴리펩티드를 추가로 더 포함하는 것인, CAR.
  5. 제4항에 있어서, 상기 FLT3 중쇄 가변 영역은 서열번호 21 내지 23, 서열번호 29 내지 31 중 어느 하나에 의하여 코딩되는 아미노산 서열 또는 이의 등가물(equivalent)을 포함하는 것인, CAR.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FLT 경쇄 가변 영역의 CDR 영역은 서열번호 24 내지 26, 서열번호 32 내지 34 중 어느 하나에 의하여 코딩되는 아미노산 서열 또는 이의 등가물을 포함하는 것인, CAR.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 폴리펩티드는 (GGGGS)n 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 상기 n은 1 내지 6의 정수인 것인, CAR.
  8. 전술한 어느 한 항에 있어서, CAR에 부착된 검출 가능한 마커 또는 정제 마커(purification marker)를 추가로 더 포함하는, CAR.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 등가물은 CAR에 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리펩티드 또는 CAR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열 (complement)에 높은 엄격도(high stringency) 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하고, 상기 높은 엄격도 조건은 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도이고; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 버퍼 농도; 약 55%내지 약 75%의 포름아마이드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함하는 것인, CAR.
  10. 이의 각각의 등가물, 이의 상보적 서열 또는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 CAR를 코딩하는 분리된 핵산 서열로서, 상기 등가물은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 서열에 적어도 80% 서열 동일성을 갖거나, 또는 CAR를 코딩하는 분리된 핵산의 상보적 서열 또는 폴리뉴클레오티드에 높은 엄격도 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 갖고, 상기 높은 엄격도 조건은, 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도이고; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 버퍼 농도; 약 55%내지 약 75%의 포름아마이드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함하는 것인, CAR.
  11. 제10항에 있어서, FLT3 항체의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림(upstream)에 위치한 프로모터 코딩 폴리뉴클레오티드 서열(promoter encoding polynucleotide sequence)을 추가로 더 포함하는, 분리된 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 상기 프로모터 코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 CMV 프로모터, MND 프로모터, 또는 EF1 알파 프로모터 중에서 선택된 것인, 분리된 핵산.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, FLT3 항체의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림 또는 다운스트림(downstream)에 위치한 iCasp 코딩 폴리뉴클레오티드를 추가로 더 포함하는 것인, 분리된 핵산.
  14. 제13항에 있어서, 상기 iCasp코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 40인, 분리된 핵산.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, FLT3 항체의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림에 위치한 2A 펩티드(T2A) 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 더 포함하는, 분리된 핵산.
  16. 제15항에 있어서, 상기 2A 펩티드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 41인, 분리된 핵산.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, FLT3 항체의 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림에 위치한 시그널 펩티드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 더 포함하는, 분리된 핵산.
  18. 제17항에 있어서, 상기 시그널 펩티드 코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44에서 선택된 것인, 분리된 핵산.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 분리된 핵산을 포함하는, 벡터 또는 mRNA.
  20. 제19항에 있어서, 상기 벡터 또는 mRNA는 플라스미드인, 벡터 또는 mRNA.
  21. 제19항에 있어서, 상기 벡터 또는 mRNA는 레트로바이러스성(retroviral) 벡터, 렌티바이러스성(lentiviral) 벡터, 아데노바이러스성(adenoviral) 벡터, 및 아데노-관련(adeno-associated) 바이러스성 벡터의 군에서 선택된 것인, 벡터 또는 mRNA.
  22. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 CAR; 및/또는 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 분리된 핵산; 및/또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 벡터 또는 mRNA를 포함하는, 분리된 세포.
  23. 제22항에 있어서, 분리된 핵산에 결합된 검출 가능한 라벨을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 더 포함하는, 분리된 세포.
  24. 제22항 또는 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포인, 분리된 세포.
  25. 제22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 진핵세포인, 분리된 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 진핵세포는 동물 세포, 포유류 세포, 소(bovine) 세포, 고양이(feline) 세포, 개(canine) 세포, 쥐(murine) 세포, 말(equine) 세포 또는 인간 세포의 군에서 선택된 것인, 분리된 세포.
  27. 제25항에 있어서, 상기 진핵세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 수지상(dendritic) 세포, 또는 골수(myeloid) 세포인, 분리된 세포.
  28. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 CAR; 및/또는 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 분리된 핵산; 및/또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 벡터 또는 mRNA; 및/또는 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항의 분리된 세포를 포함하는, 조성물.
  29. FLT3 항원을 발현하는 세포에 결합한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 CAR를 포함하는 분리된 세포를 포함하는 분리된 복합체.
  30. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항의 분리된 핵산 및/또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 벡터 또는 mRNA를 분리된 세포에 형질도입하는 것을 포함하는, FLT3 CAR 발현 세포를 제조하는 방법.
  31. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항의 분리된 세포의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 이의 치료를 필요로 하는 대상에서 FLT3를 발현하는 암을 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 분리된 세포는 치료 대상의 자가 유래인(autologous) 것인, 방법.
  33. 제31항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 혈액 및/또는 골수에 영향을 미치는 암인 것인, 방법.
  34. 제31항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)인 것인, 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상은 인간 환자인 것인, 방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항의 상기 분리된 세포는 제13항 및 제14항 중 어느 한 항의 분리된 핵산을 포함하고, 추가로 iCasp 발현 폴리뉴클레오티드의 발현 유도를 포함하는 것인, 방법.
  37. 환자로부터 분리된 종양 샘플을 유효량의 항-FLT3 항체와 접촉시키는 단계 및 종양 샘플에 결합하는 임의의 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 환자가 FLT3 CAR 요법에 반응할 가능성이 있거나 혹은 그렇지 않거나를 결정하는 방법으로서, 상기 종양 샘플에 결합한 항체의 존재는 환자가 FLT3 CAR 요법에 반응할 가능성이 있다는 것을 나타내며, 종양 샘플에 결합한 항체의 부존재는 환자가 FLT3 CAR 요법에 반응하지 않을 것임을 나타내는 것인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, FLT3 CAR 요법에 반응할 가능성이 있다고 결정된 환자에게 유효량의 FLT3 CAR 발현 세포를 투여하는 단계를 추가로 더 포함하는 방법.
  39. 본원에 개시된 바와 같은 조성물, 및 대안으로 사용 설명서를 포함하는 키트.
  40. 제39항에 있어서, FLT3 항원 결합 도메인, 및 대안으로 사용 설명서를 추가로 더 포함하는 키트.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7054924B2 (ja) * 2015-09-23 2022-04-15 サイトイミューン セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫療法のためのｆｌｔ３指向ｃａｒ細胞
CA3025516A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Flt3-specific chimeric antigen receptors and methods using same
WO2018119279A1 (en) * 2016-12-21 2018-06-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies specific for flt3 and uses thereof
KR20200014777A (ko) * 2017-06-02 2020-02-11 화이자 인코포레이티드 Flt3을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체
TWI757499B (zh) 2017-06-02 2022-03-11 美商輝瑞大藥廠 對flt3具特異性之抗體及其用途
US20200206266A1 (en) * 2017-08-01 2020-07-02 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Use of flt3 car-t cells and flt3 inhibitors to treat acute myeloid leukemia
JP2020530993A (ja) * 2017-08-02 2020-11-05 オートラス リミテッド キメラ抗原受容体または改変ｔｃｒを発現し、選択的に発現されるヌクレオチド配列を含む細胞
AU2018365080A1 (en) * 2017-11-10 2020-05-07 Jura Bio, Inc. Major histocompatibility complex-based chimeric receptors and uses thereof for treating autoimmune diseases
CN109988759A (zh) * 2017-12-29 2019-07-09 上海细胞治疗研究院 一种在t细胞中具有高转录活性的嵌合启动子
US20190328785A1 (en) * 2018-04-30 2019-10-31 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Flt3-binding chimeric antigen receptors, cells, and uses thereof
CN110305847B (zh) * 2018-07-27 2021-05-18 赛诺生（深圳）基因产业发展有限公司 一种用于治疗肿瘤的基因工程细胞
CN109134665B (zh) * 2018-08-24 2021-06-11 上海先博生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及应用
US20220088070A1 (en) * 2018-11-30 2022-03-24 Juno Therapeutics, Inc. Methods for treatment using adoptive cell therapy
CN114007642A (zh) 2019-04-30 2022-02-01 森迪生物科学公司 嵌合受体及其使用方法
EP4032972A4 (en) * 2019-09-18 2024-07-24 Slbigen Inc GENETICALLY MODIFIED NK CELL LINE TRANSDUCED WITH A GENE ENCODING A NOVEL CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR AND USE THEREOF
KR102287180B1 (ko) 2019-10-01 2021-08-09 충북대학교 산학협력단 Cd138에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체, 이를 발현하는 면역세포 및 이의 항암 용도
JP2023522330A (ja) * 2020-04-17 2023-05-30 シティ・オブ・ホープ Ｆｌｔ３陽性悪性腫瘍を処置するためのｆｌｔ３標的化キメラ抗原受容体改変細胞
CN111647071B (zh) * 2020-06-17 2023-05-05 深圳豪石生物科技有限公司 识别靶细胞表面抗原的t细胞受体及其组合物
CN116410315A (zh) * 2021-12-31 2023-07-11 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种新型靶向人flt3的嵌合抗原受体修饰的t细胞的构建及应用

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0768377A1 (en) 1988-09-02 1997-04-16 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
AU7247191A (en) 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
CA2108147C (en) 1991-04-10 2009-01-06 Angray Kang Heterodimeric receptor libraries using phagemids
EP0590067A1 (en) 1991-06-14 1994-04-06 Xoma Corporation Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
ES2247204T3 (es) 1994-01-31 2006-03-01 Trustees Of Boston University Bancos de anticuerpos policlonales.
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
GB9416721D0 (en) 1994-08-18 1994-10-12 Short Brothers Plc A bias yarn assembly forming device
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
DE19608769C1 (de) 1996-03-07 1997-04-10 Univ Eberhard Karls Antikörper BV10A4H2
US6924123B2 (en) 1996-10-29 2005-08-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Lentiviral LTR-deleted vector
EP1990409A3 (en) 1999-07-20 2011-05-18 MorphoSys AG Bacteriophage
CA2406864A1 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7419829B2 (en) 2000-10-06 2008-09-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
CA2439067C (en) 2001-03-13 2011-02-15 Novartis Ag Lentiviral packaging constructs
US8034904B2 (en) * 2002-06-14 2011-10-11 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
BRPI0406678A (pt) 2003-01-07 2005-12-20 Symphogen As Método para produzir proteìnas policlonais recombinantes
US20130266551A1 (en) 2003-11-05 2013-10-10 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptors with 4-1bb stimulatory signaling domain
AR071891A1 (es) * 2008-05-30 2010-07-21 Imclone Llc Anticuerpos humanos anti-flt3 (receptor tirosina cinasa 3 tipo fms humano)
ES2573642T3 (es) * 2009-12-23 2016-06-09 Synimmune Gmbh Anticuerpos anti-FLT3 y métodos de usar los mismos
WO2011146862A1 (en) * 2010-05-21 2011-11-24 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing selective apoptosis
EP2651442B1 (en) 2010-12-14 2020-04-22 University of Maryland, Baltimore Universal anti-tag chimeric antigen receptor-expressing t cells and methods of treating cancer
WO2013044225A1 (en) 2011-09-22 2013-03-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A universal immune receptor expressed by t cells for the targeting of diverse and multiple antigens
ES2816450T3 (es) 2012-02-22 2021-04-05 Univ Pennsylvania Uso de CAR basados en ICOS para mejorar la actividad antitumoral y la persistencia del CAR
AU2013312838B2 (en) * 2012-09-04 2018-11-29 Cellectis Multi-chain chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2014124143A1 (en) 2013-02-06 2014-08-14 Anthrogenesis Corporation Modified t lymphocytes having improved specificity
DK3300745T3 (da) 2013-02-15 2019-11-04 Univ California Kimærisk antigenreceptor og fremgangsmåder til anvendelse deraf
US20160017048A1 (en) * 2013-03-07 2016-01-21 Baylor College Of Medicine Targeting cd138 in cancer
US9657105B2 (en) * 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
TWI654206B (zh) * 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
KR102339240B1 (ko) 2013-10-15 2021-12-15 더 스크립스 리서치 인스티튜트 펩타이드 키메라 항원 수용체 t 세포 스위치 및 이의 용도
KR102357968B1 (ko) 2013-10-15 2022-02-03 더 스크립스 리서치 인스티튜트 키메라 항원 수용체 t 세포 스위치 및 이의 용도
EP3097117B1 (en) * 2014-01-21 2023-10-04 Novartis Ag Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
WO2015142675A2 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
CN104091269A (zh) 2014-06-30 2014-10-08 京东方科技集团股份有限公司 一种虚拟试衣方法及虚拟试衣系统
MA40253A (fr) 2014-07-15 2017-05-24 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
WO2016070061A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for modified t cells
WO2016100236A2 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlled elimination of therapeutic cells
AU2015362753A1 (en) 2014-12-15 2017-04-27 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlled activation or elimination of therapeutic cells
ES2884844T3 (es) 2015-03-09 2021-12-13 Agensys Inc Conjugados de anticuerpo fármaco (ADC) que se unen a proteínas FLT3
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
US10286092B2 (en) * 2015-08-25 2019-05-14 Ucl Business Plc Detecting a therapeutic cell
JP7054924B2 (ja) * 2015-09-23 2022-04-15 サイトイミューン セラピューティクス， インコーポレイテッド 免疫療法のためのｆｌｔ３指向ｃａｒ細胞
TWI757499B (zh) 2017-06-02 2022-03-11 美商輝瑞大藥廠 對flt3具特異性之抗體及其用途
SG11202101067XA (en) 2018-07-04 2021-03-30 Cytoimmune Therapeutics Inc Compositions and methods for immunotherapy targeting flt3, pd-1, and/or pd-l1

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