ES2884844T3 - Conjugados de anticuerpo fármaco (ADC) que se unen a proteínas FLT3 - Google Patents

Conjugados de anticuerpo fármaco (ADC) que se unen a proteínas FLT3 Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a FLT-3 que comprende una CDRH1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, una CDRH2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, una CDRH3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, una CDRL1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDRL2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y una CDRL3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, en donde, opcionalmente, el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2, Fv y scFv; en donde opcionalmente el anticuerpo comprende una región Fc que es un subtipo de IgG; y en donde opcionalmente el anticuerpo comprende una región Fc que comprende una sustitución de un aminoácido no natural en la posición del aminoácido 124 de la cadena pesada y donde el aminoácido no natural es para-acetilfenilalanina (pAF).

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de anticuerpo fármaco (ADC) que se unen a proteínas FLT3
Campo de la invención
La invención descrita en el presente documento se refiere a anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos y conjugados de anticuerpo fármaco (ADC) de los mismos, que unen proteínas, denominados FLT3, y a los mismos para su uso en terapia, particularmente para su uso en el tratamiento de cáncer.
Antecedentes de la invención
Se estima que 1.660.290 hombres y mujeres (854.790 hombres y 805.500 mujeres) fueron diagnosticados y 580.350 hombres y mujeres murieron de cáncer de todos los sitios en 2013. Desde 2006-2010, la mediana de edad en el momento del diagnóstico de cáncer de todos los sitios fue de 66 años. La tasa de incidencia ajustada por edad fue de 463,0 por 100.000 hombres y mujeres por año. Estas tasas se basan en casos diagnosticados en 2006-2010 de 18 áreas geográficas SEER ((N.B. SEER = Surveillance, Epidemiology, and End Results Program, NCI). Desde 2006-2010, la mediana de edad en el momento de la muerte por cáncer de todos los sitios fue de 72 años. La tasa de mortalidad ajustada por edad fue de 176,4 por 100.000 hombres y mujeres por año. Estas tasas se basan en pacientes que murieron en 2006-2010 en los e E.UU. La supervivencia relativa general a 5 años para 2003-2009 de 18 áreas geográficas SEER fue del 65,8 %.
Las leucemias son cánceres que comienzan en el tejido que forma la sangre, como la médula ósea, y hacen que se produzcan cantidades anormalmente grandes de células sanguíneas que ingresen al torrente sanguíneo. Las principales leucemias están comprendidas por Leucemia Linfoblástica Aguda (ALL, por sus siglas en inglés), Mieloide Aguda (AML, por sus siglas en inglés), Linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés), Mielógena Crónica (CML, por sus siglas en inglés) y Tricoleucemia (CLL, por sus siglas en inglés).
Para estas leucemias como un grupo, se estima que 48.610 hombres y mujeres (27.880 hombres y 20.730 mujeres) serán diagnosticados y 23.720 hombres y mujeres morirán de leucemia en 2013. Desde 2006-2010, la mediana de edad en el momento del diagnóstico de leucemia fue de 66 años. La tasa de incidencia ajustada por edad fue de 12,8 por 100.000 hombres y mujeres por año. Estas tasas se basan en casos diagnosticados en 2006-2010 de 18 áreas geográficas SEER. Desde 2006-2010, la mediana de edad en la muerte por leucemia fue de 75 años. La tasa de mortalidad ajustada por edad fue de 7,1 por 100.000 hombres y mujeres por año. Estas tasas se basan en pacientes que murieron en 2006-2010 en los EE.UU. La supervivencia relativa general a 5 años para 2003-2009 de 18 áreas geográficas SEER fue del 56,0 %.
La CLL es el segundo tipo más común de leucemia en adultos y habitualmente empeora lentamente. A menudo se produce durante o después de la mediana edad y rara vez se produce en niños. Los pacientes con CLL en fase temprana no se tratan con quimioterapia hasta que se vuelven sintomáticos o muestran evidencia de progresión rápida de la enfermedad. El inicio temprano de la quimioterapia no ha mostrado beneficios en la CLL e incluso puede aumentar la mortalidad. Cuando se inicia la quimioterapia, el análogo de nucleósido fludarabina es la terapia de primera línea más comúnmente usada en la CLL. Los regímenes combinados han mostrado mejores tasas de respuesta en varios ensayos clínicos e incluyen lo siguiente: Fludarabina, ciclofosfamida y rituximab (FCR); Pentostatina, ciclofosfamida y rituximab (PCR); Fludarabina, ciclofosfamida y mitoxantrona (FCM); Ciclofosfamida, vincristina y prednisona (CVP); Ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona (CHOP). Se estima que 15.680 hombres y mujeres (9.720 hombres y 5.960 mujeres) serán diagnosticados y 4.580 hombres y mujeres morirán de leucemia linfocítica crónica en 2013. Desde 2006-2010, la mediana de edad en el momento del diagnóstico de leucemia linfocítica crónica fue de 71 años. La tasa de incidencia ajustada por edad fue de 4,3 por 100.000 hombres y mujeres por año. Estas tasas se basan en casos diagnosticados en 2006-2010 de 18 áreas geográficas SEER. Desde 2006-2010, la mediana de edad en la muerte por leucemia linfocítica crónica fue de 79 años. La tasa de mortalidad ajustada por edad fue de 1,4 por 100.000 hombres y mujeres por año. Estas tasas se basan en pacientes que murieron en 2006-2010 en los EE.uU. La supervivencia relativa general a 5 años para 2003­ 2009 de 18 áreas geográficas SEER fue del 79,2 %.
La leucemia mieloide aguda (AML) es el tipo más común de leucemia aguda entre los adultos. El tratamiento actual de la AML debe ser lo suficientemente agresivo para lograr la remisión completa (CR, por sus siglas en inglés) porque la remisión parcial no ofrece un beneficio sustancial en la supervivencia. Las tasas de remisión en AML en adultos están inversamente relacionadas con la edad, con una tasa de remisión esperada de más del 65 % para los menores de 60 años. Los datos sugieren que una vez alcanzada, la duración de la remisión puede ser más corta en pacientes de edad avanzada. Los pacientes que expresan el antígeno de células progenitoras CD34 y/o la glucoproteína P (producto del gen MDR1) tienen un resultado inferior. El análisis citogenético proporciona la información de pronóstico más sólida disponible, prediciendo el resultado tanto de la inducción en remisión como de la terapia posterior a la remisión. Las anomalías citogenéticas que indican un buen pronóstico incluyen t(8; 21), inv(16) ort(16; 16) y t(15; 17). La citogenética normal presagia AML de riesgo promedio. Los pacientes con LMA que se caracteriza por deleciones de los brazos largos o monosomías de los cromosomas 5 o 7; por translocaciones o inversiones del cromosoma 3,t(6; 9), t(9; 22); o por anomalías del cromosoma llq23 tienen un pronóstico particularmente desfavorable con la quimioterapia. Se estima que 14.590 hombres y mujeres (7.820 hombres y 6.770 mujeres) serán diagnosticados y 10.370 hombres y mujeres morirán de leucemia mieloide aguda en 2013. Desde 2006-2010, la mediana de edad en el momento del diagnóstico de leucemia mieloide aguda fue de 67 años. La tasa de incidencia ajustada por edad fue de 3,7 por 100.000 hombres y mujeres por año. Estas tasas se basan en casos diagnosticados en 2006-2010 de 18 áreas geográficas SEER. Desde 2006-2010, la mediana de edad en la muerte por leucemia mieloide aguda fue de 72 años. La tasa de mortalidad ajustada por edad fue de 2,8 por 100.000 hombres y mujeres por año. Estas tasas se basan en pacientes que murieron en 2006-2010 en los EE.Uu . La supervivencia relativa general a 5 años para 2003-2009 de 18 áreas geográficas SEER fue del 24,2 %. Obsérvese, toda la información general sobre el cáncer se obtuvo del sitio web del NCI (www.cancer.gov) y todas las estadísticas se basan en la incidencia SEER y las estadísticas de mortalidad NCHS que se encuentran en: Howlader N., et. al., SEER Cancer Statistics Review, 1975-2010, National Cancer Institute. Bethesda, MD, http://seer.cancer.gov/csr/1975_2010/, basado en el envío de datos SEER de noviembre de 2012, publicado en el sitio web de SEER, 2013.
La leucemia linfoblástica aguda ("ALL") representa un grupo de neoplasias malignas de células linfoides en fase precursora de BIT que surgen de alteraciones genéticas que bloquean la diferenciación linfoide e impulsan la proliferación y supervivencia celular aberrante. Se han logrado avances notables en las últimas décadas en el tratamiento de la ALL infantil, con tasas de supervivencia de cinco (5) años que ahora se acercan al 90 %. Sin embargo, hasta el 20 % de los niños serán refractarios al tratamiento o recaerán después del tratamiento y la tasa de supervivencia libre de eventos para estos pacientes sigue siendo baja. También sigue siendo un desafío tratar a pacientes adultos con ALL, con una alta tasa de recaídas incluso después de un progreso significativo en la quimioterapia moderna. En las últimas décadas se han logrado mejoras rápidas en los resultados del tratamiento de la ALL, que se basa principalmente en la intensificación y optimización de la quimioterapia, uso adaptado al riesgo del trasplante de células madre, así como terapia individualizada y dirigida que incluye anticuerpos monoclonales. Usando secuenciación de última generación, están evaluándose las mutaciones adicionales que afectan a la linfopoyesis normal y la importancia de las mutaciones cooperantes, así como también las alteraciones epigenéticas. Los datos obtenidos de esta manera ayudarán en la evaluación del pronóstico en el paciente individual pero, de manera importante, también en la incorporación de una terapia dirigida apropiada para la anomalía mutacional.
Además, se está logrando la utilidad terapéutica de los anticuerpos monoclonales (mAb) (G. Kohler y C. Milstein, Nature 256:495-497 (1975)). Los anticuerpos monoclonales se han aprobado ahora como terapias en trasplante, cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad cardiovascular e inflamación. Los diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras. Tales diferencias en la función se reflejan en distintas estructuras tridimensionales para los diversos isotipos de inmunoglobulina (P.M. Alzari et al., Annual Rev. Immunol., 6:555-580 (1988)).
Debido a que los ratones son convenientes para la inmunización y reconocen la mayoría de los antígenos humanos como extraños, los mAb contra dianas humanas con potencial terapéutico han sido normalmente de origen murino. Sin embargo, los mAb murinos tienen desventajas inherentes como agentes terapéuticos humanos. Requieren una dosificación más frecuente ya que los mAb tienen una semivida circulante más corta en seres humanos que los anticuerpos humanos. Más críticamente, la administración repetida de anticuerpos murinos al sistema inmunitario humano hace que el sistema inmunitario humano responda reconociendo la proteína del ratón como extraña y generando una respuesta de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA). Una respuesta HAMA tal puede dar como resultado una reacción alérgica y la rápida eliminación del anticuerpo murino del sistema, haciendo inútil el tratamiento con el anticuerpo murino. Para evitar tales efectos, se han realizado intentos de crear sistemas inmunitarios humanos en ratones.
Los intentos iniciales esperaban crear ratones transgénicos capaces de responder a antígenos con anticuerpos que tuvieran secuencias humanas (Véase Bruggemann et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6709-6713 (1989)), pero estaban limitados por la cantidad de ADN que podía mantenerse de manera estable mediante los vehículos de clonación disponibles. El uso de vectores de clonación de cromosomas artificiales de levadura (YAC) abrió el camino para introducir grandes fragmentos de línea germinal del locus de Ig humana en mamíferos transgénicos. Esencialmente una mayoría de los genes V, D y J humanos dispuestos con el mismo espaciado que se encuentra en el genoma humano y las regiones constantes humanas se introdujeron en ratones usando YAC. Una de estas cepas de ratones transgénicos se conoce como ratones XenoMouse® y está disponible en el mercado de Amgen Fremont, Inc. (Fremont CA), anteriormente Abgenix, Inc.
Adicionalmente, los anticuerpos pueden prepararse usando ratones transgénicos Veloclmmune en los cuales las secuencias genómicas que llevan segmentos variables endógenos de ratón en la cadena pesada de inmunoglobulina (segmentos VH, DH y JH) y/o los loci de la cadena ligera kappa (VK y JK) se han reemplazado, en su totalidad o en parte, por secuencias genómicas humanas que llevan segmentos variables de la línea germinal no reordenados de la cadena pesada de inmunoglobulina humana (VH, DH, y JH) y/o loci de cadenas ligeras kappa (VK y JK) (Regeneron, Tarrytown, NY). Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. n.° 6.586.251, 6.596.541, 7.105.348, 6.528.313, 6.638.768 y 6.528.314.
El documento WO 2009/155015A1 desvela anticuerpos completamente humanos que se unen específicamente a FLT3 humano dentro de los dominios extracelulares 4 o 5 con alta afinidad, y métodos para tratar la leucemia mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo ya sea solo o en combinación con un agente o tratamiento anticáncer incluyendo metotrexato.
Piloto et al., (2006) CANCER RESEARCH 66(9): 4843-4851 desvela IMC-EB10, un anticuerpo monoclonal anti-FLT3, como prolongación de la supervivencia y reducción del injerto inmunodeficiente combinado diabético no obeso/grave de algunas líneas celulares de leucemia linfoblástica aguda y muestras leucémicas primarias.
Williams et al., (2005) LEUKEMIA 19(8): 1432-1438 desvela la selección basada en células de EB10, A2IN y D4-3, anticuerpos anti-FLT3 completamente humanos, y la actividad de EB10 y D4-3 como candidatos para el tratamiento de la leucemia humana que expresa FLT3.
Sumario de la invención
La invención proporciona anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, ácidos nucleicos aislados, vectores de expresión, células hospedadoras recombinantes, composiciones farmacéuticas de conjugados de anticuerpo fármaco (ADC), composiciones farmacéuticas para su uso en terapia, conjugados de anticuerpo fármaco y composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto como se define en las reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones, la invención comprende anticuerpos completamente humanos conjugados con un agente terapéutico. En determinadas realizaciones, existe la condición de que la secuencia de ácido nucleico completa de la Figura 2A y/o 2B no esté codificada y/o no se prepare la secuencia de aminoácidos completa de la Figura 3A y/o 3B. En determinadas realizaciones, se codifica la secuencia completa de ácidos nucleicos de la Figura 2A y/o 2B y/o se prepara la secuencia completa de aminoácidos de la Figura 3A y/o 3B, cualquiera de los cuales está en respectivas formas de dosis unitarias humanas.
Se desvelan diversas composiciones inmunogénicas o terapéuticas, tales como conjugados de anticuerpo-fármaco, y estrategias para tratar cánceres que expresan FLT3 tales como cánceres de tejidos listados en la Tabla I (por ejemplo, AML, ALL, incluyendo leucemia linfoblástica de células B y leucemia linfoblástica de células B precursoras).
Breve descripción de las figuras
Figura 1. La secuencia de ADNc y de aminoácidos de FLT3 se muestra en la Figura 1. La metionina de inicio está subrayada. El marco de lectura abierto se extiende desde el ácido nucleico 67-3048 incluyendo el codón de parada.
Figura 2A. El ADNc y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de CHv62.21. La región variable de cadena pesada está doblemente subrayada y la región constante de IgG1 humana de cadena pesada está subrayada.
Figura 2B. El ADNc y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de CHv62.21 y la cadena ligera de CHv62.21pAF. La región variable de cadena ligera está doblemente subrayada, la región constante kappa humana está subrayada.
Figura 2C. El ADNc y la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de CHv62.21 modificada con la inserción de un aminoácido no natural. La ubicación del codón ámbar para la inserción del aminoácido no natural ("nnAA") para-acetilfenilalanina (pAF) en el resto de ácido nucleico 371 está marcada con una X. La región variable de cadena pesada está doblemente subrayada y la región constante de IgG1 humana de cadena pesada está subrayada.
Figura 3A. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de CHv62.21. La región variable de cadena pesada está doblemente subrayada y la región constante de IgG1 humana está subrayada.
Figura 3B. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de CHv62.21 y la cadena ligera de CHv62.21pAF. La región variable de cadena ligera está doblemente subrayada y la región constante kappa humana está subrayada.
Figura 3C. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de CHv62.21. La posición de aminoácido 124, marcada con una X, es la ubicación del codón ámbar para la inserción del aminoácido no natural ("nnAA") paraacetilfenilalanina (pAF). La región variable de cadena pesada está doblemente subrayada y la región constante de IgG1 humana está subrayada.
Figura 4A. Alineación de la cadena pesada de CHv62.21 con la línea germinal de Ig humana.
Figura 4B. Alineación de la cadena ligera de CHv62.21 con la línea germinal de Ig humana.
Figura 5. Estudio de valoración de efectividad y dosis de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 en el modelo de xenoinjerto establecido por vía subcutánea de la línea celular MV4-11 de leucemia mielomonocítica B humana implantada en ratones CB17/SCID.
Figura 6. Estudio de efectividad de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) y CHv62.21pAF (AGS62P) (anticuerpo desnudo) en un modelo de xenoinjerto establecido por vía subcutánea de la línea celular MV4-11 de leucemia mielomonocítica B humana implantada en ratones c B17 SCID.
Figura 7. CHv62.21 y CHv62.21pAF no median la actividad de citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) in vitro EOL-1, SEM y Raji (de izquierda a derecha en la figura). Detalles del ensayo: 1) E:T = 100:1; 2) Concentración de anticuerpo = 2,5 pg/ml; 3) Tiempo de incubación: 4H; 4) mAb control de isotipo y ADC: AGS91.1-L363-pAF, AGS9188-pAF-AGSL-0182-30; 5) Control positivo: Rituximab dirigido a células Raji.
Figura 8. CHv62.21 muestra actividad de bloqueo de no ligando. El Mab bloqueador del ligando FLT3 (1b37.1) que se compara con CHv62.21 en un ensayo de unión a ligando confirma que el Mab CHv62.21 no es un bloqueador del ligando.
F igura 9. CHv62.21 no interfiere con la proliferación celular mediada por FL.
Figura 10. La actividad citotóxica de un Mab de bloqueo del ligando 1 b37.1 FLT3 se reduce en presencia de FL. Figura 10(A). Evaluación de la citotoxicidad in vitro de v62-1b21.1-AGL-0129-08 con y sin ligando FLT3 humano (hFL) en células RS-4-11. Figura 10(B). Evaluación de la citotoxicidad in vitro de v62-1b37.1-AGL-0129-08 con y sin ligando FLT3 humano (hFL) en células RS-4-11.
Figura 11. El ligando FLT3 no interfiere con la citotoxicidad mediada por CHv62.21pAF-AGL-0182-30 en células MOLM-13. Figura 11(A). Evaluación de la unión de CHv62.21pAF biotinilado y v62-1b37.1 en presencia de ligando FLT3 humano en células MOLM-13. Figura 11(B). Evaluación de la citotoxicidad in vitro de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 con y sin ligando FLT3 humano en células MOLM-13.
Figura 12. Estabilidad in vitro de CHv62.21pAF-AGL-0182-30. Figura 12(A). Evaluación de la estabilidad de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 en suero humano. Figura 12(B). Evaluación de la estabilidad de CHv62-AGL-0301-20 en suero humano.
Figura 13. Estudio de efectividad de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) y CHv62.21pAF (anticuerpo desnudo) en el modelo de xenoinjerto establecido por vía subcutánea de la línea celular MV4-11 de leucemia mielomonocítica B humana implantada en ratones CB17 SCID usando régimen de dosis múltiples.
Figura 14. Efectividad de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 en el modelo de xenoinjerto SEM-xcl establecido por vía subcutánea.
Descripción detallada de la invención
Esquema de las secciones
I. ) Definiciones
II. ) Anticuerpos FLT3
III. ) Conjugados de anticuerpo fármaco generalmente
III(A). Maitansinoides
III(B). Auristatinas y dolostatinas
III(C). Calicheamicina
III(D). Otros agentes citotóxicos
IV. ) Conjugados de anticuerpo fármaco que se unen a FLT3
V. ) Unidades enlazadoras
VI. ) La unidad ensanchadora
VII. ) La unidad de aminoácido
VIII. ) La unidad espaciadora
IX. ) La unidad de fármaco
X. ) Carga de fármaco
XI. ) Métodos para determinar el efecto citotóxico de los ADC
XII. ) Tratamiento de cáncer o cánceres que expresan FLT3
XIII. ) FLT3 como una diana para la terapia basada en anticuerpos
XIV. ) Cócteles FLT3 ADC
XV. ) Terapia de combinación
XVI. ) Kits/artículos de fabricación
I.) Definiciones:
A menos que se defina de otra manera, todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos o terminología científicos que se usan en el presente documento pretenden tener los significados comúnmente comprendidos por los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención. En algunos casos, los términos con significados comúnmente comprendidos se definen en el presente documento con fines de claridad y/o para tener una referencia inmediata, y la inclusión de dichas definiciones en el presente documento no se ha de considerar necesariamente como representativa de una diferencia sustancial frente a lo que se comprende en la técnica. Muchas de las técnicas y los procedimientos descritos o referenciados en el presente documento generalmente son bien entendidos y comúnmente empleados usando metodología convencional por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a. Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según sea apropiado, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles en el mercado generalmente se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos del fabricante salvo que se indique lo contrario. Cuando se usa un nombre comercial en el presente documento, la referencia al nombre comercial también se refiere a la formulación del producto, el fármaco genérico y el principio o principios farmacéuticos activos del producto del nombre comercial, a menos que el contexto indique otra cosa.
Las expresiones "cáncer avanzado", "cáncer localmente avanzado", "enfermedad avanzada" y "enfermedad localmente avanzada" significan cánceres que se han extendido a través de la cápsula de tejido relevante y están destinados a incluir la enfermedad en estadio C de acuerdo con el sistema de la American Urological Association (AUA), enfermedad en estadio C1-C2 de acuerdo con el sistema de Whitmore-Jewett y enfermedad en estadio T3-T4 y N+ de acuerdo con el sistema TNM (tumor, nodo, metástasis). En general, no se recomienda la cirugía para pacientes con enfermedad localmente avanzada y estos pacientes tienen resultados sustancialmente menos favorables en comparación con los pacientes que tienen cáncer clínicamente localizado (confinado en un órgano). El término "alquilo", por sí mismo o como parte de otro término, se refiere a un hidrocarburo C1-C12 saturado que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos. Los grupos alquilo particulares son aquellos que tienen de 1 a 8 átomos de carbono, de 1 a 6 átomos de carbono o de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a: metilo (Me), etilo (Et), n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tere-butilo (tBu), n-pentilo, isopentilo, terc-pentilo y n-hexilo, isohexilo. En algunas realizaciones, un grupo alquilo tiene átomos de carbono normales, secundarios o terciarios y no tiene átomos de carbono cíclicos.
El término "alquenilo", por sí mismo o como parte de otro término, se refiere a un hidrocarburo C2-C12 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace sp2 carbono-carbono. Los grupos alquenilo particulares son aquellos que tienen de 2 a 8 átomos de carbono, de 2 a 6 átomos de carbono o de 2 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: vinilo (-CH=CH2), alilo (-CH2CH2=CH2), ciclopentenilo (-C5H7) y 5-hexenilo (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2). En algunas realizaciones, un grupo alquenilo tiene átomos de carbono normales, secundarios o terciarios y no tiene átomos de carbono cíclicos.
El término "alquinilo", por sí mismo o como parte de otro término, se refiere a un hidrocarburo C2-C12 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace sp carbono-carbono. Los grupos alquinilo particulares son aquellos que tienen de 2 a 8 átomos de carbono, de 2 a 6 átomos de carbono o de 2 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: etinilo (-CECH) y 2-propinilo (-CH2CECH). En algunas realizaciones, un grupo alquinilo tiene átomos de carbono normales, secundarios o terciarios y no tiene átomos de carbono cíclicos.
El término "alcoxi" se refiere a un grupo -O-alquilo, donde el O es el punto de fijación al resto de la molécula y alquilo es como se define anteriormente.
El término "heterocicloalquilo" se refiere a una estructura de anillo monocíclico o condensado, puenteado o espiro policíclico que está saturado o parcialmente saturado y tiene de 3 a 12 átomos de anillo por estructura de anillo seleccionados de átomos de carbono y hasta tres heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre. Los grupos heterocicloalquilo particulares son aquellos que tienen de 3 a 8 átomos de anillo o de 5 a 7 átomos de anillo por estructura de anillo. La estructura del anillo puede contener opcionalmente hasta dos grupos oxo en miembros del anillo de carbono o azufre. Las entidades ilustrativas, en forma de restos apropiadamente unidos, incluyen:
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El termino "heteroanlo" se refiere a un heterociclo aromático monocichco, biciclico condensado o policiclico condensado (estructura de anillo que tiene átomos de anillo seleccionados de átomos de carbono y hasta cuatro heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre) que tiene de 3 a 12 átomos en el anillo por heterociclo. Los grupos heteroarilo particulares son aquellos que tienen de 3 a 8 átomos de anillo o de 5 a 7 átomos de anillo por estructura de anillo. Los ejemplos ilustrativos de grupos heteroarilo incluyen las siguientes entidades, en forma de restos apropiadamente unidos:
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Los términos "heterociclo", "heterocíclico" o "heterociclilo" como se usan en el presente documento abarcan tanto los restos "heterocicloalquilo" como "heteroarilo" como se definen anteriormente.
Los expertos en la materia reconocerán que las especies de grupos heterociclilo, heteroarilo y heterocicloalquilo listadas o ilustradas anteriormente no son exhaustivas y que también pueden seleccionarse especies adicionales dentro del alcance de estos términos definidos.
El término "halógeno" representa cloro, flúor, bromo o yodo. El término "halo" representa cloro, fluoro, bromo o yodo. El término "sustituido" significa que el grupo o resto especificado lleva uno o más sustituyentes. La expresión "no sustituido" significa que el grupo especificado no lleva sustituyentes. La expresión "opcionalmente sustituido" significa que el grupo especificado está no sustituido o sustituido con uno o más sustituyentes. Cuando el término "sustituido" se usa para describir un sistema estructural, la sustitución está destinada a ocurrir en cualquier posición permitida por valencia en el sistema.
Cualquier fórmula dada en el presente documento pretende representar compuestos que tienen estructuras representadas por la fórmula estructural, así como ciertas variaciones o formas. En particular, los compuestos de cualquier fórmula dada en el presente documento pueden tener centros asimétricos y, por lo tanto, existen en diferentes formas enantioméricas. Todos los isómeros y estereoisómeros ópticos de los compuestos de fórmula general y mezclas de los mismos, se consideran dentro del alcance de la fórmula. Por lo tanto, cualquier fórmula dada en el presente documento pretende representar un racemato, una o más formas enantioméricas, una o más formas diastereoméricas, una o más formas atropisoméricas y mezclas de las mismas. Adicionalmente, determinadas estructuras pueden existir como isómeros geométricos (es decir, isómeros cis y trans), como tautómeros o como atropisómeros. Adicionalmente, cualquier fórmula dada en el presente documento pretende referirse también a cualquiera de los hidratos, solvatos y formas amorfas y polimórficas de tales compuestos y mezclas de los mismos, incluso si tales formas no se listan explícitamente. En algunas realizaciones, el disolvente es agua y los solvatos son hidratos.
Cualquier fórmula dada en el presente documento también pretende representar formas no marcadas así como formas marcadas isotópicamente de los compuestos. Los compuestos marcados isotópicamente tienen estructuras representadas por las fórmulas dadas en el presente documento, excepto por que uno o más átomos están reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o número másico seleccionado. Los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los compuestos descritos en el presente documento incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor, cloro y yodo, tales como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F, 36Cl y 125I, respectivamente. Dichos compuestos marcados isotópicamente son útiles en estudios metabólicos (preferentemente con 14C), estudios de cinética de reacción (con, por ejemplo 2H o 3H), técnicas de detección o formación de imágenes [tales como la tomografía por emisión de positrones (PET) o la tomografía de emisión monofotónica (SPECT)], incluyendo ensayos de distribución en tejidos de sustrato o de fármaco, o en el tratamiento radioactivo de pacientes. En particular, un compuesto marcado con 18F o 11C puede ser particularmente preferido para estudios PET o SPECT. Además, la sustitución con isótopos más pesados tales como deuterio (es decir, 2H) puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una semivida in vivo aumentada o unos requisitos de dosificación reducidos. Los compuestos marcados isotópicamente descritos en el presente documento y los profármacos de los mismos pueden prepararse generalmente llevando a cabo los procedimientos desvelados en los esquemas o en los ejemplos y en las preparaciones descritas a continuación sustituyendo un reactivo isotópicamente marcado fácilmente disponible por un reactivo no marcado isotópicamente.
Al referirse a cualquier fórmula dada en el presente documento, la selección de un resto particular de una lista de posibles especies para una variable especificada no pretende definir la misma elección de la especie para la variable que aparece en otra parte. En otras palabras, cuando una variable aparece más de una vez, la elección de la especie de una lista específica es independiente de la elección de la especie para la misma variable en otra parte de la fórmula, a menos que se indique lo contrario.
La nomenclatura "Ci-j" con j > i, cuando se aplica en el presente documento a una clase de sustituyentes, pretende referirse a realizaciones de cualquiera de las composiciones, usos o métodos descritos en el presente documento para los cuales todos y cada uno de los miembros de números de carbono, de i a j incluyendo i y j, se realiza de forma independiente. A modo de ejemplo, el término C1-3 se refiere independientemente a realizaciones que tienen un miembro de carbono (C1), realizaciones que tienen dos miembros de carbono (C2) y realizaciones que tienen tres miembros de carbono (C3).
El término alquilo Cn-m se refiere a una cadena alifática, ya sea lineal o ramificada, con un número total N de miembros de carbono en la cadena que satisface n < N < m, con m > n.
Los nombres químicos listados en el presente documento se generaron usando el software AutoNOM™. Si hay una discrepancia entre una estructura química y el nombre listado para esa estructura, prevalece la estructura.
De acuerdo con las consideraciones interpretativas anteriores sobre asignaciones y nomenclatura, se entiende que la referencia explícita en el presente documento a un conjunto implica, cuando sea químicamente significativo y a menos que se indique lo contrario, referencia independiente a realizaciones de dicho conjunto, y referencia a todas y cada una de las posibles realizaciones de subconjuntos del conjunto al que se hace referencia explícitamente.
"Alterar el patrón de glucosilación nativo" pretende significar para los fines del presente documento la deleción de uno o más restos de carbohidrato encontrados en la secuencia nativa de FLT3 (bien eliminando el sitio de glucosilación subyacente o bien eliminando la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos) y/o la adición de uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en la secuencia nativa de FLT3, en donde el "patrón de glucosilación nativo" se refiere al patrón de glucosilación post-traduccional natural que resulta de una combinación particular de secuencia FLT-3, tipo de célula y condiciones de crecimiento usadas. Además, la expresión incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y las proporciones de los diversos restos de carbohidratos presentes.
El término "análogo" se refiere a una molécula que es estructuralmente similar o comparte atributos similares o correspondientes con otra molécula (por ejemplo, una proteína relacionada con FLT3). Por ejemplo, un análogo de una proteína FLT3 puede unirse específicamente a un anticuerpo o célula T que se une específicamente a FLT3.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio a menos que se indique claramente lo contrario. Por lo tanto, un "anticuerpo" puede ser de origen natural o hecho por el ser humano tales como anticuerpos monoclonales producidos por tecnología convencional de hibridomas o ratones transgénicos. Los anticuerpos FLT3 comprenden anticuerpos monoclonales y policlonales así como fragmentos que contienen el dominio de unión al antígeno y/o una o más regiones determinantes de complementariedad de estos anticuerpos. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a FLT3 y/o exhibe la actividad biológica deseada y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos siempre que se unan específicamente a FLT3 y/o exhiban la actividad biológica deseada. Puede usarse cualquier anticuerpo específico en los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento. Por lo tanto, en una realización el término "anticuerpo" abarca una molécula que comprende al menos una región variable de una molécula de inmunoglobulina de cadena ligera y al menos una región variable de una molécula de cadena pesada que en combinación forman un sitio de unión específico para el antígeno diana. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. Por ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Los anticuerpos útiles en los presentes métodos y composiciones pueden generarse en cultivo celular, en fagos o en diversos animales, incluyendo pero no limitado a vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés y simios. Por lo tanto, en una realización, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de mamífero. Pueden usarse técnicas de fagos para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con características de especificidad o avidez alteradas. Tales técnicas son habituales y bien conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo se produce mediante métodos recombinantes conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede producirse un anticuerpo recombinante transfectando una célula hospedadora con un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo. Pueden usarse uno o más vectores para transfectar la secuencia de ADN que expresa al menos una región VL y al menos una región VH en la célula hospedadora. Las descripciones ilustrativas de medios recombinantes de generación y producción de anticuerpos incluyen Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shephard, et al., MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993); and CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, la edición más reciente). Un anticuerpo de la presente invención puede modificarse por medios recombinantes para aumentar la efectividad del anticuerpo en la mediación de la función deseada. Por lo tanto, está dentro del alcance de la invención que los anticuerpos puedan modificarse mediante sustituciones usando medios recombinantes. Normalmente, las sustituciones serán sustituciones conservativas. Por ejemplo, al menos un aminoácido en la región constante del anticuerpo puede reemplazarse por un resto diferente. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU N.° 5.624.821, la patente de EE.UU N.° 6.194.551, la Solicitud N.° WO 9958572; y Angal, et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993). La modificación en aminoácidos incluye deleciones, adiciones y sustituciones de aminoácidos. En algunos casos, tales cambios se realizan para reducir las actividades no deseadas, por ejemplo, citotoxicidad dependiente del complemento. Con frecuencia, los anticuerpos se marcan uniendo, ya sea de manera covalente o no covalente, una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación y se informan extensamente en la bibliografía científica y de patentes. Estos anticuerpos pueden explorarse para detectar la unión a FLT3 normal o defectuoso. Véase, por ejemplo, ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996). Los anticuerpos adecuados con las actividades biológicas deseadas pueden identificarse usando los siguientes ensayos in vitro incluyendo pero no limitado a: proliferación, migración, adhesión, crecimiento en agar blando, angiogénesis, comunicación célula-célula, apoptosis, transporte, transducción de señales y los siguientes ensayos in vivo tales como la inhibición del crecimiento tumoral. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento también pueden ser útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, pueden cribarse para determinar la capacidad de unirse al antígeno específico sin inhibir la unión al receptor o la actividad biológica del antígeno. Como anticuerpos neutralizantes, los anticuerpos pueden ser útiles en ensayos de unión competitiva. También pueden usarse para cuantificar el FLT3 o su receptor.
La expresión "fragmento de unión a antígeno" o "fragmento de anticuerpo" de un anticuerpo (o sencillamente "porción de anticuerpo"), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo FLT3 que retienen la capacidad de unirse de manera específica a un antígeno (por ejemplo, a FLT3 y variantes; véase, la Figura 1). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V l , V h , C l y Cm; (ii) un fragmento F(ab% un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios V h y C h1 (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios V l y V h de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio V h ; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V l y V h , estén codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una única cadena de proteína en la cual las regiones V l y V h se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véanse, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85:5879-5883). También se pretende que dichos anticuerpos monocatenarios estén abarcados dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se exploran para determinar su utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.
El término "Fc", como se usa en el presente documento, se refiere a una región que comprende una región bisagra, dominios CH2 y/o CH3.
Como se usa en el presente documento, puede usarse cualquier forma del "antígeno" para generar un anticuerpo que sea específico para FLT3. Por lo tanto, el antígeno inductor puede ser un solo epítopo, múltiples epítopos o la proteína completa sola o en combinación con uno o más agentes potenciadores de la inmunogenicidad conocidos en la técnica. El antígeno inductor puede ser una proteína aislada de longitud completa, una proteína de superficie celular (por ejemplo, inmunización con células transfectadas con al menos una parte del antígeno) o una proteína soluble (por ejemplo, inmunización solo con la parte del dominio extracelular de la proteína). El antígeno puede producirse en una célula modificada genéticamente. El ADN que codifica el antígeno puede ser genómico o no genómico (por ejemplo, ADNc) y codifica al menos una parte del dominio extracelular. Como se usa en el presente documento, el término "parte", en el contexto de un antígeno, se refiere al número mínimo de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea apropiado, para constituir un epítopo inmunogénico del antígeno de interés. Puede emplearse cualquier vector genético adecuado para la transformación de las células de interés, incluyendo, pero no limitado a, vectores adenovíricos, plásmidos y vectores no víricos, tales como lípidos catiónicos. En una realización, el anticuerpo de los métodos y composiciones en el presente documento se une específicamente al menos a una parte del dominio extracelular del FLT3 de interés.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento pueden constituir o ser parte de un "agente bioactivo". Como se usa en el presente documento, la expresión "agente bioactivo" se refiere a cualquier compuesto sintético o natural que se una al antígeno y/o potencia o media un efecto biológico deseado para potenciar las toxinas que matan las células. En una realización, los fragmentos de unión útiles en la presente invención son fragmentos biológicamente activos. Como se usa en el presente documento, la expresión "biológicamente activo" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es capaz de unirse al epítopo antigénico deseado y ejercer directa o indirectamente un efecto biológico. Los efectos directos incluyen, pero no se limitan a la modulación, la estimulación y/o la inhibición de una señal de crecimiento, la modulación, la estimulación y/o la inhibición de una señal anti-apoptótica, la modulación, la estimulación y/o la inhibición de una señal apoptótica o necrótica, modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada ADCC y modulación, estimulación y/o inhibición de la cascada CDC.
La afinidad de unión de la proteína de unión al antígeno está determinada por la constante de asociación (Ka) y la constante de disociación (Kd) (KD=Kd/Ka). La afinidad de unión puede medirse mediante BIACORE, por ejemplo, mediante la captura del anticuerpo de prueba en una superficie del sensor recubierta de proteína A y haciendo fluir FLT3 sobre esta superficie. Como alternativa, la afinidad de unión puede medirse mediante FORTEBIO, por ejemplo, con el receptor del anticuerpo de prueba capturado en una aguja recubierta de proteína A y haciendo fluir FLT3 sobre esta superficie. Un experto en la materia puede identificar otros ensayos adecuados conocidos en la técnica para medir la afinidad de unión.
La expresión "se une específicamente", como se usa en el presente documento en relación con las proteínas de unión a antígenos, significa que la proteína de unión a antígeno se une al FLT3 así como a un dominio discreto, o secuencia de aminoácidos discreta, dentro de FLT3 con unión nula o insignificante a otras proteínas (por ejemplo, no relacionadas). Esta expresión, sin embargo, no excluye el hecho de que los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos también puedan tener reactividad cruzada con moléculas estrechamente relacionadas. Los anticuerpos y fragmentos de los mismos, así como los conjugados de anticuerpo fármaco que comprenden aquellos descritos en el presente documento, pueden unirse específicamente a FLT3, con una afinidad al menos 2, 5, 10, 50, 100 o 1000 veces mayor de la que se unen a moléculas estrechamente relacionadas.
La unión de cualquiera de los anticuerpos desvelados en el presente documento, en cualquier forma, por ejemplo, en un conjugado de anticuerpo fármaco, a FLT3 podría esperarse que bloqueara parte o la totalidad de la unión de FL a FLT3. Sin embargo, en el presente documento se encuentran anticuerpos anti-FLT3 que no inhiben sustancialmente la unión de FL a FLT3. Para "inhibir sustancialmente" la unión, uno esperaría una cantidad detectable de una disminución en la unión más allá de un cambio mínimo; no se abarca un pequeño cambio en la unión que es equivalente a no más de una cantidad mínima de unión como se esperaría en interacciones aleatorias de proteína o en interacciones inespecíficas anticuerpo-antígeno. La medición de si un anticuerpo inhibe sustancialmente la unión de otra molécula al antígeno diana puede lograrse usando una medición biofísica o una medición funcional mediante métodos que se conocen en la técnica. Por ejemplo, la interacción de las dos proteínas puede medirse directamente en un ensayo de unión física (por ejemplo, véase el Ejemplo 14, a continuación) o indirectamente a través de un ensayo funcional que mide los efectos posteriores de las interacciones de proteínas, tal como la señalización a través de un receptor o los efectos celulares posteriores como el crecimiento o la inhibición del crecimiento de una célula. Por lo tanto, los anticuerpos anti-FLT3 desvelados en el presente documento que no inhiben sustancialmente la unión de FL a FLT3 no provocan una reducción significativa en la unión de FL a FLT3, y la señalización de la unión de FL a través de FLT3 es detectable.
Los anticuerpos "biespecíficos" también son útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo, normalmente un anticuerpo monoclonal, que tiene especificidades de unión por al menos dos epítopos antigénicos diferentes. En una realización, los epítopos pueden ser del mismo antígeno. En otra realización, los epítopos son de dos antígenos diferentes. Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos biespecíficos de manera recombinante usando la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina. Véanse, por ejemplo, Milstein et al., Nature 305:537-39 (1983). Como alternativa, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Véanse, por ejemplo, Brennan, et al., Science 229:81 (1985). Los anticuerpos biespecíficos incluyen fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Véanse, por ejemplo, Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48 (1993), Gruber, et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).
Los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos procedentes de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que se unan específicamente al antígeno diana y/o exhiban la actividad biológica deseada (Pat. de EE.UU. N.° 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851­ 6855 (1984)).
Como se usa en el presente documento, los términos "cáncer", "neoplasia" y "tumor", se usan indistintamente y en forma singular o bien plural, se refieren a células que han sufrido una transformación maligna que las convierte en patológicas para el organismo hospedador. Las células cancerosas primarias (es decir, las células obtenidas cerca del sitio de transformación maligna) pueden distinguirse fácilmente de las células no cancerosas mediante técnicas bien establecidas, particularmente examen histológico. La definición de una célula cancerosa, como se usa en el presente documento, incluye no solo una célula cancerosa primaria, sino cualquier célula derivada de un ancestro de células cancerosas. Esto incluye células cancerosas metastatizadas y cultivos in vitro y líneas celulares derivadas de células cancerosas. Al referirse a un tipo de cáncer que normalmente se manifiesta como un tumor sólido, un tumor "clínicamente detectable" es uno que es detectable sobre la base de la masa tumoral; por ejemplo, mediante procedimientos tales como exploración CAT, formación de imágenes MR, rayos X, ultrasonido o palpación, y/o que sea detectable debido a la expresión de uno o más antígenos específicos del cáncer en una muestra obtenible de un paciente. Los tumores pueden ser tumores hematopoyéticos, por ejemplo, tumores de células sanguíneas o similares, lo que significa tumores líquidos. Los ejemplos específicos de condiciones clínicas basadas en un tumor tal incluyen leucemia tales como leucemia mielocítica crónica o leucemia mielocítica aguda; mieloma tal como mieloma múltiple; linfoma y similares.
La expresión "agente terapéutico" se refiere a todos los agentes que proporcionan un beneficio terapéutico y/o son terapéuticamente eficaces como se define en el presente documento. Un agente terapéutico puede, por ejemplo, revertir, mejorar, aliviar, inhibir o limitar el progreso de, o disminuir la gravedad de, una enfermedad, trastorno o afección, o afectar o mejorar uno o más síntomas de enfermedad, tales como cáncer. Un agente tal puede ser citotóxico o citostático. La expresión incluye, pero no se limita a, agentes quimioterapéuticos, agentes antineoplásicos y agentes de "unidad de fármaco" como se definen en el presente documento.
El término "agente antineoplásico" se refiere a todos los agentes que proporcionan un beneficio terapéutico y/o son terapéuticamente eficaces, como se define en el presente documento, en el tratamiento de una neoplasia o cáncer.
En algunas realizaciones que emplean cualquiera de los conjugados de anticuerpo-fármaco y composiciones farmacéuticas de los mismos como se desvela en el presente documento, el conjugado de anticuerpo fármaco que comprende un agente terapéutico y composiciones farmacéuticas del mismo, también son eficaces para tratar un precáncer o al menos una célula preneoplásica, por ejemplo, prevenir la transformación maligna en una célula cancerosa. En otras realizaciones, el uno o más agentes antineoplásicos también son eficaces para tratar un precáncer o al menos una célula preneoplásica, por ejemplo, prevenir la transformación maligna en una célula cancerosa.
La expresión "agente quimioterapéutico" se refiere a todos los compuestos químicos que son eficaces para inhibir el crecimiento tumoral. Los ejemplos no limitantes de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes; por ejemplo, mostazas nitrogenadas, compuestos de etilenimina y alquilsulfonatos; antimetabolitos, por ejemplo, ácido fólico, antagonistas de purina o pirimidina; inhibidores mitóticos, por ejemplo, agentes anti-tubulina tales como alcaloides vinca, auristatinas y derivados de podofilotoxina; antibióticos citotóxicos; compuestos que dañan o interfieren con la expresión o replicación del ADN, por ejemplo, aglutinantes del surco menor del ADN; y antagonistas del receptor del factor de crecimiento. Además, los agentes quimioterapéuticos incluyen agentes citotóxicos (como se define en el presente documento), anticuerpos, moléculas biológicas y moléculas pequeñas.
El término "compuesto" se refiere y abarca el compuesto químico en sí, así como, tanto si se indica explícitamente como si no, y a menos que el contexto aclare que se deben excluir los siguientes: las formas amorfas y cristalinas del compuesto, incluyendo las formas polimórficas, donde estas formas puedan ser parte de una mezcla o estar en aislamiento; las formas de ácido libre y base libre del compuesto, que son normalmente las formas que muestran en las estructuras proporcionadas en el presente documento; los isómeros del compuesto, que se refieren a isómeros ópticos, e isómeros tautómeros, donde los isómeros ópticos incluyen enantiómeros y diastereómeros, los isómeros quirales y no quirales, y los isómeros ópticos incluyen isómeros ópticos aislados así como mezclas de isómeros ópticos que incluyen mezclas racémicas y mezclas no racémicas; donde un isómero puede estar en forma aislada o en una mezcla con uno o más isómeros diferentes; isótopos del compuesto, incluyendo compuestos que contienen deuterio y tritio, e incluyendo compuestos que contienen radioisótopos, incluyendo radioisótopos terapéutica y diagnósticamente eficaces; formas multiméricas del compuesto, incluyendo formas diméricas, triméricas, etc.; sales del compuesto, preferentemente sales farmacéuticamente aceptables, incluyendo las sales de adición de ácido y las sales de adición de base, incluyendo las sales que tienen contraiones orgánicos y contraiones inorgánicos, e incluyendo las formas de iones híbridos, donde si un compuesto se asocia con dos o más contraiones, los dos o más contraiones pueden ser iguales o diferentes; y solvatos del compuesto, incluyendo hemisolvatos, monosolvatos, disolvatos, etc., incluyendo solvatos orgánicos y solvatos inorgánicos, dichos solvatos inorgánicos incluyen hidratos; donde si un compuesto se asocia a dos o más moléculas de disolvente, las dos o más moléculas de disolvente pueden ser iguales o diferentes. En algunos casos, la referencia hecha en el presente documento a un compuesto incluirá una referencia explícita a una de las anteriores formas, por ejemplo, sales y/o solvatos; sin embargo, esta referencia es solo para enfatizar, y no se considera como excluyente de las diferentes formas anteriores como se ha identificado anteriormente.
Las expresiones "región determinante de complementariedad" y "CDR", son conocidas en la técnica por referirse a secuencias no contiguas de aminoácidos dentro de regiones variables de anticuerpos, que confieren especificidad de antígeno y afinidad de unión. En general, hay tres (3) CDR en cada región variable de cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) y tres (3) CDR en cada región variable de cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2, Cd R-L3).
Los límites exactos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada pueden determinarse fácilmente usando cualquiera de una serie de esquemas bien conocidos, incluyendo aquellos descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeración "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeración "Chothia"), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography", J. M al. Biol. 262, 732-745". (esquema de numeración "Contact"), Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains", Dev Comp Immunol, ene 2003;27(1):55-77 (esquema de numeración "IMGT") y Honegger A y Pliickthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool", J Mal Biol, 8 de junio de 2001;309(3):657-70, (esquema de numeración "Aho").
Los límites de una determinada CDR pueden variar dependiendo del esquema utilizado para la identificación. Por ejemplo, el esquema de Kabat se basa en alineaciones estructurales, mientras que el esquema de Chothia se basa en información estructural. La numeración de los esquemas de Kabat y Chothia se basa en las longitudes de secuencia de las regiones de anticuerpos más comunes, con inserciones acomodadas por letras de inserción, por ejemplo, "30a", y deleciones que aparecen en algunos anticuerpos. Los dos esquemas colocan determinadas inserciones y deleciones ("indels") en diferentes posiciones, dando como resultado la numeración diferencial. El esquema de Contact se basa en el análisis de estructuras cristalinas complejas y es similar en muchos aspectos al esquema de numeración de Chothia. La Tabla V, a continuación, lista las posiciones de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 y CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 como se identifica por los esquemas de Kabat, Chothia y Contact, respectivamente. Para CDR-H1, la numeración de restos se da listada usando los esquemas de numeración de Kabat y Chothia.
Por lo tanto, a menos que se especifique lo contrario, las expresiones "CDR" y "región determinante de complementariedad" de un anticuerpo dado o región del mismo, tal como una región variable, así como CDR individuales (por ejemplo, "CDR-H1, CDR-H2) del anticuerpo o región del mismo, deben entenderse que abarcan la región determinante complementaria definida por cualquiera de los esquemas conocidos descritos anteriormente en el presente documento. En algunos casos, se especifica el esquema para la identificación de CDR, tales como las CDR definidas por el método de Kabat, Chothia o Contact. En otros casos, se da la secuencia de aminoácidos particular de una CDR. Véase, por ejemplo, la Tabla V.
Como se usa en el presente documento, la expresión "sustitución conservativa" se refiere a sustituciones de aminoácidos y/o secuencias de aminoácidos que son conocidas por los expertos en esta materia y que pueden realizarse generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en esta materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson, et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a Edición 1987)). Tales sustituciones ilustrativas se realizan preferentemente de acuerdo con aquellas expuestas en la Tabla II y la Tabla o Tablas III(a-b). Por ejemplo, tales cambios incluyen la sustitución de cualquiera de isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones también pueden considerarse conservativas, dependiendo del entorno del aminoácido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, la glicina (G) y la alanina (A) pueden ser frecuentemente intercambiables, al igual que la alanina (A) y la valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrófoba, con frecuencia puede intercambiarse con leucina e isoleucina y, a veces, con valina. La lisina (K) y la arginina (R) son frecuentemente intercambiables en lugares en los que la característica significativa del residuo de aminoácido es su carga y las pK diferentes de estos dos restos de aminoácido no son significativas. Aún otros cambios pueden considerarse "conservativos" en entornos particulares (véase, por ejemplo, la Tabla III(a) en el presente documento; las páginas 13-15 de "Biochemistry" 2a ED. Lubert Stryer ed (Stanford University); Henikoff et al., PNAS 1992 Vol 89 10915­ 10919; Lei et al., J Biol Chem 19 de mayo de 1995; 270(20):11882-6). También se permiten otras sustituciones y pueden determinarse empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservativas conocidas.
La expresión "agente citotóxico" se refiere a una sustancia que inhibe o previene la actividad de expresión de las células, la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. La expresión pretende incluir isótopos radiactivos, agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a auristatinas (por ejemplo, auristatina E, auristatina F, MMAE y MMAF), auromicinas, maitansinoides, ricina, cadena A de ricina, combrestatina, duocarmicinas, dolastatinas, doxorrubicina, daunorrubicina, taxoles, cisplatino, cc1065, bromuro de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxiantracindiona, actinomicina, toxina diftérica, exotoxina A de Pseudomonas (PE), PE40, abrina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfasarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, calicheamicina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, glucocorticoides y otros agentes quimioterapéuticos, así como radioisótopos tales como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 o 213, P32, isótopos radiactivos de Lu incluyendo Lu177 y toxinas de la presente invención denotadas AGD-0182.
Los anticuerpos, incluyendo anticuerpos de la invención, también pueden conjugarse con cualquiera de los agentes citotóxicos anteriormente mencionados y también con una enzima activadora del profármaco anticanceroso capaz de convertir el profármaco en su forma activa.
Como se usa en el presente documento, el término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V h ) conectado con un dominio variable de cadena ligera (V l ) en la misma cadena polipeptídica (V h -V l o VL-VH). Usando un enlazador que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Se describen diacuerpos con más detalle en, por ejemplo, los documentos EP 404097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993).
El término "agotar", en el contexto del efecto de un agente de unión a FLT3 en las células que expresan FLT3, se refiere a una reducción en el número de o eliminación de las células que expresan FLT3. Para los fines de la presente invención, FLT3, alias, Fms como receptor de tirosina quinasa 3, también conocido como Flk2 (quinasa 2 del hígado fetal), STK1 (tirosina quinasa 1 de células madre) y CD135, es un miembro de las tirosina quinasas receptoras de tipo III (RTK). El FLT3 humano codifica un RTK de 993 aminoácidos de longitud, que comprende un receptor unido a membrana con cinco dominios extracelulares de tipo inmunoglobulina y dos dominios de tirosina quinasa intracelular (TKD) unidos por un dominio de inserción de quinasa (Stirewalt D L et al; Nat Rev Cancer; 650-665(2003). El gen FLT3 humano (ID de Gen N.°: 2322 (National Center for Biotechnology Information)) se encuentra en el cromosoma 13q12 y comparte una homología de secuencia de aminoácidos del 85 % con FLT3 de ratón (Rosnet 0 et al; Oncogene 8:173-179 (1993). FLT3 se expresa en células progenitoras mieloides y linfoides normales y por las células leucémicas del 70-90 % de los pacientes con AML (Carow, C.E et al; Blood 87: 1089-1096 (1996); Rosnet 0 et al; Leukemia 10:238-248 (1996) y también en ALL.
La expresión "producto génico" se usa en el presente documento para indicar un péptido/proteína o ARNm. Por ejemplo, un "producto génico" a veces se denomina en el presente documento "secuencia de aminoácidos de cáncer", "proteína de cáncer", "proteína de un cáncer listada en la Tabla I", un "ARNm de cáncer", "ARNm de un cáncer listado en la Tabla I", etc. En una realización, la proteína de cáncer está codificada por un ácido nucleico de la Figura 1. La proteína de cáncer puede ser un fragmento o, alternativamente, ser la proteína de longitud completa codificada por ácidos nucleicos de la Figura 1. En una realización, se usa una secuencia de aminoácidos del cáncer para determinar la identidad o similitud de la secuencia. En otra realización, las secuencias son variantes alélicas de origen natural de una proteína codificada por un ácido nucleico de la Figura 1. En otra realización, las secuencias son variantes de secuencia como se describe además en el presente documento.
Los anticuerpos "heteroconjugados" son útiles en los presentes métodos y composiciones. Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo heteroconjugado" se refiere a dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos pueden prepararse usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo usar agentes reticulantes. Véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 4.676.980.
El término "homólogo" se refiere a una molécula que exhibe homología con otra molécula, al, por ejemplo, tener secuencias de restos químicos iguales o similares en las posiciones correspondientes.
La expresión "idéntica" o "identidad de secuencia" indica el grado de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o dos secuencias de aminoácidos cuando se alinean de forma óptima y se comparan con inserciones o supresiones adecuadas.
El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones multiplicado por 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden conseguirse usando un algoritmo matemático, como se describe a continuación.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderación de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos también puede determinarse usando el algoritmo de Meyers, et al., Comput. Appi. Biosci., 4:11-17 (1988)), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de restos ponderados PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman, et al., J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y una ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
A modo de ejemplo, una secuencia de polinucleótidos puede ser idéntica a una secuencia de polinucleótidos de referencia que es 100 % idéntica a la secuencia de referencia, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia, tal como al menos un 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % idéntica. Tales alteraciones se seleccionan de al menos una deleción de nucleótidos, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción y en donde dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la secuencia de polinucleótidos de referencia como se describe en el presente documento por el porcentaje numérico del porcentaje de identidad respectivo (dividido por 100) y restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la secuencia de polinucleótidos de referencia o: n.sub.n.ltoreq.x.sub.n-(x.sub.ny), en donde n.sub.n es el número de alteraciones de nucleótidos, x.sub.n es el número total de nucleótidos en la secuencia de polinucleótidos de referencia como se describe en el presente documento (véanse las secuencias de ácidos nucleicos en el "Listado de secuencias" para obtener ejemplos de secuencias de polinucleótidos de referencia), e y es 0,50 para el 50 %, 0,60 para el 60 %, 0,70 para el 70 %, 0,75 para el 75 %, 0,80 para el 80 %, 0,85 para el 85 %, 0,90 para el 90 %, 0,95 para el 95 %, 0,98 para el 98 %, 0,99 para el 99 % o 1,00 para el 100 %, es el símbolo para el operador de multiplicación, y en donde cualquier producto no entero de x.sub.n e y se redondea hacia abajo al número entero más cercano antes de restarlo de x.sub.n.
De forma similar, una secuencia de polipéptido puede ser idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia como se describe en el presente documento (véanse las secuencias de aminoácidos en el "Listado de secuencias" para obtener ejemplos de secuencias polipeptídicas de referencia), que es el 100 % idéntica, o puede incluir hasta un determinado número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de manera que el % de identidad sea inferior al 100 %, tal como al menos un 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % idéntica. Tales alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción, de aminoácidos, y en donde dichas alteraciones pueden darse en las posiciones de amino o carboxi terminal de la secuencia de polipéptidos de referencia o en cualquier parte entre estas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un % de identidad determinado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la secuencia polipeptídica codificada por la secuencia polipeptídica de referencia por el porcentaje numérico del porcentaje de identidad respectivo (dividido por 100) y después restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia como se describe en el presente documento (véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 1-21) o: n.sub.a.ltoreq.x.sub.a-(x.sub.ay), en donde n.sub.a es el número de alteraciones de aminoácidos, x.sub.a es el número total de aminoácidos en la secuencia de polipéptido de referencia e y es, 0,50 para el 50 %, 0,60 para el 60 %, 0,70 para el 70 %, 0,75 para el 75 %, 0,80 para el 80 %, 0,85 para el 85 %, 0,90 para el 90 %, 0,95 para el 95 %, 0,98 para el 98 %, 0,99 para el 99 % o 1,00 para el 100 %, es el símbolo para el operador de multiplicación, y en donde cualquier producto no entero de x.sub.a e y se redondea hacia abajo al número entero más cercano antes de restarlo de x.sub.a.
El porcentaje de identidad puede determinarse a lo largo de longitud de la secuencia. Como se define en el presente documento, la expresión "más del 75 % idéntico" incluye más del 75 %, el 80 %, el 85 %, el 95 % y el 99 % de identidad, así como todos los valores discretos y subintervalos discretos, con en este intervalo.
En una realización, el anticuerpo proporcionado en el presente documento es un "anticuerpo humano". Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo en el cual esencialmente todas las secuencias de la cadena ligera y las secuencias de la cadena pesada, incluyendo las regiones determinantes de complementariedad (CDR), son de genes humanos. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se preparan mediante la técnica del trioma, la técnica de células B humanas (véase, por ejemplo, Kozbor, et al., Immunol. Today 4: 72 (1983), la técnica de transformación del VEB (véase, por ejemplo, Cole et al. MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96 (1985)) o usando visualización de fagos (véase, por ejemplo, Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). En una realización específica, el anticuerpo humano se genera en un ratón transgénico. Se conocen en la técnica técnicas para fabricar tales anticuerpos parcial o completamente humanos y puede usarse cualquiera de tales técnicas. De acuerdo con una realización particularmente preferida, las secuencias de anticuerpos completamente humanos se preparan en un ratón transgénico diseñado para expresar genes de anticuerpos de cadena ligera y pesada humana. Una descripción ilustrativa de la preparación de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos se encuentra en la Solicitud N.° WO 02/43478 y la Patente de Estados Unidos 6.657.103 (Abgenix) y su progenie. Las células B de ratones transgénicos que producen el anticuerpo deseado pueden fusionarse para formar líneas de células de hibridoma para la producción continua del anticuerpo. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; y 5.545.806; y Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998); Green, et al., J. Exp. Med.
188:483-95 (1998).
Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) así como anticuerpos humanos. Tales anticuerpos son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones f R son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Véase, por ejemplo, Cabilly Patente de EE.UU. N.° 4.816.567; Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; y ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press 1996).
Los términos y expresiones "inhibir" o "inhibición de" como se usan en este documento significan reducir en una cantidad medible, o prevenir por completo.
Las expresiones "aislado" o "biológicamente puro" se refieren a material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan al material tal como se encuentra en su estado nativo. Por lo tanto, los péptidos aislados preferentemente no contienen materiales normalmente asociados a los péptidos en su entorno in situ. Por ejemplo, se dice que un polinucleótido está "aislado" cuando está sustancialmente separado de polinucleótidos contaminantes que corresponden o son complementarios a genes distintos de los genes FLT3 o que codifican polipéptidos distintos del producto del gen FLT3 o fragmentos del mismo. Un experto en la materia puede emplear fácilmente procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido FLT3 aislado. Se dice que una proteína está "aislada", por ejemplo, cuando se emplean métodos físicos, mecánicos o químicos para retirar las proteínas FLT3 de los constituyentes celulares que normalmente están asociados a la proteína. Un experto en la materia puede emplear fácilmente métodos de purificación convencionales para obtener una proteína FLT3 aislada. Como alternativa, puede prepararse una proteína aislada por medios químicos.
Los "marcadores" adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, fracciones fluorescentes, fracciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de tales marcadores incluyen las patentes de EE.UU. N.° 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Además, los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden ser útiles como componente de unión a antígeno de fluorocuerpos. Véase, por ejemplo, Zeytun et al., Nat. Biotechnol. 21: 1473-79 (2003).
El término "mamífero" se refiere a cualquier organismo clasificado como un mamífero, incluyendo ratones, ratas, conejos, perros, gatos, vacas, caballos y seres humanos. En una realización de la invención, el mamífero es un ratón. En otra realización de la invención, el mamífero es un ser humano.
Las expresiones "cáncer metastásico" y "enfermedad metastásica" significan cánceres que se han diseminado a los ganglios linfáticos regionales o a sitios distantes y pretenden incluir la enfermedad en estadio D bajo el sistema AUA y el estadio TxNxM+ bajo el sistema TNM.
El término "modificado", como se usa en el presente documento se refiere a la presencia de un cambio a un aminoácido natural, un aminoácido no natural, un polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido de aminoácido no natural. Tales cambios o modificaciones, pueden obtenerse mediante modificaciones posteriores a la síntesis de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido de aminoácido no natural, o por co-traducción, o por modificaciones postraduccionales de un aminoácido natural, un aminoácido no natural, un polipéptido de aminoácido natural o un polipéptido de aminoácido no natural.
Los términos y expresiones "modulador" o "compuesto de prueba" o "fármaco candidato" o equivalentes gramaticales como se usan en el presente documento describen cualquier molécula, por ejemplo, proteína, oligopéptido, molécula orgánica pequeña, polisacárido, polinucleótido, etc., a probar para determinar la capacidad de alterar directa o indirectamente el fenotipo del cáncer o la expresión de una secuencia del cáncer, por ejemplo, un ácido nucleico o secuencias de proteínas, o efectos de secuencias de cáncer (por ejemplo, señalización, expresión génica, interacción de proteínas, etc.) En un aspecto, un modulador neutralizará el efecto de una proteína cancerosa. Por "neutralizar" se entiende que la actividad de una proteína se inhibe o se bloquea, junto con el consiguiente efecto sobre la célula. En otro aspecto, un modulador neutralizará el efecto de un gen y su proteína correspondiente, normalizando los niveles de dicha proteína. En realizaciones preferidas, los moduladores alteran los perfiles de expresión, o los ácidos nucleicos o proteínas del perfil de expresión proporcionados en el presente documento, o las rutas efectoras posteriores. En una realización, el modulador suprime un fenotipo de cáncer, por ejemplo, a una huella dactilar de tejido normal. En otra realización, un modulador indujo un fenotipo de cáncer. Generalmente, se ejecuta una pluralidad de mezclas de ensayo en paralelo con diferentes concentraciones del agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Normalmente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a concentración cero o por debajo del nivel de detección.
Los moduladores, candidatos a fármacos, o compuestos de prueba, abarcan numerosas clases químicas, aunque normalmente son moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 100 y menos de aproximadamente 2500 Dalton. Las moléculas pequeñas preferidas son menos de 2000, o menos de 1500 o menos de 1000 o menos de 500 Da. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlaces de hidrógeno, y típicamente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden a menudo estructuras cíclicas de carbono o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los moduladores también comprenden biomoléculas tales como péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Son particularmente preferidos los péptidos. Una clase de moduladores son péptidos, por ejemplo de aproximadamente cinco a aproximadamente 35 aminoácidos, prefiriéndose de aproximadamente cinco a aproximadamente 20 aminoácidos, y siendo particularmente preferido de aproximadamente 7 a aproximadamente 15. Preferentemente, la proteína moduladora de cáncer es soluble, incluye una región no transmembrana y/o, tiene una Cys N-terminal para ayudar en la solubilidad. En una realización, el extremo C del fragmento se mantiene como un ácido libre y el extremo N es una amina libre para ayudar en el acoplamiento, es decir, a la cisteína. En una realización, una proteína cancerosa se conjuga con un agente inmunogénico como se analiza en el presente documento. En una realización, la proteína del cáncer está conjugada con BSA. Los péptidos, por ejemplo, de longitudes preferidas, pueden enlazare entre sí o con otros aminoácidos para crear un péptido/proteína más largo. Los péptidos moduladores pueden ser digeridos de proteínas naturales como se describe anteriormente, péptidos aleatorios o péptidos aleatorios "sesgados". En una realización preferida, los moduladores basados en péptidos/proteínas son anticuerpos y fragmentos de los mismos, como se define en el presente documento.
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único epítopo antigénico. Por el contrario, las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) normalmente incluyen una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) diferentes epítopos. En una realización, el anticuerpo policlonal contiene una pluralidad de anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades, afinidades o avideces de epítopo dentro de un solo antígeno que contiene múltiples epítopos antigénicos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo estando obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse mediante el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975) o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de fagotecas de anticuerpos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol.
222: 581-597 (1991), por ejemplo. Estos anticuerpos monoclonales habitualmente se unirán con al menos una Kd de aproximadamente 1 j M, más habitualmente al menos aproximadamente 300 nM, normalmente al menos aproximadamente 30 nM, preferentemente al menos aproximadamente 10 nM, más preferentemente al menos aproximadamente 3 nM o mejor, habitualmente determinado por ELISA.
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único epítopo antigénico. Por el contrario, las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) normalmente incluyen una multitud de anticuerpos dirigidos contra (o específicos para) diferentes epítopos. En una realización, el anticuerpo policlonal contiene una pluralidad de anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades, afinidades o avideces de epítopo dentro de un solo antígeno que contiene múltiples epítopos antigénicos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo estando obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse mediante el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975) o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de fagotecas de anticuerpos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol.
222: 581-597 (1991), por ejemplo. Estos anticuerpos monoclonales habitualmente se unirán con al menos una Kd de aproximadamente 1 j M, más habitualmente al menos aproximadamente 300 nM, normalmente al menos aproximadamente 30 nM, preferentemente al menos aproximadamente 10 nM, más preferentemente al menos aproximadamente 3 nM o mejor, habitualmente determinado por ELISA.
Un "aminoácido no natural" o escrito de otra manera como "nnAA" se refiere a un aminoácido que no es uno de los veinte (20) aminoácidos comunes o pirolisina o selenocisteína. Otros términos que pueden usarse como sinónimo del término nnAA son "aminoácido codificado no natural", "aminoácido no natural", "aminoácido de origen no natural". Adicionalmente, el término nnAA incluye, pero no se limita a, aminoácidos que no se encuentran de forma natural y que pueden obtenerse sintéticamente o pueden obtenerse mediante modificación de aminoácidos no naturales. Por ejemplo, para los fines de esta invención, la para-acetilfenilalanina se considera un nnAA.
El término "para-acetilfenilalanina" o "pAF" significa ácido 3-(4-acetilfenil)-2-aminopropanoico como se indica mediante la siguiente estructura química:
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Un "excipiente farmacéutico" comprende un material tal como un adyuvante, un vehículo, agentes de ajuste de pH y tamponantes, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes, conservante y similares.
"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición no tóxica, inerte y/o que es fisiológicamente compatible con seres humanos u otros mamíferos.
El término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y se pretende que incluya formas monocatenarias y bicatenarias de ADN y/o ARN. En la técnica, este término se usa a menudo de manera intercambiable con "oligonucleótido". Un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos desvelada en el presente documento en la que timidina (T), como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1, también puede ser uracilo (U); esta definición se refiere a las diferencias entre las estructuras químicas del ADN y el ARN, en particular, la observación de que una de las cuatro bases principales del ARN es el uracilo (U) en lugar de la timidina (T).
El término "polipéptido" significa un polímero de al menos aproximadamente 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos. A lo largo de la memoria descriptiva, se usan designaciones convencionales de tres letras (Véase, la Tabla III) o de una sola letra para los aminoácidos. En la técnica, este término se usa a menudo de manera intercambiable con "péptido" o "proteína".
Una molécula de ADN o ARN "recombinante" es una molécula de ADN o ARN que se ha sometido a manipulación molecular in vitro.
Como se usa en el presente documento, la expresión anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" o "de cadena sencilla" se refiere a fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios Vh y Vl de anticuerpos, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido de Fv comprende adicionalmente un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de los sFv, véase Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).
Como se usa en el presente documento, las expresiones y términos "específica", "se une específicamente" y "se une específicamente a" se refieren a la unión selectiva del anticuerpo al epítopo del antígeno diana. Los anticuerpos pueden probarse para determinar la especificidad de unión comparando la unión a un antígeno apropiado con la unión a un antígeno o mezcla de antígenos irrelevante en un conjunto dado de condiciones. Si el anticuerpo se une al antígeno apropiado al menos 2, 5, 7 y preferentemente 10 veces más que con antígeno o mezcla de antígenos irrelevante entonces se considera que es específico. En una realización, un anticuerpo específico es aquel que solo se une al antígeno FLT3, pero no se une al antígeno irrelevante. En otra realización, un anticuerpo específico es aquel que se une al antígeno FLT3 humano pero no se une al antígeno FLT3 no humano con el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más de homología de aminoácidos con el antígeno FLT3. En otra realización, un anticuerpo específico es aquel que se une al antígeno FLT3 humano pero no se une al antígeno FLT3 no humano con el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o más de identidad en porcentaje con la secuencia de aminoácidos del antígeno FLT3. En otra realización, un anticuerpo específico es aquel que se une al antígeno FLT3 humano y al antígeno FLT3 murino, pero con un mayor grado de unión al antígeno humano. En otra realización, un anticuerpo específico es aquel que se une al antígeno FLT3 humano y al antígeno FLT3 de primate, pero con un mayor grado de unión al antígeno humano. En otra realización, el anticuerpo específico se une al antígeno FLT3 humano y a cualquier antígeno FLT3 no humano, pero con un mayor grado de unión al antígeno humano o cualquier combinación de los mismos.
Como se usa en el presente documento "tratar" o "terapéutico" y términos relacionados gramaticalmente, se refieren a cualquier mejora de cualquier consecuencia de la enfermedad, tal como supervivencia prolongada, menor morbilidad y/o una reducción de los efectos secundarios que son los subproductos de una modalidad terapéutica alternativa; como se aprecia fácilmente en la técnica, se prefiere la erradicación total de la enfermedad, pero no es un requisito para una acción de tratamiento.
El término "variante" se refiere a una molécula que presenta una variación de un tipo o norma descritos, tal como una proteína que tiene uno o más restos de aminoácidos diferentes en la posición o posiciones correspondientes de una proteína descrita específicamente (por ejemplo, la proteína FLT3 mostrada en la Figura 1). Un análogo es un ejemplo de proteína variante. Las isoformas de corte y empalme y los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son otros ejemplos de variantes.
Las "proteínas FLT3" y/o las "proteínas relacionadas con FLT3" a las que se une el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de la invención incluyen las identificadas específicamente en el presente documento (véase, la Figura 1), así como variantes alélicas, variantes de sustitución conservativas, análogos y homólogos que pueden aislarse/generarse y caracterizarse sin experimentación indebida siguiendo los métodos descritos en el presente documento o fácilmente disponibles en la técnica. Las proteínas de fusión que combinan partes de diferentes proteínas FLT3 o fragmentos de las mismas, así como también proteínas de fusión de una proteína FLT3 y un polipéptido heterólogo, también se incluyen. Tales proteínas FLT3 se denominan colectivamente las proteínas relacionadas con FLT3, las proteínas de la invención o FLT3. La expresión "proteína relacionada con FLT3" se refiere a un fragmento de polipéptido o una secuencia de proteína FLT3 de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de 25 aminoácidos; o,
al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 991, 992 o 993 o más aminoácidos.
II.) Anticuerpos FLT3
La invención proporciona anticuerpos como se define en las reivindicaciones adjuntas que se unen a proteínas relacionadas con FLT3 (Véase la Figura 1). En una realización, el anticuerpo que se une a proteínas relacionadas con FLT3 es un anticuerpo que se une específicamente a la proteína FLT3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No .: 2. El anticuerpo que se une específicamente a la proteína FLT3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 2 incluye anticuerpos que pueden unirse a otras proteínas relacionadas con FLT3. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a la proteína FLT3 que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 2 puede unirse a proteínas relacionadas con FLT3 tales como variantes de FLT3 y los homólogos o análogos del mismo.
Los anticuerpos FLT3 de la invención son particularmente útiles en el cáncer (véase, por ejemplo, Tabla I), para ensayos de pronóstico, de formación de imágenes, metodologías diagnósticas y terapéuticas. Se describe un ensayo de unión de FLT3 desvelado en el presente documento para su uso en la detección de cáncer, por ejemplo, en un inmunoensayo. De forma similar, tales anticuerpos son útiles (por ejemplo, cuando se combinan con un agente terapéutico, en un ADC, en el tratamiento y/o pronóstico de la leucemia mieloide aguda ("AML") y la leucemia linfoblástica aguda (ALL) y otros cánceres, en la medida en que FLT3 también se expresa o sobreexpresa en estos otros cánceres. Por otra parte, los anticuerpos expresados intracelularmente (por ejemplo, anticuerpos monocatenarios) son terapéuticamente útiles en el tratamiento de cánceres en los que está implicada la expresión de FLT3, tales como cánceres AML o ALL avanzados o metastásicos u otros cánceres avanzados o metastásicos.
Diversos métodos para la preparación de anticuerpos, específicamente anticuerpos monoclonales, son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden prepararse inmunizando un hospedador mamífero adec uado usando una proteína, péptido o fragmento relacionados con FLT3, en forma aislada o inmunoconjugada (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow y Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, también pueden usarse proteínas de fusión de FLT3, tales como una proteína de fusión FLT3 GST. En una realización particular, se produce una proteína de fusión GST que comprende toda o la mayor parte de la secuencia de aminoácidos de la Figura 1, y después se usa como inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. En otra realización, se sintetiza una proteína relacionada con FLT3 y se usa como un inmunógeno.
Además, se usan técnicas de inmunización de ADN desnudo conocidas en la técnica (con o sin proteína relacionada con FLT3 purificada o células que expresan FLT3) para generar una respuesta inmunitaria al inmunógeno codificado (para una revisión, véase Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).
La secuencia de aminoácidos de una proteína FLT3 como se muestra en la Figura 1 puede analizarse para seleccionar regiones específicas de la proteína FLT3 para generar anticuerpos. Por ejemplo, los análisis de hidrofobicidad e hidrofilidad de una secuencia de aminoácidos de FLT3 se usan para identificar regiones hidrófilas en la estructura de FLT3. Las regiones de una proteína FLT3 que muestran estructura inmunogénica, así como otras regiones y dominios, puede identificarse fácilmente usando diversos otros métodos conocidos en la técnica, tales como el análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Los perfiles de hidrofilidad pueden generarse usando el método de Hopp, T.P. y Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828. Los perfiles de hidropaticidad pueden generarse usando el método de Kyte, J. y Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132. Los perfiles de porcentaje (%) de restos accesibles pueden generarse usando el método de Janin J., 1979, Nature 277:491-492. Los perfiles de flexibilidad promedio pueden generarse usando el método de Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Los perfiles beta-tum pueden generarse usando el método de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. Los métodos preferidos para la generación de anticuerpos FLT3 se ilustran además mediante los ejemplos proporcionados en el presente documento.
Los métodos para preparar una proteína o polipéptido para su uso como inmunógeno son bien conocidos en la técnica. También son bien conocidos en la técnica los métodos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un vehículo, tales como BSA, KLH u otra proteína vehículo. En algunas circunstancias, se usa conjugación directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos, los reactivos de enlace tales como los suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL, son eficaces. La administración de un inmunógeno FLT3 a menudo se lleva a cabo mediante inyección durante un período de tiempo adecuado y con el uso de un adyuvante adecuado, como se entiende en la técnica. Durante el calendario de inmunización, pueden tomarse títulos de anticuerpos para determinar la idoneidad de la formación de anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales FLT3 pueden producirse por diversos medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las líneas celulares inmortalizadas que secretan un anticuerpo monoclonal deseado se preparan usando la tecnología de hibridoma convencional de Kohler y Milstein o modificaciones que inmortalizan las células B productoras de anticuerpos, como se conoce generalmente. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados se seleccionan mediante inmunoensayo en el cual el antígeno es una proteína relacionada con FLT3. Cuando se identifica el cultivo celular inmortalizado apropiado, las células pueden expandirse y los anticuerpos pueden producirse a partir de cultivos in vitro o a partir del líquido ascítico.
Los anticuerpos o fragmentos de la invención también pueden producirse por medios recombinantes. Las regiones que se unen específicamente a las regiones deseadas de una proteína FLT3 también pueden producirse en el contexto de anticuerpos injertados quiméricos o de regiones determinantes de complementariedad (CDR) de origen de múltiples especies. También pueden producirse anticuerpos FLT3 humanizados o humanos y se prefieren para su uso en contextos terapéuticos. Los métodos para humanizar anticuerpos murinos y otros anticuerpos no humanos, sustituyendo una o más de las CDR de anticuerpos no humanos por las correspondientes secuencias de anticuerpos humanos, son bien conocidos (véase, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536). Véanse también, Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 y Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296.
En una realización preferida, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden prepararse usando ratones Veloclmmune en los cuales las secuencias genómicas que llevan segmentos variables endógenos de ratón en la cadena pesada de inmunoglobulina (segmentos VH, DH y JH) y/o los loci de la cadena ligera kappa (VK y JK) se han reemplazado, en su totalidad o en parte, por secuencias genómicas humanas que llevan segmentos variables de la línea germinal no reordenados de la cadena pesada de inmunoglobulina humana (VH, DH, y JH) y/o loci de cadenas ligeras kappa (VK y JK) (Regeneron, Tarrytown, NY). Véanse, por ejemplo, las Patentes de Ee .UU. n.° 6.586.251, 6.596.541, 7.105.348, 6.528.313, 6.638.768 y 6.528.314.
Además, los anticuerpos humanos de la invención pueden generarse usando el ratón HuMAb (Medarex, Inc.) que contiene miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (mu y gamma) y ligera kappa no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que activan los loci de la cadena mu y kappa endógena (véase, por ejemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859).
En otra realización, los anticuerpos completamente humanos de la invención pueden generarse usando un ratón que lleva secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tales como un ratón que lleva un transgén de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Dichos ratones, denominados en el presente documento "ratones KM", tales ratones se describen en Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727 y la Publicación PCT WO 02/43478 de Tomizuka, et al.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también pueden prepararse usando métodos de visualización de fagos para la detección de bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Tales métodos de visualización de fagos para aislar los anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Véanse, por ejemplo: las Pat. de EE.UU. N.° 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 DE Ladner et al.; las Pat. de EE.UU. N.° 5.427.908 y 5.580.717 de Dower et al.; las Pat. de EE.UU. N.° 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty et al.; y las Pat. de EE.UU. N.° 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths et al.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también pueden prepararse usando ratones SCID en los cuales las células inmunitarias humanas se han reconstituido de tal manera que puede generarse una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Tales ratones se describen en, por ejemplo, las Pat. de EE.UU. N.° 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson, et al.
Adicionalmente, los antibióticos humanos de la presente invención pueden producirse con técnicas que usan ratones transgénicos, inactivados para la producción de anticuerpos, modificados por ingeniería genética con loci de cadenas ligeras y pesadas humanas denominados Xenomouse (Amgen Fremont, Inc., anteriormente Abgenix, Inc.). En el documento US 6.657.103 puede encontrarse una descripción ilustrativa de la preparación de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos. Véanse, también, las Patentes de EE.UU. N.° 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; y 5.545.806; y Mendez, et. al. Nature Genetics, 15: 146-156 (1998); Kellerman, S.A. & Green, L.L., Curr. Opin. Biotechnol 13, 593-597 (2002).
Cualquiera de los métodos de producción anteriores da como resultado anticuerpos que tienen cierta capacidad para unirse a FLT3, u homólogos o fragmentos o secuencias polipeptídicas que tienen el 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 9, 98 o 99 % de identidad de secuencia con FLT3. La afinidad de unión (K d ) de los anticuerpos, los fragmentos de unión de los mismos y los conjugados de anticuerpo fármaco que comprenden los mismos para FLT3 puede ser 1 mM o menos, 100 nM o menos, 10 nM o menos, 2 nM o menos o 1 nM o menos. Como alternativa, la K d puede estar entre 5 y 10 nM; o entre 1 y 2 nM. La K d puede estar entre 1 micromolar y 500 micromolar o entre 500 micromolar y 1 nM.
La afinidad de unión de la proteína de unión al antígeno está determinada por la constante de asociación (Ka) y la constante de disociación (Kd) (KD=Kd/Ka). La afinidad de unión puede medirse mediante BIACORE, por ejemplo, mediante la captura del anticuerpo de prueba en una superficie del sensor recubierta de proteína A y haciendo fluir FLT3 sobre esta superficie. Como alternativa, la afinidad de unión puede medirse mediante FORTEBIO, por ejemplo, con el receptor del anticuerpo de prueba capturado en una aguja recubierta de proteína A y haciendo fluir FLT3 sobre esta superficie. Un experto en la materia puede identificar otros ensayos adecuados conocidos en la técnica para medir la afinidad de unión.
La expresión "se une específicamente", como se usa en el presente documento en relación con las proteínas de unión a antígenos, significa que la proteína de unión a antígeno se une al FLT3 así como a un dominio discreto, o secuencia de aminoácidos discreta, dentro de FLT3 con unión nula o insignificante a otras proteínas (por ejemplo, no relacionadas). Esta expresión, sin embargo, no excluye el hecho de que los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos también puedan tener reactividad cruzada con moléculas estrechamente relacionadas. Los anticuerpos y fragmentos de los mismos, así como los conjugados de anticuerpo fármaco que comprenden aquellos descritos en el presente documento, pueden unirse específicamente a FLT3, con una afinidad al menos 2, 5, 10, 50, 100 o 1000 veces mayor de la que se unen a moléculas estrechamente relacionadas.
En una realización preferida, un MAb FLT3 de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo designado CHv62.21 producido por una célula de ovario de hámster chino (CHO) depositada bajo el N.° de registro de la American Type Culture Collection (ATCC): PTA-121831 (Véase, la Figura 3A y/o 3B). Se desvelan anticuerpos que comprenden regiones variables pesadas y ligeras que comprenden secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de CHv62.21 y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los MAb FLT3 de la invención. La región variable de cadena pesada de CHv62.21 consiste en la secuencia de aminoácidos que va desde el 1er resto (E) al 123o resto (S) de SEQ ID NO: 9 y la región variable de cadena ligera de CHv62.21 consiste en la secuencia de aminoácidos que va desde el 1er resto (D) al 108o resto (R) de SEQ ID NO: 10. La CDR1-3 (Kabat) de la región variable de la cadena pesada de CHv62.21 consiste en la secuencia de aminoácidos que varía de 31-35, de 50-65 y de 95-102 de SEQ ID NO: 9 respectivamente, y la CDR1-3 (Kabat o Chothia) de la región variable de cadena ligera de CHv62.21 consiste en la secuencia de aminoácidos que va de 24-34, de 50-56 y de 89­ 97 de SEQ ID NO: 10 respectivamente (Véanse, la Figura 4 y la Tabla V). Como la región constante del anticuerpo de la invención, puede elegirse cualquier subclase de región constante. En una realización, puede usarse la región constante de IgGl humana como región constante de cadena pesada y la región constante kappa de Ig humana como región constante de cadena ligera.
Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en las reivindicaciones adjuntas, en donde el anticuerpo monoclonal aislado o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde:
(a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada expuesta en la Figura 3A y/o 3B; y
(a) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera expuesta en la Figura 3A y/o 3B. En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de Vh y/o Vl son el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idénticas a las secuencias Vh y Vl expuestas en la Figura 3A y/o 3B. La divulgación en el presente documento también proporciona polinucleótidos o ácidos nucleicos que codifican a o b, o las secuencias de Vh o Vl establecidas en la Figura 3A y/o 3B, así como polinucleótidos o ácidos nucleicos que son el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % por ciento idénticos a estos.
Se desvela un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada humanizada y una región variable de cadena ligera humanizada, en donde:
(a) la región variable de cadena pesada comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR de la región variable de cadena pesada expuestas en la Figura 3A y/o 3B;
(b) la región variable de cadena ligera comprende CDR que tienen las secuencias de aminoácidos de las CDR de la región variable de cadena pesada expuestas en la Figura 3A y/o 3B.
Los anticuerpos modificados por ingeniería genética de la invención incluyen aquellos en los cuales se han realizado modificaciones en los restos del marco dentro de Vh y/o Vl (por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo). Generalmente, tales modificaciones en la región marco se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia es "retromutar" uno o más restos de la región marco a la correspondiente secuencia de la línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que se ha sometido a mutación somática puede contener restos de la región marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo. Tales restos pueden identificarse mediante la comparación de las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo. Para reestablecer las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas pueden "retromutarse" a la secuencia de la línea germinal mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR (por ejemplo, "retromutada" de leucina a metionina). También se pretende que dichos anticuerpos "retromutados" estén abarcados por la invención.
Otro tipo de modificación en la región marco implica mutar uno o más restos en la región marco o incluso en una o más regiones CDR, para retirar los epítopos de células T para reducir de esta manera la posible inmunogenicidad del anticuerpo. Esta estrategia también se denomina "desinmunización" y se describe con más detalle en la Publicación de Patente de EE.UU. N.° 2003/0153043 de Carr, et al.
Además o como alternativa a las modificaciones realizadas en la región marco o en las regiones CDR, los anticuerpos de la invención pueden modificarse por ingeniería genética para que incluyan modificaciones en la región Fc, normalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Adicionalmente, un MAb FLT3 de la invención puede modificarse químicamente (por ejemplo, pueden unirse una o más fracciones químicas al anticuerpo) o puede modificarse para alterar su glucosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades del MAb. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación.
En una realización, se modifica la región bisagra de CH1 de tal manera que se altera el número de restos de cisteína en la región bisagra, por ejemplo, se aumenta o reduce. Este enfoque se describe con más detalle en la Pat de EE.UU. N.° 5.677.425 de Bodmer, et al. El número de restos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del MAb FLT3.
En otra realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del MAb FLT3. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de la interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento Fc-bisagra de tal manera que el anticuerpo tenga una unión a la proteína A estafilocócica (SpA) deteriorada en relación con la unión al dominio SpA Fc-bisagra nativo. Este enfoque se describe con detalle adicional en la Pat. de EE.UU. N.° 6.165.745 de Ward, et al.
En otra realización, el MAb FLT3 se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles diversas estrategias. Por ejemplo, las mutaciones pueden introducirse como se describe en la Pat. de EE.Uu . N.° 6.277.375 de Ward. Como alternativa, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CH1 o CL para contener un epítopo de unión al receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Pat. de EE.UU. N.° 5.869.046 y 6.121.022 por Presta et al. En otras realizaciones adicionales, se altera la región Fc reemplazando al menos un resto de aminoácido por un resto de aminoácido diferente para alterar la función o funciones efectoras del MAb FLT3. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de restos específicos aminoácidos pueden reemplazarse por un resto de aminoácido diferente de tal manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero retenga la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo parental. El ligando efector para el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc del componente C1 del complemento. Esta estrategia se describe con detalle adicional en las Pat. de EE.UU. N.° 5.624.821 y 5.648.260, ambas por Winter, et al.
En otra realización, la cadena pesada se altera reemplazando al menos un residuo de aminoácido con un aminoácido no natural a través de la tecnología ReCODE desarrollada por Ambrx (La Jolla, CA). Un ejemplo de aminoácido no natural es la para-acetilfenilalanina.
La reactividad de los anticuerpos FLT3 con una proteína relacionada con FLT3 puede establecerse por varios medios bien conocidos, incluyendo transferencia Western, inmunoprecipitación, análisis ELISA y FACS usando, según sea apropiado, proteínas relacionadas con FLT3, células que expresan FLT3 o extractos de las mismas. Un anticuerpo FLT3 o un fragmento del mismo puede marcarse con un marcador detectable o conjugar con una segunda molécula. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero no se limitan a, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, compuesto quimioluminiscente, un quelante de metal o una enzima. Además, los anticuerpos biespecíficos específicos para dos o más epítopos de FLT3 se generan usando métodos generalmente conocidos en la técnica. Los anticuerpos homodiméricos también pueden generarse mediante técnicas de reticulación conocidas en la técnica (por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565). En otra realización preferida más, el MAb FLT3 de la invención es un anticuerpo que comprende la cadena pesada y ligera de un anticuerpo designado CHv62.21. La cadena pesada de CHv62.21 consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er resto (E) al 453o resto (K) de SEQ ID NO: 9 y la cadena ligera de CHv62.21 consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er resto (D) al 214o resto (C) de la secuencia SEQ ID NO: 10. La secuencia de la cual se expone en la Figura 2A y/o 2B y la Figura 3A y/o 3B. En una realización preferida, CHv62.21 se modifica con un aminoácido no natural ("nnAA") y se conjuga con un agente citotóxico. En una realización, el nnAA es pAF. En una realización preferida, el agente citotóxico se conjuga específicamente en el nnAA.
En otra realización más, el MAb FLT3 de la invención se produce mediante el método de producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende cultivar una célula hospedadora para permitir la expresión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, en donde la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):
(a) una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 123o S de SEQ ID NO: 9 y un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 108o R de SEQ ID NO: 10;
(b) una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 123o S de SEQ ID NO: 9 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 108o R de SEQ ID NO: 10; y
(c) una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 123o S de SEQ ID NO: 9 y una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 108o R de SEQ ID NO: 10.
En otra realización más, el MAb FLT3 de la invención se produce mediante el método de producción de un anticuerpo que comprende cultivar una célula hospedadora para permitir la expresión del anticuerpo, en donde la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):
(a) una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 9 y un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C d e SEQ ID NO: 10;
(b) una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 9 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10; y
(c) una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 9 y una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10.
La célula de ovario de hámster chino (CHO) que produce el anticuerpo designado CHv62.21 se envió (a través de Federal Express) a la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 09 de diciembre de 2014 y el número de registro asignado PTA-121831.
Como alternativa o adicionalmente, en otra realización de la invención, los MAb que se unen a FLT3, en este caso, el MAb CHv62.21 puede sufrir modificaciones postraduccionales como se conoce en la técnica. Los ejemplos de modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a, modificaciones químicas, tales como enlaces disulfuro, oligosacáridos, formación de piroglutamato N-terminal, procesamiento de lisina C-terminal, desamidación, isomerización, oxidación, glicación, escisión del enlace peptídico, reticulación no reducible, truncamiento y otros conocidos en la materia. Véanse, Liu, et. al., Heterogeneity of Monoclonal Antibodies, J. Pharma. Sci. vol. 97, n.° 7, pp. 2426-2447 (julio de 2008). Otros tipos de modificaciones incluyen interacción no covalente, heterogeneidad conformacional y agregación. Id.
En una realización adicional, el MAb CHv62.21 comprende una ciclación del Glutamato de cadena pesada N-terminal en el resto 1 a Piro-glutamato. Un experto en la materia entenderá y apreciará que se entiende que dicha ciclación se produce de forma espontánea. Véanse, Dick, et. al., Determination of the Origin of the N-Terminal Pyro-Glutamtate Variation in Monoclonal Antibodies Using Model Peptides, Biotechnology and Bioengineering, vol. 97, n.° 3, pp 544-553 (15 de junio de 2007).
Adicionalmente o como alternativa, los aminoácidos del MAb CHv62.21 pueden sufrir más modificaciones postraduccionales que incluyen, pero no limitado a, desamidación, isomerización, glicación y/u oxidación. Los polipéptidos de la invención, o los fragmentos de los mismos, pueden sufrir modificaciones postraduccionales adicionales, incluyendo glucosilación, por ejemplo, sitios de glucosilación ligados a N o ligados a O que son bien conocidos en la técnica. Como se describe anteriormente, pueden realizarse cambios en la secuencia de aminoácidos del polipéptido o en las condiciones del proceso (tales como cambios en el cultivo, purificación y/o condiciones de almacenamiento) para evitar o minimizar tales alteraciones, o para facilitarlas en circunstancias donde dicho procesamiento sea beneficioso. Por otra parte, tales preparaciones pueden comprender polipéptidos que tienen niveles variables de más de un tipo de modificación o modificaciones relacionadas con el procesamiento, por ejemplo, un polipéptido puede tener algunos, la mayoría, o sustancialmente toda la lisina C-terminal retirada y/o algunos, la mayoría, o sustancialmente todo de un aminoácido N-terminal convertido en ácido piroglutamato (por ejemplo, los polipéptidos mostrados en la Figura 2A y/o 2B o la Figura 3A y/o 3B o en las secuencias consenso o fragmentos de unión a antígeno). Las condiciones del proceso tales como la variación de la temperatura y la composición del tampón pueden tener efectos significativos sobre el grado de tales modificaciones.
En una realización adicional, el MAb CHv62.21 comprende un truncamiento de la lisina de la cadena pesada C-terminal en el resto 453 de SEQ ID NO: 9.
En una realización adicional, el MAb CHv62.21 comprende una adición de glucosilación o glucosilaciones a la Asparagina de la cadena pesada en el resto 303 incluyendo, pero no limitado a, GO (N-glucano de tipo complejo biantenario asialo, agalacto, afucosilado; G0F (N-glucano de tipo complejo biantenario asialo, agalacto, de núcleo fucosilado); Manosa-5 (oligomanosa-5 ligada a N); GIF (N-glucano de tipo complejo biantenario asialo, monogalacto, de núcleo fucosilado); G2 (N-glucano de tipo complejo biantenario asialo, bigalacto, afucosilado); G2F (N-glucano de tipo complejo biantenario asialo, bigalacto, de núcleo fucosilado); A1 (oligosacárido ligado a N biantenario monosialilado, Neu5Acid); y/o A2 (oligosacárido ligado a N biantenario disialilado, Neu5Acid).
Adicionalmente o como alternativa en otra realización, el MAb CHv62.21 comprende la adición de glicación o glicaciones a uno o más restos de serina de la cadena ligera. Generalmente, la glicación resulta de la reacción no enzimática entre los azúcares reductores y la amina primaria N-terminal o el grupo amina de las cadenas laterales de la lisina. Un experto en la materia comprenderá y apreciará que la glicación puede enmascarar la carga positiva en el grupo de aminoácidos primario N-terminal o la cadena lateral de los residuos de lisina, lo que hará que el anticuerpo sea más ácido.
La secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la invención puede verificarse por cualquier medio conocido en la técnica (por ejemplo, espectrometría de masas) y puede ser idéntica a las secuencias desveladas en el presente docu mento (Véanse, la Figura 2A y/o 2B y la Figura 3A y/o 3B) o pueden diferir de esas secuencias en uno o más restos de aminoácidos como resultado del procesamiento de modificación postraduccional. A modo de ejemplo no limitante, en todos o en una parte de los polipéptidos sustancialmente homogéneos, puede retirarse un aminoácido C-terminal de la cadena ligera o de la cadena pesada, por procesamiento proteolítico u otro procesamiento que se produce durante el cultivo. De forma similar, los aminoácidos N-terminales pueden estar ausentes, por ejemplo, uno (1), dos (2), tres (3), cuatro (4) o cinco (5) aminoácidos N-terminales pueden estar ausentes.
En otra realización, la región variable de la cadena pesada de CHv62.21 MAb se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 123 (S) de SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 123 (S) de SEQ ID NO: 9 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico.
En otra realización, la cadena pesada de CHv62.21 MAb se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9, una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico, una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 en donde se retira el resto C-terminal 453 (K) y una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico y se retira el resto C-terminal 453 (K).
En otra realización, el MAb CHv62.21 o fragmento de unión a antígeno del mismo es una mezcla de proteínas producida de forma recombinante obtenida por expresión en una célula hospedadora, en donde la región variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 123 (S) de SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 123 (S) de SEQ ID NO: 9 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico.
En otra realización, el MAb CHv62.21 es una mezcla de proteínas producida de forma recombinante obtenida por expresión en una célula hospedadora, en donde la cadena pesada del anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9, una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico, una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 en donde se retira el resto C-terminal 453 (K) y una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico y se retira el resto C-terminal 453 (K).
En otra realización, el MAb CHv62.21 comprende la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 9 en donde el 1er E se modifica a piro-glutamato y la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10.
En otra realización, el MAb CHv62.21 comprende la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 9 y la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10.
En otra realización, el MAb CHv62.21 comprende la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 9 en donde el 1er E se modifica a piro-glutamato y se retira el resto C-terminal 453o K y la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10.
En otra realización, el MAb CHv62.21 comprende la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 9 en se retira el resto C-terminal 453o K y la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10.
En una realización preferida adicional de la invención, los MAb FLT3 de la invención y, específicamente, el MAb denotado CHv62.21 está modificado con un aminoácido no natural ("nnAA") en la cadena pesada. En una realización preferida, un codón ámbar está ubicado en la posición de aminoácido 124 de la SEQ ID NO: 11 para la inserción de un nnAA denotado para-acetilfenilalanina (Figura 3C). El CHv62.21 modificado se denota CHv62.21pAF para los fines de esta invención.
En consecuencia, en una realización preferida de la invención, CHv62.21pAF comprende lo siguiente:
Una región variable de cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er resto (E) al 123o resto (S) de SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er resto (D) al 108o resto (R) de SEQ ID NO: 10. La CDR1-3 (Kabat) de la región variable de la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos que va de 31-35, de 50-65 y de 95-102 de SEQ ID NO: 11 respectivamente, y la CDR1-3 (Kabat o Chothia) de la región variable de cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos que va de 24-34, de 50-56 y de 89-97 de SEQ ID NO: 10 respectivamente (Véanse, la Figura 3B, la Figura 3C y la Tabla V).
Una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er resto (E) al 453o resto (K) de SEQ ID NO: 11 con un nnAA de para-acetilfenilalanina insertado en el resto 124 de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera de CHv62.21 que consiste en una secuencia de aminoácidos que va del 1er resto (D) al 214o resto (C) de SEQ ID NO: 10. Las secuencias de las cuales se exponen en la Figura 2B y/o 2C y la Figura 3B y/o 3C. En una realización preferida, CHv62.21pAF se conjuga con un agente citotóxico.
En otra realización más, el MAb FLT3 de la invención se produce mediante el método de producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende cultivar una célula hospedadora para permitir la expresión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, en donde la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):
(a) una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 123o S de SEQ ID NO: 11 y un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 108o R SEQ ID NO: 10;
(b) una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 123o S de SEQ ID NO: 11 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 108o R de SEQ ID NO: 10; y
(c) una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 123o S de SEQ ID NO: 11 y una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 108o R de SEQ ID NO: 10.
En otra realización más, el MAb FLT3 de la invención se produce mediante el método de producción de un anticuerpo que comprende cultivar una célula hospedadora para permitir la expresión del anticuerpo, en donde la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c):
(a) una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 11 y un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10;
(b) una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 11 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10; y
(c) una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 11 y una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10;
En otra realización más, el MAb FLT3 de la invención se produce mediante el método de producción de un anticuerpo que comprende cultivar una célula hospedadora para permitir la expresión del anticuerpo, en donde la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en los siguientes (a) a (d):
(a) una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 11 y un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10;
(b) una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 11 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10;
(c) una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 11 y una célula hospedadora transformada con un vector d e expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10; y
(d) una célula hospedante transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que codifica una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 452o G de SEQ ID NO: 11 en donde el 1er E se modifica a piroglutamato y la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10.
En otra realización, la región variable de la cadena pesada de CHv62.21pAF MAb se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 123 (S) de SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 123 (S) de SEQ ID NO: 11 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico.
En otra realización, la cadena pesada de CHv62.21pAF MAb se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11, una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico, una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 en donde se retira el resto C-terminal 453 (K) y una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico y se retira el resto C-terminal 453 (K).
En otra realización, el MAb CHv62.21pAF o fragmento de unión a antígeno del mismo es una mezcla de proteínas producida de forma recombinante obtenida por expresión en una célula hospedadora, en donde la región variable de cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 123 (S) de SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoácidos resto 1 (E) al resto 123 (S) de SEQ ID NO: 11 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico.
En otra realización, el MAb CHv62.21pAF es una mezcla de proteínas producida de forma recombinante obtenida por expresión en una célula hospedadora, en donde la cadena pesada se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11, una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico, una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 en donde se retira el resto C-terminal 453 (K) y una secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico y se retira el resto C-terminal 453 (K). En otra realización, el MAb CHv62.21pAF comprende la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 11 y la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10.
En otra realización, el MAb CHv62.21pAF comprende la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 11 en donde el 1er E se modifica a piro-glutamato y la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10.
En otra realización, el MAb CHv62.21pAF comprende la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 11 en donde el 1er E se modifica a piro-glutamato y se retira el resto C-terminal 453o K y la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10.
En otra realización, el MAb CHv62.21pAF comprende la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 11 en se retira el resto C-terminal 453o K y la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10.
La célula de ovario de hámster chino (CHO) que produce el anticuerpo designado CHv62.21pAF se envió (a través de Federal Express) a la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 09 de diciembre de 2014 y el número de registro asignado PTA-121836.
Ill.) Conjugados de anticuerpo fármaco generalmente
En otro aspecto, la invención proporciona conjugados de anticuerpo fármaco (ADC), que comprenden un anticuerpo de la invención conjugado con un agente terapéutico mediante un enlazador. El agente terapéutico puede ser un agente citotóxico, un agente citostático, un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de los mismos), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). En otro aspecto, la invención proporciona además métodos para usar los ADC. En un aspecto, un ADC comprende cualquiera de los MAb FLT3 anteriores unidos covalentemente o unidos mediante enlace oxima a un agente citotóxico o un agente detectable.
El uso de conjugados de anticuerpo fármaco para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos, es decir, fármacos para destruir o inhibir células tumorales en el tratamiento de cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172; patente de EE.UU. 4.975.278) permite la administración dirigida de fracciones de fármaco a tumores y la acumulación intracelular en los mismos, donde la administración sistémica de estos agentes de fármaco no conjugados pueden dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad para las células normales, así como para las células que se busca eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet pp. (15 de marzo de 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). De esta forma se busca la máxima efectividad con la mínima toxicidad. Para estas estrategias se han notificado como útiles tanto anticuerpos policlonales como anticuerpos monoclonales (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). Los fármacos usados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina (Rowland et al., (1986) anteriormente citado). Las toxinas usadas en los conjugados de anticuerpo fármaco incluyen toxinas bacterianas tales como la toxina diftérica, toxinas vegetales tales como ricina, toxinas de moléculas pequeñas tales como geldanamicina (Mandler et al (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (documento EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623) y calicheamicina (Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden alterar sus efectos citotóxicos y citostáticos por mecanismos que incluyen unión a tubulina, unión al ADN o inhibición de la topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grandes o ligandos de receptores de proteínas.
Son ejemplos de conjugados de anticuerpo fármaco, ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) que es un conjugado de anticuerpo-radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal IgG1 kappa murino dirigido contra el antígeno CD20 que se encuentra en la superficie de linfocitos B normales y malignos y un radioisótopo de 111In o 90Y unido mediante un quelante enlazador de tiourea (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69).
También, MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado de anticuerpo fármaco compuesto por un anticuerpo de CD33 humano unido a la calicheamicina, fue aprobado en 2000 para el tratamiento de leucemia mieloide aguda mediante inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; Patentes de EE.UU. N.° 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001).
Adicionalmente, los anticuerpos anti-FLT3 humanos se han evaluado anteriormente como potenciales agentes terapéuticos para la leucemia mieloide. Por ejemplo, IMC-EB10, un anticuerpo contra FLT3 fue desarrollado por Imclone. Este anticuerpo es un bloqueante de ligando que inhibe la activación mediada por FLT3 de quinasas posteriormente (MAPK, Akt y Stat5). El anticuerpo también inhibe la proliferación de células leucémicas in vitro; y se sabe que actúa a través de la toxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). EB10 ha provocado una supervivencia prolongada de los xenoinjertos leucémicos cuando se trata solo y en combinación con metotrexato (Véanse, los documentos WO2009/155015 y US2011/0008355). Este anticuerpo también se evaluó en ensayos clínicos en humanos (NCT00887926), pero se interrumpió debido a la falta de efectividad. Véanse también, e B10 conjugado con MMAF fue desarrollado por ImClone (Véase, Proc Amer Assoc Cancer Res, Volumen 46, 2005). Se sabe en la técnica que los anticuerpos agonistas desarrollados contra FLT3 pueden potenciar la proliferación y/ diferenciación de células hematopoyéticas primitivas. (Véase, el documento WO 95/27062).
Además de los productos biológicos, se han desarrollado y probado numerosos inhibidores de moléculas pequeñas en ensayos clínicos en seres humanos. La mayoría de estos inhibidores se dirigen a FLT3 y otras quinasas y, por lo tanto, no son específicos de la quinasa FLT3 en sí. En la mayoría de los casos, estos inhibidores se dirigen a FLT3-ITD y posiblemente a FLT-TKD. En consecuencia, ninguno está disponible para dirigirse solo a FLT3 de tipo silvestre. Los inhibidores de moléculas pequeñas que se sabe que han ingresado en ensayos clínicos en seres humanos son:
Midostaurina o PKC-412 (Novartis), Quizartinib o AC220 (Ambit), Nexavar (Onyx/Bayer), AZD1152 o Barasertib (Astrazeneca), Crenolinib (Arog), Plexxicon (Daichii Sankyo) y ASP2215 (Astellas). Generalmente, la mayoría de los ensayos clínicos en seres humanos aún están en curso. En la mayoría de los casos, se han observado anemia como efectos secundarios trombocitopenia, neutropenia, anemia.
Además, Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo fármaco compuesto por el anticuerpo huC242 enlazado a través del enlazador disulfuro s Pp con la fracción de fármaco maitansinoide, DM1, está avanzando a los ensayos clínicos en Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como de colon, pancreático, gástrico y otros.
Adicionalmente, MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo fármaco compuesto por el anticuerpo monoclonal anti-antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) enlazado a la fracción de fármaco maitansinoide, DM1, está en desarrollo para el tratamiento potencial de tumores de próstata.
Finalmente, los péptidos auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron con anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos de Lewis Y en carcinomas) y cAC10 (específicos de CD30 en neoplasias malignas hematológicas) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784).
El MAb CD30 conjugado con MMAE ahora está disponible en el mercado como ADCETRIS (Seattle Genetics, Bothell, WA). ADCETRIS (brentuximab vedotina) es un conjugado de fármaco de anticuerpo dirigido a CD-30 que consiste en tres componentes: 1) el anticuerpo IgG1 quimérico denominado cAC10, específico para CD30 humano, 2) el agente disruptor de microtúbulos MMAE y 3) un enlazador escindible por proteasa que une covalentemente MMAE a caC10. Véanse, información de prescripción de ADCENTRIS.
Además, en el presente documento se describen agentes terapéuticos que incluyen pero no se limitan a agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de ADC. Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos que no son fragmentos de unión de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Hay una diversidad de radionucleidos disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se preparan usando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridil ditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidioésteres (tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de bis-fluorina activa (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al (1987) Science, 238:1098. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ilustrativo para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo (documento WO94/11026).
Los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una calicheamicina, maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, un tricoteceno y CC1065 y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en el presente documento.
III(A). Maitansinoides
Los compuestos de maitansina adecuados para su uso como fracciones de fármaco de maitansinoide se conocen bien en la técnica y pueden aislarse de fuentes naturales de acuerdo con métodos conocidos, producirse usando técnicas de ingeniería genética (véase Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973) o maitansinol y análogos de maitansinol preparados sintéticamente de acuerdo con métodos conocidos.
Las fracciones de fármaco maitansinoide ilustrativas incluyen aquellas que tienen un anillo aromático modificado, tales como: C-19-decloro (documento US 4256746) (preparado por reducción con hidruro de litio y aluminio de ansamitocina P2); C-20-hidroxi (o C-20-desmetil) /-C-19-decloro (Pat. de EE.UU. N.° 4.361.650 y 4.307.016) (preparado por desmetilación usando Streptomyces o Actinomyces o decloración usando LAH); y C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), /-decloro (Pat. de EE.u U. N.° 4.294.757) (preparado por acilación usando cloruros de acilo) y los que tienen modificaciones en otras posiciones
Las fracciones de fármaco maitansinoide ilustrativas también incluyen aquellas que tienen modificaciones tales como: C-9-SH (documento US 4.424.219) (preparado mediante la reacción de maitansinol con H2S o P2S5); C-14-alcoximetil(desmetoxi/CH2 OR) (documento uS 4331598); C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (documento US 4450254) (preparado de Nocardia); C-15-hidroxi/aciloxi (documento US 4.364.866) (preparado mediante la conversión de maitansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (Pat. de EE.UU. N.° 4.313.946 y 4.315.929) (aislado de Trewia nudlflora); C-18-N-desmetilo (Pat. de EE.UU. N.° 4.362.663 y 4.322.348) (preparado por la desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y 4,5-desoxi (documento US 4.371.533) (preparado mediante la reducción de maitansinol con tricloruro de titanio/LAH).
Los ADC que contienen maitansinoides, los procedimientos para prepararlos y su uso terapéutico se desvelan, por ejemplo, en las Pat. de EE.UU. N.° 5.208.020; 5.416.064; 6.441.163 y la Patente Europea EP 0425235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describieron ADC que comprenden un maitansinoide designado DM 1 enlazado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorrectal humano. Se descubrió que el conjugado era altamente citotóxico para las células de cáncer de colon cultivadas y mostraba actividad antitumoral en un ensayo in vivo de crecimiento tumoral. Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) describen ADC en los cuales se conjugó un maitansinoide mediante un enlazador disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal murino tA.1 que se une al oncogén HER-2/neu. Se probó la citotoxicidad del conjugado TA.1-maitansonoide in vitro en la línea celular de cáncer de mama humano SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El fármaco conjugado alcanzó un grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que podría aumentarse aumentando el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró una baja citotoxicidad sistémica en ratones.
III(B). Auristatinas y dolastatinas
En algunas realizaciones, el ADC comprende un anticuerpo de la invención conjugado con dolastatinas o análogos y derivados peptídicos de dolostatina, las auristatinas (Patentes de EE.UU. N.° 5.635.483; 5.780.588). Se ha demostrado que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis del GTP y la división nuclear y celular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) y tienen actividad anticáncer (documento US 5.663.149) y antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). La fracción de fármaco de dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo a través del extremo N (amino) o el extremo C (carboxilo) de la fracción de fármaco peptídico (documento WO 02/088172). Las realizaciones ilustrativas con auristatina incluyen las fracciones farmacológicas de monometilauristatina DE y DF ligadas al extremo N, desveladas en "Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research", Volumen 45, Resumen Número 623, presentado el 28 de marzo de 2004 y descrito en la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 2005/0238649.
Normalmente, las fracciones de fármaco basadas en péptidos pueden prepararse formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptido. Tales enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis en fase líquida (véase E. Schroder y K. Lubke, "The Peptides", volumen 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Los restos de fármaco auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los métodos de: los documentos US 5635483; los documentos US 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; y Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784.
III(C). Calicheamicina
En otras realizaciones, el ADC comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. Las familias de antibióticos de la calicheamicina son capaces de producir roturas de ADN bicatenario a concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de la calicheamicina, véanse las patentes de EE.UU. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas de American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de calicheamicina que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, Y11, a2I, as1, N-acetil-Y-i1, PSAG y 9^ (Hinman et al., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de EE.UU. mencionadas anteriormente de American Cyanamid. Otro fármaco antitumoral con el que puede conjugarse el anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tanto la calicheamicina como la QFA tienen sitios de acción intracelulares y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpos mejora en gran medida sus efectos citotóxicos.
III(D). Otros agentes citotóxicos
Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida de manera colectiva como el complejo LL-E33288 descrita en las patentes de EE.UU. 5.053.394, 5.770.710, así como esperamicinas (patente de EE.u U.
5.877.296).
Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos que no son fragmentos de unión de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Véanse, por ejemplo, el documento WO 93/21232 (publicado el 28 de octubre de 1993).
La presente invención contempla además un ADC formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa; DNasa). Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Está disponible una diversidad de isótopos radioactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I31, I125, Y90, Re186, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para detección, puede comprender un átomo radiactivo para estudios de centellografía, por ejemplo, tc99m o I123 o un marcador de espín para obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como obtención de imágenes por resonancia magnética, MRI), tales como de nuevo, yodo-123, yodo-131, indio-Ill, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.
Los marcadores radioactivos u otros marcadores pueden incorporarse en el conjugado de maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Los marcadores, tales como tc99m o I123, .Re188, Re188 e In111 pueden unirse a través de un resto de cisteína en el péptido. Puede unirse itrio-90 a través de un resto de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) puede usarse para incorporar yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.
IV.) Compuestos de conjugados anticuerpo fármaco que se unen a FLT3
La presente invención proporciona, entre otros, compuestos de conjugados de anticuerpo fármaco para la administración dirigida de agentes terapéuticos como se define en las reivindicaciones adjuntas. Los inventores han descubierto que los compuestos de conjugados anticuerpo fármaco tienen una potente actividad citotóxica y/o citostática contra las células que expresan FLT3.
Tales conjugados de anticuerpo-fármaco no bloquean la unión de FL a FLT3, de tal manera que FL puede señalizar a través de FLT3 incluso cuando el anticuerpo está unido. Dichos anticuerpos demuestran una actividad citotóxica que no se reduce en presencia de FL (donde un conjugado de fármaco de anticuerpo anti-FLT3 que bloquea la unión de FL a FLT3 exhibe una citotoxicidad reducida en presencia de FL. En realizaciones preferidas, los conjugados de fármaco anti-FLT3 descritos en el presente documento no inhiben sustancialmente la unión de FL a FLT3.
Los compuestos de conjugados anticuerpo fármaco comprenden una unidad de anticuerpo unida covalentemente a al menos una unidad de fármaco. Las unidades de fármaco pueden unirse covalentemente a la unidad de anticuerpo directamente o mediante una unidad enlazadora (-LU-).
En algunas realizaciones, el compuesto conjugado de anticuerpo fármaco tiene la siguiente fórmula:
L -(LU-D)p (I)
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde:
L es la unidad de Anticuerpo, por ejemplo, MAb FLT3 de la presente invención, tales como CHv62.21 o CHv62.21pAF y
(LU-D) es una unidad enlazadora-unidad de fármaco, en donde:
LU- es una unidad enlazadora y
-D es una unidad de fármaco que tiene actividad citostática o citotóxica contra una célula diana; y p varía de 1 a 20.
En algunas realizaciones, p varía de 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 o 1 a 2. En algunas realizaciones, p varía de 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4 o 2 a 3. En otras realizaciones, p es 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En algunas realizaciones, p es 2 o 4. En algunas realizaciones, p es un número entero. En otras realizaciones, p se mide como una relación promedio de fármaco a anticuerpo y puede ser un número entero o no entero.
En algunas realizaciones, el compuesto conjugado de anticuerpo fármaco tiene la siguiente fórmula:
L -(Aa-Ww-Yy-D)p (II)
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
L es la unidad de Anticuerpo, por ejemplo, MAb FLT3, tales como CHv62.21 o CHv62.21pAF; y
-Aa-Ww-Yy- es una unidad enlazadora (LU), en donde:
-A- es una Unidad ensanchadora,
a es 0 o 1 o 2 o 3,
cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido,
w es un número entero que varía de 0 a 12,
-Y- es una unidad espadadora autoinmolable,
y es 0, 1 o 2;
-D es una unidad de fármaco que tiene actividad citostática o citotóxica contra la célula diana; y p es un número entero de 1 a 20.
En algunas realizaciones, a es 0 o 1, w es 0 o 1 e y es 0, 1 o 2. En algunas realizaciones, a es 0 o 1, w es 0 o 1 e y es 0 o 1. En algunas realizaciones, p varía de 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 o 1 a 2. En algunas realizaciones, p varía de 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4 o 2 a 3. En otras realizaciones, p es 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En algunas realizaciones, p es 2 o 4. En algunas realizaciones, cuando w no es cero, y es 1 o 2. En algunas realizaciones, cuando w es de 1 a 12, y es 1 o 2. En algunas realizaciones, w es 2 a 12 e y es 1 o 2. En algunas realizaciones, a es 1 y w e y son 0.
Para composiciones que comprenden una pluralidad de anticuerpos, la carga del fármaco está representada por p, el número promedio de moléculas de fármaco por Anticuerpo. La carga de fármaco puede variar de 1 a 20 fármacos (D) por Anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo en preparación de reacciones de conjugación puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectroscopía de masas, ensayo ELISA y HPLC. También puede determinarse la distribución cuantitativa de los Conjugados de Anticuerpo Fármaco en términos de p. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de los Conjugados de Anticuerpo Fármaco homogéneos donde p es un valor determinado de Conjugados de Anticuerpo Fármaco con otras cargas de fármaco pueden lograrse por medios tales como HPLC en fase inversa o electroforesis. En realizaciones ilustrativas, p es de 2 a 8.
La generación de compuestos de conjugado de anticuerpo fármaco puede lograrse mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia. Resumiendo, los compuestos de conjugado de anticuerpo fármaco comprenden MAb FLT3 de la invención como la unidad de anticuerpo, un fármaco y, opcionalmente, un enlazador que une el fármaco y el agente aglutinante. En una realización preferida, el Anticuerpo es MAb FLT3 que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo designado CHv62.21 descrito anteriormente. En una realización más preferida, el Anticuerpo es MAb FLT3 que comprende las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo designado CHv62.21pAF descrito anteriormente (Véase, Fórmula (I)).
Están disponibles varias reacciones diferentes para la unión covalente de fármacos y/o enlazadores a agentes de unión. Esto a menudo se logra mediante la reacción de los restos de aminoácidos del agente aglutinante, por ejemplo, molécula de anticuerpo, incluyendo los grupos amina de lisina, los grupos de ácido carboxílico libres de ácido glutámico y aspártico, los grupos sulfhidrilo de cisteína y los diversos restos de los aminoácidos aromáticos. Uno de los métodos no específicos más comúnmente usados de unión covalente es la reacción de carbodiimida para ligar un grupo carboxi (o amino) de un compuesto a un grupo amino (o carboxi) del anticuerpo. Adicionalmente, se han usado agentes bifuncionales, tales como dialdehídos o imidoésteres para ligar el grupo amino de un compuesto a grupos amino de una molécula de anticuerpo. Para la unión de fármacos a agentes de unión también se encuentra disponible la reacción de bases de Schiff. Este método implica la oxidación con peryodato de un fármaco que contiene grupos glicol o hidroxilo, que forma de este modo un aldehído que después se hace reaccionar con el agente de unión. La unión se produce a través de la formación de una base de Schiff con grupos amino del agente de unión. También pueden usarse isotiocianatos como agentes de acoplamiento para unir covalentemente fármacos a agentes de unión. El experto en la materia conoce otras técnicas.
En determinadas realizaciones, un intermedio, que es el precursor del enlazador, se hace reaccionar con el fármaco en condiciones apropiadas. En determinadas realizaciones, se usan grupos reactivos sobre el fármaco y/o el intermedio. El producto de la reacción entre el fármaco y el intermedio, o el fármaco derivatizado, se hace reaccionar posteriormente con el MAb FLT3 ven condiciones apropiadas.
V.) Unidades enlazadoras
Normalmente, los compuestos conjugados de anticuerpo fármaco comprenden una unidad enlazadora entre la unidad de fármaco y la unidad de anticuerpo. En algunas realizaciones, el enlazador es escindible en condiciones intracelulares, de tal manera que la escisión del enlazador libera la unidad de fármaco del anticuerpo en el ambiente intracelular. En otras realizaciones adicionales, la unidad enlazadora no es escindible y el fármaco se libera, por ejemplo, mediante degradación de anticuerpos.
En algunas realizaciones, el enlazador es escindible por un agente de escisión que está presente en el ambiente intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El enlazador puede ser, por ejemplo, un enlazador de peptidilo que se escinde por una enzima peptidasa o proteasa intracelular, incluyendo, pero no limitado a, una proteasa lisosómica o endosómica. El enlazador también puede escindirse mediante un agente de escisión que está presente en el ambiente extracelular (por ejemplo, en las proximidades de la membrana celular o el espacio tisular). El enlazador puede ser, por ejemplo, un enlazador de peptidilo que se escinde por una enzima peptidasa o proteasa extracelular, incluyendo, pero no limitado a, enzimas de la familia de las catepsinas o metaloproteinasas de matriz). En algunas realizaciones, el enlazador peptídico es de al menos dos aminoácidos de longitud o de al menos tres aminoácidos de longitud. En una realización preferida, el enlazador de peptidilo contiene al menos una unidad de amino-oxiácido (Ambrx, Inc., La Jolla, CA). Los agentes de escisión pueden incluir aquellos agentes conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123 y la Patente de EE.UU. N.°: 6.214.345). Una ventaja del uso de la escisión proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente normalmente se atenúa cuando se conjuga y la estabilidad en suero de los conjugados normalmente es alta.
En otras realizaciones, el enlazador escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a determinados valores de pH. Normalmente, el enlazador sensible al pH es hidrolizable en condiciones ácidas. Por ejemplo, puede usarse un enlazador lábil al ácido que es hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una oxima, hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal, o similares). (Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661.) Dichos enlazadores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, tales como las de la sangre, pero son inestables o menos estables por debajo de pH 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En determinadas realizaciones, el enlazador hidrolizable es un enlazador de tioéter (tal como, por ejemplo, un tioéter acoplado al agente terapéutico mediante un enlace de acilhidrazona (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 5.622.929).
En otras realizaciones adicionales, el enlazador es escindible en condiciones reductoras conocidas en la técnica. (Véanse, por ejemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., En Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Véase también la Patente de EE.UU N.° 4.880.935). El enlazador también puede escindirse en condiciones reductoras que se encuentran intracelularmente (o extracelularmente). Por ejemplo, en una realización preferida, el enlace N-O del enlazador específico puede reducirse y romperse formalmente para dar como resultado una escisión del enlazador. En otras realizaciones adicionales, la unidad de anticuerpo no es escindible y el fármaco se libera mediante degradación del anticuerpo. (Véase la publicación PCT N.° WO2012/166560 (Ambrx, Inc.).
En otras realizaciones no mutuamente excluyentes, el enlazador promueve la internalización celular como se conoce en la técnica.
Una diversidad de enlazadores ilustrativos que pueden usarse con las presentes composiciones y métodos se describen en el documento WO 2004/010957, la Publicación de EE.UU. N.° 2006/0074008, la Publicación de EE.UU. N.° 20050238649 y la Publicación de EE.UU. N.° 2006/0024317.
En una realización preferida, el LU de la presente invención se denota AGL y se conoce comúnmente como ácido 2-(aminooxi)acético o C2H5NO3.
VI.) La unidad ensanchadora
La unidad ensanchadora (A), cuando está presente, tiene la capacidad de enlazar una unidad de Anticuerpo a una unidad de Aminoácido (-W-), si está presente, a una unidad espaciadora (-Y-), si está presente; o a una unidad de Fármaco (-D). Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes en un MAb FLT3 (por ejemplo, CHv62.21 o CHv62.21pAF), ya sea de forma natural o mediante manipulación química incluyen, pero no se limitan a, ceto, aldehido, sulfhidrilo, amino, hidroxilo, el grupo hidroxilo anomérico de un carbohidrato y carboxilo. Los grupos funcionales adecuados son ceto, aldehído, sulfhidrilo y amino. En un ejemplo, el grupo ceto está en un aminoácido no natural (nnAA) incorporado en el Mab de la invención. En un ejemplo adicional, el grupo aldehído está en un nnAA incorporado en el Mab de la invención. En otro ejemplo, pueden generarse grupos sulfhidrilo mediante reducción de los enlaces disulfuro intramoleculares de un MAb FLT3. En otra realización, pueden generarse grupos sulfhidrilo mediante la reacción de un grupo amino de un resto de lisina de un MAb FLT3 con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) u otros reactivos generadores de sulfhidrilos. En determinadas realizaciones, el MAb FLT3 es un anticuerpo recombinante y está diseñado para llevar una o más lisinas. En otras realizaciones determinadas, el MAb FLT3 recombinante está diseñado para llevar grupos sulfhidrilo adicionales, por ejemplo, cisteínas adicionales. En una realización, la unidad ensanchadora forma un enlace oxima con un grupo ceto de la unidad Anticuerpo. El grupo ceto está presente en un nnAA incorporado en el MAb.
Ha de entenderse a partir de todas las realizaciones ilustrativas que incluso cuando no se indica expresamente, pueden enlazarse de 1 a 20 restos de fármaco a un Anticuerpo (p = 1-20).
La unidad de aminoácido
La unidad de aminoácido (-W-), cuando está presente, enlaza la unidad ensanchadora a la unidad espaciadora en caso de que esté presente la unidad espaciadora, enlaza la Unidad ensanchadora con el Resto del fármaco si está ausente la Unidad separadora, y enlaza la Unidad de anticuerpo con la Unidad del fármaco si están ausentes las Unidades ensanchadora y separadora.
Ww- puede ser, por ejemplo, una unidad de monopéptido, dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido. Cada unidad -W- independientemente tiene la fórmula indicada a continuación entre corchetes y w es un número entero que varía de 0 a 12:
Figure imgf000033_0001
en donde R19 incluye pero no se limita a hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH20H, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)aNHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4-piridilmetil-, fenilo, ciclohexilo. Para referencia adicional, véanse (documentos US2014/0072586 y WO2012/047724).
En determinadas realizaciones, la unidad de aminoácido puede comprender aminoácidos naturales. En otras realizaciones, la unidad de aminoácido puede comprender aminoácidos no naturales.
En algunas realizaciones, la unidad de aminoácido puede escindirse enzimáticamente por una o más enzimas, incluyendo una proteasa asociada a cáncer o a tumores, para liberar la Unidad de fármaco (-D), que en una realización se protona in vivo tras la liberación para proporcionar un Fármaco (D).
En un aspecto de la unidad de aminoácido, la unidad de aminoácido es valina-citrulina (vc o Val-Cit). En otro aspecto, la unidad de aminoácido es fenilalanina-lisina (es decir, fk). En otro aspecto más de la unidad de aminoácido, la unidad de aminoácido es N-metilvalina-citrulina.
VII. ) La unidad espaciadora
La unidad espaciadora (-Y-), cuando está presente, enlaza una unidad de Aminoácido con la unidad de fármaco cuando está presente una Unidad de aminoácido. Como alternativa, la Unidad espaciadora une la Unidad ensanchadora con la Unidad de fármaco cuando la Unidad de aminoácido está ausente. La Unidad espaciadora también une la Unidad de fármaco con la Unidad de anticuerpo cuando están ausentes tanto la Unidad de aminoácido como la Unidad ensanchadora. Las unidades espaciadoras son de dos tipos generales: no autoinmolables o autoinmolables. Se conocen en la técnica ejemplos de posibles espaciadores de la invención. Véanse, Toki et al., 2002, J. Org. Chem. 67:1866-1872 y Nature Biotechnology 21(7):778-784).
Otros ejemplos de espaciadores de autoinmolación incluyen, pero no se limitan a, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) y orto o para-aminobencilacetales. Pueden usarse separadores que experimenten una ciclación tras la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas del ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillo biciclo[2.2.1 ] y biciclo[2.2.2] apropiadamente sustituidos (Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) y amidas del ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). La eliminación de fármacos que contienen amina que están sustituidos en la posición a de la glicina (Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27: 1447) son también ejemplos de espaciadores autoinmolables.
VIII. ) La unidad de fármaco
La Unidad de Fármaco (D) puede ser cualquier agente terapéutico. Por ejemplo, la Unidad de Fármaco puede ser una fracción que es un agente citotóxico, citostático o inmunomodulador (por ejemplo, inmunosupresor) o quimioterapéutico. D es una unidad (fracción) de fármaco que tiene un átomo que puede formar un enlace con la Unidad espaciadora (si está presente), con la Unidad de aminoácidos (si está presente), con la Unidad ensanchadora (si está presente) o con la Unidad de anticuerpo. En algunas realizaciones, la Unidad de fármaco D tiene un átomo de nitrógeno que puede formar un enlace con la unidad separadora (si se usa). Como se usa en el presente documento, las expresiones "Unidad de fármaco" y "Fracción de fármaco" son sinónimas y se usan de forma indistinta.
Las clases útiles de agentes citotóxicos o inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, agentes antitubulina, aglutinantes del surco menor del ADN, inhibidores de la replicación del ADN y agentes alquilantes. En algunas realizaciones, el fármaco es una auristatina, tal como auristatina E (también conocida en la técnica como derivado de dolastatina-10) o un derivado de la misma. Otras auristatinas típicas incluyen AFP, MMAF y MMAE. La síntesis y estructura de auristatinas ilustrativas se describen en las Patentes de EE.UU. N.° 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; y 4.486.414.
En algunas realizaciones, la Unidad de fármaco es una calicheamicina, camptotecina, un maitansinoide o una antraciclina. En algunas realizaciones, el fármaco es un taxano, un inhibidor de la topoisomerasa, un alcaloide vinca o similar.
En algunas realizaciones típicas, los agentes citotóxicos adecuados incluyen, por ejemplo, aglutinantes de la ranura menor del ADN (por ejemplo, enediinas y lexitropsinas, un compuesto CBI; véase también la Patente de EE.UU. N.° 6.130.237), duocarmicinas, taxanos (por ejemplo, paclitaxel y docetaxel), puromicinas y alcaloides vinca. Otros agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, CC-1065, SN-38, topotecán, morfolino-doxorrubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, discodermolida, eleuterobina, y mitoxantrona.
En algunas realizaciones, el fármaco es un agente antitubulina. Los ejemplos de agentes antitubulina incluyen, auristatinas, taxanos (por ejemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik) y alcaloides vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina). Otros agentes antitubulina incluyen, por ejemplo, derivados de bacatina, análogos de taxanos (por ejemplo, epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcimida, estramustina, criptoficinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatinas, discodermólido y eleuterobina.
En determinadas realizaciones, el agente citotóxico es un maitansinoide, otro grupo de agentes antitubulina. Por ejemplo, en realizaciones específicas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 (ImmunoGen, Inc.; véase también Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131).
En determinadas realizaciones, el agente citotóxico o citostático es una dolastatina. En determinadas realizaciones, el agente citotóxico o citostático es de la clase auristatina.
En una realización adicional, las Unidades de fármaco son análogos de péptidos de dolaproína-dolaisoleuina novedosos. Por lo tanto, se proporcionan en el presente documento compuestos de Fórmula (I):
Figure imgf000034_0001
en donde
R1 y R2 son cada uno independientemente -H o alquilo;
X es -O-, -NRz-, -S- o está ausente;
en donde Rz es -H o alquilo;
R3 es un grupo de fórmula:
Figure imgf000034_0002
en donde R15 y R16 son cada uno independientemente -H, -OH, -NH2, -SH, -N3, alquilo, alquenilo, alquinilo, -alquil-OH, -alquil-NH2 , -alquil-SH o -alquil-N3 ;
R4 es un grupo de fórmula:
Figure imgf000034_0003
en donde R17 y R18 son cada uno independientemente -H, -OH, -NH2 , -SH, -N3 , -CO2H, alquilo, alquenilo, alquinilo, -alquil-OH, -alquil-NH2 , -alquil-SH, -alquil-N3 o -alquil-CO2H
R5 es sec-butilo o isobutilol;
R6 es -H o alquilo;
R7 y R8 son cada uno independientemente -H, alquilo, -CO2Ra , CONRbRc , fenilo sustituido o no sustituido o anillo heterocíclico sustituido o no sustituido;
en donde Ra es -H o alquilo;
Rb y Rc son cada uno independientemente H o alquilo;
R9 es -H o alquilo; o R9 se toma junto con R4 y los átomos a los cuales está unido para formar un anillo de h eterocicloalquilo sustituido o no sustituido;
R10 es -H o alquilo;
R11 es -H o alquilo;
R12 es -H o alquilo;
R13 es -H o alquilo; y
R14 es -H, -OH o alquilo;
con la condición de que cuando X esté ausente y R15, R16, R17 y R18 sean cada uno metilo, entonces R8 no sea fenilo sustituido o no sustituido o anillo heterocíclico sustituido o no sustituido;
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
En algunas realizaciones, R1 y R2 son cada uno independientemente -H o alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6. En algunas realizaciones, R1 y R2 son cada uno independientemente -H o metilo. En algunas realizaciones, R1 y R2 son cada uno independientemente alquilo. En algunas realizaciones, R1 y R2 son ambos metilo. En algunas realizaciones, R1 y R2 son ambos -H.
En algunas realizaciones, X está ausente. En otras realizaciones, X es -O-. En algunas realizaciones, R1 y R2 son cada uno independientemente alquilo y X está ausente. En algunas realizaciones, R1 y R2 son ambos metilo y X está ausente. En otras realizaciones, R1 y R2 son ambos -H y X es -O-. En algunas realizaciones, X es -NRz-, en donde Rz es -H o alquilo. En algunas realizaciones, Rz es -H. En algunas realizaciones, X es Rz es alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6 o metilo.
En determinadas realizaciones, R3 es
Figure imgf000035_0001
en donde R15 y R16 son cada uno independientemente -H, -OH, -NH2, -SH, -N3, alquilo, alquenilo, alquinilo, -alquil-OH, -alquil-NH2, -alquil-SH o -alquil-N3. En otras realizaciones más, R15 y R16 son cada uno independientemente -H, alquilo, -(CH2)o-6CECH, -(CH2)o-6CH=CH2, -(CH2)o-6OH, -(CH2)o-6NH2, -(CH2)o-6SH o -(CH2)o-6N3. En algunas realizaciones, R15 y R16 son cada uno independientemente -H, -OH o alquilo. En algunas realizaciones, R15 y R16 son cada uno independientemente -H, -OH o metilo. En algunas realizaciones, R15 es -OH y R16 es hidrógeno. En algunas realizaciones, R15 es -OH y R16 es metilo.
En determinadas realizaciones, R3 está en la configuración estereoquímica R con respecto al resto de la molécula. En otras realizaciones, R3 está en la configuración estereoquímica S con respecto al resto de la molécula. En determinadas realizaciones, el propio grupo R3 contiene uno o más centros quirales y esos estereocentros están cada uno independientemente en la configuración R o S.
En determinadas realizaciones, R4 es
Figure imgf000035_0002
en donde R17 y R18 son cada uno independientemente -H, -OH, -NH2, -SH, -N3 , -CO2H, alquilo, alquenilo, alquinilo, -alquil-OH, -alquil-NH2 , -alquil-SH, -alquil-N3 o -alquil-CO2H. En otras realizaciones, R4 es
Figure imgf000035_0003
en donde R17 es -H, -OH, -NH2, -SH, -N3 , -CO2H, alquilo, alquenilo, alquinilo, -alquil-OH, -alquil-NH2 , -alquil-SH, -alquil-N3 o -alquil-CO2H y R18 es -H, -OH, -NH2 , -SH, -N3, -CO2H, alquenilo, alquinilo, -alquil-OH, -alquil-NH2, -alquil-SH, -alquil-N3 o -alquil-CO2H. En otras realizaciones más, R17 y R18 son cada uno independientemente -H, alquilo, -(CH2)o-6CECH, -(CH2)o-6CH=CH2, -(CH2)o-6OH, -(CH2)o-6NH2 , -(CH2)o-6SH o -(CH2)o-6N3. En algunas realizaciones, R17 y R18 son cada uno independientemente -H, -OH, -NH2 , -SH, -N3, -CO2H, alquilo, -alquil-NH2 o -alquil-N3. En algunas realizaciones, R17 y R18 son cada uno independientemente -H, -OH, -NH2 , -SH, -N3, -CO2H, metilo, -CH2NH2 o -CH2N3.
En determinadas realizaciones, R4 se toma junto con R9 y los átomos a los cuales está unido para formar un anillo de heterocicloalquilo sustituido o no sustituido. En determinadas realizaciones, R4 se toma junto con R9 y los átomos a los cuales está unido para formar un anillo de heterocicloalquilo de 5 a 7 miembros, que puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos seleccionados de -OH, -NH2 , -SH y -N3. En determinadas realizaciones, el anillo heterocicloalquilo es un anillo de pirrolidina, que puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos seleccionados de -OH, -NH2 , -SH y -N3.
En determinadas realizaciones, R4 está en la configuración estereoquímica R con respecto al resto de la molécula. En otras realizaciones, R4 está en la configuración estereoquímica S con respecto al resto de la molécula. En determinadas realizaciones, el propio grupo R4 contiene uno o más centros quirales y esos estereocentros están cada uno independientemente en la configuración R o S.
En determinadas realizaciones, R5 es sec-butilo. En otras realizaciones, R5 es isobutilo. En determinadas realizaciones, R5 está en la configuración estereoquímica R con respecto al resto de la molécula. En otras realizaciones, R5 está en la configuración estereoquímica S con respecto al resto de la molécula. En algunas realizaciones, el centro quiral dentro del grupo R5 está en la configuración R y, en otras realizaciones, ese centro está en la configuración S.
En determinadas realizaciones, R6 es -H. En otras realizaciones, R6 es alquilo, por ejemplo, alquilo C1-8, alquilo C1-4, metilo o etilo.
En algunas realizaciones, R7 y R8 son cada uno independientemente -H, alquilo, -CO2Ra o -CONRbRc; en donde Ra es -H o alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6 o metilo; y Rb y Rc son cada uno independientemente - H o alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6 o metilo.
En determinadas realizaciones, R7 y R8 son cada uno independientemente un fenilo sustituido o no sustituido o un anillo heterocíclico sustituido o no sustituido, en donde el fenilo o el anillo heterocíclico puede estar sustituido con uno o más grupos seleccionados de halo, oxo, hidroxi, amino, alquilo y alcoxi. En otras realizaciones determinadas, R7 es un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros no sustituido. En otras realizaciones determinadas, R7 es un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros sustituido. En otras realizaciones determinadas, R8 es fenilo que está opcionalmente sustituido con halo.
En determinadas realizaciones, R7 está en la configuración estereoquímica R con respecto al resto de la molécula. En otras realizaciones, R7 está en la configuración estereoquímica S con respecto al resto de la molécula.
En determinadas realizaciones, R8 está en la configuración estereoquímica R con respecto al resto de la molécula. En otras realizaciones, R8 está en la configuración estereoquímica S con respecto al resto de la molécula.
En algunas realizaciones, R7 es -CO2Ra -CONRbRc; tetrazolilo o tiazolilo, en donde Ra es -H o alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6 o metilo; y Rb y Rc son cada uno independientemente - H o alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6 o metilo; y R8 es fenilo que está opcionalmente sustituido con halo.
En algunas realizaciones, R9 es -H. En otras realizaciones, R9 es alquilo, por ejemplo, alquilo C1-8, alquilo C1-4, metilo o etilo. En algunas realizaciones, R9 es -H o metilo. En algunas realizaciones, R9 es metilo.
En algunas realizaciones, R10 es -H. En otras realizaciones, R10 es alquilo, por ejemplo, alquilo C1-8, alquilo C1-4, metilo o etilo. En algunas realizaciones, R10 es -H o metilo. En algunas realizaciones, R10 es metilo.
En algunas realizaciones, R11 es -H. En otras realizaciones, R11 es alquilo, por ejemplo, alquilo C1-8, alquilo C1-4, metilo o etilo. En algunas realizaciones, R11 es -H o metilo. En algunas realizaciones, R11 es metilo.
En algunas realizaciones, R12 es -H. En otras realizaciones, R12 es alquilo, por ejemplo, alquilo C1-8, alquilo C1-4, metilo o etilo. En algunas realizaciones, R12 es -H o metilo. En algunas realizaciones, R12 es metilo.
En algunas realizaciones, R13 es -H. En otras realizaciones, R13 es alquilo, por ejemplo, alquilo C1-8, alquilo C1-4, metilo o etilo. En algunas realizaciones, R13 es -H o metilo. En algunas realizaciones, R13 es metilo.
En algunas realizaciones, R14 es -H. En algunas realizaciones, R14 es alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6, metilo o etilo. En algunas realizaciones, R14 es -OH.
En determinadas realizaciones, R14 está en la configuración estereoquímica R con respecto al resto de la molécula. En otras realizaciones, R14 está en la configuración estereoquímica S con respecto al resto de la molécula.
En algunas realizaciones, R7 es -CO2Ra , en donde Ra es -H o alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6 o metilo; R8 es fenilo; y R14 es -H. En algunas realizaciones, R7 es -CONRbRc, en donde Rb y Rc son cada uno independientemente - H o alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6 o metilo; R8 es fenilo; y R14 es -H. En algunas realizaciones, R7 es alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6 o metilo; R8 es fenilo; y R14 es -OH. En algunas realizaciones, R7 es metilo, R8 es fenilo y R14 es -Oh . En algunas realizaciones, R7 y R14 son ambos -H y R8 es piridinilo, piperidinilo, fenilo no sustituido o fenilo sustituido con halo, por ejemplo fluoro, cloro o bromo. En algunas realizaciones, R7 es -CO2Ra, en donde Ra es -H o alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6 o metilo; R8 es -H o alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6 o metilo; y R14 es alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6, metilo o etilo. En algunas realizaciones, R7 es -CO2Ra, en donde Ra es -H o alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6 o metilo; R8 es -H o alquilo, por ejemplo, alquilo C1-6 o metilo; y R14 es -OH.
En determinadas realizaciones,
R1 y R2 son cada uno independientemente -H o alquilo C1-6;
X es -O- o está ausente;
R3 es
Figure imgf000037_0001
en donde R15 y R16 son cada uno independientemente -H, -OH o alquilo C1-6;
R4 es
Figure imgf000037_0002
en donde R17 es -OH, -NH2 , -SH, -N3, -CO2H, -alquil C1.6-NH2 , alquinilo, alquenilo o -alquil C1-6-N3; y R18 es -H o alquilo C1-6;
R5 es sec-butilo;
R6 es -H;
R7 es -H, alquilo C1-6, -CO2Ra, -CONRbRc , tetrazolilo o tiazolilo; en donde Ra es -H o alquilo C1-6; y Rb y Rc son cada uno - H o alquilo C1-6;
R8 es -H, alquilo C1.6, fenilo sustituido o no sustituido o anillo heterocíclico sustituido o no sustituido;
R9 es -H;
R10, R11, R12 y R13 son cada uno independientemente alquilo C1-6; y
R14 es -H, alquilo C1.6 u -OH.
En determinadas realizaciones,
R1 y R2 son cada uno independientemente -H o metilo;
X es -O- o está ausente; R3 es
Figure imgf000037_0003
en donde R15 y R16 son cada uno independientemente -H, -OH o metilo;
R4 es
Figure imgf000037_0004
en donde R17 es -OH, -NH2 , -SH, -N3, -CO2H, aminometilo, alquinilo, alquenilo o azidometilo; y R18 es -H o metilo; R5 es sec-butilo;
R6 es -H;
R7 es -H, metilo, -CO2Ra o -CONRbRc ; en donde Ra es -H o metilo; y Rb y Rc son cada uno - H o metilo;
R8 es -H, metilo, etilo, piridinilo, piperidinilo, fenilo no sustituido, fenilo sustituido con halo;
R9 es -H;
R10, R11, R12 y R13 sean cada uno metilo; y
R14 es -H, metilo u -OH.
En determinadas realizaciones,
R1 y R2 son cada uno independientemente -H o alquilo C1-6;
X está ausente;
R3 es
Figure imgf000038_0001
en donde R15 y R16 son cada uno independientemente -H, -OH o alquilo Ci-a;
R4 es
Figure imgf000038_0002
en donde R17 es -N3 y R18 es -H o metilo;
R5 es sec-butilo;
Ra es -H;
R7 es -H, alquilo C1-a, -CO2Ra, -CONRbRc, tetrazolilo o tiazolilo; en donde Ra es -H o alquilo C1-a; y Rb y Rc son cada uno - H o alquilo C1-a;
R8 es -H, alquilo C1-a, fenilo sustituido o no sustituido o anillo heterocíclico sustituido o no sustituido;
R9 es -H;
R10, R11, R12 y R13 son cada uno independientemente alquilo C1-a; y
R14 es -H, alquilo C|.a u -OH.
En determinadas realizaciones,
R1 y R2 son cada uno independientemente -H o alquilo C1-a;
X es -O-;
R3 es
Figure imgf000038_0003
en donde R15 y R1a son cada uno independientemente -H, -OH o alquilo C1-a;
R4 es
Figure imgf000038_0004
en donde R17 es -N3 y R18 es -H o metilo;
R5 es sec-butilo;
Ra es -H;
R7 es -H, alquilo C1-a, -CO2Ra, -CONRbRc , tetrazolilo o tiazolilo; en donde Ra es -H o alquilo C1-a; y Rb y Rc son cada uno - H o alquilo C1-a;
R8 es -H, alquilo C1-a, fenilo sustituido o no sustituido o anillo heterocíclico sustituido o no sustituido;
R9 es -H;
R10, R11, R12 y R13 son cada uno independientemente alquilo C1-a; y
R14 es -H, alquilo C1-a u -OH.
En algunas realizaciones de Fórmula (I), en donde,
R1 y R2 sean cada uno metilo;
X está ausente;
R3 es un grupo de fórmula:
Figure imgf000038_0005
en donde R15 y R1a son cada uno metilo;
R4 es un grupo de fórmula:
Figure imgf000039_0001
en donde R17 es -N3, -NH2, -OH, -SH y R18 es -H o metilo;
R5 es sec-butilo;
R6 es -H;
R7 es -CO2Ra o CONRbRc,
en donde Ra es -H o alquilo C1-6;
Rb y Rc son cada uno independientemente H o alquilo C1-6;
R8 es fenilo;
R9 es -H;
R10, R11, R12 y R13 son cada uno independientemente metilo; y
R14 es -H.
En algunas realizaciones de Fórmula (I), en donde,
R1 y R2 son cada uno -H;
X es -O-;
R3 es un grupo de fórmula:
Figure imgf000039_0002
en donde R15 y R16 son cada uno metilo;
R4 es un grupo de fórmula:
Figure imgf000039_0003
en donde R17 es -N3 y R18 es -H o metilo;
R5 es sec-butilo;
R6 es -H;
R7 es -CO2Ra o CONRbRc,
en donde Ra es -H o alquilo C1-6;
Rb y Rc son cada uno independientemente H o alquilo C1-6;
R8 es fenilo;
R9 es -H;
R10, R11, R12 y R13 son cada uno independientemente metilo; y
R14 es -H.
Debe entenderse que cualquier definición de grupo variable proporcionada en el presente documento puede usarse en combinación con cualquier otra definición de grupo variable proporcionada en el presente documento, de tal manera que todas las posibles combinaciones y permutaciones de grupos variables proporcionadas en el presente documento, cuando sea químicamente factible, se contemplan.
En determinadas realizaciones, los compuestos de Fórmula (I) se seleccionan del grupo que consiste en:
2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-3-hidroxi-N-metilpropanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metilo;
2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3R)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-3-hidroxi-N-metilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanamido)-3-fenilpropanoato de (S)-metilo;
(S)-2-(dimetilamino)-N-((S)-3-hidroxi-1-(((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-((2-(piridin-2-il)etil)amino)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-1-oxopropan-2-il)-3-metilbutanamida;
(2S,3R)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-3-hidroxi-N-((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi 2-met¡l-3-oxo-3-((2-(p¡nd¡n-2-¡l)et¡l)am¡no)prop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l)-N-met¡lbutanam¡da;
(2S)-2-(d¡met¡lam¡no)-N-((2S)-3-h¡droxM-(((3R,4S,5S)-3-metoxM-((2S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-((2-(p¡per¡d¡n-2-¡l)et¡l)am¡no)prop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)(met¡l)am¡no)-1-oxopropan-2-¡l)-3-met¡lbutanam¡da;
(2S,3R)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-3-h¡drox¡-N-((3R,4S,5S)-3-metox¡-1-((2S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-((2-(p¡per¡d¡n-2-¡l)et¡l)am¡no)prop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-N-met¡lbutanam¡da;
2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-az¡do-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropanoato de (S)-met¡lo;
2- ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-am¡no-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-met¡lpropanam¡do)-3- metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropanoato de (S)-met¡lo;
(S)-N-((S)-3-am¡no-1-(((3R,4S,5S)-3-metox¡-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-((2-(p¡r¡d¡n-2-¡l)et¡l)am¡no)prop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)(met¡l)am¡no)-1-oxopropan-2-¡l)-2-(d¡met¡l-am¡no)-3-met¡lbutanam¡da;
2- ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-az¡do-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-met¡lpropanam¡do)-3- metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropanoato de (S)-met¡lo;
2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-4-az¡do-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropanoato de (S)-met¡lo;
2- ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-4-am¡no-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-met¡lbutanam¡do)-3- metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropanoato de (S)-met¡lo;
(S)-2-((S)-2-(am¡noox¡)-3-met¡lbutanam¡do)-N-((3R,4S,5S)-3-metox¡-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-((2-(p¡r¡d¡n-2-¡l)et¡l)am¡no)prop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-N,3-d¡met¡lbutanam¡da;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(d¡met¡lammo)-3-h¡drox¡propanam¡do)-N,3-d¡met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-fen¡lalan¡na;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((2S,3R)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-h¡drox¡butanam¡do)-N,3-d¡met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-fen¡lalan¡na;
ác¡do (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-az¡do-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropano¡co;
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-am¡no-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l)am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l)-2-((2S,3R)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-h¡drox¡butanam¡do)-N,3-d¡met¡lbutanam¡da;
(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-am¡no-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l)am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-h¡drox¡propanam¡do)-N,3-d¡met¡lbutanam¡da;
2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((R)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-3-mercapto-N-met¡lpropanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropanoato de (S)-met¡lo;
ác¡do (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((R)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-3-mercapto-N-met¡lpropanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropano¡co; ác¡do (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-3-h¡drox¡-N-met¡lpropanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropano¡co; ác¡do (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3R)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-3-h¡drox¡-N-met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropano¡co;
2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(d¡met¡lammo)-3-h¡drox¡propanam¡do)-N,3-d¡met¡l-butanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropanoato de (S)-met¡lo;
2- ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((2S,3R)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-h¡drox¡butanam¡do)-N,3-d¡met¡lbutanam¡do)-3- metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropanoato de (S)-met¡lo;
2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-am¡no-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropanoato de (S)-met¡lo;
ác¡do (S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-am¡no-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropanam¡do)-3-fen¡lpropano¡co;
(25.35) -3-az¡do-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-((3R,4S,5S)-3-metox¡-1-((S)-2-((lR,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-(fenet¡lam¡no)prop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-N-met¡lbutanam¡da;
(25.35) -3-az¡do-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-h¡drox¡-1-fen¡lpropan-2-¡l)am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxo-heptano-4-¡l)-N-met¡lbutanam¡da;
(25.35) -3-az¡do-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-clorofenet¡l)am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-met¡lbutanam¡da;
(25.35) -3-az¡do-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-clorofenet¡l)am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡d¡n-1- ¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-met¡lbutanam¡da;
(25.35) -3-am¡no-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-((3R,4S,5S)-3-metox¡-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2- met¡l-3-oxo-3-(fenet¡lam¡no)prop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-N-met¡lbutanam¡da;
(25.35) -3-am¡no-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-h¡drox¡-1-fen¡lpropan-2-¡l)am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxo-heptano-4-¡l)W-met¡lbutanam¡da;
(25.35) -3-am¡no-A/-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-dorofenet¡l)am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡dm-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-W-met¡lbutanam¡da;
(25.35) -3-am¡no-A/-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-dorofenet¡l)am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡dm-1- ¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-W-met¡lbutanam¡da;
(S)-4-am¡no-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-W-((3R,4S,5S)-3-metox¡-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-(fenet¡lam¡no)prop¡l)p¡rrol¡dm-1-¡l)-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-W-met¡lbutanam¡da;
(S)-4-am¡no-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-W-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-h¡drox¡-1-femlpropan-2-¡l)ammo)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡dm-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxo-heptano-4-¡l)-W-met¡lbutanam¡da;
(S)-4-am¡no-W-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-dorofenet¡l)ammo)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-W-met¡lbutanam¡da;
(S)-4-am¡no-W-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-dorofenet¡l)ammo)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-3- metox¡-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l)-2-((S)-2-(d¡met¡lammo)-3-met¡lbutanam¡do)-W-met¡lbutanam¡da;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(d¡met¡lammo)-3-met¡lbutanam¡do)-W-met¡lpent-4-mam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo;
(25.35) -W-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-ammo-1-oxo-3-femlpropan-2-¡l)ammo)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rral¡d¡n-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-3-az¡do-2-((S)-2-(d¡met¡lammo)-3-met¡lbutanam¡do)-W-met¡lbutanam¡da;
(25.35) -3-az¡do-2-((S)-2-(d¡met¡lammo)-3-met¡lbutanam¡do)-W-((3R,4S,5S)-3-metox¡-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2- met¡l-3-oxo-3-((2-(p¡nd¡n-2-¡l)et¡l)ammo)prap¡l)p¡rral¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-W-met¡lbutanam¡da; (25.35) -3-az¡do-W-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(terc-but¡lam¡no)-1-oxo-3-femlpmpan-2-¡l)am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-W-met¡lbutanam¡da;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-az¡do-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-W-met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-val¡nato de met¡lo;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-6-am¡no-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-A/-met¡l-hexanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,4S)-4-az¡do-1-(d¡met¡l-L-val¡lo)-A/-met¡lp¡rrol¡d¡n-2-carboxam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo;
ác¡do (S)-3-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-4-(((3R,4S,5S)-3-metox¡-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-3-(((S)-1- metox¡-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l)am¡no)-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)(met¡l)am¡no)-4- oxobutano¡co;
(2S,3R)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-3-h¡drox¡-W-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-h¡droxM-femlpropan-2-¡l)am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡dm-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l)-W-met¡lbutanam¡da;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N,3-d¡met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-ser¡nato de met¡lo;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-az¡do-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-W-met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-¡soleuc¡nato de met¡lo; (25.35) -3-am¡no-A/-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-am¡no-1-oxo-3-femlpropan-2-¡l)am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡dm-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-2-((S)-2-(d¡met¡lammo)-3-met¡lbutanam¡do)-W-met¡lbutanam¡da;
(25.35) -3-am¡no-A/-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(terc-but¡lammo)-1-oxo-3-femlpropan-2-¡l)ammo)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-W-met¡lbutanam¡da;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-az¡do-W-met¡l-2-((S)-3-met¡l-2-(met¡lammo)butanam¡do)propanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-az¡do-W-met¡l-2-((S)-3-met¡l-2-(met¡lam¡no)butanam¡do)butanam¡do)-3- metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-fen¡lalan¡nato de met¡lo;
(25.35) -W-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-ammo-1-oxo-3-femlpropan-2-¡l)ammo)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rral¡d¡n-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-3-az¡do-W-met¡l-2-((S)-3-met¡l-2-(met¡lam¡no)butanam¡do)butanam¡da;
((2S,3S)-3-az¡do-W-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(terc-but¡lam¡no)-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l)am¡no)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxoprop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-3-metox¡-5-met¡M-oxoheptan-4-¡l)-W-met¡l-2-((S)-3-met¡l-2-(met¡lam¡no)butanam¡do)butanam¡da;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-az¡do-W-met¡l-2-((S)-3-met¡l-2-(met¡lam¡no)butanam¡do)butanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-fen¡lalan¡nato de terc-but¡lo;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-az¡do-W-met¡l-2-((S)-3-met¡l-2-(met¡lam¡no)butanam¡do)butanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-fen¡lalan¡na;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-az¡do-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-1-met¡lbutanam¡do)-W-met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)p¡rrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-fen¡lalan¡nato de tercbut¡lo;
(25.35) -3-az¡do-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-W-((3R,4S,5S)-3-metox¡-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2- met¡l-3-oxo-3-(((S)-2-femM-(1H-tetrazol-5-¡l)et¡l)am¡no)prop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxo-heptan-4-¡l)-A/-met¡lbutanam¡da;
(25.35) -3-az¡do-N-((3R,4S,5S)-3-metoxM-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-met¡l-3-oxo-3-(((S)-2-fen¡M-(1H-tetrazol-5-¡l)et¡l)am¡no)prop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-N-met¡l-2-((S)-3-met¡l-2-(metilamino)butanam¡do)butanam¡da;
(25.35) -3-azido-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-((3R,4S,5S)-3-metox¡-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-(((S)-2-fen¡l-1-(t¡azol-2-¡l)etil)am¡no)prop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-N-metilbutanamida;
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-am¡no-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanamido)-N-met¡lbutanam¡do)-3-metox¡-5-met¡lheptano¡l)pirrol¡d¡n-2-¡l)-3-metox¡-2-met¡lpropano¡l)-L-fen¡lalan¡nato de tercbutilo;
(25.35) -3-amino-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-((3R,4S,5S)-3-metox¡-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-(((S)-2-fen¡l-1-(1H-tetrazol-5-¡l)etil)am¡no)prop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxo-heptan-4-¡l)-N-metilbutanamida; y
(25.35) -3-amino-2-((S)-2-(d¡met¡lam¡no)-3-met¡lbutanam¡do)-N-((3R,4S,5S)-3-metox¡-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metox¡-2-met¡l-3-oxo-3-(((S)-2-fen¡l-1-(t¡azol-2-¡l)etil)am¡no)prop¡l)p¡rrol¡d¡n-1-¡l)-5-met¡l-1-oxoheptan-4-¡l)-N-metilbutanamida;
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
En el presente documento también se proporcionan sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de Fórmula (I), preferentemente de los descritos anteriormente y los compuestos específicos ejemplificados en el presente documento, composiciones farmacéuticas que comprenden tales sales y métodos de uso de tales sales.
Una "sal farmacéuticamente aceptable" pretende significar una sal de un ácido o base libre de un compuesto representado en el presente documento que es no tóxico, biológicamente tolerable, o de otro modo biológicamente adecuado para la administración al sujeto. Véase, generalmente, S.M. Berge, et al. "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19. Las sales farmacéuticamente aceptables preferidas son aquellas que son farmacológicamente eficaces y adecuadas para el contacto con los tejidos de sujetos sin indebida toxicidad, irritación o respuesta alérg¡ca. Un compuesto descr¡to en el presente documento puede poseer un grupo suf¡c¡entemente ác¡do, un grupo suf¡c¡entemente bás¡co, o ambos t¡pos de grupos func¡onales, y en consecuenc¡a reacc¡onan con una ser¡e de bases ¡norgán¡cas u orgán¡cas y ác¡dos ¡norgán¡cos y orgán¡cos, formando una sal farmacéut¡camente aceptable. Ejemplos de sales farmacéut¡camente aceptables ¡ncluyen sales de ad¡c¡ón de ác¡do tales como sulfatos, pirosulfatos, bisulfatos, sulfitos, bisulfitos, fosfatos, monohidrógeno-fosfatos, dihidrogenofosfatos, metafosfatos, pirofosfatos, cloruros, bromuros, yoduros, acetatos, propionatos, decanoatos, caprilatos, acrilatos, formiatos, isobutiratos, caproatos, heptanoatos, propiolatos, oxalatos, malonatos, succinatos, suberatos, sebacatos, fumaratos, maleatos, butina-1,4-dioatos, hexina-1,6-dioatos, benzoatos, clorobenzoatos, metilbenzoatos, dinitrobenzoatos, hidroxibenzoatos, metoxibenzoatos, ftalatos, sulfonatos, metilsulfonatos, propilsulfonatos, besilatos, xilenosulfonatos, naftaleno-1-sulfonatos, naftaleno-2-sulfonatos, fenilacetatos, fenilpropionatos, fenilbutiratos, citratos, lactatos, yhidroxibutiratos, glicolatos, tartratos, mandelatos y sales con bases inorgánicas como sodio, potasio, magnesio, calcio, aluminio y similares o bases orgánicas como metilamina, etilamina, etanolamina, lisina, ornitina y similares, sales con diversos aminoácidos o derivados de aminoácidos tales como acetil-leucina y similares, sales de amonio, etc.
Con fines de tratamiento, las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos descritos en el presente documento pueden comprender además uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Un excipiente farmacéuticamente aceptable es una sustancia que no es tóxica y, de otra manera, biológicamente adecuada para la administración a un sujeto. Tales excipientes facilitan la formulación y la administración de un compuesto descrito en el presente documento y son compatibles con el principio activo. Los ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen estabilizantes, lubricantes, tensioactivos, diluyentes, antioxidantes, aglutinantes, agentes colorantes, emulsionantes o agentes modificadores del sabor. En realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas son composiciones estériles.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden formularse como soluciones, emulsiones, suspensiones o dispersiones en disolventes o vehículos farmacéuticos adecuados, o como píldoras, comprimidos, pastillas para chupar, supositorios, polvos para reconstitución, o cápsulas junto con vehículos sólidos de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica para la preparación de diversas formas de dosificación. Para aplicaciones tópicas, los compuestos descritos en el presente documento se formulan preferentemente como cremas o pomadas o un vehículo similar adecuado para la administración tópica. Las composiciones farmacéuticas y los compuestos descritos en el presente documento pueden administrarse en los métodos de la invención mediante una vía de administración adecuada, por ejemplo, oral, nasal, parenteral, rectal, tópica, ocular o por inhalación.
El término "tratar" o "tratamiento" como se usa en el presente documento pretende hacer referencia a la administración de un compuesto descrito en el presente documento a un sujeto con el fin de crear un beneficio terapéutico. El tratamiento incluye revertir, mejorar, aliviar, inhibir el progreso de, o disminuir la gravedad de, una enfermedad, trastorno o afección, o uno o más síntomas de cáncer. El término "sujeto" se refiere a un paciente mamífero que necesita tal tratamiento, tal como un ser humano.
En los métodos de tratamiento proporcionados en el presente documento, "una cantidad eficaz" significa una cantidad o dosis suficiente para producir generalmente el beneficio terapéutico deseado en sujetos que necesitan tal tratamiento. Adicionalmente, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa cualquier cantidad que, en comparación con un sujeto correspondiente que no ha recibido tal cantidad, da como resultado, pero no se limita a, curación, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o efecto secundario, o una disminución en la velocidad de avance de una enfermedad o trastorno. El término también incluye dentro de su alcance cantidades eficaces para mejorar la función fisiológica normal, así como cantidades eficaces para provocar una función fisiológica en un sujeto, por ejemplo, un ser humano, que potencia o ayuda en el efecto terapéutico de un segundo agente farmacéutico. Las cantidades eficaces, incluyendo cantidades terapéuticamente eficaces, o las dosis de los compuestos descritos en el presente documento pueden determinarse mediante métodos de rutina, tales como modelado, escalada de dosis o ensayos clínicos, teniendo en cuenta factores de rutina, por ejemplo, el modo o vía de administración o suministro del fármaco, la farmacocinética del agente, la gravedad y el transcurso de la enfermedad, el estado de salud del sujeto, la condición y el peso y el criterio del médico tratante. Una dosis ilustrativa para los conjugados de anticuerpo-fármaco desvelados en el presente documento está en el intervalo de aproximadamente 1 ug a 2 mg de compuesto activo por kilogramo de peso corporal del sujeto por día, preferentemente de aproximadamente 0,05 a 100 mg/kg/día, o de aproximadamente 1 a 35 mg/kg/día, o de aproximadamente 0,1 a 10 mg/kg/día. La dosificación total puede administrarse en unidades de dosificación únicas o divididas (por ejemplo, BID, TID, QID).
Los compuestos descritos en el presente documento pueden usarse en composiciones o métodos farmacéuticos en combinación con principios activos adicionales en el tratamiento del cáncer. Los principios activos adicionales pueden administrarse por separado de un compuesto descrito en el presente documento o pueden incluirse con un compuesto descrito en el presente documento en una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento. Por ejemplo, los principios activos adicionales son aquellos que se sabe o se descubre que son eficaces en el tratamiento de cáncer, incluyendo aquellos activos contra otra diana asociada con el cáncer, tales como pero no limitado a, Velcade, Rituximab, Metotrexato, Herceptina, Vincristina, Prednisona, Irinotecán o similares o una combinación de los mismos. Una combinación tal puede servir para aumentar la efectividad, disminuir uno o más efectos secundarios, o disminuir la dosis requerida de un compuesto desvelado.
Los compuestos de Fórmula (I) se describirán ahora con referencia a esquemas sintéticos ilustrativos para su preparación general a continuación y los ejemplos específicos que siguen. Los expertos reconocerán que, para obtener los diversos compuestos del presente documento, los materiales de partida pueden seleccionarse adecuadamente de manera que los sustituyentes finalmente deseados se llevarán a través del esquema de reacción con o sin protección, según sea apropiado, para producir el producto deseado. Como alternativa, puede ser necesario o deseable emplear, en lugar del sustituyente finalmente deseado, un grupo adecuado que pueda usarse a través del esquema de reacción y reemplazarse según sea apropiado con el sustituyente deseado. Además, un experto en la materia reconocerá que pueden usarse grupos protectores para proteger determinados grupos funcionales (amino, carboxi o grupos de cadena lateral) de las condiciones de reacción, y que tales grupos se retiran en condiciones convencionales cuando sea apropiado. Cada una de las reacciones representadas en el Esquema A se ejecuta preferentemente a una temperatura de aproximadamente temperatura ambiente a la temperatura de reflujo del disolvente orgánico usado. A menos que se especifique lo contrario, las variables son como se definieron anteriormente en referencia a la Fórmula (I).
Esquema A
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Con referencia al esquema A, la preparación de compuestos de Fórmula (I) comienza con una forma ácida protegida de dolaisoleuina (Dil) marcada (A) (véase Pettit et al. (1994) J. Org. Chem. 59:1796-1800). El compuesto (A) se representa con un grupo protector de terc-butil éster, pero un experto en la materia puede seleccionar un reemplazo apropiado. El acoplamiento con una valina protegida con nitrógeno o un derivado de isoleucina (B), donde PG es un grupo protector de amino adecuado tal como un grupo Boc (t-butoxicarbonilo) o fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), se efectúa en condiciones convencionales de acoplamiento de péptidos. Por ejemplo, las reacciones se llevan a cabo en presencia de cianofosfonato de dietilo (DEPC), PyBrOP, PyBOP, BOP, diisopropilcarbodiimida (DIC), diciclohexilcarbodiimida (DCC), clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDCI), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), 1-hidroxi-7-aza-benzotriazol (HOAt), HBTU (hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio), HATU (hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio) y similares, o una combinación de los mismos. Las reacciones se realizan típicamente en presencia de una base de amina terciaria, tal como diisopropiletilamina. Los disolventes adecuados incluyen diclorometano, N,N-dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), acetato de etilo y similares. El grupo protector de amino del dipéptido (C) resultante se retira por desprotección en condiciones adecuadas. Por ejemplo, donde PG es un grupo Boc, el compuesto (C) se trata con ácido trifluoroacético para formar la amina libre (D). Donde PG es un grupo Fmoc, el compuesto (C) se trata con piperidina o dietilamina para producir el compuesto (D). El compuesto (D) se acopla después al derivado de aminoácido (E), en forma protegida si es necesario, en condiciones de acoplamiento de péptidos como se describe anteriormente, para generar tripéptido (F). El tratamiento con ácido retira el grupo protector carboxi para proporcionar ácido libre (G).
Con referencia al esquema B, la dolaproína protegida con amino (Dap) designada como (H) (véase Pettit et al. (1994) J. Org. Chem. 59:6287-6295) se acopla con la amina (J) (que se prepara usando métodos conocidos por un expe rto en la materia) en condiciones de acoplamiento de péptidos como se describe anteriormente. El dipéptido resultante (K) se desprotege como se analizó para el Esquema A para proporcionar el compuesto (L).
Esquema C
Acoplamiento de péptido
(G) (L) --------------------------- -- (I)
Refiriéndose al esquema C, el ácido (G) y la amina (L) se acoplan en condiciones de acoplamiento de péptidos como se analizó anteriormente para proporcionar compuestos de Fórmula (I). Cuando el resultado de la reacción es una forma protegida de Fórmula (I), se emplean condiciones de desprotección adecuadas para dar el compuesto diana. También se proporciona en el presente documento una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de al menos un compuesto de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
También se proporciona en el presente documento un método para tratar a un sujeto que padece o ha sido diagnosticado con cáncer, que comprende administrar a un sujeto que necesite dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un compuesto de Fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
También se proporciona en el presente documento el uso de al menos un compuesto de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para el tratamiento de cáncer en un sujeto que necesite dicho tratamiento. También se proporciona en el presente documento el uso de al menos un compuesto de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un sujeto que necesite dicho tratamiento.
También se proporciona en el presente documento un kit que contiene al menos un compuesto de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que necesite dicho tratamiento, e instrucciones para su uso.
También se proporciona en el presente documento un artículo de fabricación que comprende al menos un compuesto de Fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto que necesite dicho tratamiento.
También se proporcionan en el presente documento conjugados de anticuerpo fármaco (ADC) en donde un compuesto de Fórmula (I) se conjuga con un Anticuerpo.
Los ADC ilustrativos que utilizan la Fórmula (I) tienen las siguientes estructuras en donde "L" o "mAb-s-" representan un MAb FLT3 designado CHv62.21 expuesto en el presente documento.
Adicionalmente, os ADC ilustrativos adicionales que utilizan la Fórmula (I) tienen las siguientes estructuras en donde "L" o "mAb-s-" representan un MAb FLT3 designado CHv62.21pAF expuesto en el presente documento.
En una realización preferida, los compuestos de Fórmula (I) comprenden Unidades de Fármaco que comprenden el compuesto denotado (2S,3S)-W-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-amino-1-oxo-3-fen¡lpropan-2-¡l)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-met¡M-oxoheptan-4-il)-3-azido-W-metil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamida.
En una realización preferida, los compuestos de Fórmula (I) comprenden Unidades de Fármaco que comprenden el compuesto expuesto a continuación como Fórmula (II):
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IX. ) Carga de fármaco
La carga de fármaco está representada por p y es el número promedio de restos de fármaco por anticuerpo en una molé cula. La carga de fármaco puede variar de 1 a 20 fracciones de fármaco (D) por anticuerpo. Los ADC de la invención incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con una gama de restos de fármaco, de 1 a 20. El número promedio de fracciones farmacológicas por anticuerpo en preparaciones de ADC procedentes de reacciones de conjugación puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectroscopia de masas y, ensayo ELISA. También puede determinarse la distribución cuantitativa de ADC en términos de p. En algunos casos, la separación, la purificación y la caracterización de los ADC homogéneos donde p es un determinado valor de ADC con otras cargas de fármaco puede lograrse por medios tales como electroforesis.
Para algunos conjugados de anticuerpo fármaco, p puede estar limitado por el número de sitios de fijación del anticuerpo. Por ejemplo, cuando la fijación es un tiol de cisteína, un anticuerpo puede tener únicamente uno o varios grupos tiol de cisteína o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales puede fijarse un enlazador. En determinadas realizaciones, una mayor carga farmacológica, por ejemplo, p > 5, puede provocar agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de la permeabilidad celular de determinados conjugados de anticuerpo fármaco. En determinadas realizaciones, la carga de fármaco para un ADC de la invención varía de 1 a aproximadamente 8; de aproximadamente 2 a aproximadamente 6; de aproximadamente 3 a aproximadamente 5; de aproximadamente 3 a aproximadamente 4; de aproximadamente 3,1 a aproximadamente 3,9; de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,8; de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,7; de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,6; de aproximadamente 3,3 a aproximadamente 3,8; o de aproximadamente 3,3 a aproximadamente 3,7. De hecho, se ha comprobado que, para determinados ADC, la relación óptima de restos de fármaco por anticuerpo puede ser menor de 8, y puede ser aproximadamente 2 a aproximadamente 5.
En determinadas realizaciones, se conjugan menos del máximo teórico de restos farmacológicos con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, restos de lisina que no reaccionan con el intermedio de fármaco enlazador o el reactivo enlazador, como se analiza a continuación. Generalmente, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de cisteína libres y reactivos que puedan enlazarse a una fracción farmacológica; de hecho, la mayoría de los restos tiol de las cisteínas en los anticuerpos se encuentran en forma de puentes disulfuro. En determinadas realizaciones, un anticuerpo puede reducirse con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP), en condiciones reductoras parciales o totales, para generar grupos tiol de cisteína reactivos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo se somete a condiciones desnaturalizantes para revelar grupos nucleófilos reactivos tales como lisina o cisteína.
La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC puede controlarse de maneras diferentes, por ejemplo, mediante: (i) limitación del exceso molar del intermedio fármaco-enlazador o reactivo enlazador con respecto al anticuerpo, (ii) limitación del tiempo o la temperatura de reacción de conjugación, (iii) condiciones reductoras parciales o limitantes para la modificación de tiol de cisteína, (iv) modificación por ingeniería genética mediante técnicas recombinantes la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de manera que el número y la posición de los restos de cisteína se modifiquen para controlar el número y/o la posición de las fijaciones del enlazador-fármaco (tal como tioMab o tioFab preparados como se desvela en el presente documento y el documento WO2006/034488).
Ha de entenderse que cuando más de un grupo nucleófilo reacciona con un intermedio de fármaco-enlazador o reactivo enlazador seguido del reactivo de la fracción de fármaco, después el producto resultante es una mezcla de compuestos ADC con una distribución de uno o más restos de fármaco unidos a un anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo puede calcularse a partir de la mezcla mediante un ensayo de anticuerpos ELISA doble, que es específico del anticuerpo y específico del fármaco. Las moléculas de ADC individuales pueden identificarse en la mezcla mediante espectroscopía de masas y separarse mediante HPLC, por ejemplo, cromatografía de interacción hidrófoba (véanse, por ejemplo, Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Resumen N.° 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 27-31 de marzo de 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, marzo de 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location ofdrug attachment in antibody-drug conjugates", Resumen N.° 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, 27-31 de marzo de 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, marzo de 2004). En determinadas realizaciones, puede aislarse un ADC homogéneo con un único valor de carga de la mezcla de conjugación mediante electroforesis o cromatografía.
X. ) Métodos para determinar el efecto citotóxico de los ADC
Se conocen métodos para determinar si un fármaco o un conjugado de anticuerpo-fármaco ejerce un efecto citostático y/o citotóxico sobre una célula. Generalmente, la actividad citotóxica o citostática de un conjugado de anticuerpo fármaco puede medirse: exponiendo células de mamífero que expresan una proteína diana del conjugado de anticuerpo fármaco en un medio de cultivo celular; cultivando las células durante un periodo de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 días; y midiendo la viabilidad celular. Pueden usarse ensayos in vitro basados en células para medir la viabilidad (proliferación), citotoxicidad e inducción de apoptosis (activación de caspasa) del conjugado de anticuerpo fármaco.
Para determinar si un conjugado de anticuerpo fármaco ejerce un efecto citostático, puede usarse un ensayo de incorporación de timidina. Por ejemplo, pueden cultivarse células cancerosas que expresan un antígeno diana a una dens idad de 5.000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos durante un periodo de 72 horas y exponerse a 0,5 |jCi de 3H-timidina durante las 8 horas finales del periodo de 72 horas. La incorporación de 3H-timidina en células del cultivo se mide en presencia y ausencia del conjugado de anticuerpo fármaco.
Para determinar la citotoxicidad, puede medirse la necrosis o la apoptosis (muerte celular programada). La necrosis normalmente va acompañada de permeabilidad aumentada de la membrana plasmática; hinchamiento de la célula y ruptura de la membrana plasmática. La apoptosis normalmente se caracteriza por la formación de ampollas en la membrana, condensación del citoplasma y la activación de endonucleasas endógenas. La determinación de cualquiera de estos efectos en las células cancerosas indica que un conjugado de anticuerpo fármaco es útil en el tratamiento de cánceres.
La viabilidad celular puede medirse determinando en una célula la captación de un colorante, tal como rojo neutro, azul de tripano o azul ALAMAR™ (véase, por ejemplo, Page et al., 1993, Intl. J. Oncology 3:473-476). En dicho ensayo, las células se incuban en medio que contiene el colorante, se lavan las células y el resto del colorante, que refleja la captación celular del colorante, se mide espectrofotométricamente. También puede usarse el colorante de unión a proteínas sulforrodamina B (SRB) para medir la citotoxicidad (Skehan et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst.
82:1107-12).
Como alternativa, una sal de tetrazolio, tales como MTT, se usa en un ensayo colorimétrico cuantitativo para la supervivencia y proliferación de células de mamíferos mediante la detección de células vivas pero no muertas (véase, por ejemplo, Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63).
La apoptosis puede cuantificarse midiendo, por ejemplo, la fragmentación del ADN. Se encuentran disponibles métodos fotométricos comerciales para la determinación cuantitativa in vitro de la fragmentación de ADN. Los ejemplos de dichos ensayos, incluyendo TUNEL (que detecta la incorporación de nucleótidos marcados en ADN fragmentado) y los ensayos basados en ELISA, se describen en Biochemica, 1999, n.° 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).
También puede determinarse la apoptosis midiendo los cambios morfológicos en una célula. Por ejemplo, como en el caso de la necrosis, puede determinarse la pérdida de integridad de la membrana plasmática midiendo la captación de ciertos colorantes (por ejemplo, un colorante fluorescente, tal como, por ejemplo, naranja de acridina o bromuro de etidio). Se ha descrito un método para medir el número de células apoptóticas por Duke y Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16). Las células también pueden marcarse con un colorante de ADN (por ejemplo, naranja de acridina, bromuro de etidio o yoduro de propidio) y las células se observan para detectar condensación y marginación de la cromatina a lo largo de la membrana nuclear interna. Otros cambios morfológicos que pueden medirse para determinar la apoptosis incluyen, por ejemplo, condensación citoplasmática, formación de ampollas de membrana aumentada y encogimiento celular.
La presencia de células apoptóticas puede medirse en los compartimentos tanto adheridos como "flotantes" de los cultivos. Por ejemplo, pueden recogerse ambos compartimentos retirando el sobrenadante, tripsinizando las células adheridas, combinando las preparaciones después de una etapa de lavado por centrifugación (por ejemplo, 10 minutos a 2000 rpm) y determinando la apoptosis (por ejemplo, midiendo la fragmentación del ADN). (Véase, por ejemplo, Piazza et al., 1995, Cancer Research 55:3110-16).
In vivo, el efecto de una composición terapéutica de FLT3 puede evaluarse en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, pueden usarse modelos de cáncer xenogénico, en donde los explantes de cáncer o los tejidos de xenoinjerto pasados se introducen en animales inmunodeprimidos, tales como ratones desnudos o SCID (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). Por ejemplo, la Solicitud de Patente PCT WO98/16628 y la Patente de EE.UU. 6.107.540 describen diversos modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humano capaces de recapitular el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis y la formación de metástasis osteoblásticas características de la enfermedad en fase tardía. La efectividad puede predecirse usando ensayos que miden la inhibición de la formación de tumores, regresión o metástasis tumoral y similares.
Los ensayos in vivo que evalúan la promoción de la apoptosis son útiles para evaluar composiciones terapéuticas. En una realización, los xenoinjertos de ratones portadores de tumores tratados con la composición terapéutica pueden examinarse para detectar la presencia de focos apoptóticos y compararse con ratones de control portadores de xenoinjertos no tratados. El grado en el que se encuentran focos apoptóticos en los tumores de los ratones tratados proporciona una indicación de la eficacia terapéutica de la composición.
Las composiciones terapéuticas usadas en la práctica de los métodos anteriores pueden formularse en composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo adecuado para el método de administración deseado. Los vehículos adecuados incluyen cualquier material que cuando se combina con la composición terapéutica retiene la función antitumoral de la composición terapéutica y generalmente no reacciona con el sistema inmunitario del paciente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de una serie de vehículos farmacéuticos estándar, como soluciones salinas tamponadas con fosfato estériles, agua bacteriostática y similares (véase, generalmente, Remington's Pharmaceutical Sciences 16a Edición, A. Osal., Ed., 1980).
Las formulaciones terapéuticas pueden solubilizarse y administrarse mediante cualquier ruta capaz de administrar la composición terapéutica al sitio del tumor. Las vías de administración potencialmente eficaces incluyen, pero no se limitan a, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraórgana, ortotópica y similares. Una formulación preferida para inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua bacteriostática conservada, agua estéril sin conservantes y/o diluida en cloruro de polivinilo o bolsas de polietileno que contienen cloruro de sodio para inyección estéril al 0,9 %, USP. Las preparaciones de proteínas terapéuticas pueden liofilizarse y almacenarse como polvos estériles, preferentemente al vacío, y después reconstituirse en agua bacteriostática (que contiene, por ejemplo, conservante de alcohol bencílico) o en agua estéril antes de la inyección.
Las dosificaciones y los protocolos de administración para el tratamiento de cánceres usando los métodos anteriores variarán con el método y el cáncer diana, y generalmente dependerán de varios otros factores apreciados en la técnica.
En una realización, la composición farmacéutica de la presente invención puede comprender más de una especie de ADC de la invención debido a la modificación de CHv62.21 MAb o CHv62.21pAF MAb. Por ejemplo, la presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende el ADC de la invención, en donde el MAb CHv62.21 es un anticuerpo que carece de lisina C-terminal de cadena pesada, un anticuerpo que tiene una modificación postraduccional N-terminal, un anticuerpo que carece de lisina C-terminal de cadena pesada y que tiene una modificación postraduccional N-terminal y/o un anticuerpo que tiene lisina C-terminal de cadena pesada y que no tiene una modificación postraduccional N-terminal.
Por ejemplo, una composición farmacéutica de la presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende dos o más especies del ADC de la invención, en donde MAb CHv62.21 del a Dc se selecciona del grupo de los siguientes 1) a 4):
1) MAb CHv62.21 que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID NO: 10;
2) MAb CHv62.21 que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID NO: 10;
3) MAb CHv62.21 que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (Q) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 en donde se retira el resto C-terminal 453 (K) y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID NO: 10; y 4) MAb CHv62.21 que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico y se retira el resto C-terminal 453 (K) y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID NO: 10.
En una realización, una composición farmacéutica de la presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende MAb CHv62.21 que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ iD NO: 10 y MAb CHv62.21 que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (Q) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 en donde se retira el resto C-terminal 453 (K) y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID NO: 10.
En una realización, una composición farmacéutica de la presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende MAb CHv62.21 que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (Q) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 en donde se retira el resto C-terminal 453 (K) y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID NO: 10 y MAb CHv62.21 que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 9 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico y se retira el resto C-terminal 453 (K) y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID NO: 10.
En una realización preferida, una composición farmacéutica de la presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende dos o más especies del ADC de la invención, en donde MAb CHv62.21pAF del ADC se selecciona del grupo de los siguientes 1) a 4):
1) MAb CHv62.21pAF que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de s Eq ID NO: 10 ;
2 ) MAb CHv62.21pAF que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID NO: 10;
3) MAb CHv62.21pAF que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (Q) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 en donde se retira el resto C-terminal 443 (T) y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID NO: 10; y 4) MAb CHv62.21pAF que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico y se retira el resto C-terminal 443 (T) y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID NO: 10.
En una realización, una composición farmacéutica de la presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende MAb CHv62.21pAF que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID NO: 10 y MAb CHv62.21pAF que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (Q) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 en donde se retira el resto C-terminal 443 (T) y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID No : 10.
En una realización, una composición farmacéutica de la presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende MAb CHv62.21pAF que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (Q) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 en donde se retira el resto C-terminal 443 (T) y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ ID NO: 10 y MAb CHv62.21pAF que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (E) al resto 453 (K) de SEQ ID NO: 11 en donde el resto N-terminal 1 (E) se convierte en ácido piroglutámico y se retira el resto C-terminal 443 (T) y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del resto 1 (D) al resto 214 (C) de SEQ iD No : 10.
XI.) Tratamiento de cáncer o cánceres que expresan FLT3
La identificación de FLT3 como una proteína que normalmente se expresa en un conjunto restringido de tejidos o células, pero que también se expresa en cánceres como los listados en la Tabla I, abre una serie de enfoques terapéuticos para el tratamiento de tales cánceres.
Cabe destacar que, las terapias antitumorales dirigidas han sido útiles incluso cuando la proteína diana se expresa en tejidos o células normales, incluso tejidos de órganos vitales normales. Un órgano vital es aquel que es necesario para sustentar la vida, tales como el corazón o el colon. Un órgano no vital es aquel que se puede extraer, después de lo cual el individuo aún puede sobrevivir. Son ejemplos de órganos no vitales ovario, mama y próstata.
La expresión de una proteína diana en tejido normal, incluso tejido normal vital, no anula la utilidad de un agente de dirección para la proteína como terapéutico para ciertos tumores en los que la proteína también se sobreexpresa. Por ejemplo, la expresión en órganos vitales no es en sí misma perjudicial. Además, los órganos considerados dispensables, tales como la próstata y el ovario, pueden retirarse sin afectar a la mortalidad. Finalmente, algunos órganos vitales no se ven afectados por la expresión normal de los órganos debido a un inmunoprivilegio. Los órganos inmunoprivilegiados son órganos que están protegidos de la sangre por una barrera hemato-orgánica y, por lo tanto, no son accesibles a la inmunoterapia. Son ejemplos de órganos inmunoprivilegiados el cerebro y los testículos.
En consecuencia, los enfoques terapéuticos que inhiben la actividad de una proteína FLT3 son útiles para pacientes que padecen un cáncer que expresa FLT3 (tal como, por ejemplo, los cánceres expuestos en la Tabla I). Estos enfoques terapéuticos generalmente se dividen en tres clases. La primera clase modula la función de FLT3 en lo que se refiere al crecimiento de las células tumorales que conduce a la inhibición o el retraso del crecimiento de las células tumorales o induce su destrucción. La segunda clase comprende diversos métodos para inhibir la unión o asociación de una proteína FLT3 con su pareja de unión o con otras proteínas. La tercera clase comprende una diversidad de métodos para inhibir la transcripción de un gen FLT3 o la traducción de ARNm de FLT3.
En consecuencia, los pacientes con cáncer pueden evaluarse para determinar la presencia y el nivel de expresión de FLT3, preferentemente usando evaluaciones inmunohistoquímicas del tejido tumoral, imágenes cuantitativas de FLT3 u otras técnicas que indiquen de manera confiable la presencia y el grado de expresión de FLT3. Se prefiere el análisis inmunohistoquímico de biopsias tumorales o muestras quirúrgicas para este fin, si es aplicable. Los métodos para el análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales son bien conocidos en la técnica.
XIII.) FLT3 como una diana para la terapia basada en anticuerpos
FLT3 es una diana atractiva para las estrategias terapéuticas basadas en anticuerpos. Se conocen varias estrategias de anticuerpos en la técnica para dirigirse a moléculas tanto extracelulares como intracelulares (véase, por ejemplo, complemento y muerte mediada por ADCC, así como el uso de intracuerpos). Debido a que FLT3 se expresa por células cancerosas de diversos linajes en relación con las células normales correspondientes, se prepara la administración sistémica de composiciones FLT3 inmunorreactivas que exhiben una excelente sensibilidad sin efectos tóxicos, no específicos y/o no diana provocados por la unión de la composición inmunorreactiva a órganos y tejidos no diana. Los anticuerpos específicamente reactivos con dominios de FLT3 son útiles para tratar cánceres que expresan FLT3 sistémicamente, preferentemente como conjugados de anticuerpo-fármaco (es decir, ADC) en los que el conjugado es con una toxina o un agente terapéutico.
Los expertos en la materia entienden que los anticuerpos pueden usarse para dirigirse específicamente y unirse a moléculas inmunogénicas tales como una región inmunogénica de una secuencia de FLT3 que se muestra en la Figura 1. Además, los expertos entienden que es rutinario conjugar anticuerpos a agentes citotóxicos (véase, por ejemplo, Slevers et al. Blood 93:11 3678-3684 (1 de junio de 1999)). Cuando se administran agentes citotóxicos y/o terapéuticos directamente a las células, tal como conjugándolos con anticuerpos específicos para una molécula expresada por esa célula (por ejemplo, FLT3), el agente citotóxico ejercerá su efecto biológico conocido (es decir, citotoxicidad) sobre esas células.
Se conoce en la técnica una amplia diversidad de composiciones y métodos para usar conjugados de anticuerpoagente citotóxico para destruir células. En el contexto de cánceres, los métodos típicos implican administrar a un mamífero que tiene un tumor una cantidad biológicamente eficaz de un conjugado que comprende un agente citotóxico y/o terapéutico seleccionado enlazado a un agente de direccionamiento (por ejemplo, un MAb FLT3, preferentemente CHv62.21 o CHv62.21pAF) que se une a un antígeno (por ejemplo, FLT3) expresado, accesible a la unión o localizado en las superficies de la célula. Una realización típica es un método para administrar un agente citotóxico y/o terapéutico a una célula que expresa FLT3, que comprende conjugar el agente citotóxico con un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un epítopo FLT3 y, exponer la célula al conjugado de anticuerpo fármaco (ADC). Otra realización ilustrativa es un método para tratar a un individuo sospechoso de padecer cáncer metastatizado, que comprende una etapa de administrar por vía parenteral a dicho individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico y/o terapéutico.
La inmunoterapia contra el cáncer con anticuerpos FLT3 puede realizarse de acuerdo con diversos enfoques que se han empleado exitosamente en el tratamiento de otros tipos de cáncer, incluyendo pero no limitado a cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenari et al., 1997, Blood 90:2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk et al., 1992, Cancer Res. 52:2771-2776), Linfoma de células B (Funakoshi et al., 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), leucemia (Zhong et al., 1996, Leuk. Res. 20:581-589), cáncer colorrectal (Moun et al., 1994, Cancer Res. 54:6160-6166; Velders et al., 1995, Cancer Res. 55:4398-4403) y cáncer de mama (Shepard et al., 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127). Algunos enfoques terapéuticos implican la conjugación de un anticuerpo desnudo a una toxina o radioisótopo, tales como la conjugación de Y91 o I131 a anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, ZevalinTM, IDEC Pharmaceuticals Corp. o Bexxar™, Coulter Pharmaceuticals) respectivamente, mientras que otros implican la coadministración de anticuerpos y otros agentes terapéuticos, tales como Herceptin™ (trastuzu MAb) con paclitaxel (Genentech, Inc.). En una realización preferida, los anticuerpos se conjugarán con un agente citotóxico, mencionado anteriormente, preferentemente un derivado de aurastatina denominado MMAE (Seattle Genetics).
Aunque la terapia con anticuerpos FLT3 es útil para todas las fases del cáncer, la terapia con anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cánceres avanzados o metastásicos. El tratamiento con la terapia con anticuerpos está indicado para pacientes que han recibido una o más rondas de quimioterapia. Como alternativa, la terapia con anticuerpos se combina con un régimen de quimioterapia o radiación para pacientes que no han recibido tratamiento quimioterapéutico. Adicionalmente, la terapia con anticuerpos puede permitir el uso de dosis reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente para pacientes que no toleran muy bien la toxicidad del agente quimioterapéutico. Fan et al. (Cancer Res. 53:4637-4642, 1993), Prewett et al. (International J. of Onco. 9:217-224, 1996) y Hancock et al. (Cancer Res. 51:4575-4580, 1991) describen el uso de diversos anticuerpos junto con agentes quimioterapéuticos.
Los anticuerpos monoclonales FLT3 que tratan los cánceres expuestos en la Tabla I incluyen aquellos que inician una potente respuesta inmunitaria contra el tumor o aquellos que son directamente citotóxicos. En este sentido, los anticuerpos monoclonales (MAb) de FLT3 pueden provocar la lisis de células tumorales mediante mecanismos de citotoxicidad celular mediados por complemento o dependientes de anticuerpos (ADCC), ambos de los cuales requieren una porción Fc intacta de la molécula de inmunoglobulina para la interacción con los sitios del receptor Fc de la célula efectora en las proteínas del complemento. Además, los MAb FLT3 que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento tumoral son útiles para tratar cánceres que expresan FLT3. Los mecanismos por los que actúan directamente los MAb citotóxicos incluyen: inhibición del crecimiento celular, modulación de la diferenciación celular, modulación de los perfiles de factores de angiogénesis tumoral e inducción de apoptosis. El mecanismo o mecanismos por los cuales un MAb FLT3 particular ejerce un efecto antitumoral se evalúan usando cualquier número de ensayos in vitro que evalúan la muerte celular tales como ADCC, lisis celular mediada por complemento, y así sucesivamente, como se conoce, en general, en la técnica.
En consecuencia, los anticuerpos monoclonales preferidos de la invención para su uso en terapia son aquellos que son completamente humanos y que se unen específicamente al antígeno FLT3 diana con alta afinidad.
XIV. ) Cócteles FLT3 ADC
Los métodos terapéuticos desvelados contemplan la administración de ADC de FLT3 individuales, así como combinaciones o cócteles, de diferentes MAb (es decir, MAb FLT3 o Mab que se unen a otra proteína). Dichos cócteles de MAb pueden tener ciertas ventajas en la medida en que contienen MAb que se dirigen a diferentes epítopos, explotan diferentes mecanismos efectores o combinan MAb directamente citotóxicos con MAb que dependen de la funcionalidad efectora inmunitaria. Dichos MAb en combinación pueden exhibir efectos terapéuticos sinérgicos. Además, los MAb FLT3 pueden administrarse concomitantemente con otras modalidades terapéuticas, incluyendo pero no limitado a diversos agentes quimioterapéuticos y biológicos, bloqueantes de andrógenos, inmuno moduladores (por ejemplo, IL-2, GM-CSF), cirugía o radiación. En una realización preferida, los MAb FLT3 se administran en forma conjugada.
Las formulaciones de FLT3 ADC se administran mediante cualquier vía capaz de administrar los anticuerpos a una célula tumoral. Las vías de administración incluyen, pero no se limitan a, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica y similares. El tratamiento generalmente implica la administración repetida de la preparación FLT3 ADC, a través de una vía de administración aceptable tal como inyección intravenosa (IV), normalmente en una dosis en el intervalo, incluyendo pero no limitado a, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o 25 mg/kg de peso corporal. En general, las dosis en el intervalo de 10-1000 mg de MAb por semana son eficaces y bien toleradas.
Basado en la experiencia clínica con Herceptin® (Trastuzumab) en el tratamiento del cáncer de mama metastásico, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV, seguido de dosis semanales de aproximadamente 2 mg/kg IV de la preparación de MAb representa un régimen de dosificación aceptable. Preferentemente, la dosis de carga inicial se administra como una infusión de 90 minutos o más. La dosis de mantenimiento periódica se administra como una infusión de 30 minutos o más, con la condición de que se tolere bien la dosis inicial. Como apreciarán los expertos en la materia, diversos factores pueden influir en el régimen de dosis ideal en un caso particular. Tales factores incluyen, por ejemplo, la afinidad de unión y la semivida de los MAb usados, el grado de expresión de FLT3 en el paciente, la extensión del antígeno FLT3 diseminado circulante, el nivel de concentración de anticuerpos en estado estable deseado, la frecuencia del tratamiento y la influencia de agentes quimioterapéuticos u otros usados en combinación con el método de tratamiento, así como el estado de salud de un paciente en particular.
Opcionalmente, los pacientes deben ser evaluados para determinar los niveles de FLT3 en una muestra determinada (por ejemplo, los niveles de antígeno FLT3 circulante y/o células que expresan FLT3) para ayudar a determinar el régimen de dosificación más eficaz, etc. Dichas evaluaciones también se usan con fines de seguimiento a lo largo de la terapia y son útiles para medir el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (por ejemplo, citología de orina y/o niveles de ImmunoCyt en la terapia del cáncer de vejiga, o por analogía, niveles séricos de PSA en la terapia del cáncer de próstata).
Se desvelan los ADC FLT3, que inhiben o retardan el crecimiento de células tumorales que expresan FLT3. Se describen métodos para inhibir la angiogénesis y otras funciones biológicas y, por lo tanto, reducir el crecimiento tumoral en mamíferos, preferentemente de seres humanos, usando tales ADC FLT3, y en particular usando tales ADC FLT3 combinados con otros fármacos o tratamientos inmunológicamente activos.
XV. ) Terapia de combinación
En una realización, hay sinergia cuando los tumores, incluyendo los tumores humanos, se tratan con ADC FLT3 junto con agentes quimioterapéuticos o radiación o combinaciones de los mismos. En otras palabras, la inhibición del crecimiento tumoral por un ADC FLT3 aumenta más de lo esperado cuando se combina con agentes quimioterapéuticos o radiación o combinaciones de los mismos. La sinergia puede mostrarse, por ejemplo, por una mayor inhibición del crecimiento tumoral con tratamiento combinado de lo que se esperaría de un tratamiento de solo FLT3 ADC o el efecto aditivo del tratamiento con un FLT3 ADC y un agente quimioterapéutico o radiación. Preferentemente, la sinergia se demuestra por la remisión del cáncer donde no se espera la remisión del tratamiento ya sea de un ADC FLT3 o con el tratamiento que usa una combinación aditiva de un ADC FLT3 y un agente quimioterapéutico o radiación.
El método para inhibir el crecimiento de células tumorales usando un ADC FLT3 y una combinación de quimioterapia o radiación o ambas comprende administrar el ADC FLT3 antes, durante o después de comenzar la quimioterapia o la radioterapia, así como cualquier combinación de los mismos (es decir, antes y durante, antes y después, durante y después, o antes, durante y después de comenzar la quimioterapia y/o radioterapia). Por ejemplo, el ADC FLT3 se administra normalmente entre 1 y 60 días, preferentemente entre 3 y 40 días, más preferentemente entre 5 y 12 días antes de comenzar la radioterapia y/o la quimioterapia. Sin embargo, dependiendo del protocolo de tratamiento y las necesidades específicas del paciente, el método se realiza de manera que proporcione el tratamiento más eficaz y, en última instancia, prolongue la vida del paciente.
La administración de agentes quimioterapéuticos puede lograrse de diversas formas que incluyen sistémicamente por vía parenteral y enteral. En una realización, los ADC de FLT3 y el agente quimioterapéutico se administran como moléculas separadas. Los ejemplos particulares de agentes quimioterapéuticos o quimioterapia incluyen cisplatino, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, mecloretamina (mostaza de nitrógeno), estreptozocina, ciclofosfamida, carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina, procarbazina, mitomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5-fluorouracilo, vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol), docetaxel (taxotere), aldesleucina, asparaginasa, busulfán, carboplatino, cladribina, dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, interferón alfa, leuprolida, megestrol, melfalán, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobromano, plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorelbina, gemcitabina, clorambucilo, taxol y combinaciones de los mismos.
La fuente de radiación, usada en combinación con un FLT3 ADC, puede ser externa o interna al paciente que está siendo tratado. Cuando la fuente es externa al paciente, la terapia se conoce como radioterapia de haz externo (EBRT). Cuando la fuente de radiación es interna al paciente, el tratamiento se llama braquiterapia (BT).
Los regímenes terapéuticos descritos anteriormente pueden combinarse además con agentes y/o regímenes adicionales para el tratamiento del cáncer, por ejemplo, quimioterapia adicional, vacunas contra el cáncer, inhibidores de la transducción de señales, agentes útiles para tratar el crecimiento celular anormal o el cáncer, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-CTLA-4 como se describe en el documento WO/2005/092380 (Pfizer)) u otros ligandos que inhiben el crecimiento tumoral al unirse a IGF-1R y citocinas.
Cuando el mamífero se somete a quimioterapia adicional, pueden usarse los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente. Adicionalmente, pueden usarse inhibidores de factores de crecimiento, modificadores de la respuesta biológica, terapia antihormonal, modulador selectivo del receptor de estrógenos (SERM), inhibidores de la angiogénesis y antiandrógenos. Por ejemplo, pueden usarse antihormonas, por ejemplo anti-estrógenos como Nolvadex (tamoxifeno) o anti-andrógenos tales como Casodex (4-ciano-3-(4-fluorofenilsulfonil)-2-hidroxi-2-metil-3--(trifluorometil)propionanilida).
Los enfoques terapéuticos anteriores pueden combinarse con cualquiera de una amplia diversidad de regímenes quirúrgicos, de quimioterapia o de radioterapia. Los enfoques terapéuticos de la invención pueden permitir el uso de dosis reducidas de quimioterapia (u otras terapias) y/o una administración menos frecuente, una ventaja para todos los pacientes y particularmente para aquellos que no toleran bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.
XVI.) Kits/artículos de fabricación
Se desvelan kits para su uso en las aplicaciones de laboratorio, pronósticas, profilácticas, de diagnóstico y terapéuticas descritas en el presente documento. Tales kits pueden comprender un vehículo, envase o recipiente que está compartimentado para recibir uno o más recipientes, tales como viales, tubos y similares, comprendiendo cada uno del recipiente o recipientes uno de los elementos separados que se usarán en el método, junto con una etiqueta o un prospecto con instrucciones de uso, tal como un uso descrito en el presente documento. Por ejemplo, el recipiente o recipientes pueden comprender un anticuerpo que está o puede estar marcado de forma detectable. Los kits pueden comprender un recipiente que comprende una unidad de fármaco. El kit puede incluir todas o parte de las secuencias de aminoácidos de la Figura 2A, 2B y/o 2C o la Figura 3A, 3B y/o 3C o análogos de los mismos, o una molécula de ácido nucleico que codifica tales secuencias de aminoácidos.
El kit comprenderá normalmente el recipiente descrito anteriormente y uno o más recipientes asociados al mismo que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas; vehículo, envase, recipiente, vial y/o tubos y etiquetas que listan contenidos y/o instrucciones de uso y prospectos con instrucciones de uso.
Puede estar presente una etiqueta en o con el recipiente para indicar que la composición se usa para una terapia específica o una aplicación no terapéutica, tales como una aplicación pronóstica, profiláctica, diagnóstica o de laboratorio, y también puede indicar direcciones para cualquier uso in vivo o in vitro, tales como los descritos en el presente documento. Las instrucciones u otra información también pueden incluirse en un inserto o insertos o etiqueta o etiquetas que se incluyen con o en el kit. La etiqueta puede estar en el recipiente o asociada a él. Una etiqueta puede estar en un recipiente cuando las letras, los números u otros caracteres que forman la etiqueta están moldeados o grabados en el propio contenedor; una etiqueta está asociada a un recipiente cuando está presente en un receptáculo o vehículo que también contiene al recipiente, por ejemplo, en forma de un prospecto. La etiqueta puede indicar que la composición se usa para diagnosticar, tratar, la profilaxis o pronosticar una enfermedad, tal como un cáncer de un tejido expuesto en la Tabla I.
Los términos "kit" y "artículo de fabricación" pueden usarse como sinónimos.
En otra divulgación, un artículo o artículos de fabricación que contienen composiciones, tales como anticuerpo o anticuerpos o conjugados de anticuerpo fármaco (ADC), por ejemplo, materiales útiles para el diagnóstico, pronóstico, profilaxis y/o tratamiento de cánceres de tejidos tales como los expuestos en la Tabla I se proporcionan. El artículo de fabricación comprende normalmente al menos un recipiente y al menos una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales, tales como vidrio, metal o plástico. El recipiente puede contener secuencia o secuencias de aminoácidos, molécula o moléculas pequeñas, secuencia o secuencias de ácido nucleico, población o poblaciones de células y/o anticuerpo o anticuerpos. En otra realización, un recipiente comprende un anticuerpo, fragmento de unión del mismo o proteína de unión específica para su uso en la evaluación de la expresión de proteínas de FLT3 en células y tejidos, o para los fines relevantes de laboratorio, pronósticos, diagnósticos, profilácticos y terapéuticos; pueden incluirse indicaciones y/o instrucciones para tales usos en o con dicho recipiente, al igual que los reactivos y otras composiciones o herramientas usadas para estos fines.
El recipiente puede contener alternativamente una composición que sea eficaz para el tratamiento, el diagnóstico, la pronosticación y/o la profilaxis de una afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Los agentes activos en la composición pueden ser un anticuerpo capaz de unirse específicamente a f LT3 o un conjugado de anticuerpo-fármaco que se une específicamente a FLT3.
El artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y/o solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agitadores, agujas, jeringas y/o prospectos con indicaciones y/o instrucciones de uso.
Ejemplos
Diversos aspectos de la invención se describen e ilustran adicionalmente por medio de los varios ejemplos que siguen, ninguno de los cuales pretende limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1
El antígeno FLT3
FLT3, Fms como receptor de tirosina quinasa 3, también conocido como Flk2 (quinasa 2 del hígado fetal), STK1 (tirosina quinasa 1 de células madre) y CD135, es un miembro de las tirosina quinasas receptoras de tipo MI (RTK). El FLT3 humano codifica un RTK de 993 aminoácidos de longitud, que comprende un receptor unido a membrana con cinco dominios extracelulares de tipo inmunoglobulina y dos dominios de tirosina quinasa intracelular (TKD) unidos por un dominio de inserción de quinasa (Stirewalt D L et al; Nat Rev Cancer; 650-665(2003). El gen FLT3 humano (ID de Gen N.°: 2322 (National Center for Biotechnology Information)) se encuentra en el cromosoma 13q12 y comparte una homología de secuencia de aminoácidos del 85 % con FLT3 de ratón (Rosnet O et al; Oncogene 8:173-179 (1993). FLT3 se expresa en células progenitoras mieloides y linfoides normales y por las células leucémicas del 70-90 % de los pacientes con AML (Carow, C.E et al; Blood 87: 1089-1096 (1996); Rosnet O et al; Leukemia 10:238-248 (1996) y también en ALL. Se sabe que FLT3 está implicado en la proliferación, diferenciación y apoptosis de las células hematopoyéticas. Muchas células hematopoyéticas producen ligando FLT3 (FLT3L), que promueve la dimerización y activación del receptor, induciendo de esta manera una cascada de señalización a través de las rutas de PI3quinasa y MAPK (Stirewalt D L et al; Nat Rev Cancer; 650-665(2003). Aproximadamente, el 30 % de los pacientes con AML albergan mutaciones de duplicación interna en tándem (ITD) de FLT3 que impulsan la activación constitutiva de los receptores y la cascada de señalización descendente, asociado a un resultado deficiente de la enfermedad (Gunawardane R N et al; Mom Cancer Ther 12:438-447 (2013). Para realizaciones ilustrativas del antígeno FLT3, véase la Figura 1.
Ejemplo 2
Generación de anticuerpos monoclonales (MAb) FLT3
En una realización, los anticuerpos monoclonales terapéuticos ("MAb") para FLT3 comprenden aquellos que reaccionan con epítopos específicos de FLT3 que se unirían a FLT3 expresado en células. Los inmunógenos para la generación de tales MAb incluyen aquellos diseñados para codificar o contener los dominios extracelulares o la secuencia completa de la proteína FLT3, regiones que se predice que contienen motivos funcionales, y regiones de FLT3 que se predice que son antigénicas por análisis informático de la secuencia de aminoácidos. Los inmunógenos incluyen péptidos, proteínas y células recombinantes (que expresan de forma endógena FLT3 o que han sido diseñadas para expresar FLT3).
Los MAb para FLT3 se generaron usando la tecnología VelocImmune® (Regeneron, Tarrytown, NY) en donde los ratones modificados genéticamente producen anticuerpos que tienen regiones variables completamente humanas y regiones constantes de ratón. El MAb designado v62-1b21 (también conocido como AGS62.21) se generó después de inmunizar ratones VelocImmune® con proteína FLT3 humana recombinante. El MAb FLT3, v62-1b21 se une específicamente a la proteína Flt3 y a las células que expresan Flt3 (recombinantes y endógenas).
Después de la selección, v62-1b21 (producido de forma natural por una línea celular de hibridoma) se convirtió en un anticuerpo nativo completamente humano expresado en CHO combinando las secuencias variables humanas del anticuerpo VelocImmune® (Véase, el Ejemplo 3 - Expresión de CHv62.21 usando métodos de ADN recombinante) pero con regiones constantes humanas que incorporan un aminoácido no natural en la posición 124 de la cadena pesada, de acuerdo con la tecnología ReCODE desarrollada por Ambrx (La Jolla, cA) (Véase, el Ejemplo 4 -Expresión de CHv62.21pAF humano usando métodos de ADN recombinante).
Las secuencias de codificación de ADN para v62-1b21 se determinaron después de aislar el ARNm de las células de hibridoma productoras de v62-1b21. El anti-Flt3, las secuencias de ácidos nucleicos variables de cadena ligera y pesada de v62-1b21 derivaron de las células de hibridoma usando el siguiente protocolo. Se lisaron células de hibridoma secretoras de v62-1b21 con reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL). Se purificó el ARN total y se generó el ADNc de la primera hebra a partir del ARN total con cebado con oligo (dT)12-18 usando el sistema de preamplificación Gibco-BRL Superscript. A continuación, se amplificó el ADNc de la primera cadena usando cebadores de cadena pesada variable de inmunoglobulina humana y cebadores de cadena ligera variable de inmunoglobulina humana. Se secuenciaron los productos de la PCR y se determinaron las regiones variables de cadena pesada y ligera.
Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera se listan en la Figura 2A y/o 2B y en la Figura 3A y/o 3B. La alineación del MAb CHv62.21 con la línea germinal de Ig humana se muestra en la Figura 4A-4B.
Ejemplo 3
Expresión de CHv62.21 usando métodos de ADN recombinante
Para expresar CHv62.21 MAb de forma recombinante en células transfectadas, se clonaron secuencias de cadena pesada y ligera variables de MAb de hibridoma v62.21 en dirección 5' de las regiones constantes de IgG1 de cadena pesada humana e IgK de cadena ligera humana, respectivamente. Se clonaron los casetes completos de cadena pesada y cadena ligera de MAb CHv62.21 humano en dirección 3' del promotor/potenciador de CMV en un vector de clonación. La construcción de expresión de MAb CHv62.21 recombinante se transfectó en células CHO para una expresión estable en el sistema Lonza GS (Lonza, Basilea, Suiza). El MAb CHv62.21 secretado a partir de células c Ho recombinantes se purificó y se evaluó para determinar la unión a FLT3 de la superficie celular mediante citometría de flujo. Los resultados muestran que el anticuerpo CHv62.21 recombinante expresado en células CHO se une a FLT3 en la superficie celular.
Los resultados muestran además que el CHv62.21 expresado de forma recombinante expresado en células CHO se une a FLT3 de manera similar al v62.21 purificado de hibridoma. El MAb CHv62.21 secretado a partir de células recombinantes también se evalúa para la unión a la proteína recombinante FLT3 mediante ELISA. La unión de CHv62.21 a la proteína FLT3 es idéntica entre el material MAb derivado de CHO y de células de hibridoma.
La célula de ovario de hámster chino (CHO) que produce un anticuerpo designado CHv62.21 se envió (a través de Federal Express) a la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 09 de diciembre de 2014 y el número de registro asignado PTA-121831.
Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera se listan en la Figura 2A y/o 2B y en la Figura 3A y/o 3B.
Como resultado del análisis experimental, usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, digestión con proteasas, análisis CLEM, etc.), modificación o modificaciones de aminoácidos del MAb CHv62.21 derivado de células CHO, se mostró que la deleción de lisina en el C terminal de la cadena pesada se produce en la mayoría de MAb CHv62.21 purificados y la piroglutamilación en el N terminal de la cadena pesada y la deleción de lisina en el C de terminal la cadena pesada se produce en una parte de MAb CHv62.21 purificados.
Ejemplo 4
Expresión de CHv62.21pAF humano usando métodos de ADN recombinante
Para expresar CHv62.21pAF de forma recombinante en células transfectadas, se clonaron secuencias de cadena pesada y ligera variables de MAb v62-1b21 de hibridoma 1b21 en dirección 5' de las regiones constantes de IgG1 de cadena pesada humana e IgK de cadena ligera humana, respectivamente. Se clonaron los casetes completos de cadena pesada y cadena ligera de MAb CHv62.21 humano en dirección 3' del promotor/potenciador de CMV en un vector de clonación. La construcción de expresión de MAb CHv62.21 recombinante se transfectó después en células CHO pAFsup1-4E2 (Ambrx, La Jolla, CA), que expresan de forma estable el ARNt supresor ámbar y la aminoacil ARNt sintetasa específica de pAF, para la generación de clones estables. Los clones estables producen CHv62.21pAF mediante la incorporación de pAF en el MAb. Los clones estables se sometieron a amplificación génica seguida de subclonación. El CHv62.21pAF secretado del subclón estable se purificó y se evaluó para determinar la unión a FLT3 de la superficie celular mediante citometría de flujo. Los resultados muestran que el anticuerpo CHv62.21pAF recombinante expresado a partir de las células CHO se une a FLT3 en la superficie celular. La célula de ovario de hámster chino (CHO) que produce un anticuerpo designado CHv62.21pAF se envió (a través de Federal Express) a la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 el 09 de diciembre de 2014 y el número de registro asignado PTA-121836.
Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera se listan en la Figura 2C y/o 2B y en la Figura 3C y/o 3B.
Como resultado del análisis experimental, usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, digestión con proteasas, análisis CLEM, etc.), modificación o modificaciones de aminoácidos del MAb CHv62.21pAF derivado de células CHO, se mostró que la deleción de lisina en el C terminal de la cadena pesada se produce en la mayoría de MAb CHv62.21 purificados y la piroglutamilación en el N terminal de la cadena pesada y la deleción de lisina en el C de terminal la cadena pesada se produce en una parte de MAb CHv62.21 pAF purificados.
Ejemplo 5
Generación de Unidad enlazadora AGL
En una realización preferida, la Unidad enlazadora de la presente invención, denotada AGL, se usa para enlazar un MAb FLT3 de la presente invención, preferentemente CHv62.21pAF, con una Unidad de Fármaco de la presente invención, preferentemente AGD-0182 se conoce comúnmente como ácido 2-(aminooxi)acético (Chem-Impex International, Inc., Wood Dale, IL).
En una realización adicional, la unidad de enlace AGL de la presente invención tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000055_0001
ácido 2-(aminooxi)acético
Fórmula química: CvH ,N O ,
Masa exacta: 91,0269
Peso molecular: 91,0660
m iz: 91,0269 (100,0%), 92,0303 (2,2%)
Ejemplo 6
Generación y síntesis de la unidad de fármaco AGD-0182
La Unidad de Fármaco expuesta en la Fórmula (II) se generó usando el siguiente proceso. En primer lugar, a una suspensión agitada a 23 °C de Boc-Dap-OH diciclohexilamina (10,0 g, 21,3 mmol) y H-Phe-NH2 sal de HCl (6,42 g, 32,0 mmol) en CH2Ch (20,0 ml) se añadió DIEA (11,0 g, 14,9 ml, 85,3 mmol) seguido de la adición de DEPC (5,19 g, 4,80 ml, 0,032 mol). Después de 10 h, el análisis por CLEM mostró que la reacción se había completado. La reacción bruta se lavó con H2O (25 ml x 2), seguido de salmuera (25 ml x 2). La fracción orgánica se secó sobre una almohadilla sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío. El aceite naranja bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (gel de sílice 40 pm, 60 A, tamaño) usando del 2 % al 10 % de metanol en CH2Ch como el eluyente. Se obtuvo un total de 7,25 g de Boc-Dap-Phe-NH2 (16,7 mmol, 78 %) como un aceite amarillo. TR de CLEM = 1,28 min (Método B); ESI-EM m/z 434,19 [M+H]+.
En segundo lugar, a una suspensión agitada a 23 °C de Boc-Dap-Phe-NH2 (7,25 g, 16,7 mmol) en CH2Ch (10 ml) se añadió TFA (10 ml). Después de 5 h, el análisis por CLEM mostró que la reacción se había completado. Los productos orgánicos volátiles se evaporaron al vacío para dar producto bruto, que se usó sin purificación adicional. Se obtuvo un total de 6,00 g de H-Dap-Phe-NH2 como un sólido naranja (13,4 mmol, 80 %). TR de CLEM = 0,691 min (Método B); ESI-EM m/z 334,17 [M+H]+ .
Después, a una suspensión agitada a 23 °C de Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-OH sal de TFA (456 mg, 0,586 mmol) y H-Dap-Phe-NH2 sal de TFA (457 mg, 1,02 mmol) en DMF (10 ml) se le añadió DIEA (0,350 g, 0,500 ml, 2,74 mmol) seguido de la adición de HATU (0,520 g, 1,37 mmol). Después de 10 h, el análisis por CLEM mostró que la reacción se había completado. La reacción bruta se purificó mediante RP-HPLC preparatoria con una columna Phenomenex Gemini NX-C18 10 p 110 A (150 x 30 mm) usando MeCN del 10 % al 90 % en ácido fórmico acuoso al 0,1 % como el eluyente. Se obtuvo un total de 526 mg de Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 como la sal de ácido fórmico (0,513 mmol, 75 %). TR de CLEM = 1,81 min (Método B); ESI-EM m/z 980,39 [M+H]+ .
Finalmente, a una solución agitada a 23 °C de Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 (525 mg, 0,513 mmol) en acetonitrilo (10 ml) se añadió piperidina (5 ml). Después de 2 h, el análisis por CLEM mostró que la reacción se había completado. A la solución de reacción bruta se le añadió hexanos (15 ml x 3). La capa de acetonitrilo se concentró al vacío. El aceite bruto se purificó mediante RP-HPLC preparatoria con una columna Phenomenex Gemini NX-C18 10 p 110 A (150 x 30 mm) usando MeCN del 5 % al 95 % en TFA acuoso al 0,1 % como el eluyente. Se obtuvo un total de 354 mg del compuesto del título como la sal de TFA (0,406 mmol, 79 %). TR de CLEM = 1,15 min (Método B); ESI-EM m/z 758,24 [M+H]+; HRMS m/z 758,4915 [C38H63NgO7+H]+ .
La síntesis anterior generó la siguiente Unidad de Fármaco denotada (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-amino-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-3-azido-N-metil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamida, que se establece como Fórmula (II):
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Ejemplo 7
Síntesis de Enlazador de Fármaco AGL y Unidad de fármaco AGD-0182
La síntesis de la unidad enlazadora AGL y la unidad de fármaco AGD-0182 se completó de la siguiente manera. El método A se describe usando los siguientes procedimientos y protocolos:
0-0,50 min: isocrático 80 agua/10 acetonitrilo/10 ácido fórmico al 1 % en agua; 0,50-3,50 min: gradiente lineal 80 agua/10 acetonitrilo/10 ácido fórmico al 1 % en agua a 0 agua/90 acetonitrilo/10 ácido fórmico al 1 % en agua; 3,50-3,99 min isocrático 0 agua/90 acetonitrilo/10 ácido fórmico al 1 % en agua; 3,99-4,00 min gradiente lineal 0 agua/90 acetonitrilo/10 ácido fórmico al 1 % en agua a 80 agua/10 acetonitrilo/10 ácido fórmico al 1 % en agua. El método B se describe usando los siguientes procedimientos y protocolos:
0-0,50 min: isocrático 85 agua/5 acetonitrilo/10 ácido fórmico al 1 % en agua; 0,50-1,60 min: gradiente lineal 85 agua/5 acetonitrilo/10 ácido fórmico al 1 % en agua a 0 agua/98 acetonitrilo/2 ácido fórmico al 1 % en agua; 1,60-1,80 min isocrático 0 agua/98 acetonitrilo/2 ácido fórmico al 1 % en agua; 1,80-1,90 min gradiente lineal 0 agua/98 acetonitrilo/2 ácido fórmico al 1 % en agua a 85 agua/5 acetonitrilo/10 ácido fórmico al 1 % en agua; 1,90-2,00 min isocrático 85 agua/5 acetonitrilo/10 ácido fórmico al 1 % en agua.
Usando los métodos anteriores, la síntesis es como sigue:
A una suspensión agitada a 23 °C de Boc-Dap-OH diciclohexilamina (10,0 g, 21,3 mmol) y H-Phe-NH2 sal de HCl (6,42 g, 32,0 mmol) en CH2Ch (20,0 ml) se añadió DIEA (11,0 g, 14,9 ml, 85,3 mmol) seguido de la adición de DEPC (5,19 g, 4,80 ml, 0,032 mol). Después de 10 h, el análisis por CLEM mostró que la reacción se había completado. La reacción bruta se lavó con H20 (25 ml x 2), seguido de salmuera (25 ml x 2). La fracción orgánica se secó sobre una almohadilla sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío. El aceite naranja bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (gel de sílice 40 pm, 60 A, tamaño) usando del 2 % al 10 % de metanol en CH2Ch como el eluyente. Se obtuvo un total de 7,25 g de Boc-Dap-Phe-NH2 (16,7 mmol, 78 %) como un aceite amarillo. TR de CLEM = 1,28 min (Método B); ESI-EM m/z 434,19 [M+H]+.
A una suspensión agitada a 23 °C de Boc-Dap-Phe-NH2 (7,25 g, 16,7 mmol) en CH2Ch (10 ml) se añadió TFA (10 ml). Después de 5 h, el análisis por CLEM mostró que la reacción se había completado. Los productos orgánicos volátiles se evaporaron al vacío para dar producto bruto, que se usó sin purificación adicional. Se obtuvo un total de 6,00 g de H-Dap-Phe-NH2 como un sólido naranja (13,4 mmol, 80 %). TR de CLEM = 0,691 min (Método B); ESI-EM m/z 334,17 [M+H]+.
A una suspensión agitada a 23 °C de Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-OH sal de TFA (456 mg, 0,586 mmol) y H-Dap Phe-NH2 sal de TFA (457 mg, 1,02 mmol) en DMF (10 ml) se le añadió DIEA (0,350 g, 0,500 ml, 2,74 mmol) seguido de la adición de HATU (0,520 g, 1,37 mmol). Después de 10 h, el análisis por CLEM mostró que la reacción se había completado. La reacción bruta se purificó mediante RP-HPLC preparatoria con una columna Phenomenex Gemini NX-C18 10 |j 110 A (150 x 30 mm) usando MeCN del 10 % al 90 % en ácido fórmico acuoso al 0,1 % como el eluyente. Se obtuvo un total de 526 mg de Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 como la sal de ácido fórmico (0,513 mmol, 75 %). TR de CLEM = 1,81 min (Método B); ESI-EM m/z 980,39 [M+H]+ .
A una solución agitada a 23 °C de Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 (525 mg, 0,513 mmol) en acetonitrilo (10 ml) se añadió piperidina (5 ml). Después de 2 h, el análisis por CLEM mostró que la reacción se había completado. A la solución de reacción bruta se le añadió hexanos (15 ml x 3). La capa de acetonitrilo se concentró al vacío. El aceite bruto se purificó mediante RP-HPLC preparatoria con una columna Phenomenex Gemini NX-C18 10 j 110 A (150 x 30 mm) usando MeCN del 5 % al 95 % en TFA acuoso al 0,1 % como el eluyente. Se obtuvo un total de 354 mg del compuesto resultante (MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 como la sal de TFA (0,406 mmol, 79 %). TR de CLEM = 1,15 min (Método B); ESI-EM m/z 758,24 [M+H]+; HRMS m/z 758,4915 [C3 sH63N9O7+H]+ .
A una solución agitada a 23 °C de MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 (2,0 g, 2,64 mmol) y Boc-Aoa (0,53 g, 2,77 mmol) en DMF (7,0 ml) y DCM (15,0 ml) se añadió HATU (1,05 g, 2,77 mmol), seguido de la adición de DIPEA (0,51 ml), 2,92 mmol). Después de 1 h, la mezcla de reacción se concentró al vacío para producir una solución de DMF bruta que se diluyó adicionalmente con 150 ml de EtOAc. La mezcla de reacción bruta se lavó con 100 ml de NaHCO3 sat., seguido de 100 ml de salmuera. La fracción orgánica se secó sobre una almohadilla sulfato de magnesio, se filtró y se concentró al vacío. El Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (gel de sílice 40 jm, 60 A, tamaño) usando del 0 % al 5 % de metanol en CH2Ch como el eluyente. Se obtuvo un total de 2,13 g de Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 (2,29 mmol, 87 %) como un sólido de color beige. TR de CLEM = 1,46 min (Método A); ESI-EM m/z 931,46 [M+H]+ .
A una solución agitada a 23 °C de Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2 (2,1 g, 2,26 mmol) en dioxano (15,0 ml) se añadió HCl 4 M en dioxano (10,0 ml, 40,0 mmol). Después de 0,5 h, la mezcla de reacción se concentró al vacío para producir un aceite bruto de color amarillo pálido. El aceite bruto de color amarillo pálido se disolvió en 6 ml de metanol y se añadió lentamente (gota a gota) a 150 ml de solución de EtOAc agitada vigorosamente. Se obtuvo un precipitado blanco a partir de la solución. El precipitado blanco se recogió mediante filtración y el sobrenadante se concentró hasta un sólido. Tanto el precipitado blanco como el sobrenadante concentrado se purificaron en varias porciones mediante RP-HPLC preparatoria con un Phenomenex Gemini 10 j, Columna C18 de 110 A (150 x 30 mm) usando MeCN del 5 % al 95 % en ácido clorhídrico 0,001 M como el eluyente.
Las fracciones de producto resultantes se combinaron, se concentraron y se secaron al vacío durante 18 h para producir un sólido de color blanco. Se obtuvo un total de 1,31 g de AGL-0182-30 HCl (1,51 mmol, 67 %). t R de CLEM = 1,16 min (Método A); ESI-EM m/z 831,27 [M+H]+.(Véase, generalmente la Tabla IV).
En una realización preferida, AGL-0182-30 tiene la siguiente fórmula:
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Ejemplo 8
Conjugación de anticuerpo y fármaco de MAb CHv62.21pAF
El Mab CHv62.21pAF se conjugó con un péptido que contenía dolaisoluina-dolaproína designado AGL-0182-30 usando un enlazador de alcoxiamina descrito en el presente documento para crear el conjugado de anticuerpofármaco (ADC) de la invención designado CHv62.21pAF-AGL-0182-30 usando los siguientes protocolos.
La síntesis del enlazador de fármaco AGL-0182-30 se logró usando los métodos descritos en el Ejemplo 7 titulado "Síntesis del enlazador de fármaco AGL y unidad de fármaco AGD-0182".
A continuación, el conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención designado cHv62.21pAF-AGL-0182-30 se preparó usando los siguientes protocolos.
Resumiendo, se añaden 215,5 ml de Mab CHv62.21pAF a una concentración de 17,17 mg/ml formulado en tampón citrato 50 mM que contiene NaCl 500 mM a un pH final de 4,0 a 9,7 ml de tampón citrato 50 mM que contiene NaCl 500 mM a un pH final de 4,0, 9,1 ml de hidrazida acética 1,35 M (disuelta en agua), 7,26 ml de dMsO y 5,08 ml de una solución 50 mM de AGL-0182-30 (disuelta en DMSO). Se deja que se produzca la conjugación a 28 °C durante 16-24 horas. El exceso de AGL-0182-30 y otros componentes de reacción de moléculas pequeñas se retiran mediante ultrafiltración/diafiltración con 12 diavolúmenes de histidina 20 mM pH 6,0 que contiene trehalosa al 5 %. El conjugado de anticuerpo-fármaco resultante (ADC) se denomina CHv62.21pAF-AGL-0182-30 y tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000058_0001
En donde el Mab es CHv62.21pAF y p es de 1,8 a 2,0. El valor p promedio del conjugado anticuerpo-fármaco indicado en este Ejemplo fue de aproximadamente 1,9 por análisis de espectrometría de masas. En una realización de la presente invención, el valor de p está entre 1,5 y 2,5.
El ADC resultante de la presente invención incorpora un nnAA en el componente de anticuerpo del ADC por lo que el Enlazador de Fármaco se conjuga mediante enlace de oxima y se usa para el tratamiento terapéutico de los cánceres indicados en la Tabla I.
Ejemplo 9
Caracterización del MAb CHv62.21
Los MAb que se unen a FLT3 se generaron usando los procedimientos establecidos en el ejemplo titulado "Generación de anticuerpos monoclonales (MAb) de FLT3" y se cribaron, se identificaron y se caracterizaron usando una combinación de ensayos conocidos en la técnica.
A. Unión FACS
Se probó la unión de CHv62.21 a líneas celulares de LMA y LLA-B cultivadas in vitro. (Véase, la Tabla VII). Resumiendo, se biotinilaron CHv62.21 y un anticuerpo de control de isotipo coincidente usando biotina NHS LC. In vitro, se usaron líneas de células cancerosas de crecimiento exponencial para todos los experimentos. Las células se recolectaron y lavaron mediante centrifugación. Las células se bloquearon con Fc para reducir la unión no específica. Los anticuerpos se diluyeron a una concentración final de 10 ug/ml y se co-incubaron con células a 4 °C durante 1 hora. Al final de la incubación, las células se lavaron y se incubaron con detección secundaria de anticuerpo estreptavidina-PE a una dilución final 1:200 (2,5 ug/ml) durante 1 hora a 4 °C. Después de lavar el anticuerpo secundario no unido, las células se analizaron mediante FACS y se determinó y notificó la fluorescencia media geométrica. La relación de fluorescencia se calculó como sigue: Geo media de cHv62.21/ Geo media de control de isotipo=MFR, una medida de la multiplicidad de expresión por encima del control de isotipo.
Se obtuvieron los valores medios geométricos y los valores de las relaciones de florescencia media (MFR) (Tabla VI) y se muestran los histogramas (Tabla VII). Los resultados muestran que el CHv62.21 se une a varias líneas de células cancerosas humanas que expresan AML y B-ALL.
B. Actividad ADCC
Se analizaron CHv62.21 y CHv62.21pAF para determinar la actividad ADCC in vitro. Resumiendo, los anticuerpos monoclonales anti-FLT3 desnudos y ADC, CHv62.21 y CHv62.21pAF, se probaron por su capacidad para mediar la actividad de citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) usando las líneas celulares diana EOL-1 y SEM en presencia de las células efectoras, PBMC humanas normales usando el ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® (Promega, G1780).
Un (1) día antes de realizar el ensayo, tres (3) viales de las células efectoras, PBMC humanas normales (Hemacare, ID del donante: 1888), se descongelaron, se lavaron y se sembraron en matraces de cultivo celular T-175 en RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 %. Los matraces se almacenaron en una incubadora a 37 °C CO2 al 5 % durante la noche. El día siguiente, las PBMC se recogieron de los matraces de cultivo usando tripsina-EDTA al 0,25 % (Gibco) y se lavaron y se sembraron a una concentración de 1,0e6 células/pocillo en tampón de ensayo (RPMI1640+FBS al 0,1 %). Las células diana SEM y EOL-1 junto con la línea celular de control positivo, Raji, se recolectaron, se lavaron y se sembraron a una concentración de 2,0e5 células/pocillo usando tampón de ensayo.
Cada una de las muestras de prueba se diluyó hasta una concentración final de 2,5 ug/ml en tampón de ensayo. Los volúmenes iguales de células diana, muestra de ensayo y células efectoras se añadieron a los pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos por triplicado. La placa se centrifugó suavemente y se incubó durante 4 horas en una incubadora humidificada a 37 °C. Después de las cuatro (4) horas de incubación, las placas de ensayo se centrifugaron y se recogió un volumen de 50 pl del sobrenadante y se transfirió a una placa de 96 pocillos nueva. La actividad de la lactato deshidrogenasa en el sobrenadante se determinó usando el kit de detección de LDH colorimétrico; Ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® (Promega) con lecturas de absorbancia tomadas a 490 nm.
Los datos se analizaron primero restando el promedio de los valores de absorbancia de los pocillos de fondo del medio de cultivo de todos los valores de absorbancia de los pocillos Experimental, Efector espontáneo, Diana espontánea y Diana máxima. A continuación, el promedio de las lecturas de absorbancia corregidas se normalizó y la actividad ADCC se calculó usando la siguiente fórmula:
E x p e r im e n ta l — E f e c t o r e sp o n tán e o — D ia n a e sp o n tá n e a
Los resultados de la Figura 7 muestran que los MAb CHv62.21 y CHv62.21pAF no muestran actividad ADCC. Sin embargo, el control positivo, Rituximab confirma la actividad ADCC en la línea celular Raji.
Ejemplo 10
CHv62.21pAF-AGL-0182-30 inhibe el crecimiento de tumores in vivo
La expresión significativa de FLT3 en células tumorales, junto con su expresión restrictiva en células normales hace que FLT3 sea una buena diana para la terapia con anticuerpos y, de manera similar, terapia a través de ADC. Por lo tanto, se evalúala efectividad terapéutica de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 en modelos de ratón de xenoinjerto de cáncer ALL, AML y B-LL humanos.
La efectividad del conjugado anticuerpo-fármaco sobre el crecimiento tumoral y la formación de metástasis se estudia en modelos de xenoinjerto de cáncer de ratón (por ejemplo, subcutáneo y ortotópico).
Los tumores subcutáneos (s.c.) se generan mediante la inyección de 5 x 104-106 células cancerosas mezcladas a una dilución 1:1 con Matrigel (Collaborative Research) en el flanco derecho de ratones SCID macho. Para probar la eficacia de ADC en la formación de tumores, es decir, las inyecciones de ADC se inician el mismo día que las inyecciones de células tumorales. Como control, a los ratones se les inyecta IgG humana purificada o PBS; o un MAb purificado que reconoce un antígeno irrelevante no expresado en células humanas. En estudios preliminares, no se encuentran diferencias entre el control de IgG o PBS sobre el crecimiento del tumor. Los tamaños de los tumores se determinan mediante medidas de calibre y el volumen del tumor se calcula como ancho2 x Longitud/2, en donde el ancho es la dimensión más pequeña y la longitud es la dimensión más grande. Se sacrifican los ratones con tumores subcutáneos de más de 1,5 cm de diámetro.
Una ventaja de los modelos de cáncer de xenoinjerto es la capacidad de estudiar la neovascularización y la angiogénesis. El crecimiento del tumor depende en parte del desarrollo de nuevos vasos sanguíneos. Aunque el sistema capilar y la red sanguínea en desarrollo son de origen del hospedador, el inicio y la arquitectura de la neovasculatura están regulados por el tumor del xenoinjerto (Davidoff et al., Clin Cancer Res. (2001) 7:2870; Solesvik et al., Eur J Cancer Clin Oncol. (1984) 20:1295). El efecto del anticuerpo y la molécula pequeña sobre la neovascularización se estudia de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tal como por el análisis IHC de tejidos tumorales y su microambiente circundante.
El ADC CHv62.21pAF-AGL-0182-30 inhibe la formación en línea o líneas celulares cancerosas denominadas xenoinjertos cancerosos establecidos subcutáneos MV4-11. Estos resultados indican la utilidad de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 en el tratamiento de estadios locales y avanzados del cáncer y, preferentemente, aquellos cánceres indicados en la Tabla I.
ADC FLT3:
Se generaron anticuerpos monoclonales contra FLT3 como se describe en el Ejemplo titulado "Generación de anticuerpos monoclonales (MAb) FLT3". Además, los MAb se conjugan con una toxina como se describe en el Ejemplo titulado "Conjugación de anticuerpo-fármaco de MAb CHv62.21pAF" para formar CHv62.21pAF-AGL-0182-30. El CHv62.21pAF y el CHv62.21pAF-AGL-0182-30 se caracterizan por fAc S y otros métodos conocidos en la técnica para determinar su capacidad para unirse a FLT3.
Líneas celulares y xenoinjertos:
Las células se mantienen en DMEM, suplementado con L-glutamina y 10 % FBS, como se conoce en la técnica. Los xenoinjertos MV4-11 se mantienen mediante propagación en serie en ratones SCID.
Valoración de efectividad y dosis de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 en el modelo de xenoinjerto establecido por vía subcutánea de la línea celular MV4-11 de leucemia mielomonocítica B humana implantada en ratones CB 17/SCID.
En este experimento, células MV4-11 de leucemia mielomonocítica B humana (3,0x106 células por ratón) se inyectaron en los flancos de ratones SCID individuales y se dejó que los tumores crecieran. Cuando los volúmenes tumorales promedio alcanzaron un tamaño predeterminado (200 mm3), los animales se emparejaron por tamaño de tumor y se asignaron al azar en grupos de tratamiento y control con un tamaño de tumor medio similar y variación en cada grupo usando el software Study Director (v.2.1; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA). Todos los ratones del estudio se precargaron con bloqueante de Fc (mlYS-1c3.1-hIgG1) a 20 mg/kg mediante inyección intraperitoneal en la tarde anterior al día de la administración del fármaco.
Se dosificó CHv62.21pAF-AGL-0182-30 a 3 niveles de dosificación diferentes (0,5, 1,0 y 2,0 mg/kg) como un solo bolo mediante inyección intravenosa. Histidina 20 mM / Trehalosa al 5 %, pH 6,0 y 91.1-AGL-0182-30 se usaron como el vehículo y los controles de ADC, respectivamente. Todos los agentes se administraron basándose en el peso corporal individual de cada animal obtenido inmediatamente antes de cada dosificación. El crecimiento tumoral en cada grupo se controló dos veces por semana usando medidas de calibre hasta la finalización del estudio. Se realizó un análisis estadístico de los datos del volumen tumoral del último día antes del sacrificio del animal utilizando la prueba de Kruskal-Wallis. Se realizaron comparaciones por pares usando los procedimientos de prueba de Tukey (de 2 lados) para proteger la tasa de error de los experimentos.
Este estudio evaluó la efectividad de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 y lo comparó con su control de ADC (91.1-AGL-0182-30) en el modelo de xenoinjerto de leucemia mielomonocítica B humana MV4-11 establecido por vía subcutánea en ratones CB17/SCID. Se administró CHv62.21pAF-AGL-0182-30 a 3 niveles de dosificación diferentes (0,5, 1,0 y 2,0 mg/kg) como una dosis sola mediante inyección en bolo intravenosa (i.v.). Se dosificó 91.1-AGL-0182-30 a 2 mg/kg por vía i.v. como control de ADC. E histidina 20 mM /trehalosa al 5 %, pH 6,0 se usó como el control de vehículo.
Los resultados no indicaron diferencia estadística entre los tratamientos del vehículo y los controles ACD (p>0,9999). CHv62.21pAF-AGL-0182-30 a 2,0 mg/kg hizo una regresión estadísticamente significativa del tumor en un 100 % (p<0,0001), en comparación con el tamaño del tumor inicial al comienzo de la dosificación. En comparación con el control del vehículo, CHv62.21pAF-AGL-0182-30 a 1,0 mg/kg inhibió de forma estadísticamente significativa el crecimiento tumoral en un 78,1 % (p<0,0001). CHv62.21pAF-AGL-0182-30 no mostró ninguna efectividad en este modelo a la dosis de 0,5 mg/kg (p=0,5344). (Figura 5).
Efectividad de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) y CHv62.21pAF (anticuerpo desnudo) en un modelo de xenoinjerto establecido por vía subcutánea de la línea celular MV4-11 de leucemia mielomonocítica B humana implantada en ratones CB17 SCID.
En otro experimento, células MV4-11 de leucemia mielomonocítica B humana (3,0x106 células por ratón) se inyectaron en los flancos de ratones SCID individuales y se dejó que los tumores crecieran. Cuando los volúmenes tumorales promedio alcanzaron un tamaño predeterminado (200 mm3), los animales se emparejaron por tamaño de tumor y se asignaron al azar en grupos de tratamiento y control con un tamaño de tumor medio similar y variación en cada grupo usando el software Study Director (v.2.1; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA). Todos los ratones del estudio se precargaron con bloqueante de Fc (mlYS-1c3.1-hIgG1) a 20 mg/kg mediante inyección intraperitoneal en la tarde anterior al día de la administración del fármaco. Se dosificaron CHv62.21pAF-AGL-0182-30 y el control de ADC (91.1-AGL-0182-30) a 1 mg/kg como un solo bolo mediante inyección intravenosa. AGS62P (alias CHv62.21pAF) y el control de anticuerpo desnudo (91.1-pAF) se dosificaron a 2 mg/kg como un solo bolo mediante inyección intravenosa. Todos los agentes se administraron basándose en el peso corporal individual de cada animal obtenido inmediatamente antes de cada dosificación. El crecimiento tumoral en cada grupo se controló dos veces por semana usando medidas de calibre hasta la finalización del estudio. Se realizó un análisis estadístico de los datos del volumen tumoral del último día antes del sacrificio del animal utilizando la prueba de Kruskal-Wallis. Se realizaron comparaciones por pares usando los procedimientos de prueba de Tukey (de 2 lados) para proteger la tasa de error de los experimentos.
Este estudio evaluó la efectividad de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) y CHv62.21pAF (anticuerpo desnudo).
Los resultados muestran que en comparación con el control ADC (91.1-AGL-0182.30), CHv62.21pAF-AGL-0182-30 a 1,0 mg/kg como dosis única mediante inyección intravenosa inhibió de forma estadísticamente significativa el crecimiento tumoral en un 51,4 % (p=0,0010). En comparación con el control de anticuerpo desnudo (91.1-pAF), CHv62.21pAF a 2,0 mg/kg como dosis única por inyección intravenosa no mostró diferencias estadísticamente diferentes (p=0,6570). Adicionalmente, los resultados indicaron que CHv62.21pAF-AGL-0182-30 a 1,0 mg/kg inhibió de forma estadísticamente significativa el crecimiento tumoral en un 54,3 %, en comparación con CHv62.21pAF a 2,0 mg/kg (p=0,0134). (Figura 6 ).
Efectividad de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) y CHv62.21pAF (anticuerpo desnudo) en un modelo de xeno injerto establecido por vía subcutánea de la línea celular MV4-11 de leucemia mielomonocítica B humana implantada en ratones CB17 SCID.
En otro experimento, células MV4-11 de leucemia mielomonocítica B humana (3,0x106 células por ratón) se inyectaron en los flancos de ratones SCID individuales y se dejó que los tumores crecieran. Cuando los volúmenes tumorales promedio alcanzaron un tamaño predeterminado (200 mm3), los animales se emparejaron por tamaño de tumor y se asignaron al azar en grupos de tratamiento y control con un tamaño de tumor medio similar y variación en cada grupo usando el software Study Director (v.2.1; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA). Todos los ratones del estudio se precargaron con bloqueante de Fc (mlYS-1c3.1-hIgG1) a 20 mg/kg mediante inyección intraperitoneal en la tarde anterior al día de la administración del fármaco. Se dosificaron CHv62.21pAF-AGL-0182-30 y el control de ADC (91.1-AGL-0182-30) a 2 mg/kg QW durante 2 semanas mediante inyección intravenosa. AGS62P (alias CHv62.21pAF) y el control de anticuerpo desnudo (91.1-pAF) se dosificaron a 2 mg/kg QW durante semanas mediante inyección intravenosa. Todos los agentes se administraron basándose en el peso corporal individual de cada animal obtenido inmediatamente antes de cada dosificación. El crecimiento tumoral en cada grupo se controló dos veces por semana usando medidas de calibre hasta la finalización del estudio. Se realizó un análisis estadístico de los datos del volumen tumoral del último día antes del sacrificio del animal utilizando la prueba de Kruskal-Wallis. Se realizaron comparaciones por pares usando los procedimientos de prueba de Tukey (de 2 lados) para proteger la tasa de error de los experimentos.
Este estudio evaluó la efectividad de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 (ADC) y Chv62.21pAF (anticuerpo desnudo) usando un régimen de dosis múltiples durante un marco de tiempo de 2 semanas.
Los resultados muestran que en comparación con el control ADC (91.1-AGL-0182.30), CHv62.21pAF-AGL-0182-30 a 2,0 mg/kg como una dosis múltiple por inyección intravenosa inhibió de forma estadísticamente significativa el crecimiento del tumor con una regresión del tumor del 100 % el día 17 (p=0,0001). En comparación con el control de anticuerpo desnudo (91.1-pAF), CHv62.21pAF a 2,0 mg/kg como una dosis múltiple por inyección intravenosa no mostró diferencias estadísticamente diferentes. (Figura 13).
Efectividad de CHv62.21pAF-AGL-0182-30 en el modelo de xenoinjerto SEM-xcl establecido subcutáneamente en ratones CB17 SCID.
En otro experimento, células SEM-xcl de leucemia linfoblástica aguda humanas (1,0x106 células por ratón) se inyectaron en los flancos de ratones SCID individuales y se dejó que los tumores crecieran. Cuando los volúmenes tumorales promedio alcanzaron un tamaño predeterminado (200 mm3), los animales se emparejaron por tamaño de tumor y se asignaron al azar en grupos de tratamiento y control con un tamaño de tumor medio similar y variación en cada grupo usando el software Study Director (v.2.1; Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA).
Se dosificó CHv62.21pAF-AGL-0182-30 a 5,0 mg/kg, 2,0 mg/kg o 1,0 mg/kg como dosis única en bolo el día 0 mediante inyección intravenosa. El ADC control, AGS91.1-pAF-AGL-0182-30, se dosificó a 5,0 mg/kg usando la misma vía y programa de dosificación. Histidina 20 mM/trehalosa al 5 %, pH 5,2 se usó como el vehículo. Todos los agentes se administraron basándose en el peso corporal individual de cada animal obtenido inmediatamente antes de cada dosificación. El crecimiento tumoral en cada grupo se controló dos veces por semana usando medidas de calibre hasta la finalización del estudio. Se realizó un análisis estadístico de los datos del volumen tumoral del último día antes del sacrificio del animal utilizando la prueba de Kruskal-Wallis. Se realizaron comparaciones por pares usando los procedimientos de prueba de Tukey (de 2 lados) para proteger la tasa de error de los experimentos. Los resultados muestran que CHv62.21pAF-AGL-0182-30 en los tres niveles de dosificación (5,0, 2,0 y 1,0 mg/kg) demostraron una potente actividad antitumoral en comparación con el ADC de control, AGS91.1-pAF-AGL-0182-30, o al control del vehículo (p<0,0001), dando como resultado más del 75 % de inhibiciones del crecimiento tumoral en general. Por otra parte, cuando se dosificó a 5,0 mg/kg, CHv62.21pAF-AGL-0182-30 redujo significativamente el tumor en un 57,3 % en comparación con su volumen de tumor de partida inicial. Se observó una diferencia estadísticamente significativa en la efectividad entre 5,0 mg/kg y 2,0 mg/kg o 1,0 mg/kg. (Figura 14).
Conclusión
En resumen, las Figuras 5, 6, 13 y 14 muestran que el ADC de FLT3 titulado CHv62.21pAF-AGL-0182-30 inhibió significativamente el crecimiento de células tumorales que expresan FLT3 en comparación con los ADC de control y los anticuerpos desnudos que se unen a FLT3. Por lo tanto, el CHv62.21pAF-AGL-0182-30 puede usarse con fines terapéuticos para tratar y controlar los cánceres expuestos en la Tabla I.
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Ensayos clínicos en seres humanos para el tratamiento y diagnóstico de carcinomas humanos a través del uso de ADC FLT3
Los ADC de FLT3 se usan de acuerdo con la presente invención que se unen específicamente a FLT3 y se usan en el tratamiento de determinados tumores, preferentemente aquellos listados en la Tabla I. En relación con cada una de estas indicaciones, se persiguen con éxito dos enfoques clínicos.
I. ) Terapia complementaria: En terapia complementaria, los pacientes se tratan con ADC FLT3 en combinación con un agente quimioterapéutico o antineoplásico y/o radioterapia o una combinación de los mismos. Las dianas de cáncer primario, tales como aquellas listadas en la Tabla I, se tratan con protocolos convencionales mediante la adición de ADC FLT3 a la terapia convencional de primera y segunda línea. Los diseños de protocolo abordan la eficacia según la evaluación de los siguientes ejemplos, incluyendo pero no limitado a, reducción de la masa tumoral de lesiones primarias o metastásicas, supervivencia libre de progresión aumentada, supervivencia general, mejora de la salud de los pacientes, estabilización de enfermedades, así como la capacidad de reducir las dosis habituales de quimioterapia convencional y otros agentes biológicos. Estas reducciones de dosis permiten una terapia adicional y/o prolongada al reducir la toxicidad relacionada con la dosis del agente quimioterapéutico o biológico. Los ADC de FLT3 se usan en varios ensayos clínicos complementarios en combinación con agentes quimioterapéuticos o antineoplásicos.
II. ) Monoterapia: En relación con el uso de los ADC FLT3 en monoterapia de tumores, los ADC FLT3 se administran a pacientes sin un agente quimioterapéutico o antineoplásico. En una realización, la monoterapia se realiza clínicamente en pacientes con cáncer en etapa terminal con enfermedad metastásica extensa. Los diseños de protocolo abordan la eficacia según la evaluación de los siguientes ejemplos, incluyendo pero no limitado a, reducción de la masa tumoral de lesiones primarias o metastásicas, supervivencia libre de progresión aumentada, supervivencia general, mejora de la salud de los pacientes, estabilización de enfermedades, así como la capacidad de reducir las dosis habituales de quimioterapia convencional y otros agentes biológicos.
Dosificación
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria usada en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se vayan a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosificación unitaria está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del anticuerpo y/o ADC y del efecto terapéutico o profiláctico concreto que se vaya a lograr y de (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formar compuestos de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Un intervalo ilustrativo no limitante para una cantidad terapéuticamente eficaz de un ADC FLT3 administrado en combinación es de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mg/kg, al menos 1 mg/kg, al menos 2 mg/kg, al menos 3 mg/kg o al menos 4 mg/kg. Otros intervalos ilustrativos no limitantes son, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 mg/kg, o por ejemplo de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 5 mg/kg, o por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 7,5 mg/kg. La dosis alta se refiere a una dosis de más de 10 mg/kg. Cabe señalar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección a aliviar, y pueden incluir dosis únicas o múltiples. Cabe entender además que para cualquier sujeto particular, deben ajustarse los regímenes de dosificación específicos con el paso del tiempo según las necesidades del individuo y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones y que los intervalos de dosificación expuestos en el presente documento son únicamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada.
Plan de desarrollo clínico (CDP)
El CDP sigue y desarrolla tratamientos de ADC de FLT3 en relación con la terapia adyuvante o la monoterapia. Los ensayos inicialmente demuestran la seguridad y luego confirman la eficacia en dosis repetidas. Los ensayos son de etiqueta abierta que comparan la quimioterapia estándar con la terapia convencional más ADC FLT3. Como se apreciará, un criterio no limitante que puede utilizarse en relación con el reclutamiento de pacientes son los niveles de expresión de FLT3 en sus tumores determinados por biopsia.
Al igual que con cualquier producto terapéutico basado en infusión de proteínas o anticuerpos, los problemas de seguridad están relacionados principalmente con (i) síndrome de liberación de citocinas, es decir, hipotensión, fiebre, sacudidas, escalofríos; (ii) el desarrollo de una respuesta inmunogénica al material (es decir, el desarrollo de anticuerpos humanos por parte del paciente al anticuerpo terapéutico, o respuesta HAMA); y, (iii) toxicidad para las células normales que expresan FLT3. Se usan pruebas convencionales y seguimiento para monitorizar cada uno de estos problemas de seguridad. Se ha descubierto que los ADC de FLT3 son seguros tras la administración en seres humanos.
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Dete cción de proteína FLT3 en especímenes derivados de pacientes normales y con cáncer
La detección de la proteína FLT3 en el cáncer usando anticuerpos anti-FLT3 se evaluó en muestras de PBMC de sangre periférica de pacientes con leucemia linfocítica aguda en poblaciones de células mieloides (AML).
A. Materiales y métodos de unión de FACS
En este experimento, las muestras se incubaron con un cóctel de CD45, CD33, CD34, CD3, CD20, CD38 y mAb anti-Flt3-biotina o isotipo-biotina. La detección secundaria de mAb biotinilados fue estreptavidina-PE. Se prepararon cócteles de control de fluorescencia menos uno (FMO) con reactivo de detección de estreptavidina-PE (SAv-PE) y se usaron para controlar poblaciones de células. Se usó un citómetro de flujo LSRII (Bd Biosciences) para la adquisición de datos.
Los linfocitos se activaron en la población CD45+ a partir de la cual se identificaron cuatro poblaciones distintas, CD33+/3-/20-(Blastos mieloides), CD33+/3-/34+/38-(Células madre), CD33-/3+ (células T) y CD33-/20+ (células B). El análisis se realizó con el software Flowjo versión 9.5.4 (Tri-Star, Ashland, OR). Los valores fluorescentes se informan como media geométrica (MFI).
B. Resultados
Los resultados establecidos en la Tabla VIII para muestras de pacientes con AML muestran que MAb anti-FLT3 se une a las poblaciones mieloides, de células madre, de células T y B de todas las muestras analizadas.
Adicionalmente, como se muestra en la Tabla VIII, las gráficas de distribución MFIR para todas las muestras analizadas muestran una variabilidad moderada en las poblaciones mieloides, de células madre y de células B, mientras que las células T tenían menos variabilidad en MFIR. La MFIR media para blastos mieloides fue de alrededor de 963,1, mientras que la MFIR media para las células madre fue 318,2, mientras que la MFIR media para las células T fue de 9,842, mientras que MFIR para células B fue 72,60 en AML. La MFIR media de para muestras normales fue 642,4 en mieloides, 68,29 para las células madre, 11,66 para células T, y 13,73 para células B.
La totalidad de los resultados expuestos en la Tabla VIII muestran que los MAb anti-FLT3, tales como el MAb CHv62.21 y el MAb Chv62.21pAF de la invención pueden detectar la proteína FLT3 sobreexpresada en AML.
Ejemplo 13
Citotoxicidad celular in vitro mediada por CHv62.21pAF y CHv62.21pAF-AGL-0182-30
La capacidad del anticuerpo FLT3 (CHv62.21pAF) y ADC FLT3 (CHv62.21pAF-AGL-0182-30) para mediar la citotoxicidad dependiente de FLT3 se evaluó usando las líneas celulares de leucemia humana MV-4-11 y MOLM-13, que expresan endógenamente FLT3 y la línea celular de leucemia humana, Karpas299, que no expresa FLT3. Resumiendo, las células MV-4-11, MOLM-13 y Karpas299 se sembraron en 50 pl de medio completo, a una densidad de 1500, 2000 y 3000 células/pocillo, respectivamente, en placas de 96 pocillos y se coloca en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados C; 5 % de CO2. El día siguiente, las células se bloquearon con Fc a un volumen de 25 pl por pocillo para reducir la unión no específica y una solución madre 4x de cHv62.21pAF-AGL-0182-30, anticuerpo de control de isotipo conjugado con AGD-0182 (91.1pAF-AGL-0182-30), cHv62.21pAF y el anticuerpo de control de isotipo (91.1pAF) se prepararon en medio completo y se añadieron 25 pl de las diluciones seriadas de los ADC y los anticuerpos a los pocillos apropiados. Las células se trataron con cHv62.21pAF-AGL-0182-30, 91.lpAF-AGL-0182-30, cHv62.21pAF y 91.1pAF durante 5 días en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados C; 5 % de CO2. Al final del periodo de incubación, se añadieron 20 pl de Presto Blue a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas. Las placas se leyeron usando un lector de placas BioTek Synergy H4 usando longitudes de onda 540 de excitación y 590 de emisión.
Los resultados de la Tabla IX muestran que el ADC anti-FLT3 (CHv62.21pAF-AGL-0182-30) puede inducir selectivamente la citotoxicidad de las líneas celulares MOLM-13 y MV-4-11 que expresan FLT3 mientras que no puede inducir la citotoxicidad de la línea celular Karpas299 que no expresa FLT3. El anticuerpo anti-FLT3 (CHv62.21pAF) no induce citotoxicidad en las líneas celulares Mo LM-13 y MV-4-11. Por lo tanto, estos datos demuestran que el FLT3 MAb CHv62.21pAF solo no induce la citotoxicidad de las células. Más bien, solo el FLT3 ADC CHv62.21pAF-AGL-0182-30 puede destruir selectivamente las células MOLM-13 y MV-4-11 que expresan FLT3, mientras que no tiene efecto sobre las células Karpas299 que no expresan FLT3.
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Ventajas de CHv62.21pAF sobre MAb FLT3 de la técnica anterior
El MAb CHv62.21pAF de la invención presenta varias ventajas sobre otros MAb que se unen a FLT3. Especialmente cuando se considera a la luz de la utilidad terapéutica del ADC de la invención. Por ejemplo, la técnica anterior enseña que después de que los pacientes con AML hayan sido tratados con quimioterapia, hay un aumento en la expresión del ligando FLT3 en plasma ("FL"). Véase, Takashi, et. al., Blood vol. 117(12) (marzo de 2011). Además, se ha demostrado que el aumento de FL reduce significativamente la actividad de los inhibidores de FLT. Id. Se ha informado que el Eb 10 conjugado con monometil auristatina F (EB 10-MMAF) es el ADC que comprende el anticuerpo anti-FLT3 humano. (Véase, Proc Amer Assoc Cancer Res, Volumen 46, 2005). Se ha demostrado que el EB1O bloquea FL. Véase, Patente de EE.UU. N.° 8.071.099 (Imclone). En consecuencia, un objeto de la presente divulgación es diseñar MAb que se unan al antígeno FLT3, pero no se unan a FL.
En un experimento, se confirmó que el MAb CHv62.21 de la invención no bloquea FL. Resumiendo, se adquirió FLT3-Fc humano recombinante de R and D Systems. Esta proteína se inmovilizó sobre la superficie de microesferas Luminex activadas usando química sulfo-NHS/EDC convencional de acuerdo con el procedimiento proporcionado por Luminex. Una versión de la proteína con etiqueta His, junto con varias otras proteínas se conjugaron con microesferas Luminex y sirvieron como controles en este procedimiento.
Además, el ligando FLT3 también se adquirió de R and D Systems. El ligando se biotiniló usando Thermo Scientific EZ-Link Sulfa-NHS-LC-Biotin, Fórmula sin peso según las recomendaciones del fabricante. Después de dos (2) horas de hacer reaccionar la proteína con Sulfo-NHS-LC-Biotin, la biotina no incorporada se retiró mediante diálisis contra DPBS.
La capacidad de FLT3 inmovilizado sobre la superficie de las microesferas para unirse a su ligando biotinilado se evaluó haciendo reaccionar las microesferas con diversas concentraciones de ligando biotinilado, preparado en tampón que contiene PBS, BSA al 2 %, Tween 20 al 0,05 % y azida sódica al 0,1 %, durante 120 minutos a TA con agitación suave. Al final de la incubación, las microesferas se aspiraron y se lavaron. El ligando FLT3 biotinilado unido a su receptor inmovilizado se detectó con estreptavidina-R-ficoeritrina (Moss, Inc.). La fluorescencia asociada a las microesferas se midió con el instrumento Luminex. Esta evaluación reveló que una concentración de 5 ng/ml de ligando FLT3 biotinilado era suficiente para generar una señal robusta, pero no saturó el FLT3 asociado con las microesferas.
Finalmente, para evaluar la capacidad de los anticuerpos FLT3 para bloquear potencialmente el ligando, se prepararon mezclas que contenían ligando FLT3 biotinilado a 5 ng/ml, más los diversos anticuerpos bajo investigación a 10 pg/ml. Estas mezclas se aplicaron al FLT3 inmovilizado sobre las microesferas y se incubaron durante 60 minutos. Al final de la incubación, las microesferas se aspiraron y se lavaron. El ligando FLT3 biotinilado unido a su receptor inmovilizado se detectó con estreptavidina-R-ficoeritrina (Moss, Inc.). La fluorescencia asociada a las microesferas se midió con el instrumento Luminex. Los anticuerpos con la capacidad de bloquear el ligando se observaron mediante la reducción de MFI (mediana de la intensidad de fluorescencia).
Los resultados de la Figura 8 confirman que FLT3 MAb CHv62.21 no es un bloqueante de FL y otro FLT3 Mab denotado v62-1b37.1 (Tabla X) es un bloqueante de FL, similar al MAb FLT3 de la técnica anterior denotado EB 10 (Véase, la Patente de EE.UU. N.° 8.071.099).
La capacidad de los anticuerpos FLT3 (CHv62.21 y v62-1b37.1) para mediar el efecto del ligando FLT3 humano se evaluó utilizando la línea celular de leucemia humana EOL-1, que expresa de forma endógena FLT3. También se usó el anticuerpo de control de isotipo (mlys-1c3.1). Las células EOL-1 se sembraron en 50 pl de medio completo, a una densidad de 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se colocaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C; 5 % de CO2. El día siguiente, las células se trataron con 50, 10 o 5 ng/ml de ligando FLT3 humano (en 25 pl de medio completo) y 10, 1, 0,1 y 0 pg/ml de anticuerpo de prueba (en 25 pl de medio completo). Se usó medio solo como el control sin tratar. Las células se trataron durante 5 días en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C; 5 % de CO2. Al final del periodo de incubación, se añadieron 100 pl de Cell Titer Glo a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos, agitando, a temperatura ambiente. Las placas se leyeron usando un lector de placas BioTek Synergy H4 usando luminiscencia y se graficaron usando el software Graphpad Prism.
Los resultados en la Figura 9, muestran que el v62-1b37.1 inhibe el crecimiento a altas concentraciones en presencia del ligando FLT3, pero CHv62.21 no tiene ningún efecto sobre el crecimiento. El ligando FLT3 humano solo no tiene ningún efecto sobre el crecimiento de la línea celular EOL-1.
Basado en las enseñanzas de que la concentración de FL en plasma se aumentó después de la quimioterapia para el tratamiento del cáncer (Véase, Takashi et. al., anteriormente citado), se demostró que existen ventajas cuando los MAb FLT3 de la invención no bloquean FL. Para confirmar este punto, se demostró que mientras que la actividad citotóxica de un MAb que bloquea el ligando se reduce en presencia de FL, la actividad citotóxica de un Mab que no bloquea el ligando no se reduce en presencia de FL.
La capacidad de los ADC de FLT3 (cHv62.21pAF-AGL-0182-30 y v62-1b21.1-AGL-0129-08) para mediar la citotoxicidad dependiente de FLT3 en ausencia y presencia de ligando FLT3 humano (hFL) se evaluó utilizando el línea celular de leucemia RS-4-11, que expresa de forma endógena FLT3.
Resumiendo, las células RS-4-11 se sembraron en 50 j l de medio completo a una densidad de 3000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se colocaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C; 5 % de CO2. El día siguiente, los ADC se prepararon en medio completo a 10 jg/ml y se diluyeron en serie 1:5 para un total de 9 puntos. Se añadieron 25 j l de las diluciones en serie de los ADC a los pocillos apropiados con y sin ligando FLT3 humano (100 ng/ml añadidos 25 j l por pocillo). Las células se trataron con v62-1b21.1-AGL-0129-08 (Tabla XI, Véase, el documento WO2015/183978, Agensys, Inc.) y v62-1b37.1-AGL-0129-08 con y sin ligando FLT3 humano durante 5 días en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C; 5 % de CO2. Al final del periodo de incubación, se añadieron 20 j l de Presto Blue a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas. Las placas se leyeron utilizando un lector de placas BioTek Synergy H4 usando longitudes de onda 540 de excitación y 590 de emisión y se representaron gráficamente utilizando el software Graphpad Prism.
Los resultados de la Figura 10(A) y 10(B) muestran que los ADC anti-FLT3 (v62-1b21.1-AGL-0129-08 y v62-1b37.1-AGL-0129-08) pueden inducir la citotoxicidad del FLT3 que expresa la línea celular RS-4-11. El ADC anti-FLT3, v62-1b21.1-AGL-0129-08, tiene un nivel similar de citotoxicidad en presencia y ausencia del ligando FLT3 humano. Sin embargo, la actividad citotóxica del ADC anti-FLT3, v62-1b37.1-AGL-0129-08, se reduce en presencia de ligando FLT3 humano en comparación con el tratamiento con ADC sin ligando.
En otro experimento, la capacidad de los anticuerpos anti-FLT3, CHv62.21 y v62-1b37.1, para unirse a FLT3 expresado en la superficie de la línea celular de leucemia humana MOLM-13 se evaluó en presencia de ligando FLT3 humano (hFL). El anticuerpo de control de isotipo, AGS91.1-pAF, se usó como un control negativo.
Resumiendo, las células MOLM-13 se sembraron a una densidad de 50.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Las placas se lavaron una vez con 150 j l por pocillo de PBS. Las células se bloquearon con Fc (20 jg/ml) a un volumen de 50 j l por pocillo en tampón Fa Cs (PBS FBS al 2 % azida sódica al 0,1 %) para reducir la unión no específica. Las células se incubaron a 4 °C durante 15 minutos. Se añadió ligando FLT3 humano a los pocillos apropiados a 100 ng/ml y se diluyó en serie 1:2 a través de la placa para un total de 11 puntos. Las células se incubaron durante 30 minutos a 4 °C antes de añadir anticuerpos f LT3 biotinilados. Después de la incubación, los anticuerpos anti-FLT3 biotinilados y el anticuerpo de control de isotipo se prepararon en tampón FACS a 10 jg/ml y 1 jg/ml y se añadieron 25 j l a los pocillos y se incubaron durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS y se añadieron 100 j l de estreptavidina-PE (Jackson immune) por pocillo y se incubaron durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con tampón FACS y se leyeron en el citómetro Attune (Life technologies) y se analizaron en el software FlowJo (Tree Star).
Los resultados de la Figura 11(A) muestran que el ligando FLT3 humano no interfiere con la unión del anticuerpo anti-FLT3, AGS62P, a células MOLM-13. Sin embargo, el ligando FLT3 humano interfiere con la unión del anticuerpo anti-FLT3, cHv62-1b37.1, a las células MOLM-13 de una manera dependiente de la dosis.
Finalmente, la capacidad de ADC FLT3, AGS62P1, para mediar la citotoxicidad dependiente de FLT3 en ausencia y presencia de ligando FLT3 humano (hFL) se evaluó usando la línea celular de leucemia humana MOLM-13, que expresa de forma endógena FLT3. El ADC de control de isotipo, AGS91.1.88-pAF-AGL-0182-30 se usó como un control negativo.
Resumiendo, las células MOLM-13 se sembraron en 50 j l de medio completo a una densidad de 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se colocaron en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C; 5 % de CO2. El día siguiente, las células se bloquearon con Fc a un volumen de 25 j l por pocillo para reducir la unión no específica. Los ADC se prepararon en medio completo para una concentración final de 10 jg/ml y se diluyeron en serie 1:5 para un total de 9 puntos. Se añadieron 12,5 j l de las diluciones en serie de los ADC a los pocillos apropiados con y sin ligando FLT3 humano (100 ng/ml añadidos 12,5 j l por pocillo). Las células se trataron con AGS62P1 y AGS91.1.88-pAF-AGL-0182-30 con y sin ligando FLT3 humano durante 5 días en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C; 5 % de CO2. Al final del periodo de incubación, se añadieron 20 j l de Presto Blue a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas. Las placas se leyeron utilizando un lector de placas BioTek Synergy H4 usando longitudes de onda 540 de excitación y 590 de emisión y se representaron gráficamente utilizando el software Graphpad Prism.
El resultado en la Figura 11(B) muestra que el ligando FLT3 humano no interfiere con la citotoxicidad mediada por ADC anti-FLT3 (CHv62.21pAF-AGL-0182-30) en células MOLM-13.
Por lo tanto, mientras que los MAb FLT3 pueden usarse en un contexto terapéutico, no todos los MAb FLT3 son iguales. Los resultados de las Figuras 8-11 muestran que los MAb FLT3 que no se unen a FL presentan ventajas destacadas sobre los MAb FLT3 que se muestra que se unen a FL. Además, a la luz de la utilidad terapéutica de un ADC de la invención, los resultados muestran que un ADC que comprende un Mab FLT3 no bloqueante de ligandos, tal como CHv62.21pAF-AGL-0182-30 retiene los efectos antitumorales en comparación con el ADC que comprende un Mab FLT3 bloqueante de ligando en presencia de FL. Un experto en la materia entenderá que se sabe que la presencia de FL aumenta después de los tratamientos quimioterapéuticos. Además, se sabe que se ha demostrado que la presencia elevada de FL reduce la actividad de los inhibidores de FLT3. Por consiguiente, los resultados de las Figuras 8-11 sugieren que un ADC que comprende un Mab FLT3 no bloqueante de ligando tiene un mejor índice terapéutico y efectos antitumorales en comparación con un ADC que comprende un Mab FLT3 bloqueante de ligando en pacientes con cáncer.
Ejemplo 15
Prueba de estabilidad de CHv62.21pAF-AGL-0182-30
La estabilidad de FLT3 ADC CHv62.21pAF-AGL-0182-30 y otro FLT3 ADC usando otro compuesto citotóxico denominado AGL-0301-20 (Véase, el documento WO2014/043403, Agensys, Inc.) se evaluó in vitro. En este experimento, se añadió suero humano (Millipore) con 0,4 mg/ml de cada ADC y fosfato a pH 7,3 a una concentración final de 50 mM y se incubó en una incubadora humidificada a 37 °C. Se recogieron alícuotas de 100 pl y se congelaron a -80 °C a los 5 minutos, 3 horas, 25,25 horas, 51,25 horas y 171,2 horas. Después de recolectar todas las muestras, se realizó un ELISA para cuantificar el anticuerpo y los componentes del fármaco de cada ADC.
Los resultados muestran que el enlace del anticuerpo del fármaco CHv62.21pAF-AGL-0182-30 es estable durante el transcurso del tiempo del experimento Figura 12(A). Sin embargo, La Figura 12(B) muestra que el enlace fármacoanticuerpo para v62-1b21-AGL-0301-20 es lábil, dando como resultado una desconjugación significativa durante el transcurso del tiempo del experimento.
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversos contenidos de datos del sitio web, publicaciones, solicitudes de patente y patentes. (Los sitios web se hace referencia por su localizador uniforme de recursos, o URL, las direcciones en la Web).
Tablas
Tabla I: Tejidos / células que expresan FLT3 cuando son malignos.
Leucemia mieloide aguda ("AML");
Leucemia linfoblástica aguda ("ALL")
Leucemia linfoblástica de células B;
Leucemia linfoblástica de células B precursoras.
TABLA II: Abreviaturas de aminoácidos
Figure imgf000066_0001
TABLA III: Matriz de sustitución de aminoácidos
Adaptado de la matriz de sustitución de aminoácidos de GCG Software 9.0 BLOSUM62 (matriz de sustitución de bloques). Cuanto más alto es el valor, más probable es que se encuentre una sustitución en proteínas naturales relacionadas.
Figure imgf000067_0001
1.1 2 W 7 Y
Tabla IV. Método general para la síntesis de AGL-0182-30
Método general para la síntesis de AGL-0182-30
Donde AA1 = Aminoácido 1
AA2 = Aminoácido 2
AA5 = Aminoácido 5
Dil = Dolaisoleuina
Dap = Dolaproina
Enlazador = Aminooxiacetilo Tabla V. Posiciones CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 y CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 como se identifica por los esquemas de Kabat, Chothia y Contact, respectivamente. Para CDR-H1, la numeración de restos se da listada usando los esquemas de numeración de Kabat y Chothia.
CDR Kabat Chothia Contact
L24-L34 L24-L34 L30-L36
CDR-L1 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: RNDLGWY (SEQ ID NO:
14) 15) 16)
L46-L55
CDR-L2 L50-L56 L50-L56
AASSLQS (SEQ ID NO: 17) AASSLQS (SEQ ID NO: 18) RLIYAASSLQ (SEQ ID NO:
19)
L89-L96
CDR-L3 L89-L97 L89-L97
LQHNGFPYT (SEQ ID NO: 20 LQHNGFPYT (SEQ ID NO: 21 LQHNGFPYT (SEQ ID NO:
22
CDR-H1 * H31-H35 H26-H32 H30-H35
GYSIN (SEQ ID NO: 23) GFTFSGY (SEQ ID NO: 24) SGYSIN (SEQ ID NO: 25)
CDR-H1 ** H31-H35 H26-H32 H30-H35
GYSIN (SEQ ID NO: 26) GFTFSGY (SEQ ID NO: 27) SGYSIN (SEQ ID NO: 28)
H50-H65 52-H56 H47-H58
CDR-H2 SISSSSNYIYYADSVKG (SEQ H WVSSISSSSNYI (SEQ ID
ID NO: 29) SSSSN (SEQ ID NO: 30) NO: 31)
H95-H102 H95-H102 H93-H101
CDR-H3 EGFIAGTTFDAFDI (SEQ ID EGFIAGTTFDAFDI (SEQ ID AREGFIAGTTFDAFD (SEQ
NO: 32) NO: 33) ID NO: 34)
*Numeración de Kabat
**Numeración de Chothia
Tabla VI. Tabla de valores de medias geométricos y valores de relación de florescencia media (MFR) en el ensayo
FACS.
Figure imgf000068_0001
Tabla VII. Histogramas que muestran los resultados de la unión de FACS por línea celular Tabla VIII. Expresión de FLT3 en AML primaria y muestras normales Expresión en muestras de AML
Expresión de FLT3 en muestras de AML
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000070_0003
Expresión en muestras normales
Expresión de FLT3 en muestras normales
Figure imgf000070_0002
9 Muestras de sangre del cordón/ I muestra de médula ósea
Figure imgf000070_0004
Tabla IX. Evaluación de la citotoxicidad in vitro de cHv62.21 pAF-AGL-0182-30 y cHv62.21 pAF en células MOLM-13, MV-4-11 y Karpas299
Citotoxicidad MOLM-13
Figure imgf000071_0001
Concentración (ng/ml)
Citotoxicidad Karpas299

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a FLT-3 que comprende una CDRH1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, una CDRH2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, una CDRH3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, una CDRL1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, una CDRL2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y una CDRL3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, en donde, opcionalmente, el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')2, Fv y scFv;
en donde opcionalmente el anticuerpo comprende una región Fc que es un subtipo de IgG; y en donde opcionalmente el anticuerpo comprende una región Fc que comprende una sustitución de un aminoácido no natural en la posición del aminoácido 124 de la cadena pesada y donde el aminoácido no natural es para-acetilfenilalanina (pAF).
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende
(i) una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 123o S de SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 108o R de SEQ ID NO: 10; o
(ii) una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 1er E al 452o G de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10; o
(iii) una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 452o G de SEQ ID NO: 11, en donde el 1er E de la región variable de cadena pesada o de la cadena pesada está sustituido con piroglutamato y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er E al 453o K de SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que va del 1er D al 214o C de SEQ ID NO: 10.
4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de un anticuerpo producido por una célula de ovario de hámster chino (CHO) depositada bajo el N.° de Registro de ATCC PTA-121831 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de un anticuerpo producido por un ovario de hámster chino (CHO) depositada bajo el N.° de Registro de ATCC. PTA-121831.
5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un anticuerpo producido por una célula de ovario de hámster chino (CHO) depositada bajo el N.° de Registro de ATCC PTA-121836 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de un anticuerpo producido por un ovario de hámster chino (CHO) depositada bajo el N.° de Registro de ATCC. PTA-121836.
6. Uno o más ácidos nucleicos aislados que codifican el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Uno o más vectores de expresión que comprenden el uno o más ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una célula hospedadora recombinante que comprende el uno o más vectores de expresión de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno producido cultivando la célula hospedadora recombinante de acuerdo con la reivindicación 8.
10. Un conjugado de anticuerpo fármaco que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 conjugado con un agente terapéutico a través de un enlazador,
en donde, opcionalmente, el enlazador es un enlazador no escindible, que es opcionalmente ácido 2-(aminooxi) acético.
11. El conjugado de anticuerpo fármaco de la reivindicación 10, en donde el agente terapéutico es (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-amino-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-3-azido-N-metil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamida.
12. El conjugado de anticuerpo fármaco de la reivindicación 10 o la reivindicación 11 en donde el conjugado de anticuerpo fármaco tiene la siguiente fórmula:
Anticuerpo -(Enlazador -agente terapéutico)p,
en donde el enlazador es ácido 2-(aminooxi)acético y en donde el agente terapéutico es (2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-amino-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)amino)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-3-azido-N-metil-2-((S)-3-metil-2-(metilamino)butanamido)butanamida y en donde p se selecciona del grupo que consiste en 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9,
y 3.
13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado de anticuerpo fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde, opcionalmente, la composición farmacéutica comprende además uno o más agentes antineoplásicos.
14. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13 para su uso en terapia.
15. El conjugado de anticuerpo fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento de cáncer en un sujeto, en donde, opcionalmente, el sujeto es un sujeto humano;
en donde, opcionalmente, el cáncer comprende una o más células que expresan FLT3 en un nivel aumentado en comparación con una célula no cancerosa; o
en donde, opcionalmente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en Leucemia mieloide aguda (AML), Leucemia linfoblástica aguda (ALL), Leucemia linfoblástica de células B y Leucemia linfoblástica de células B precursoras;
y en donde dicho tratamiento comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho conjugado de anticuerpo fármaco o composición farmacéutica.
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