JP6764873B2 - Ｆｌｔ３タンパク質に結合する抗体薬物複合体（ａｄｃ） - Google Patents

Ｆｌｔ３タンパク質に結合する抗体薬物複合体（ａｄｃ） Download PDF

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Description

関連出願に対する相互参照
本願は、２０１５年３月９日に提出された米国仮特許出願第６２／１３０，４７６号明細書に対する優先権を主張する。その内容は、参照によりその全体において組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルにおける配列リストの提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルにおける以下の提出の内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる：配列リストのコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：５１１５８２００９２４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０１６年３月７日、サイズ：４４，８４７バイト）。
連邦政府支援研究の下でなされた発明に対する権利の陳述
該当なし。
本明細書中に記載の発明は、ＦＬＴ３と呼ばれるタンパク質に結合する、抗体、その抗原結合断片およびその抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に関する。本発明はさらに、ＦＬＴ３を発現する癌の処置において有用な、予後診断、予防および治療方法ならびに組成物に関する。
２０１３年に１，６６０，２９０人の男女（男性８５４，７９０人および女性８０５，５００人）が癌と診断され、５８０，３５０人の男女が全部位の癌で死亡したと推定される。２００６年〜２０１０年に、全部位の癌に対する診断時年齢の中央値は６６歳であった。年齢調整発症率は男女１００，０００人あたり年間４６３．０人であった。これらの比率は、１８カ所のＳＥＥＲ地理的地域（Ｎ．Ｂ．ＳＥＥＲ＝Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｅｎｄ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｇｒａｍ，ＮＣＩ）からの２００６〜２０１０年に診断された症例に基づく。２００６〜２０１０年に、全部位の癌に対する死亡年齢の中央値は７２歳であった。年齢調整死亡率は男女１００，０００人あたり年間１７６．４人であった。これらの比率は、米国で２００６〜２０１０年に死亡した患者に基づく。１８カ所のＳＥＥＲ地理的地域からの２００３年〜２００９年の全体的な５年相対生存率は６５．８％であった。
白血病は、骨髄などの血液形成組織で始まり、異常に多数の血液細胞が産生され、血流に侵入するようになる。主要な白血病は、急性リンパ芽球性（ＡＬＬ）、急性骨髄性（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）およびヘアリー細胞（ＣＬＬ）白血病から構成される。
群としてのこれらの白血病に対して、２０１３年に、４８，６１０人の男女（２７，８８０人の男性および２０，７３０人の女性）が白血病と診断され、２３，７２０人の男女が白血病で死亡すると推定される。２００６年〜２０１０年に、白血病に対する診断時年齢の中央値は６６歳であった。年齢調整発症率は男女１００，０００人あたり年間１２．８人であった。これらの比率は、１８カ所のＳＥＥＲ地理的地域からの２００６〜２０１０年に診断された症例に基づく。２００６〜２０１０年に、白血病に対する死亡年齢の中央値は７５歳であった。年齢調整死亡率は男女１００，０００人あたり年間７．１人であった。これらの比率は、米国で２００６〜２０１０年に死亡した患者に基づく。１８カ所のＳＥＥＲ地理的地域からの２００３年〜２００９年の全体的な５年相対生存率は５６．０％であった。
ＣＬＬは成人において２番目に多いタイプの白血病であり、通常はゆっくりと悪化する。これは中年期以降に起こることが多く、小児での発症は稀である。早期ＣＬＬ患者は、症状を示すようになるか、または疾患の急速な進行の証拠を呈するまで、化学療法での処置が行われない。化学療法の早期開始は、ＣＬＬにおいて効果がなく、死亡率を増加させる可能性さえある。化学療法が開始される場合、ヌクレオシド類似体フルダラビンは、ＣＬＬにおいて最も一般的に使用される第１選択治療である。併用治療計画は、いくつかの臨床試験において奏効率の改善を示し、次のものを含む：フルダラビン、シクロホスファミドおよびリツキシマブ（ＦＣＲ）；ペントスタチン、シクロホスファミドおよびリツキシマブ（ＰＣＲ）；フルダラビン、シクロホスファミドおよびミトキサントロン（ＦＣＭ）；シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン（ＣＶＰ）；シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン（ＣＨＯＰ）。２０１３年に１５，６８０人の男女（男性９，７２０人、女性５，９６０人）が慢性リンパ球性白血病と診断され、４，５８０人の男女が死亡すると推定される。２００６年〜２０１０年に、慢性リンパ球性白血病に対する診断時年齢の中央値は７１歳であった。年齢調整発症率は男女１００，０００人あたり年間４．３人であった。これらの比率は、１８カ所のＳＥＥＲ地理的地域からの２００６〜２０１０年に診断された症例に基づく。２００６年〜２０１０年に、慢性リンパ球性白血病に対する死亡年齢の中央値は７９歳であった。年齢調整死亡率は男女１００，０００人あたり年間１．４人であった。これらの比率は、米国で２００６〜２０１０年に死亡した患者に基づく。１８カ所のＳＥＥＲ地理的地域からの２００３年〜２００９年の全体的な５年相対生存率は７９．２％であった。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は成人における最も一般的なタイプの急性白血病である。部分寛解は実質的な生存利益を提供しないため、現在のＡＭＬ処置は、完全寛解（ＣＲ）を達成するために十分に積極的であるべきである。成人ＡＭＬにおける寛解率は年齢に反比例し、６０歳未満の場合の予想寛解率は６５％を超える。データから、一度達成されると、高齢患者では寛解の持続時間が短くなり得ることが示唆される。前駆細胞抗原ＣＤ３４および／またはＰ−糖タンパク質（ＭＤＲ１遺伝子産物）を発現する患者の転帰は悪い。細胞遺伝学的分析から、利用可能な最強の予後情報が幾分か提供され、寛解誘発および寛解後療法の両方の転帰が予測される。良好な予後を示す細胞遺伝学的異常としては、ｔ（８；２１）、ｉｎｖ（１６）またはｔ（１６；１６）およびｔ（１５；１７）が挙げられる。正常な細胞遺伝学は、平均リスクＡＭＬの前兆である。長腕の欠失または５番もしくは７番染色体のモノソミーを特徴とする；３番染色体の転座または逆位、ｔ（６；９）、ｔ（９；２２）を特徴とする；または１１ｑ２３番染色体の異常を特徴とするＡＭＬ患者は、化学療法で特に予後不良である。２０１３年に１４，５９０人の男女（男性７，８２０人および女性６，７７０人）が急性骨髄性白血病と診断され、１０，３７０人の男女が死亡すると推定される。２００６年〜２０１０年に、急性骨髄性白血病に対する診断時年齢の中央値は６７歳であった。年齢調整発症率は男女１００，０００人あたり年間３．７人であった。これらの比率は、１８カ所のＳＥＥＲ地理的地域からの２００６〜２０１０年に診断された症例に基づく。２００６年〜２０１０年に、急性骨髄性白血病に対する死亡時年齢の中央値は７２歳であった。年齢調整された死亡率は、男女１００，０００人あたり年間２．８人であった。これらの比率は、米国で２００６〜２０１０年に死亡した患者に基づく。１８カ所のＳＥＥＲ地理的地域からの２００３年〜２００９年の全体的な５年相対生存率は２４．２％であった。一般的な癌情報は全て、ＮＣＩのウェブサイト（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ）から入手したものであり、統計は全て、２０１３年にＳＥＥＲウェブサイトに掲載の、２０１２年１１月ＳＥＥＲデータの提出に基づく、Ｈｏｗｌａｄｅｒ Ｎ．ら、ＳＥＥＲ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ，１９７５−２０１０，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ｈｔｔｐ：／／ｓｅｅｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃｓｒ／１９７５＿２０１０／内で見出されるＳＥＥＲ発生率およびＮＣＨＳ死亡率統計に基づくことに注意すること。
急性リンパ芽球性白血病（「ＡＬＬ」）は、リンパ球分化を阻止し、異常な細胞増殖および生存を推進する遺伝子変化から生じるＢ／Ｔ前駆体段階のリンパ系細胞悪性腫瘍の群に相当する。過去数十年間に、小児ＡＬＬの処置は顕著に進歩し、５年生存率は現在９０％に迫る。しかし、小児の２０％以下で処置が無効であるか、または処置後に再発し、これらの患者に対する無症候生存率は依然として低いままである。また、現代の化学療法の顕著な進歩の後でさえ、再発率が高いＡＬＬ成人患者を処置することは依然として困難である。この数十年、ＡＬＬの処置の結果が急速に改善されているが、これは、主に、化学療法の強化および最適化、幹細胞移植のリスクに適応した使用、ならびにモノクローナル抗体を含む個別化および標的化療法に基づく。次世代配列決定を用いて、正常なリンパ球形成に影響を及ぼすさらなる突然変異および協同する突然変異の意義ならびにエピジェネティックな変化が評価されている。このようにして得られたデータは、個々の患者における予後の評価に役立つが、重要なこととして、突然変異的な異常に適切な標的化療法を組み込むことにおいても役立つ。
さらに、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（非特許文献１）の治療的有用性が実現されている。モノクローナル抗体は、現在、移植、癌、感染症、心臓血管疾患および炎症における治療として承認されている。アイソタイプによってエフェクター機能が異なる。機能のこのような差異は、様々な免疫グロブリンアイソタイプに対する異なる三次元構造に反映される（非特許文献２）。
マウスは免疫化に好都合であり、殆どのヒト抗原を外来物と認識するので、治療可能性があるヒト標的に対するｍＡｂは、一般的にマウス由来となっている。しかし、マウスｍＡｂは、ヒト治療剤として固有の欠点を有する。ｍＡｂはヒト抗体よりもヒトにおける循環半減期が短いため、より頻繁に投与する必要がある。より重要なこととして、ヒト免疫系に対するマウス抗体の反復投与は、マウスタンパク質を外来物として認識し、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を生じさせることによってヒト免疫系を反応させる。このようなＨＡＭＡ反応によって、アレルギー反応が生じ、系からマウス抗体が迅速に消失し、それによってマウス抗体による処置が無益になり得る。このような影響を回避するために、マウス内でヒト免疫系を生成させる試みがなされている。
最初の試みは、ヒト配列を有する抗体で抗原に反応可能なトランスジェニックマウスを作製することを望むものであったが（非特許文献３を参照）、利用可能なクローニングビヒクルによって安定して維持され得るＤＮＡの量により制限された。酵母人工染色体（ＹＡＣ）クローニングベクターの使用によって、トランスジェニック哺乳動物にヒトＩｇ遺伝子座の大きな生殖系列断片を導入する方法がもたらされた。本質的に、ＹＡＣを用いて、ヒトゲノムおよびヒト定常領域で見出されるものと同じ間隔で配置されたヒトＶ、ＤおよびＪ領域遺伝子の大部分をマウスに導入した。あるこのようなトランスジェニックマウス系列はＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスとして知られており、以前はＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．であったＡｍｇｅｎ Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ ＣＡ）から市販されている。
さらに、抗体は、免疫グロブリン重鎖（ＶＨ、ＤＨおよびＪＨセグメント）および／またはカッパ軽鎖（ＶＫおよびＪＫ）遺伝子座で内在性マウス可変セグメントを有するゲノム配列が、全体または一部、ヒト免疫グロブリン重鎖（ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ）および／またはカッパ軽鎖（ＶＫおよびＪＫ）遺伝子座の再編成されていない生殖系列可変セグメントを有するヒトゲノム配列で置換されているＶｅｌｏｃｌｍｍｕｎｅトランスジェニックマウスを用いて調製され得る（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５および特許文献６を参照のこと。
米国特許第６，５８６，２５１号明細書 米国特許第６，５９６，５４１号明細書 米国特許第７，１０５，３４８号明細書 米国特許第６，５２８，３１３号明細書 米国特許第６，６３８，７６８号明細書 米国特許第６，５２８，３１４号明細書
Ｇ．ＫｏｈｌｅｒおよびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５） Ｐ．Ｍ．Ａｌｚａｒｉら、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５５５−５８０（１９８８） Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６７０９−６７１３（１９８９）
本発明は、ＦＬＴ３タンパク質およびＦＬＴ３タンパク質のポリペプチド断片に結合する、抗体、抗原結合断片およびその抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、治療剤と複合化された完全ヒト抗体を含む。ある一定の実施形態において、図２Ａおよび／または２Ｂの核酸配列全体がコードされていないこと、および／または図３Ａおよび／または３Ｂのアミノ酸配列全体が調製されていないことという条件がある。ある一定の実施形態において、図２Ａおよび／または２Ｂの核酸配列全体がコードされ、および／または図３Ａおよび／または３Ｂのアミノ酸配列全体が調製され、その何れも個々のヒト単位用量形態である。
本発明はさらに、抗体薬物複合体などの様々な免疫原性または治療組成物および、表Ｉで列挙される組織の癌（例えば、ＡＭＬ、Ｂ細胞リンパ芽球性白血病および前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病を含むＡＬＬ）などのＦＬＴ３を発現する癌を処置するためのストラテジーを提供する。
ＦＬＴ３のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を図１で示す。開始メチオニンには下線を付す。オープンリーディングフレームは、終止コドンを含む核酸６７〜３０４８から伸びる。 ＣＨｖ６２．２１重鎖のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列。二重下線は重鎖可変領域であり、下線は重鎖ヒトＩｇＧ１定常領域である。 ＣＨｖ６２．２１軽鎖およびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ軽鎖のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列。二重下線は軽鎖可変領域であり、下線はヒトカッパ定常領域である。 非天然アミノ酸の挿入により修飾されたＣＨｖ６２．２１重鎖のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列。Ｘでマークされているのは、核酸残基３７１での非天然アミノ酸（「ｎｎＡＡ」）パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）の挿入のためのアンバーコドンの位置である。二重下線は重鎖可変領域であり、下線は重鎖ヒトＩｇＧ１定常領域である。 ＣＨｖ６２．２１重鎖のアミノ酸配列。二重下線は重鎖可変領域であり、下線はヒトＩｇＧ１定常領域である。 ＣＨｖ６２．２１軽鎖およびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ軽鎖のアミノ酸配列。二重下線は軽鎖可変領域であり、下線はヒトカッパ定常領域である。 ＣＨｖ６２．２１重鎖のアミノ酸配列。Ｘでマークされたアミノ酸位置１２４は、非天然アミノ酸（「ｎｎＡＡ」）パラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）の挿入のためのアンバーコドンの位置である。二重下線は重鎖可変領域であり、下線はヒトＩｇＧ１定常領域である。 ヒトＩｇ生殖系列に対するＣＨｖ６２．２１重鎖のアライメント。 ヒトＩｇ生殖系列に対するＣＨｖ６２．２１軽鎖のアライメント。 ＣＢ１７／ＳＣＩＤマウスに移植されたヒトＢ骨髄単球性白血病細胞株ＭＶ４−１１の皮下確立異種移植モデルにおけるＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０の有効性および用量漸増試験。 ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスに移植されたヒトＢ骨髄単球性白血病細胞株ＭＶ４−１１の皮下確立異種移植モデルにおけるＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０（ＡＤＣ）およびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ（ＡＧＳ６２Ｐ）（ネイキッド抗体）の有効性試験。 ＣＨｖ６２．２１およびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦは、インビトロＥＯＬ−１、ＳＥＭおよびＲａｊｉ（図で左から右）で抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）に介在しない。アッセイの詳細：１）Ｅ：Ｔ＝１００：１；２）抗体濃度＝２．５μｇ／ｍＬ；３）温置時間：４時間；４）アイソタイプ対照ｍＡｂおよびＡＤＣ：ＡＧＳ９１．１−Ｌ３６３−ｐＡＦ、ＡＧＳ９１．８８−ｐＡＦ−ＡＧＳＬ−０１８２−３０；５）陽性対照：Ｒａｊｉ細胞を標的とするリツキシマブ。 ＣＨｖ６２．２１は、非リガンド遮断活性を示す。リガンド結合アッセイにおいてＣＨｖ６２．２１と比較されるＦＬＴ３リガンド遮断薬Ｍａｂ（１ｂ３７．１）は、ＣＨｖ６２．２１ Ｍａｂが非リガンド遮断薬であることを確認する。 ＣＨｖ６２．２１は、ＦＬ介在性細胞増殖を妨げない。 １ｂ３７．１ ＦＬＴ３リガンド遮断Ｍａｂの細胞傷害活性は、ＦＬの存在下で低下する。図１０（Ａ）。ＲＳ−４−１１細胞におけるヒトＦＬＴ３リガンド（ｈＦＬ）ありおよびなしでの、ｖ６２−１ｂ２１．１−ＡＧＬ−０１２９−０８のインビトロ細胞傷害性の評価。図１０（Ｂ）。ＲＳ−４−１１細胞におけるヒトＦＬＴ３リガンド（ｈＦＬ）ありおよびなしでの、ｖ６２−１ｂ３７．１−ＡＧＬ−０１２９−０８のインビトロ細胞傷害性の評価。 ＦＬＴ３リガンドは、ＭＯＬＭ−１３細胞におけるＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０介在性の細胞傷害性を妨げない。図１１（Ａ）。ＭＯＬＭ−１３細胞でのヒトＦＬＴ３リガンドの存在下でのビオチン化ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦおよびｖ６２−１ｂ３７．１の結合の評価。図１１（Ｂ）。ＭＯＬＭ−１３細胞でのヒトＦＬＴ３リガンドありおよびなしでの、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０のインビトロ細胞傷害性の評価。 ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０のインビトロ安定性。図１２（Ａ）。ヒト血清中のＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０の安定性の評価。図１２（Ｂ）。ヒト血清中のＣＨｖ６２−ＡＧＬ−０３０１−２０の安定性の評価。 複数回投与計画を用いた、ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスに移植されたヒトＢ骨髄単球性白血病細胞株ＭＶ４−１１の皮下確立異種移植モデルにおけるＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０（ＡＤＣ）およびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ（ネイキッド抗体）の有効性試験。 皮下確立ＳＥＭ−ｘｃｌ異種移植モデルにおけるＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０の有効性。
セクションの概要
Ｉ．）定義
ＩＩ．）ＦＬＴ３抗体
ＩＩＩ．）一般的に抗体薬物複合体
ＩＩＩ（Ａ）．メイタンシノイド
ＩＩＩ（Ｂ）．オーリスタチンおよびドロスタチン
ＩＩＩ（Ｃ）．カリケアマイシン
ＩＩＩ（Ｄ）．他の細胞傷害性薬剤
ＩＶ．）ＦＬＴ３に結合する抗体薬物複合体
Ｖ．）リンカー単位
ＶＩ．）ストレッチャ単位
ＶＩＩ．）アミノ酸単位
ＶＩＩＩ．）スペーサ単位
ＩＸ．）薬物単位
Ｘ．）薬物負荷量
ＸＩ．）ＡＤＣの細胞傷害効果を判定する方法
ＸＩＩ．）ＦＬＴ３を発現する癌の処置
ＸＩＩＩ．）抗体に基づく治療法に対する標的としてのＦＬＴ３
ＸＩＶ．）ＦＬＴ３ ＡＤＣカクテル
ＸＶ．）併用療法
ＸＶＩ．）キット／製品
Ｉ．）定義：
別段の定めがない限り、本明細書中で使用される技術の全ての用語、記号および他の科学用語または用語法は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。一部の例において、一般的に理解される意味を有する用語を、明瞭化のためにおよび／または容易に言及できるように本明細書中で定義するが、本明細書中にこのような定義を包含することは、当技術分野において一般に理解されるものを超える実質的な相違に相当すると必ずしも解釈されるべきではない。本明細書中に記載の、または本明細書中で言及される技術および手順の多くはよく理解されており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ．Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載される広く利用されている分子クローニング方法論など、当業者により、従来の方法論を使用して一般的に使用される。必要に応じて、市販のキットおよび試薬の使用を含む手順は全般的に、特記しない限り、製造者が定めたプロトコルおよび／またはパラメータに従って実施する。
本明細書中で商品名が使用される場合、商品名に対する言及は、文脈により別段の指示がない限り、商品名製品の、製品処方、ジェネリック薬および活性医薬成分をも指す。
「進行癌」、「局所進行癌」、「進行疾患」および「局所進行疾患」という用語は、関連する組織被膜を通じて拡大する癌を意味し、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＵＡ）の系の下でステージＣの病期、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔの系の下でステージＣ１−Ｃ２の病期およびＴＮＭ（腫瘍、結節、転移）の系の下でステージＴ３〜Ｔ４およびＮ＋の病期を含むことが意図される。一般に、局所進行性疾患の患者には外科手術は推奨されず、これらの患者は臨床的に限局性の（臓器限定）癌を有する患者と比較して、実質的に有益な転帰とはならない。
「アルキル」という用語は、それ自体で、または別の用語の一部として、ノルマル、２級、３級または環状炭素原子を含有する飽和Ｃ１−Ｃ１２炭化水素を指す。特定のアルキル基は、１〜８個の炭素原子、１〜６個の炭素原子または１〜４個の炭素原子を有するものである。アルキル基の例としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルおよびｎ−ヘキシル、イソヘキシルが挙げられるが限定されない。いくつかの実施形態において、アルキル基は、ノルマル、２級または３級炭素原子を有し、環状炭素原子を有さない。
「アルケニル」という用語は、それ自体で、または別の用語の一部として、少なくとも１個の不飽和部位、すなわち炭素−炭素、ｓｐ２二重結合を有する、ノルマル、２級、３級または環状炭素原子を含有するＣ２−Ｃ１２炭化水素を指す。特定のアルケニル基は、２〜８個の炭素原子、２〜６個の炭素原子または２〜４個の炭素原子を有するものである。例としては、ビニル（−ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（−ＣＨ２ＣＨ２＝ＣＨ２）、シクロペンテニル（−Ｃ５Ｈ７）および５−ヘキセニル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）が挙げられるが限定されない。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、ノルマル、２級または３級炭素原子を有し、環状炭素原子を有さない。
「アルキニル」という用語は、それ自体で、または別の用語の一部として、少なくとも１個の不飽和部位、すなわち炭素−炭素、ｓｐ三重結合を有する、ノルマル、２級、３級または環状炭素原子を含有するＣ２−Ｃ１２炭化水素を指す。特定のアルキニル基は、２〜８個の炭素原子、２〜６個の炭素原子または２〜４個の炭素原子を有するものである。例としては、エチニル（−Ｃ≡ＣＨ）および２−プロピニル（−ＣＨ２Ｃ≡ＣＨ）が挙げられるが限定されない。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、ノルマル、２級または３級炭素原子を有し、環状炭素原子を有さない。
「アルコキシ」という用語は、Ｏが分子の残りの部分への結合点であり、アルキルが上記で定義されるとおりである−Ｏ−アルキル基を指す。
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、飽和または部分飽和であり、炭素原子ならびに窒素、酸素および硫黄から選択される３個以下のヘテロ原子から選択される１個の環構造あたり３〜１２個の環原子を有する、単環式または縮合、架橋またはスピロ多環式環構造を指す。特定のヘテロシクロアルキル基は、１個の環構造あたり３〜８個の環原子または５〜７個の環原子を有するものである。環構造は、場合によっては、炭素または硫黄環員上に２個以下のオキソ基を含有し得る。例示的実体としては、適切に結合された部分の形態で、次のものが挙げられる：
「ヘテロアリール」という用語は、１個の複素環あたり３〜１２個の環原子を有する、単環式、縮合二環式または縮合多環式芳香族複素環（炭素原子ならびに窒素、酸素および硫黄から選択される４個以下のヘテロ原子から選択される環原子を有する環構造）を指す。特定のヘテロアリール基は、１個の環構造あたり３〜８個の環原子または５〜７個の環原子を有するものである。ヘテロアリール基の実例としては、適切に結合された部分の形態で、次の実体が挙げられる：
本明細書中で使用される場合、「複素環」、「複素環式」または「ヘテロシクリル」という用語は、上記で定められるとおりの、「ヘテロシクロアルキル」および「ヘテロアリール」部分の両方を包含する。
当業者は、上記で列挙または例示したヘテロシクリル、ヘテロアリールおよびヘテロシクロアルキル基の種が網羅的ではなく、これらの定められる用語の範囲内のさらなる種も選択し得ることを認識するであろう。
「ハロゲン」という用語は、塩素、フッ素、臭素またはヨウ素を表す。「ハロ」という用語は、クロロ、フルオロ、ブロモまたはヨードを表す。
「置換される」という用語は、特定の基または部分が１つ以上の置換基を有することを意味する。「非置換」という用語は、特定の基が置換基を持たないことを意味する。「場合により置換される」という用語は、特定の基が置換されていないか、または１つ以上の置換基により置換されていることを意味する。「置換される」という用語が構造系を記載するために使用される場合、置換が、系上の何らかの原子価許容位置で起こることを意味する。
本明細書中で与えられる式は何れも、構造式によって示される構造ならびにある種の変形または形態を有する化合物を表すものとする。特に、本明細書中で与えられる何れの式の化合物も不斉中心を有し得、したがって、異なるエナンチオマー形態で存在し得る。一般式の化合物の全ての光学異性体および立体異性体、およびそれらの混合物は、式の範囲内にあると考えられる。したがって、本明細書中で与えられる式は何れも、ラセミ体、１つ以上のエナンチオマー形態、１つ以上のジアステレオマー形態、１つ以上のアトロプ異性体形態およびそれらの混合物を表すものとする。さらに、特定の構造は、幾何異性体（すなわちシスおよびトランス異性体）として、互変異性体として、またはアトロプ異性体として存在し得る。さらに、本明細書中で与えられる式は何れも、水和物、溶媒和物および非晶質および多形体のような形態が明示的に列挙されないとしても、このような化合物の水和物、溶媒和物および非晶質および多形体の何れか１つ、およびそれらの混合物をも指すものとする。いくつかの実施形態において、溶媒は水であり、溶媒和物は水和物である。
本明細書中で与えられる何れかの式はまた、化合物の非標識形態ならびに同位体標識形態も表すものとする。同位体標識された化合物は、１つ以上の原子が、選択された原子質量または質量数を有する原子によって置換されていることを除いて、本明細書中で与えられる式によって示される構造を有する。本明細書中に記載の化合物に組み込まれ得る同位体の例としては、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌおよび１２５Ｉなど、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、塩素およびヨウ素の同位体などが挙げられる。このような同位体標識化合物は、薬物または基質組織分布アッセイを含む、代謝研究（好ましくは１４Ｃによる）、反応速度論研究（例えば２Ｈまたは３Ｈによる）、検出またはイメージング技術［陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）など］において、または患者の放射線処置において有用である。特に、１８Ｆまたは１１Ｃ標識化合物は、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ研究のために特に好ましいものであり得る。さらに、重水素（すなわち２Ｈ）などのより重い同位体での置換によって、代謝安定性がより高くなり、例えばインビボ半減期延長または必要用量の減少の結果、ある一定の治療上の利点がもたらされ得る。本明細書中に記載の同位体標識化合物およびそのプロドラッグは、一般に、容易に入手可能な同位体標識試薬で非同位体標識試薬を置き換えることによって、下記のスキームまたは実施例および調製で開示される手順を実施することにより調製し得る。
本明細書中で与えられる何らかの式に言及する場合、指定された可変要素に対する可能な種のリストからの特定の部分の選択は、他の箇所に出現する可変要素に対して同じ種を選択することを定めるものではない。言い換えると、可変要素が複数回出現する場合、指定されたリストからの種の選択は、特に明記しない限り、式の他の箇所の同じ可変要素に対する種の選択とは独立している。
本明細書中で置換基のクラスに適用される場合、ｊ＞ｉである「Ｃｉ−ｊ」という命名法は、ｉおよびｊを含むｉからｊの炭素員の数の１つ１つが独立に実現される、本明細書中に記載の組成物、使用または方法の何れかの実施形態を指すものとする。一例として、Ｃ１−３という用語は、１個の炭素員（Ｃ１）を有する実施形態、２個の炭素員（Ｃ２）を有する実施形態および３個の炭素員（Ｃ３）を有する実施形態を独立して指す。
Ｃｎ−ｍアルキルという用語は、直鎖または分枝鎖にかかわらず、ｍ＞ｎであるｎ≦Ｎ≦ｍを満たす鎖中の炭素員の総数Ｎを有する脂肪族鎖を指す。
本明細書中で列挙される化学名は、ＡｕｔｏＮＯＭ（商標）ソフトウェアを使用して生成させた。化学構造とその構造に対して列挙される名称との間に矛盾がある場合、構造を優先する。
割り当ておよび命名法に関する先行する解釈上の考察によれば、セットに対する本明細書中での明確な言及は、化学的に意味があり、特に明記しない限り、このようなセットの実施形態への独立した言及および明確に言及されるセットのサブセットの可能な実施形態の１つ１つへの言及を示唆すると理解される。
「ネイティブのグリコシル化パターンを変化させる」とは、本明細書中で、ネイティブ配列ＦＬＴ３で見出される１つ以上の炭水化物部分を（根本的なグリコシル化部位を除去するか、または化学的および／または酵素的手段によりグリコシル化を欠失させることの何れかによって）欠失させること、および／またはネイティブ配列ＦＬＴ３に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味することを目的とするものとし、ここで「ネイティブのグリコシル化パターン」は、使用されるＦＬＴ−３配列、細胞型および成長条件の特定の組合せから生じる天然の翻訳後グリコシル化パターンを指す。さらに、この句は、存在する様々な炭水化物部分の性質および割合の変化を含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。
「類似体」という用語は、構造的に類似しているか、または別の分子（例えばＦＬＴ３関連タンパク質）と類似または対応する属性を共有する分子を指す。例えば、ＦＬＴ３タンパク質の類似体は、ＦＬＴ３に特異的に結合する抗体またはＴ細胞によって特異的に結合され得る。
「抗体」という用語は、特に明示されない限り、最も広い意味で使用される。したがって、「抗体」は、天然物または従来のハイブリドーマまたはトランスジェニックマウス技術によって産生されるモノクローナル抗体などの人工物であり得る。ＦＬＴ３抗体は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび／または１つ以上の相補性決定領域を含有する断片を含む。本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、ＦＬＴ３に特異的に結合し、および／または所望の生物学的活性を示し、ＦＬＴ３に特異的に結合し、および／または所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および抗体断片を明確に含める。本明細書中で提供される方法および組成物において、あらゆる特異的抗体を使用し得る。したがって、一実施形態において、「抗体」という用語は、組み合わせられて標的抗原に対する特異的結合部位を形成する、軽鎖免疫グロブリン分子からの少なくとも１つの可変領域と、重鎖分子からの少なくとも１つの可変領域とを含む分子を包含する。一実施形態において、抗体はＩｇＧ抗体である。例えば、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体である。本発明の方法および組成物において有用な抗体は、細胞培養において、ファージにおいて、またはウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジーおよび類人猿を含むが限定されない様々な動物において産生され得る。したがって、一実施形態において、本発明の抗体は哺乳動物抗体である。一次抗体を単離するかまたは特異性もしくは親和性の特徴が変化した変異体を作製するために、ファージ技術を使用し得る。このような技術は、日常的であり、当技術分野で周知である。一実施形態において、本抗体は、当技術分野で公知の組み換え手段によって作製される。例えば、組み換え抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを用いて宿主細胞に遺伝子移入することによって作製し得る。宿主細胞中で少なくとも１個のＶＬおよび少なくとも１個のＶＨ領域を発現するＤＮＡ配列を遺伝子移入するために、１つ以上のベクターを使用し得る。抗体作製および産生の組み換え手段の代表的な記載としては、Ｄｅｌｖｅｓ，ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ：ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｗｉｌｅｙ，１９９７）；Ｓｈｅｐｈａｒｄら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；およびＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、最新版）が挙げられる。本発明の抗体は、所望の機能に介在する際の抗体の効力を高めるために組み換え手段によって修飾し得る。したがって、組み換え手段を用いた置換によって抗体を修飾し得ることは本発明の範囲内である。典型的には、置換は保存的置換である。例えば、抗体の定常領域の少なくとも１つのアミノ酸を異なる残基で置換し得る。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書、米国特許第６，１９４，５５１号明細書、国際公開第９９５８５７２号パンフレット；およびＡｎｇａｌら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−０８（１９９３）を参照のこと。アミノ酸における修飾には、アミノ酸の欠失、付加および置換が含まれる。一部の場合では、このような変化は望ましくない活性、例えば補体依存性細胞傷害性を低下させるためになされる。本抗体は、共有結合または非共有結合の何れかで、検出可能なシグナルを提供する物質を連結することによって標識されることが多い。多岐にわたる標識および複合化技術が知られており、科学文献および特許文献の両方で広く報告されている。これらの抗体は、正常または欠陥ＦＬＴ３への結合についてスクリーニングし得る。例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）を参照のこと。所望の生物学的活性を有する適切な抗体は、増殖、遊走、接着、軟寒天増殖、血管形成、細胞間情報伝達、アポトーシス、輸送、シグナル伝達を含むが限定されない次のインビトロアッセイ、および腫瘍増殖の阻害などの以下のインビボアッセイを使用して同定し得る。本明細書中で提供される抗体は、診断用途においても有用であり得る。捕捉または非中和抗体として、抗原の受容体結合または生物学的活性を阻害することなく特異的抗原に結合する能力についてそれらをスクリーニングし得る。中和抗体として、抗体は競合結合アッセイにおいて有用であり得る。これらは、ＦＬＴ３またはその受容体を定量するためにも使用し得る。
本明細書中で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」または「抗体断片」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持するＦＬＴ３抗体の１つ以上の断片を指す（例えばＦＬＴ３および変異体；図１参照）。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片によって発揮され得ることが示されている。抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（Ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされているものの、組み換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖となることを可能にする合成リンカーによって、それらを連結させ得る（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照）。このような１本鎖抗体も、抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者にとって公知の従来技術を用いて得られ、断片はインタクトな抗体と同じように有用性についてスクリーニングされる。
「Ｆｃ」という用語は、本明細書中で使用される場合、ヒンジ領域、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含む領域を指す。
本明細書中で使用される場合、「抗原」の何らかの形態を使用して、ＦＬＴ３に特異的な抗体を作製し得る。したがって、誘発抗原は、単一エピトープ、複数のエピトープまたはタンパク質全体単独であり得るか、または当技術分野で公知の１つ以上の免疫原性促進剤と組み合わせられ得る。誘発抗原は、単離された全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、抗原の少なくとも一部が遺伝子移入された細胞を用いて免疫化）または可溶性タンパク質（例えば、タンパク質の細胞外ドメイン部分のみで免疫化）であり得る。抗原は、遺伝子改変細胞において産生され得る。抗原をコードするＤＮＡは、ゲノムまたは非ゲノム（例えばｃＤＮＡ）であり得、細胞外ドメインの少なくとも一部をコードする。本明細書中で使用される場合、抗原の文脈における「部分」という用語は、必要に応じて、関心のある抗原の免疫原性エピトープを構成するために、最小限の数のアミノ酸または核酸を指す。アデノウイルスベクター、プラスミドおよび非ウイルスベクター、例えばカチオン性脂質など、を含むが限定されない、関心のある細胞の形質転換に適した何らかの遺伝子ベクターを使用し得る。一実施形態において、本明細書中の方法および組成物の抗体は、関心のあるＦＬＴ３の細胞外ドメインの少なくとも一部に特異的に結合する。
本明細書中で提供される抗体またはその抗原結合断片は、「生物活性剤」を構成し得るか、またはその一部であり得る。本明細書中で使用される場合、「生物活性剤」という用語は、抗原に結合し、および／または細胞死滅毒素を増強するために所望の生物学的効果を増強するかまたはそれに介在する何らかの合成または天然化合物を指す。一実施形態において、本発明において有用な結合断片は、生物学的に活性である断片である。本明細書で使用される場合、「生物学的に活性」という用語は、所望の抗原性エピトープに結合し、生物学的効果を直接的または間接的に発揮することが可能な抗体または抗体断片を指す。直接的な影響としては、成長シグナルの調節、刺激および／または阻害、抗アポトーシスシグナルの調節、刺激および／または阻害、アポトーシスもしくは壊死シグナルの調節、刺激および／または阻害、ＡＤＣＣカスケードの調節、刺激および／または阻害およびＣＤＣカスケードの調節、刺激および／または阻害が挙げられるが限定されない。
抗原結合タンパク質の結合親和性は、結合定数（Ｋａ）および解離定数（Ｋｄ）（ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ）によって決定される。結合親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥによって、例えば、プロテインＡでコーティングされたセンサー表面上への試験抗体の捕捉およびこの表面上を流動するＦＬＴ３によって、測定し得る。あるいは、結合親和性は、ＦＯＲＴＥＢＩＯによって、例えば、プロテインＡでコーティングされた針上への試験抗体受容体の捕捉およびこの表面上を流動するＦＬＴ３によって、測定し得る。当業者は、結合親和性を測定するための当技術分野で公知の他の適切なアッセイを同定し得る。
「特異的に結合する」という用語は、抗原結合タンパク質に関して本明細書で使用される場合、抗原結合タンパク質がＦＬＴ３ならびにＦＬＴ３内の別個のドメインまたは別個のアミノ酸配列に結合し、他の（例えば無関係な）タンパク質に結合しないか、または実質的に結合しないことを意味する。しかし、この用語は、抗体またはその結合断片が密接に関連する分子と交差反応性でもあり得るという事実を排除するものではない。本明細書中に記載のこれらを含む抗体およびその断片ならびにこれらを含む抗体薬物複合体は、密接に関連する分子に結合するよりも少なくとも２、５、１０、５０、１００または１０００倍高い親和性でＦＬＴ３に特異的に結合し得る。
いかなる形態であれ、例えばＦＬＴ３に対する抗体薬物複合体の形態での、本明細書中で開示される抗体の何れの結合も、ＦＬＴ３へのＦＬ結合の一部または全てを阻止すると予想され得る。しかし、ＦＬＴ３へのＦＬ結合を実質的に阻害しない抗ＦＬＴ３抗体が本明細書に記載される。結合を「実質的に阻害する」ために、些細ではない変化の検出可能な量の結合減少が予想され；無作為なタンパク質タンパク質相互作用または非特異的な抗体−抗原相互作用において予想されるようなほんの些細な量の結合と同等である小さな結合変化は包含されない。抗体が標的抗原への別の分子の結合を実質的に阻害するか否かを測定することは、生物物理学的測定または当技術分野で公知の方法による機能的測定を用いて遂行され得る。例えば、２つのタンパク質の相互作用は、物理的結合アッセイ（例えば下記の実施例１４参照）で直接的に、またはタンパク質相互作用の下流の効果、例えば受容体を通じたシグナル伝達など、または続く細胞効果、例えば細胞の増殖または増殖の阻害などを測定する機能アッセイを介して間接的に測定し得る。したがって、ＦＬＴ３へのＦＬの結合を実質的に阻害しない本明細書中で開示される抗ＦＬＴ３抗体は、ＦＬＴ３へのＦＬ結合の顕著な低下を引き起こさず、ＦＬＴ３を通じたＦＬ結合のシグナル伝達は検出可能である。
「二重特異性」抗体も、本発明の方法および組成物において有用である。本明細書中で使用される場合、「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる抗原エピトープに対する結合特異性を有する、抗体、典型的にはモノクローナル抗体を指す。一実施形態において、そのエピトープは同じ抗原に由来する。別の実施形態において、そのエピトープは２つの異なる抗原由来である。二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、二重特異性抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を用いて組み換えにより作製され得る。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−３９（１９８３）を参照のこと。あるいは、二重特異性抗体は化学結合を用いて調製され得る。例えば、Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）を参照のこと。二重特異性抗体としては、二重特異性抗体断片が挙げられる。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−４８（１９９３）、Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
本明細書中に記載のモノクローナル抗体は、それらが標的抗原に特異的に結合し、および／または所望の生物学的活性を発揮する限り、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体における対応する配列と同一もしくは相同であるか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属し、一方で、その鎖の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにこのような抗体の断片における対応する配列と同一であるかまたは相同である、「キメラ」抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、ＰｒｏＣ．ＮａｔＬ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
本明細書中で使用される場合、「癌」、「新生物」および「腫瘍」という用語は、交換可能に使用され、単数または複数形の何れかで、それらを宿主生物に対して病的状態にする悪性形質転換を受けた細胞を指す。原発性癌細胞（すなわち、悪性形質転換の部位の近くから得られる細胞）は、十分に確立された技術、特に組織学的検査によって非癌性細胞と容易に区別され得る。本明細書中で使用される場合、癌細胞の定義には、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞祖先由来のいかなる細胞も含まれる。これには、転移した癌細胞、およびインビトロ培養および癌細胞由来の細胞株が含まれる。固形腫瘍として通常発現する癌のタイプを指す場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えばＣＡＴスキャン、ＭＲイメージング、Ｘ線、超音波または触診などの手順によって腫瘍量に基づいて検出可能であり、および／または患者から入手可能な試料中の１つ以上の癌特異的抗原の発現より検出可能であるものである。腫瘍は造血器腫瘍、例えば液体腫瘍を意味する血液細胞などの腫瘍であり得る。このような腫瘍に基づく臨床症状の具体例としては、慢性骨髄球性白血病または急性骨髄球性白血病などの白血病；多発性骨髄腫などの骨髄腫；リンパ腫などが含まれる。
「治療剤」という用語は、本明細書中で定義されるような、治療上の利益を提供する、および／または治療上有効な全ての薬剤を指す。治療剤は、例えば、疾患、障害または状態の進行を逆転、改善、緩和、阻害または制限するか、または疾患、障害または状態の重症度を軽減するか、または癌などの疾患の１つ以上の症状に影響を与えるか、もしくはそれを好転させるかまたは改善し得る。このような薬剤は、細胞傷害性または細胞分裂阻害性であり得る。この用語には、化学療法剤、抗新生物剤および本明細書で定義されるような「薬物単位」剤が含まれるが限定されない。
「抗新生物剤」という用語は、新生物または癌の処置において、本明細書で定義されるような、治療上の利益を提供する、および／または治療上有効である全ての薬剤を指す。
本明細書中で開示される抗体薬物複合体およびその医薬組成物の何れかを使用するいくつかの実施形態において、治療剤を含む抗体薬物複合体およびその医薬組成物は、前癌状態または少なくとも１つの前腫瘍状態の細胞を処置すること、例えば癌性細胞への悪性形質転換を予防することにおいても有効である。他の実施形態において、１つ以上の抗新生物剤は、前癌状態または少なくとも１つの前腫瘍状態の細胞を処置すること、例えば癌性細胞への悪性形質転換を予防することにおいても有用である。
「化学療法剤」という用語は、腫瘍増殖を阻害することにおいて有効な全ての化学化合物を指す。化学療法剤の非限定例としては、アルキル化剤；例えば、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物およびアルキルスルホネート；代謝拮抗剤、例えば、葉酸、プリンまたはピリミジンアンタゴニスト；有糸分裂阻害剤、例えば抗チューブリン剤、例えばビンカアルカロイド、オーリスタチンおよびポドフィロトキシン誘導体など；細胞傷害性抗生物質；ＤＮＡ発現または複製を損なうかまたはこれらを妨害する化合物、例えばＤＮＡ副溝結合剤；および増殖因子受容体アンタゴニストが挙げられる。さらに、化学療法剤としては、（本明細書で定められるとおりの）細胞傷害剤、抗体、生体分子および小分子が挙げられる。
「化合物」という用語は、化学的化合物それ自体ならびに、明示的に述べられるか否かにかかわらず、以下のものを排除しようとすることが文脈から明確にならない限り、以下のものを指し、包含する：多形体を含む化合物の非晶質および結晶形態（これらの形態が混合物の一部であり得るかまたは単離されている場合）；典型的には、本明細書中で提供される構造において示される形態である、化合物の遊離酸および遊離塩基形態；光学異性体および互変異性体を指す化合物の異性体、（光学異性体には、エナンチオマーおよびジアステレオマー、キラル異性体および非キラル異性体が含まれ、この光学異性体には、単離光学異性体ならびにラセミおよび非ラセミ混合物を含む光学異性体の混合物が含まれる）；異性体が、単離形態であってもよく、または１つ以上の他の異性体との混合物であり得る場合；重水素およびトリチウム含有化合物を含む、および治療上および診断上有効な放射性同位体を含む放射性同位体を含有する化合物を含む、本化合物の同位体；二量体、三量体などの形態を含む本化合物の多量体形態；化合物の塩、好ましくは、酸付加塩および塩基付加塩を含む、有機対イオンおよび無機対イオンを有する塩を含む、および双性型を含む、薬学的に許容可能な塩（化合物が２つ以上の対イオンと会合する場合、この２つ以上の対イオンは同じであってもまたは異なっていてもよい）；および有機溶媒和物および無機溶媒和物を含む、ヘミ溶媒和物、モノ溶媒和物、ジ溶媒和物などを含む化合物の溶媒和物（この無機溶媒和物は水和物を含む）；化合物が２つ以上の溶媒分子と会合する場合、この２つ以上の溶媒分子が同じであってもまたは異なっていてもよい場合。いくつかの例において、本発明の化合物に対して本明細書中でなされる言及には、１つまたはの（ｏｎｅ ｏｒ ｏｆ）上記形態、例えば塩および／または溶媒和物への明示的な言及が含まれるが、この言及は単なる強調であり、上記で特定されるような上記の形態の他のものを排除するものとして解釈されるべきではない。
「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語が、抗原特異性および結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことは、当技術分野で公知である。一般的に、各重鎖可変領域に３個のＣＤＲがあり（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）、各軽鎖可変領域に３個のＣＤＲがある（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）。
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」， ５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」付番スキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）ＪＭＢ ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」付番スキーム）、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６），「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２，７３２−７４５．（「Ｃｏｎｔａｃｔ」付番スキーム）、Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰら、「ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ−ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ」，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３ Ｊａｎ；２７（１）：５５−７７（「ＩＭＧＴ」付番スキーム）およびＨｏｎｅｇｇｅｒ ＡおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ，「Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ」，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００１ Ｊｕｎ ８；３０９（３）：６５７−７０，（ＡＨｏ付番スキーム）により記載されるものを含む、いくつかの周知のスキームの何れかを使用して容易に決定し得る。
所与のＣＤＲの境界は、識別のために使用されるスキームに応じて変化し得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは構造的アライメントに基づき、一方でＣｈｏｔｈｉａスキームは構造情報に基づく。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａスキームの両方に対する付番は、最も一般的な抗体領域配列長に基づき、挿入は、挿入文字、例えば「３０ａ」によって調節され、一部の抗体において欠失が出現する。この２つのスキームは、異なる位置にある一定の挿入および欠失（「インデル」）を配置し、その結果、付番が異なる。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複雑な結晶構造の分析に基づき、多くの点でＣｈｏｔｈｉａ付番スキームと同様である。それぞれＫａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａおよびＣｏｎｔａｃｔスキームにより識別されるようなＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３の位置を以下の表Ｖに列挙する。ＣＤＲ−Ｈ１の場合、残基付番は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ付番スキームの両方を用いて列挙される。
したがって、別段の指定がない限り、所与の抗体またはその領域、例えば可変領域の用語「ＣＤＲ」および「相補性決定領域」ならびに抗体またはその領域の個々のＣＤＲ（例えば、「ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２）という用語は、本明細書中の上記の既知のスキームの何れかによって定義されるような相補性決定領域を包含するものと理解されるべきである。一部の例において、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＣｏｎｔａｃｔ法によって定義されるＣＤＲなど、特定のＣＤＲまたは複数のＣＤＲの同定のためのスキームが指定される。他の場合、ＣＤＲの特定のアミノ酸配列が与えられる。例えば、表Ｖを参照のこと。
本明細書中で使用される場合、「保存的置換」という用語は、当業者にとって公知であり、一般に、得られる分子の生物学的活性を変化させることなくなされ得るアミノ酸および／またはアミノ酸配列の置換を指す。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＴＨＥ ＧＥＮＥ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９８７））。このような代表的置換は、好ましくは、表ＩＩおよび表ＩＩＩ（ａ〜ｂ）で示されるものに従いなされる。例えば、このような変化には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびロイシン（Ｌ）の何れかをこれらの疎水性アミノ酸の何れかの他のものに対して；アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）に対して、およびその逆で；グルタミン（Ｑ）をアスパラギン（Ｎ）に対して、およびその逆で；およびセリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）に対して、およびその逆で、置換することが含まれる。他の置換もまた、特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して、保存的であると考えられ得る。例えば、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）がそうであり得るように、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）が交換可能であり得ることが多い。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、ロイシンおよびイソロイシンと、時としてバリンと交換可能であり得ることが多い。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の重要な特性がその電荷であり、これらの２つのアミノ酸残基のｐＫが異なることが重要でない位置で交換可能であることが多い。また他の変化は、特定の環境において「保存的」と考えられ得る（例えば、本明細書中の表ＩＩＩ（ａ）；１３−１５頁「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」 ２ｎｄ ＥＤ．Ｌｕｂｅｒｔ Ｓｔｒｙｅｒ ｅｄ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＵｎｉＶｅｒｓｉｔｙ）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、ＰＮＡＳ １９９２ Ｖｏｌ ８９ １０９１５−１０９１９；Ｌｅｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９５ Ｍａｙ １９；２７０（２０）：１１８８２−６を参照）。他の置換も許容され、経験的に、または既知の保存的置換に従い、決定され得る。
「細胞傷害剤」という用語は、細胞の発現活性、細胞の機能を阻害または防止する、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体、化学療法剤および、断片および／または変異体を含む、小分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性毒素などの毒素を含むものとする。細胞傷害剤の例としては、オーリスタチン（例えば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）、オーロマイシン、メイタンシノイド、リシン、リシンＡ鎖、コンブレスタチン、デュオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシン（ａｎｔｈｒａｃｉｎ）ジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン、レトストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、キュリーシン、クロチン、カリケアマイシン、サパオナリア・オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤およびグルココルチコイドおよび他の化学療法剤ならびにＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２または２１３、Ｐ３２などの放射性同位体、Ｌｕ１７７を含むＬｕの放射性同位体およびＡＧＤ−０１８２と呼ばれる本発明の毒素が挙げられるが限定されない。
本発明の抗体を含む抗体はまた、前述の細胞傷害剤の何れかに、およびまたプロドラッグをその活性型に変換可能な抗癌プロドラッグ活性化酵素にも複合化させ得る。
本明細書中で使用される場合、「二特異性抗体」というは用語、断片が、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指す。同じ鎖上の２個のドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させざるを得ないようにし、２個の抗原結合部位を生成させる。二特異性抗体は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−４８（１９９３）により完全に記載されている。
ＦＬＴ３発現細胞におけるＦＬＴ３結合剤の効果の文脈における「枯渇」という用語は、ＦＬＴ３発現細胞の数の減少または排除を指す。本発明の目的のために、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３受容体として知られ、Ｆｌｋ２（胎児肝臓キナーゼ２）、ＳＴＫ１（幹細胞チロシンキナーゼ１）およびＣＤ１３５としても知られる、ＦＬＴ３は、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の一員である。ヒトＦＬＴ３は、キナーゼ挿入ドメインによって連結される５個の免疫グロブリン様細胞外ドメインおよび２個の細胞内チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）を有する膜結合受容体を含む９９３アミノ酸長のＲＴＫをコードする（Ｓｔｉｒｅｗａｌｔ ＤＬら；Ｎａｔ ＲｅＶ Ｃａｎｃｅｒ；６５０−６６５（２００３）。ヒトＦＬＴ３遺伝子（遺伝子番号２３２２（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））は染色体１３ｑ１２上に位置し、マウスＦＬＴ３と８５％のアミノ酸配列相同性を共有する（Ｒｏｓｎｅｔ Ｏら；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１７３−１７９（１９９３）。ＦＬＴ３は正常骨髄およびリンパ球前駆細胞において、およびＡＭＬ患者の７０〜９０％の白血病細胞によって（Ｃａｒｏｗ，Ｃ．Ｅら、ＢＬｏｏｄ ８７：１０８９−１０９６（１９９６）；Ｒｏｓｎｅｔ Ｏら；Ｌｅｕｋｅｍｉａ １０：２３８−２４８（１９９６）およびＡＬＬにおいても発現される。
「遺伝子産物」という用語は、ペプチド／タンパク質またはｍＲＮＡを示すために本明細書中で使用される。例えば、「本発明の遺伝子産物」は、本明細書中で、「癌アミノ酸配列」、「癌タンパク質」、「表Ｉで列挙される癌のタンパク質」、「癌ｍＲＮＡ」、「表Ｉで列挙される癌のｍＲＮＡ」などと呼ばれるときがある。一実施形態において、癌タンパク質は、図１の核酸によってコードされる。癌タンパク質は、断片であり得るか、または、あるいは、図１の核酸によってコードされる全長タンパク質であり得る。一実施形態において、配列同一性または類似性を判定するために癌アミノ酸配列が使用される。別の実施形態において、配列は、図１の核酸によってコードされるタンパク質の天然に存在する対立遺伝子変異体である。別の実施形態において、本配列は、本明細書中でさらに記載されるような配列変異体である。
「ヘテロコンジュゲート（Ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」抗体は、本発明の方法および組成物において有用である。本明細書中で使用される場合、「ヘテロコンジュゲート（Ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体」という用語は、２個の共有結合した抗体を指す。このような抗体は、架橋剤を用いることを含む、合成タンパク質化学における既知の方法を用いて調製し得る。例えば、米国特許第４，６７６，９８０号明細書を参照のこと。
「相同体」という用語は、例えば、対応する位置で同一または類似である化学残基の配列を有することによって、別の分子と相同性を示す分子を指す。
「同一」または「配列同一性」という用語は、最適にアライメントされ、適切な挿入または欠失と比較される場合の２個の核酸または２個のアミノ酸配列間の同一性の程度を示す。
２つの配列間の「パーセント同一性」は、ギャップの数を考慮した、配列により共有される同一位置の数（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）と、この２つの配列の最適アライメントのために導入する必要がある各ギャップの長さとの関数である。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、後述するように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６の長さウェイトを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して決定し得る。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０ウェイト・レジデュー・テーブル（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、Ｍｅｙｅｒｓら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｉ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムを用いても決定し得る。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスの何れかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６の長さウェイトを使用し、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．ＭｏＬ．ＢｉｏＬ．４８：４４４−４５３（１９７０）アルゴリズムを用いて決定し得る。
例として、ポリヌクレオチド配列は、参照配列と１００％同一である参照ポリヌクレオチド配列と同一であり得るか、または参照配列と比較した場合、例えば少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一など、ある整数のヌクレオチド変化までを含み得る。このような変化は、少なくとも１個のヌクレオチド欠失、転移および塩基転換を含む置換または挿入から選択され、ここでこの変化は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置で、または、参照配列中のヌクレオチドの間で個々にまたは参照配列内の１つ以上の連続群での何れかで散在する５’もしくは３’末端の間の何れかの位置で起こり得る。ヌクレオチド変化の数は、本明細書中に記載のような参照ポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの総数に、個々のパーセント同一性の数字上のパーセント（１００で割ったもの）を乗じ、その積を参照ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの総数から減じることで求められ、すなわち：ｎ．ｓｕｂ．ｎ．ｌｔｏｒｅｑ．ｘ．ｓｕｂ．ｎ−（ｘ．ｓｕｂ．ｎｙ）（式中、ｎ．ｓｕｂ．ｎはヌクレオチド変化の数であり、ｘ．ｓｕｂ．ｎは、本明細書中に記載のような参照ポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドの総数であり（代表的な参照ポリヌクレオチド配列については「配列リスト」中の核酸配列を参照）、ｙは、５０％の場合は０．５０、６０％の場合は０．６０、７０％の場合は０．７０、７５％の場合は０．７５、８０％の場合は０．８０、８５％の場合は０．８５、９０％の場合は０．９０、９５％の場合は０．９５、９８％の場合は０．９８、９９％の場合は０．９９または１００％の場合は１．００である）は、乗算演算子に対するシンボルであり、ここでｘ．ｓｕｂ．ｎおよびｙの何らかの非整数の積は、それをｘ．ｓｕｂ．ｎから減じる前に最も近い整数に丸められる。
同様に、ポリペプチド配列は、本明細書中に記載のようなポリペプチド参照配列と同一であり得る（代表的な参照ポリペプチド配列については「配列リスト」中のアミノ酸配列を参照）、すなわち１００％同一であるか、または、参照配列と比較した場合、ある一定の整数のアミノ酸変化まで含み得、例えば少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％の同一性など、％同一性が１００％未満となる。このような変化は、少なくとも１個のアミノ酸欠失、保存的および非保存的置換を含む置換または挿入からなる群から選択され、ここでこの変化は、参照ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置で、または、参照配列中のアミノ酸の間で個々にまたは参照配列内の１つ以上の連続群での何れかで散在するこれらの末端位置の間の何れかの位置で起こり得る。所与の％同一性に対するアミノ酸変化の数は、ポリペプチド参照配列によりコードされるポリペプチド鎖中のアミノ酸の総数に、個々のパーセント同一性の数字上のパーセント（１００で割ったもの）を乗じ、その積を本明細書中に記載のようなポリペプチド参照配列（例えば配列番号１〜２１を参照）中のアミノ酸の総数から減じることで求められ、すなわち：ｎ．ｓｕｂ．ａ．ｌｔｏｒｅｑ．ｘ．ｓｕｂ．ａ−（ｘ．ｓｕｂ．ａｙ）（式中、ｎ．ｓｕｂ．ａはアミノ酸変化の数であり、ｘ．ｓｕｂ．ａは、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸の総数であり、ｙは、５０％の場合は０．５０、６０％の場合は０．６０、７０％の場合は０．７０、７５％の場合は０．７５、８０％の場合は０．８０、８５％の場合は０．８５、９０％の場合は０．９０、９５％の場合は０．９５、９８％の場合は０．９８、９９％の場合は０．９９または１００％の場合は１．００である）は、乗算演算子に対するシンボルであり、ここでｘ．ｓｕｂ．ａおよびｙの何らかの非整数の積は、それをｘ．ｓｕｂ．ａから減じる前に最も近い整数に丸められる。
パーセント同一性は、配列の長さにわたって決定され得る。本明細書で定義されるように、「７５％を超えて同一」という用語は、７５％、８０％、８５％、９５％および９９％を超える同一性ならびにこの範囲内の全ての離散値および離散した部分的範囲を含む。
一実施形態において、本明細書中で提供される抗体は「ヒト抗体」である。本明細書中で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖および重鎖配列の本質的に配列全体がヒト遺伝子に由来する抗体を指す。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）参照、ＥＢＶ形質転換技術（例えば、Ｃｏｌｅら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ ７７−９６（１９８５）参照）によって、またはファージディスプレイ（例えばＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１）参照）を使用して、調製される。具体的な実施形態において、ヒト抗体は、トランスジェニックマウスにおいて作製される。このような部分的から完全なヒト抗体を作製するための技術は当技術分野で公知であり、あらゆるこのような技術を使用し得る。ある特に好ましい実施形態によれば、完全ヒト抗体配列は、ヒト重鎖および軽鎖抗体遺伝子を発現するように改変されたトランスジェニックマウスにおいて作製される。国際公開第０２／４３４７８号パンフレットおよび米国特許第６，６５７，１０３号明細書（Ａｂｇｅｎｉｘ）およびその子孫で見出されるヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの調製の代表的な記載。次いで、所望の抗体を産生するトランスジェニックマウスからのＢ細胞を融合させて、抗体の連続生産のためのハイブリドーマ細胞株を作製し得る。例えば、米国特許第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；および同第５，５４５，８０６号明細書；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３１：３３−４２（１９９８）；Ｇｒｅｅｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−９５（１９９８）を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト（例えばマウス）抗体ならびにヒト抗体由来の配列を含有する抗体の形態を指す。このような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、および典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのもの、の少なくとも一部も含む。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ 米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３；およびＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６）を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「阻害する」または「〜の阻害」という用語は、測定可能な量を減少させること、または完全に妨げることを意味する。
「単離された」または「生物学的に純粋な」という句は、ネイティブ状態で見出されるときに物質に通常付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。したがって、本発明による単離ペプチドは、好ましくは、それらのインシトゥ環境においてペプチドと通常会合している物質を含有しない。例えば、ポリヌクレオチドは、ＦＬＴ３遺伝子以外の遺伝子に対応するかもしくは相補的であるか、またはＦＬＴ３遺伝子産物もしくはその断片以外のポリペプチドをコードする混入ポリヌクレオチドから実質的に分離される場合、「単離される」と言われる。当業者は、単離ＦＬＴ３ポリヌクレオチドを得るために、核酸単離手順を容易に使用し得る。タンパク質は、例えば、タンパク質に通常付随する細胞構成物からＦＬＴ３タンパク質を取り除くために物理的、機械的または化学的方法が用いられる場合、「単離される」と言われている。当業者は、単離ＦＬＴ３タンパク質を得るために標準的な精製方法を容易に使用し得る。あるいは、化学的手段によって単離タンパク質を調製し得る。
適切な「標識」としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光部分、化学発光部分、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号明細書；同第３，９３９，３５０号明細書；同第３，９９６，３４５号明細書；同第４，２７７，４３７号明細書；同第４，２７５，１４９号明細書；および同第４，３６６，２４１号明細書が挙げられる。さらに、本明細書中で提供される抗体は、フルオロボディー（ｆｌｕｏｒｏｂｏｄｉｅｓ）の抗原結合成分として有用であり得る。例えば、Ｚｅｙｔｕｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１４７３−７９（２００３）を参照のこと。
「哺乳動物」という用語は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびヒトを含む、哺乳動物として分類される何らかの生物を指す。本発明の一実施形態において、哺乳動物はマウスである。本発明の別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
「転移性癌」および「転移性疾患」という用語は、所属リンパ節または遠隔部位に広がっている癌を意味し、ＡＵＡ系下のステージＤの疾患およびＴＮＭ系下のステージＴｘＮｘＭ＋を含むものとする。
本明細書中で使用される場合、「修飾される」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドへの変化の存在を指す。このような変化または修飾は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドの合成後修飾によって、または同時翻訳によって、または天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチドまたは非天然アミノ酸ポリペプチドの翻訳後修飾によって得ることができる。
本明細書中で使用される場合、「モジュレータ」または「試験化合物」または「薬物候補」という用語または文法上の等価物は、癌表現型または癌配列、例えば核酸もしくはタンパク質配列の発現または癌配列の効果（例えばシグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質相互作用など）を直接的または間接的に変化させる能力について試験しようとする、何らかの分子、例えばタンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖類、ポリヌクレオチドなどを述べる。一態様において、モジュレータは、本発明の癌タンパク質の効果を中和する。「中和する」とは、細胞での結果として生じる効果と同時に、タンパク質の活性が阻害されるかまたは阻止されることを意味する。別の態様において、モジュレータは、本発明の遺伝子の対応するタンパク質のレベルを正常化することによって、本発明の遺伝子およびその対応するタンパク質の効果を中和する。好ましい実施形態において、モジュレータは、発現プロファイル、または本明細書中で提供される発現プロファイル核酸もしくはタンパク質、または下流エフェクター経路を変化させる。ある実施形態において、モジュレータは、癌の表現型を、例えば正常組織フィンガープリントまで抑制する。別の実施形態において、モジュレータは癌表現型を誘導した。一般に、様々な濃度に対して差次的な反応を得るために、複数のアッセイ混合物を様々な薬剤濃度と並行して実行する。典型的には、これらの濃度のうち１つは陰性対照、すなわちゼロ濃度または検出レベルを下回るものとして働く。
モジュレータ、薬物候補または試験化合物は多数の化学クラスを包含するが、典型的にはそれらは有機分子、好ましくは１００ダルトンを超え約２５００ダルトン未満の分子量を有する有機低分子化合物である。好ましい小分子は、２０００未満または１５００未満または１０００未満または５００Ｄ未満である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは官能性化学基のうち少なくとも２つを含む。候補薬剤は、上記の官能基の１つ以上で置換された環状炭素または複素環構造および／または芳香族または多環芳香族構造を含むことが多い。モジュレータは、生体分子、例えばペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体またはそれらの組み合わせなども含む。ペプチドが特に好ましい。モジュレータのあるクラスは、例えば約５〜約３５個のアミノ酸のペプチドであり、約５〜約２０個のアミノ酸が好ましく、約７〜約１５個が特に好ましい。好ましくは、癌調節タンパク質は可溶性であり、非膜貫通領域を含み、および／または可溶性を助けるためにＮ末端Ｃｙｓを有する。一実施形態において、断片のＣ末端は遊離酸として維持され、Ｎ末端はカップリング、すなわちシステインへのカップリングに役立つ遊離アミンである。一実施形態において、本発明の癌タンパク質は、本明細書中で論じられるような免疫原性物質に複合化される。一実施形態において、癌タンパク質はＢＳＡに複合化される。本発明の、例えば好ましい長さのペプチドは、互いにまたは他のアミノ酸に連結されて、より長いペプチド／タンパク質を生成させ得る。調節ペプチドは、上記で概説されるような天然タンパク質の消化物、ランダムペプチドまたは「偏った」ランダムペプチドであり得る。好ましい実施形態において、ペプチド／タンパク質に基づくモジュレータは、本明細書で定義されるような、抗体およびその断片である。
本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在する可能性のある天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原性エピトープに対して向けられる。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体標品は、典型的には、異なるエピトープに対して向けられた（またはそれらに特異的な）多数の抗体を含む。一実施形態において、ポリクローナル抗体は、複数の抗原エピトープを含有する単一の抗原内の異なるエピトープ特異性、親和性または結合活性を有する複数のモノクローナル抗体を含有する。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用しようとするモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組み換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照）。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約１μＭ、より通常には少なくとも約３００ｎＭ、典型的には少なくとも約３０ｎＭ、好ましくは少なくとも約１０ｎＭ、より好ましくは少なくとも約３ｎＭまたはそれより良好なＫｄで結合し、通常はＥＬＩＳＡにより測定される。
本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在する可能性のある天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原性エピトープに対して向けられる。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体標品は、典型的には、異なるエピトープに対して向けられた（またはそれらに特異的な）多数の抗体を含む。一実施形態において、ポリクローナル抗体は、複数の抗原エピトープを含有する単一の抗原内の異なるエピトープ特異性、親和性または結合活性を有する複数のモノクローナル抗体を含有する。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られるような抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明に従って使用しようとするモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組み換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書参照）。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。これらのモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約１μＭ、より通常には少なくとも約３００ｎＭ、典型的には少なくとも約３０ｎＭ、好ましくは少なくとも約１０ｎＭ、より好ましくは少なくとも約３ｎＭまたはそれより良好なＫｄで結合し、通常はＥＬＩＳＡにより測定される。
「非天然アミノ酸」またはそうでなければ「ｎｎＡＡ」と記載されるものは、２０種類の共通アミノ酸またはピロリジン（ｐｙｒｏｌｙｓｉｎｅ）またはセレノシステインのうち１つではないアミノ酸を指す。ｎｎＡＡという用語と同義語として使用され得る他の用語は、「非天然コードアミノ酸」、「非天然アミノ酸」、「非天然型のアミノ酸」である。さらに、ｎｎＡＡという用語には、天然に存在せず、合成により得られ得るか、または非天然アミノ酸の修飾によって得られ得るアミノ酸が含まれるが限定されない。例えば、本発明の目的に対して、パラ−アセチルフェニルアラニンはｎｎＡＡとみなされる。
「パラ−アセチルフェニルアラニン」または「ｐＡＦ」という用語は、以下の化学構造で示されるような３−（４−アセチルフェニル）−２−アミノプロパン酸を意味する。
「医薬賦形剤」は、アジュバント、担体、ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、保存剤などの物質を含む。
「薬学的に許容可能な」は、ヒトまたは他の哺乳動物と生理学的に適合する、無毒性、不活性および／または組成物を指す。
「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドの何れかまたは何れかのタイプのヌクレオチドの修飾形態の、少なくとも１０塩基または塩基対長のヌクレオチドのポリマー形態を意味し、１本鎖および２本鎖形態のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むものとする。当技術分野において、この用語は、「オリゴヌクレオチド」と交換可能に使用されることが多い。ポリヌクレオチドは、例えば図１に示されるようなチミジン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）でもあり得る本明細書中で開示されるヌクレオチド配列を含み得；この定義はＤＮＡとＲＮＡとの間の化学構造の違い、特にＲＮＡの４つの主要な塩基のうちの１つがチミジン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）であるという所見に関連する。
「ポリペプチド」という用語は、少なくとも約４、５、６、７または８個のアミノ酸のポリマーを意味する。本明細書を通して、アミノ酸に対する標準的な３文字（表ＩＩＩ参照）または１文字表記を使用する。当技術分野において、この用語は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用されることが多い。
「組み換え」ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、インビトロで分子操作を受けたＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
本明細書中で使用される場合、「１本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」または「１本鎖」抗体という用語は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片を指し、これらのドメインは１本のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照のこと。
本明細書中で使用される場合、「特異的」、「特異的に結合する（「ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ」および「ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ」）」という用語は、標的抗原エピトープへの抗体の選択的結合を指す。抗体は、所定の一連の条件下で、無関係である抗原または抗原混合物への結合と適切な抗原への結合を比較することによって、結合の特異性について試験し得る。抗体が、無関係である抗原または抗原混合物よりも少なくとも２、５、７および好ましくは１０倍、適切な抗原に結合する場合、それは特異的とみなされる。一実施形態において、特異的抗体は、ＦＬＴ３抗原にのみ結合するが、無関係である抗原には結合しない抗体である。別の実施形態において、特異的抗体は、ヒトＦＬＴ３抗原に結合するが、ＦＬＴ３抗原と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸相同性がある非ヒトＦＬＴ３抗原と結合しない抗体である。別の実施形態において、特異的抗体は、ヒトＦＬＴ３抗原に結合するが、ＦＬＴ３抗原のアミノ酸配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性がある非ヒトＦＬＴ３抗原と結合しない抗体である。別の実施形態において、特異的抗体は、ヒトＦＬＴ３抗原に結合し、マウスＦＬＴ３抗原に結合するが、ヒト抗原との結合度がより高い抗体である。別の実施形態において、特異的抗体は、ヒトＦＬＴ３抗原に結合し、霊長類ＦＬＴ３抗原に結合するが、ヒト抗原との結合度がより高い抗体である。別の実施形態において、特異的抗体は、ヒトＦＬＴ３抗原に結合し、何らかの非ＦＬＴ３抗原に結合するが、ヒト抗原またはその何らかの混合物との結合度がより高い抗体である。
本明細書中で使用される場合、「処置すること」または「治療的」および文法的に関連する用語は、生存延長、罹患率低下および／または代替治療モダリティの副産物である副作用の軽減などの疾患の何らかの結果の何らかの改善を指し；当技術分野において容易に理解されるように、疾患の完全な根絶が好ましいが、治療行為に対する必要条件ではない。
「変異体」という用語は、例えば、具体的に記載されるタンパク質（例えば図１で示されるＦＬＴ３タンパク質）の対応する位置に１つ以上の異なるアミノ酸残基を有するタンパク質など、記載されたタイプまたは基準からの変動を呈する分子を指す。類似体は変異体タンパク質の例である。スプライシングアイソフォームおよび一塩基多型（ＳＮＰ）は、変異体のさらなる例である。
本発明の「ＦＬＴ３タンパク質」および／または「ＦＬＴ３関連タンパク質」には、本明細書中で具体的に同定されたもの（図１参照）ならびに、本明細書中で概説されるかまたは当技術分野で容易に利用可能な方法に従い、過度の実験を行うことなく、単離／作製され、特徴評価され得る、アレル変異体、保存的置換変異体、類似体および相同体が含まれる。異なるＦＬＴ３タンパク質またはその断片の部分を組み合わせる融合タンパク質、ならびにＦＬＴ３タンパク質および異種ポリペプチドの融合タンパク質も含まれる。このようなＦＬＴ３タンパク質は、ＦＬＴ３関連タンパク質、本発明のタンパク質またはＦＬＴ３と総称される。「ＦＬＴ３関連タンパク質」という用語は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個または２５個を超えるアミノ酸；または少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９１、９９２個または９９３個以上のアミノ酸のポリペプチド断片またはＦＬＴ３タンパク質配列を指す。
ＩＩ．）ＦＬＴ３抗体
本発明の別の態様は、ＦＬＴ３関連タンパク質に結合する抗体を提供する（図１参照）。一実施形態において、ＦＬＴ３関連タンパク質に結合する抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＦＬＴ３タンパク質に特異的に結合する抗体である。配列番号２のアミノ酸配列を含むＦＬＴ３タンパク質に特異的に結合する抗体としては、他のＦＬＴ３関連タンパク質に結合し得る抗体が挙げられる。例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含むＦＬＴ３タンパク質に結合する抗体は、ＦＬＴ３変異体およびその相同体または類似体などのＦＬＴ３関連タンパク質に結合し得る。
本発明のＦＬＴ３抗体は、癌（例えば表Ｉ参照）において、予後アッセイ、イメージング、診断および治療方法論のために特に有用である。一実施形態において、例えば免疫アッセイにおいて、癌の検出での使用のための、本明細書中で開示されるＦＬＴ３結合アッセイである。同様に、このような抗体は、（例えばＡＤＣ中で治療剤と組み合わせられる場合）、急性骨髄性白血病（「ＡＭＬ」）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）および他の癌（これらの他の癌においてもＦＬＴ３が発現されるかまたは過剰発現される限り）の、処置および／または予後診断において有用である。さらに、細胞内で発現される抗体（例えば１本鎖抗体）は、進行性もしくは転移性ＡＭＬもしくはＡＬＬ癌または他の進行性もしくは転移性癌など、ＦＬＴ３の発現が関与する癌を処置することにおいて治療上有用である。
抗体、具体的にはモノクローナル抗体の調製のための様々な方法は、当技術分野で周知である。例えば、抗体は、単離または免疫複合化形態で、ＦＬＴ３関連タンパク質、ペプチドまたは断片を使用して適した哺乳動物ホストを免疫化することによって調製し得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，Ｅｄｓ．，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））。さらに、ＦＬＴ３の融合タンパク質、例えばＦＬＴ３ ＧＳＴ融合タンパク質なども使用し得る。特定の実施形態において、図１のアミノ酸配列の全てまたは大部分を含むＧＳＴ融合タンパク質が作製され、次いで適切な抗体を生成させるための免疫原として使用される。別の実施形態において、ＦＬＴ３関連タンパク質が合成され、免疫原として使用される。
さらに、コードされた免疫原に対する免疫反応を生じさせるために（精製ＦＬＴ３関連タンパク質またはＦＬＴ３発現細胞ありまたはなしで）当技術分野で公知のネイキッドＤＮＡ免疫化技術が使用される（総説として、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８を参照）。
抗体を生成させるためにＦＬＴ３タンパク質の特異的な領域を選択するため、図１で示されるようなＦＬＴ３タンパク質のアミノ酸配列を分析し得る。例えば、ＦＬＴ３構造中の親水性領域を同定するために、ＦＬＴ３アミノ酸配列の疎水性および親水性分析を使用する。免疫原性構造ならびに他の領域およびドメインを示すＦＬＴ３タンパク質の領域は、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ，Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ，Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析など、当技術分野で公知の様々な他の方法を使用して容易に同定し得る。親水性プロファイルは、Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．およびＷｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８の方法を用いて生成させ得る。疎水性親水性指標プロファイルは、Ｋｙｔｅ，Ｊ．およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２の方法を用いて生成させ得る。パーセント（％）接触可能残基プロファイルは、Ｊａｎｉｎ Ｊ．，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：４９１−４９２の方法を使用して生成させ得る。平均柔軟性プロファイルは、Ｂｈａｓｋａｒａｎ Ｒ．，Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ Ｐ．Ｋ．，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５の方法を使用して生成させ得る。ベータターンプロファイルは、Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ Ｂ．，１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：２８９−２９４の方法を用いて生成させ得る。したがって、これらのプログラムまたは方法の何れかによって同定される各領域は、本発明の範囲内である。ＦＬＴ３抗体の生成のための好ましい方法は、本明細書中で提供される実施例によってさらに例示される。免疫原としての使用のためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法は、当技術分野で周知である。ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他の担体タンパク質などの担体とのタンパク質の免疫原性複合体を調製するための方法も、当技術分野で周知である。いくつかの状況において、例えばカルボジイミド試薬を用いた直接的複合化が使用され；他の例においては、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬによって供給されるものなどの連結試薬が有効である。ＦＬＴ３免疫原の投与は、当技術分野で理解されているように、適切な期間にわたり適切なアジュバントを使用して注射を行うことによって実施されることが多い。免疫化スケジュールの間、抗体形成の妥当性を判定するために、抗体の力価を取り得る。
ＦＬＴ３モノクローナル抗体は、当技術分野で周知の様々な手段によって作製し得る。例えば、所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、一般的に知られているように、抗体産生Ｂ細胞を不死化する、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術または修飾を用いて調製される。所望の抗体を分泌する不死化細胞株は、抗原がＦＬＴ３関連タンパク質である免疫アッセイによってスクリーニングされる。適切な不死化細胞培養物が同定される場合、細胞を増殖させ、抗体をインビトロ培養物または腹水の何れかから産生させ得る。
本発明の抗体または断片は、組み換え手段によっても作製し得る。ＦＬＴ３タンパク質の所望の領域に特異的に結合する領域は、複数の種由来のキメラまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体という状況下でも作製し得る。ヒト化またはヒトＦＬＴ３抗体もまた作製し得、これらは治療的状況での使用に好ましい。対応するヒト抗体配列を１つ以上の非ヒト抗体ＣＤＲで置換することによる、マウスおよび他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６を参照）。また、Ｃａｒｔｅｒら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５およびＳｉｍｓら、１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６も参照のこと。
好ましい実施形態において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、免疫グロブリン重鎖（ＶＨ、ＤＨおよびＪＨセグメント）および／またはカッパ軽鎖（ＶＫおよびＪＫ）遺伝子座で内在性マウス可変セグメントを有するゲノム配列が、全体または一部、ヒト免疫グロブリン重鎖（ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ）および／またはカッパ軽鎖（ＶＫおよびＪＫ）遺伝子座の再編成されていない生殖系列可変セグメントを有するヒトゲノム配列で置換されているＶｅｌｏｃｌｍｍｕｎｅマウスを用いて調製され得る（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）。例えば、米国特許第６，５８６，２５１号明細書、米国特許第６，５９６，５４１号明細書、米国特許第７，１０５，３４８号明細書、米国特許第６，５２８，３１３号明細書、米国特許第６，６３８，７６８号明細書および米国特許第６，５２８，３１４号明細書を参照のこと。
さらに、本発明のヒト抗体は、内在性ミューおよびカッパ鎖遺伝子座を不活性化する標的とされる突然変異と一緒に、再編成されていないヒト重鎖（ミューおよびガンマ）およびカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有するＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）を使用して、作製され得る（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９を参照のこと）。
別の実施形態において、本発明の完全ヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖トランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｏｍｏｓｏｍｅ）を有するマウスなど、導入遺伝子およびトランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｏｍｏｓｏｍｅ）上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウスを用いて作製され得る。本明細書中で、「ＫＭマウス」と呼ばれるこのようなマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７２２−７２７およびＴｏｍｉｚｕｋａらに対する国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載されている。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いて調製することもできる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野において確立されている。例えば、Ｌａｄｎｅｒらに対する米国特許第５，２２３，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；および同第５，５７１，６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒらに対する米国特許第５，４２７，９０８号明細書および同第５，５８０，７１７号明細書；Ｍｃｃａｆｆｅｒｔｙらに対する米国特許第５，９６９，１０８号明細書および同第６，１７２，１９７号明細書；およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓらに対する米国特許第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書および第６，５９３，０８１号明細書を参照のこと。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、免疫化の際にヒト抗体反応が生じ得るようにヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを用いて調製することもできる。このようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらに対する米国特許第５，４７６，９９６号明細書および同第５，６９８，７６７号明細書に記載されている。
さらに、本発明のヒト抗体は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｍｇｅｎ Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｉｎｃ．，以前のＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と呼ばれる、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座で改変された、抗体産生について不活性化されたトランスジェニックマウスを用いる技術によって作製し得る。ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスを調製する代表的な記述は、米国特許第６，６５７，１０３号明細書で見出され得る。また、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；および同第５，５４５，８０６号明細書；およびＭｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９８）；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｓ．Ａ．およびＧｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３，５９３−５９７（２００２）も参照のこと。
上記の何らかの作製方法の結果、ＦＬＴ３または、ＦＬＴ３に対して８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９、９８もしくは９９％配列同一性を有する相同体もしくは断片もしくはポリペプチド配列に結合する一定の能力を有する抗体が生じる。ＦＬＴ３に対する抗体、その結合断片およびこれらを含む抗体薬物複合体の結合親和性（ＫＤ）は、１ｍＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、２ｎＭ以下または１ｎＭ以下であり得る。あるいは、ＫＤは５〜１０ｎＭ；または１〜２ｎＭの間であり得る。ＫＤは、１マイクロモル濃度〜５００マイクロモル濃度または５００マイクロモル濃度〜１ｎＭの間であり得る。
抗原結合タンパク質の結合親和性は、結合定数（Ｋａ）および解離定数（Ｋｄ）（ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ）によって決定される。結合親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥによって、例えば、プロテインＡでコーティングされたセンサー表面上への試験抗体の捕捉およびこの表面上を流動するＦＬＴ３によって、測定し得る。あるいは、結合親和性は、ＦＯＲＴＥＢＩＯによって、例えば、プロテインＡでコーティングされた針上への試験抗体受容体の捕捉およびこの表面上を流動するＦＬＴ３によって、測定し得る。当業者は、結合親和性を測定するための当技術分野で公知の他の適切なアッセイを同定し得る。
「特異的に結合する」という用語は、抗原結合タンパク質に関して本明細書で使用される場合、抗原結合タンパク質がＦＬＴ３ならびにＦＬＴ３内の別個のドメインまたは別個のアミノ酸配列に結合し、他の（例えば無関係な）タンパク質に結合しないか、または実質的に結合しないことを意味する。しかし、この用語は、抗体またはその結合断片が密接に関連する分子と交差反応性でもあり得るという事実を排除するものではない。本明細書中に記載のこれらを含む抗体およびその断片ならびにこれらを含む抗体薬物複合体は、密接に関連する分子に結合するよりも少なくとも２、５、１０、５０、１００または１０００倍高い親和性でＦＬＴ３に特異的に結合し得る。
好ましい実施形態において、本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１２１８３１の下に寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されるＣＨｖ６２．２１と呼ばれる抗体の重鎖および軽鎖可変領域（図３Ａおよび／または３Ｂを参照）、またはＣＨｖ６２．２１の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで本抗体は、本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂの所望の機能的特性を保持する。ＣＨｖ６２．２１の重鎖可変領域は、配列番号９の１番目の残基（Ｅ）〜１２３番目の残基（Ｓ）の範囲のアミノ酸配列からなり、ＣＨｖ６２．２１の軽鎖可変領域は、配列番号１０の１番目の残基（Ｄ）〜１０８番目の残基（Ｒ）残基の範囲のアミノ酸配列からなる。ＣＨｖ６２．２１の重鎖可変領域のＣＤＲ１−３（Ｋａｂａｔ）は、それぞれ配列番号９の３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２の範囲のアミノ酸配列からなり、ＣＨｖ６２．２１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１−３（ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ）は、それぞれ配列番号１０の２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７の範囲のアミノ酸配列からなる（図４および表Ｖを参照）。本発明の抗体の定常領域として、定常領域の何れかのサブクラスを選択し得る。一実施形態において、重鎖定常領域としてヒトＩｇＧ１定常領域および軽鎖定常領域としてヒトＩｇカッパ定常領域を使用し得る。
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
（ａ）前記重鎖可変領域は、図３Ａおよび／または３Ｂで示される重鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）前記軽鎖可変領域は、図３Ａおよび／または３Ｂで示される軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
他の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、図３Ａおよび／または３Ｂで示されるＶＨおよびＶＬ配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。本明細書中の開示はまた、図３Ａおよび／または３Ｂで示されるａもしくはｂ、またはＶＨもしくはＶＬ配列をコードするポリヌクレオチドまたは核酸ならびに、これらと８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチドまたは核酸も提供する。
別の実施形態において、本発明は、ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域を含み、
（ａ）前記重鎖可変領域は、図３Ａおよび／または３Ｂで示される重鎖可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み；
（ｂ）前記軽鎖可変領域は、図３Ａおよび／または３Ｂで示される軽鎖可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
本発明の改変抗体としては、（例えば、抗体の特性を改善するために）ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基に対して修飾がなされたものが挙げられる。典型的には、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、あるアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「復帰突然変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって同定し得る。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列配置に戻すために、体細胞突然変異は、例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ介在突然変異誘発（例えば、ロイシンからメチオニンへの「復帰突然変異」）によって生殖系列配列に「復帰突然変異」させ得る。このような「復帰突然変異型」抗体も、本発明に包含されるものとする。
別のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去して、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させるために、フレームワーク領域内で、または１つ以上のＣＤＲ領域内でも、１つ以上の残基を突然変異させることを含む。このアプローチは、「脱免疫化」とも呼ばれ、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３／０１５３０４３号明細書中でさらに詳細に記載されている。
フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて、またはこの修飾の代わりに、本発明の抗体は、典型的には、抗体の１つ以上の機能的特性、例えば血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞傷害性を変化させるために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように改変され得る。さらに、本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂは、再びＭＡｂの１つ以上の機能的特性を改変するために、化学的に修飾され得る（例えば、１つ以上の化学的部分が抗体に結合され得る）か、またはそのグリコシル化を改変するように修飾され得る。これらの実施形態のそれぞれを以下でさらに詳細に説明する。
一実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変化する、例えば増減するよう修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の組み立てを促進するために、またはＦＬＴ３ ＭＡｂの安定性を増減させるために変更される。
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、ＦＬＴ３ ＭＡｂの生物学的半減期を短縮させるように突然変異される。より具体的には、１つ以上のアミノ酸突然変異がＦｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入され、その抗体は、ネイティブＦｃ−ヒンジドメインブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合と比べてＳｐＡ結合が低下するようになる。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳細に記載されている。
別の実施形態において、ＦＬＴ３ ＭＡｂは、その生物学的半減期を延長させるように修飾される。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄに対する米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載されているように突然変異が導入され得る。あるいは、生物学的半減期を延長させるために、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書および同第６，１２１，０２２号明細書に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、抗体をＣＨ１またはＣＬ領域内で改変し得る。
さらに他の実施形態において、ＦＬＴ３ ＭＡｂのエフェクター機能を変化させるために少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによって、Ｆｃ領域が改変される。例えば、アミノ酸特異的残基から選択される１つ以上のアミノ酸は、抗体のエフェクターリガンドに対する親和性が変化しているが親抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換され得る。親和性が変化させられるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、両者ともＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号明細書および同第５，６４８，２６０号明細書にさらに詳細に記載されている。
別の実施形態において、重鎖は、Ａｍｂｒｘ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によって開発されたＲｅＣＯＤＥ技術を通じて、少なくとも１つのアミノ酸残基を非天然アミノ酸で置換することによって改変される。非天然アミノ酸の一例は、パラ−アセチルフェニルアラニンである。
ＦＬＴ３関連タンパク質とのＦＬＴ３抗体の反応性は、必要に応じて、ＦＬＴ３関連タンパク質、ＦＬＴ３発現細胞またはその抽出物を使用して、ウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析を含む多くの周知の手段によって確立され得る。ＦＬＴ３抗体またはその断片は、検出可能なマーカーで標識され得るか、または第２の分子に複合化され得る。適切な検出可能マーカーとしては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるが限定されない。さらに、２つ以上のＦＬＴ３エピトープに特異的な二重特異性抗体は、当技術分野で一般に公知の方法を用いて作製される。ホモ二量体抗体も、当技術分野で公知の架橋技術（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）によって作製され得る。
さらに別の好ましい実施形態において、本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂは、ＣＨｖ６２．２１と呼ばれる抗体の重鎖および軽鎖を含む抗体である。ＣＨｖ６２．２１の重鎖は、配列番号９の１番目の残基（Ｅ）〜４５３番目の残基（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列からなり、ＣＨｖ６２．２１の軽鎖は、配列番号１０の１番目の残基（Ｄ）〜２１４番目の残基（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる。その配列は、図２Ａおよび／または２Ｂおよび図３Ａおよび／または３Ｂで示されている。好ましい実施形態において、ＣＨｖ６２．２１は、非天然アミノ酸（「ｎｎＡＡ」）で修飾され、細胞傷害剤に複合化される。一実施形態において、ｎｎＡＡはｐＡＦである。好ましい実施形態において、細胞傷害剤は、ｎｎＡＡにおいて特異的に複合化される。
さらに別の実施形態において、本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂは、抗体または抗原結合断片の発現を可能にするために宿主細胞を培養することを含む抗体または抗原結合断片を作製する方法によって作製され、ここで宿主細胞は、以下の（ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択される：
（ａ）配列番号９の１番目のＥ〜１２３番目のＳの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１０の１番目のＤ〜１０８番目のＲの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて遺伝子移入された宿主細胞；
（ｂ）配列番号９の１番目のＥ〜１２３番目のＳの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび配列番号１０の１番目のＤ〜１０８番目のＲの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて遺伝子移入された宿主細胞；および
（ｃ）配列番号９の１番目のＥ〜１２３番目のＳの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて遺伝子移入された宿主細胞および配列番号１０の１番目のＤ〜１０８番目のＲの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて遺伝子移入された宿主細胞。
さらに別の実施形態において、本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂは、抗体の発現を可能にするために宿主細胞を培養することを含む抗体を作製する方法によって作製され、ここで宿主細胞は、以下の（ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択される：
（ａ）配列番号９の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号９の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞；および
（ｃ）配列番号９の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞および配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
ＣＨｖ６２．２１と呼ばれる抗体を産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓを介して）２０１４年１２月９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８に送付され、受託番号ＰＴＡ−１２１８３１が割り当てられた。
あるいは、またはさらに、本発明の別の実施形態において、ＦＬＴ３に結合するＭＡｂ、この場合はＭＡｂ ＣＨｖ６２．２１、は、当技術分野で公知のような翻訳後修飾を受け得る。翻訳後修飾の例としては、化学的修飾、例えばジスルフィド結合、オリゴ糖、Ｎ末端ピログルタメート形成、Ｃ末端リジンプロセシング、脱アミド化、異性化、酸化、糖化、ペプチド結合切断、還元不可能な架橋、短縮化および当技術分野で公知の他のものが挙げられるが限定されない。Ｌｉｕら、Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．ｖｏｌ．９７，ｎｏ．７，ｐｐ．２４２６−２４４７（Ｊｕｌｙ ２００８）を参照のこと。他のタイプの修飾としては、非共有相互作用、立体構造の不均一性および凝集が挙げられる（同上）。
さらなる実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂは、残基１のＮ末端重鎖グルタメートのピログルタメートへの環化を含む。このような環化が自発的に起こると理解されることを当業者は理解し、認識するであろう。Ｄｉｃｋら、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｐｙｒｏ−Ｇｌｕｔａｍｔａｔｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．９７，ｎｏ．３，ｐｐ５４４−５５３（Ｊｕｎｅ １５，２００７）を参照のこと。
さらに、またはあるいは、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂのアミノ酸は、脱アミド化、異性化、糖化および／または酸化を含むが限定されないさらなる翻訳後修飾を受け得る。本発明のポリペプチドまたはその断片は、グリコシル化、例えば当技術分野で周知のＮ−結合型またはＯ−結合型グリコシル化部位、を含むさらなる翻訳後修飾を受け得る。既に記載のように、このような変化を妨げるかまたは最小化するために、またはこのような処理が有益である状況においてそれらを促進するために、ポリペプチドのアミノ酸配列または工程条件の改変（培養、精製および／または保存条件の改変など）を行い得る。さらに、このような調製物は、複数のタイプのプロセシング関連修飾のレベルが様々であるポリペプチドを含み得、例えば、ポリペプチドは、Ｃ末端リジンの一部、大部分または実質的に全てが除去され得、および／またはＮ末端アミノ酸の一部、大部分または実質的に全てがピログルタミン酸に変換され得る（例えば、図２Ａおよび／または２Ｂまたは図３Ａおよび／または３Ｂにおいて、またはコンセンサス配列もしくは抗原結合断片において示されるポリペプチド）。緩衝液の組成および温度の変更などの工程条件は、このような修飾の度合いに顕著な影響を及ぼし得る。
さらなる実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂは、配列番号９の残基４５３のＣ末端重鎖リジンの短縮化を含む。
さらなる実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂは、Ｇ０（アシアロ−、アガラクト、アフコシル化二分岐性複合型Ｎ−グリカン）；Ｇ０Ｆ（アシアロ−、アガラクト、コア−フコシル化二分岐性複合型Ｎ−グリカン）；マンノース−５（Ｎ−結合型オリゴマンノース−５）；Ｇ１Ｆ（アシアロ−、モノガラクト、コア−フコシル化二分岐性複合型Ｎ−グリカン）；Ｇ２（アシアロ−、ビガラクト、アフコシル化２分岐性複合型Ｎ−グリカン）；Ｇ２Ｆ（アシアロ−、ビガラクト、コアフコシル化２分岐性複合型Ｎ−グリカン）；Ａ１（モノシアリル化、２分岐性Ｎ−結合型オリゴ糖、Ｎｅｕ５Ａｃｉｄ）；および／またはＡ２（ジシアリル化、二分岐性Ｎ−結合型オリゴ糖Ｎｅｕ５Ａｃｉｄ）を含むが限定されない残基３０３の重鎖アスパラギンへのグリコシル化の付加を含む。
さらにまたはあるいは、別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂは、軽鎖の１つ以上のセリン残基への糖化の付加を含む。一般に、糖化は、還元糖とＮ末端１級アミンまたはリジン側鎖のアミン基との間の非酵素的反応の結果起こる。当業者は、糖化が、抗体をより酸性にするＮ末端の一級アミノ酸基またはリジン残基の側鎖上の正電荷を遮蔽し得ることを理解および認識するであろう。
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、当技術分野で公知の何らかの手段（例えば質量分析法）によって確認し得、本明細書中で開示される配列と同一であり得るか（図２Ａおよび／または２Ｂおよび図３Ａおよび／または３Ｂを参照）、または翻訳後修飾処理の結果として１つ以上のアミノ酸残基でこれらの配列と異なり得る。非限定例として、実質的に均質なポリペプチドの全てまたは一部において、軽鎖または重鎖の何れかに由来するＣ末端アミノ酸は、タンパク質分解処理または培養中に生じる他の処理によって除去され得る。同様に、Ｎ末端アミノ酸は存在しなくてもよく、例えば、１個、２個、３個、４個または５個のＮ末端アミノ酸が存在しなくてもよい。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂの重鎖可変領域は、配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基１２３（Ｓ）の範囲のアミノ酸配列および配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基１２３（Ｓ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されているものからなる群から選択される。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂの重鎖は、配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列、配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されているもの、配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているもの、および配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換され、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているものからなる群から選択される。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂまたはその抗原結合断片は、宿主細胞での発現により得られるタンパク質の組み換え産生混合物であり、ここで抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域は、配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基１２３（Ｓ）の範囲のアミノ酸配列および配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基１２３（Ｓ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されているものからなる群から選択される。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂは、宿主細胞での発現により得られるタンパク質の組み換え産生混合物であり、ここで抗体の重鎖は、配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列、配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されているもの、配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているもの、および配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換され、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているものからなる群から選択される。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂは、配列番号９の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列であって、１番目のＥがピロ−グルタメートに修飾されているものからなる重鎖と、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂは、配列番号９の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂは、配列番号９の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列であって、１番目のＥがピロ−グルタメートに修飾されており、Ｃ末端残基の４５３番目のＫが除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂは、配列番号９の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列であって、Ｃ末端残基の４５３番目のＫが除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む。
本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂ、具体的にはＣＨｖ６２．２１と表示されるＭＡｂは、重鎖において非天然アミノ酸（「ｎｎＡＡ」）で修飾されている。好ましい実施形態において、アンバーコドンは、ｎｎＡＡで表されるパラ−アセチルフェニルアラニンの挿入のために配列番号１１のアミノ酸位置１２４に位置する（図３Ｃ）。修飾されたＣＨｖ６２．２１は、本発明の目的のためにＣＨｖ６２．２１ｐＡＦと表示する。
したがって、本発明の好ましい実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦは以下を含む：
重鎖可変領域は、配列番号１１の１番目の残基（Ｅ）〜１２３番目の残基（Ｓ）残基の範囲のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域は、配列番号１０の１番目の残基（Ｄ）〜１０８番目の残基（Ｒ）残基の範囲のアミノ酸配列からなる。重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３（Ｋａｂａｔ）は、それぞれ配列番号１１の３１〜３５、５０〜６５および９５〜１０２の範囲のアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３（ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ）は、それぞれ配列番号１０の２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７の範囲のアミノ酸配列からなる（図３Ｂ、図３Ｃおよび表Ｖを参照）。
パラ−アセチルフェニルアラニンのｎｎＡＡが配列番号１１の残基１２４において挿入されている、配列番号１１の１番目の残基（Ｅ）〜４５３番目の残基（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列からなる重鎖および、配列番号１０の１番目の残基（Ｄ）〜２１４番目の残基（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなるＣＨｖ６２．２１の軽鎖。その配列は、図２Ｂおよび／または２Ｃおよび図３Ｂおよび／または３Ｃで示される。好ましい実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦは、細胞傷害剤に複合化される。
さらに別の実施形態において、本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂは、抗体または抗原結合断片の発現を可能にするために宿主細胞を培養することを含む抗体または抗原結合断片を作製する方法によって作製され、ここで宿主細胞は、以下の（ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択される：
（ａ）配列番号１１の１番目のＥ〜１２３番目のＳの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１０の１番目のＤ〜１０８番目のＲの範囲のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて遺伝子移入された宿主細胞；
（ｂ）配列番号１１の１番目のＥ〜１２３番目のＳの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび配列番号１０の１番目のＤ〜１０８番目のＲの範囲のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて遺伝子移入された宿主細胞；および
（ｃ）配列番号１１の１番目のＥ〜１２３番目のＳの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて遺伝子移入された宿主細胞および配列番号１０の１番目のＤ〜１０８番目のＲの範囲のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて遺伝子移入された宿主細胞。
さらに別の実施形態において、本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂは、抗体の発現を可能にするために宿主細胞を培養することを含む抗体を作製する方法によって作製され、ここで宿主細胞は、以下の（ａ）〜（Ｃ）からなる群から選択される：
（ａ）配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞；および
（ｃ）配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞および配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
さらに別の実施形態において、本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂは、抗体の発現を可能にするために宿主細胞を培養することを含む抗体を作製する方法によって作製され、ここで宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される：
（ａ）配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドおよび配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞；
（ｃ）配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞および配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞；および
（ｄ）配列番号１１の１番目のＥ〜４５２番目のＧの範囲のアミノ酸配列であって１番目のＥがピログルタメートに修飾されているものからなる重鎖、および配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂの重鎖可変領域は、配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基１２３（Ｓ）の範囲のアミノ酸配列および配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基１２３（Ｓ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されているものからなる群から選択される。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂの重鎖は、配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列、配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されているもの、配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているもの、および配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換され、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているものからなる群から選択される。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂまたはその抗原結合断片は、宿主細胞での発現により得られるタンパク質の組み換え産生混合物であり、ここで抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域は、配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基１２３（Ｓ）の範囲のアミノ酸配列および配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基１２３（Ｓ）のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されているものからなる群から選択される。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂは、宿主細胞での発現により得られるタンパク質の組み換え産生混合物であり、ここで重鎖は、配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列、配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されているもの、配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているもの、および配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換され、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているものからなる群から選択される。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂは、配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂは、配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列であって、１番目のＥがピロ−グルタメートに修飾されているものからなる重鎖と、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂは、配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列であって、１番目のＥがピロ−グルタメートに修飾されており、Ｃ末端残基の４５３番目のＫが除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む。
別の実施形態において、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂは、配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列であって、Ｃ末端残基の４５３番目のＫが除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含む。
ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦと呼ばれる抗体を産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓを介して）２０１４年１２月９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１０８に送付され、受託番号ＰＴＡ−１２１８３６を割り当てられた。
ＩＩＩ．）一般的な抗体薬物複合体
別の態様において、本発明は、治療薬に複合化させた抗体を含む抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を提供する。治療剤は、細胞傷害剤、細胞分裂阻害剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素活性毒素またはその断片）または放射性同位体（すなわち放射性複合体）であり得る。別の態様において、本発明は、ＡＤＣを使用する方法をさらに提供する。一態様において、ＡＤＣは、オキシム結合を介して細胞傷害剤または検出可能な薬剤に共有結合または連結させられた上記のＦＬＴ３ ＭＡｂの何れかを含む。
細胞傷害剤または細胞分裂阻害剤、すなわち癌の処置において腫瘍細胞を死滅させるかまたは阻害するための薬物（Ｓｙｒｉｇｏｓ ａｎｄ Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ ａｎｄ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；米国特許第４，９７５，２７８号明細書）の局所送達のための抗体−薬物複合体の使用によって、腫瘍への薬物部分の標的化送達、およびそれらにおける細胞内蓄積が可能となるが、これらの非複合化薬剤の全身投与の結果、排除しようとする腫瘍細胞だけでなく正常細胞に対しても許容できないレベルの毒性が生じ得る（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８６） Ｌａｎｃｅｔ ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，」 ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａら（ｅｄ．ｓ），ｐｐ．４７５−５０６）。それにより最小の毒性で最大限の有効性が求められる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が、これらのストラテジーにおいて有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７）。これらの方法で使用される薬物としては、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびビンデシンが挙げられる（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６）前出）。抗体−毒素複合体で使用される毒素としては、細菌毒素、例えばジフテリア毒素など、植物毒素、例えばリシンなど、小分子毒素、例えばゲルダナマイシンなど（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｊｏｕｒ，ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（欧州特許第１３９１２１３号明細書；Ｌｉｕら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３）およびカリケアマイシン（Ｌｏｄｅら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎら（１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）が挙げられる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合またはトポイソメラーゼ阻害を含む機序によって、それらの細胞傷害性および細胞分裂阻害効果に影響を及ぼし得る。いくつかの細胞傷害性薬物は、大きな抗体またはタンパク質受容体リガンドと複合化させる場合、不活性であるかまたは活性がより低い傾向がある。
抗体薬物複合体の例は、正常および悪性Ｂリンパ球の表面上で見出されるＣＤ２０抗原に対して向けられたマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体およびチオ尿素リンカー−キレート剤により結合させられる１１１Ｉｎまたは９０Ｙ放射性同位体から構成される抗体−放射性同位体複合体であるゼバリン（登録商標）（イブリツモマブ・チウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ／Ｉｄｅｃ）である（Ｗｉｓｅｍａｎら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２７（７）：７６６−７７；Ｗｉｓｅｍａｎら（２００２）Ｂｌｏｏｄ ９９（１２）：４３３６−４２；Ｗｉｔｚｉｇら（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：２４５３−６３；Ｗｉｔｚｉｇら（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１５）：３２６２−６９）。
また、カリケアマイシンに連結されたｈｕＣＤ３３抗体から構成される抗体薬物複合体であるマイロターグ（商標）（ゲムツズマブ・オゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、注射による急性骨髄性白血病の処置について２０００年に承認された（Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６；米国特許第４９７０１９８号明細書；同第５０７９２３３号明細書；同第５５８５０８９号明細書；同第５６０６０４０号明細書；同第５６９３７６２号明細書；同第５７３９１１６号明細書；同第５７６７２８５号明細書；同第５７７３００１号明細書）。
さらに、抗ヒトＦＬＴ３抗体は、骨髄性白血病の有望な治療薬としてより早くから評価されている。例えば、ＦＬＴ３に対する抗体であるＩＭＣ−ＥＢ１０は、Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発された。この抗体は、下流のキナーゼ（ＭＡＰＫ、ＡｋｔおよびＳｔａｔ５）のＦＬＴ３介在性の活性化を阻害するリガンド遮断薬である。この抗体はまた、インビトロで白血病細胞の増殖を阻害し；抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して作用することが知られている。ＥＢ１０は、単独で、およびメトトレキサートと組み合わせて処置した場合、白血病異種移植片の生存期間を延長させた（国際公開第２００９／１５５０１５号パンフレットおよび米国特許出願公開２０１１／０００８３５５号明細書参照）。この抗体は、ヒト臨床試験（ＮＣＴ００８８７９２６）においても評価されたが、有効性がなかったため終了となった。また、ＭＭＡＦと複合化されたＥＢ１０もＩｍＣｌｏｎｅによって開発されたことを参照のこと（Ｐｒｏｃ Ａｍｅｒ Ａｓｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ４６，２００５を参照）。
ＦＬＴ３に対して開発されたアゴニスト抗体は、原始造血細胞の増殖および／分化を促進し得ることが当技術分野で公知である（国際公開第９５／２７０６２号パンフレットを参照）。
生物剤に加えて、多数の小分子阻害剤が開発され、ヒト臨床試験で試験されている。これらの阻害剤の殆どは、ＦＬＴ３および他のキナーゼを標的とし、したがってＦＬＴ３キナーゼそれ自身には特異的ではない。殆どの場合、これらの阻害剤はＦＬＴ３−ＩＴＤおよびおそらくＦＬＴ−ＴＫＤを標的とする。したがって、野生型ＦＬＴ３のみを標的とするために利用可能なものはない。ヒト臨床試験に入ったことが知られている小分子阻害剤は以下のものである：
ミドスタウリンまたはＰＫＣ−４１２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、キザルチニブまたはＡＣ２２０（Ａｍｂｉｔ）、ネクサバール（Ｏｎｙｘ／Ｂａｙｅｒ）、ＡＺＤ１１５２またはバラセルチブ（Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）、クレノリニブ（Ｃｒｅｎｏｌｉｎｉｂ）（Ａｒｏｇ）、プレキシコン（第一三共）およびＡＳＰ２２１５（アステラス製薬）。全般的に、殆どのヒト臨床試験は現在継続中である。殆どの場合、血小板減少症、好中球減少症、貧血が副作用として観察されている。
さらに、ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬物部分、ＤＭ１、に連結されたｈｕＣ２４２抗体から構成される抗体薬物複合体であるカンツズマブ・メルタンシン（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）は、結腸、膵臓、胃など、ＣａｎＡｇを発現する癌の処置に対する第ＩＩ相試験に進んでいる。
さらに、メイタンシノイド薬物部分（ＤＭ１）に連結された抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体から構成される抗体薬物複合体であるＭＬＮ−２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．，ＢＺＬ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）は、前立腺腫瘍の処置の可能性に対して開発中である。
最後に、ドラスタチンの合成類似体である、オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）をキメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌腫においてルイスＹに特異的）およびｃＡＣ１０（血液学的悪性腫瘍においてＣＤ３０に特異的）に複合化させた（Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（７）：７７８−７８４）。
ＭＭＡＥに複合化されたＣＤ３０ ＭＡｂは現在、アドセトリス（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）として市販されている。アドセトリス（ブレンツキシマブ・ベドチン）は、３つの構成成分：１）ヒトＣＤ３０に特異的なｃＡＣ１０と呼ばれるキメラＩｇＧ１抗体、２）微小管破壊剤ＭＭＡＥおよび３）ＭＭＡＥをｃＡＣ１０に共有結合させるプロテアーゼ切断可能なリンカーからなるＣＤ−３０に対する抗体薬物複合体である。アドセントリス（ＡＤＣＥＮＴＲＩＳ）処方情報を参照のこと。
さらに、ＡＤＣの生成に有用な化学療法剤を含むが限定されない治療剤が、本明細書中に記載されている。使用し得る酵素活性毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォルディイ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開された国際公開第９３／２１２３２号パンフレットを参照のこと。放射性複合化抗体の作製のために、様々な放射性核種を利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。抗体と細胞傷害剤との複合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）など、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８に記載されるように調製し得る。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性核種の複合化のための代表的なキレート剤である（国際公開第９４／１１０２６号パンフレット）。
抗体および１つ以上の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン、トリコテセンおよびＣＣ１０６５など、および毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体の複合体も本明細書中で企図される。
ＩＩＩ（Ａ）．メイタンシノイド
メイタンシノイド薬物部分としての使用に適したメイタンシン化合物は当技術分野で周知であり、公知の方法に従い天然起源から単離され得るか、遺伝子工学技術（Ｙｕら（２００２）ＰＮＡＳ ９９：７９６８−７９７３参照）を用いて製造され得るか、またはメイタンシノールおよびメイタンシノール類似体は、公知の方法に従って合成により調製され得る。
代表的なメイタンシノイド薬物部分としては、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４２５６７４６号明細書）（アンサマイトシンＰ２の水素化リチウムアルミニウム還元によって調製）；Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号明細書および同第４，３０７，０１６号明細書）（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を用いた脱メチル化またはＬＡＨを用いた脱塩素化により調製）；およびＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号明細書）（塩化アシルを用いたアシル化により調製）などの修飾芳香族環を有するものおよび他の位置に修飾を有するものが挙げられる。
代表的なメイタンシノイド薬物部分としては、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号明細書）（メイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応により調製）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４３３１５９８号明細書）；Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４４５０２５４号明細書）（ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製）；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号明細書）（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）によるメイタンシノールの変換により調製）；Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号明細書および同第４，３１５，９２９号明細書）（トレウィア・ヌドルフロラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｌｆｌｏｒａ）から単離）；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号明細書および同第４，３２２，３４８号明細書）（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）によるメイタンシノールの脱メチル化により調製）；および４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号明細書）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製）などの修飾を有するものも挙げられる。
メイタンシノイドを含有するＡＤＣ、その作製方法およびそれらの治療的使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書；同第５，４１６，０６４号明細書；同第６，４４１，１６３号明細書および欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号明細書に開示されており、これらの開示は参照により本明細書中に明示的に組み込まれる。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８-８６２３（１９９６）は、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に連結されるＤＭ１と呼ばれるメイタンシノイドを含むＡＤＣを記載した。本複合体は、培養された結腸癌細胞に対して高い細胞傷害性であることが見出され、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性が示された。Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）は、メイタンシノイドがジスルフィドリンカーを介して、ヒト結腸癌細胞株上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７または、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１と複合化されたＡＤＣを記載する。細胞あたり３×１０５のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３において、ＴＡ．１−メイタンシノイド複合体の細胞傷害性をインビトロで試験した。薬物複合体は、遊離メイタンシノイド薬物と同様の程度の細胞傷害性を達成したが、これは抗体分子あたりのメイタンシノイド分子数を増加させることによって向上させ得る。Ａ７−メイタンシノイド複合体が示した全身細胞傷害性は、マウスにおいて低かった。
ＩＩＩ（Ｂ）．オーリスタチンおよびドラスタチン
いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、ドラスタチンまたはドロスタチンペプチド類似体および誘導体、オーリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号明細書、同第５，７８０，５８８号明細書）と複合化された本発明の抗体を含む。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞分裂を妨げ（Ｗｏｙｋｅら（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、抗癌活性（米国特許第５，６６３，１４９号明細書）および抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔら（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有することが示されている。ドラスタチンまたはオーリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を通じて抗体に連結させ得る（国際公開第０２／０８８１７２号パンフレット）。
代表的なオーリスタチンの実施形態は、２００４年３月２８日に発表され、その開示が、その全体において参照により明示的に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号明細書に記載されている、Ｓｅｎｔｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ４５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６２３で開示されるＮ末端連結モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦを含む。
典型的には、ペプチドに基づく薬物部分は、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチド断片間にペプチド結合を形成することによって調製し得る。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で周知である液相合成法（Ｅ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｂｋｅ，「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐｐ７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ参照）に従って調製し得る。オーリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、米国特許第５６３５４８３号明細書；同第５７８０５８８号明細書；Ｐｅｔｔｉｔら（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：５４６３−５４６５；Ｐｅｔｔｉｔら（１９９８）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １３：２４３−２７７；Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９６，７１９−７２５；Ｐｅｔｔｉｔら（１９９６）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１５：８５９−８６３；およびＤｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１（７）：７７８−７８４の方法に従って調製し得る。
ＩＩＩ（Ｃ）．カリケアマイシン
他の実施形態において、ＡＤＣは、１つ以上のカリケアマイシン分子に複合化された本発明の抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、サブピコモル濃度で２本鎖ＤＮＡ切断を生じさせることが可能である。カリケアマイシンファミリーの複合体の調製については、米国特許第５，７１２，３７４号明細書、同第５，７１４，５８６号明細書、同第５，７３９，１１６号明細書、同第５，７６７，２８５号明細書、同第５，７７０，７０１号明細書、同第５，７７０，７１０号明細書、同第５，７７３，００１号明細書、同第５，８７７，２９６号明細書（全てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照のこと。使用し得るカリケアマイシンの構造類似体としては、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１ Ｉ、ＰＳＡＧおよびθＩ １（Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５−２９２８（１９９８）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄに対する前述の米国特許）が挙げられるが限定されない。抗体が複合化され得る別の抗腫瘍薬は、葉酸拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシンおよびＱＦＡの両方とも、細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に横断しない。したがって、抗体介在性の内在化を通じたこれらの薬剤の細胞取り込みは、それらの細胞傷害効果を大きく促進する。
ＩＩＩ（Ｄ）．他の細胞傷害性薬剤
本発明の抗体に複合化させ得る他の抗腫瘍剤としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｉｃｉｎ）、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号明細書、同第５，７７０，７１０号明細書に記載の、まとめてＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として知られる薬剤ファミリーならびにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号明細書）が挙げられる。
使用し得る酵素活性毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォルディイ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。例えば、国際公開第９３／２１２３２号パンフレット（１９９３年１０月２８日に公開）を参照のこと。
本発明は、抗体と、核酸分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮＡｓｅ）との間に形成されるＡＤＣをさらに企図する。
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は放射性が高い原子を含み得る。放射性複合化抗体の作製のために、様々な放射性同位体を利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。本複合体が検出に使用される場合、これは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９mまたはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られる）用のスピン標識、例えばこれもまたヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などを含み得る。
放射性または他の標識は、既知の方法で本複合体に組み込まれ得る。例えば、ペプチドは生合成され得るか、または例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を用いた化学的アミノ酸合成によって合成され得る。ｔｃ９９mまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１などの標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して連結され得る。イットリウム−９０は、リジン残基を介して連結され得る。ヨウ素−１２３を組み込むために、ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｎｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を使用し得る。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）は、他の方法を詳細に記載する。
ＩＶ．）ＦＬＴ３に結合する抗体薬物複合化合物
本発明は、とりわけ、治療剤の標的送達のための抗体−薬物複合化合物を提供する。発明者らは、抗体−薬物複合化合物がＦＬＴ３を発現する細胞に対して強力な細胞傷害および／または細胞分裂阻害活性を有することを発見した。
このような抗体薬物複合体は、ＦＬＴ３へのＦＬの結合を阻止せず、抗体が結合されていてもＦＬはＦＬＴ３を通じてシグナル伝達し得るようになっている。このような抗体は、ＦＬの存在下で細胞傷害活性が低下しないを示す（ここで、ＦＬＴ３へのＦＬ結合を阻止する抗ＦＬＴ３抗体薬物複合体は、ＦＬの存在下で細胞傷害性低下を示す）。好ましい実施形態において、本明細書中に記載の抗ＦＬＴ３薬物複合体は、ＦＬＴ３へのＦＬの結合を実質的に阻害しない。
抗体−薬物複合化合物は、少なくとも１つの薬物単位に共有結合した抗体単位を含む。薬物単位は、抗体単位に直接またはリンカー単位（−ＬＵ−）を介して共有結合され得る。
いくつかの実施形態において、抗体薬物複合化合物は、以下の式：
Ｌ−（ＬＵ−Ｄ）ｐ（Ｉ）
またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を有し；式中：
Ｌは抗体単位、例えば本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂ、例えばＣＨｖ６２．２１またはＣＨｖ６２．２１ｐＡＦなどであり、
（ＬＵ−Ｄ）はリンカー単位−薬物単位部分であり、式中、
ＬＵ−はリンカー単位であり、
−Ｄは標的細胞に対して細胞分裂阻害または細胞傷害活性を有する薬物単位であり；
ｐは１〜２０の範囲である。
いくつかの実施形態において、ｐは、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３または１〜２の範囲である。いくつかの実施形態において、ｐは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４または２〜３の範囲である。他の実施形態において、ｐは１、２、３、４、５または６である。いくつかの実施形態において、ｐは２または４である。いくつかの実施形態において、ｐは整数である。他の実施形態において、ｐは平均薬物対抗体比として測定され、これはイネガー（ｉｎｅｇｅｒ）であってもよいし、または整数でなくてもよい。
いくつかの実施形態において、抗体薬物複合化合物は、以下の式またはその薬学的に許容可能な塩もしくは溶媒和物を有し：
Ｌ−（Ａａ−Ｗｗ−Ｙｙ−Ｄ）ｐ（ＩＩ）
式中：
Ｌは抗体単位、例えばＦＬＴ３ ＭＡｂ、例えばＣＨｖ６２．２１またはＣＨｖ６２．２１ｐＡＦなどであり；
−Ａａ−Ｗｗ−Ｙｙ−はリンカー単位（ＬＵ）であり；式中、
−Ａ−はストレッチャ単位であり、
ａは０または１または２または３であり、
各−Ｗ−は独立にアミノ酸単位であり、
ｗは０〜１２の範囲の整数であり、
−Ｙ−は自壊性スペーサ単位であり、
ｙは０、１または２であり、
−Ｄは標的細胞に対して細胞分裂阻害または細胞傷害活性を有する薬物単位であり；
ｐは１〜２０の整数である。
いくつかの実施形態において、ａは０または１であり、ｗは０または１であり、ｙは０、１または２である。いくつかの実施形態において、ａは０または１であり、ｗは０または１であり、ｙは０または１である。いくつかの実施形態において、ｐは、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３または１〜２の範囲である。いくつかの実施形態において、ｐは、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４または２〜３の範囲である。他の実施形態において、ｐは１、２、３、４、５または６である。いくつかの実施形態において、ｐは２または４である。いくつかの実施形態において、ｗがゼロでない場合、ｙは１または２である。いくつかの実施形態において、ｗが１〜１２である場合、ｙは１または２である。いくつかの実施形態において、ｗは２〜１２であり、ｙは１または２である。いくつかの実施形態において、ａは１であり、ｗおよびｙは０である。
複数の抗体を含む組成物に対して、薬物負荷量は、抗体あたりの薬物分子の平均数ｐにより表される。薬物負荷量は、抗体あたり１〜２０薬物（Ｄ）の範囲であり得る。複合化反応の準備における抗体あたりの薬物の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイおよびＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴評価され得る。ｐの観点における抗体−薬物複合体の定量的分布も決定し得る。いくつかの例において、ｐが、他の薬物負荷量を伴う抗体−薬物−複合体からのある一定の値である場合の、均質な抗体−薬物−複合体の分離、精製および特徴評価は、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段によって達成され得る。代表的な実施形態において、ｐは２〜８である。
抗体−薬物複合化合物の生成は、当業者に公知のいかなる技術によっても達成され得る。簡潔に述べると、抗体−薬物複合化合物は、抗体単位としての本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂと、薬物と、場合によっては薬物および結合剤を連結させるリンカーと、を含む。好ましい実施形態において、本抗体は、上記のＣＨｖ６２．２１と呼ばれる抗体の重鎖および軽鎖可変領域を含むＦＬＴ３ ＭＡｂである。より好ましい実施形態において、本抗体は、上記のＣＨｖ６２．２１ｐＡＦと呼ばれる抗体の重鎖および軽鎖を含むＦＬＴ３ ＭＡｂである（式（Ｉ）を参照）。
結合剤への薬物および／またはリンカーの共有結合のために、多数の異なる反応が利用可能である。これは、結合剤、例えば、リジンのアミン基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基および芳香族アミノ酸の様々な部分を含む、結合剤、例えば抗体分子の、アミノ酸残基の反応によって達成されることが多い。共有結合の最も一般的に使用される非特異的な方法の１つは、化合物のカルボキシ（またはアミノ）基を抗体のアミノ（またはカルボキシ）基に連結させるためのカルボジイミド反応である。さらに、化合物のアミノ基を抗体分子のアミノ基に結合させるために、ジアルデヒドまたはイミドエステルのような二官能性薬剤が使用されてきた。結合剤への薬物の結合のためにも利用可能であるのは、シッフ塩基反応である。この方法は、グリコールまたはヒドロキシ基を含有する薬物の過ヨウ素酸酸化を含み、したがってアルデヒドを形成させ、次にこれを結合剤と反応させる。結合は、結合剤のアミノ基とのシッフ塩基の形成を介して起こる。薬物を結合剤に共有結合させるためのカップリング剤として、イソチオシアネートも使用され得る。他の技術が当業者にとって公知であり、本発明の範囲内である。
ある一定の実施形態において、リンカーの前駆体である中間体を適切な条件下で薬物と反応させる。ある一定の実施形態において、反応基は、薬物および／または中間体において使用される。薬物と中間体または誘導体化薬物との間の反応の生成物を、続いて、適切な条件下でＦＬＴ３ ＭＡｂと反応させる。
Ｖ．）リンカー単位
典型的には、抗体−薬物複合化合物は、薬物単位と抗体単位との間にリンカー単位を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、リンカー切断によって細胞内環境において抗体から薬物単位が放出されるように、細胞内条件下で切断可能である。さらに他の実施形態において、リンカー単位は切断可能ではなく、例えば抗体分解によって薬物が放出される。
いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオレ（ｃａｖｅｏｌｅａ）内）に存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むが限定されない、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。リンカーはまた、細胞外環境（例えば、細胞膜または組織空間の近傍）に存在する切断剤によって切断され得る。リンカーは、例えば、カテプシンファミリー酵素またはマトリクスメタロプロテイナーゼを含むが限定されない、細胞外ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。好ましい実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも１個のアミノ−オキシ酸単位（Ａｍｂｒｘ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含有する。切断剤としては、当技術分野で公知の薬剤が挙げられ得る（例えばＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３および米国特許第６，２１４，３４５号明細書を参照）。治療剤の細胞内タンパク質分解放出を使用することについてのある長所は、複合化される場合にその薬剤が一般的に減弱化され、その複合体の血清安定性が一般的に高くなることである。
他の実施形態において、切断可能なリンカーはｐＨ感受性であり、すなわち、ある一定のｐＨ値での加水分解に対して感受性である。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソーム中で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用し得る。（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号明細書；同第５，８２４，８０５号明細書；同第５，６２２，９２９号明細書；ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３；Ｎｅｖｉｌｌｅら、１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３−１４６６１を参照）。このようなリンカーは、血中などの中性ｐＨ条件下では比較的安定であるが、リソソームのおおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満では不安定であるかまたは安定性が低下する。ある一定の実施形態において、加水分解性リンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合されるチオエーテルなど）である（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号明細書を参照）。
さらに他の実施形態において、リンカーは、当技術分野で公知の還元条件下で切断可能である。（例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋら、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７を参照。また米国特許第４，８８０，９３５号明細書も参照）。リンカーは、細胞内（または細胞外）で見られる還元条件下で切断することもできる。例えば、好ましい実施形態において、特異的リンカーＮ−Ｏ結合を形式上還元して破壊して、リンカーの切断をもたらし得る。
さらに他の実施形態において、リンカー単位は切断可能ではなく、薬物は抗体分解によって放出される。（その全体においておよび全ての目的のために参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１２／１６６５６０号パンフレット（Ａｍｂｒｘ，Ｉｎｃ．）を参照）。
他の相互に排他的ではない実施形態において、リンカーは、当技術分野で知られているように細胞内在化を促進する。
本発明の組成物および方法とともに使用し得る様々な代表的リンカーは、国際公開第２００４／０１０９５７号パンフレット、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号明細書、米国特許出願公開第２００５０２３８６４９号明細書および米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号明細書に記載されている（これらはそれぞれ、その全体においておよび全ての目的のために参照により本明細書中に組み込まれる）。
好ましい実施形態において、本発明のＬＵはＡＧＬと表示され、一般には２−（アミノオキシ）酢酸またはＣ２Ｈ５ＮＯ３として知られる。
ＶＩ．）ストレッチャ単位
ストレッチャ単位（Ａ）は、存在する場合、抗体単位を、存在するならばアミノ酸単位（−Ｗ−）に、存在するならばスペーサ単位（−Ｙ−）に；または薬物単位（−Ｄ）に結合可能である。天然にまたは化学的操作を介するかの何れかで、ＦＬＴ３ ＭＡｂ（例えばＣＨｖ６２．２１またはＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ）上に存在し得る有用な官能基としては、ケト、アルデヒド、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、炭水化物のアノマーヒドロキシル基およびカルボキシルが挙げられるが限定されない。適切な官能基は、ケト、アルデヒド、スルフヒドリルおよびアミノである。一例において、ケト基は、本発明のＭａｂに組み込まれる非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）上にある。さらなる例において、アルデヒド基は、本発明のＭａｂに組み込まれるｎｎＡＡ上にある。別の例において、ＦＬＴ３ ＭＡｂの分子内ジスルフィド結合の還元によってスルフヒドリル基が生成され得る。別の実施形態において、ＦＬＴ３ ＭＡｂのリジン部分のアミノ基と２−イミノチオラン（トラウト試薬）または他のスルフヒドリル生成試薬との反応によって、スルフヒドリル基が生成され得る。ある一定の実施形態において、ＦＬＴ３ ＭＡｂは組み換え抗体であり、１つ以上のリジンを保有するように操作されている。ある一定の他の実施形態において、組み換えＦＬＴ３ ＭＡｂは、さらなるスルフヒドリル基、例えばさらなるシステインを保有するように操作されている。
一実施形態において、ストレッチャ単位は、抗体単位のケト基とオキシム結合を形成する。ケト基は、ＭＡｂに組み込まれるｎｎＡＡ上に存在する。
明示的に示されていない場合でも、１〜２０の薬物部分が抗体（ｐ＝１〜２０）に連結され得ることは、全ての代表的な実施形態から理解されるべきである。
アミノ酸単位
アミノ酸単位（−Ｗ−）は、存在する場合、ストレッチャ単位を、スペーサ単位が存在する場合はスペーサ単位に連結させ、ストレッチャ単位を、スペーサ単位がない場合には薬物部分に連結させ、抗体単位を、ストレッチャ単位およびスペーサ単位がない場合には薬物単位に連結させる。
Ｗｗ−は、例えば、モノペプチド、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチド単位であり得る。各−Ｗ−単位は、独立して、角括弧中に以下で示す式を有し、ｗは、０〜１２の範囲の整数である：
式中、Ｒ１９としては、水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジルメチル−、３−ピリジルメチル−、４−ピリジルメチル−、フェニル、シクロヘキシルが挙げられるが限定されない。さらなる参考文献については、（参照により本明細書中に完全に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／００７２５８６号明細書および国際公開第２０１２／０４７７２４号パンフレット）を参照のこと。
一定の実施形態において、アミノ酸単位は天然アミノ酸を含み得る。他の実施形態において、アミノ酸単位は非天然アミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態において、アミノ酸単位は、癌または腫瘍関連プロテアーゼを含む１つ以上の酵素によって酵素的に切断されて、薬物単位（−Ｄ）を遊離させ得、ある実施形態において、放出時にインビボでプロトン化されて、薬物（Ｄ）をもたらす。
アミノ酸単位のある態様において、アミノ酸単位は、バリン−シトルリン（ｖｃまたはｖａｌ−ｃｉｔ）である。別の態様において、アミノ酸単位はフェニルアラニン−リジン（すなわちｆｋ）である。アミノ酸単位のさらに別の態様において、アミノ酸単位はＮ−メチルバリン−シトルリンである。
ＶＩＩ．）スペーサ単位
スペーサ単位（−Ｙ−）は、存在する場合、アミノ酸単位が存在するときは、アミノ酸単位を薬物単位に連結させる。あるいは、スペーサ単位は、アミノ酸単位がないときは、ストレッチャ単位を薬物単位に連結させる。スペーサ単位はまた、アミノ酸単位およびストレッチャ単位の両方がないときは、薬物単位を抗体単位に連結させる。スペーサ単位は、非自壊型（ｎｏｎ ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）または自壊型（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）の２種類の一般的なタイプがある。本発明の可能なスペーサの例は当技術分野で公知である。Ｔｏｋｉら、２００２，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：１８６６−１８７２およびＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（７）：７７８−７８４）を参照のこと。
自壊型（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）スペーサの他の例としては、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体などのＰＡＢ基と電子的に同様の芳香族化合物（Ｈａｙら、１９９９，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）およびオルトまたはパラ−アミノベンジルアセタールが挙げられるが限定されない。置換および非置換４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、１９９５，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：２２３）、適切に置換されたビシクロ［２.２.１］およびビシクロ［２.２.２］環系（Ｓｔｏｒｍら、１９７２，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：５８１５）および２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙら、１９９０，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：５８６７）など、アミド結合加水分解時に環化受けるスペーサを使用し得る。グリシンのα位置で置換されるアミン含有薬物の排除（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙら、１９８４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１４４７）も、自壊型（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）スペーサの例である。
ＶＩＩＩ．）薬物単位
薬物単位（Ｄ）は何らかの治療剤であり得る。例えば、薬物単位は、細胞傷害性、細胞分裂阻害性または免疫調節性（例えば免疫抑制性）または化学療法剤である部分であり得る。Ｄは、スペーサ単位（存在する場合）、アミノ酸単位（存在する場合）と、ストレッチャ単位（存在する場合）と、または抗体単位との結合を形成し得る原子を有する薬物単位（部分）である。いくつかの実施形態において、薬物単位Ｄは、スペーサ単位（使用される場合）と結合を形成し得る窒素原子を有する。本明細書で使用される場合、「薬物単位」および「薬物部分」という用語は同義語であり、交換可能に使用される。
細胞傷害性または免疫調節剤の有用なクラスとしては、例えば、抗チューブリン剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤およびアルキル化剤が挙げられる。いくつかの実施形態において、薬物は、オーリスタチン、例えばオーリスタチンＥ（当技術分野でドラスタチン−１０の誘導体としても知られる）またはその誘導体などである。他の典型的なオーリスタチンとしては、ＡＦＰ、ＭＭＡＦおよびＭＭＡＥが挙げられる。代表的なオーリスタチンの合成および構造は、米国特許第６，３２３，３１５号明細書；同第６，２３９，１０４号明細書；同第６，０３４，０６５号明細書；同第５，７８０，５８８号明細書；同第５，６６５，８６０号明細書；同第５，６６３，１４９号明細書；同第５，６３５，４８３号明細書；同第５，５９９，９０２号明細書；同第５，５５４，７２５号明細書；同第５，５３０，０９７号明細書；同第５，５２１，２８４号明細書；同第５，５０４，１９１号明細書；同第５，４１０，０２４号明細書；同第５，１３８，０３６号明細書；同第５，０７６，９７３号明細書；同第４，９８６，９８８号明細書；同第４，９７８，７４４号明細書；同第４，８７９，２７８号明細書；同第４，８１６，４４４号明細書；および同第４，４８６，４１４号明細書に記載されており、これらのそれぞれは、その全体において、および全ての目的のために、参照により本明細書中に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、薬物単位は、カリケアマイシン、カンプトテシン、メイタンシノイドまたはアントラサイクリンである。いくつかの実施形態において、薬物は、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどである。
いくつかの典型的な実施形態において、適切な細胞傷害剤としては、例えば、ＤＮＡ副溝結合剤（例えば、エネジインおよびレキシトロプシン、ＣＢＩ化合物；米国特許第６，１３０，２３７号明細書も参照）、デュオカルマイシン、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、ピューロマイシンおよびビンカアルカロイドが挙げられるが限定されない。他の細胞傷害剤としては、例えば、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネットロプシン、エポチロンＡおよびＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、ディスコデルモライド、エリュテロビンおよびミトキサントロンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、薬物は抗チューブリン剤である。抗チューブリン剤の例としては、オーリスタチン、タキサン（例えばタキソール（登録商標）（パクリタキセル）、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（ツラリック（Ｔｕｌａｒｉｋ））およびビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビン）が挙げられる。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例えばエポチロンＡおよびＢ）、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモライドおよびエリュテロビンが挙げられる。
ある一定の実施形態において、細胞傷害剤は、メイタンシノイド、抗チューブリン剤の別の群である。例えば、具体的な実施形態において、メイタンシノイドはメイタンシンまたはＤＭ−１である（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃ．；Ｃｈａｒｉら、１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７−１３１も参照）。
ある一定の実施形態において、細胞傷害剤または細胞分裂阻害剤は、ドラスタチンである。ある一定の実施形態において、細胞傷害剤または細胞分裂阻害剤は、オーリスタチンクラスである。
さらなる実施形態において、薬物単位は、新規のドラプロイン−ドライソリューイン（ｄｏｌａｉｓｏｌｅｕｉｎｅ）ペプチド類似体である。したがって、本明細書で提供されるのは、式（Ｉ）の化合物 または薬学的に許容可能なその塩である：
式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して−Ｈまたはアルキルであり；
Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲＺ−、−Ｓ−であるかまたは存在せず；
ここでＲＺは、−Ｈまたはアルキルであり；
Ｒ３は、式：

の基であり；
ここでＲ１５およびＲ１６は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−ＯＨ、アルキル−ＮＨ２、アルキル−ＳＨまたはアルキル−Ｎ３であり；
Ｒ４は、式：

の基であり；
ここで、Ｒ１７およびＲ１８は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３−、−ＣＯ２Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキル−ＯＨ、アルキル−ＮＨ２、−アルキル−ＳＨ、−アルキル−Ｎ３または−アルキル−ＣＯ２Ｈであり；
Ｒ５はｓｅｃ−ブチルまたはイソブチルであり；
Ｒ６は−Ｈまたはアルキルであり；
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、−Ｈ、アルキル、−ＣＯ２Ｒａ、ＣＯＮＲｂＲＣ、置換もしくは非置換フェニルまたは置換もしくは非置換複素環であり；
ここでＲａは、−Ｈまたはアルキルであり；
ＲｂおよびＲＣは、それぞれ独立に、Ｈまたはアルキルであり；
Ｒ９は−Ｈまたはアルキルであるか；またはＲ９は、Ｒ４およびそれらが連結される原子と一緒になって、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル環を形成し；
Ｒ１０は、−Ｈまたはアルキルであり；
Ｒ１１は、−Ｈまたはアルキルであり；
Ｒ１２は、−Ｈまたはアルキルであり；
Ｒ１３は、−Ｈまたはアルキルであり；
Ｒ１４は、−Ｈ、−ＯＨまたはアルキルであり；
ただし、Ｘが存在せず、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８がそれぞれメチルである場合、Ｒ８は置換もしくは非置換フェニルまたは置換もしくは非置換複素環ではない。
いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、−Ｈまたはアルキル、例えばＣ１−６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、−Ｈまたはメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は両者ともメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は両者とも−Ｈである。
いくつかの実施形態において、Ｘは存在しない。他の実施形態において、Ｘは−Ｏ−である。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立にアルキルであり、Ｘは存在しない。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２は両者ともメチルであり、Ｘは存在しない。他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は両者とも−Ｈであり、Ｘは−Ｏ−である。いくつかの実施形態において、Ｘは−ＮＲＺ−であり、ＲＺは−Ｈまたはアルキルである。いくつかの実施形態において、ＲＺは−Ｈである。いくつかの実施形態において、ＸはＲＺがアルキル、例えばＣ１−６アルキルまたはメチルである。
ある一定の実施形態において、 Ｒ３は、式：

であり；
ここでＲ１５およびＲ１６は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３、アルキル、アルケニル、アルキニル、−アルキル−ＯＨ、−アルキル−ＮＨ２、−アルキル−ＳＨまたは−アルキル−Ｎ３である。さらに他の実施形態において、Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立に、−Ｈ、アルキル、（ＣＨ２）０−６Ｃ≡ＣＨ、−（ＣＨ２）０−６ＣＨ＝ＣＨ２、−（ＣＨ２）０−６ＯＨ、−（ＣＨ２）０−６ＮＨ２、−（ＣＨ２）０−６ＳＨまたは−（ＣＨ２）０−６Ｎ３である。いくつかの実施形態において、Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨまたはアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨまたはメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１５は−ＯＨであり、Ｒ１６は水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ１５は−ＯＨであり、Ｒ１６はメチルである。
ある一定の実施形態において、Ｒ３は分子の残部に対してＲ立体化学配置である。他の実施形態において、Ｒ３は、分子の残部に対してＳ立体化学配置である。ある一定の実施形態において、Ｒ３基自体が、１つ以上の不斉中心を含有し、これらの立体中心は、それぞれ独立に、ＲまたはＳ配置である。
ある一定の実施形態において、Ｒ４は、

であり、ここでＲ１７およびＲ１８は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３、−ＣＯ２Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、−アルキル−ＯＨ、−アルキル−ＮＨ２、−アルキル−ＳＨ、−アルキル−Ｎ３または−アルキル−ＣＯ２Ｈである。他の実施形態において、Ｒ４は、

であり、ここでＲ１７は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３、−ＣＯ２Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、−アルキル−ＯＨ、−アルキル−ＮＨ２、−アルキル−ＳＨ、−アルキル−Ｎ３または−アルキル−ＣＯ２Ｈであり、Ｒ１８は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３、−ＣＯ２Ｈ、アルケニル、アルキニル、−アルキル−ＯＨ、−アルキル−ＮＨ２、−アルキル−ＳＨ、−アルキル−Ｎ３または−アルキル−ＣＯ２Ｈである。さらに他の実施形態において、Ｒ１７およびＲ１８は、それぞれ独立に、−Ｈ、アルキル、−（ＣＨ２）０−６Ｃ≡ＣＨ、−（ＣＨ２）０−６ＣＨ＝ＣＨ２、−（ＣＨ２）０−６ＯＨ、−（ＣＨ２）０−６ＮＨ２、−（ＣＨ２）０−６ＳＨまたは−（ＣＨ２）０−６Ｎ３である。いくつかの実施形態において、Ｒ１７およびＲ１８は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３、−ＣＯ２Ｈ、アルキル、−アルキル−ＮＨ２または−アルキル−Ｎ３である。いくつかの実施形態において、Ｒ１７およびＲ１８は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３、−ＣＯ２Ｈ、メチル、−ＣＨ２ＮＨ２または−ＣＨ２Ｎ３である。
ある一定の実施形態において、Ｒ４は、Ｒ９およびそれらが連結される原子と一緒になって、置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキル環を形成する。ある一定の実施形態において、Ｒ４は、Ｒ９およびそれらが連結される原子と一緒になって、非置換であり得るか、または−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−Ｎ３から選択される１つ以上の基で置換され得る、５〜７員ヘテロシクロアルキル環を形成する。ある一定の実施形態において、ヘテロシクロアルキル環は、非置換であり得るか、または−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−Ｎ３から選択される１つ以上の基で置換されていてもよいピロリジン環である。
ある一定の実施形態において、Ｒ４は分子の残部に対してＲ立体化学配置にある。他の実施形態において、Ｒ４は分子の残部に対してＳ立体化学配置にある。ある一定の実施形態において、Ｒ４基自体が、１つ以上の不斉中心を含有し、これらの立体中心は、それぞれ独立に、ＲまたはＳ配置である。
ある一定の実施形態において、Ｒ５はｓｅｃ−ブチルである。他の実施形態において、Ｒ５はイソブチルである。ある一定の実施形態において、Ｒ５は分子の残部に対してＲ立体化学配置にある。他の実施形態において、Ｒ５は、分子の残部に対してＳ立体化学配置にある。いくつかの実施形態において、Ｒ５基内の不斉中心はＲ配置であり、他の実施形態において、不斉中心はＳ配置である。
ある一定の実施形態において、Ｒ６は−Ｈである。他の実施形態において、Ｒ６はアルキル、例えばＣ１−８アルキル、Ｃ１−４アルキル、メチルまたはエチルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、−Ｈ、アルキル、−ＣＯ２Ｒａまたは−ＣＯＮＲｂＲｃであり；ここでＲａは−Ｈまたはアルキル、例えばＣ１−６アルキルまたはメチルであり；ＲｂおよびＲｃは、それぞれ独立に、−Ｈまたはアルキル、例えばＣ１−６アルキルまたはメチルである。
ある一定の実施形態において、Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立に、置換もしくは非置換フェニルまたは置換もしくは非置換複素環であり、ここでフェニルまたは複素環は、ハロ、オキソ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルおよびアルコキシから選択される１つ以上の基で置換され得る。ある一定の他の実施形態において、Ｒ７は、非置換３〜８員複素環である。ある一定の他の実施形態において、Ｒ７は置換された３〜８員複素環である。ある一定の他の実施形態において、Ｒ８は、場合によりハロで置換されているフェニルである。
ある一定の実施形態において、Ｒ７は分子の残部に対してＲ立体化学配置にある。他の実施形態において、Ｒ７は分子の残部に対してＳ立体化学配置にある。
ある一定の実施形態において、Ｒ８は分子の残部に対してＲ立体化学配置である。他の実施形態において、Ｒ８は分子の残部に対してＳ立体化学配置である。
いくつかの実施形態において、Ｒ７は、−ＣＯ２Ｒａ −ＣＯＮＲｂＲｃ；テトラゾリルまたはチアゾリルであり、ここでＲａは−Ｈまたはアルキル、例えばＣ１−６アルキルまたはメチルであり；ＲｂおよびＲｃは、それぞれ独立に、−Ｈまたはアルキル、例えば、Ｃ１−６アルキルまたはメチルであり；Ｒ８は場合によりハロで置換されているフェニルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ９は−Ｈである。他の実施形態において、Ｒ９は、アルキル、例えばＣ１−８アルキル、Ｃ１−４アルキル、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ９は−Ｈまたはメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ９はメチルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１０は−Ｈである。他の実施形態において、Ｒ１０は、アルキル、例えばＣ１−８アルキル、Ｃ１−４アルキル、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１０は−Ｈまたはメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１０はメチルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１１は−Ｈである。他の実施形態において、Ｒ１１は、アルキル、例えばＣ１−８アルキル、Ｃ１−４アルキル、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は、−Ｈまたはメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１１はメチルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１２は−Ｈである。他の実施形態において、Ｒ１２は、アルキル、例えばＣ１−８アルキル、Ｃ１−４アルキル、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１２は、−Ｈまたはメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１２はメチルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１３は−Ｈである。他の実施形態において、Ｒ１３は、アルキル、例えばＣ１−８アルキル、Ｃ１−４アルキル、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３は−Ｈまたはメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１３はメチルである。
いくつかの実施形態において、Ｒ１４は−Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｒ１４は、アルキル、例えばＣ１−６アルキル、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１４は−ＯＨである。
ある一定の実施形態において、Ｒ１４は分子の残部に対してＲ立体化学配置にある。他の実施形態において、Ｒ１４は分子の残部に対してＳ立体化学配置にある。
いくつかの実施形態において、Ｒ７は−ＣＯ２Ｒａであり、ここでＲａは−Ｈまたはアルキル、例えばＣ１−６アルキルまたはメチルであり；Ｒ８はフェニルであり；Ｒ１４は−Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｒ７は−ＣＯＮＲｂＲｃであり、ここでＲｂおよびＲｃはそれぞれ独立に−Ｈまたはアルキル、例えばＣ１−６アルキルまたはメチルであり；Ｒ８はフェニルであり；Ｒ１４は−Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｒ７はアルキル、例えばＣ１−６アルキルまたはメチルであり；Ｒ８はフェニルであり；Ｒ１４は−ＯＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ７はメチルであり、Ｒ８はフェニルであり、Ｒ１４は−ＯＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ７およびＲ１４は両者とも−Ｈであり、Ｒ８はピリジニル、ピペリジニル、非置換フェニル、またはハロ、例えばフルオロ、クロロもしくはブロモで置換されているフェニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ７は−ＣＯ２Ｒａであり、ここでＲａは−Ｈまたはアルキル、例えばＣ１−６アルキルまたはメチルであり；Ｒ８は−Ｈまたはアルキル、例えばＣ１−６アルキルまたはメチルであり；Ｒ１４はアルキル、例えばＣ１−６アルキル、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ７は−ＣＯ２Ｒａであり、ここでＲａは−Ｈまたはアルキル、例えばＣ１−６アルキルまたはメチルであり；Ｒ８は−Ｈまたはアルキル、例えばＣ１−６アルキルまたはメチルであり；Ｒ１４は−ＯＨである。
ある一定の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、−ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｘは−Ｏ−であるか、または存在せず；
Ｒ３は、

であり；ここでＲ１５およびＲ１６はそれぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ４は、

であり；ここで、Ｒ１７は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ１−６アルキル−ＮＨ２、アルキニル、アルケニルまたは−Ｃ１−６アルキル−Ｎ３であり；Ｒ１８は−ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ５はｓｅｃ−ブチルであり；
Ｒ６は−Ｈであり；
Ｒ７は、−Ｈ、Ｃ１−６アルキル、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲｂＲｃ、テトラゾリルまたはチアゾリルであり；ここでＲａは−ＨまたはＣ１−６アルキルであり；ＲｂおよびＲｃはそれぞれ−ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ８は、−Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換フェニルまたは置換もしくは非置換複素環であり；
Ｒ９は−Ｈであり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立に、Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ１４は、−Ｈ、Ｃ１−６アルキルまたは−ＯＨである。
ある一定の実施形態において、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、−Ｈまたはメチルであり；
Ｘは−Ｏ−であるか、または存在せず；
Ｒ３は、

であり；ここでＲ１５およびＲ１６はそれぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨまたはメチルであり；
Ｒ４は、

であり；ここで、Ｒ１７は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−Ｎ３、−ＣＯ２Ｈ、アミノメチル、アルキニル、アルケニル、またはアジドメチルであり；Ｒ１８は−Ｈまたはメチルであり；
Ｒ５はｓｅｃ−ブチルであり；
Ｒ６は−Ｈであり；
Ｒ７は、−Ｈ、メチル、−ＣＯ２Ｒａまたは−ＣＯＮＲｂＲｃであり；ここでＲａは−Ｈまたはメチルであり；ＲｂおよびＲｃはそれぞれ−Ｈまたはメチルであり；
Ｒ８は、−Ｈ、メチル、エチル、ピリジニル、ピペリジニル、非置換フェニル、ハロで置換されたフェニルであり；
Ｒ９は−Ｈであり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３はそれぞれメチルであり；
Ｒ１４は、−Ｈ、メチルまたは−ＯＨである。
ある一定の実施形態において、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、−ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｘは存在せず；
Ｒ３は、

であり；ここでＲ１５およびＲ１６はそれぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ４は

であり；ここでＲ１７は−Ｎ３であり、Ｒ１８は−Ｈまたはメチルであり；
Ｒ５はｓｅｃ−ブチルであり；
Ｒ６は−Ｈであり；
Ｒ７は、−Ｈ、Ｃ１−６アルキル、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲｂＲｃ、テトラゾリルまたはチアゾリルであり；ここでＲａは−ＨまたはＣ１−６アルキルであり；ＲｂおよびＲｃはそれぞれ−ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ８は、−Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換フェニルまたは置換もしくは非置換複素環であり；
Ｒ９は−Ｈであり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立に、Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ１４は、−Ｈ、Ｃ１−６アルキルまたは−ＯＨである。
ある一定の実施形態において、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、−ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｘは−Ｏ−であり；
Ｒ３は、

であり；ここでＲ１５およびＲ１６はそれぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ４は

であり；ここでＲ１７は−Ｎ３であり、Ｒ１８は−Ｈまたはメチルであり；
Ｒ５はｓｅｃ−ブチルであり；
Ｒ６は−Ｈであり；
Ｒ７は、−Ｈ、Ｃ１−６アルキル、−ＣＯ２Ｒａ、−ＣＯＮＲｂＲｃ、テトラゾリルまたはチアゾリルであり；ここでＲａは−ＨまたはＣ１−６アルキルであり；ＲｂおよびＲｃはそれぞれ−ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ８は、−Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換もしくは非置換フェニルまたは置換もしくは非置換複素環であり；
Ｒ９は−Ｈであり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立に、Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ１４は、−Ｈ、Ｃ１−６アルキルまたは−ＯＨである。
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれメチルであり；
Ｘは存在せず；
Ｒ３は、式：

の基であり、ここで、Ｒ１５およびＲ１６はそれぞれメチルであり；
Ｒ４は式：

の基であり、ここでＲ１７は、−Ｎ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨであり、Ｒ１８は−Ｈまたはメチルであり；
Ｒ５はｓｅｃ−ブチルであり；
Ｒ６は−Ｈであり；
Ｒ７は、−ＣＯ２ＲａまたはＣＯＮＲｂＲｃであり；ここでＲａは−ＨまたはＣ１−６アルキルであり；ＲｂおよびＲｃは、それぞれ独立に、ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ８はフェニルであり；
Ｒ９は−Ｈであり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立にメチルであり；
Ｒ１４は−Ｈである。
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ−Ｈであり；
Ｘは−Ｏ−であり；
Ｒ３は、式：

の基であり、ここで、Ｒ１５および１６はそれぞれメチルであり；
Ｒ４は式：

の基であり、ここでＲ１７は−Ｎ３であり、Ｒ１８は−Ｈまたはメチルであり；
Ｒ５はｓｅｃ−ブチルであり；
Ｒ６は−Ｈであり；
Ｒ７は、−ＣＯ２ＲａまたはＣＯＮＲｂＲｃであり、ここでＲａは−ＨまたはＣ１−６アルキルであり；ＲｂおよびＲｃは、それぞれ独立に、ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ８はフェニルであり；
Ｒ９は−Ｈであり；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立にメチルであり；
Ｒ１４は−Ｈである。
本明細書で提供される何らかの可変基の定義は、化学的に実現可能な場合には、本明細書で提供される可変基の全ての可能な組み合せおよび並べ替えが企図されるように、本明細書中で提供される何らかの他の可変基の定義と組み合わせて使用され得る。
ある一定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、次のものからなる群から選択される：
（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルプロパンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノエート；
（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノエート；
（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−Ｎ−（（Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（２−（ピリジン−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−３−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（２−（ピリジン−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（２Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−Ｎ−（（２Ｓ）−３−ヒドロキシ−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（２Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（２−（ピペリジン−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−３−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（２Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（２−（ピペリジン−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノエート；
（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−３−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルプロパンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノエート；
（Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−３−アミノ−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（２−（ピリジン−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド；
（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−３−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルプロパンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノエート；
（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−４−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノエート；
（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−４−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノエート；
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（アミノオキシ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（２−（ピリジン−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド；
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−ヒドロキシプロパンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン；
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−２−（ジメチルアミノ）−３−ヒドロキシブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン；
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸；
（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−アミノ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−２−（ジメチルアミノ）−３−ヒドロキシブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド；
（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−アミノ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−２−（（２Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−ヒドロキシプロパンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド；
（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−３−メルカプト−Ｎ−メチルプロパンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノエート；
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−３−メルカプト−Ｎ−メチルプロパンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸；
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルプロパンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸；
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸；
（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−ジメチルアミノ）−３−ヒドロキシプロパンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノエート；
（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（２Ｓ，３Ｒ）−２−（ジメチルアミノ）−３−ヒドロキシブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノエート；
（Ｓ）−メチル２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパノエート；
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（フェネチルアミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（４−クロロフェネチル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（２−クロロフェネチル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（フェネチルアミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（４−クロロフェネチル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（２−クロロフェネチル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（Ｓ）−４−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（フェネチルアミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（Ｓ）−４−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（Ｓ）−４−アミノ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（４−クロロフェネチル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（Ｓ）−４−アミノ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（２−クロロフェネチル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド；
メチル（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルペント−４−インアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート；
（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−アミノ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−３−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（２−（ピリジン−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド； メチル（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−バリネート；
メチル（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−６−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート；
メチル（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（ジメチル−Ｌ−バリル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート；
（Ｓ）−３−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−４−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−（（（Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−４−オキソブタン酸；
（２Ｓ，３Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；
メチル（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−セリネート；
メチル（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−イソロイシネート；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−アミノ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アミノ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド；
メチル（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−３−アジド−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）プロパンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート；
メチル（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート；
（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−アミノ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−３−アジド−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミド；
ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート；
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン；
ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミド；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アジド−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；
ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（２Ｓ，３Ｓ）−３−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニネート；
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；および
（２Ｓ，３Ｓ）−３−アミノ−２−（（Ｓ）−２−（ジメチルアミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ−メチルブタンアミド；および薬学的に許容可能なその塩。
式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩、好ましくは上記のものおよび本明細書中で例示される具体的な化合物の塩、このような塩を含む医薬組成物およびこのような塩を使用する方法も本明細書中で提供される。
「薬学的に許容可能な塩」は、無毒性、生物学的に耐容性である、または、そうでなければ対象への投与に生物学的に適切である、本明細書中で表される化合物の遊離酸または塩基の塩を意味するものとする。全般的に、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９７７，６６，１−１９を参照のこと。好ましい薬学的に許容可能な塩は、薬理学的に有効であり、過度の毒性、刺激またはアレルギー反応がない、対象の組織との接触に適しているものである。本明細書中に記載の化合物は、十分に酸性の基、十分に塩基性の基、または両方のタイプの官能基を保持し得、したがって、いくつかの無機または有機塩基および無機および有機酸と反応して薬学的に許容可能な塩を形成し得る。薬学的に許容可能な塩の例としては、酸付加塩、例えば硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオレート（ｐｒｏｐｉｏｌａｔｅ）、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキシン−１，６−ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、プロピルスルホン酸塩、ベシル酸塩、キシレンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩およびマンデル酸塩および、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウムなどの無機塩基またはメチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リジン、オルニチンなどの有機塩基との塩、アミノ酸またはアセチルロイシンなどの様々なアミノ酸誘導体との塩、アンモニウム塩などが挙げられる。
処置目的のために、本明細書中に記載の化合物を含む医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容可能な賦形剤は、無毒性であり、そうでなければ対象への投与に生物学的に適している物質である。このような賦形剤は、本明細書中に記載の化合物の処方および投与を容易にし、有効成分と適合性がある。薬学的に許容可能な賦形剤の例としては、安定化剤、滑沢剤、界面活性剤、希釈剤、抗酸化剤、結合剤、着色剤、乳化剤または矯味剤が挙げられる。好ましい実施形態において、医薬組成物は無菌組成物である。
本明細書中に記載の医薬組成物は、様々な剤形の調製のための当技術分野で公知の従来の方法に従い、適切な薬学的溶媒または担体中の溶液、エマルジョン、懸濁液または分散液として、または固形担体とともに、丸剤、錠剤、薬用キャンディー、坐剤、再構成用散剤またはカプセル剤として、処方され得る。局所適用のために、本明細書中に記載の化合物は、好ましくは、クリームまたは軟膏または局所投与に適した同様のビヒクルとして処方される。本明細書中に記載の医薬組成物および化合物は、本発明の方法において、例えば、経口、鼻腔、非経口、直腸、局所、眼または吸入による、適切な送達経路によって投与し得る。
本明細書中で使用される場合の「処置する」または「処置すること」という用語は、治療的有用性を生じさせる目的での、対象への本明細書中に記載の化合物の投与を指すものとする。処置することには、疾患、障害もしくは状態、または癌の１つ以上の症状の進行を逆転させる、改善する、緩和する、阻害する、またはそれらの重症度を軽減することが含まれる。「対象」という用語は、ヒトなど、このような処置を必要とする哺乳動物患者を指す。
本明細書で提供される処置方法において、「有効量」は、このような処置を必要とする対象において所望の治療的恩恵を一般にもたらすのに十分な量または用量を意味する。さらに、「治療的有効量」という用語は、このような量を投与されていない対応する対象と比較した場合、疾患、障害または副作用の治癒、予防または改善をもたらすか、または疾患または障害の進行速度を遅らせるがこれらに限定されない、何らかの量を意味する。この用語はまた、その範囲内で、正常な生理学的機能を増強するのに有効な量、ならびに対象、例えばヒトにおいて生理学的機能を引き起こすのに有効な量を含み、この量は、第２の医薬品の治療効果を増強するか、または促進する。本明細書中に記載の化合物の治療的有効量または用量を含む有効量は、通常の因子、例えば投与方式もしくは経路、または薬物送達、薬剤の薬物動態、感染の重症度もしくは経過、対象の健康状況、状態および体重ならびに処置を行う医師の判断を考慮して、常法、例えばモデリング、用量漸増または臨床治験などによって確認し得る。本明細書中で開示される抗体薬物複合体に対する代表的な用量は、約１μｇ〜２ｍｇ活性化合物／ｋｇ対象体重／日、好ましくは約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ／日または約１〜３５ｍｇ／ｋｇ／日または約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。総投与量は、単回または分割投与単位（例えば、ＢＩＤ、ＴＩＤ、ＱＩＤ）で与え得る。
本明細書中に記載の化合物は、癌の処置においてさらなる活性成分と組み合わせて医薬組成物または方法において使用され得る。さらなる活性成分は、本明細書中に記載の化合物とは別に投与し得るか、または本明細書中に記載の化合物とともに本明細書中で提供される医薬組成物中に含まれ得る。例えば、さらなる活性成分は、ベルケード、リツキシマブ、メトトレキサート、ハーセプチン、ビンクリスチン、プレドニゾン、イリノテカンなどであるが限定されない、癌に関連する別の標的に対して活性であるものを含む、癌の処置に有効であることが知られているかまたは発見されているものまたはそれらの組み合わせである。このような組み合わせは、有効性を向上させるか、１つ以上の副作用を減少させるか、または開示される化合物の必要用量を減少させるために役立ち得る。
ここで、続く式（Ｉ）の化合物の一般的な調製および具体的な実施例についての例示的な合成スキームを参照することにより、式（Ｉ）の化合物を説明する。熟練者は、本明細書中の様々な化合物を得るために、所望の生成物をもたらすのに適切な場合、保護ありまたはなしで、最終的に所望される置換基が反応スキームを通じて運ばれるように、出発材料が適切に選択され得ることを認識するであろう。あるいは、最終的に所望される置換基の代わりに、反応スキームを通じて運ばれ得、必要に応じて所望の置換基で置換され得る適切な基を使用することが必要であり得るかまたは所望され得る。さらに、当業者は、反応条件からある一定の官能基（アミノ、カルボキシまたは側鎖基）を保護するために、保護基を使用し得ること、および必要に応じて標準的な条件下でこのような基が除去されることを認識するであろう。スキームＡに示される各反応は、好ましくは、室温前後〜使用される有機溶媒の還流温度の温度で行われる。別段の定めがない限り、可変要素は式（Ｉ）に関して上記で定義したとおりである。
スキームＡを参照して、式（Ｉ）の化合物の調製は、（Ａ）と表示されたドライソリューイン（ｄｏｌａｉｓｏｌｅｕｉｎｅ）（Ｄｉｌ）の保護された酸形態で開始する（Ｐｅｔｔｉｔら（１９９４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：１７９６−１８００参照）。化合物（Ａ）はｔｅｒｔ−ブチルエステル保護基とともに示されるが、当業者は適切な置換を選択し得る。ＰＧが適切なアミノ保護基、例えばＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）またはフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基などである窒素保護バリンまたはイソロイシン誘導体（Ｂ）とのカップリングは、標準的なペプチドカップリング条件下で行われる。例えば、反応は、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ＰｙＢｒＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＢＯＰ、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）など、またはそれらの組み合わせの存在下で行われる。反応は、典型的には、ジイソプロピルエチルアミンなどの３級アミン塩基の存在下で行われる。適切な溶媒としては、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸エチルなどが挙げられる。得られるジペプチド（Ｃ）上のアミノ保護基を適切な条件下で脱保護することにより除去する。例えば、ＰＧがＢｏｃ基である場合、化合物（Ｃ）をトリフルオロ酢酸で処理して遊離アミン（Ｄ）を形成させる。ＰＧがＦｍｏｃ基である場合、化合物（Ｃ）をピペリジンまたはジエチルアミンで処理して化合物（Ｄ）を得る。次いで、化合物（Ｄ）を、上記のようなペプチドカップリング条件下で、必要に応じて保護された形態で、アミノ酸誘導体（Ｅ）にカップリングさせて、トリペプチド（Ｆ）を生成させる。酸での処理によってカルボキシ保護基を除去して、遊離酸（Ｇ）を提供する。
スキームＢを参照して、上記のようなペプチドカップリング条件下で、（Ｈ）と呼ばれるアミノ保護されたドラプロイン（Ｄａｐ）（Ｐｅｔｔｉｔら（１９９４）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６２８７−６２９５参照）をアミン（Ｊ）（当業者にとって公知の方法を使用して調製）とカップリングさせる。得られたジペプチド（Ｋ）をスキームＡについて論じたように脱保護して化合物（Ｌ）を得る。
スキームＣを参照して、酸（Ｇ）およびアミン（Ｌ）を上記で論じたようなペプチドカップリング条件下でカップリングさせて、式（Ｉ）の化合物を得る。反応の結果が式（Ｉ）の保護形態である場合、適切な脱保護条件を使用して、標的化合物を得る。
有効量の少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容可能なその塩と、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む医薬組成物も本明細書中で提供される。
癌に罹患しているかまたは癌と診断された対象を処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に有効量の少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含む方法も本明細書中で提供される。
このような処置を必要とする対象における癌の処置のための、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容可能なその塩の使用も本明細書中で提供される。
このような処置を必要とする対象における癌の処置のための薬剤の製造における、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容可能なその塩の使用も本明細書中で提供される。
このような処置を必要とする対象における癌の処置における使用ための、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容可能なその塩を含有するキットおよび使用のための説明書も本明細書中で提供される。
このような処置を必要とする対象における癌の処置における使用ための、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容可能なその塩を含む製品も本明細書中で提供される。
式（Ｉ）の化合物が抗体に複合化されている抗体薬物複合体（ＡＤＣ）も本明細書中で提供される。
式（Ｉ）を利用する代表的なＡＤＣは、次の構造を有し、ここで「Ｌ」または「ｍＡｂ−ｓ−」は、本明細書中に記載されるＣＨｖ６２．２１と呼ばれるＦＬＴ３ ＭＡｂを表す。
さらに、式（Ｉ）を利用するさらなる代表的なＡＤＣは、次の構造を有し、ここで「Ｌ」または「ｍＡｂ−ｓ−」は、本明細書中に記載されるＣＨｖ６２．２１ｐＡＦと呼ばれるＦＬＴ３ ＭＡｂを表す。
好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−アミノ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−３−アジド−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミドで示される化合物を含む薬物単位を含む。
好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）として以下に示す化合物を含む薬物単位を含む。
ＩＸ．）薬物負荷量
薬物負荷量はｐにより表され、分子中の抗体あたりの薬物部分の平均数である。薬物負荷量は、抗体あたり１〜２０薬物部分（Ｄ）の範囲であり得る。本発明のＡＤＣは、１〜２０の範囲の薬物部分と複合化された抗体の集まりを含む。複合化反応からのＡＤＣの調製における抗体あたりの薬物部分の平均数は、質量分析およびＥＬＩＳＡアッセイなどの従来の手段によって特徴評価し得る。ｐの観点におけるＡＤＣの量的分布も決定し得る。いくつかの例において、ｐが他の薬物負荷量でのＡＤＣからのある一定の値である、均質なＡＤＣの分離、精製および特徴評価は、電気泳動などの手段によって達成され得る。
いくつかの抗体−薬物複合体に対して、ｐは、抗体上の結合部位の数によって制限され得る。例えば、結合がシステインチオールである場合、抗体は１つのみ、またはいくつかのシステインチオール基を有し得るか、または、リンカーが結合され得る、１つのみ、またはいくつかの十分に反応性のチオール基を有し得る。ある一定の実施形態において、より高い薬物負荷量、例えばｐ＞５、は、ある一定の抗体−薬物複合体の凝集、不溶性、毒性または細胞透過性喪失を引き起こし得る。ある一定の実施形態において、本発明のＡＤＣに対する薬物負荷量は、１〜約８、約２〜約６；約３〜約５；約３〜約４；約３．１〜約３．９；約３．２〜約３．８；約３．２〜約３．７；約３．２〜約３．６；約３．３〜約３．８；または約３．３〜約３．７の範囲である。実際に、ある一定のＡＤＣに対して、抗体あたりの薬物部分の最適比は８未満であり得、約２〜約５であり得ることが示されている。
ある一定の実施形態において、薬物部分の理論上の最大値より少ないものが、複合化反応中に抗体に複合化される。抗体は、例えば、以下で論じられるように、薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリジン残基を含有し得る。一般に、抗体は、薬物部分に連結され得る遊離および反応性システインチオール基をあまり多くは含有せず；実際に、抗体中の殆どのシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在する。ある一定の実施形態において、抗体は、反応性システインチオール基を生成させるために、部分的または全体還元条件下で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤で還元され得る。ある一定の実施形態において、リジンまたはシステインなどの反応性求核基を露出させるために抗体を変性条件に供する。
ＡＤＣの負荷量（薬物／抗体比）は、例えば、（ｉ）抗体に対する、薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬のモル過剰を制限すること、（ｉｉ）複合化反応時間または温度を制限すること、（ｉｉｉ）システインチオール修飾に対する部分的または限定的な還元条件、（ｉｖ）リンカー−薬物結合の数および／または位置の調節のためにシステイン残基の数および位置が改変されるような、組み換え技術による、抗体のアミノ酸配列の操作（本明細書中および国際公開第２００６／０３４４８８号パンフレット（その全体において参照により本明細書中に組み込まれる）で開示されるように調製されるチオＭａｂまたはチオＦａｂなど）によって、様々な方法で調節され得る。
複数の求核性基を薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応させ、続いて薬物部分試薬と反応させる場合、得られる生成物は、１つ以上の薬物部分が抗体に結合される分布を有するＡＤＣ化合物の混合物であることが理解されるべきである。抗体あたりの薬物の平均数は、抗体に特異的であり、薬物に特異的である二重ＥＬＩＳＡ抗体アッセイによって混合物から計算され得る。個々のＡＤＣ分子は、質量分析によって混合物中で同定され、ＨＰＬＣ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分離され得る（例えば、Ｈａｍｂｌｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．ら、「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｒｕｇ ｌｏａｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ＣＤ３０ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ」，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．６２４，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ ４５，Ｍａｒｃｈ ２００４；Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．ら、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．６２７，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｍａｒｃｈ ２７−３１，２００４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＣＲ，Ｖｏｌｕｍｅ ４５，Ｍａｒｃｈ ２００４を参照）。ある一定の実施形態において、電気泳動またはクロマトグラフィーによって、複合化混合物から単一の負荷値を有する均質ＡＤＣを単離し得る。
Ｘ．）ＡＤＣの細胞傷害効果を判定する方法
薬物または抗体−薬物複合体が細胞における細胞分裂阻害および／または細胞傷害効果を発揮するか否かを判定する方法は公知である。一般に、抗体薬物複合体の細胞傷害活性または細胞分裂阻害活性は、細胞培地中で抗体薬物複合体の標的タンパク質を発現する哺乳動物細胞を曝露し；細胞を約６時間〜約５日間培養し；細胞生存率を測定することによって測定され得る。抗体薬物複合体の生存能（増殖）、細胞傷害性およびアポトーシス誘導（カスパーゼ活性化）を測定するために、細胞に基づくインビトロアッセイを使用し得る。
抗体薬物複合体が細胞分裂阻害効果を発揮するか否かを判定するために、チミジン取り込みアッセイを使用し得る。例えば、９６ウェルプレートに細胞５，０００個／ウェルの密度で播種した標的抗原発現癌細胞を、７２時間培養し、７２時間の最後の８時間の間に０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンに曝露し得る。抗体薬物複合体の存在下および非存在下で、培養物の細胞への３Ｈ−チミジンの取り込みを測定する。
細胞傷害性を判定するために、壊死またはアポトーシス（プログラム細胞死）を測定し得る。壊死には、典型的には、原形質膜の透過性向上；細胞の膨張および原形質膜の破裂が伴う。アポトーシスは、典型的には、膜ブレビング、細胞質の凝縮および内在性エンドヌクレアーゼの活性化を特徴とする。癌細胞におけるこれらの影響の何れかの判定は、抗体薬物複合体が癌の処置に有用であることを示す。
細胞生存率は、ニュートラルレッド、トリパンブルーまたはＡＬＡＭＡＲ（商標）ブルーなどの色素の取り込みを細胞において測定することによって測定し得る（例えば、Ｐａｇｅら、１９９３，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３：４７３−４７６参照）。このようなアッセイにおいて、色素を含む培地中で細胞を温置し、細胞を洗浄し、細胞の色素取り込みを反映する残存色素を分光光度的に測定する。タンパク質結合色素スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）は、細胞毒性を測定するためにも使用し得る（Ｓｋｅｈａｎら、１９９０，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１０７−１２）。
あるいは、ＭＴＴなどのテトラゾリウム塩は、生存細胞を検出するが死んだ細胞を検出しないことによって、哺乳動物細胞の生存および増殖に対する定量的比色アッセイにおいて使用される（例えば、Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５−６３を参照）。
アポトーシスは、例えば、ＤＮＡ断片化を測定することによって定量し得る。ＤＮＡ断片化のインビトロでの定量的測定のための市販の測光法が利用可能である。ＴＵＮＥＬ（断片化ＤＮＡにおける標識ヌクレオチドの取り込みを検出）およびＥＬＩＳＡに基づくアッセイを含む、このようなアッセイの例は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，１９９９，ｎｏ．２，ｐｐ．３４−３７（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に記載されている。
アポトーシスは、細胞における形態学的変化を測定することによっても判定し得る。例えば、壊死と同様に、原形質膜の完全性の喪失は、ある種の色素（例えばアクリジンオレンジまたは臭化エチジウムなどの蛍光色素）の取り込みを測定することによって判定し得る。アポトーシス細胞数を測定する方法は、ＤｕｋｅおよびＣｏｈｅｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎら編、 １９９２，ｐｐ．３．１７．１−３．１７．１６）に記載されている。細胞は、ＤＮＡ色素（例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチジウムまたはヨウ化プロピジウム）で標識することもでき、核の内膜に沿ってクロマチン凝縮および辺縁趨向について細胞を観察する。アポトーシスを判定するために測定され得る他の形態学的変化としては、例えば、細胞質凝縮、膜ブレビングの増加および細胞の縮小化が挙げられる。
アポトーシス細胞の存在は、培養物の付着および「浮遊」区画の両方で測定し得る。例えば、上清を除去し、付着細胞をトリプシン処理し、遠心分離洗浄段階（例えば２０００ｒｐｍで１０分間）後に調製物を合わせ、（例えばＤＮＡ断片化を測定することにより）アポトーシスを検出することによって両区画を回収し得る。（例えば、Ｐｉａｚｚａら、１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５：３１１０−１６を参照）。
インビボで、適切な動物モデルにおいてＦＬＴ３治療用組成物の効果を評価し得る。例えば、癌の外植片または継代異種移植片組織が、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスなどの免疫不全動物に導入される、異種癌モデルを使用し得る（Ｋｌｅｉｎら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２−４０８）。例えば、国際公開第９８／１６６２８号パンフレットおよび米国特許第６，１０７，５４０号明細書は、原発腫瘍の発生、微小転移および後期疾患に特徴的な骨芽細胞転移の形成を再現可能なヒト前立腺癌の様々な異種移植モデルを記載する。有効性は、腫瘍形成の阻害、腫瘍退縮または転移などを測定するアッセイを用いて予測し得る。
アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイは、治療用組成物の評価に有用である。一実施形態において、治療用組成物で処置した腫瘍担持マウスからの異種移植片をアポトーシス病巣の存在について試験し、未処置の対照異種移植片担持マウスと比較し得る。アポトーシス病巣が処置マウスの腫瘍において見出される度合いから、本組成物の治療有効性の指標が提供される。
上記の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適した担体を含む医薬組成物に処方され得る。適切な担体としては、治療用組成物と組み合わせた場合に、治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、概して患者の免疫系と反応性がない、何らかの物質が挙げられる。例としては、滅菌リン酸緩衝塩溶液、静菌水などのいくつかの標準的な医薬担体の何れかが挙げられるが限定されない（一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓａｌ．，Ｅｄ．，１９８０を参照）。
治療用処方物を可溶化し、治療用組成物を腫瘍部位に送達可能な何らかの経路を介して投与し得る。有効である可能性がある投与経路としては、静脈内、非経口、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内、臓器内、同所性などが挙げられるが限定されない。静脈内注射のための好ましい処方物は、保存静菌水、滅菌非保存水の溶液中の治療組成物を含み、および／または注射用の０．９％滅菌塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有するポリ塩化ビニルまたはポリエチレンバッグ中で希釈される。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され、好ましくは真空下で滅菌粉末として保存され、その後、注射前に、静菌水（例えばベンジルアルコール保存剤を含有）または滅菌水中で再構成され得る。
前述の方法を使用した癌の処置のための投与量および投与プロトコールは、方法および標的癌によって変動し、一般に、当技術分野で認識されるいくつかの他の因子に依存する。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂまたはＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂの修飾ゆえに、複数種の本発明のＡＤＣを含み得る。例えば、本発明には、本発明のＡＤＣを含む医薬組成物が含まれ、ここでＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂは、重鎖Ｃ末端リジンを欠く抗体、Ｎ末端翻訳後修飾を有する抗体、重鎖Ｃ末端リジンを欠き、Ｎ末端翻訳後修飾を有する抗体および／または重鎖Ｃ末端リジンを有し、Ｎ末端翻訳後修飾がない抗体である。
例えば、本発明の医薬組成物は、ＡＤＣのＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂが以下の１）〜４）の群から選択される、２つ以上の種の本発明のＡＤＣを含む医薬組成物を含む：
１）配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含むＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂ；
２）配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されているものからなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含むＣＨｖ６２．２１ＭＡｂ；
３）配列番号９の残基１（Ｑ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含むＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂ；および
４）配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されており、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含むＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂ。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂおよび、配列番号９の残基１（Ｑ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂを含む医薬組成物を含む。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号９の残基１（Ｑ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂおよび、配列番号９の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されており、Ｃ末端残基４５３（Ｋ）が除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂを含む医薬組成物を含む。
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、ＡＤＣのＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂが以下の１）〜４）の群から選択される、２つ以上の種の本発明のＡＤＣを含む医薬組成物を含む：
１）配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含むＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂ；
２）配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されているものからなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含むＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂ；
３）配列番号１１の残基１（Ｑ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｃ末端残基４４３（Ｔ）が除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含むＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂ；および
４）配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されており、Ｃ末端残基４４３（Ｔ）が除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖と、を含むＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂ。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂおよび、配列番号１１の残基１（Ｑ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｃ末端残基４４３（Ｔ）が除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むＣＨｖ６２．２１ｐＡＦＭＡｂを含む医薬組成物を含む。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、配列番号１１の残基１（Ｑ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｃ末端残基４４３（Ｔ）が除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂおよび、配列番号１１の残基１（Ｅ）〜残基４５３（Ｋ）の範囲のアミノ酸配列であって、Ｎ末端残基１（Ｅ）がピログルタミン酸に変換されており、Ｃ末端残基４４３（Ｔ）が除去されているものからなる重鎖と、配列番号１０の残基１（Ｄ）〜残基２１４（Ｃ）の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂを含む医薬組成物を含む。
ＸＩ．）ＦＬＴ３を発現する癌の処置
制約がある一連の組織または細胞で通常発現されるが、表Ｉで列挙されるものなどの癌でも発現されるタンパク質としてのＦＬＴ３の同定によって、このような癌の処置に対するいくつかの治療アプローチが開かれる。
標的化抗腫瘍療法が、標的タンパク質が正常な組織または細胞、さらには正常重要臓器組織でも発現される場合でも有用であったことは、注目に値する。重要臓器は、心臓または結腸などの生命を維持するために必要な臓器である。非重要臓器は、除去可能であり、除去してもその個体が依然として生存可能であるものである。非重要臓器の例は、卵巣、乳房、および前立腺である。
正常組織における標的タンパク質の発現は、重要正常組織でさえも、そのタンパク質がまた過剰発現されるある種の腫瘍に対する治療薬としてのそのタンパク質に対する標的化剤の有用性を損なわない。例えば、重要臓器での発現は、それ自体有害ではない。さらに、前立腺および卵巣など、欠失可能とみなされる臓器は、死亡率に影響を及ぼすことなく除去し得る。最後に、一部の重要臓器は免疫特権のために、正常な臓器発現の影響を受けない。免疫特権臓器は、血液−臓器障壁によって血液から保護され、したがって免疫療法に対して到達不可能である臓器である。免疫特権臓器の例は、脳および精巣である。
したがって、ＦＬＴ３タンパク質の活性を阻害する治療アプローチは、ＦＬＴ３を発現する癌（例えば、表Ｉに記載される癌など）に罹患している患者に有用である。これらの治療アプローチは、一般に３つのクラスに分類される。第１のクラスは、腫瘍細胞増殖の阻害または遅延につながるか、またはその死滅を誘導する腫瘍細胞増殖に関連して、ＦＬＴ３機能を調整する。第２のクラスは、ＦＬＴ３タンパク質とその結合パートナーまたは他のタンパク質との結合または会合を阻害するための様々な方法を含む。第３のクラスは、ＦＬＴ３遺伝子の転写またはＦＬＴ３ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための様々な方法を含む。
したがって、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的ＦＬＴ３イメージング、またはＦＬＴ３発現の存在および程度を確実に示す他の技術を用いて、ＦＬＴ３発現の存在およびレベルについて癌患者を評価し得る。妥当な場合は、この目的のために腫瘍生検または外科標本の免疫組織化学的分析が好ましい。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は、当技術分野で周知である。
ＸＩＩＩ．）抗体に基づく治療に対する標的としてのＦＬＴ３
ＦＬＴ３は、抗体に基づく治療ストラテジーにとって魅力的な標的である。細胞外および細胞内の両方の分子を標的化するために、いくつかの抗体ストラテジーが当技術分野で公知である（例えば、補体およびＡＤＣＣ介在性の死滅ならびにイントラボディの使用を参照）。ＦＬＴ３は、対応する正常細胞と比較して様々な系統の癌細胞によって発現されるので、免疫反応性組成物の非標的臓器および組織への結合によって引き起こされる毒性、非特異的および／または非標的効果なく、優れた感度を示すＦＬＴ３免疫反応性組成物の全身投与が用意される。ＦＬＴ３のドメインと特異的反応性がある抗体は、好ましくは複合体が毒素または治療剤とともにある抗体薬物複合体（すなわちＡＤＣ）としてＦＬＴ３発現癌を全身的に処置するために有用である。
当業者は、抗体が、図１で示されるＦＬＴ３配列の免疫原性領域などの免疫原性分子を特異的に標的化し、それに結合するために使用され得ることを理解する。さらに、当業者は、抗体を細胞傷害剤と複合化することが日常的であることを理解する（例えば、Ｓｌｅｖｅｒｓら、Ｂｌｏｏｄ ９３：１１ ３６７８−３６８４（Ｊｕｎｅ １，１９９９）参照）。細胞傷害剤および／または治療剤が、その細胞によって発現される分子（例えばＦＬＴ３）に特異的な抗体にそれらを複合化させることなどにより細胞に直接送達される場合、細胞傷害剤は、その細胞においてその既知の生物学的効果（すなわち細胞傷害性）を発揮する。
細胞を死滅させるための抗体−細胞傷害剤複合体を使用するための多岐にわたる組成物および方法が当技術分野で公知である。癌との関連において、典型的な方法は、腫瘍を有する哺乳動物に、発現される、結合に到達可能である、または細胞表面上に局在する抗原（例えばＦＬＴ３）に結合する標的化剤（例えば、ＦＬＴ３ ＭＡｂ、好ましくはＣＨｖ６２．２１またはＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ）に連結される、選択された細胞傷害剤および／または治療剤を含む、生物学的に有効な量の複合体を投与することを伴う。典型的な実施形態は、ＦＬＴ３を発現する細胞に細胞傷害剤および／または治療剤を送達する方法であり、ＦＬＴ３エピトープに免疫特異的に結合する抗体に細胞傷害剤を複合化し、細胞を抗体薬物複合体（ＡＤＣ）に曝露することを含む。別の例示的な実施形態は、転移癌があると疑われる個体を処置する方法であり、細胞傷害剤および／または治療剤に複合化される抗体の治療的有効量を含む医薬組成物をその個体に非経口的に投与する段階を含む。
ＦＬＴ３抗体を用いた癌免疫療法は、結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３−１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、１９９７，Ｂｌｏｏｄ ９０：３１７９−３１８６，Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１９９７，Ｂｌｏｏｄ ９０：２４３７−２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋら、１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２７７１−２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９３−１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１−５８９）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎら、１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６１６０−６１６６；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：４３９８−４４０３）および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７−１２７）を含むが限定されない、他のタイプの癌の処置に首尾よく使用されてきた様々なアプローチに従って行い得る。いくつかの治療アプローチには、それぞれ、Ｙ９１またはＩ１３１の抗ＣＤ２０抗体への複合化（例えば、ＺｅｖａｌｉｎＴＭ，ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．またはＢｅｘｘａｒ（商標），Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）など、毒素または放射性同位体へのネイキッド抗体の複合化が含まれ、一方で、他のアプローチには、ハーセプチン（商標）（トラスツズマブ）とパクリタキセル（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）など、抗体および他の治療剤の同時投与が含まれる。好ましい実施形態において、抗体は、上記の細胞傷害剤、好ましくはＭＭＡＥ（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）と呼ばれるオーラスタチン（ａｕｒａｓｔａｔｉｎ）誘導体と複合化される。
ＦＬＴ３抗体療法は癌の全ての段階に有用であるが、抗体療法は、進行癌または転移癌において特に適切であり得る。本発明の抗体療法による処置は、１ラウンド以上の化学療法を受けた患者に対して適応となる。あるいは、本発明の抗体療法は、化学療法処置を受けていない患者に対しては、化学療法または放射線療法と併用される。さらに、抗体療法によって、特に化学療法剤の毒性にあまり耐容性がない患者に対して、併用化学療法の投与量を減量して使用することが可能になり得る。Ｆａｎら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：４６３７−４６４２，１９９３），Ｐｒｅｗｅｔｔら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．ｏｆ Ｏｎｃｏ．９：２１７−２２４，１９９６）およびＨａｎｃｏｃｋら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：４５７５−４５８０，１９９１）は、化学療法剤との様々な抗体の使用を記載する。
表Ｉで記載される癌を処置するＦＬＴ３モノクローナル抗体としては、腫瘍に対して強力な免疫反応を惹起するものまたは直接的に細胞傷害性であるものが含まれる。この点に関して、ＦＬＴ３モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、補体介在性または抗体依存性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機序の何れかによって、腫瘍細胞溶解を誘発し得、両方とも補体タンパク質上のエフェクター細胞Ｆｃ受容体部位との相互作用のために免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする。さらに、腫瘍増殖に対して直接的な生物学的効果を発揮するＦＬＴ３ ＭＡｂは、ＦＬＴ３を発現する癌を処置するのに有用である。直接的に細胞傷害性であるＭＡｂが作用する機序には、細胞増殖の阻害、細胞分化の調整、腫瘍血管形成因子プロファイルの調整およびアポトーシスの誘導が含まれる。特定のＦＬＴ３ ＭＡｂが抗腫瘍効果を発揮する機序は、一般的に当技術分野で知られるような、ＡＤＣＣ、補体介在性細胞溶解などの細胞死を評価する様々なインビトロアッセイを用いて評価される。
したがって、本発明の治療方法で使用される好ましいモノクローナル抗体は、完全ヒトであり、高親和性で標的ＦＬＴ３抗原に特異的に結合する抗体である。
ＸＩＶ．）ＦＬＴ３ ＡＤＣカクテル
本発明の治療方法は、単一のＦＬＴ３ ＡＤＣ、ならびに異なるＭＡｂ（すなわち、ＦＬＴ３ ＭＡｂまたは別のタンパク質に結合するＭＡｂ）の組合せまたはカクテルの投与を企図する。このようなＭＡｂカクテルは、異なるエピトープを標的とするか、異なるエフェクター機序を利用するか、または細胞傷害性ＭＡｂを免疫エフェクター機能に依存するＭＡｂと直接組み合わせるＭＡｂを含有するので、ある種の利点を有し得る。組み合わせたこのようなＭＡｂは、相乗的な治療効果を呈し得る。さらに、ＦＬＴ３ ＭＡｂは、様々な化学療法剤および生物剤、アンドロゲン遮断薬、免疫調節剤（例えばＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）、外科手術または放射線を含むが限定されない他の治療様式と同時に投与し得る。好ましい実施形態において、ＦＬＴ３ ＭＡｂは複合体の形態で投与される。
ＦＬＴ３ ＡＤＣ処方物は、抗体を腫瘍細胞に送達可能な何らかの経路を介して投与される。投与経路としては、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内、皮内などが挙げられるが限定されない。処置は、一般に、典型的には０．１、．２、．３、．４、．５、．６、．７、．８、．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５ｍｇ／ｋｇ体重を含むが限定されない範囲の用量での、静脈内注射（ＩＶ）などの許容可能な投与経路を介した、ＦＬＴ３ ＡＤＣ調製物の反復投与を含む。一般に、１０〜１０００ｍｇのＭＡｂ／週の範囲の用量が効果的であり、十分に耐容性である。
転移性乳癌の処置におけるハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）での臨床経験に基づいて、およそ４ｍｇ／ｋｇ患者体重ＩＶの初期負荷用量、続いて約２ｍｇ／ｋｇ ＩＶのＭＡｂ製剤の週用量というものが、許容可能な投与計画に相当する。好ましくは、初期負荷用量は、９０分以上の点滴として投与される。初期投与量が十分に耐容性であるならば、周期的な維持用量を３０分以上の点滴として投与する。当業者に認識されるように、特定の場合には、様々な因子が理想的な投与計画に影響を及ぼし得る。このような因子としては、例えば、使用されるＭＡｂの結合親和性および半減期、患者におけるＦＬＴ３発現の程度、循環する放出ＦＬＴ３抗原の程度、所望の定常状態抗体濃度レベル、処置頻度および本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法剤または他の薬剤の影響、ならびに特定の患者の健康状態が挙げられる。
場合によっては、患者は、最も有効な投与計画などの決定を支援するために、所与の試料中のＦＬＴ３のレベル（例えば、循環ＦＬＴ３抗原および／またはＦＬＴ３発現細胞のレベル）について評価されるべきである。このような評価は、治療期間を通したモニタリング目的にも使用され、他のパラメータ（例えば、膀胱癌治療における尿細胞診および／または免疫細胞レベル、または類推によって、前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）の評価と組み合わせて、治療の成功を評価するために有用である。
本発明の目的は、ＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害または遅延させるＦＬＴ３ ＡＤＣを提供することである。本発明のさらなる目的は、このようなＦＬＴ３ ＡＤＣを用いて、特に他の薬物または免疫学的に活性がある処置と組み合わせてこのようなＦＬＴ３ ＡＤＣを使用して、血管形成および他の生物学的機能を阻害し、それにより、哺乳動物、好ましくはヒトの腫瘍成長を抑えるための方法を提供することである。
ＸＹ．）併用療法
一実施形態において、化学療法剤または放射線またはそれらの組み合わせと併せてＦＬＴ３ ＡＤＣでヒト腫瘍を含む腫瘍を処置する場合、相乗作用がある。言い換えると、ＦＬＴ３ ＡＤＣによる腫瘍増殖の阻害は、化学療法剤または放射線またはそれらの組み合わせと併用した場合に予想を超えて増強される。相乗効果は、例えば、ＦＬＴ３ ＡＤＣのみの処置またはＦＬＴ３ ＡＤＣおよび化学療法剤または放射線での処置の相加的効果から予想されるよりも、併用処置で腫瘍増殖が大きく阻害されることにより示され得る。好ましくは、相乗効果は、ＦＬＴ３ ＡＤＣからの処置、またはＦＬＴ３ ＡＤＣと化学療法剤もしくは放射線との相加的組み合わせを用いた処置の何れからも寛解が期待されない場合の、癌の寛解によって実証される。
ＦＬＴ３ ＡＤＣおよび化学療法または放射線の組み合わせ、またはその両方を用いた腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法は、化学療法または放射線療法の開始の前に、その最中に、またはその後に、ならびにそれらの何れかの組み合わせ（すなわち、化学療法および／または放射線療法の開始前およびその最中、その前および後、その最中および後、またはその前、最中および後）で、ＦＬＴ３ ＡＤＣを投与することを含む。例えば、ＦＬＴ３ ＡＤＣは、典型的には、放射線療法および／または化学療法を開始する前に、１〜６０日間、好ましくは３〜４０日間、より好ましくは５〜１２日間投与される。しかし、処置プロトコールおよび特定の患者の必要性に応じて、最も効果的な処置を提供し、最終的に患者の寿命を延ばすように、この方法を行う。
化学療法剤の投与は、非経口および腸内経路による全身投与を含む様々な方法で達成し得る。一実施形態において、ＦＬＴ３ ＡＤＣおよび化学療法剤は別個の分子として投与される。化学療法剤または化学療法の特定の例としては、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、インターフェロンα、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ゲムシタビン、クロラムブシル、タキソールおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
ＦＬＴ３ ＡＤＣと組み合わせて使用される放射線源は、処置されている患者の体外または体内の何れかであり得る。放射線源が患者の体外にある場合、治療は外部照射療法（ＥＢＲＴ）として知られる。放射線源が患者の体内にある場合、その処置は組織内照射療法（ＢＴ）と呼ばれる。
上記の治療計画は、さらなる癌処置剤および／または計画、例えばさらなる化学療法、癌ワクチン、シグナル伝達阻害剤、異常な細胞増殖または癌の処置に有用な薬剤、抗体（例えば、国際公開第２００５／０９２３８０号パンフレット（Ｐｆｉｚｅｒ）に記載のような抗ＣＴＬＡ−４抗体）またはＩＧＦ−１Ｒに結合することによって腫瘍増殖を阻害する他のリガンドおよびサイトカインとさらに組み合わせられ得る。
哺乳動物に対してさらなる化学療法が行われる場合、上記の化学療法剤を使用し得る。さらに、増殖因子阻害剤、生物学的反応修飾因子、抗ホルモン療法、選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）、血管形成阻害剤および抗アンドロゲンを使用し得る。例えば、抗ホルモン剤、例えばＮｏｌｖａｄｅｘ（タモキシフェン）などの抗エストロゲン剤、またはカソデックス（４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３−’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリド）などの抗アンドロゲン剤を使用し得る。
上記の治療アプローチは、多岐にわたる外科手術、化学療法または放射線療法計画の何れか１つと組み合わせ得る。本発明の治療アプローチは、化学療法（または他の療法）の低投与量の使用および／またはより少ない投与頻度を可能にし得、全ての患者および特に化学療法剤の毒性に十分に耐容性ではない者にとって有利である。
ＸＶＩ．）キット／製品
本明細書に記載される検査、予後診断、予防、診断および治療用途での使用に対して、キットは本発明の範囲内である。このようなキットは、本明細書中に記載の使用などの使用説明書を含むラベルまたは挿入物と一緒に、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器を受けるように区画化されている担体、パッケージまたは容器を含み得、容器のそれぞれは、本方法において使用されるべき別個の要素のうちの１つを含む。例えば、容器は、検出可能に標識されているか、または検出可能に標識され得る抗体を含み得る。キットは、薬物単位を含む容器を含み得る。本キットは、図２Ａ、２Ｂおよび／または２Ｃ、または図３Ａ、３Ｂおよび／または３Ｃ中のアミノ酸配列またはその類似体の全部もしくは一部、またはこのようなアミノ酸配列をコードする核酸分子を含み得る。
本発明のキットは、典型的には、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジを含む市販用および使用者の観点から望ましい材料を含む、上記の容器およびそれに関連する１つ以上の他の容器；担体、パッケージ、容器、バイアルおよび／または、内容および／または使用説明を記載するチューブラベルおよび、使用説明が記載されている添付文書を含む。
本組成物が予後診断、予防的、診断的または実験的な適用などの特定の治療または非治療的適用に使用されることを示すために、容器上または容器にラベルがあり得、また、本明細書中に記載のものなどのインビボまたはインビトロ使用の何れかのための説明も示し得る。説明および／または他の情報は、キットとともに、またはキット上に含まれる挿入物またはラベル上にも含まれ得る。ラベルは、容器上にあり得るか、または容器と関連付けられ得る。ラベルを形成する文字、数字または他の符号が容器自体に成形または刻み付けられる場合、ラベルは容器上にあり得；その容器をさらに保持する入れ物または担体内に、例えば添付文書として存在する場合、ラベルは容器に関連付けられ得る。ラベルは、本組成物が、表Ｉに記載する組織の癌などの状態を診断、処置、予防または予後診断するために使用されることを示し得る。
「キット」および「製品」という用語は、同義語として使用し得る。
本発明の別の実施形態において、抗体または抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、例えば表Ｉに記載されるものなどの組織の癌の診断、予後診断、予防および／または治療に有用な物質などの組成物を含有する製品が提供される。製品は、典型的には、少なくとも１つの容器および少なくとも１つのラベルを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラス、金属またはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、アミノ酸配列、小分子、核酸配列、細胞集団および／または抗体を保持し得る。別の実施形態において、容器は、細胞および組織におけるＦＬＴ３のタンパク質発現を評価する際の使用、または関連する検査、予後診断、診断、予防および治療目的での使用のための、抗体、その結合断片または特異的結合タンパク質を含み；これらの目的のために試薬および他の組成物または用具が使用され得るように、このような使用のための指示および／または説明書がこのような容器上に、またはこのような容器とともに含まれ得る。
容器は、あるいは、状態を処置、診断、予後診断または予防するのに有効である組成物を保持し得、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の活性薬剤は、ＦＬＴ３に特異的に結合可能な抗体またはＦＬＴ３に特異的に結合する抗体薬物複合体であり得る。
製品は、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液および／またはデキストロース溶液など、薬学的に許容可能な緩衝液を含む第２の容器をさらに含み得る。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、撹拌機、針、シリンジおよび／または使用のための指示および／または説明を伴う添付文書を含む、市販用および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
本明細書中の開示のさらなる実施形態は、以下の項に記載の実施形態を含む：
第１項は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む抗体の実施形態である。代替的な実施形態において、本抗体は、表Ｖで示されるようなＣｈｏｔｈｉａ法によって決定されるようなＣＤＲを含む。別の代替的な実施形態において、本抗体は、表Ｖで示されるようなＣｏｎｔａｃｔ法によって決定されるようなＣＤＲを含む。
第２項は、抗体が、第１項に記載の抗体であって、配列番号１１の１番目のＥ〜１２３番目のＳの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含み、配列番号１０の１番目のＤ〜１０８番目のＲの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体である、さらなる実施形態である。
第３項は、抗体が、第１〜２項の何れか１項に記載の抗体であって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３１のもと寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３１のもと寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される抗体の軽鎖のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体；またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３６のもと寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３６のもと寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される抗体の軽鎖のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗体である、さらなる実施形態である。
第４項は、抗体が、第１〜３項の何れか１項に記載の抗体であって、ＩｇＧサブタイプであるＦｃ領域を含む抗体である、さらなる実施形態である。
第５項は、抗体が、第１〜４項に記載の抗体であって、Ｆｃ領域が重鎖のアミノ酸位置１２４に非天然アミノ酸の置換を含み、非天然アミノ酸がパラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）である抗体である、さらなる実施形態である。
第６項は、抗体が、第１〜５項の何れか１項に記載の抗体であって、配列番号１１の１番〜４５２番アミノ酸のアミノ酸配列からなる重鎖を含み、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である、さらなる実施形態である。第６項の代替的な実施形態において、抗体は、第１または２項に記載の抗体であって、配列番号１１の１番〜４５２番アミノ酸のアミノ酸配列からなる重鎖を含み、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番の範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である。
第７項は、抗体が、第１〜６項の何れか１項に記載の抗体であって、配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖を含み、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である、さらなる実施形態である。第７項の代替的な実施形態において、抗体は、第１または２項に記載の抗体であって、配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖を含み、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である。
第８項は、抗体が、第１〜７項の何れかに記載の抗体であって、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１２１８３１のもと寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される抗体の重鎖のアミノ酸配列からなる重鎖を含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３１のもと寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される抗体の軽鎖のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である、さらなる実施形態である。第８項の代替的な実施形態は、第５項に記載の抗体であって、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１２１８３１のもと寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される抗体の重鎖のアミノ酸配列からなる重鎖を含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３１のもと寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される抗体の軽鎖のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である。
第９項は、抗体が、第１〜８項の何れかに記載の抗体であって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３６のもと寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される抗体の重鎖のアミノ酸配列からなる重鎖を含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３６のもと寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）により産生される抗体の軽鎖のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である、さらなる実施形態である。第９項の別の実施形態は、第１〜５項の何れか１項に記載の抗体であって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３６のもと寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される抗体の重鎖のアミノ酸配列からなる重鎖を含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３６のもと寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）により産生される抗体の軽鎖のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である。
第１０項は、抗体が、第１〜９項の何れか１項に記載の抗体であって、重鎖可変領域または重鎖の１番目のＥがピログルタメートで置換されている抗体である、さらなる実施形態である。
第１１項は、抗体が、第１〜５項の何れかに記載の抗体であって、配列番号１１の１番目のＥ〜４５２番目Ｇの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖を含み、重鎖可変領域または重鎖の１番目のＥがピログルタメートに修飾されており、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である、さらなる実施形態である。第１１項の代替的な実施形態は、第１〜６項の何れか１項に記載の抗体であって、配列番号１１の１番目のＥ〜４５２番目Ｇの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖を含み、重鎖可変領域または重鎖の１番目のＥがピログルタメートに修飾されており、配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗体である。
第１２項は、第１〜１１項の何れか１項に記載の抗体のＣＤＲを含む抗原結合断片であって、ＦＬＴ−３に結合する抗原結合断片である、さらなる実施形態である。
第１３項は、第１２項に記載の抗原結合断片であって、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、単離ＶＨおよび単離ＶＬからなる群から選択される抗原結合断片である、さらなる実施形態である。
第１４項は、第１２項または第１３項に記載の抗原結合断片を含む抗体である。
第１５項は、先行する第１〜１０項または第１４項の何れかに記載の抗体に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する抗体であって、第１〜１４項の何れかに記載の抗体のＣＤＲを含む抗体である、さらなる実施形態である。
第１６項は、第１５項に記載の対応する抗体と同じ親和性でＦＬＴ３に結合し、ＦＬＴ３に結合するＦＬを実質的に阻害しない第１５項に記載の抗体である、さらなる実施形態である。
第１７項は、第１項〜第１０項または第１４項の何れか１項に記載の抗体をコードする１つ以上の単離核酸であるさらなる実施形態である。
第１８項は、第１２または１３項に記載の抗体または断片をコードする１つ以上の単離核酸であるさらなる実施形態である。
第１９項は、対応する項に記載の核酸に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、第１７または１８項に記載の核酸のさらなる実施形態である。
第２０項は、第１７項または第１８項または第１９項に記載の１つ以上の単離核酸を含む１つ以上の発現ベクターであるさらなる実施形態である。第２０項の一実施形態において、第１〜１９項の何れかに記載の抗体の重鎖および軽鎖を発現する１つの発現ベクターがある。さらなる実施形態において、第２０項に記載の発現ベクターは２個のプロモーターを含む。代替的な実施形態において、第２０項に記載の発現ベクターは１個のプロモーターを含む。第２０項の異なる実施形態において、２個の発現ベクターがあり、そのうちの１個は重鎖を発現し、他方は軽鎖を発現する。さらなる実施形態において、第２０項の各発現ベクターは、同じプロモーターを含む。またさらなる実施形態において、第２０項の各発現ベクターは異なるプロモーターを含む。
第２１項は、先行する項、第２０項に記載の１つ以上の発現ベクターを含む組み換え宿主細胞であるさらなる実施形態である。
第２２項は、先行する項、第２１項に記載の組み換え宿主細胞を培養することによって産生される抗体であるさらなる実施形態である。
第２３項は、先行する項、第２２項に記載の抗体および治療剤を含む抗体薬物複合体であるさらなる実施形態である。
第２４項は、ＦＬＴ３に結合する抗体および治療剤を含む抗体薬物複合体であって、ＦＬＴ３のＦＬＴ３リガンド（ＦＬ）への結合を実質的に阻害しない抗体薬物複合体である実施形態である。
第２５項は、抗体および治療剤を連結するリンカーをさらに含む、第２３または２４項に記載の抗体薬物複合体であるさらなる実施形態である。
第２６項は、リンカーが切断不能リンカーである、第２５項に記載の抗体薬物複合体であるさらなる実施形態である。
第２７節は、リンカーが２−（アミノオキシ）酢酸である、第２６項に記載の抗体薬物複合体であるさらなる実施形態である。
第２８項は、治療剤が細胞傷害剤または細胞分裂阻害剤である、第２３項〜第２７項の何れか１項に記載の抗体薬物複合体であるさらなる実施形態である。
第２９項は、治療剤が（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−アミノ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−３−アジド−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミドである、第２３〜２８項の何れか１項に記載の抗体薬物複合体であるさらなる実施形態である。
第３０項は、抗体薬物結合体であって、第２３〜２９項の何れか１項であり、次の式：
抗体−（リンカー−治療剤）ｐ、
（式中、リンカーは、２−（アミノオキシ）酢酸であり、治療剤は（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−アミノ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−３−アジド−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミドであり、ｐは、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９および３からなる群から選択される）
を有する抗体薬物複合体である、さらなる実施形態である。
第３１項は、ｐが１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９および３からなる群から選択される第３０項に記載の抗体薬物複合体である、さらなる実施形態である。
第３２項は、ｐが１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５からなる群から選択される第３１項に記載の抗体薬物複合体である、さらなる実施形態である。
第３３項は、ｐが１．８、１．９および２からなる群から選択される第３２項に記載の抗体薬物複合体である、さらなる実施形態である。
第３４項は、治療的有効量の第２３〜３３項の何れかに記載の抗体薬物複合体を含む医薬組成物であるさらなる実施形態である。
第３５項は、治療での使用のための第３４項に記載の医薬組成物であるさらなる実施形態である。
第３６項は、治療での使用が癌の処置である、先行する項、第３５項に記載の医薬組成物であるさらなる実施形態である。
第３７項は、１つ以上の抗新生物剤と組み合わせた、第３４〜３６項の何れか１項に記載の医薬組成物であるさらなる実施形態である。
第３８項は、対象において癌を処置する方法であって、治療的有効量の第２３〜３３項の何れかに記載の抗体薬物複合体またはその医薬組成物を前記対象に投与することを含む、さらなる実施形態である。第３７項の別の実施形態は、対象において癌を処置する方法であって、治療有効量の第３３〜３７項の何れか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、実施形態である。
第３９項は、第３３項〜３７項の何れか１項に記載の医薬組成物または第３８項に記載の方法であって、癌が、非癌性細胞と比較した場合に、高レベルでＦＬＴ３を発現する１つ以上の細胞を含む、さらなる実施形態である。
続くいくつかの実施例によって本発明の様々な態様をさらに説明し、例示するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
ＦＬＴ３抗原
Ｆｌｋ２（胎児肝臓キナーゼ２）、ＳＴＫ１（幹細胞チロシンキナーゼ１）およびＣＤ１３５としても知られる、ＦＬＴ３、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３受容体は、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の一員である。ヒトＦＬＴ３は、キナーゼ挿入ドメインによって連結される５個の免疫グロブリン様細胞外ドメインおよび２個の細胞内チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）を有する膜結合受容体を含む９９３アミノ酸長のＲＴＫをコードする（Ｓｔｉｒｅｗａｌｔ ＤＬら；Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ；６５０−６６５（２００３）。ヒトＦＬＴ３遺伝子（遺伝子番号２３２２（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））は染色体１３ｑ１２上に位置し、マウスＦＬＴ３と８５％のアミノ酸配列相同性を共有する（Ｒｏｓｎｅｔ Ｏら；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１７３−１７９ （１９９３）。ＦＬＴ３は正常骨髄およびリンパ球前駆細胞において、およびＡＭＬ患者の７０〜９０％の白血病細胞によって（Ｃａｒｏｗ，Ｃ．Ｅら、ＢＬｏｏｄ ８７：１０８９−１０９６（１９９６）；Ｒｏｓｎｅｔ Ｏら；Ｌｅｕｋｅｍｉａ １０：２３８−２４８（１９９６）およびＡＬＬにおいても発現される。ＦＬＴ３は、造血細胞の増殖、分化およびアポトーシスに関与することが知られている。多くの造血細胞は、受容体二量体化および活性化を促進するＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を産生し、したがってＰＩ３キナーゼおよびＭＡＰＫ経路を介してシグナル伝達カスケードを誘導する（Ｓｔｉｒｅｗａｌｔ Ｄ Ｌら；Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ；６５０−６６５（２００３）。ＡＭＬ患者のおよそ３０％が、受容体および下流シグナル伝達カスケードの構成的活性化を作動させるＦＬＴ３内部縦列重複（ＩＴＤ）突然変異を有するが、これは疾患の転帰が不良であることに関連する（Ｇｕｎａｗａｒｄａｎｅ Ｒ Ｎら；Ｍｏｍ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １２：４３８−４４７（２０１３）。ＦＬＴ３抗原の例示的な実施形態については、図１を参照のこと。
実施例２
ＦＬＴ３モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の作製
一実施形態において、ＦＬＴ３に対する治療用モノクローナル抗体（「ＭＡｂ」）は、細胞上で発現されるＦＬＴ３に結合するＦＬＴ３に特異的なエピトープと反応するものを含む。このようなＭＡｂの作製のための免疫原としては、細胞外ドメインまたはＦＬＴ３タンパク質配列全体、機能的モチーフを含有すると予測される領域およびアミノ酸配列のコンピュータ分析によって抗原性であると予測されるＦＬＴ３の領域をコードするかまたは含有するように設計されるものが挙げられる。免疫原としては、ペプチド、組み換えタンパク質および（内因的にＦＬＴ３を発現するか、またはＦＬＴ３を発現するように改変されている）細胞が挙げられる。
遺伝子操作されたマウスが完全ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する抗体を作製する、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）技術（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）を用いてＦＬＴ３に対するＭＡｂを作製した。ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）マウスに対して組み換えヒトＦＬＴ３タンパク質で免疫付与した後、（ＡＧＳ６２．２１としても知られている）ｖ６２−１ｂ２１と呼ばれるＭＡｂを作製した。ＦＬＴ３ ＭＡｂ、ｖ６２−１ｂ２１は、ＦＬＴ３タンパク質およびＦＬＴ３発現細胞（組み換えおよび内因性）に特異的に結合する。
選択後、Ａｍｂｒｘ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によって開発されたＲｅＣＯＤＥ技術に従い（実施例４−組み換えＤＮＡ法を用いたヒトＣＨｖ６２．２１ｐＡＦの発現を参照）、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）抗体由来のヒト可変配列（実施例３−組み換えＤＮＡ法を用いたＣＨｖ６２．２１の発現を参照）を、重鎖上の位置１２４に非天然アミノ酸を組み込むヒト定常領域と組み合わせることにより、ｖ６２−１ｂ２１（ハイブリドーマ細胞株により天然に産生）をＣＨＯ発現完全ヒトネイティブ抗体に変換した。
ｖ６２−１ｂ２１産生ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを単離した後、ｖ６２−１ｂ２１に対するＤＮＡコード配列を決定した。以下のプロトコールを使用して、抗Ｆｌｔ３、ｖ６２−１ｂ２１重鎖および軽鎖可変核酸配列をハイブリドーマ細胞から得た。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いてｖ６２−１ｂ２１分泌ハイブリドーマ細胞を溶解させた。全ＲＮＡを精製し、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステムを用いてオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライミングで全ＲＮＡから第１鎖ｃＤＮＡを生成させた。次いで、ヒト免疫グロブリン可変重鎖プライマーおよびヒト免疫グロブリン可変軽鎖プライマーを使用して、第１鎖ｃＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ産物の配列決定を行い、可変重鎖および軽鎖領域を決定した。
可変重鎖および軽鎖領域の核酸およびアミノ酸配列は、図２Ａおよび／または図２Ｂおよび図３Ａおよび／または図３Ｂに列挙される。ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂのヒトＩｇ生殖系列へのアラインメントを図４Ａ〜４Ｂで示す。
実施例３
組み換えＤＮＡ法を用いたＣＨｖ６２．２１の発現
遺伝子移入された細胞中でＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂを組み換えにより発現させるために、Ｖ６２．２１ハイブリドーマＭＡｂ可変重鎖および軽鎖配列をそれぞれヒト重鎖ＩｇＧ１およびヒト軽鎖Ｉｇκ定常領域の上流にクローニングした。完全なＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂヒト重鎖および軽鎖カセットを、クローニングベクター中のＣＭＶプロモーター／エンハンサーの下流にクローニングした。Ｌｏｎｚａ ＧＳシステム（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）での安定発現のために、組み換えＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂ発現コンストラクトをＣＨＯ細胞に遺伝子移入した。組み換えＣＨＯ細胞から分泌されたＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂを精製し、フローサイトメトリーにより細胞表面ＦＬＴ３への結合について評価した。結果から、ＣＨＯ細胞で発現される組み換えＣＨｖ６２．２１抗体が細胞表面上のＦＬＴ３に結合することが示される。
結果からさらに、ＣＨＯ細胞で発現される組み換え発現ＣＨｖ６２．２１がハイブリドーマから精製されたｖ６２．２１と同様にＦＬＴ３に結合することが示される。組み換え細胞から分泌されるＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂも、ＦＬＴ３組み換えタンパク質への結合についてＥＬＩＳＡにより評価する。ＦＬＴ３タンパク質へのＣＨｖ６２．２１の結合は、ＣＨＯ由来のＭＡｂ物質とハイブリドーマ細胞由来のＭＡｂ物質との間で同一である。
ＣＨｖ６２．２１と呼ばれる抗体を産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓを介して）２０１４年１２月９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８に送付され、受託番号ＰＴＡ−１２１８３１を割り当てられた。
可変重鎖および軽鎖領域の核酸およびアミノ酸配列は、図２Ａおよび／または図２Ｂおよび図３Ａおよび／または図３Ｂに列挙される。
実験的分析の結果として、当技術分野で公知の方法（例えば、プロテアーゼ消化、ＬＣＭＳ分析など）を使用して、ＣＨＯ細胞由来のＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂのアミノ酸修飾から、精製ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂの殆どにおいて重鎖のＣ末端のリジンの欠失が起こり、精製ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂの一部で重鎖のＮ末端のピログルタミル化および重鎖のＣ末端のリジンの欠失が起こることが示された。
実施例４
組み換えＤＮＡ法を用いたヒトＣＨｖ６２．２１ｐＡＦの発現
遺伝子移入された細胞中でＣＨｖ６２．２１ｐＡＦを組み換えにより発現させるために、ｖ６２−１ｂ２１ハイブリドーマＭＡｂ可変重鎖および軽鎖配列をそれぞれヒト重鎖ＩｇＧ１およびヒト軽鎖Ｉｇκ定常領域の上流にクローニングした。完全なＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂヒト重鎖および軽鎖カセットを、クローニングベクター中のＣＭＶプロモーター／エンハンサーの下流にクローニングした。次いで、安定クローンの生成のために、アンバーサプレッサーｔＲＮＡおよびｐＡＦ特異的アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを安定に発現するＣＨＯ ｐＡＦｓｕｐ１−４Ｅ２細胞（Ａｍｂｒｘ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に組み換えＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂ発現コンストラクトを遺伝子移入した。安定クローンは、ｐＡＦをＭＡｂに組み込むことによりＣＨｖ６２．２１ｐＡＦを産生する。安定クローンを遺伝子増幅に供し、続いてサブクローニングした。安定サブクローンから分泌されたＣＨｖ６２．２１ｐＡＦを精製し、フローサイトメトリーにより細胞表面ＦＬＴ３への結合について評価した。結果から、ＣＨＯ細胞から発現される組み換えＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ抗体が細胞表面上のＦＬＴ３に結合することが示される。
ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦと呼ばれる抗体を産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓを介して）２０１４年１２月９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８に送付され、受託番号ＰＴＡ−１２１８３６を割り当てられた。
可変重鎖および軽鎖領域の核酸およびアミノ酸配列は、図２Ｃおよび／または図２Ｂおよび図３Ｃおよび／または図３Ｂに列挙される。
実験分析の結果として、当技術分野で公知の方法（例えば、プロテアーゼ消化、ＬＣＭＳ分析など）を使用して、ＣＨＯ細胞由来のＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂのアミノ酸修飾から、精製ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂの殆どにおいて重鎖のＣ末端のリジンの欠失が起こり、精製ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂの一部で重鎖のＮ末端のピログルタミル化および重鎖のＣ末端のリジンの欠失が起こることが示された。
実施例５
リンカー単位ＡＧＬの作製
好ましい実施形態において、ＡＧＬと表示される本発明のリンカー単位は、本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂ、好ましくはＣＨｖ６２．２１ｐＡＦを本発明の薬物単位と連結するために使用され、好ましくはＡＧＤ−０１８２は２−（アミノオキシ）酢酸（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）として一般に知られる。
さらなる実施形態において、本発明のＡＧＬリンカー単位は以下の式を有する：
実施例６
ＡＧＤ−０１８２薬物単位の生成および合成
式（ＩＩ）で記載される薬物単位は、以下の工程を用いて作製した。最初に、ＣＨ２Ｃｌ２（２０．０ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｄａｐ−ＯＨジシクロヘキシルアミン（１０．０ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）およびＨ−Ｐｈｅ−ＮＨ２ＨＣｌ塩（６.４２ｇ、３２．０ｍｍｏｌ）の２３℃の撹拌懸濁液に、ＤＩＥＡ（１１．０ｇ、１４．９ｍＬ、８５．３ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＥＰＣ（５．１９ｇ、４．８０ｍＬ、０．０３２ｍｏｌ）を添加した。１０時間後、ＬＣＭＳによる分析から、反応が完了したことが示された。粗製反応物をＨ２Ｏ（２５ｍＬ×２）、続いて塩水（２５ｍＬ×２）で洗浄した。有機分画を硫酸マグネシウムのパッド上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。溶出液としてＣＨ２Ｃｌ２中２％〜１０％メタノールを使用するフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル４０μｍ、６０Å、サイズ）によって、粗製橙色油状物質を精製した。合計７．２５ｇのＢｏｃ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（１６．７ｍｍｏｌ、７８％）を黄色油状物質として得た。ＬＣＭＳ ＲＴ＝１．２８分（方法Ｂ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ４３４．１９［Ｍ＋Ｈ］＋。
第２に、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（７．２５ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）の２３℃撹拌懸濁液にＴＦＡ（１０ｍＬ）を添加した。５時間後、ＬＣＭＳによる分析から、反応が完了したことが示された。揮発性有機物を真空中で蒸発させて粗製生成物を得て、さらに精製することなくこれを使用した。全部で６．００ｇのＨ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２が橙色固形物として得られた（１３．４ｍｍｏｌ、８０％）。ＬＣＭＳ ＲＴ＝０．６９１分（方法Ｂ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ３３４．１７［Ｍ＋Ｈ］＋。
次いでＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＭｅＶａｌ−Ａｂｕ（３−Ｎ３）−Ｄｉｌ−ＯＨ ＴＦＡ塩（４５６ｍｇ、０．５８６ｍｍｏｌ）およびＨ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２ ＴＦＡ塩（４５７ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）の２３℃撹拌懸濁液に、ＤＩＥＡ（０．３５０ｇ、０．５００ｍＬ、２．７４ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＨＡＴＵ（０．５２０ｇ、１．３７ｍｍｏｌ）を添加した。１０時間後、ＬＣＭＳによる分析から、反応が完了したことが示された。溶出液として０．１％ギ酸水中の１０％〜９０％ＭｅＣＮを使用するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ−Ｃ１８ １０μ １１０Åカラム（１５０×３０ｍｍ）での分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって、粗製反応物を精製した。ギ酸塩として合計５２６ｍｇのＦｍｏｃ−ＭｅＶａｌ−Ａｂｕ（３−Ｎ３）−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２が得られた（０．５１３ｍｍｏｌ、７５％）。ＬＣＭＳ ＲＴ＝１．８１分（方法Ｂ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ９８０．３９［Ｍ＋Ｈ］＋。
最後に、アセトニトリル（１０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＭｅＶａｌ−Ａｂｕ（３−Ｎ３）−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（５２５ｍｇ、０．５１３ｍｍｏｌ）の２３℃撹拌溶液にピペリジン（５ｍＬ）を添加した。２時間後、ＬＣＭＳによる分析から、反応が完了したことが示された。粗製反応溶液にヘキサン（１５ｍＬ×３）を添加した。アセトニトリル層を真空濃縮した。溶出液として０．１％ＴＦＡ水中の５％〜９５％ＭｅＣＮを使用するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ−Ｃ１８ １０μ １１０Åカラム（１５０×３０ｍｍ）での分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって、粗製油状物質を精製した。合計３５４ｍｇの表題化合物がＴＦＡ塩として得られた（０．４０６ｍｍｏｌ、７９％）。ＬＣＭＳ ＲＴ＝１．１５分（方法Ｂ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ７５８．２４［Ｍ＋Ｈ］＋；ＨＲＭＳ ｍ／ｚ ７５８．４９１５［Ｃ３８Ｈ６３Ｎ９Ｏ７＋Ｈ］＋。
前述の合成によって、式（ＩＩ）で示される、（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−アミノ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−３−アジド−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミドで示される次の薬物単位を生成させた。
実施例７
薬物リンカーＡＧＬおよびＡＧＤ−０１８２薬物単位の合成
ＡＧＬリンカー単位およびＡＧＤ−０１８２薬物単位の合成は次のように完了した。
次の手順およびプロトコールを用いて方法Ａを記載する：
０〜０．５０分：均一溶媒８０水／１０アセトニトリル／１０水中１％ギ酸；０．５０〜３．５０分：直線勾配８０水／１０アセトニトリル／１０水中１％ギ酸〜０水／９０アセトニトリル／１０水中１％ギ酸；３．５０〜３．９９分：均一溶媒０水／９０アセトニトリル／１０水中１％ギ酸；３．９９〜４．００分 直線勾配０水／９０アセトニトリル／１０水中の１％ギ酸〜８０水／１０アセトニトリル／１０水中１％ギ酸。
次の手順およびプロトコールを用いて方法Ｂを記載する：
０〜０．５０分：均一溶媒８５水／５アセトニトリル／１０水中１％ギ酸；０．５０〜１．６０分：直線勾配８５水／５アセトニトリル／１０水中１％ギ酸〜０水／９８アセトニトリル／２水中１％ギ酸；１．６０〜１．８０分 均一溶媒０水／９８アセトニトリル／２水中１％ギ酸；１．８０〜１．９０分 直線勾配０水／９８アセトニトリル／２水中１％ギ酸〜８５水／５アセトニトリル／１０水中１％ギ酸；１．９０〜２．００分 均一溶媒８５水／５アセトニトリル／１０ 水中１％ギ酸。
上記の方法を用いて、合成は次のとおりである：
ＣＨ２Ｃｌ２（２０．０ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｄａｐ−ＯＨジシクロヘキシルアミン（１０．０ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）およびＨ−Ｐｈｅ−ＮＨ２ＨＣｌ塩（６．４２ｇ、３２．０ｍｍｏｌ）の２３℃撹拌懸濁液に、ＤＩＥＡ（１１．０ｇ、１４．９ｍＬ、８５．３ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＥＰＣ（５．１９ｇ、４．８０ｍＬ、０．０３２ｍｏｌ）を添加した。１０時間後、ＬＣＭＳによる分析から、反応が完了したことが示された。粗製反応物をＨ２Ｏ（２５ｍＬ×２）、続いて塩水（２５ｍＬ×２）で洗浄した。有機分画を硫酸マグネシウムのパッド上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。溶出液としてＣＨ２Ｃｌ２中２％〜１０％メタノールを使用するフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル４０μｍ、６０Å、サイズ）によって、粗製橙色油状物質を精製した。合計７．２５ｇのＢｏｃ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（１６．７ｍｍｏｌ、７８％）を黄色油状物質として得た。ＬＣＭＳ ＲＴ＝１．２８分（方法Ｂ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ４３４．１９［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（７．２５ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）の２３℃撹拌懸濁液にＴＦＡ（１０ｍＬ）を添加した。５時間後、ＬＣＭＳによる分析から、反応が完了したことが示された。揮発性有機物を真空中で蒸発させて粗製生成物を得て、さらに精製することなくこれを使用した。全部で６．００ｇのＨ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２が橙色固形物として得られた（１３．４ｍｍｏｌ、８０％）。ＬＣＭＳ ＲＴ＝０．６９１分（方法Ｂ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ３３４．１７［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＭｅＶａｌ−Ａｂｕ（３−Ｎ３）−Ｄｉｌ−ＯＨ ＴＦＡ塩（４５６ｍｇ、０．５８６ｍｍｏｌ）およびＨ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２ ＴＦＡ塩（４５７ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）の２３℃撹拌懸濁液に、ＤＩＥＡ（０．３５０ｇ、０．５００ｍＬ、２．７４ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＨＡＴＵ（０．５２０ｇ、１．３７ｍｍｏｌ）を添加した。１０時間後、ＬＣＭＳによる分析から、反応が完了したことが示された。溶出液として０．１％ギ酸水中の１０％〜９０％ＭｅＣＮを使用するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ−Ｃ１８ １０μ １１０Åカラム（１５０×３０ｍｍ）での分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって、粗製反応物を精製した。ギ酸塩として合計５２６ｍｇのＦｍｏｃ−ＭｅＶａｌ−Ａｂｕ（３−Ｎ３）−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２が得られた（０．５１３ｍｍｏｌ、７５％）。ＬＣＭＳ ＲＴ＝１．８１分（方法Ｂ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ９８０．３９［Ｍ＋Ｈ］＋。
アセトニトリル（１０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ＭｅＶａｌ−Ａｂｕ（３−Ｎ３）−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（５２５ｍｇ、０．５１３ｍｍｏｌ）の２３℃撹拌溶液にピペリジン（５ｍＬ）を添加した。２時間後、ＬＣＭＳによる分析から、反応が完了したことが示された。粗製反応溶液にヘキサン（１５ｍＬ×３）を添加した。アセトニトリル層を真空濃縮した。溶出液として０．１％ＴＦＡ水中の５％〜９５％ＭｅＣＮを使用するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ−Ｃ１８ １０μ １１０Åカラム（１５０×３０ｍｍ）での分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって、粗製油状物質を精製した。ＴＦＡ塩として合計３５４ｍｇの結果として生じる化合物（ＭｅＶａｌ−Ａｂｕ（３−Ｎ３）−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２）が得られた（０．４０６ｍｍｏｌ、７９％）。ＬＣＭＳ ＲＴ＝１．１５分（方法Ｂ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ７５８．２４［Ｍ＋Ｈ］＋；ＨＲＭＳ ｍ／ｚ ７５８．４９１５［Ｃ３８Ｈ６３Ｎ９Ｏ７＋Ｈ］＋。
ＤＭＦ（７．０ｍＬ）およびＤＣＭ（１５．０ｍＬ）中のＭｅＶａｌ−Ａｂｕ（３−Ｎ３）−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（２．０ｇ、２．６４ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ−Ａｏａ（０．５３ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）の２３℃撹拌溶液に、ＨＡＴＵ（１．０５ｇ、２．７７ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＰＥＡ（０．５１ｍＬ、２．９２ｍｍｏｌ）を添加した。１時間後、反応混合物を真空濃縮して、粗製ＤＭＦ溶液を得て、これを１５０ｍＬのＥｔＯＡＣでさらに希釈した。粗製反応混合物を１００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、続いて１００ｍＬの塩水で洗浄した。有機分画を硫酸マグネシウムのパッド上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。溶出液としてＣＨ２Ｃｌ２中０％〜５％メタノールを使用するフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル４０μｍ、６０Å、サイズ）によって、粗製Ｂｏｃ−Ａｏａ−ＭｅＶａｌ−Ａｂｕ（３−Ｎ３）−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２を精製した。ベージュ色の固形物として、合計２．１３ｇのＢｏｃ−Ａｏａ−ＭｅＶａｌ−Ａｂｕ（３−Ｎ３）−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（２．２９ｍｍｏｌ、８７％）が得られた。ＬＣＭＳ ＲＴ＝１．４６分（方法Ａ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ９３１．４６［Ｍ＋Ｈ］＋。
ジオキサン（１５．０ｍＬ）中のＢｏｃ−Ａｏａ−ＭｅＶａｌ−Ａｂｕ（３−Ｎ３）−Ｄｉｌ−Ｄａｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（２．１ｇ、２．２６ｍｍｏｌ）の２３℃撹拌溶液に、ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌ（１０．０ｍＬ、４０．０ｍｍｏｌ）を添加した。０．５時間後、反応混合物を真空濃縮して粗製淡黄色油状物質を得た。生じた粗製淡黄色油状物質を６ｍＬのメタノール中で溶解させ、激しく撹拌されている１５０ｍＬのＥｔＯＡＣ溶液にゆっくりと（滴下して）添加した。この溶液から白色の沈殿物が得られた。生じた白色沈殿物を濾過によって回収し、上清を濃縮して固形物とした。溶出液として０．００１Ｍ塩酸中５％〜９５％ＭｅＣＮを用いたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ １０μ、Ｃ１８ １１０Åカラム（１５０×３０ｍｍ）での分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより、白色沈殿物および濃縮上清の両方を数回に分けて精製した。
得られた生成物分画を合わせ、濃縮し、１８時間真空乾燥して、白色固形物を得た。全部で１．３１ｇのＡＧＬ−０１８２−３０・ＨＣｌ（１．５１ｍｍｏｌ、６７％）を得た。ＬＣＭＳ ＲＴ＝１．１６分（方法Ａ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ８３１．２７ ［Ｍ＋Ｈ］＋。（全般的に表ＩＶを参照）。
好ましい実施形態において、ＡＧＬ−０１８２−３０は以下の式を有する：
実施例８
ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂの抗体薬物複合化
次のプロトコールを使用して、本明細書中に記載のアルコキシアミンリンカーを用いて、ＡＧＬ−０１８２−３０と呼ばれるペプチドを含有するドライソルイン（ｄｏｌａｉｓｏｌｕｉｎｅ）−ドラプロインにＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂを複合化し、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０と呼ばれる本発明の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製した。
ＡＧＬ−０１８２−３０薬物リンカーの合成は、「薬物リンカーＡＧＬおよびＡＧＤ−０１８２薬物単位の合成」の題名の実施例７に記載の方法を使用して遂行した。
次に、以下のプロトコールを用いて、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０と呼ばれる本発明の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製した。
簡潔に述べると、最終ｐＨ４．０の５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する９．７ｍＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液、９．１ｍＬの１．３５Ｍ酢酸ヒドラジド（水中で溶解）、７．２６ｍＬのＤＭＳＯおよび５．０８ｍＬのＡＧＬ−０１８２−３０（ＤＭＳＯ中で溶解）の５０ｍＭ溶液に、最終ｐＨ４．０の、５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭクエン酸塩緩衝液中で処方した１７．１７ｍｇ／ｍＬの濃度のＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂ ２１５．５ｍＬを添加する。２８℃で１６〜２４時間、複合化を進行させる。１２ダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）の、５％トレハロースを含有する２０ｍＭヒスチジンｐＨ６．０での限外濾過／ダイアフィルトレーションによって、過剰なＡＧＬ−０１８２−３０および他の小分子反応成分を除去する。
得られた抗体薬物複合体（ＡＤＣ）をＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０と命名し、これは以下の式を有する。
ここで、ＭａｂはＣＨｖ６２．２１ｐＡＦであり、ｐは１．８〜２．０である。この実施例で記載される抗体薬物複合体の平均ｐ値は質量スペクトル分析によりおよそ１．９であった。本発明の一実施形態において、ｐ値は１．５〜２．５である。
得られた本発明のＡＤＣはｎｎＡＡをＡＤＣの抗体成分に組み込み、それにより薬物リンカーがオキシム結合を介して複合化され、表Ｉで示される癌の治療的処置に使用される。
実施例９
ＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂの特徴評価
ＦＬＴ３に結合するＭＡｂは、「ＦＬＴ３モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の作製」の題名の実施例に記載された手順を用いて作製し、当技術分野で公知のアッセイの組み合わせを用いてスクリーニング、同定および特徴評価した。
Ａ．ＦＡＣＳ結合
インビトロで増殖させたＡＭＬおよびＢ−ＡＬＬ細胞株への結合についてＣＨｖ６２．２１を試験した。（表ＶＩＩ参照）。簡潔に述べると、ＮＨＳ ＬＣビオチンを用いて、ＣＨｖ６２．２１およびアイソタイプ適合対照抗体をビオチン化した。インビトロで、指数関数増殖癌細胞株を全ての実験に使用した。遠心分離により細胞を回収し、洗浄した。細胞に対してＦｃブロッキングを行い、非特異的結合を減少させた。抗体を１０μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、細胞とともに４℃で１時間、同時温置した。温置終了時に、細胞を洗浄し、１：２００（２．５μｇ／ｍＬ）の最終希釈で、４℃で１時間、二次検出ストレプトアビジン−ＰＥ抗体とともに温置した。結合していない二次抗体を洗浄した後、細胞をＦＡＣＳにより分析し、幾何平均蛍光を測定し、報告した。蛍光比は以下のように計算した：幾何平均ＣＨｖ６２．２１／幾何平均アイソタイプ対照＝ＭＦＲ、アイソタイプ対照を上回る倍数表現の尺度。
幾何平均値および平均蛍光比（ＭＦＲ）値を得て（表ＶＩ）、ヒストグラムを示す（表ＶＩＩ）。結果から、ＣＨｖ６２．２１が、ＡＭＬおよびＢ−ＡＬＬを発現するいくつかのヒト癌細胞株に結合することが示される。
Ｂ．ＡＤＣＣ活性
ＣＨｖ６２．２１およびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦをインビトロでＡＤＣＣ活性について試験した。簡潔に述べると、ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ１７８０）を使用して、エフェクター細胞、正常ヒトＰＢＭＣの存在下で標的細胞株ＥＯＬ−１およびＳＥＭを用いて、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）に介在する能力について、ネイキッドおよびＡＤＣ抗ＦＬＴ３モノクローナル抗体、ＣＨｖ６２．２１およびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦを試験した。
アッセイを行う１日前に、３バイアルのエフェクター細胞、正常ヒトＰＢＭＣ（Ｈｅｍａｃａｒｅ、ドナーＩＤ：１８８８）を凍結融解し、洗浄し、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０中、Ｔ−１７５細胞培養フラスコに播種した。フラスコを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータ中で一晩保存した。翌日、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いてＰＢＭＣを培養フラスコから回収し、洗浄し、アッセイ緩衝液（ＰＲＭＩ１６４０＋０．１％ＦＢＳ）中細胞１．０ｅ６個／ウェルの濃度で播種した。陽性対照細胞株Ｒａｊｉと一緒に、標的細胞ＳＥＭおよびＥＯＬ−１を回収し、洗浄し、アッセイ緩衝液を用いて細胞２．０ｅ５個／ウェルの濃度で播種した。
試験試料をアッセイ緩衝液中で２．５μｇ／ｍＬの最終濃度にそれぞれ希釈した。等体積の標的細胞、試験試料およびエフェクター細胞を９６ウェル丸底プレートのウェルに３つ組で添加した。プレートを穏やかに遠心分離し、加湿した３７℃インキュベータ中で４時間温置した。４時間の温置後、アッセイプレートを遠心分離し、５０μＬの体積の上清を回収し、新しい９６ウェルプレートに移した。比色ＬＤＨ検出キット；ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、４９０ｎｍで吸光度を読み取ることによって、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼの活性を測定した。
最初に、実験、エフェクター自発的、標的自発的および標的最大ウェルの全ての吸光度値から培養培地バックグラウンドウェルの吸光度値の平均を差し引くことによって、データを分析した。次に、補正した吸光度読み取りの平均値を正規化し、以下の式を使用することによってＡＤＣＣ活性を計算した：
ＡＤＣＣ（％）＝｛（実験−エフェクター自発的−標的自発的）／（標的最大−標的自発的）｝×１００
図７の結果は、ＣＨｖ６２．２１およびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂがＡＤＣＣ活性を示さないことを示す。しかし、陽性対照であるリツキシマブは、Ｒａｊｉ細胞株においてＡＤＣＣ活性を確認する。
実施例１０
ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０は、インビボで腫瘍の増殖を阻害する。
正常細胞におけるＦＬＴ３の限定的発現とともに、腫瘍細胞におけるＦＬＴ３の顕著な発現により、ＦＬＴ３は抗体療法および同様にＡＤＣを介する治療のための良好な標的となる。したがって、ヒトＡＬＬ、ＡＭＬおよびＢ−ＬＬ癌異種移植マウスモデルにおけるＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０の治療効果を評価する。
マウス癌異種移植モデル（例えば、皮下および同所性）において、腫瘍増殖および転移形成に対する抗体薬物複合体の有効性を研究する。
雄ＳＣＩＤマウスの右側腹部にマトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と１：１希釈で混合した５×１０４〜１０６個の癌細胞を注射することにより、皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍を生成させる。腫瘍形成に対するＡＤＣ効力を試験するために、すなわち、腫瘍細胞注射と同じ日にＡＤＣ注射を開始する。対照として、マウスに精製ヒトＩｇＧまたはＰＢＳの何れか；またはヒト細胞で発現しない無関係の抗原を認識する精製ＭＡｂを注射する。予備実験において、腫瘍増殖に対して対照ＩｇＧまたはＰＢＳとの間で差は見られない。腫瘍サイズは、ノギス測定によって決定し、腫瘍体積は、幅２ｘ長さ／２として計算し、ここで、幅は最小寸法であり、長さは最大寸法である。直径１．５ｃｍを超える皮下腫瘍を有するマウスを屠殺する。
異種移植片癌モデルの長所は、血管新生および血管形成の研究が可能であることである。腫瘍の成長は、新しい血管の発生に部分的に依存する。毛細血管系および発生中の血液ネットワークは宿主起源であるものの、血管新生の開始および構造は異種移植腫瘍によって制御される（Ｄａｖｉｄｏｆｆら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１）７：２８７０；Ｓｏｌｅｓｖｉｋら、Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．（１９８４）２０：１２９５）。血管新生に対する抗体および小分子の効果は、腫瘍組織およびその周囲の微小環境のＩＨＣ分析によるなど、当技術分野で公知の手順に従い、研究される。
ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０ ＡＤＣは、ＭＶ４−１１皮下確立癌異種移植片で示される癌細胞株において形成を阻害する。これらの結果から、局所および進行期の癌および好ましくは表Ｉで示される癌の処置におけるＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０の有用性が示される。
ＦＬＴ３ ＡＤＣ：
モノクローナル抗体は、「ＦＬＴ３モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の作製」の題名の実施例に記載のように、ＦＬＴ３に対して作製された。さらに、ＭＡｂは、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０を形成するために、「ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂの抗体薬物複合化」の題名の実施例に記載のように、毒素に複合化される。ＦＡＣＳおよびＦＬＴ３への結合能を決定するための当技術分野で公知の他の方法によって、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦおよびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０の特徴評価を行う。
細胞株および異種移植片：
当技術分野で公知のように、Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で細胞を維持する。ＭＶ４−１１異種移植片は、ＳＣＩＤマウスにおける連続的な増殖によって維持される。
ＣＢ１７／ＳＣＩＤマウスに移植されたヒトＢ骨髄単球性白血病細胞株ＭＶ４−１１の皮下確立異種移植モデルにおけるＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０の有効性および用量滴定。
この実験において、ヒトＢ骨髄単球性白血病ＭＶ４−１１細胞（マウス１匹あたり細胞３．０×１０６個）を個々のＳＣＩＤマウスの側腹部に注射し、腫瘍を成長させた。平均腫瘍体積が所定のサイズ（２００ｍｍ３）に到達したとき、動物を腫瘍サイズで対応させ、Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ．２．１；Ｓｔｕｄｙｌｏｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いて、各群で平均腫瘍サイズおよび変動が同様となる処置群および対照群にランダム化した。薬物投与の前日の午後に、腹腔内注射により２０ｍｇ／ｋｇのＦｃ遮断薬（ｍＬＹＳ−１Ｃ３．１−ｈＩｇＧ１）を全ての試験マウスに予め負荷した。
ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０を静脈内注射によって単回ボーラスとして３つの異なる投与レベル（０．５、１．０および２．０ｍｇ／ｋｇ）で投与した。２０ｍＭヒスチジン／５％トレハロース、ｐＨ６．０および９１．１−ＡＧＬ−０１８２−３０をビヒクルおよびＡＤＣ対照としてそれぞれ使用した。各投与の直前に得られた各動物の個々の体重に基づいて、全ての薬剤を投与した。試験終了時まで、ノギス測定を用いて、各群の腫瘍成長を週２回監視した。クルスカル・ワリス検定を用いて、動物屠殺前の最終日に対する腫瘍体積データの統計学的解析を行った。実験あたりの過誤率を保護するために、テューキー検定の手順（両側）を用いてペアワイズ比較を行った。
この研究は、ＣＢ１７／ＳＣＩＤマウスで皮下に確立されたＭＶ４−１１ヒトＢ骨髄単球性白血病異種移植モデルにおいて、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０の有効性を評価し、そのＡＤＣ対照（９１．１−ＡＧＬ−０１８２−３０）と比較した。静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射によって単回投与として３つの異なる投与レベル（０．５、１．０および２．０ｍｇ／ｋｇ）でＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０を投与した。ＡＤＣ対照として、９１．１−ＡＧＬ−０１８２−３０をｉ．ｖ．により２ｍｇ／ｋｇで投与した。ビヒクル対照として、２０ｍＭヒスチジン／５％トレハロース、ｐＨ６．０を使用した。
結果から、ビヒクル処置とＡＣＤ対照との間に統計学的な差がないことが示された（ｐ＞０．９９９９）。２．０ｍｇ／ｋｇのＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０は、投与開始時の開始腫瘍サイズと比較した場合、腫瘍を１００％、統計学的に有意に退縮させた（ｐ＜０．０００１）。ビヒクル対照と比較して、１．０ｍｇ／ｋｇのＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０は、腫瘍成長を７８．１％、統計学的に有意に阻害した（ｐ＜０．０００１）。ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０は０．５ｍｇ／ｋｇの用量でこのモデルにおいて何ら有効性を示さなかった（ｐ＝０．５３４４）。（図５）。
ＣＢ１７ＳＣＩＤマウスに移植されたヒトＢ骨髄単球性白血病細胞株ＭＶ４−１１の皮下確立異種移植モデルにおけるＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０（ＡＤＣ）およびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ（ネイキッド抗体）の有効性。
別の実験において、ヒトＢ骨髄単球性白血病ＭＶ４−１１細胞（マウス１匹あたり細胞３．０×１０６個）を個々のＳＣＩＤマウスの側腹部に注射し、腫瘍を成長させた。平均腫瘍体積が所定のサイズ（２００ｍｍ３）に到達したとき、動物を腫瘍サイズで対応させ、Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ．２．１；Ｓｔｕｄｙｌｏｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いて、各群で平均腫瘍サイズおよび変動が同様となる処置群および対照群にランダム化した。薬物投与の前日の午後に、腹腔内注射により２０ｍｇ／ｋｇのＦｃ遮断薬（ｍＬＹＳ−１Ｃ３．１−ｈＩｇＧ１）を全ての試験マウスに予め負荷した。ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０およびＡＤＣ対照（９１．１−ＡＧＬ−０１８２−３０）を静脈内注射により単回ボーラスとして１ｍｇ／ｋｇで投与した。ＡＧＳ６２Ｐ（ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦとしても知られる）およびネイキッド抗体対照（９１．１−ｐＡＦ）を静脈内注射により単回ボーラスとして２ｍｇ／ｋｇで投与した。各投与の直前に得られた各動物の個々の体重に基づいて、全ての薬剤を投与した。試験終了時まで、ノギス測定を用いて、各群の腫瘍成長を週２回監視した。クルスカル・ワリス検定を用いて、動物屠殺前の最終日に対する腫瘍体積データの統計学的解析を行った。実験あたりの過誤率を保護するために、テューキー検定の手順（両側）を用いてペアワイズ比較を行った。
この研究では、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０（ＡＤＣ）およびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ（ネイキッド抗体）の有効性を評価した。
結果から、ＡＤＣ対照（９１．１−ＡＧＬ−０１８２．３０）と比較して、静脈注射による単回用量としての１．０ｍｇ／ｋｇのＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０は、腫瘍成長を５１．４％、統計学的に有意に阻害した（ｐ＝０．００１０）ことが示される。ネイキッド抗体対照（９１．１−ｐＡＦ）と比較して、静脈内注射による単回投与としての２．０ｍｇ／ｋｇのＣＨｖ６２．２１ｐＡＦは、統計学的な差を示さなかった（ｐ＝０．６５７０）。さらに、結果から、１．０ｍｇ／ｋｇのＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０は、２．０ｍｇ／ｋｇのＣＨｖ６２．２１ｐＡＦと比較した場合、腫瘍増殖を５４．３％、統計学的に有意に阻害したことが示された（ｐ＝０．０１３４）。（図６）。
ＣＢ１７ＳＣＩＤマウスに移植されたヒトＢ骨髄単球性白血病細胞株ＭＶ４−１１の皮下確立異種移植モデルにおけるＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０（ＡＤＣ）およびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ（ネイキッド抗体）の有効性。
別の実験において、ヒトＢ骨髄単球性白血病ＭＶ４−１１細胞（マウス１匹あたり細胞３．０×１０６個）を個々のＳＣＩＤマウスの側腹部に注射し、腫瘍を成長させた。平均腫瘍体積が所定のサイズ（２００ｍｍ３）に到達したとき、動物を腫瘍サイズで対応させ、Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ．２．１；Ｓｔｕｄｙｌｏｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いて、各群で平均腫瘍サイズおよび変動が同様となる処置群および対照群にランダム化した。薬物投与の前日の午後に、腹腔内注射により２０ｍｇ／ｋｇのＦｃ遮断薬（ｍＬＹＳ−１Ｃ３．１−ｈＩｇＧ１）を全ての試験マウスに予め負荷した。ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０およびＡＤＣ対照（９１．１−ＡＧＬ−０１８２−３０）を２ｍｇ／ｋｇ ＱＷで２週間にわたり、静脈内注射により投与した。ＡＧＳ６２Ｐ（ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦとしても知られる）およびネイキッド抗体対照（９１．１−ｐＡＦ）を静脈内注射により数週間にわたり２ｍｇ／ｋｇ ＱＷで投与した。各投与の直前に得られた各動物の個々の体重に基づいて、全ての薬剤を投与した。試験終了時まで、ノギス測定を用いて、各群の腫瘍成長を週２回監視した。クルスカル・ワリス検定を用いて、動物屠殺前の最終日に対する腫瘍体積データの統計学的解析を行った。実験あたりの過誤率を保護するために、テューキー検定の手順（両側）を用いてペアワイズ比較を行った。
この研究では、２週間の時間枠にわたる複数回投与計画を用いてＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０（ＡＤＣ）およびＣｈｖ６２．２１ｐＡＦ（ネイキッド抗体）の有効性を評価した。
結果から、ＡＤＣ対照（９１．１−ＡＧＬ−０１８２．３０）と比較して、静脈内注射による複数回用量としての２．０ｍｇ／ｋｇのＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０は、第１７日に１００％腫瘍退縮で、腫瘍成長を統計学的に有意に阻害した（ｐ＝０．０００１）ことが示される。ネイキッド抗体対照（９１．１−ｐＡＦ）と比較して、静脈内注射による複数回投与としての２．０ｍｇ／ｋｇのＣＨｖ６２．２１ｐＡＦは、統計学的な差を示さなかった。（図１３）。
ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウスにおける皮下確立ＳＥＭ−ｘｃｌ異種移植モデルにおけるＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０の有効性。
別の実験において、ヒト急性リンパ芽球性白血病ＳＥＭ−ｘｃｌ細胞（マウス１匹あたり細胞１．０×１０６個）を個々のＳＣＩＤマウスの側腹部に注射し、腫瘍を成長させた。平均腫瘍体積が所定のサイズ（２００ｍｍ３）に到達したとき、動物を腫瘍サイズで対応させ、Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ．２．１；Ｓｔｕｄｙｌｏｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いて、各群で平均腫瘍サイズおよび変動が同様となる処置群および対照群にランダム化した。
第０日に静脈内注射により、単回ボーラス投与として、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０を５．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇで投与した。同じ経路および投与スケジュールを用いて、対照ＡＤＣ、ＡＧＳ９１．１−ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０を５．０ｍｇ／ｋｇで投与した。ビヒクルとして２０ｍＭヒスチジン／５％トレハロース、ｐＨ５．２を使用した。各投与の直前に得られた各動物の個々の体重に基づいて、全ての薬剤を投与した。試験終了時まで、ノギス測定を用いて、各群の腫瘍成長を週２回監視した。クルスカル・ワリス検定を用いて、動物屠殺前の最終日に対する腫瘍体積データの統計学的解析を行った。実験あたりの過誤率を保護するために、テューキー検定の手順（両側）を用いてペアワイズ比較を行った。
結果から、対照ＡＤＣ、ＡＧＳ９１．１−ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０と、またはビヒクル対照と比較した場合、全３種類の投与量レベル（５．０、２．０および１．０ｍｇ／ｋｇ）のＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０が強力な抗腫瘍活性を示し（ｐ＜０．０００１）、その結果、概して腫瘍成長の阻害が７５％を超えたことが示される。さらに、５．０ｍｇ／ｋｇで投与した場合、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０は、最初の開始腫瘍体積と比較した場合、腫瘍を５７．３％、有意に退縮させた。５．０ｍｇ／ｋｇと２．０ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇとの間の統計学的に有意な効力の差が認められた。（図１４）。
結論
要約すると、図５、６、１３および１４からＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０と称されるＦＬＴ３ ＡＤＣは、ＦＬＴ３に結合する対照ＡＤＣおよびネイキッド抗体と比較した場合、ＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞の増殖を有意に阻害したことが示される。したがって、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０は、表Ｉで示される癌を処置および管理するための治療目的で使用され得る。
実施例１１
ＦＬＴ３ ＡＤＣの使用を通じたヒト癌腫の処置および診断のためのヒト臨床治験
ＦＬＴ３に特異的に結合するＦＬＴ３ ＡＤＣは、本発明に従って使用され、ある種の腫瘍、好ましくは表１に列挙されるものの処置において使用される。これらの適応症のそれぞれと関連して、２つの臨床アプローチが首尾よく進められる。
Ｉ．）補助的療法：補助的療法において、化学療法剤または抗新生物剤および／または放射線療法またはそれらの組み合わせと併用してＦＬＴ３ ＡＤＣで患者を処置する。標準的な第１および第２選択の治療にＦＬＴ３ ＡＤＣを追加することによって、標準的なプロトコール下で、表Ｉに列挙されるものなど、原発癌標的を処置する。プロトコール設計は、次の例、原発または転移病巣の腫瘍量の減少、無増悪生存期間の延長、全体的な生存率、患者の健康の改善、疾患の安定化ならびに、標準的な化学療法および他の生物剤の通常の用量を減少させることが可能であることを含むが限定されないもの、によって評価した場合の有効性に対処する。これらの投与量減少は、化学療法剤または生物剤の用量関連毒性を低減することによって、追加および／または長期治療を可能にする。ＦＬＴ３ ＡＤＣは、化学療法剤または抗新生物剤と組み合わせて、いくつかの補助的な臨床治験において利用される。
ＩＩ．）単独療法：腫瘍の単独療法におけるＦＬＴ３ ＡＤＣの使用に関連して、ＦＬＴ３ ＡＤＣを化学療法剤または抗新生物剤なしで患者に投与する。一実施形態において、広範な転移性疾患を有する末期癌患者において、単独療法が臨床的に行われる。プロトコール設計は、次の例、原発または転移病巣の腫瘍量の減少、無増悪生存期間の延長、全体的な生存率、患者の健康の改善、疾患の安定化ならびに、標準的な化学療法および他の生物剤の通常の用量を減少させることが可能であることを含むが限定されないもの、によって評価した場合の有効性に対処する。
投与量
投与計画は、最適な所望の反応を提供するように調節され得る。例えば、単回ボーラスを投与し得、数回の分割用量を経時的に投与し得るか、または治療状況の緊急事態によって示される場合、用量を比例的に増減させ得る。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で非経口組成物を処方することは、特に有利である。本明細書中で使用される場合、投薬単位形態とは、処置しようとする哺乳動物対象のための単位投与量として適している物理的に個別の単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体に関連して所望の治療効果を生じさせるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位形態に対する仕様は、（ａ）抗体および／またはＡＤＣの特有の特徴および達成しようとする特定の治療的または予防的効果および（ｂ）個体における感受性の処置のためにこのような活性化合物を配合する技術分野における固有の限界によって決定されるかまたはそれに直接依存する。
本発明に従って併用して投与されるＦＬＴ３ ＡＤＣの治療的有効量に対する代表的な非限定的範囲は、約０．５〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも３ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも４ｍｇ／ｋｇである。他の代表的な非限定的範囲は、例えば約０．５〜約５ｍｇ／ｋｇ、または例えば約０．８〜約５ｍｇ／ｋｇ、または例えば約１〜約７．５ｍｇ／ｋｇである。本発明の高用量の実施形態は、１０ｍｇ／ｋｇを超える投与量に関する。投与量値は、緩和しようとする状態のタイプおよび重症度によって変化し得、単回または複数回投与を含み得ることに留意されたい。何らかの特定の被験者にとって、個々のニーズおよび組成物の投与を管理または監督する者の専門的判断に従って、具体的な投与計画を経時的に調整すべきであり、本明細書中に記載の投与量範囲は単なる代表例であり、特許請求される組成物の範囲または実施を制限するものではないことをさらに理解されたい。
臨床開発計画（ＣＤＰ）
ＣＤＰは、補助的療法または単独療法に関連して、ＦＬＴ３ ＡＤＣの処置を監視し、発展させる。治験は、最初に安全性を実証し、その後、反復投与で有効性を確認する。治験は、標準的な化学療法を標準的な治療＋ＦＬＴ３ ＡＤＣと比較する非盲検試験である。認識されるように、患者の登録に関連して利用され得る１つの非限定的な基準は、生検によって決定されるような、それらの腫瘍におけるＦＬＴ３発現レベルである。
何らかのタンパク質または抗体注入に基づく治療剤と同様に、安全性の懸念は、主に、（ｉ）サイトカイン放出症候群、すなわち低血圧、発熱、震え、悪寒；（ｉｉ）物質に対する免疫原性反応の発現（すなわち、抗体治療に対する患者によるヒト抗体の発現、またはＨＡＭＡ反応）；および（ｉｉｉ）ＦＬＴ３を発現する正常細胞に対する毒性に関する。これらの安全上の懸念のそれぞれを監視するために、標準的な試験およびフォローアップが利用される。ＦＬＴ３ ＡＤＣは、ヒト投与時に安全であることが分かる。
実施例１２
正常および癌患者由来検体におけるＦＬＴ３タンパク質の検出
骨髄細胞集団における急性リンパ球性白血病（ＡＭＬ）患者の末梢血からのＰＢＭＣ試料において、抗ＦＬＴ３抗体を用いた癌におけるＦＬＴ３タンパク質の検出を評価した。
Ａ．ＦＡＣＳ結合物質および方法
この実験において、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ３８および抗Ｆｌｔ３−ビオチンまたはアイソタイプ−ビオチンｍＡｂの何れかのカクテルとともに試料を温置した。ビオチン化ｍＡｂに対する二次検出は、ストレプトアビジン−ＰＥであった。ストレプトアビジン−ＰＥ（ＳＡｖ−ＰＥ）検出試薬を用いて蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照カクテルを調製し、ゲーティング細胞集団に対して使用した。データ取得のために、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。
リンパ球は、ＣＤ３３＋／３−／２０−（髄芽球）、ＣＤ３３＋／３−／３４＋／３８−（幹細胞）、ＣＤ３３−／３＋（Ｔ細胞）およびＣＤ３３−／２０＋（Ｂ細胞）の４つの異なる集団が同定されたＣＤ４５＋集団においてゲーティングした。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアバージョン９．５．４（Ｔｒｉ−Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて分析を行った。蛍光値は、幾何平均（ＭＦＩ）として報告する。
Ｂ．結果
ＡＭＬ患者試料について表ＶＩＩＩに記載される結果から、抗ＦＬＴ３ ＭＡｂが、試験した全試料の骨髄細胞、幹細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞集団に結合することが示される。
さらに、表ＶＩＩＩで示されるように、試験した全試料のＭＦＩＲ分布プロットから、骨髄細胞、幹細胞およびＢ細胞集団において中程度の変動性が示され、一方でＴ細胞はＭＦＩＲの変動性が小さかった。骨髄芽球の平均ＭＦＩＲは約９６３．１であり、一方で幹細胞に対する平均ＭＦＩＲは３１８．２であり、Ｔ細胞に対する平均ＭＦＩＲは９．８４２であり、Ｂ細胞に対するＭＦＩＲはＡＭＬにおいて７２．６０であった。正常試料に対する平均ＭＦＩＲは、骨髄では６４２．４、幹細胞に対して６８．２９、Ｔ細胞に対して１１．６６、Ｂ細胞に対して１３．７３であった。
表ＶＩＩＩに記載される結果全体から、本発明のＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂおよびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂなどの抗ＦＬＴ３ ＭＡｂが、ＡＭＬで過剰発現されるＦＬＴ３タンパク質を検出し得ることが示される。
実施例１３
ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦおよびＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０が介在するインビトロ細胞傷害性
ＦＬＴ３を内因的に発現する、ヒト白血病ＭＶ−４−１１およびＭＯＬＭ−１３細胞株およびＦＬＴ３を発現しないヒト白血病細胞株、Ｋａｒｐａｓ２９９を使用して、ＦＬＴ３抗体（ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ）およびＦＬＴ３ ＡＤＣ（ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０）がＦＬＴ３依存性細胞傷害性に介在する能力を評価した。
簡潔に述べると、ＭＶ−４−１１、ＭＯＬＭ−１３およびＫａｒｐａｓ２９９細胞を、それぞれ細胞１５００個、２０００個および３０００個／ウェルの密度にて５０μＬの完全培地中で９６ウェルプレートに播種し、３７℃；５％ＣＯ２の組織培養インキュベータに入れた。翌日、非特異的結合を減少させるために細胞を２５μＬ／ウェルの体積でＦｃブロッキングし、ｃＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０、ＡＧＤ−０１８２に複合化されたアイソタイプ対照抗体（９１．１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０）、ｃＨｖ６２．２１ｐＡＦおよびアイソタイプ対照抗体（９１．１ｐＡＦ）の４倍保存溶液を完全培地中で調製し、２５μＬのＡＤＣおよび抗体の連続希釈物を適切なウェルに添加した。３７℃；５％ＣＯ２の組織培養インキュベータ中で５日間、ｃＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０、９１．１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０、ｃＨｖ６２．２１ｐＡＦおよび９１．１ｐＡＦで細胞を処理した。温置期間終了時に、２０μＬのＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅを各ウェルに添加し、２時間温置した。５４０励起および５９０発光波長を使用して、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ４プレートリーダーを用いて、プレートの読み取りを行った。
表ＩＸの結果から、抗ＦＬＴ３ ＡＤＣ（ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０）が、ＦＬＴ３を発現するＭＯＬＭ−１３およびＭＶ−４−１１細胞株の細胞傷害性を選択的に誘導し得、一方でＦＬＴ３非発現Ｋａｒｐａｓ２９９細胞株の細胞傷害性を誘導不可能であることが示される。抗ＦＬＴ３抗体（ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ）は、ＭＯＬＭ−１３およびＭＶ−４−１１細胞株において細胞傷害性を誘導しない。したがって、これらのデータから、ＦＬＴ３ ＭＡｂ ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ単独では細胞の細胞傷害性を誘導しないことが明らかとなる。むしろ、ＦＬＴ３ ＡＤＣ ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０のみが、ＦＬＴ３を発現するＭＯＬＭ−１３およびＭＶ−４−１１細胞を選択的に死滅させ得、一方で非ＦＬＴ３発現Ｋａｒｐａｓ２９９細胞には影響を及ぼさない。
実施例１４
先行技術のＦＬＴ３ ＭＡｂを上回るＣＨｖ６２．２１ｐＡＦの長所
本発明のＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ ＭＡｂは、ＦＬＴ３に結合する他のＭＡｂを上回るいくつかの長所を示す。特に、本発明のＡＤＣの治療的有用性を考慮して見た場合。例えば、先行技術は、ＡＭＬ患者を化学療法で処置した後、血漿ＦＬＴ３リガンド（「ＦＬ」）の発現が増加することを教示する。Ｔａｋａｓｈｉら、Ｂｌｏｏｄ ｖｏｌ．１１７（１２）（２０１１年３月）を参照。さらに、ＦＬ増加はＦＬＴ阻害剤の活性を顕著に低下させることが示されている。同上。モノメチルオーリスタチンＦ（ＥＢ１０−ＭＭＡＦ）と複合化されたＥＢ１０は、抗ヒトＦＬＴ３抗体を含むＡＤＣとして報告されている。（Ｐｒｏｃ Ａｍｅｒ Ａｓｓｏｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ４６，２００５を参照）。ＥＢ１０はＦＬを遮断することが示されている。米国特許第８，０７１，０９９号（Ｉｍｃｌｏｎｅ）を参照のこと。したがって、本発明の目的は、ＦＬＴ３抗原に結合するがＦＬに結合しないＭＡｂを操作することである。
ある実験において、本発明のＣＨｖ６２．２１ ＭＡｂはＦＬを遮断しないことが確認された。簡潔に述べると、組み換えヒトＦＬＴ３−ＦｃをＲ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。Ｌｕｍｉｎｅｘによって提供された手順に従って、標準的なスルホ−ＮＨＳ／ＥＤＣ化学を用いて、このタンパク質を活性化Ｌｕｍｉｎｅｘミクロスフェアの表面上に固定化した。いくつかの他のタンパク質とともに、このタンパク質のＨｉｓタグ付加型を、Ｌｕｍｉｎｅｘミクロスフェアに複合化し、この手順において対照とした。
さらに、ＦＬＴ３リガンドもＲ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。製造者の推奨に従い、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＥＺ−Ｌｉｎｋ スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈ Ｆｏｒｍｕｌａを使用して、このリガンドをビオチン化した。タンパク質をスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと２時間反応させた後、ＤＰＢＳに対する透析によって、取り込まれなかったビオチンを除去した。
緩やかに振盪しながらＲＴで１２０分間、ＰＢＳ、２％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％アジ化ナトリウムを含有する緩衝液中で調製した様々な濃度のビオチン化リガンドとミクロスフェアを反応させることにより、ミクロスフェアの表面上に固定化されたＦＬＴ３のビオチン化リガンドへの結合能を評価した。温置終了時に、ミクロスフェアを吸引し、洗浄した。ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン（Ｍｏｓｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、その固定化受容体に結合したビオチン化ＦＬＴ３リガンドを検出した。ミクロスフェアに付随する蛍光をＬｕｍｉｎｅｘ装置で測定した。この評価から、５ｎｇ／ｍＬのビオチン化ＦＬＴ３リガンドの濃度がロバストなシグナルを生じさせるのに十分であったが、ミクロスフェアと結合されるＦＬＴ３を飽和させなかったことが明らかになった。
最後に、ＦＬＴ３抗体が潜在的にリガンドを遮断する能力を評価するために、５ｎｇ／ｍＬのビオチン化ＦＬＴ３リガンド＋１０μｇ／ｍＬの試験中の様々な抗体を含有する混合物を調製した。これらの混合物をミクロスフェア上に固定したＦＬＴ３に適用し、６０分間温置した。温置終了時に、ミクロスフェアを吸引し、洗浄した。ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリスリン（Ｍｏｓｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、その固定化受容体に結合したビオチン化ＦＬＴ３リガンドを検出した。ミクロスフェアに付随する蛍光をＬｕｍｉｎｅｘ装置で測定した。リガンドをブロックする能力を有する抗体は、ＭＦＩ（中央蛍光強度）の低下によって観察された。
図８の結果から、ＦＬＴ３ ＭＡｂ ＣＨｖ６２．２１が非ＦＬ遮断薬であり、ｖ６２−１ｂ３７．１と表示される別のＦＬＴ３ Ｍａｂ（表Ｘ）が、ＥＢ１０と表示される先行技術のＦＬＴ３ ＭＡｂと同様のＦＬ遮断薬であることが確認される（米国特許第８，０７１，０９９号明細書を参照）。
ＦＬＴ３を内因的に発現するヒト白血病ＥＯＬ−１細胞株を用いて、ヒトＦＬＴ３リガンドの効果への、ＦＬＴ３抗体（ＣＨｖ６２．２１およびｖ６２−１ｂ３７．１）の介在能力を評価した。アイソタイプ対照抗体（ｍＬｙｓ−１Ｃ３．１）も使用した。ＥＯＬ−１細胞を細胞２０００個／ウェルの密度にて５０μＬの完全培地中で９６ウェルプレートに播種し、３７℃；５％ＣＯ２の組織培養インキュベータに入れた。翌日、５０、１０または５ｎｇ／ｍＬのヒトＦＬＴ３リガンド（２５μＬの完全培地中）および１０、１、０．１および０μｇ／ｍＬの試験抗体（２５μＬの完全培地中）で細胞を処理した。培地単独を未処理対照として使用した。細胞を３７℃；５％ＣＯ２の組織培養インキュベータ中で５日間処理した。温置期間終了時に、１００μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを各ウェルに添加し、室温で振盪しながら３０分間温置した。Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを用いるＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ４プレートリーダーを使用してプレートの読み取りを行い、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてグラフ化した。
図９の結果から、ｖ６２−１ｂ３７．１がＦＬＴ３リガンドの存在下で高濃度で増殖を阻害するが、ＣＨｖ６２．２１は増殖に何ら影響を及ぼさないことが示される。ヒトＦＬＴ３リガンド単独では、ＥＯＬ−１細胞株の増殖に影響がない。
癌処置のための化学療法後に血漿中のＦＬ濃度が増加したという教示に基づいて（Ｔａｋａｓｈｉら、前出を参照）、本発明のＦＬＴ３ ＭＡｂがＦＬを遮断しない場合に長所があることが示された。この点を確認するために、リガンド遮断ＭＡｂの細胞傷害活性がＦＬの存在下で低下する一方で、非リガンド遮断ＭＡｂの細胞傷害活性は、ＦＬの存在下で低下しないことが示された。
ＦＬＴ３を内因的に発現するヒト白血病ＲＳ−４−１１細胞株を用いて、ヒトＦＬＴ３リガンド（ｈＦＬ）の非存在下および存在下でのＦＬＴ３依存性細胞傷害性への、ＦＬＴ３ ＡＤＣ（ｃＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０およびｖ６２−１ｂ２１．１−ＡＧＬ−０１２９−０８）の介在能を評価した。
簡潔に述べると、ＲＳ−４−１１細胞を細胞３０００個／ウェルの密度にて５０μＬの完全培地中で９６ウェルプレートに播種し、３７℃；５％ＣＯ２の組織培養インキュベータに入れた。翌日、ＡＤＣを１０μｇ／ｍＬになるように完全培地中で調製し、１：５の連続希釈を行い、合計９点の濃度とした。２５μＬのＡＤＣの連続希釈物を、ヒトＦＬＴ３リガンド（１００ｎｇ／ｍＬを２５μＬ／ウェルに添加）ありおよびなしで、適切なウェルに添加した。３７℃；５％ＣＯ２の組織培養インキュベータ中で５日間、ヒトＦＬＴ３リガンドありおよびなしで、ｖ６２−１ｂ２１．１−ＡＧＬ−０１２９−０８（表ＸＩ、国際公開第２０１５／１８３９７８号パンフレット、Ａｇｅｎｓｙｓ，Ｉｎｃ．）およびｖ６２−１ｂ３７．１−ＡＧＬ−０１２９−０８を用いて細胞を処理した。温置期間終了時に、２０μＬのＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅを各ウェルに添加し、２時間温置した。５４０励起および５９０発光波長を用いるＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ４プレートリーダーを使用してプレートの読み取りを行い、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてグラフ化した。
図１０（ａ）および１０（ｂ）の結果から、抗ＦＬＴ３ ＡＤＣ（ｖ６２−１ｂ２１．１−ＡＧＬ−０１２９−０８およびｖ６２−１ｂ３７．１−ＡＧＬ−０１２９−０８）が、ＦＬＴ３発現ＲＳ−４−１１細胞株の細胞傷害性を誘導し得ることが示される。抗ＦＬＴ３ ＡＤＣ、ｖ６２−１ｂ２１．１−ＡＧＬ−０１２９−０８は、ヒトＦＬＴ３リガンドの存在下および非存在下で同様のレベルの細胞傷害性を有する。しかし、抗ＦＬＴ３ ＡＤＣ、ｖ６２−１ｂ３７．１−ＡＧＬ−０１２９−０８の細胞傷害活性は、リガンドなしでのＡＤＣ処理と比較して、ヒトＦＬＴ３リガンドの存在下で低下している。
別の実験において、ヒト白血病ＭＯＬＭ−１３細胞株の表面上で発現されるＦＬＴ３への、抗ＦＬＴ３抗体、ＣＨｖ６２．２１およびｖ６２−１ｂ３７．１の結合能をヒトＦＬＴ３リガンド（ｈＦＬ）の存在下で評価した。アイソタイプ対照抗体、ＡＧＳ９１．１−ｐＡＦを陰性対照として使用した。
簡潔に述べると、ＭＯＬＭ−１３細胞を丸底９６ウェルプレート上に細胞５０，０００個／ウェルの密度で播種した。プレートを１５０μＬ／ウェルのＰＢＳで１回洗浄した。非特異的結合を減少させるために、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．１％アジ化ナトリウム）中５０μＬ／ウェルの体積でＦｃブロッキングした（２０μｇ／ｍＬ）。細胞を４℃で１５分間温置した。ヒトＦＬＴ３リガンドを１００ｎｇ／ｍＬで適切なウェルに添加し、プレートにわたって１：２で連続希釈を行い、合計１１点の濃度とした。ビオチン化ＦＬＴ３抗体を添加する前に細胞を４℃で３０分間温置した。温置後、ビオチン化抗ＦＬＴ３抗体およびアイソタイプ対照抗体をＦＡＣＳ緩衝液中で１０μｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬに調製し、２５μＬをウェルに添加し、４℃で１時間温置した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ストレプトアビジン−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｅ）を１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で１時間温置した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、Ａｔｔｕｎｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で読み取り、Ｆｌｏｗ Ｊｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）ソフトウェアで分析した。
図１１（ａ）の結果から、ヒトＦＬＴ３リガンドは、抗ＦＬＴ３抗体、ＡＧＳ６２ＰがＭＯＬＭ−１３細胞に結合するのを妨害しないことが示される。しかし、ヒトＦＬＴ３リガンドは、抗ＦＬＴ３抗体、ｃＨｖ６２−１ｂ３７．１のＭＯＬＭ−１３細胞への結合を用量依存的に妨害する。
最後に、ＦＬＴ３を内因的に発現するヒト白血病ＭＯＬＭ−１３細胞株を用いて、ヒトＦＬＴ３リガンド（ｈＦＬ）の非存在下および存在下でのＦＬＴ３依存性細胞傷害性へのＦＬＴ３ ＡＤＣ、ＡＧＳ６２Ｐ１の介在能を評価した。アイソタイプ対照ＡＤＣ、ＡＧＳ９１．１．８８−ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０を陰性対照として使用した。
簡潔に述べると、ＭＯＬＭ−１３細胞を細胞２０００個／ウェルの密度にて５０μＬの完全培地中で９６ウェルプレートに播種し、３７℃；５％ＣＯ２の組織培養インキュベータに入れた。翌日、非特異的結合を減少させるために、細胞を２５μＬ／ウェルの体積でＦｃブロッキングした。ＡＤＣを１０μｇ／ｍＬの最終濃度になるように完全培地中で調製し、１：５の連続希釈を行い、合計９点の濃度とした。１２．５μＬのＡＤＣの連続希釈物を、ヒトＦＬＴ３リガンド（１００ｎｇ／ｍＬを１２．５μＬ／ウェルで添加）ありおよびなしで、適切なウェルに添加した。３７℃；５％ＣＯ２の組織培養インキュベータ中で５日間、ヒトＦＬＴ３リガンドありおよびなしで、ＡＧＳ６２Ｐ１およびＡＧＳ９１．１．８８−ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０を用いて細胞を処理した。温置期間終了時に、２０μＬのＰｒｅｓｔｏ Ｂｌｕｅを各ウェルに添加し、２時間温置した。５４０励起および５９０発光波長を用いるＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ４プレートリーダーを使用してプレートの読み取りを行い、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてグラフ化した。
図１１（ｂ）の結果から、ヒトＦＬＴ３リガンドが、ＭＯＬＭ−１３細胞における抗ＦＬＴ３ ＡＤＣ（ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０）介在性の細胞傷害性を妨害しないことが示される。
したがって、ＦＬＴ３ ＭＡｂが治療の状況で使用され得る一方で、全てのＦＬＴ３ ＭＡｂが同じではない。図８〜１１の結果から、ＦＬに結合しないＦＬＴ３ ＭＡｂは、ＦＬに結合することが示されているＦＬＴ３ ＭＡｂよりも卓越した長所を示すことが示される。さらに、本発明のＡＤＣの治療的有用性に照らして、この結果から、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０などの非リガンド遮断薬ＦＬＴ３ ＭＡｂを含むＡＤＣが、ＦＬ存在下で、リガンド遮断薬ＦＬＴ３ Ｍａｂを含むＡＤＣと比較して、抗腫瘍効果を保持することが示される。当業者は、化学療法処置後にＦＬの存在が増加することが知られていることを理解する。さらに、ＦＬの存在の上昇がＦＬＴ３阻害剤の活性を低下させることが示されていることが知られている。したがって、図８〜１１の結果から、癌患者におけるリガンド遮断薬ＦＬＴ３ ＭＡｂを含むＡＤＣと比較した場合、非リガンド遮断薬ＦＬＴ３ Ｍａｂを含むＡＤＣがより良好な治療指数および抗腫瘍効果を有することが示唆される。
実施例１５
ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０の安定性試験
ＦＬＴ３ ＡＤＣ ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０およびＡＧＬ−０３０１−２０と表示される別の細胞傷害性化合物（国際公開第２０１４／０４３４０３号パンフレット、Ａｇｅｎｓｙｓ，Ｉｎｃ．を参照）を用いた別のＦＬＴ３ ＡＤＣの安定性をインビトロで評価した。この実験において、ヒト血清（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に０．４ｍｇ／ｍＬの各ＡＤＣおよびリン酸塩ｐＨ７．３を最終濃度５０ｍＭで添加し、加湿インキュベータ中で３７℃で温置した。１００μＬのアリコートを回収し、−８０℃で５分、３時間、２５．２５時間、５１．２５時間および１７１．２時間で凍結させた。全試料を回収した後、各ＡＤＣの抗体および薬物成分を定量するためにＥＬＩＳＡを実施した。
結果から、ＣＨｖ６２．２１ｐＡＦ−ＡＧＬ−０１８２−３０薬物抗体結合は、実験図１２（Ａ）の時間経過にわたって安定であることが示される。しかし、図１２（Ｂ）から、ｖ６２−１ｂ２１−ＡＧＬ−０３０１−２０に対する薬物−抗体結合は不安定であり、その結果、実験の時間経過にわたって顕著な脱複合化（ｄｅ−ｃｏｎｕｇａｔｉｏｎ）をもたらすことが示される。
本出願を通じて、様々なウェブサイトのデータコンテンツ、刊行物、特許出願及び特許が参照される。（ウェブサイトはそれらのＵｎｉｆｏｒｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ＬｏｃａｔｏｒまたはＵＲＬ、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ上のアドレスにより参照される。）これらの参考文献の各々の開示は、それらの全体において本明細書によって本明細書に参照により組み込まれる。
本発明は、本発明の個々の態様の単一の説明として意図される、本明細書中で開示される実施形態による範囲に限定されるものではなく、機能的に等価なものは何れも本発明の範囲内である。本明細書中に記載のものに加えて、本発明のモデルおよび方法に対する様々な改変は、上記の説明および教示から当業者に明らかになるであろうし、同様に本発明の範囲内に入るものとする。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく実施され得る。

Claims (22)

  1. 配列番号２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２および配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む、ＦＬＴ−３に結合する抗体又はその抗原結合断片。
  2. （ｉ）配列番号１１の１番目のＥ〜１２３番目のＳの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号１０の１番目のＤ〜１０８番目のＲの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
    （ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸番号１番のＥ〜４５２番のＧのアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖；
    （ｉｉｉ）配列番号１１の１番目のＥ〜４５３番目のＫの範囲のアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖；
    （ｉｖ）配列番号１１の１番目のＥ〜４５２番目Ｇの範囲のアミノ酸配列からなり、１番目のＥがピログルタメートに置換されている重鎖および配列番号１０の１番目のＤ〜２１４番目のＣの範囲のアミノ酸配列からなる軽鎖；
    （ｖ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３１で寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３１で寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）により産生される抗体の軽鎖のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；又は、
    （ｖｉ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３６で寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生される抗体の重鎖のアミノ酸配列からなる重鎖およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１８３６で寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）により産生される抗体の軽鎖のアミノ酸配列からなる軽鎖；
    を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  3. 前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の抗原結合断片。
  4. 前記抗体はＩｇＧサブタイプであるＦｃ領域を含む、請求項１又は２に記載の抗体。
  5. 前記抗体は、前記重鎖のアミノ酸位置１２４に非天然アミノ酸の置換を含むＦｃ領域を含み、且つ前記非天然アミノ酸がパラ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）である、請求項１、２、又は４に記載の抗体。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片をコードする、１以上の単離核酸。
  7. 請求項６に記載の１以上の単離核酸を含む、１以上の発現ベクター。
  8. 請求項７に記載の１以上の発現ベクターを含む、組み換え宿主細胞。
  9. 請求項８に記載の組み換え宿主細胞を培養することによって産生される、抗体または抗原結合断片。
  10. リンカーを介して治療剤と複合化された請求項１〜５及び９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合断片を含む抗体薬物複合体。
  11. 前記抗体または抗原結合断片は、ＦＬＴ３に結合するが、ＦＬＴ３リガンド（ＦＬ）に対するＦＬＴ３の結合を実質的に阻害しない、請求項１０に記載の抗体薬物複合体。
  12. 前記リンカーが切断不能リンカーである、請求項１０又は１１に記載の抗体薬物複合体。
  13. 前記リンカーが２−（アミノオキシ）酢酸である、請求項１２に記載の抗体薬物複合体。
  14. 前記治療剤が（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−アミノ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−３−アジド−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミドである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の抗体薬物複合体。
  15. 前記抗体薬物複合体は、次の式を有し、

    抗体−（リンカー−治療剤）ｐ

    式中、
    前記リンカーは、２−（アミノオキシ）酢酸であり、
    前記治療剤は（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（Ｓ）−１−アミノ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−３−アジド−Ｎ−メチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタンアミド）ブタンアミドであり、
    ｐは、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９および３からなる群から選択される、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の抗体薬物複合体。
  16. 治療的有効量の請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の抗体薬物複合体及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
  17. 癌の処置を含む治療での使用のためのものである、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. （ａ）前記癌が、非癌性細胞と比較した場合、ＦＬＴ３を高レベルで発現する１以上の細胞を含み；または、
    （ｂ）前記癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞リンパ芽球性白血病および前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病からなる群から選択される、請求項１７又は１８に記載の医薬組成物。
  19. １つ以上の抗新生物剤を更に含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  20. 対象において癌を処置するための、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の抗体薬物複合体。
  21. 前記対象がヒト患者である、請求項２０に記載の抗体薬物複合体。
  22. 前記癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞リンパ芽球性白血病および前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病からなる群から選択される、対象において癌を処置するための、請求項２０又は２１に記載の抗体薬物複合体。
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