CN107614010A - 结合至flt3蛋白的抗体药物偶联物(adc) - Google Patents

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Abstract

本文描述结合至FLT3蛋白的抗体药物偶联物(ADC)及其变体。FLT3在正常成人组织中会呈现显示不同且有限的表达模式，且其于表I所列的癌症中表达异常。因此，本发明的ADC提供用于治疗癌症的治疗性组合物。

Description

结合至FLT3蛋白的抗体药物偶联物(ADC)
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年3月9日提交的美国临时专利申请第62/130,476号的优先权。该案的内容以全文引用的方式并入本文中。
ASCII文本文件的序列表
下列ASCII文本文件上的提交内容以全文引用的方式并入本文中：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：511582009200SeqList.txt，记录日期：2016年3月7日，大小：44,847个字节)。
联邦资助研究下的发明权利声明
不适用。
技术领域
本文描述的本发明涉及结合称为FLT3的蛋白质的抗体、其抗原结合片段及其抗体药物偶联物(ADC)。本发明进一步涉及适用于治疗表达FLT3的癌症的预后、预防及治疗方法及组合物。
背景技术
据估计，2013年1,660,290名男性及女性(854,790名男性及805,500名女性)经诊断患有各部位癌症及580,350名男性及女性死于各部位癌症。2006至2010年间，经诊断患有各部位癌症的中值年龄为66岁。年龄调整发病率为每年每100,000名男性及女性中有463.0名。这些比率基于在2006至2010年间自18个SEER地理区域(注：SEER＝监测(Surveillance)、流行病学(Epidemiology)及最终结果(End Result)计划，NCI)诊断的病例。在2006至2010年间，死于各部位癌症的中值年龄为72岁。年龄调整死亡率为每年每100,000名男性及女性中有176.4名。这些比率基于在美国于2006至2010年间死亡的患者。18个SEER地理区域的2003-2009年间总体5年相对存活率为65.8％。
白血病是起始于造血组织(例如骨髓)，且会产生异常大量血细胞并进入血流中的癌症。主要白血病包括急性淋巴母细胞性(ALL)、急性骨髓性(AML)、慢性淋巴细胞性(CLL)、慢性髓系(CML)及毛细胞(CLL)白血病。
就这些白血病群组而言，据估计，2013年有48,610名男性及女性(27,880名男性及20,730名女性)经诊断患有白血病及23,720名男性及女性死于白血病。在2006至2010年间，经诊断患有白血病的中值年龄为66岁。年龄调整发病率为每年每100,000名男性及女性中有12.8名。这些比率基于2006至2010年间自18个SEER地理区域诊断的病例。2006至2010年间，死于白血病的中值年龄为75岁。年龄调整死亡率为每年每100,000名男性及女性中有7.1名。这些比率基于在美国于2006至2010年间死亡的患者。18个SEER地理区域的2003-2009年间总体5年相对存活率为56.0％。
CLL是成人中第二常见类型的白血病且其通常会缓慢恶化。其通常发生在中年期间或中年后，且其极少发生于儿童中。早期CLL的患者未经化学疗法治疗直至它们呈现症状或显示疾病的迅速进展的证据。化学疗法的早期开始已无法于CLL中显示益处且甚至可能增加死亡率。当开始化学疗法时，核苷类似物氟达拉滨(fludarabine)是CLL中最常用的一线疗法。组合方案在若干临床试验中已显示改善的响应率且包括以下：氟达拉滨、环磷酰胺及利妥昔单抗(rituximab)(FCR)；喷司他汀(Pentostatin)、环磷酰胺及利妥昔单抗(PCR)；氟达拉滨、环磷酰胺及米托蒽醌(mitoxantrone)(FCM)；环磷酰胺、长春新碱(vincristine)及氯泼尼松(prednisone)(CVP)；环磷酰胺、多柔比星(doxorubicin)、长春新碱及氯泼尼松(CHOP)。据估计，2013年有15,680名男性及女性(9,720名男性及5,960女性)经诊断患有慢性淋巴细胞性白血病并且4,580名男性及女性将死于慢性淋巴细胞性白血病。自2006至2010年间，诊断患有慢性淋巴细胞性白血病的中值年龄为71岁。年龄调整发病率为每年每100,000名男性及女性中有4.3名。这比率基于2006至2010年自18个SEER地理区域诊断的病例。自2006至2010年间，死于慢性淋巴细胞性白血病的中值年龄为79岁。年龄调整死亡率为每年每100,000名男性及女性中有1.4名。这些比率基于在美国于2006至2010年间死亡的患者。18个SEER地理区域的2003-2009总体5年相对存活率为79.2％。
急性骨髓性白血病(AML)是成人中最常见类型的急性白血病。AML的当前治疗应足够侵略性以达成完全缓解(CR)，因为部分缓解未提供实质性存活益处。成人AML中的缓解率与年龄呈反比例关系，针对那些小于60岁者预期缓解率大于65％。数据表明一经达成，较年长患者中的缓解的持续时间可较短。表达祖代细胞抗原CD34和/或P-糖蛋白(MDR1基因产物)的患者具有略差的结果。细胞遗传学分析提供一些可获得的最强预后信息，以预测缓解诱导及缓解后治疗两者的结果。指示良好预后的细胞遗传学异常包括t(8；21)、inv(16)或t(16；16)及t(15；17)。正常细胞遗传学预示平均-风险AML。患有具有以下特征的AML患者使用化学疗法具有特别差的预后：染色体5或7的长臂或单染色体的缺失；染色体3、t(6；9)、t(9；22)的易位或倒位；或染色体11q23的异常。据估计2013年14,590名男性及女性(7,820名男性及6,770名女性)经诊断患有急性骨髓性白血病及10,370名男性及女性死于急性骨髓性白血病。自2006至2010年间，诊断患有急性骨髓性白血病的中值年龄为67岁。年龄调整发病率为每年每100,000名男性及女性中有3.7名。这些比率基于2006至2010年自18个SEER地理区域诊断的病例。自2006至2010年间，死于急性骨髓性白血病的中值年龄为72岁。年龄调整死亡率为每年每100,000名男性及女性中有2.8名。这些比率基于在美国于2006至2010年间死亡的患者。18个SEER地理区域的2003-2009总体5年相对存活率为24.2％。注意，所有常见的癌症信息获得自NCI网站(www.cancer.gov)且所有统计学资料基于SEER发病率及NCHS死亡率统计学资料发现于以下中：Howlader N.等，SEER Cancer Statistics Review,1975-2010,National Cancer Institute.Bethesda,MD,http：//seer.cancer.gov/csr/1975_2010/，基于2012年11月的SEER资料提交，发布于SEER网站，2013。
急性淋巴母细胞性白血病(“ALL”)表示源自阻断淋巴分化并驱动异常细胞增殖及存活的遗传改变的B/T-前体-阶段类淋巴细胞恶性肿瘤的群组。在过去数十年间已于治疗儿童ALL中获得显著进步，及五(5)年存活率现接近90％。然而高达20％的儿童难以治疗或治疗后会复发，且这些患者的无事件存活率仍然较差。治疗患有ALL的成人患者甚至在现代化学疗法显著进步后因高复发率而还仍具挑战性。在近几十年间，已在ALL的治疗结果中达成迅速的改善，其主要基于化学疗法的强化及优化；干细胞移植的风险适应性用途；及包括单抗的对象化及靶向疗法。使用下代测序，评估影响正常淋巴细胞形成的额外突变与协同突变的重要性及表观遗传改变。以此方式获得的数据将有助于评估个别患者的预后，但重要地，还有助于并入适用于突变异常的靶向疗法。
此外，意识到单抗(mAb)的治疗效用(G.Kohler及C.Milstein,Nature 256：495-497(1975))。现已批准单抗作为移植、癌症、传染性疾病、心血管疾病及炎症中的疗法。不同同种型具有不同效应功能。功能中的此类差异体现于用于各种免疫球蛋白同种型的不同三维结构(P.M.Alzari等，Annual Rev.Immunol.,6：555-580(1988))。
因为小鼠便于免疫且可将大部分人类抗原识别为外来物，因此具有治疗潜力的抗人类标靶的mAb已通常是鼠源的。然而，鼠类mAb作为人类疗法具有固有缺点。它们需更频繁给药，因为mAb相较于人类抗体于人类中具有更短循环半衰期。更精确而言，向人类免疫系统重复给予鼠类抗体会造成人类免疫系统将小鼠蛋白识别为外来物并产生人类抗小鼠抗体(HAMA)响应而产生响应。此HAMA响应可导致过敏反应并自系统中迅速清除鼠类抗体，从而使通过鼠类抗体治疗变得无效。为避免此类影响，已尝试于小鼠内产生人类免疫系统的尝试。
希望初始尝试创造能够以具有人类序列的抗体对抗原产生响应的转基因小鼠(参见Bruggemann等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 86：6709-6713(1989))，但受到可通过可利用的克隆载体保持稳定的DNA的数量的限制。使用酵母人工染色体(YAC)克隆载体引导人类Ig基因座的大种系片段引入转基因哺乳动物内。基本上大部分人类V、D及J区基因以与人类基因组中发现的相同间隔布置并且人类恒定区使用YAC引入小鼠内。一种此类转基因小鼠品系称为小鼠且购买自Amgen Fremont,Inc.(Fremont CA)，前身为Abgenix,Inc。
另外，抗体可使用VelocImmune转基因小鼠制备，在该小鼠中，在免疫球蛋白重链(VH、DH及JH区段)和/或κ轻链(VK及JK)基因座处具有内源性小鼠可变区段的基因组序列已全部或部分用具有人类免疫球蛋白重链(VH、DH及JH)和/或κ轻链(VK及JK)基因座(Regeneron,Tarrytown,NY)的未经重排种可变区段的人类基因组序列置换。参见，例如，美国专利案第6,586,251、6,596,541、7,105,348、6,528,313、6,638,768及6,528,314号。
发明内容
本发明提供结合至FLT3蛋白及FLT3蛋白的多肽片段的抗体、其抗原结合片段及其抗体药物偶联物(ADC)。在一些实施方式中，本发明包含与治疗剂偶联的完全人类抗体。在某些实施方式中，限制条件为图2A和/或2B的整个核酸序列未经编码和/或图3A和/或3B的整个氨基酸序列未经制备。在某些实施方式中，图2A和/或2B的整个核酸序列经编码和/或图3A和/或3B的整个氨基酸序列经制备，它们中的任何一种呈各自人类单位剂型。
本发明进一步提供各种免疫原性或治疗性组合物(例如抗体药物偶联物)，及用于治疗表达FLT3的癌症例如列于表I中的组织的癌症(例如，AML、ALL，包括B细胞淋巴母细胞性白血病及前体B细胞淋巴母细胞性白血病)的策略。
图式简单说明
图1：FLT3的cDNA及氨基酸序列显示于图1中。起始甲硫氨酸加下划线。开放阅读框自核酸67延伸至3048(包含终止密码子)。
图2A：CHv62.21重链的cDNA及氨基酸序列。重链可变区加双下划线及重链人类IgG1恒定区加下划线。
图2B：CHv62.21轻链及CHv62.21pAF轻链的cDNA及氨基酸序列。轻链可变区加双下划线及人类κ恒定区加下划线。
图2C：经非天然氨基酸的插入修饰的CHv62.21重链的cDNA及氨基酸序列。X标记用于在核酸残基371处插入非天然氨基酸(“nnAA”)对乙酰基苯丙氨酸(pAF)的琥珀密码子的位置。重链可变区加双下划线及重链人类IgG1恒定区加下划线。
图3A：CHv62.21重链的氨基酸序列。重链可变区加双下划线及人类IgG1恒定区加下划线。
图3B：CHv62.21轻链及CHv62.21pAF轻链的氨基酸序列。轻链可变区加双下划线及人类κ恒定区加下划线。
图3C：CHv62.21重链的氨基酸序列。X标记的氨基酸位置124用于插入非天然氨基酸(“nnAA”)对乙酰基苯丙氨酸(pAF)的琥珀密码子的位置。重链可变区加双下划线及人类IgG1恒定区加下划线。
图4A：CHv62.21重链与人类Ig种系的比对。
图4B：CHv62.21轻链与人类Ig种系的比对。
图5：CHv62.21pAF-AGL-0182-30于植入CB17/SCID小鼠中的人类B骨髓单核细胞性白血病细胞系MV4-11的皮下建立的异种移植物模型中的疗效及剂量滴定研究。
图6：CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC)及CHv62.21pAF(AGS62P)(裸抗体)于植入CB17SCID小鼠中的人类B骨髓单核细胞性白血病细胞系MV4-11的皮下建立的异种移植物模型中的疗效研究。
图7：CHv62.21及CHv62.21pAF于体外EOL-1、SEM及Raji(图中从左至右)中不介导抗体依赖性细胞毒性活性(ADCC)。分析详情：1)E：T＝100：1；2)抗体浓度＝2.5μg/mL；3)孵育时间：4H；4)同种型对照mAb及ADC：AGS91.1-L363-pAF、AGS91.88-pAF-AGSL-0182-30；5)阳性对照：靶向Raji细胞的利妥昔单抗。
图8：CHv62.21显示非配体阻断活性。在配体结合分析中比较FLT3配体阻断剂Mab(1b37.1)与CHv62.21证实CHv62.21 Mab是非配体阻断剂。
图9：CHv62.21不干扰FL介导的细胞增殖。
图10：1b37.1FLT3配体阻断Mab的细胞毒性活性在FL的存在下减小。图10(A)：v62-1b21.1-AGL-0129-08在存在及不存在人类FLT3配体(hFL)的情况下对RS-4-11细胞的体外细胞毒性的评估。图10(B)：v62-1b37.1-AGL-0129-08在存在及不存在人类FLT3配体(hFL)的情况下对RS-4-11细胞的体外细胞毒性的评估。
图11：FLT3配体不干扰MOLM-13细胞中CHv62.21pAF-AGL-0182-30介导的细胞毒性。图11(A)：生物素化CHv62.21pAF及v62-1b37.1在MOLM-13细胞上存在人类FLT3配体下的结合评估。图11(B)：CHv62.21pAF-AGL-0182-30在MOLM-13细胞上存在及不存在人类FLT3配体的情况下的体外细胞毒性的评估。
图12：CHv62.21pAF-AGL-0182-30的体外稳定性。图12(A)：CHv62.21pAF-AGL-0182-30于人类血清中的稳定性评估。图12(B)：CHv62-AGL-0301-20于人类血清中的稳定性评估。
图13：CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC)及CHv62.21pAF(裸抗体)使用多剂量方案于植入CB17SCID小鼠中的人类B骨髓单核细胞性白血病细胞系MV4-11的皮下建立的异种移植物模型中的疗效研究。
图14：CHv62.21pAF-AGL-0182-30于皮下建立的SEM-xcl异种移植物模型中的疗效。
具体实施方式
章节概况
I.)定义
II.)FLT3抗体
III.)抗体药物偶联物概述
III(A).类美登素
III(B).奥瑞司他汀(Auristatin)及海兔毒素(dolostatin)
III(C).卡奇霉素(Calicheamicin)
III(D).其他细胞毒剂
IV.)结合FLT3的抗体药物偶联物
V.)接头单元
VI.)延伸子单元(Stretcher Unit)
VII.)氨基酸单元
VIII.)间隔子单元
IX.)药物单元
X.)药物负载
XI.)测定ADC的细胞毒性效应的方法
XII.)表达FLT3的癌症的治疗
XIII.)FLT3作为基于抗体的疗法的标靶
XIV.)FLT3ADC混合物
XV.)组合疗法
XVI.)试剂盒/制品
I.)定义：
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术术语、注释及其他科学术语旨在具有本领域技术人员所通常了解的含义。在一些情况下，本文出于清楚起见和/或供及时参考而定义具有通常含义的术语，且本文包括此类定义应不必理解为表示与本领域中通常所了解的定义具有实质性差异。本文所述或所参考的许多技术及程序经充分理解且由本领域技术人员使用常规方法来使用，例如，例如，描述于Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y中的广泛应用的分子克隆方法论。除非另有说明，否则适当地，涉及使用市售试剂盒及试剂的程序通常根据制造商定义的实验方案和/或参数进行。
当本文使用商标名时，除非内容另有指示，否则对商标名的提及还表示产品调配物、学名药物及商标名产品的活性药物成分。
术语“晚期癌症”、“局部晚期癌症”、“晚期疾病”及“局部晚期疾病”表示已贯穿相关组织被膜的癌症，且表示包括依据美国泌尿协会(AUA)系统的C期疾病、依据Whitmore-Jewett系统的C1至C2期疾病、依据TNM(肿瘤、结节、转移)系统的T3至T4期及N+疾病。一般而言，对于患有局部晚期疾病的患者不推荐手术，且这些患者相较于患有临床局部(局限于器官)癌症的患者具有明显较为不利的结果。
术语“烷基”(其本身或作为另一术语的一部分)指含有伯、仲、叔或环碳原子的饱和C1-C12烃。特定烷基是那些具有1至8个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子的烷基。烷基的实施例包括(但不限于)：甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基(tBu)、正戊基、异戊基、第三戊基及正己基、异己基。在一些实施方式中，烷基具有伯、仲或叔碳原子且不具有环碳原子。
术语“烯基”(其本身或作为另一术语的一部分)指含有伯、仲、叔或环碳原子及至少一个不饱和位点(即，碳碳sp2双键)的C2-C12烃。特定烯基是那些具有2至8个碳原子、2至6个碳原子或2至4个碳原子的烯基。实施例包括(但不限于)：乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH2＝CH2)、环戊烯基(-C5H7)及5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。在一些实施方式中，烯基具有伯、仲或叔碳原子且不具有环碳原子。
术语“炔基”(其本身或作为另一术语的一部分)指含有伯、仲、叔或环碳原子及至少一个不饱和位点(即，碳碳sp三键)的C2-C12烃。特定炔基是那些具有2至8个碳原子、2至6个碳原子或2至4个碳原子的炔基。实施例包括(但不限于)：乙炔基(-C≡CH)及2-丙炔基(-CH2C≡CH)。在一些实施方式中，炔基具有伯、仲或叔碳原子且不具有环碳原子。
术语“烷氧基”指-O-烷基，其中该O连接至该分子的剩余部分的连接点，且烷基如上文定义。
术语“杂环烷基”指单环或稠合、桥接或螺接多环结构，其为饱和或部分饱和且每个环结构具有3至12个选自碳原子及至多三个选自氮、氧、硫的杂原子的环原子。特定杂环烷基是那些每个环结构具有3至8个环原子或5至7个环原子的杂环烷基。该环结构可任选在碳或硫环成员上含有至多两个氧代。作为适当结合的部分的形式的示例性实体包括：
术语“杂芳基”指每个杂环具有3至12个环原子的单环、稠合双环或稠合多环芳族杂环(环结构具有选自碳原子及至多四个选自氮、氧及硫的杂原子的环原子)。特定杂芳基是那些每个环结构具有3至8个环原子或5至7个环原子的杂芳基。杂芳基的示例性实施例包括作为适当结合的部分的形式的下列实体：
如本文使用的术语“杂环”、“杂环性”或“杂环基”包含如上文定义的“杂环烷基”及“杂芳基”部分。
本领域技术人员将知晓上文列举或描绘的杂环基、杂芳基及杂环烷基的种类不详尽且还可选择在这些经定义的术语的范围内的额外的种类。
术语“卤素”表示氯、氟、溴或碘。术语“卤代”表示氯代、氟代、溴代或碘代。
术语“经取代”表示指定基团或部分具有一个或多个取代基。术语“未经取代”表示指定基团无取代基。术语“任选经取代”表示指定基团未经取代或经一个或多个取代基取代。在使用术语“经取代”以描述结构性系统的情况下，该取代表示发生于系统上的任何价位容许的位置处。
本文给定的任何式旨在表示具有由结构式及某些变化或形式描绘的结构的化合物。具体地，本文给定的任何式的化合物可具有非对称中心且因此以不同的镜像异构物形式存在。具有通式的化合物的所有光学异构物及立体异构物及其混合物视为在该式的范围内。因此，本文给定的任何式旨在表示外消旋物、一种或多种镜像异构物形式、一种或多种非镜像异构物形式、一种或多种阻转异构物形式(atropisomeric form)及其混合物。此外，某些结构可呈几何异构物(即，顺式或反式异构物)、呈互变异构物或呈阻转异构物的形式存在。另外，本文给定的任何式旨在还表示水合物、溶剂合物及此类化合物的非晶与多晶形式及其混合物中的任何一种，即使未明确列举此类形式。在一些实施方式中，溶剂为水并且溶剂合物为水合物。
本文给定的任何式还旨在表示化合物的未经标记形式及同位素标记形式。同位素标记化合物具有由本文给定的式所描绘的结构，只是一个或多个原子经具有选定的原子质量或质量数的原子置换。可并入本文描述的化合物中的同位素的实施例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯及碘的同位素，例如分别为2H、3H、11C、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F、36Cl及125I。此类同位素标记化合物适用于新陈代谢研究(优选用14C)、反应动力学研究(例如用2H或3H)、包括药物或基质组织分布分析的检测或成像技术(例如正电子发射断层摄影术(PET)或单光子发射计算机断层扫描摄影术(SPECT))或患者的放射性治疗中。具体地，经18F或11C标记的化合物可特别优选适用于PET或SPECT研究。此外，使用较重同位素(例如氘(即，2H))的取代可提供某些由于较大的新陈代谢稳定性造成的治疗优势，例如，增加的体内半衰期或减小的剂量需求。本文描述的同位素标记化合物及其前药可通常通过以经容易获得的同位素标记试剂代替非同位素标记试剂进行下文所述的方案或实施例及制备中所揭示的程序来制备。
当提及本文给定的任何式时，自用于指定变量的可能种类的列表中选择特定部分非旨在定义对用于本文别处出现的变量的种类的相同选择。换言之，在变量出现多于一次的情况下，除非另有说明，否则自指定列表中选择的种类独立于该式中别处对相同变量的种类的选择。
当本文应用于一类取代基时，命名法“Ci-j”(j>i)表示指本文所述的其中碳成员(i至j，包括i与j)的数目中的各者及每一个为独立实现的任何组合物、用途或方法的实施方式。例如，术语C1-3独立地指具有一个碳成员(C1)的实施方式、具有两个碳成员(C2)的实施方式及具有三个碳成员(C3)的实施方式。
术语Cn-m烷基指链中具有碳成员总数N且满足n≤N≤m且m>n的脂族链直链或支链。
使用AutoNOMTM软件产生本文列举的化学名称。若化学结构与针对该结构所列举的名称间有矛盾，则以结构为准。
根据针对分配及命名法的前述说明性注意事项，应了解本文针对一组其中在化学上有意义且除非另有说明的暗示的明确参考、针对此组的实施方式的独立参考及针对该组的子组的可能实施方式中的各者及每一个的参考指明确性。
“改变天然糖基化模式”出于本文的目的旨在表示删除天然序列FLT3中发现的一个或多个碳水化合物部分(通过移除目标糖基化位点或通过化学和/或酶促方式删除糖基化)和/或添加一个或多个不存在于天然序列FLT3中的糖基化位点，其中该“天然糖基化模式”指由于所用FLT-3序列、细胞类型及生长条件的特定组合造成的天然翻译后糖基化模式。另外，该词组包括天然蛋白质的糖基化中的定性变化，涉及存在的各种碳水化合物部分的性质及比例的变化。
术语“类似物”指与另一分子(例如，FLT3相关蛋白)结构类似或共享类似或相应属性的分子。例如，FLT3蛋白的类似物可被特异性结合至FLT3的抗体或T细胞特异性结合。
除非另有明确指示，否则术语“抗体”在最广泛意义上使用。因此，“抗体”可为天然生成或人造，例如通过常规杂交瘤或转基因小鼠技术产生的单抗。FLT3抗体包含单克隆及多克隆抗体及含有这些抗体的抗原结合结构域和/或一个或多个互补决定区的片段。如本文使用，术语“抗体”指特异性结合FLT3和/或显示所需生物活性的抗体或其片段的任何形式且明确涵盖单抗(包括全长单抗)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)及抗体片段，只要它们特异性结合FLT3和/或显示所需生物活性即可。任何特异性抗体可用于本文提供的方法及组合物中。因此，在一个实施方式中，术语“抗体”涵盖一种分子，该分子包含至少一个来自轻链免疫球蛋白分子的可变区及至少一个来自重链分子的可变区且其组合以形成用于靶抗原的特异性结合位点。在一个实施方式中，该抗体为IgG抗体。例如，该抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。适用于本发明方法及组合物中的抗体可于细胞培养物、噬菌体或各种动物包括(但不限于)牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、绵羊、狗、猫、猴、黑猩猩及猿中产生。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体为哺乳动物抗体。噬菌体技术可用以分离初始抗体或用以产生具有经改变的特异性或结合性特性的变体。此类技术为本领域中常用及熟知。在一个实施方式中，该抗体通过本领域中已知的重组方式产生。例如，重组抗体可通过用包含编码该抗体的DNA序列的载体转染宿主细胞来产生。一种或多种载体可用以转染于宿主细胞中表达至少一个VL及至少一个VH区的DNA序列。抗体产生及制备的重组方式的示例性描述包括Delves,《抗体生产：关键技术》(ANTIBODY PRODUCTION：ESSENTIAL TECHNIQUES)(Wiley,1997)；Shephard等人，《单克隆抗体》(MONOCLONALANTIBODIES)(牛津大学出版社,2000)；Goding,《单克隆抗体：原理和实践》(MONOCLONALANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRaCTICE)(学院出版社,1993)及《新编免疫学指南》(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)(John Wiley&Sons出版社，最新版)。本发明的抗体可通过重组方式修饰以增加抗体于介导所需功能中的疗效。因此，可通过使用重组方式取代以修饰抗体在本发明的范围内。通常，该取代将为保守取代。例如，抗体的恒定区中的至少一个氨基酸可被不同残基置换。参见，例如，美国专利案第5,624,821号、美国专利案第6,194,551号、申请WO 9958572及Angal等人，Mol.Immunol.30：105-08(1993)。氨基酸中的修饰包括氨基酸的删除、添加及取代。在一些情况下，作出此类变化以减小非所需的活性，例如，补体依赖性细胞毒性。经常地，该抗体通过连接(共价或非共价)提供可检测信号的物质来标记。各种标记及结合技术已知且广泛报告于科学文献与专利文献中。可针对结合至正常或缺陷性FLT3筛选这些抗体。参见，例如，《抗体工程：实践方法》(ANTIBODYENGINEERING：APRaCTICAL APPROACH)(牛津大学出版社,1996)。可使用下列体外分析包括(但不限于)：增殖、迁移、黏着、软琼脂生长、血管生成、细胞-细胞通讯、细胞凋亡、运输、信号转导，及下列体内分析(例如肿瘤生长的抑制)识别具有所需生物活性的合适的抗体。本文提供的抗体还适用于诊断应用中。就捕获或非中和抗体而言，可针对结合至特异性抗原而不抑制该抗原的受体结合或生物活性的能力筛选它们。就中和抗体而言，该抗体适用于竞争性结合分析中。它们还可用以定量FLT3或其受体。
如本文使用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”(或简称为“抗体部分”)指FLT3抗体的保留特异性结合至抗原(例如，FLT3及变体；参见图1)的能力的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段进行。涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实施例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含两个通过双硫键在铰链区连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH及CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL及VH通过单独的基因编码，但它们可使用重组方法，通过可将它们制备成其中VL及VH区配对以形成单价分子的单一蛋白质链的合成接头而连接(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等，(1988)Science 242：423-426；及Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此类单链抗体还旨在涵盖于术语抗体的“抗原结合片段”的范围内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规方法获得，且该片段经筛选得到与完整抗体相同的效用。
如本文使用，术语“Fc”指包含铰链区、CH2和/或CH3结构域的区域。
如本文使用，该“抗原”的任何形式可用以产生对FLT3具特异性的抗体。因此，该诱发抗原可为单表位、多表位、或单独整个蛋白质或与一种或多种本领域中已知的免疫原性增强剂组合的整个蛋白质。该诱发抗原可为经分离全长蛋白、细胞表面蛋白(例如，利用经抗原的至少一部分转染的细胞进行免疫)或可溶性蛋白(例如，利用仅蛋白质的胞外结构域部分进行免疫)。该抗原可在经基因修饰的细胞中产生。编码该抗原的DNA可为基因组或非基因组(例如，cDNA)且编码该胞外结构域的至少一部分。如本文使用，术语“部分”在抗原的内容中指氨基酸或核酸的最小数量，适当地，以构成感兴趣抗原的免疫原性表位。可使用适用于感兴趣细胞的转化的任何基因载体，包括(但不限于)腺病毒载体、质粒及非病毒载体，例如阳离子型脂质。在一个实施方式中，本文的方法及组合物的抗体特异性结合感兴趣FLT3的胞外结构域的至少一部分。
本文提供的抗体或其抗原结合片段可构成“生物活性剂”或可为“生物活性剂”的一部分。如本文使用，术语“生物活性剂”指结合抗原和/或增强或介导所需生物效应以增强杀死细胞的毒素的效果的任何合成或天然生成的化合物。在一个实施方式中，适用于本发明中的结合片段为生物活性片段。如本文使用，术语“生物活性”指抗体或抗体片段可结合所需抗原性表位并直接或间接发挥生物效应。直接效应包括(但不限于)生长信号的调整、刺激和/或抑制；抗凋亡信号的调整、刺激和/或抑制；凋亡或坏死信号的调整、刺激和/或抑制；ADCC级联反应的调整、刺激和/或抑制；及CDC级联反应的调整、刺激和/或抑制。
抗原结合蛋白的结合亲和力通过结合常数(Ka)及解离常数(Kd)(KD＝Kd/Ka)测定。该结合亲和力可通过BIACORE测量，例如，通过将测试抗体捕获于涂布蛋白-A的传感器表面上并使FLT3在此表面上流动。或者，该结合亲和力可通过FORTEBIO来测量，例如将测试抗体受体捕获于涂布蛋白-A的针上并使FLT3在此表面上流动。本领域技术人员可识别本领域中已知的测量结合亲和力的其他合适的分析。
术语“特异性结合”(如本文使用关于抗原结合)蛋白质表示该抗原结合蛋白结合至FLT3及FLT3内的离散结构域或离散氨基酸序列而不结合或非显著结合至其他(例如，无关)蛋白质。然而，此术语不排除抗体或其结合片段还可与紧密相关分子交叉反应的事实。本文描述的抗体及其片段及包含这些的抗体药物偶联物可以相较于它们结合至紧密相关分子的亲和力大至少2、5、10、50、100或1000倍的亲和力特异性结合至FLT3。
本文揭示的任何抗体(无论呈何种形式，例如呈抗体药物偶联物的形式)结合至FLT3可预期阻断一些或全部FL结合至FLT3。然而，本文是非基本抑制FL结合至FLT3的抗FLT3抗体。为“基本抑制”结合，技术人员将预期超过最低变化的可检测量的结合减少；不涵盖等于不超过将在无规随机蛋白质蛋白质相互作用或非特异性抗体-抗原相互作用中预期的最低量结合的较小结合变化。测量抗体是否基本抑制另一分子结合至靶抗原可使用生物物理性测量法或功能性测量法由本领域已知的方法完成。例如，两种蛋白质的相互作用可在物理结合分析(例如，参见实施例14，下文)中直接测量或经由测量蛋白质相互作用的下游效应(例如通过受体发信号或后续细胞效应(例如细胞生长或细胞生长的抑制))的功能性分析间接测量。因此，本文揭示的非基本抑制FL结合至FLT3的抗FLT3抗体不引起FL结合至FLT3的显著减少且通过FLT3的FL结合的信号是可检测的。
“双特异性”抗体还适用于本发明方法及组合物中。如本文使用，术语“双特异性抗体”指对至少两种不同抗原性表位具有结合特异性的抗体，其通常为单抗。在一个实施方式中，该表位来自相同抗原。在另一实施方式中，该表位来自两种不同抗原。本领域中已知用于制备双特异性抗体的方法。例如，双特异性抗体可使用两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达来重组产生。参见，例如，Milstein等，Nature 305：537-39(1983)。或者，双特异性抗体可使用化学键联来制备。参见，例如，Brennan等，Science 229：81(1985)。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见，例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48(1993)、Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。
本文描述的单抗具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分是与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列同源，同时该链的剩余部分是与衍生自其他物种或属于其他抗体类别或子类的抗体及此类抗体的片段中的相应序列相同或与衍生自其他物种或属于其他抗体类别或子类的抗体及此类抗体的片段中的相应序列同源，只要它们特异性结合靶抗原和/或显示所需生物活性(美国专利案第4,816,567号及Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
如本文使用，术语“癌症”、“赘生物”及“肿瘤”(可互换使用且呈单数形式或复数形式)指已经历恶性转化使得对宿主生物体而言病理性的细胞。通过完全确立的技术(具体地，病理学检查)可易于区分原发性癌细胞(即，获得自恶性转化部位附近的细胞)及非癌性细胞。如本文使用，癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，且包括衍生自癌细胞祖代的任何细胞。此包括转移的癌细胞及衍生自癌细胞的体外培养物及细胞系。当提及一种类型的癌症通常显示为固体肿瘤时，“临床可检测”肿瘤基于肿瘤质量例如，通过例如CAT扫描、MR成像、X射线、超音波或触诊等程序可检测的肿瘤和/或因获得自患者的样品中的一种或多种癌症特异性抗原的表达而可检测的肿瘤。肿瘤可为造血性肿瘤，例如，血细胞的肿瘤或类似物，表示液体肿瘤。基于此肿瘤的临床病症的具体实施例包括白血病(例如慢性骨髓细胞性白血病或急性骨髓细胞性白血病)；骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)；淋巴瘤及类似疾病。
术语“治疗剂”指提供治疗益处和/或是如本文定义的治疗有效的所有药剂。治疗剂可(例如)逆转、减轻、缓解、抑制或限制疾病、失调症或病症的发展或减小疾病、失调症或病症的严重性，或影响或改善或减轻疾病(例如癌症)的一种或多种症状。此种药剂可为细胞毒性或细胞增殖抑制性。该术语包括(但不限于)化学治疗剂、抗肿瘤剂及如本文定义的“药物单元”药剂。
术语“抗肿瘤剂”指在肿瘤或癌症的治疗中提供如本文定义的治疗益处和/或治疗有效的所有药剂。
在采用如本文揭示的任何抗体药物偶联物及其药物组合物的一些实施方式中，包含治疗剂的抗体药物偶联物及其药物组合物还有效治疗前癌或至少一种前肿瘤细胞，例如防止恶性转化为癌性细胞。在其他实施方式中，该一种或多种抗肿瘤剂还有效治疗前癌或至少一种前肿瘤细胞，例如防止恶性转化为癌性细胞。
术语“化学治疗剂”指有效抑制肿瘤生长的所有化学化合物。化学治疗剂的非限制性实施例包括烷化剂，例如，氮芥、次乙亚胺化合物及烷基磺酸盐；抗代谢物，例如，叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂；有丝分裂抑制剂，例如，抗微管蛋白剂，例如长春花生物碱、奥瑞司他汀及鬼臼毒素的衍生物；细胞毒性抗生素；损害或妨碍DNA表达或复制的化合物，例如，DNA小沟结合剂；及生长因子受体拮抗剂。另外，化学治疗剂包括细胞毒剂(如本文定义)、抗体、生物分子及小分子。
术语“化合物”指且包含化学化合物本身，及无论是否明确说明，且除非内容明确排除以下各物：该化合物的非晶形及晶形(包括多晶形)，其中这些形式可为混合物的一部分或可为孤立的；该化合物的游离酸及游离碱形式，它们通常为本文提供的结构中显示的形式；该化合物的异构物，它们指光学异构物及互变异构性异构物，其中光学异构物包括镜像异构物及非镜像异构物、对掌性异构物及非对掌性异构物，及光学异构物包括经分离光学异构物及包括外消旋及非外消旋混合物的光学异构物的混合物；其中异构物可呈分离形式或呈与一种或多种其他异构物混合的形式；该化合物的同位素，它们包括含氘-及含氚化合物，且包括含有放射性同位素的化合物，包括治疗有效-及诊断有效的放射性同位素；该化合物的多聚形式，包括二聚、三聚等形式；该化合物的盐，优选为药学上可接受的盐，包括酸加成盐及碱加成盐，包括具有有机相对离子及无机相对离子的盐，包括两性离子形式，其中若化合物与两种或更多种相对离子结合，则该两种或更多种相对离子可相同或不同；及该化合物的溶剂合物，包括半溶剂合物、单溶剂合物、二溶剂合物等，包括有机溶剂合物及无机溶剂合物，该无机溶剂合物包括水合物；其中若化合物与两种或更多种溶剂分子结合，则该两种或更多种溶剂分子可相同或不同。在一些实施例中，本文对本发明的化合物作出的参考将包括对上述形式(例如，盐和/或溶剂合物)中的一种或多种作出的明确参考；然而，此种参考仅用于强调，且不应理解为排除如上文识别的其他上述形式。
本领域中已知术语“互补决定区”及“CDR”指抗体可变区内的氨基酸的非邻接序列，它们赋予抗原特异性及结合亲和力。一般而言，各重链可变区中具有三(3)个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)及各轻链可变区中具有三(3)个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
给定CDR的精确氨基酸序列边界可使用许多熟知方案中的任何一种易于测定，该方案包括以下描述：Kabat等人，(1991),“热门免疫学蛋白质序列(Sequences of Proteinsof immunological Interest)”，第5版.公共卫生署，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人，(1997)JMB273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996),“抗体-抗原相互作用：接触分析和结合位点拓扑学(Antibody-antigen inteRactions：Contact analysis and binding sitetopogRaphy)”，J.Mol.Biol.262,732-745.(“Contact”编号方案)；LefRanc MP等人，“免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的IMGT独特编号(IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains)”，Dev Comp Immunol,2003Jan；27(1)：55-77(“IMGT”编号方案)及Honegger A与Plückthun A,“免疫球蛋白可变结构域的另一种编号方案：自动建模和分析工具(Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains：an automatic modeling and analysis tool)”，J Mol Biol,2001Jun 8；309(3)：657-70,(AHo编号方案)。
给定CDR的边界可取决于用于识别的方案而变化。例如，Kabat方案基于结构比对，而Chothia方案基于结构信息。用于Kabat及Chothia方案的编号基于最常用的抗体区序列长度，及通过插入字母调适插入物(例如，“30a”)及一些抗体中呈现删除部分。两种方案在不同位置放置某些插入物及删除部分(“插入缺失(indel)”)导致差异性编号。Contact方案基于对复合物结晶结构的分析且在许多方面中类似于Chothia编号方案。下文表V列举如分别通过Kabat、Chothia及Contact方案识别的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的位置。就CDR-H1而言，残基编号使用Kabat及Chothia编号方案给定列表。
因此，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”及该抗体或其区的个别CDR(例如，“CDR-H1、CDR-H2)应了解为涵盖如通过本文描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。在一些情况中，规定用于识别一个或多个特定CDR的方案，例如如通过Kabat、Chothia或Contact方法界定的CDR。在其他情况下，给定CDR的特定氨基酸序列。参见，例如表V。
如本文使用，术语“保守取代”指本领域技术人员已知的氨基酸和/或氨基酸序列的取代且通常可经作出而不改变所得分子的生物活性。本领域技术人员知晓(一般而言)多肽的非必需区域中的单一氨基酸取代不实质改变生物活性(参见，例如，Watson等，《基因的分子生物学》(MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE),The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(1987年第4版))。此类示例性取代优选根据那些列举于表II及表III(a至b)中作出。例如，此类变化包括以异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)及亮氨酸(L)中的任何一种取代这些疏水性氨基酸中的任何另一种；以天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)且反之还然；以谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)且反之还然；及以丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)且反之还然。其他取代还可视为保守的，视特定氨基酸的环境及其于蛋白质的三维结构中的作用而定。例如，甘氨酸(G)及丙氨酸(A)可经常可互换使用，如丙氨酸(A)及缬氨酸(V)可经常可互换使用。相对疏水的甲硫氨酸(M)可经常与亮氨酸及异亮氨酸可互换使用，且有时可与缬氨酸可互换使用。赖氨酸(K)及精氨酸(R)在其中氨基酸残基的显著特征为其电荷及这些两种氨基酸残基的相异pK不显著的位置中可经常可互换使用。在特定环境中，其他变化可视为“保守”(参见，例如本文的表III(a)，第13至15页，生物化学“Biochemistry”，第2版，Lubert Stryer编，(StanfordUniversity)；Henikoff等人，PNAS 1992，第89卷，第10915至10919页；Lei等人，J BiolChem，1995年5月19日；270(20)：11882-6)。还允许其他取代且可根据经验或根据已知保守取代判定。
术语“细胞毒剂”指抑制或预防细胞的表达活性、细胞的功能和/或引起细胞的破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素、化学治疗剂及毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段和/或变体)。细胞毒剂的实施例包括(但不限于)奥瑞司他汀(例如，奥瑞司他汀E、奥瑞司他汀F、MMAE及MMAF)、金霉素、类美登素、蓖麻毒蛋白(ricin)、蓖麻毒蛋白A链、考布他汀(combrestatin)、多卡米新(duocarmycin)、海兔毒素、多柔比星、道诺霉素(daunorubicin)、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthRacin dione)、放线菌素、白喉毒素(diphtheria toxin)、假单胞菌属外毒素(Pseudomonas exotoxin)(PE)A、PE40、相思子素(abrin)、相思子素A链、蒴莲根毒素A链(modeccin A chain)、α-八叠球菌、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)、麻风树毒蛋白(curicin)、巴豆毒蛋白(crotin)、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonariaofficinalis)抑制剂及糖皮质素(glucocorticoid)及其他化学治疗剂，及放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或Bi213、P32、Lu的放射性同位素(包括Lu177)和本发明表示为AGD-0182的毒素。
抗体(包括本发明的抗体)还可偶联至前述细胞毒剂中的任何一种且还可偶联至可使前药转化为其活性形式的抗癌前药活化酶。
如本文使用，术语“双功能抗体”指具有两种抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含连接至相同多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于无法在相同链上的两个结构域间配对的接头，迫使该结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双功能抗体更完整地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48(1993)中。
术语“耗尽”在FLT3结合剂对FLT3表达细胞的效应的内容中指减少FLT3表达细胞的数量或消除FLT3表达细胞。出于本发明的目的，FLT3，也称为Fms样酪氨酸激酶3受体，还称为Flk2(胎肝激酶2)、STK1(干细胞酪氨酸激酶1)及CD135)是III型受体酪氨酸激酶(RTK)中的一员。人类FLT3编码具有993个氨基酸的长度的RTK，其包含具有五个类免疫球蛋白胞外结构域及两个通过激酶插入结构域连接的胞内酪氨酸激酶结构域(TKD)的膜结合受体(Stirewalt D L等人；Nat Rev Cancer；650-665(2003)。人类FLT3基因(Gene ID No.：2322(国家生物技术信息中心))位于染色体13q12上并与小鼠FLT3共享85％的氨基酸序列同源性(Rosnet O等；Oncogene 8：173-179(1993)。FLT3表达于正常骨髓性及类淋巴性祖代细胞中且还表达于70-90％AML患者的白血病性细胞(Carow,C.E等；Blood 87：1089-1096(1996)；Rosnet O等；Leukemia 10：238-248(1996)且还表达于ALL中。
本文使用术语“基因产物”以指示肽/蛋白质或mRNA。例如，本文中“本发明的基因产物”有时指“癌症氨基酸序列”、“癌症蛋白质”、“表I中所列癌症的蛋白质”、“癌症mRNA”、“表I中所列癌症的mRNA”等。在一个实施方式中，该癌症蛋白质通过图1的核酸编码。该癌症蛋白质可为片段，或者可为通过图1的核酸编码的全长蛋白质。在一个实施方式中，癌症氨基酸序列用以测定序列同一性或相似性。在另一实施方式中，该序列通过图1的核酸编码的蛋白质的天然生成的等位基因变体。在另一实施方式中，该序列是如本文进一步描述的序列变体。
“杂偶联物”抗体适用于本发明方法及组合物中。如本文使用，术语“杂偶联物抗体”指两个共价连接的抗体。此类抗体可使用合成蛋白化学中的已知方法制得，包括使用交联剂。参见，例如，美国专利案第4,676,980号。
术语“同源物”指通过例如在相应位置具有相同或类似的化学残基的序列而对另一分子显示同源性的分子。
术语“相同”或“序列一致性”指示当经用适当的插入或删除的优化比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列间的一致性程度。
两个序列间的“一致性百分比”是由该序列共享的相同位置的数量的函数(即，一致性％＝相同位置的数量/总位置数量乘以100)，需考虑间隙的数量，及各间隙的长度，它们需引入以用于两个序列的优化比对。序列的比较及两个序列间的一致性百分比的测定可使用如下文描述的数学算法完成。
两个核苷酸序列间的一致性百分比可使用GCG软件程序包中的GAP程序，使用NWSgapdna测定。CMP矩阵及间隙权重40、50、60、70或80且长度权重1、2、3、4、5或6。两个核苷酸或氨基酸序列间的一致性百分比还可使用Meyers等人，Comput.Appi.Biosci.,4：11-17(1988)的算法测定，该算法已并入ALIGN程序(版本2.0)中，该程序使用PAM120重量残差表、间隙长度罚分12及间隙罚分4。另外，两个氨基酸序列间的一致性百分比可使用Needleman等人，J.Mol.Biol.48：444-453(1970)算法测定，该算法已并入GCG软件程序包的GAP程序中，该程序使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵及间隙权重16、14、12、10、8、6或4及长度权重1、2、3、4、5或6。
例如，多核苷酸序列可与参考多核苷酸序列相同(即，100％相同于参考序列)，或其相较于参考序列可包括多达某一整数量的核苷酸改变，例如至少50、60、70、75、80、85、90、95、98或99％一致性。此类改变选自至少一种核苷酸删除、取代(包括转化及颠换)或插入，且其中该改变可发生于参考核苷酸序列的5'或3'端位置或发生于那些端位置间的任何位置，或者个别地穿插于参考序列中的核苷酸间或参考序列内的一个或多个连续性基团间。核苷酸改变的数量通过将如本文描述的参考多核苷酸序列中的核苷酸的总数乘以各自一致性百分比(除以100)的数值百分比并自参考多核苷酸序列中的核苷酸的该总数减去该乘积测得，或：n.sub.n.ltoreq.x.sub.n-(x.sub.ny)，其中n.sub.n为核苷酸改变的数量，x.sub.n是如本文描述的参考多核苷酸序列中的核苷酸的总数(参见用于示例性参考多核苷酸序列的“序列表”中的核酸序列)，且y针对50％为0.50；针对60％为0.60；针对70％为0.70；针对75％为0.75；针对80％为0.80；针对85％为0.85；针对90％为0.90；针对95％为0.95；针对98％为0.98；针对99％为0.99或针对100％为1.00，y为用于乘法运算符的标志，且其中x.sub.n与y的任何非整数乘积四舍五入为最接近的整数，接着将其自x.sub.n中减去。
类似地，多肽序列可与如本文描述的多肽参考序列相同(参见用于示例性参考多肽序列的“序列表”中的氨基酸序列)(即，100％相同)，或其相较于参考序列可包括多达某一整数量的氨基酸改变以使得该一致性％小于100％，例如至少50、60、70、75、80、85、90、95、98或99％相同。此类改变选自：至少一种氨基酸删除、取代(包括保守取代或非保守取代)或插入，且其中该改变可发生于参考多肽序列的氨基端或羧基端位置或发生于那些端位置间的任何位置，或个别地穿插于参考序列中的氨基酸间或参考序列内的一个或多个连续性基团间。给定一致性％的氨基酸改变的数量通过将由多肽参考序列编码的多肽序列中的氨基酸的总数乘以各自一致性百分比(除以100)的数值百分比及然后自如本文描述的多肽参考序列(参见，例如SEQ ID NO：1至21)中的氨基酸的该总数中减去该乘积来测定，或：n.sub.a.ltoreq.x.sub.a-(x.sub.ay)，其中n.sub.a为氨基酸改变的数量，x.sub.a为参考多肽序列中的氨基酸的总数，及y针对50％为0.50；针对60％为0.60；针对70％为0.70；针对75％为0.75；针对80％为0.80；针对85％为0.85；针对90％为0.90；针对95％为0.95；针对98％为0.98；针对99％为0.99或针对100％为1.00，y为用于乘法运算符的标志，且其中x.sub.a与y的任何非整数乘积在将其自x.sub.a中减去前四舍五入为最接近的整数。
一致性百分比可跨序列长度测定。如本文定义，术语“超过75％一致性”包括超过75％、80％、85％、95％及99％一致性及所有在此范围中的离散值及离散子范围。
在一个实施方式中，本文提供的抗体是“人类抗体”。如本文使用，术语“人类抗体”指其中基本上轻链及重链序列的全部序列(包括互补决定区(CDR))来自人类基因的抗体。在一个实施方式中，人类单抗通过三源杂交瘤(trioma)技术、人类B细胞技术(参见，例如，Kozbor等人，Immunol.Today 4：72(1983)、EBV转化技术(参见，例如，Cole等人，MONOCLONALANTIBODIES AND CANCER THERaPY 77-96(1985))或使用噬菌体展示(参见，例如，Marks等人，J.Mol.Biol.222：581(1991))制得。在一具体实施例中，该人类抗体产生于转基因小鼠中。用于制备此类部分至完全人类抗体的技术本领域中已知且可使用任何此类技术。根据一项特别优选实施方式，完全人类抗体序列在经改造以表达人类重链及轻链抗体基因的转基因小鼠中制备。制备产生人类抗体的转基因小鼠及其子代的示例性描述参见申请第WO02/43478号及美国专利案6,657,103(Abgenix)。产生所需抗体的转基因小鼠的B细胞然后可经融合以制备用于该抗体的连续产生的杂交瘤细胞系。参见，例如，美国专利案第5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016及5,545,806号及Jakobovits,Adv.DrugDel.Rev.31：33-42(1998)、Green等人，J.Exp.Med.188：483-95(1998)。
如本文使用，术语“人源化抗体”指含有来自非人类(例如，鼠类)抗体及人类抗体的序列的抗体的形式。此类抗体为含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。一般而言，该人源化抗体将包含基本所有至少一个及通常两个可变结构域，其中所有或基本所有高可变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环且所有或基本所有FR区为人类免疫球蛋白序列的FR区。该人源化抗体任选还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人类免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区。参见例如，Cabilly美国专利号4,816,567；Queen等(1989)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033；和ANTIBODY ENGINEERING:APRaCTICAL APPROACH(《抗体工程：实践方法》)(牛津大学出版社(Oxford UniversityPress)1996)。
如本文使用的术语“抑制”表示以可测量的量减少或彻底预防。
词组“分离”或“生物纯”指材料基本或基本上不含当该材料以天然状态发现时通常伴随该材料的组分。因此，本发明的经分离肽优选不含有在它们原位环境中通常与该肽结合的材料。例如，当多核苷酸基本与对应于或互补于除FLT3基因外的基因或编码除FLT3基因产物或其片段外的多肽的污染物多核苷酸分离时，认为该多核苷酸经“分离”。本领域技术人员可易于采用核酸分离程序以获得经分离FLT3多核苷酸。例如，当采用物理、机械或化学方法以自通常与蛋白质结合的细胞成分中移除FLT3蛋白时，认为该蛋白质经“分离”。本领域技术人员可易于采用标准纯化方法以获得经分离FLT3蛋白。或者，可通过化学方式制得经分离蛋白。
合适的“标记”包括放射性核素、酶、基质、辅助因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁粒子及类似物。教导此类标记的用途的专利案包括美国专利案第3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149及4,366,241号。另外，本文提供的抗体可用作含氟体的抗原结合组分。参见，例如，Zeytun等人，Nat.Biotechnol.21：1473-79(2003)。
术语“哺乳动物”指归类为哺乳动物的任何生物体，包括小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马及人类。在本发明的一个实施方式中，该哺乳动物为小鼠。在本发明的另一实施方式中，该哺乳动物为人类。
术语“转移性癌症”及“转移性疾病”表示已扩散至区域性淋巴结或扩散至较远部位的癌症，且它们表示包括在根据AUA系统的D期疾病及在根据TNM系统的TxNxM+期。
如本文使用的术语“经修饰”指存在对天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的改变。此类改变或修饰可通过天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的合成后修饰或通过天然氨基酸、非天然氨基酸、天然氨基酸多肽或非天然氨基酸多肽的翻译后修饰获得。
如本文使用的术语“调节剂”或“测试化合物”或“药物候选物”或语法性等同物描述待用于测试直接或间接改变癌症表型或癌症序列(例如，核酸或蛋白质序列)的表达或癌症序列的效应(例如，发信号、基因表达、蛋白质相互作用等)的能力的任何分子(例如，蛋白质、寡肽、有机小分子、多糖、多核苷酸等)。在一个方面中，调节剂将中和本发明的癌症蛋白质的效应。关于“中和”，其表示抑制或阻断蛋白质的活性及对该细胞的后续效应。在另一方面中，调节剂将通过标准化该蛋白质的含量来中和本发明的基因及其相应蛋白质的效应。在优选实施方式中，调节剂改变表达分布或本文提供的表达分布核酸或蛋白质或下游效应路径。在一个实施方式中，该调节剂将癌症表型抑制(例如)至正常组织指纹。在另一实施方式中，调节剂诱发癌症表型。通常，多种分析混合物以不同药剂浓度平行操作以获得对各种浓度的差异反应。通常，这些浓度中的一种充当阴性对照，即，以零浓度或低于检测的浓度。
调节剂、药物候选物或测试化合物涵盖许多化学类别，然而通常它们为有机分子，优选为具有大于100并小于约2,500道尔顿的分子量的小有机化合物。优选的小分子为小于2000或小于1500或小于1000或小于500D。候选物药剂包含与蛋白质进行结构性相互作用(具体地，氢键结合)所必需的官能基且通常包括至少一个氨基、羰基、羟基或羧基，优选该化学官能基中的至少两种。该候选物药剂通常包含环碳或杂环结构和/或经上述官能基中的一种或多种取代的芳族或聚芳族结构。调节剂还包含生物分子，例如肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构性类似物或其组合。特别优选为肽。调节剂的一种类别为肽，例如具有约5个至约35个氨基酸，具有约5个至约20个氨基酸优选，且具有约7个至约15个氨基酸特别优选。优选地，该癌症调节蛋白为可溶，包括非跨膜区，和/或具有N端Cys以促进溶解。在一个实施方式中，该片段的C端保持为游离酸及N端为游离胺以促进偶联，即，偶联至半胱氨酸。在一个实施方式中，本发明的癌症蛋白质结合至如本文讨论的免疫原性药剂。在一个实施方式中，该癌症蛋白质结合至BSA。本发明的肽(例如，具有优选长度的肽)可彼此相连或连接至其他氨基酸以产生较长的肽/蛋白质。该调节肽可为如上文概述的天然生成蛋白质的消化物、随机肽或“偏向性”随机肽。在一优选实施方式中，基于肽/蛋白质的调节剂是如本文定义的抗体及其片段。
如本文使用，术语“单抗”指获得自基本同源性抗体的群体的抗体，即，包含除可少量存在的可能天然生成突变外相同的群体的个别抗体。单抗为高度特异性的、导向单一抗原性表位。对比之下，常规(多克隆)抗体制剂通常包括大量导向不同表位(或对不同表位具有特异性)的抗体。在一个实施方式中，该多克隆抗体含有多种在含有多种抗原性表位的单一抗原内具有不同表位特异性、亲和力或结合性的单抗。修饰词“单株”指示抗体的特征为获得自抗体的基本同源性群体，且不应理解为需通过任何特定方法产生该抗体。例如，待根据本发明使用的单抗可首先通过Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法制得，或可通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利案第4,816,567号)制得。该“单抗”还可(例如)使用Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述的技术分离自噬菌体抗体库。这些单抗将通常以至少约1μM，更通常至少约300nM，通常至少约30nM，优选至少约10nM，更优选至少约3nM或更大的Kd结合，该Kd通常通过ELISA测得。
如本文使用，术语“单抗”指获得自基本同源性抗体的群体的抗体，即，包含除可少量存在的可能天然生成突变外相同的群体的个别抗体。单抗为高度特异性的、导向单一抗原性表位。对比之下，常规(多克隆)抗体制剂通常包括大量导向不同表位(或对不同表位具有特异性)的抗体。在一个实施方式中，该多克隆抗体含有多种在含有多种抗原性表位的单一抗原内具有不同表位特异性、亲和力或结合性的单抗。修饰词“单株”指示抗体的特征为获得自抗体的基本同源性群体，且不应理解为需通过任何特定方法产生该抗体。例如，待根据本发明使用的单抗可首先通过Kohler等人，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法制得，或可通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利案第4,816,567号)制得。该“单抗”还可(例如)使用Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述的技术分离自噬菌体抗体库。这些单抗将通常以至少约1μM，更通常至少约300nM，通常至少约30nM，优选至少约10nM，更优选至少约3nM或更大的Kd结合，该Kd通常通过ELISA测得。
“非天然氨基酸”或另外写为“nnAA”指非二十(20)种常见氨基酸或焦赖氨酸或硒半胱氨酸中的一种的氨基酸。可与术语nnAA同义使用的其他术语为“非天然编码的氨基酸”、“非天然氨基酸”、“非天然生成的氨基酸”。另外，术语nnAA包括(但不限于)非天然生成的氨基酸且可合成获得或可通过非天然氨基酸的修饰获得的氨基酸。例如，出于本发明的目的，对乙酰基苯丙氨酸视为nnAA。
术语“对乙酰基苯丙氨酸”或“pAF”表示如通过以下化学结构表示的3-(4-乙酰基苯基)-2-氨基丙酸：
“药物赋形剂”包含例如辅助剂、载剂、pH调节剂及缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、防腐剂等材料。
“药学上可接受”指非毒性、惰性的和/或与人类或哺乳动物可生理性兼容的组合物。
术语“多核苷酸”表示具有至少10个碱基或碱基对长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式或任一类型核苷酸的经修饰形式，且其表示包括DNA和/或RNA的单链及双链形式。在本领域中，此术语通常与“寡核苷酸”可互换使用。多核苷酸可包含本文揭示的核苷酸序列，其中如图1中的实施例显示的胸苷(T)还可为尿嘧啶(U)；此定义适用于在DNA与RNA的化学结构间的差异，具体地，经观察，RNA中的四个主要碱基中的一种为尿嘧啶(U)而非胸苷(T)。
术语“多肽”表示具有至少约4、5、6、7或8个氨基酸的聚合物。在整个说明书中，使用用于氨基酸的标准三个字母(参见，表III)或单一字母命名。在本领域中，此术语通常与“肽”或“蛋白质”可互换使用。
“重组”DNA或RNA分子为已经受体外分子操作的DNA或RNA分子。
如本文使用，术语“单链Fv”或“scFv”或“单链”抗体指包含抗体的VH及VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，该Fv多肽进一步包含在VH与VL结构域间的多肽接头，其使得sFv形成用于抗原结合所需的结构。有关sFv的综述参见Pluckthun，THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES(《单克隆抗体的药理学》)，第113卷，Rosenburg及Moore编，纽约Springer-Verlag出版社，第269至315页(1994)。
如本文使用，术语“特异性”、“特异性结合”及“特异结合”指抗体选择性结合至靶抗原表位。可通过在一组给定条件下比较结合至适当的抗原与结合至无关抗原或抗原混合物测试抗体的结合特异性。若该抗体结合至适当的抗原至少2、5、7及优选10倍于结合至无关抗原或抗原混合物，则认为该抗体为特异性的。在一个实施方式中，特异性抗体为仅结合FLT3抗原但不结合至无关抗原的抗体。在另一实施方式中，特异性抗体为结合人类FLT3抗原但不结合与FLT3抗原具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的氨基酸同源性的非人类FLT3抗原的抗体。在另一实施方式中，特异性抗体为结合人类FLT3抗原但不结合与FLT3抗原的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大一致性百分比的非人类FLT3抗原的抗体。在另一实施方式中，特异性抗体为结合人类FLT3抗原及结合鼠类FLT3抗原，但结合人类抗原的程度更大的抗体。在另一实施方式中，特异性抗体为结合人类FLT3抗原及结合灵长类动物FLT3抗原，但结合人类抗原的程度更大的抗体。在另一实施方式中，该特异性抗体结合至人类FLT3抗原及任何非人类FLT3抗原，但结合人类抗原或其任何组合的程度更大。
如本文使用，“以治疗”或“治疗性”及语法相关术语指疾病的任何结果的任何改善，例如延长的存活率、较小的发病率和/或作为替代治疗方法的副产物的副作用降低；如本领域中易于了解，完全根除疾病虽非治疗行为的要求，但优选。
术语“变体”指显示自所述类型或正常型变异的分子，例如在明确描述的蛋白质(例如，显示于图1中的FLT3蛋白)的相应位置具有一个或多个不同氨基酸残基的蛋白质。类似物为变体蛋白的实施例。接合异构体及单核苷酸多态型(SNP)为变体的其他实施例。
本发明的“FLT3蛋白”和/或“FLT3相关蛋白”包括本文明确识别的那些(参见，图1)及遵循本文概述的方法或本领域中易于获得的方法不经过度实验下即可分离/产生及表征的等位基因变体、保守取代变体、类似物及同源物。还包括组合不同FLT3蛋白或其片段的部分的融合蛋白，以及FLT3蛋白与异源性多肽的融合蛋白。此类FLT3蛋白共同称为FLT3相关蛋白、本发明的蛋白质或FLT3。术语“FLT3相关蛋白”指具有以下数目氨基酸的多肽片段或FLT3蛋白序列：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或多于25个氨基酸；或至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、991、992或993或更多个氨基酸。
II.)FLT3抗体
本发明的另一方面提供结合至FLT3相关蛋白(参见图1)的抗体。在一个实施方式中，该结合至FLT3相关蛋白的抗体为特异性结合至包含SEQ ID NO.：2的氨基酸序列的FLT3蛋白的抗体。该特异性结合至包含SEQ ID NO.：2的氨基酸序列的FLT3蛋白的抗体包括可结合至其他FLT3相关蛋白的抗体。例如，结合包含SEQ ID NO.：2的氨基酸序列的FLT3蛋白的抗体可结合例如FLT3变体及其同源物或类似物的FLT3相关蛋白。
本发明的FLT3抗体尤其适用于癌症(参见，例如，表I)预后分析、成像、诊断及治疗方法。在一个实施方式中，本文揭示的FLT3结合分析用于癌症的检测中，例如，用于免疫分析中。类似地，此类抗体(例如，当与治疗剂组合于ADC中时)适用于急性骨髓性白血病(“AML”)及急性淋巴母细胞性白血病(ALL)及其他癌症的治疗和/或预后，达到FLT3还在这些其他癌症中表达或过表达的程度。此外，细胞内表达的抗体(例如，单链抗体)在治疗上适用于治疗其中涉及FLT3表达的癌症，例如晚期或转移性AML或ALL癌症或其他晚期或转移性癌症。
本领域中熟知用于制备抗体(具体而言，单抗)的各种方法。例如，抗体可通过使用FLT3相关蛋白、肽或片段(以分离或免疫偶联形式)，免疫合适的哺乳动物宿主来制备(《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual),CSH出版社，Harlow与Lane(1988)；Harlow,《抗体》(Antibodies)，纽约冷泉港实验室出版社(1989))。另外，还可使用FLT3的融合蛋白，例如FLT3GST-融合蛋白。在一特定的实施方式中，产生包含图1的氨基酸序列的全部或大部分的GST融合蛋白，且然后用作免疫原以产生适当的抗体。在另一实施方式中，合成FLT3相关蛋白并用作免疫原。
另外，使用本领域中已知的裸DNA免疫技术(有或无经纯化的FLT3相关蛋白或FLT3表达细胞)以产生对经编码的免疫原的免疫反应(参考Donnelly等人，1997,Ann.Rev.Immunol.15：617-648)。
可分析如显示于图1中的FLT3蛋白的氨基酸序列以选择FLT3蛋白的特异性区以用于产生抗体。例如，FLT3氨基酸序列的疏水性及亲水性分析用以识别FLT3结构中的亲水性区。FLT3蛋白的显示免疫原性结构的区及其他区与结构域可使用本领域中已知的各种其他方法例如Chou-Fasman、Garnier-Robson、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schultz或Jameson-Wolf分析易于识别。亲水性概况可使用Hopp,T.P.及Woods,K.R.,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828的方法产生。水疗性(Hydropathicity)概况可使用Kyte,J.及Doolittle,R.F.,1982,J.Mol.Biol.157：105-132的方法产生。可及残基百分比(％)概况可使用Janin J.,1979,Nature 277：491-492的方法产生。平均可挠性概况可使用Bhaskaran R.,Ponnuswamy P.K.,1988,Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255的方法产生。β-转角概况可使用Deleage,G.,Roux B.,1987,Protein Engineering 1：289-294的方法产生。因此，通过这些程序或方法中的任何一种所识别的各区域在本发明的范围内。用于产生FLT3抗体的优选方法以文中提供的实施例方式进一步说明。本领域中熟知用于制备作为免疫原使用的蛋白质或多肽的方法。本领域中还熟知用于制备具有蛋白质与载剂(例如BSA、KLH或其他载体蛋白)的免疫原性组合物的方法。在一些情况下，使用直接结合，使用例如碳二亚胺试剂；在其他情况下，连接试剂(例如由Pierce Chemical Co.,Rockford,IL供应的那些)为有效的。如本领域中了解，FLT3免疫原的给予通常通过注射一段合适的时间并使用合适的辅助剂进行。在免疫时间表期间，可获得抗体的效价以测定抗体形成的充分性。
FLT3单抗可通过本领域中熟知的各种方式制备。例如，分泌所需单抗的永生化细胞使用产生抗体的B细胞永生化的Kohler及Milstein的标准杂交瘤技术或修饰来制备，如通常已知。通过其中抗原为FLT3相关蛋白的免疫分析筛选分泌所需抗体的永生化细胞系。当识别经适当永生化细胞培养物时，该细胞可扩增且自体外培养物或自腹水流体产生抗体。
本发明的抗体或片段还可通过重组方式产生。特异性结合至FLT3蛋白的所需区域的区域还可产生于多物种起源的嵌合性或互补决定区(CDR)接枝抗体的情况。还可产生人源化或人类FLT3抗体且优选用于治疗性情况。通过以一种或多种非人类抗体CDR取代相应人类抗体序列而使鼠类及其他非人类抗体人源化的方法熟知(参见，例如，Jones等，1986,Nature 321：522-525；Riechmann等，1988,Nature 332：323-327；Verhoeyen等，1988,Science 239：1534-1536)。还参见Carter等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285及Sims等，1993,J.Immunol.151：2296。
在一优选实施方式中，本发明的人类单抗可使用VelocImmune小鼠制备，在该小鼠中，在免疫球蛋白重链(VH、DH及JH区段)和/或κ轻链(VK及JK)基因座处具有内源性小鼠可变区段的基因组序列已全部或部分被具有人类免疫球蛋白重链(VH、DH及JH)和/或κ轻链(VK及JK)基因座(Regeneron,Tarrytown,NY)的未经重排的种系可变嵌段的人类基因组序列置换。参见，例如，美国专利案第6,586,251、6,596,541、7,105,348、6,528,313、6,638,768及6,528,314号。
另外，本发明的人类抗体可使用HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)产生，该HuMAb小鼠含有编码未经重排的人类重链(μ及γ)及κ轻链免疫球蛋白序列的人类免疫球蛋白基因迷你基因座(miniloci)，以及使内源性μ及κ链基因座失活的靶向突变(参见，例如，Lonberg等人，(1994)Nature 368(6474)：856-859)。
在另一实施方式中，本发明的完全人类抗体可使用于转基因及转染色体上载有人类免疫球蛋白序列的小鼠(例如载有人类重链转基因及人类轻链转染色体的小鼠)来培育。本文将此类小鼠称为“KM小鼠”，此类小鼠描述于Tomizuka等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727及Tomizuka等人的PCT公开案WO 02/43478中。
本发明的人类单抗还可使用用于筛选人类免疫球蛋白基因库的噬菌体展示方法制备。本领域中建立用于分离人类抗体的此类噬菌体展示方法。参见，例如Ladner等人的美国专利案第5,223,409；5,403,484及5,571,698号；Dower等人的美国专利案第5,427,908及5,580,717号；McCafferty等人的美国专利案第5,969,108及6,172,197号及Griffiths等人的美国专利案第5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915及6,593,081号。
本发明的人类单抗还可使用已将人类免疫细胞重新组构于其中以使得可在免疫后产生人类抗体反应的SCID小鼠来制备。此类小鼠描述于(例如)Wilson等人的美国专利案第5,476,996及5,698,767号中。
另外，本发明的人类抗体可以使用针对抗体产生失活、用称为Xenomouse(AmgenFremont,Inc.,formerly Abgenix,Inc.)的人类重链及轻链基因座改造的转基因小鼠的技术来制备。制备产生人类抗体的转基因小鼠的示例性描述可参见U.S.6,657,103。还参见美国专利案第5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016及5,545,806号；及Mendez等人，Nature Genetics,15：146-156(1998)；Kellerman,S.A.&Green,L.L.,Curr.Opin.Biotechnol 13,593-597(2002)。
上述产生方法中的任何一种导致具有一定结合FLT3、或相对于FLT3具有85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的序列一致性的同源物或片段或多肽序列的能力的抗体。该抗体、其结合片段及包含其的抗体药物偶联物针对FLT3的结合亲和力(KD)可为1mM或更小、100nM或更小、10nM或更小、2nM或更小或1nM或更小。或者，该KD可为5至10nM；或1至2nM。该KD可为1微摩尔至500微摩尔或可为500微摩尔至1nM。
该抗原结合蛋白的结合亲和力通过结合常数(Ka)及解离常数(Kd)(KD＝Kd/Ka)测定。该结合亲和力可通过BIACORE例如通过将测试抗体捕获于经蛋白A涂布的传感器表面上并使FLT3在此表面上流动来测量。或者，该结合亲和力可通过FORTEBIO例如以将测试抗体受体捕获于经涂布蛋白A的针上并使FLT3在此表面上流动来测量。本领域技术人员可识别本领域中已知的其他合适的分析以测量结合亲和力。
术语“特异性结合”(如本文使用关于抗原结合)蛋白质表示该抗原结合蛋白结合至FLT3及FLT3内的离散结构域或离散氨基酸序列而不结合或非显著结合至其他(例如，无关)蛋白质。然而，此术语不排除抗体或其结合片段还可与紧密相关分子交叉反应的事实。本文描述的抗体及其片段及包含这些抗体的抗体药物偶联物可以相较于它们结合至紧密相关分子的亲和力大至少2、5、10、50、100或1000倍的亲和力特异性结合至FLT3。
在一优选实施方式中，本发明的FLT3 MAb包含通过根据美国菌种保存中心(ATCC)登录号：PTA-121831(参见，图3A和/或3B)保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的命名为CHv62.21的抗体的重链及轻链可变区，或包含与CHv62.21的重链及轻链可变区的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重链及轻链可变区，且其中该抗体保留本发明的FLT3 MAb的所需功能性质。CHv62.21的重链可变区由自SEQ ID NO：9的第1个残基(E)至第123个残基(S)范围内的氨基酸序列组成，及CHv62.21的轻链可变区由SEQ ID NO：10的第1个残基(D)至第108个残基(R)范围内的氨基酸序列组成。CHv62.21的重链可变区的CDR1-3(Kabat)由分别自SEQ ID NO：9的31至35范围内；自50至65范围内及自95至102范围内的氨基酸序列组成，及CHv62.21的轻链可变区的CDR1-3(Kabat或Chothia)由分别自SEQ ID NO：10的24至34范围内；自50至56范围内及自89至97范围内的氨基酸序列组成(参见，图4及表V)。就本发明的抗体的恒定区而言，可选择恒定区的任何子类别。在一个实施方式中，可使用人类IgG1恒定区作为该重链恒定区及人类Igκ恒定区作为该轻链恒定区。
例如，本发明提供经分离单抗或其抗原结合部分，其包含重链可变区及轻链可变区，其中：(a)该重链可变区包含与如图3A和/或3B中阐述的重链可变区氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；及(b)该轻链可变区包含与如图3A和/或3B中阐述的轻链可变区氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
在其他实施方式中，该VH和/或VL氨基酸序列与图3A和/或3B中阐述的VH及VL序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。本发明还提供编码a或b或图3A和/或3B中阐述的VH或VL序列的多核苷酸或核酸及与这些85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的多核苷酸或核酸。
在另一实施方式中，本发明提供经分离单抗或其抗原结合部分，其包含人源化重链可变区及人源化轻链可变区，其中：(a)该重链可变区包含具有图3A和/或3B中阐述的重链可变区CDR的氨基酸序列的互补决定区(CDR)；(b)该轻链可变区包含具有图3A和/或3B中阐述的轻链可变区CDR的氨基酸序列的CDR。
本发明的经改造的抗体包括其中已对VH和/或VL内的框架残基作出修饰(例如，以改善抗体的性质)的那些。通常作出此类框架修饰以减小抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“突变回(backmutate)”至相应的种系序列。更具体而言，已经历体细胞突变的抗体可含有不同于衍生该抗体的种系序列的框架残基。此类残基可通过比较抗体框架序列与衍生该抗体的种系序列识别。为使框架区序列返回至它们的种系构造，该体细胞突变可通过(例如)定点突变形成或PCR介导的突变形成“突变回”至种系序列(例如，自亮氨酸“突变回”至甲硫氨酸)。此类经“突变回”的抗体还旨在包本发明内。
另一类型的框架修饰涉及在框架区内或甚至在一个或多个CDR区内突变一个或多个残基，以移除T细胞表位，从而减小抗体的潜在免疫原性。此方法还称为“去免疫”并详细描述于Carr等人的美国专利公开案第2003/0153043号中。
另外或或者为在框架或CDR区内进行修饰，本发明的抗体可经改造以包括Fc区内的修饰，通常改变抗体的一种或多种功能性质，例如血清半衰期、补体固定(complementfixation)、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的FLT3 MAb可经化学修饰(例如，可将一个或多个化学部分结合至抗体)或经修饰以改变其糖基化，再改变MAb的一种或多种功能性质。这些实施方式中的每种详细描述于下文中。
在一个实施方式中，CH1的铰链区经修饰以使得该铰链区中的半胱氨酸残基的数量得到改变(例如，增加或减少)。此方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利案第5,677,425号中。CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数量经改变(例如)以促进轻链及重链的组装或增加或减小FLT3 MAb的稳定性。
在另一实施方式中，抗体的Fc铰链区经突变以减小FLT3 MAb的生物半衰期。更具体而言，将一种或多种氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域接口区内以使得该抗体相对于天然Fc铰链结构域SpA结合已损害葡萄球菌蛋白A(Staphylococcyl protein A)(SpA)结合。此方法进一步详细描述于Ward等人的美国专利案第6,165,745号。
在另一实施方式中，该FLT3 MAb经修饰以增加其生物半衰期。各种方法是可能的。例如，突变可根据Ward的美国专利案第6,277,375号中描述来引入。或者，为增加生物半衰期，该抗体可于CH1或CL区内经改变以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利案第5,869,046及6,121,022号中描述。
在其他实施方式中，该Fc区通过以不同氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基以改变FLT3 MAb的效应功能而加以改变。例如，一个或多个选自氨基酸特异性残基的氨基酸可经不同氨基酸残基置换以使得该抗体对效应配体具有经改变的亲和力但保留亲代抗体的抗原结合能力。亲和力经改变的效应配体可为(例如)Fc受体或补体的C1组分。此方法进一步详细描述于Winter等人的美国专利案第5,624,821及5,648,260号中。
在另一实施方式中，重链通过由Ambrx(La Jolla,CA)开发的ReCODE技术以非天然氨基酸置换至少一个氨基酸残基而加以改变。非天然氨基酸的一个实施例是对乙酰基苯丙氨酸。
FLT3抗体与FLT3相关蛋白的反应性可通过许多熟知方法(包括西方墨点转渍法、免疫沈淀法、ELISA及FACS分析)适当时使用FLT3相关蛋白、FLT3表达细胞或其萃取物建立。FLT3抗体或其片段可用可检测标记标记或结合至第二分子。合适的可检测标记包括(但不限于)放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。此外，对两种或更多种FLT3表位具有特异性的双特异性抗体使用本领域中通常已知的方法产生。同源二聚抗体还可使用本领域中已知的交联技术产生(例如，Wolff等人，CancerRes.53：2560-2565)。
在又另一优选实施方式中，本发明的FLT3 Mab是包含命名为CHv62.21的抗体的重链及轻链的抗体。CHv62.21的重链由自SEQ ID NO：9的第1个残基(E)至第453个残基(K)范围内的氨基酸序列组成及CHv62.21的轻链由自SEQ ID NO：10序列的第1个残基(D)至第214个残基(C)范围内的氨基酸序列组成。其序列阐述于图2A和/或2B及图3A和/或3B中。在一优选实施方式中，CHv62.21以非天然氨基酸(“nnAA”)修饰并偶联至细胞毒剂。在一个实施方式中，该nnAA是pAF。在一优选实施方式中，该细胞毒剂在nnAA处特异性偶联。
在又另一实施方式中，本发明的FLT3 Mab通过产生抗体或抗原结合片段的方法来产生，该方法包括培养宿主细胞以容许抗体或抗原结合片段的表达，其中该宿主细胞选自由以下(a)至(c)组成的群：(a)包含含有编码由自SEQ ID NO：9的第1个E至第123个S范围内的氨基酸序列组成的重链可变区的碱基序列的多核苷酸及含有编码由自SEQ ID NO：10的第1个D至第108个R范围内的氨基酸序列组成的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转染宿主细胞；(b)包含含有编码由自SEQ ID NO：9的第1个E至第123个S范围内的氨基酸序列组成的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体及包含含有编码由自SEQ IDNO：10的第1个D至第108个R范围内的氨基酸序列组成的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞；及(c)包含含有编码由自SEQ ID NO：9的第1个E至第123个S范围内的氨基酸序列组成的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞及包含含有编码由自SEQ ID NO：10的第1个D至第108个R范围内的氨基酸序列组成的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞。
在又另一实施方式中，本发明的FLT3 MAb通过产生抗体的方法来产生，该方法包括培养宿主细胞以容许抗体的表达，其中该宿主细胞选自由以下(a)至(c)组成的群：(a)包含含有编码由自SEQ ID NO：9的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链的碱基序列的多核苷酸及包含含有编码由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞；(b)包含含有编码由自SEQ ID NO：9的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体及包含含有编码由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞；及(c)包含含有编码由自SEQ ID NO：9的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞及包含含有编码由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞。
产生命名为CHv62.21的抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在2014年12月9日送(经由联邦快递)至美国菌种保存中心(ATCC),P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108且指定登录号为PTA-121831。
或者或另外，在本发明的另一实施方式中，结合FLT3的Mab(在此情况下，为MAbCHv62.21)可经受如本领域中已知的翻译后修饰。翻译后修饰的实施例包括(但不限于)化学修饰(例如双硫键)、寡糖、N端焦谷氨酸盐形成、C端赖氨酸处理、脱酰胺作用、异构化作用、氧化、糖基化、肽键裂解、非还原交联、截断及本领域中已知的其他修饰。参见，Liu等人，单抗的异质性(Heterogeneity of Monoclonal Antibodies),J.Pharma.Sci.，第97卷，第7期，第2426至2447页(2008年7月)。其他类型的修饰包括非共价相互作用、构形异质性、及聚集，同上。
在另一实施方式中，该CHv62.21 MAb包括N端重链谷氨酸盐在残基1处环化为焦谷氨酸盐。本领域技术人员将了解并知晓此种环化应了解为自发出现。参见，Dick等人，”使用模型肽确定单抗中T-末端焦谷氨酸变化的起源”(Determination of the Origin of theN-Terminal Pyro-Glutamtate Variation in Monoclonal Antibodies Using ModelPeptides),Biotechnology and Bioengineering，第97卷，第3期，第544至553页(2007年6月15日)。
另外或或者，该CHv62.21 MAb的氨基酸可经受其他翻译后修饰，包括(但不限于)脱酰胺作用、异构化作用、糖基化和/或氧化。本发明的多肽或其片段可经受额外的翻译后修饰，包括糖基化，例如本领域中熟知的N连接型或O连接型糖基化位点。如先前描述，可于多肽的氨基酸序列或处理条件中作出变化(例如于培养、纯化和/或储存条件的变化)以排除或最小化此类改变或以于其中此种处理有利的情况中促进它们。此外，此类制剂可包含具有不同程度的多于一种类型的处理相关修饰的多肽，例如，多肽的一些、大部分或基本全部的C端赖氨酸可经移除和/或一些、大部分或基本全部的N端氨基酸可经转化为焦谷氨酸(例如，显示于图2A和/或2B或图3A和/或3B中或一致序列或抗原结合片段中的多肽)。例如不同缓冲组合物及温度的处理条件可对此类修饰的程度具有显著影响。
在另一实施方式中，该CHv62.21 MAb包含SEQ ID NO：9的残基453处的C端重链赖氨酸的截断。
在另一实施方式中，该CHv62.21 MAb包含向残基303处的重链天冬酰胺添加糖基化，包括(但不限于)G0(唾液酸基-、去半乳糖、去岩藻糖基化二触角复合物-N型-聚糖；G0F(唾液酸基-、去半乳糖、核-岩藻糖基化二触角复合物-N型-聚糖)；甘露糖-5(N-连接型寡聚甘露糖-5)；G1F(唾液酸基-、单半乳糖、核-岩藻糖基化二触角复合物-N型-聚糖)；G2(唾液酸基-、双半乳糖、岩藻糖基化二触角复合物-N型-聚糖)；G2F(唾液酸基-、双半乳糖、核-岩藻糖基化二触角复合物-N型-聚糖)；A1(单唾液酸化二触角N-连接型寡聚糖，Neu5Acid)；和/或A2(二唾液酸化二触角N-连接型寡聚糖，Neu5Acid)。
另外或或者，在另一实施方式中，该CHv62.21 MAb包括向轻链的一个或多个丝氨酸残基添加糖基化。通常，糖基化产生自在还原糖与N端原发性胺或赖氨酸侧链的氨基间的非酶反应。本领域技术人员将了解及知晓糖基化可掩蔽N端原发性氨基酸基团或赖氨酸残基的侧链上的正电荷，从而使该抗体更具酸性。
本发明的多肽的氨基酸序列可通过本领域中已知的任何方式(例如，质谱法)证实且可与本文揭示的序列(参见，图2A和/或2B及图3A和/或3B)相同或可由于翻译后修饰加工而在一个或多个氨基酸残基处不同于那些序列。藉助于非限制性实施例，在全部或部分基本同源性多肽上，轻链或重链的C端氨基酸可通过发生于培养期间的蛋白水解处理或其他处理而加以移除。类似地，可缺乏N端氨基酸，例如，可缺乏一(1)、二(2)、三(3)、四(4)或五(5)个N端氨基酸。
在另一实施方式中，CHv62.21 MAb的重链可变区选自：自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基123(S)范围内的氨基酸序列及自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基123(S)范围内的氨基酸序列，其中该N端残基1(E)转化为焦谷氨酸。
在另一实施方式中，CHv62.21 MAb的重链选自：自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列；自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列，其中该N端残基1(E)转化为焦谷氨酸；自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列，其中移除该C端残基453(K)；及自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列，其中该N端残基1(E)转化为焦谷氨酸并移除该C端残基453(K)。
在另一实施方式中，CHv62.21 MAb或其抗原结合片段通过于宿主细胞中表达所获得的蛋白质的重组产生混合物，其中该抗体或其抗原结合片段的重链可变区选自：自SEQID NO：9的残基1(E)至残基123(S)范围内的氨基酸序列及自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基123(S)范围内的氨基酸序列，其中该N端残基1(E)转化为焦谷氨酸。
在另一实施方式中，CHv62.21 MAb通过于宿主细胞中表达所获得的蛋白质的重组产生混合物，其中该抗体的重链选自由以下组成的群：自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列；自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列，其中该N端残基1(E)转化为焦谷氨酸；自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列，其中移除该C端残基453(K)；自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列，其中该N端残基1(E)转化为焦谷氨酸并移除该C端残基453(K)。
在另一实施方式中，CHv62.21 MAb包含由自SEQ ID NO：9的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链(其中将第1个E修饰为焦谷氨酸盐)及由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
在另一实施方式中，CHv62.21 MAb包含由自SEQ ID NO：9的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链及由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
在另一实施方式中，CHv62.21 MAb包含由自SEQ ID NO：9的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链，其中将该第1个E修饰为焦谷氨酸盐并移除该C端残基第453个K，及包含由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
在另一实施方式中，CHv62.21 MAb包含由自SEQ ID NO：9的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链，其中移除该C端残基第453个K，及包含由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
在本发明的另一优选实施方式中，本发明的FLT3 MAb及(具体地)表示为CHv62.21的Mab在重链中经非天然氨基酸(“nnAA”)修饰。在一优选实施方式中，琥珀密码子位于SEQID NO：11的氨基酸位置124以用于插入表示为对乙酰基苯丙氨酸(图3C)的nnAA。出于本发明的目的，以CHv62.21pAF表示经修饰的CHv62.21。
因此，在本发明的一优选实施方式中，CHv62.21pAF包含以下：
重链可变区由自SEQ ID NO：11的第1个残基(E)至第123个残基(S)残基范围内的氨基酸序列组成，及轻链可变区由自SEQ ID NO：10的第1个残基(D)至第108个残基(R)残基范围内的氨基酸序列组成。重链可变区的CDR1-3(Kabat)由分别自SEQ ID NO：11的31至35；自50至65及自95至102范围内的氨基酸序列组成，及轻链可变区的CDR1-3(Kabat或Chothia)由分别自SEQ ID NO：10的24至34；自50至56及自89至97范围内的氨基酸序列组成(参见，图3B、图3C及表V)。
重链由自SEQ ID NO：11的第1个残基(E)至第453个残基(K)范围内的氨基酸序列及插入于SEQ ID NO：11的残基124处的对乙酰基苯丙氨酸的nnAA组成及CHv62.21的轻链由自SEQ ID NO：10的第1个残基(D)至第214个残基(C)范围内的氨基酸序列组成。它们序列阐述于图2B和/或2C及图3B和/或3C中。在一优选实施方式中，CHv62.21pAF结合至细胞毒剂。
在又另一实施方式中，本发明的FLT3 MAb通过产生抗体或抗原结合片段的方法产生，该方法包括培养宿主细胞以容许抗体或抗原结合片段的表达，其中该宿主细胞选自由以下(a)至(c)组成的群：(a)包含含有编码由自SEQ ID NO：11的第1个E至第123个S范围内的氨基酸序列组成的重链可变区的碱基序列的多核苷酸及包含编码包含自SEQ ID NO：10的第1个D至第108个R范围内的氨基酸序列的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞；(b)包含含有编码由自SEQ ID NO：11的第1个E至第123个S范围内的氨基酸序列组成的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体及包含含有编码包含自SEQID NO：10的第1个D至第108个R范围内的氨基酸序列的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞；及(c)包含含有编码由自SEQ ID NO：11的第1个E至第123个S范围内的氨基酸序列组成的重链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞及包含含有编码包含自SEQ ID NO：10的第1个D至第108个R范围内的氨基酸序列的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞。
在又另一实施方式中，本发明的FLT3 MAb通过产生抗体的方法产生，该方法包括培养宿主细胞以容许抗体的表达，其中该宿主细胞选自由以下(a)至(c)组成的群：(a)包含含有编码由自SEQ ID NO：11的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链的碱基序列的多核苷酸及包含编码由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞；(b)包含含有编码由自SEQID NO：11的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体及包含含有编码由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞；及(c)包含含有编码由自SEQID NO：11的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞及包含含有编码由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞；在又另一实施方式中，本发明的FLT3 MAb通过产生抗体的方法产生，该方法包括培养宿主细胞以容许抗体的表达，其中该宿主细胞选自由以下(a)至(d)组成的群：(a)包含含有编码由自SEQ IDNO：11的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链的碱基序列的多核苷酸及包含编码由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞；(b)包含含有编码由自SEQ ID NO：11的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体及包含含有编码由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞；(c)包含含有编码由自SEQ ID NO：11的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞及包含含有编码由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞；及(d)包含含有编码由自SEQ IDNO：11的第1个E至第452个G范围内的氨基酸序列组成的重链及由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞，其中该第1个E修饰为焦谷氨酸盐。
在另一实施方式中，CHv62.21pAF MAb的重链可变区选自：自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基123(S)范围内的氨基酸序列及自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基123(S)范围内的氨基酸序列，其中该N端残基1(E)转化为焦谷氨酸。
在另一实施方式中，CHv62.21pAF MAb的重链选自：自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列；自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列，其中该N端残基1(E)转化为焦谷氨酸；自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)的氨基酸序列，其中将该C端残基453(K)移除；及自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列，其中该N端残基1(E)转化为焦谷氨酸并将该C端残基453(K)移除。
在另一实施方式中，CHv62.21pAF MAb或其抗原结合片段通过于宿主细胞中表达所获得的蛋白质的重组产生混合物，其中该抗体或其抗原结合片段的重链可变区选自：自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基123(S)范围内的氨基酸序列及自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基123(S)范围内的氨基酸序列，其中该N端残基1(E)转化为焦谷氨酸。
在另一实施方式中，CHv62.21pAF MAb通过于宿主细胞中表达所获得的蛋白质的重组产生混合物，其中该重链选自：自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列；自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列，其中该N端残基1(E)转化为焦谷氨酸；自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列，其中将该C端残基453(K)移除；及自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列，其中该N端残基1(E)转化为焦谷氨酸并将该C端残基453(K)移除。
在另一实施方式中，CHv62.21pAF MAb包含由自SEQ ID NO：11的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链及由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
在另一实施方式中，CHv62.21pAF MAb包含由自SEQ ID NO：11的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链，其中将该第1个E修饰为焦谷氨酸盐，及包含由自SEQ IDNO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
在另一实施方式中，CHv62.21pAF MAb包含由自SEQ ID NO：11的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链，其中将该第1个E修饰为焦谷氨酸盐并移除该C端残基第453个K，及包含由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
在另一实施方式中，CHv62.21pAF MAb包含由自SEQ ID NO：11的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链，其中将该C端残基第453个K移除，及包含由自SEQ IDNO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
产生命名为CHv62.21pAF的抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞于2014年12月9日送(经由联邦快递)至美国菌种保存中心(ATCC),P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108且登录号指定为PTA-121836。
III.)抗体-药物偶联物概述
在另一方面中，本发明提供抗体-药物偶联物(ADC)，它们包含偶联至治疗剂的抗体。该治疗剂可为细胞毒剂、细胞增殖抑制剂、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性组合物)。在另一方面中，本发明进一步提供使用ADC的方法。在一个方面中，ADC包含上文共价结合或经由肟键结合至细胞毒剂或检测剂的FLT3 MAb中的任何一种。
抗体-药物偶联物于局部递送细胞毒性或细胞增殖抑制剂，即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物(Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614；Niculescu-Duvaz及Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26：151-172；美国专利案4,975,278)的使用容许将药物部分靶向递送至肿瘤及于其中细胞内聚集，其中这些未经结合的药物的全身性给予可对正常细胞导致不可接受的毒性水平并设法消除肿瘤细胞(Baldwin等人，(1986)Lancet pp.(Mar.15,1986)：603-05；Thorpe,(1985)《癌症治疗中细胞毒剂的抗体载体：综述》(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:AReview)，刊于《单克隆抗体84：生物和临床应用》(Monoclonal Antibodies 84:Biologicaland Clinical Applications),A.PincheRa等人(编)，第475至506页)。从而寻求以最小毒性达成最大疗效。多克隆抗体及单抗均已报告在这些策略中有用(Rowland等人，(1986)Cancer Immunol.Immunother.,21：183-87)。这些方法中使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星、胺甲喋呤及长春地辛(Rowland等人，(1986)同上)。抗体-毒素组合物中使用的毒素包括细菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如蓖麻毒蛋白)、小分子毒素(例如格尔德霉素(geldanamycin))(Mandler等人(2000)Jour.of the Nat.CancerInst.92(19)：1573-1581；Mandler等人，(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人，(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)、类美登素(EP 1391213；Liu等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)及卡奇霉素(Lode等人，(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等人，(1993)Cancer Res.53：3336-3342)。该毒素可通过机制(包括微管蛋白结合、DNA结合或拓朴异构酶抑制)影响它们细胞毒性及细胞增殖抑制效应。一些细胞毒性药物在偶联至大抗体或蛋白质受体配体时趋于失活或活性减小。
抗体药物偶联物的实施例是(替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)，其是由针对发现于正常及恶性B淋巴细胞的表面上的CD20抗原的鼠类IgG1κ单抗及通过硫脲接头-螯合剂结合的111In或90Y放射性同位素组成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等人，(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77；Wiseman等人，(2002)Blood99(12)：4336-42；Witzig等人，(2002)J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63；Witzig等人，(2002)J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69)。
另外，MYLOTARGTM(吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)，WyethPharmaceuticals)(由连接至卡奇霉素的hu CD33抗体组成的抗体药物偶联物)于2000年经批准用于急性骨髓性白血病的注射治疗中(Drugs of the Future(2000)25(7)：686；美国专利案第4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001号)。
另外，早期已将抗人类FLT3抗体评定为用于骨髓性白血病的潜在治疗。例如，IMC-EB10(抗FLT3的抗体)由Imclone开发。此抗体为配体阻断剂，其抑制下游激酶(MAPK、Akt及Stat5)的FLT3介导的活化。该抗体还抑制体外白血病细胞的增殖；且已知经由抗体依赖性细胞毒性(ADCC)发挥作用。当单独治疗及与胺甲喋呤组合治疗时，EB10已引起白血病异种移植物的延长的存活(参见，WO2009/155015及US2011/0008355)。还在人类临床试验(NCT00887926)中评估此抗体，但因缺乏疗效而终止。还参见，由ImClone开发结合至MMAF的EB10(参见，Proc Amer Assoc Cancer Res，第46卷，2005)。
本领域中已知针对FLT3开发的激动抗体可增强原始造血细胞的增殖及/分化(参见，WO 95/27062)。
除生物制剂外，已开发许多小分子抑制剂并于人类临床试验中测试。这些抑制剂中的大部分靶向FLT3及其他激酶且因此对FLT3激酶本身不具有特异性。在大多数情况下，这些抑制剂靶向FLT3-ITD及可能的FLT-TKD。因此，无抑制剂可单独靶向野生型FLT3。已知已进入人类临床试验中的小分子抑制剂为：
米哚妥林(Midostaurin)或PKC-412(Novartis)、奎扎替尼(Quizartinib)或AC220(Ambit)、蕾莎瓦(Nexavar)(Onyx/Bayer)、AZD1152或巴拉塞替(Barasertib)(Astrazeneca)、克莱拉尼(Crenolanib)(Arog)、Plexxicon(Daichii Sankyo)及ASP2215(Astellas)。通常，大多数人类临床试验仍在进行中。在大多数情况下，已观察到作为副作用的血小板减少症、中性粒细胞减少症、贫血症。
另外，莫坎妥珠单抗(Cantuzumab mertansine)(Immunogen,Inc.)(由经由二硫接头SPP连接至类美登素药物部分(DM1)的huC242抗体组成的抗体药物偶联物)进展至用于治疗表达CanAg的癌症(例如结肠、胰、胃及其他)的II期试验。
另外，MLN-2704(Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.)(由连接至类美登素药物部分(DM1)的抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单抗组成的抗体药物偶联物)处于开发中以用于前列腺肿瘤的潜在治疗。
最后，奥瑞司他汀肽、奥瑞司他汀E(AE)及单甲基奥瑞司他汀(MMAE)、海兔毒素的合成类似物结合至嵌合性单抗cBR96(对癌上的Lewis Y具有特异性)及cAC10(对血液恶性肿瘤上的CD30具有特异性)(Doronina等人，(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784)。
偶联至MMAE的CD30Mab现作为ADCETRIS(Seattle Genetics,Bothell,WA)购得。ADCETRIS(贝伦妥单抗维多汀(brentuximab vedotin))为导向CD-30的抗体药物偶联物，其由三种组分组成：1)表示为cAC10的嵌合性IgG1抗体，其对人类CD30具有特异性；2)微管破坏剂MMAE；及3)将MMAE共价连接至caC10的蛋白酶可裂解接头。参见，ADCENTRIS处方信息。
此外，本文描述治疗剂，包括(但不限于)在ADC的产生中有用的化学治疗剂。可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自假单胞菌属绿脓杆菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思子素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、桐油树蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陆毒蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素及单端孢菌素。参见，例如，1993年10月28日公开的WO 93/21232。各种放射性核素适用于产生放射性结合的抗体。实施例包括212Bi、131I、131In、90Y及186Re。抗体及细胞毒剂的组合物使用各种双功能性蛋白-偶合剂例如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸盐(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨基酯的双功能性衍生物(例如二甲基己二酰亚胺HCl)、活性酯(例如二琥珀酰亚氨基辛二酸盐)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮化衍生物(例如双-(对重氮化苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸盐(例如2,6-二异氰酸甲苯酯)及双-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)加以制备。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等人(1987)Science,238：1098中描述加以制备。经碳-14标记的1-异硫氰氧基苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)用于将放射性核苷酸结合至抗体的示例性螯合剂(WO94/11026)。
本文还预期抗体及一种或多种小分子毒素(例如卡奇霉素、类美登素、海兔毒素、奥瑞司他汀、单端孢菌素及CC1065)及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的偶联物。
III(A).类美登素
适用作类美登素药物部分的类美登素化合物为本领域中熟知，且可根据已知方法分离自天然来源，使用基因工程技术制备(参见Yu等人，(2002)PNAS 99：7968-7973)，或根据已知方法合成制备美登醇及美登醇类似物。
示例性类美登素化合物药物部分包括具有经修饰的芳环的那些，例如：C-19-脱氯(US 4256746)(通过安丝菌素(ansamytocin)P2的氢化锂铝还原制得)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利案第4,361,650及4,307,016号)(通过使用链霉菌属(Streptomyces)或放线菌属(Actinomyces)的脱甲基化或使用LAH的脱氯化制得)；及C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利案第4,294,757号)(通过使用酰基氯化物的酰化制得)，及在其他位置具有修饰的那些。
示例性类美登素药物部分还包括具有例如以下的修饰的那些：C-9-SH(US 4,424,219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应制得)；C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(US4331598)；C-14-羟基甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(US 4450254)(自土壤丝菌属(Nocardia)制得)；C-15-羟基/酰氧基(US 4,364,866)(通过以链霉菌属转化美登醇制得)；C-15-甲氧基(美国专利案第4,313,946及4,315,929号)(分离自滑桃树属(TrewianudlfloRa))；C-18-N-脱甲基(美国专利案第4,362,663及4,322,348号)(通过以链霉菌属脱甲基化美登醇制得)；及4,5-脱氧基(US 4,371,533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原制得)。
含有类美登素的ADC、其制备方法及其治疗性用途揭示例如于美国专利案第5,208,020；5,416,064；6,441,163号及欧洲专利EP 0 425 235B1中，该案件的揭示内容以明确引入的方式并入本文中。Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)描述包含连接至针对人类结肠直肠癌的单抗C242的命名为DM1的类美登素的ADC。发现该组合物对经培养的结肠癌细胞具有高度细胞毒性，且在体内肿瘤生长分析中显示抗肿瘤活性。Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)描述其中类美登素经由二硫接头结合至结合人类结肠癌细胞系上的抗原的鼠类抗体A7或结合至结合HER-2/neu癌基因的另一鼠类单抗TA.1的ADC。体外测试TA.1-类美登素组合物对人类乳腺癌细胞系SK-BR-3的细胞毒性，人类乳腺癌细胞系SK-BR-3每个细胞表达3x 105个HER-2表面抗原。药物偶联物达成与游离类美登素药物类似的细胞毒性程度，其可通过增加每个抗体分子中的类美登素分子的数量而增加。该A7-类美登素组合物于小鼠中显示低全身性细胞毒性。
III(B).奥瑞司他汀及海兔毒素
在一些实施方式中，该ADC包含结合至海兔毒素或海兔毒素肽类似物及衍生物、奥瑞司他汀的本发明的抗体(美国专利案第5,635,483；5,780,588号)。海兔毒素及奥瑞司他汀已显示干扰微管动态、GTP水解及细胞核及细胞分裂(Woyke等人，(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(US 5,663,149)及抗真菌活性(Pettit等人，(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。海兔毒素或奥瑞司他汀药物部分可通过肽药物部分的N(氨基)端或C(羧基)端结合至抗体(WO 02/088172)。
示例性奥瑞司他汀实施方式包括N端连接型单甲基奥瑞司他汀药物部分DE及DF，它们揭示于“2004年3月28日呈递的Senter等人，Proceedings of the AmericanAssociation for Cancer Research，第45卷，文摘号623中并描述于美国专利公开案第2005/0238649号中，该案件的揭示内容以全文引用的方式明确并入本文中。
通常，基于肽的药物部分可通过在两种或更多种氨基酸与/或肽片段间形成肽键制备。此类肽键可(例如)根据肽化学领域中熟知的液相合成方法制备(参见及K.Lübke,“《肽》(The Peptides)”，第1卷，第76至136页，1965,Academic Press)。奥瑞司他汀/海兔毒素药物部分可根据以下方法制备：US 5635483；US 5780588；Pettit等人，(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等人，(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit,G.R.等人，Synthesis,1996,719-725；Pettit等人，(1996)J.Chem.Soc.PerkinTrans.1 5：859-863；及Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7)：778-784。
III(C).卡奇霉素
在其他实施方式中，该ADC包含偶联至一个或多个卡奇霉素分子的本发明的抗体。抗生素的卡奇霉素家族可在亚皮摩尔浓度下产生断裂的双链DNA。为制备卡奇霉素家族的组合物，参见美国专利5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296(全部属于American Cyanamid公司)。可使用的卡奇霉素的结构性类似物包括(但不限于)γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG及θI 1(Hinman等人，CancerResearch 53：3336-3342(1993)；Lode等人，Cancer Research 58：2925-2928(1998)及上述属于American Cyanamid的美国专利)。可结合抗体的另一抗肿瘤药物为QFA，其为抗叶酸剂。卡奇霉素及QFA均具有细胞内作用位点且不容易跨越质膜。因此，这些药剂通过抗体介导的内化的细胞吸收极大地增强它们细胞毒性效应。
III(D).其他细胞毒剂
其他可偶联至本发明的抗体的抗肿瘤剂包括BCNU、链脲佐菌素、长春新碱及5-氟尿嘧啶、描述于美国专利案第5,053,394、5,770,710号中的统称为LL-E33288复合物的药剂家族、及埃斯培拉霉素(esperamicin)(美国专利5,877,296)。
可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自假单胞菌属绿脓杆菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思子素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐树蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆毒蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素及单端孢菌素。参见，例如，WO 93/21232(1993年10月28日公开)。
本发明进一步预期抗体与具有核分解活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，例如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)所形成的ADC。
就肿瘤的选择性破坏而言，该抗体可包含高度放射性原子。各种放射性同位素适用于产生放射性结合的抗体。实施例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu的放射性同位素。当组合物用于检测时，其可包含用于闪烁研究的放射性原子(例如tc99m或I123)或用于核磁共振(NMR)成像(还称为磁振造影，mri)的自旋标记(例如还是碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁)。
该放射性标记或其他标记可用已知方法并入偶联物中。例如，该肽可生物合成或可通过使用涉及(例如)以氟-19代替氢的合适的氨基酸前体的化学氨基酸合成而合成。例如tc99m或I123、Re186、Re188及In111的标记可经由半胱氨酸残基结合于肽中。钇-90可经由赖氨酸残基结合。可使用IODOGEN方法(FRaker等人，(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57并入碘-123。“《免疫闪烁法中的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy)”(Chatal,CRC出版社1989)详细描述其他方法。
IV.)结合FLT3的抗体-药物偶联物化合物
本发明尤其提供用于治疗剂的靶向递送的抗体-药物偶联物化合物。发明人已发现该抗体-药物偶联物化合物具有针对表达FLT3的细胞的强效细胞毒性和/或细胞增殖抑制活性。
此类抗体药物偶联物不阻断FL结合至FLT3，以使得FL甚至在结合抗体时可透过FLT3发信号。此类抗体证实细胞毒性活性在FL的存在下不减小(其中不阻断FL结合至FLT3的抗FLT3抗体药物偶联物在FL的存在下显示减小的细胞毒性)。在优选实施方式中，本文描述的抗FLT3药物偶联物不实质抑制FL结合至FLT3。
该抗体-药物偶联物化合物包含共价连接至至少一个药物单元的抗体单元。该药物单元可直接或经由接头单元(-LU-)共价连接至抗体单元。
在一些实施方式中，该抗体药物偶联物化合物具有下式：
L-(LU-D)p (I)
或其药学上可接受的盐或溶剂合物；其中：
L是抗体单元，例如，本发明的FLT3 MAb，例如CHv62.21或CHv62.21pAF，和
(LU-D)是接头单元-药物单元部分，其中：
LU-是接头单元，和
-D是具有针对靶细胞的细胞增殖抑制或细胞毒性活性的药物单元；及P在自1至20范围内。
在一些实施方式中，p在自1至10范围内；自1至9范围内；自1至8范围内；自1至7范围内；自1至6范围内；自1至5范围内；自1至4范围内；自1至3范围内或自1至2范围内。在一些实施方式中，p在自2至10范围内；自2至9范围内；自2至8范围内；自2至7范围内；自2至6范围内；自2至5范围内；自2至4范围内或自2至3范围内。在其他实施方式中，p是1、2、3、4、5或6。在一些实施方式中，p是2或4。在一些实施方式中，p是整数。在其他实施方式中，p是测量为平均药物对抗体的比率且可为整数或非整数。
在一些实施方式中，该抗体药物偶联物化合物具有下式：
L-(Aa-Ww-Yy-D)p (II)
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：
L是抗体单元，例如，FLT3 MAb，如CHv62.21或CHv62.21pAF；和-Aa-Ww-Yy-是接头单元(LU)，其中：
-A-是延伸子单元，
a是0或1或2或3，
各-W-独立地是氨基酸单元，
w是0至12的整数，
-Y-是自我分解型间隔子单元，
y是0、1或2；
-D是具有针对靶细胞的细胞增殖抑制或细胞毒性活性的药物单元；和p是1至20的整数。
在一些实施方式中，a是0或1，w是0或1，及y是0、1或2。在一些实施方式中，a是0或1，w是0或1，及y是0或1。在一些实施方式中，p在自1至10范围内；自1至9范围内；自1至8范围内；自1至7范围内；自1至6范围内；自1至5范围内；自1至4范围内；自1至3范围内或自1至2范围内。在一些实施方式中，p在自2至8范围内；自2至7范围内；自2至6范围内；自2至5范围内；自2至4范围内或自2至3范围内。在其他实施方式中，p是1、2、3、4、5或6。在一些实施方式中，p是2或4。在一些实施方式中，当w不为0时，y是1或2。在一些实施方式中，当w是1至12时，y是1或2。在一些实施方式中，w是2至12及y是1或2。在一些实施方式中，a是1及w与y是0。
就包含多个抗体的组合物而言，药物负载由p(每个抗体中药物分子的平均数量)表示。药物负载可在自每个抗体中1至20个药物(D)范围内。在组合物反应的制备中每个抗体的药物平均数量可通过常规方式(例如质谱法、ELISA分析及HPLC)表征。还可测定抗体-药物偶联物的p的定量分布。在一些实施例中，均质抗体-药物偶联物(其中p是具有其他药物负载的抗体-药物偶联物的某一值)的分离、纯化及表征可通过例如逆相HPLC或电泳等方式达成。在示例性实施方式中，p是2至8。
抗体-药物偶联物化合物的产生可通过本领域技术人员已知的任何技术完成。简言之，该抗体-药物偶联物化合物包含作为抗体单元的本发明FLT3 MAb、药物及任选连接该药物与该结合剂的接头。在一优选实施方式中，该抗体是包含上文描述的命名为CHv62.21的抗体的重链及轻链可变区的FLT3 MAb。在更优选实施方式中，该抗体是包含上文描述的命名为CHv62.21pAF的抗体的重链及轻链的FLT3 MAb(参见，式(I))。
许多不同的反应适用于将药物和/或接头共价结合至结合剂。这通常通过结合剂(例如，抗体分子)的氨基酸残基(包括赖氨酸的氨基、谷氨酸及天冬氨酸的游离羧酸基团、半胱氨酸的巯基及芳族氨基酸的各种部分)的反应完成。共价结合的最常用非特异性方法中的一种是碳二亚胺反应，以将化合物的羧基(或氨基)连接至抗体的氨基(或羧基)。另外，双功能性剂(例如二醛或亚氨基酯)已用以将化合物的氨基连接至抗体分子的氨基。还适用于将药物连接至结合剂的反应是希夫碱反应(Schiff base reaction)。此方法涉及含有二醇或羟基的药物的过碘酸氧化，因此形成醛，其然后与结合剂反应。经由希夫碱及结合剂的氨基的形成发生连接。可使用异构硫氰酸盐作为偶合剂以将药物共价连接至结合剂。其他技术为本领域技术人员已知且在本发明的范围内。
在某些实施方式中，中间物(其为接头的前体)在适当的条件下与药物反应。在某些实施方式中，反应性基团用于药物和/或中间物上。药物与中间物或衍生化药物之间的反应产物随后在适当的条件下与FLT3 MAb反应。
V.)接头单元
通常，该抗体-药物偶联物化合物包含在药物单元与抗体单元间的接头单元。在一些实施方式中，该接头在细胞内条件下可裂解，以使得该接头的裂解自抗体释放药物单元于细胞内环境中。在其他实施方式中，该接头单元不可裂解且该药物(例如)通过抗体降解释放。
在一些实施方式中，该接头可通过存在于细胞内环境(例如，在溶酶体或胞内体或胞膜窖(caveolea)内)中的裂解剂裂解。该接头可为(例如)肽基接头，其通过细胞内肽酶或蛋白酶(包括(但不限于)溶酶体或胞内体蛋白酶)裂解。该接头还可通过存在于细胞外环境(例如，在细胞膜或组织间隔周围)中的裂解剂裂解。该接头可为(例如)肽基接头，其通过细胞外肽酶或蛋白酶(包括(但不限于)组织蛋白酶家族酶或基质金属蛋白酶))裂解。在一些实施方式中，该肽基接头为至少两个氨基酸长度或至少三个氨基酸长度。在一优选实施方式中，该肽基接头含有至少一个氨氧基酸单元(Ambrx,Inc.,La Jolla,CA)。裂解剂可包括那些本领域中已知的药剂(参见，例如，Dubowchik and Walker,1999,Pharm.Therapeutics83：67-123及美国专利案第6,214,345号)。使用治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一项优点为当结合时该药剂通常经衰减且组合物的血清稳定性通常较高。
在其他实施方式中，该可裂解的接头为pH敏感型，即，在某些pH值下对水解敏感。通常，该pH敏感型接头在酸性条件下可水解。例如，可使用可于溶酶体中水解的酸不稳定性接头(例如，肟、腙、半卡腺、硫半卡腺、顺式乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮或类似物)。(参见，例如，美国专利案第5,122,368；5,824,805；5,622,929号；Dubowchik及Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83：67-123；Neville等人，1989,Biol.Chem.264：14653-14661)。此类接头在中性pH条件下(例如那些在血液中)相对稳定，但在低于pH 5.5或5.0(溶酶体的近似pH)下不稳定或较不稳定。在某些实施方式中，该可水解的接头是硫醚接头(例如，例如，经由酰腙键连接至治疗剂的硫醚(参见，例如，美国专利案第5,622,929号)。
在其他实施方式中，该接头在本领域中已知的还原条件下可裂解。(参见，例如，Thorpe等人，1987,Cancer Res.47：5924-5931；Wawrzynczak等人，于《免疫偶联物：癌症的放射成像和治疗中的抗体偶联物》(Immunoconjugates：Antibody Conjugates inRadioimagery and Therapy of Cancer)(C.W.Vogel编，Oxford U.Press,1987.还参见美国专利案第4,880,935号)。该接头还可在细胞内(或细胞外)发现的还原条件下裂解。例如，在一优选实施方式中，该特异性接头N-O键可形式上还原并破坏以导致接头的裂解。
在其他实施方式中，该接头单元不可裂解且该药物通过抗体降解释放。(参见以全文引用的方式并入本文中且用于所有目的的PCT公开案第WO2012/166560号(Ambrx,Inc.))。
在其他非互相排他性的实施方式中，如本领域中已知，接头促进细胞内化。
各种可与本发明的组合物及方法一起使用的示例性接头描述于WO 2004/010957、美国公开案第2006/0074008号、美国公开案第20050238649号及美国公开案第2006/0024317号(其各以全文引用的方式并入本文中且用于所有目的)中。
在优选实施方式中，本发明的LU表示AGL且常称为2-(氨氧基)乙酸或C2H5NO3。
VI.)延伸子单元
延伸子单元(A)(当存在时)可将抗体单元连接至氨基酸单元(-W-)(若存在)连接至间隔子单元(-Y-)(若存在)；或连接至药物单元(-D)。可天然或经由化学操作存在于FLT3MAb(例如，CHv62.21或CHv62.21pAF)上的有用的官能团包括(但不限于)酮基、醛基、巯基、氨基、羟基、碳水化合物的变旋异构羟基、及羧基。合适的官能基是酮基、醛基、巯基及氨基。在一个实施例中，该酮基在并入本发明的MAb内的非天然氨基酸(nnAA)上。在另一实施例中，该醛基在并入本发明的MAb内的nnAA上。在另一实施例中，巯基可通过FLT3 MAb的分子内双硫键的还原产生。在另一实施方式中，巯基可通过FLT3 MAb的赖氨酸部分的氨基与2-亚氨基硫烷(Traut试剂)或其他产生巯基的试剂反应产生。在某些实施方式中，该FLT3 Mab是重组抗体且经改造以载有一个或多个赖氨酸。在某些其他实施方式中，该重组FLT3 MAb经改造以载有额外的巯基(例如，额外的半胱氨酸)。
在一个实施方式中，该延伸子单元与抗体单元的酮基形成肟键。该酮基存在于并入MAb中的nnAA上。
已自甚至其中未明确指示的所有示例性实施方式中了解，1至20个药物部分可连接至抗体(p＝1至20)。
氨基酸单元
氨基酸单元(-W-)(当存在时)将延伸子单元连接至间隔子单元(若该间隔子单元存在)，将延伸子单元连接至药物部分(若缺乏间隔子单元)，及将抗体单元连接至药物单元(若缺乏延伸子单元及间隔子单元)。
Ww-可为(例如)单肽、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。各-W-单元独立地具有下文方括号中指示的式且w是0至12的整数：
其中R19包括(但不限于)氢、甲基、异丙基、异丁基、仲丁基、苄基、对羟基苄基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(＝NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(＝NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基。为进一步参考，参见(US2014/0072586及WO2012/047724，它们以引用的方式完全并入本文中)。
在某些实施方式中，该氨基酸单元可包含天然氨基酸。在其他实施方式中，该氨基酸单元可包含非天然氨基酸。
在一些实施方式中，该氨基酸单元可通过一种或多种酶(包括与癌症或肿瘤相关联的蛋白酶)酶促裂解，以释放药物单元(-D)，其在一个实施方式中一经释放即经体内质子化以提供药物(D)。
在氨基酸单元的一个方面中，该氨基酸单元是缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)。在另一方面中，该氨基酸单元是苯丙氨酸-赖氨酸(即，fk)。在氨基酸单元的又另一方面中，该氨基酸单元是N-甲基缬氨酸-瓜氨酸。
VII.)间隔子单元
间隔子单元(-Y-)当存在时将氨基酸单元连接至药物单元(当氨基酸单元存在时)。或者，该间隔子单元将延伸子单元连接至药物单元(当缺乏氨基酸单元时)。当氨基酸单元及延伸子单元皆不存在时，该间隔子单元还将药物单元连接至抗体单元。间隔子单元具有两种一般类型：非自我分解型或自我分解型。本领域中已知本发明的可能的间隔子单元的实施例。参见，Toki等人，2002,J.Org.Chem.67：1866-1872和Nature Biotechnology21(7)：778-784)。
自我分解型间隔子单元的其他实施例包括(但不限于)电子类似于PAB基团的芳族化合物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等人，1999,Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)及邻位或对位氨基苄基缩醛。可使用酰胺键一经水解即经受环化的间隔子单元，例如经取代或未经取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人，1995,Chemistry Biology 2：223)、经适当取代的双环[2.2.1]及双环[2.2.2]环系统(Storm等人，1972,J.Amer.Chem.Soc.94：5815)及2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等人，1990,J.Org.Chem.55：5867)。在甘氨酸的α-位置经取代的含胺药物的消除(Kingsbury等人，1984,J.Med.Chem.27：1447)也是自我分解型间隔子单元的实施例。
VIII.)药物单元
药物单元(D)可为任何治疗剂。例如，该药物单元可为部分，其为细胞毒性、细胞增殖抑制或免疫调节(例如，免疫抑制)或化学治疗剂。D是具有可与间隔子单元(若存在)；与氨基酸单元(若存在)；与延伸子单元(若存在)或与抗体单元成键的原子的药物单元(部分)。在一些实施方式中，该药物单元D具有可与间隔子单元(若使用)成键的氮原子。如本文使用，术语“药物单元”及“药物部分”是同义词且可互换使用。
细胞毒性或免疫调节剂的有用类别包括(例如)抗微管蛋白剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂及烷化剂。在一些实施方式中，该药物是奥瑞司他汀，例如奥瑞司他汀E(本领域中还称为海兔毒素-10的衍生物)或其衍生物。其他典型的奥瑞司他汀包括AFP、MMAF及MMAE。示例性奥瑞司他汀的合成及架构于美国专利案第6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444及4,486,414号中，各以全文引用的方式并入本文中且用于所有目的。
在一些实施方式中，该药物单元是卡奇霉素、喜树碱(camptothecin)、类美登素或蒽环霉素(anthracyclinc)。在一些实施方式中，该药物是紫杉烷、拓朴异构酶抑制剂、长春花生物碱或类似物。
在一些典型实施方式中，合适的细胞毒剂包括(例如)DNA小沟结合剂(例如，烯二炔及雷西曲星、CBI化合物；还参见美国专利案第6,130,237号)、多卡米新、紫杉烷(例如，太平洋紫杉醇及多西他赛)、嘌呤霉素及长春花生物碱。其他细胞毒剂包括(例如)CC-1065、SN-38、拓扑替康、吗啉基-多柔比星、根霉素、氰基吗啉基-多柔比星、棘霉素、考布他汀、纺锤菌素、埃博霉素A及B、雌莫司汀、念珠藻素、西马多汀、类美登素、海绵内酯、艾榴塞洛素(eleutherobin)及米托蒽醌。
在一些实施方式中，该药物是抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的实施例包括奥瑞司他汀、紫杉烷(例如，(太平洋紫杉醇)、(多西他赛))、T67(Tularik)及长春花生物碱(例如，长春新碱、长春花碱、长春地辛及长春瑞滨)。其他抗微管蛋白剂包括(例如)浆果赤霉素衍生物、紫杉烷类似物(例如，埃博霉素A与B)、诺考达唑、秋水仙碱及秋水仙酰胺、雌莫司汀、自念珠藻环肽(cryptophycin)、西马多汀、类美登素、考布他汀、海绵内酯及艾榴塞洛素。
在某些实施方式中，该细胞毒剂是类美登素(抗微管蛋白剂的另一组)。例如，在具体实施方式中，该类美登素是美登素或DM-1(ImmunoGen,Inc.；还参见Chari等人，1992,Cancer Res.52：127-131)。
在某些实施方式中，该细胞毒性或细胞增殖抑制剂是海兔毒素。在某些实施方式中，该细胞毒性或细胞增殖抑制剂是奥瑞司他汀类别。
在另一实施方式中，药物单元为新多拉脯氨酸-多拉异亮氨酸(dolaproine-dolaisoleuine)肽类似物。因此，本文提供式(I)化合物：
其中R1及R2各独立地是-H或烷基；
X是-O-、-NRz-、-S-或不存在；
其中Rz是-H或烷基；
R3是具有下式的基团：
其中R15及R16各独立地是-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、烷基、烯基、炔基、-烷基-OH、-烷基-NH2、-烷基-SH或-烷基-N3；
R4是具有下式的基团：
其中R17及R18各独立地是-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、烷基、烯基、炔基、-烷基-OH、-烷基-NH2、-烷基-SH、-烷基-N3或-烷基-CO2H；
R5是仲丁基或异丁基；
R6是-H或烷基；
R7及R8各独立地是-H、烷基、-CO2Ra、CONRbRc、经取代或未经取代的苯基或经取代或未经取代的杂环；
其中Ra是-H或烷基；
Rb及Rc各独立地是H或烷基；
R9是-H或烷基；或R9连同R4及它们连接的原子形成经取代或未经取代的杂环烷基环；
R10是-H或烷基；
R11是-H或烷基；
R12是-H或烷基；
R13是-H或烷基；
及R14是-H、-OH或烷基；
限制条件为当X不存在且R15、R16、R17及R18各是甲基时，则R8非经取代或是未经取代的苯基或经取代或未经取代的杂环；
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，R1及R2各独立地是-H或烷基，例如C1-6烷基。在一些实施方式中，R1及R2各独立地是-H或甲基。在一些实施方式中，R1及R2各独立地是烷基。在一些实施方式中，R1及R2皆为甲基。在一些实施方式中，R1及R2皆为-H。
在一些实施方式中，X不存在。在其他实施方式中，X是-O-。在一些实施方式中，R1及R2各独立地是烷基，且X不存在。在一些实施方式中，R1及R2皆为甲基，及X不存在。在其他实施方式中，R1及R2皆为-H，且X是-O-。在一些实施方式中，X是-NRz-，其中Rz是-H或烷基。在一些实施方式中，Rz是-H。在一些实施方式中，X是Rz是烷基，例如C1-6烷基或甲基。
在某些实施方式中，R3是其中R15及R16各独立地是-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、烷基、烯基、炔基、-烷基-OH、-烷基-NH2、-烷基-SH或-烷基-N3。在其他实施方式中，R15及R16各独立地是-H、烷基、-(CH2)0-6C≡CH、-(CH2)0-6CH＝CH2、-(CH2)0-6OH、-(CH2)0-6NH2、-(CH2)0-6SH或-(CH2)0-6N3。在一些实施方式中，R15及R16各独立地是-H、-OH或烷基。在一些实施方式中，R15及R16各独立地是-H、-OH或甲基。在一些实施方式中，R15是-OH且R16是氢。在一些实施方式中，R15是-OH且R16是甲基。
在某些实施方式中，R3相对于分子的剩余部分呈R立体化学构型。在其他实施方式中，R3相对于分子的剩余部分呈S立体化学构型。在某些实施方式中，该R3基团本身含有一个或多个手性中心，且那些立体中心各独立地呈R或S构型。
在某些实施方式中，R4是其中R17及R18各独立地是-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、烷基、烯基、炔基、-烷基-OH、-烷基-NH2、-烷基-SH、-烷基-N3或-烷基-CO2H。在其他实施方式中，R4是其中R17是-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、烷基、烯基、炔基、-烷基-OH、-烷基-NH2、-烷基-SH、-烷基-N3或-烷基-CO2H，且R18是-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、烯基、炔基、-烷基-OH、-烷基-NH2、-烷基-SH、-烷基-N3或-烷基-CO2H。在其他实施方式中，R17及R18各独立地是-H、烷基、-(CH2)0-6C≡CH、-(CH2)0-6CH＝CH2、-(CH2)0-6OH、-(CH2)0-6NH2、-(CH2)0-6SH或-(CH2)0-6N3。在一些实施方式中，R17及R18各独立地是-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、烷基、-烷基-NH2或-烷基-N3。在一些实施方式中，R17及R18各独立地是-H、-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、甲基、-CH2NH2或-CH2N3。
在某些实施方式中，R4连同R9及它们连接的原子形成经取代或未经取代的杂环烷基环。在某些实施方式中，R4连同R9及它们连接的原子形成5元至7元杂环烷基环，其可未经取代或经一个或多个选自-OH、-NH2、-SH及-N3的基团取代。在某些实施方式中，该杂环烷基环是吡咯啶环，其可未经取代或经一个或多个选自-OH、-NH2、-SH及-N3的基团取代。
在某些实施方式中，R4相对于分子的剩余部分呈R立体化学构型。在其他实施方式中，R4相对于分子的剩余部分呈S立体化学构型。在某些实施方式中，该R4基团本身含有一个或多个手性中心，且那些立体中心各独立地呈R或S构型。
在某些实施方式中，R5是仲丁基。在其他实施方式中，R5是异丁基。在某些实施方式中，R5是相对于分子的剩余部分呈R立体化学构型。在其他实施方式中，R5是相对于分子的剩余部分呈S立体化学构型。在一些实施方式中，R5基团内的手性中心是呈R构型，及在其他实施方式中，该中心是呈S构型。
在某些实施方式中，R6是-H。在其他实施方式中，R6是烷基，例如C1-8烷基、C1-4烷基、甲基或乙基。
在一些实施方式中，R7及R8各独立地是-H、烷基、-CO2Ra或-CONRbRc；其中Ra是-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；及Rb及Rc各独立地是-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基。
在某些实施方式中，R7及R8各独立地经取代或未经取代的苯基或经取代或未经取代的杂环，其中该苯基或杂环可经一个或多个选自卤素、氧代、羟基、氨基、烷基及烷氧基的基团取代。在某些其他实施方式中，R7是未经取代的3元至8元杂环。在某些其他实施方式中，R7是经取代的3元至8元杂环。在某些其他实施方式中，R8是任选经卤素取代的苯基。
在某些实施方式中，R7是相对于分子的剩余部分呈R立体化学构型。在其他实施方式中，R7是相对于分子的剩余部分呈S立体化学构型。
在某些实施方式中，R8是相对于分子的剩余部分呈R立体化学构型。在其他实施方式中，R8是相对于分子的剩余部分呈S立体化学构型。
在一些实施方式中，R7是-CO2Ra-CONRbRc；四唑基或噻唑基，其中Ra是-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；且Rb及Rc各独立地是-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；且R8是任选经卤素取代的苯基。
在一些实施方式中，R9是-H。在其他实施方式中，R9是烷基，例如C1-8烷基、C1-4烷基、甲基或乙基。在一些实施方式中，R9是-H或甲基。在一些实施方式中，R9是甲基。
在一些实施方式中，R10是-H。在其他实施方式中，R10是烷基，例如C1-8烷基、C1-4烷基、甲基或乙基。在一些实施方式中，R10是-H或甲基。在一些实施方式中，R10是甲基。
在一些实施方式中，R11是-H。在其他实施方式中，R11是烷基，例如C1-8烷基、C1-4烷基、甲基或乙基。在一些实施方式中，R11是-H或甲基。在一些实施方式中，R11是甲基。
在一些实施方式中，R12是-H。在其他实施方式中，R12是烷基，例如C1-8烷基、C1-4烷基、甲基或乙基。在一些实施方式中，R12是-H或甲基。在一些实施方式中，R12是甲基。
在一些实施方式中，R13是-H。在其他实施方式中，R13是烷基，例如C1-8烷基、C1-4烷基、甲基或乙基。在一些实施方式中，R13是-H或甲基。在一些实施方式中，R13是甲基。
在一些实施方式中，R14是-H。在一些实施方式中，R14是烷基，例如C1-6烷基、甲基或乙基。在一些实施方式中，R14是-OH。
在某些实施方式中，R14是相对于分子的剩余部分呈R立体化学构型。在其他实施方式中，R14是相对于分子的剩余部分呈S立体化学构型。
在一些实施方式中，R7是-CO2Ra，其中Ra是-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；R8是苯基；且R14是-H。在一些实施方式中，R7是-CONRbRc，其中Rb及Rc各独立地是-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；R8是苯基；且R14是-H。在一些实施方式中，R7是烷基，例如C1-6烷基或甲基；R8是苯基；且R14是-OH。在一些实施方式中，R7是甲基，R8是苯基，且R14是-OH。在一些实施方式中，R7及R14皆为-H，且R8是吡啶基、哌啶基、未经取代的苯基或经卤素(例如氟、氯或溴)取代的苯基。在一些实施方式中，R7是-CO2Ra，其中Ra是-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；R8是-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；且R14是烷基，例如C1-6烷基、甲基或乙基。在一些实施方式中，R7是-CO2Ra，其中Ra是-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；R8是-H或烷基，例如C1-6烷基或甲基；且R14是-OH。
在某些实施方式中，
R1及R2各独立地是-H或C1-6烷基；
X是-O-或不存在；
R3是其中R15及R16各独立地是-H、-OH或C1-6烷基；
R4是其中R17是-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、-C1-6烷基-NH2、炔基、烯基或-C1-6烷基-N3；且R18是-H或C1-6烷基；
R5是仲丁基；
R6是-H；
R7是-H、C1-6烷基、-CO2Ra、-CONRbRc、四唑基或噻唑基；其中Ra是-H或C1-6烷基；且Rb及Rc各是-H或C1-6烷基；
R8是-H、C1-6烷基、经取代或未经取代的苯基或经取代或未经取代的杂环；
R9是-H；
R10、R11、R12及R13各独立地是C1-6烷基；
及R14是-H、C1-6烷基或-OH。
在某些实施方式中，
R1及R2各独立地是-H或甲基；
X是-O-或不存在；
R3是其中R15及R16各独立地是-H、-OH或甲基；
R4是其中R17是-OH、-NH2、-SH、-N3、-CO2H、氨基甲基、炔基、烯基或叠氮基甲基；且R18是-H或甲基；
R5是仲丁基；
R6是-H；
R7是-H、甲基、-CO2Ra或-CONRbRc；其中Ra是-H或甲基；且Rb及Rc各是-H或甲基；
R8是-H、甲基、乙基、吡啶基、哌啶基、未经取代的苯基、经卤素取代的苯基；
R9是-H；
R10、R11、R12及R13各是甲基；
及R14是-H、甲基或-OH。
在某些实施方式中，
R1及R2各独立地是-H或C1-6烷基；
X不存在；
R3是其中R15及R16各独立地是-H、-OH或C1-6烷基；
R4是其中R17是-N3，且R18是-H或甲基；
R5是仲丁基；
R6是-H；
R7是-H、C1-6烷基、-CO2Ra、-CONRbRc、四唑基或噻唑基；其中Ra是-H或C1-6烷基；且Rb及Rc各是-H或C1-6烷基；
R8是-H、C1-6烷基、经取代或未经取代的苯基或经取代或未经取代的杂环；
R9是-H；
R10、R11、R12及R13各独立地是C1-6烷基；
及R14是-H、C1-6烷基或-OH。
在某些实施方式中，R1及R2各独立地是-H或C1-6烷基；
X是-O-；
R3是其中R15及R16各独立地是-H、-OH或C1-6烷基；
R4是其中R17是-N3，及R18是-H或甲基；；
R5是仲丁基；
R6是-H；
R7是-H、C1-6烷基、-CO2Ra、-CONRbRc、四唑基或噻唑基；其中Ra是-H或C1-6烷基；且Rb及Rc各是-H或C1-6烷基；
R8是-H、C1-6烷基、经取代或未经取代的苯基或经取代或未经取代的杂环；
R9是-H；
R10、R11、R12及R13各独立地是C1-6烷基；
及R14是-H、C1-6烷基或-OH。
在式(I)的一些实施方式中，其中，R1及R2各是甲基；
X不存在；
R3是具有下式的基团：其中R15及R16各是甲基；
R4是具有下式的基团：其中R17是-N3、-NH2、-OH、-SH且R18是-H或甲基；
R5是仲丁基；
R6是-H；
R7是-CO2Ra或CONRbRc，其中Ra是-H或C1-6烷基；Rb及Rc各独立地是H或C1-6烷基；
R8是苯基；
R9是-H；
R10、R11、R12及R13各独立地是甲基；
及R14是-H。
在式(I)的一些实施方式中，其中，R1及R2各是-H；
X是-O-；
R3是具有下式的基团：其中R15及R16各是甲基；
R4是具有下式的基团：其中R17是-N3且R18是-H或甲基；
R5是仲丁基；
R6是-H；
R7是-CO2Ra或CONRbRc，其中Ra是-H或C1-6烷基；
Rb及Rc各独立地是H或C1-6烷基；
R8是苯基；
R9是-H；
R10、R11、R12及R13各独立地是甲基；和
及R14是-H。
应了解本文提供的任何可变基团定义可与本文提供的任何其他可变基团组合使用，以使得预期本文提供的可变基团的所有可能的组合及置换(其中化学可行)。
在某些实施方式中，式(I)化合物选自：(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-羟基-N-甲基丙酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3R)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-羟基-N-甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-(二甲基氨基)-N-((S)-3-羟基-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-((2-(吡啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺；(2S,3R)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-羟基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-((2-(吡啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；(2S)-2-(二甲基氨基)-N-((2S)-3-羟基-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((2S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-((2-(哌啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺；(2S,3R)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-羟基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((2S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-((2-(哌啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-氨基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丙酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-N-((S)-3-氨基-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-((2-(吡啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丙酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-4-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-4-氨基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((S)-2-(氨氧基)-3-甲基丁酰氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-((2-(吡啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-羟基丙酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((2S,3R)-2-(二甲基氨基)-3-羟基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸；(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-2-((2S,3R)-2-(二甲基氨基)-3-羟基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰胺；(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-羟基丙酰氨基)-N,3-二甲基丁酰胺；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((R)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-巯基-N-甲基丙酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((R)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-巯基-N-甲基丙酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-羟基-N-甲基丙酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3R)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-羟基-N-甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-羟基丙酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((2S,3R)-2-(二甲基氨基)-3-羟基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-氨基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸甲酯；(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-氨基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰氨基)-3-苯基丙酸；(2S,3S)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(苯乙基氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；(2S,3S)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；(2S,3S)-3-叠氮基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-氯苯乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰胺；(2S,3S)-3-叠氮基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-氯苯乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰胺；(2S,3S)-3-氨基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(苯乙基氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；(2S,3S)-3-氨基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；(2S,3S)-3-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-氯苯乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰胺；(2S,3S)-3-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-氯苯乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰胺；(S)-4-氨基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(苯乙基氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；(S)-4-氨基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；(S)-4-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-氯苯乙基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰胺；(S)-4-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((2-氯苯乙基)胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基戊-4-炔酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯基丙氨酸甲酯；(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰胺；(2S,3S)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-((2-(吡啶-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；(2S,3S)-3-叠氮基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-缬氨酸甲酯；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-6-氨基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基己酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯基丙氨酸甲酯；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,4S)-4-叠氮基-1-(二甲基-L-缬胺酰基)-N-甲基吡咯啶-2-羧酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯基丙氨酸甲酯；(S)-3-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-4-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-3-(((S)-1-甲氧基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-4-氧代丁酸；(2S,3R)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-3-羟基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-丝氨酸甲酯；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-异亮氨酸甲酯；(2S,3S)-3-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰胺；(2S,3S)-3-氨基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-3-叠氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丙酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯基丙氨酸甲酯；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-叠氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯基丙氨酸甲酯；(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-3-叠氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺；((2S,3S)-3-叠氮基-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-(叔丁基氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-叠氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯基丙氨酸第三丁酯；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-叠氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯基丙氨酸第三丁酯；(2S,3S)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；(2S,3S)-3-叠氮基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺；(2S,3S)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-氨基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯基丙氨酸第三丁酯；(2S,3S)-3-氨基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(1H-四唑-5-基)乙基)氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；和(2S,3S)-3-氨基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-(((S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙基)氨基)丙基)吡咯啶-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N-甲基丁酰胺；及其药学上可接受的盐。
本文还提供式(I)化合物的药学上可接受的盐(优选上文描述的那些及本文示例的特定化合物的药学上可接受的盐)、包含此类盐的药物组合物及使用此类盐的方法。
“药学上可接受的盐”旨在表示本文表示的化合物的游离酸或游离碱的盐，其无毒、生物可容许或另外在生物上适用于向对象给予。参见通常S.M.Berge等人，“《药物盐》(Pharmaceutical Salts)”，J.Pharm.Sci.1977,66,1-19。优选的药学上可接受的盐是药理上有效且适用于与对象的组织接触而无异常毒性、刺激性或过敏反应的那些。本文描述的化合物可具有足够酸性的基团、足够碱性的基团或该两种类型的官能基并因此与许多无机碱或有机碱及无机酸及有机酸反应以形成药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实施例包括：酸加成盐，例如硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、一氢磷酸盐、二氢磷酸盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、酞酸盐、磺酸盐、甲基磺酸盐、丙基磺酸盐、苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、甘醇酸盐、酒石酸盐及杏仁酸盐；及与无机碱(例如钠、钾、镁、钙、铝及类似物)或有机碱(例如甲胺、乙胺、乙醇胺、赖氨酸、鸟氨酸及类似物)形成的盐；与各种氨基酸或氨基酸衍生物例如乙酰基亮氨酸及类似物)形成的盐；铵盐等。
出于治疗目的，包含本文描述的化合物的药物组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂是非毒性的且另外在生物上适用于向对象给予的物质。此类赋形剂促进本文描述的化合物的调配及给予且与活性成分相容。药学上可接受的赋形剂的实施例包括稳定剂、润滑剂、表面活性剂、稀释剂、抗氧化剂、黏合剂、着色剂、乳化剂或口味改良剂。在优选实施方式中，药物组合物是无菌组合物。
本文描述的药物组合物可根据本领域中已知的用于制备各种剂型的常规方法调配成合适的药物溶剂或载剂中的溶液、乳液、悬浮液或分散液或调配成丸剂、片剂、锭剂、栓剂、用于重建的粉剂或载有固体载剂的胶囊。就局部应用而言，本文描述的化合物优选调配成适用于局部给予的霜剂或软膏或类似载体。本文描述的药物组合物及化合物可在本发明方法中通过合适的递送路径(例如，经口、经鼻、非经肠、经直肠、局部、经眼睛或经吸入)给予。
如本文使用的术语“治疗”或“处理”旨在表示产生治疗益处的目的向对象给予本文描述的化合物。治疗包括逆转、减轻、缓解、抑制疾病、失调症或病症或癌症的一种或多种症状的发展或减小疾病、失调症或病症或癌症的一种或多种症状的严重性。术语“对象”指需此种治疗的哺乳动物患者(例如人类)。
在本文提供的治疗方法中，“有效量”表示足以通常在需此种治疗的对象中产生所需治疗利益的量或剂量。此外，术语“治疗有效量”表示相较于未接受此种量的相应的对象，导致(但不限于)疾病、失调或副作用的治愈、预防或减轻或减小疾病或失调症的发展速率的任何量。该术语还将有效增强正常生理功能的量及有效引起对象(例如人类)中的生理功能的量包括在其范围内，其增强或有助于第二药物剂的治疗性效应。本文描述的化合物的有效量(包括治疗有效量)或剂量可通过例行方法(例如建模、剂量递增或临床试验)，将例行因素例如，给予或药物递送的模式或途径；药剂的药物动力学；感染的严重性及病程；对象的健康状态、病症与体重及治疗医师的判断考虑在内来确定。用于本文揭示的抗体药物偶联物的示例性剂量在每公斤对象体重每天约1ug至2mg活性化合物的范围内；优选约0.05至100mg/kg/天或约1至35mg/kg/天或约0.1至10mg/kg/天。总剂量可以单一或分开的剂量单元(例如，BID、TID、QID)给予。
本文描述的化合物可在癌症的治疗中与额外活性成分组合用于药物组合物或方法中。该额外活性成分可独立于本文描述的化合物给予或可与本文描述的化合物一起包本文提供的药物组合物中。例如，额外活性成分是已知或已发现可有效治疗癌症的那些，包括针对与癌症相关联的另一目标的活性的那些，例如(但不限于)维卡德(Velcade)、利妥昔单抗、氨甲喋呤、贺赛汀(Herceptin)、长春新碱、氯泼尼松、伊立替康(Irinotecan)或类似物或其组合。此种组合可有助于增加所揭示化合物的疗效；减少一种或多种副作用或减小所需剂量。
现将通过参考下文用于式(I)化合物的一般制备的描绘性合成方案及后续具体实施例描述式(I)化合物。技术人员将知晓为获得本文的各种化合物，可适当选择起始材料以使得最终所需取代基将通过任选具有或不具有保护的反应方案载有以产生所需产品。或者，可必需或需要采用可通过反应方案载有且任选经所需取代基置换的合适基团代替最终所需取代基。另外，本领域技术人员将知晓保护基团可用以自反应条件下保护某些官能基(氨基、羧基或侧链基团)，且在适当时于标准条件下移除此类基团。描绘于方案A中的各反应优选在自约室温至所用有机溶剂的回流温度的温度下进行。除非另有规定，否则变量如上文参考式(I)所定义。
方案A
参考方案A，式(I)化合物的制备起始于标记为(A)的多拉异亮氨酸(Dil)的经保护的酸形式(参见Pettit等人，(1994)J.Org.Chem.59：1796-1800)。化合物(A)以叔丁酯保护基团表示，但本领域技术人员可选择适当的替代。与氮受保护的缬氨酸或异亮氨酸衍生物(B)(其中PG是合适的氨基保护基团，例如Boc(第三丁氧基羰基)或茀基甲氧基羰基(Fmoc)基团)的偶合在标准肽偶合条件下实现。例如，反应在以下各物的存在下进行：氰基膦酸二乙酯(DEPC)、PyBrOP、PyBOP、BOP、二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂-苯并三唑(HOAt)、HBTU(六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓)、HATU(六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓)及类似物或其组合。反应通常在三级胺碱(例如二异丙基乙胺)的存在下进行。合适的溶剂包括二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯及类似物。所得的二肽(C)上的氨基保护基团通过在合适条件下的去保护来移除。例如，在PG是Boc基团的情况下，化合物(C)经三氟乙酸处理以形成游离胺(D)。在PG是Fmoc基团的情况下，化合物(C)经哌啶或二乙胺处理以产生化合物(D)。然后化合物(D)在如上文描述的肽偶合条件下偶合至氨基酸衍生物(E)(若必要可呈受保护的形式)，以产生三肽(F)。用酸处理以移除羧基保护基团以提供游离酸(G)。
方案B
参考方案B，使命名为(H)的氨基受保护的多拉脯氨酸(Dap)(参见Pettit等人，(1994)J.Org.Chem.59：6287-6295)与胺(J)(使用本领域技术人员已知的方法制得)在如上文描述的肽偶合条件下偶合。所得的二肽(K)如针对方案A所述去保护以提供化合物(L)。
方案C
参考方案C，酸(G)及胺(L)是在如上文讨论的肽偶合条件下偶合以提供式(I)化合物。其中反应结果是式(I)的受保护形式，采用合适的去保护条件以产生目标化合物。
本文还提供包含有效量的至少一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文还提供治疗罹患癌症或经诊断患有癌症的对象的方法，该方法包括向需此种治疗的对象给予有效量的至少一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐。
本文还提供至少一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐于治疗需此种治疗的对象中的癌症的用途。
本文还提供至少一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐于制备用于治疗需此种治疗的对象中的癌症的药物的用途。
本文还提供含有至少一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐的试剂盒(其用于治疗需此种治疗的对象中的癌症)及使用说明。
本文还提供包含至少一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐的制备的对象，其用于治疗需此种治疗的对象中的癌症。
本文还提供抗体药物偶联物(ADC)，其中式(I)化合物偶联至抗体。
利用式(I)的示例性ADC具有下列结构，其中“L”或“mAb-s-”表示命名为本文阐述的CHv62.21的FLT3 MAb。
另外，利用式(I)的其他示例性ADC具有下列结构，其中“L”或“mAb-s-”表示命名为本文阐述的CHv62.21pAF的FLT3 MAb。
在一优选实施方式中，式(I)化合物包含药物单元，该药物单元包含表示为(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-3-叠氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺的化合物。
在一优选实施方式中，式(I)化合物包含药物单元，该药物单元包含下文阐述为式(II)的化合物：
IX.)药物负载
药物负载由p表示且为分子中每个抗体的药物部分的平均数量。药物负载可在每个抗体1至20个药物部分(D)的范围内。本发明的ADC包括与自1至20个药物部分偶联的抗体的集合。在由结合反应制备ADC中每个抗体的药物部分的平均数量可通过常规方式例如质谱法及ELISA分析来表征。还可测定ADC中p的定量分布。在一些实施例中，其中p是具有其他药物负载的ADC的某一值的均质ADC的分离、纯化及表征可通过例如电泳的方式达成。
就一些抗体-药物偶联物而言，p可受抗体上的连接位点的数量限制。例如，在该连接为半胱氨酸硫醇的情况下，抗体可具有仅一个或数个半胱氨酸硫醇基团，或可具有仅一个或数个足够反应性硫醇基团，接头可通过该基团连接。在某些实施方式中，较高药物负载(例如，p>5)可引起某些抗体-药物偶联物聚集、不溶、具毒性或损失细胞渗透性。在某些实施方式中，本发明的ADC的药物负载在自1至约8的范围内；自约2至约6的范围内；自约3至约5的范围内；自约3至约4的范围内；自约3.1至约3.9的范围内；自约3.2至约3.8的范围内；自约3.2至约3.7的范围内；自约3.2至约3.6的范围内；自约3.3至约3.8的范围内或自约3.3至约3.7的范围内。事实上，已显示针对某些ADC而言，每个抗体的药物部分的最佳比率可小于8且可为约2至约5。
在某些实施方式中，小于理论最大值的药物部分在偶联反应期间偶联至抗体。如下文讨论，抗体可含有(例如)不与药物-接头中间物或接头试剂反应的赖氨酸残基。通常，抗体不含有可连接至药物部分的许多游离及反应性半胱氨酸硫醇基团；事实上抗体中大多数半胱氨酸硫醇残基以双硫桥形式存在。在某些实施方式中，抗体可用还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)在部分或完全还原条件下还原，以产生反应性半胱氨酸硫醇基团。在某些实施方式中，使抗体经受变性条件以暴露反应性亲核基团(例如赖氨酸或半胱氨酸)。
ADC的负载(药物/抗体比率)可用不同方式进行控制，例如，通过：(i)相对于抗体限制药物-接头中间物或接头试剂的摩尔过量；(ii)限制偶联反应时间或温度；(iii)部分限制或限制用于半胱氨酸硫醇修饰的还原条件；(iv)通过重组技术改造抗体的氨基酸序列以使得半胱氨酸残基的数量及位置经修饰以控制接头-药物结合的数量和/或位置(例如如本文及WO2006/034488(以全文引用的方式并入本文中)中所揭示制得的thioMab或thioFab)。
应了解当多于一个亲核基团与药物-接头中间物或接头试剂、接着药物部分试剂反应时，然后所得产物是具有一个或多个药物部分连接至抗体的分布的ADC化合物的混合物。每个抗体的药物平均数量可自混合物通过双ELISA抗体分析计算，该分析对抗体具有特异性且对药物具有特异性。个别ADC分子可通过质谱法于混合物中识别出并通过HPLC例如疏水性相互作用层析法分离(参见，例如，Hamblett,K.J.等，“《药物载量对抗CD30抗体药物偶联物的药理学、药代动力学和毒性的作用》(Effect of drug loading on thepharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30antibody-drugconjugate)”，摘要编号624，美国癌症研究协会(American Association for CancerResearch)，2004年会，2004年3月27-31日，AACR会议记录，卷45，2004年3月；Alley,S.C.等人，“《抗体药物偶联物中药物连接位置的控制》(Controlling the location of drugattachment in antibody-drug conjugates)”，摘要编号627，美国癌症研究协会，2004年会，2004年3月27-31日，AACR会议记录，卷45，2004年3月)。在某些实施方式中，具有单一负载值的均质ADC可通过电泳或层析法自偶联混合物分离。
X.)测定ADC的细胞毒性效应的方法
判定药物或抗体-药物偶联物是否对细胞发挥细胞增殖抑制和/或细胞毒性效应的方法是已知的。通常，抗体药物偶联物的细胞毒性或细胞增殖抑制活性可通过以下测量：将表达抗体药物偶联物的靶蛋白的哺乳动物细胞曝露于细胞培养基中；培养该细胞约6小时至约5天的时段；及测量细胞存活率。可使用基于细胞的体外分析以测量抗体药物偶联物的存活率(增殖)、细胞毒性及细胞凋亡的诱发(胱冬酶(caspase)活化)。
为判定抗体药物偶联物是否发挥细胞增殖抑制效应，可使用胸苷并入分析。例如，可于96孔板上以每孔5,000个细胞的密度接种表达靶抗原的癌细胞培养72小时时段并在72小时时段的最终8小时期间曝露于0.5μCi 3H-胸苷。在存在或缺乏抗体药物偶联物的情况下测量培养物的细胞中3H-胸苷的并入。
为测定细胞毒性，可测量细胞坏死或细胞凋亡(程序化细胞死亡)。坏死通常伴随质膜的渗透性增加；细胞膨胀及质膜破裂。细胞凋亡的特征通常为膜起泡、细胞质凝缩及内源性核酸内切酶的活化。对癌细胞的任一这些效应的测定指示抗体药物偶联物适用于癌症治疗。
细胞存活率可通过测定细胞中染料(例如中性红、台盼蓝或ALAMARTM蓝)的吸收来测量(参见，例如，Page等人，1993,Intl.J.Oncology 3：473-476)。在此种分析中，该细胞可培养在含有该染料的培养基中，清洗该细胞并通过分光亮度计测量剩余的染料(其反映细胞对染料的吸收)。还可使用结合蛋白质的染料磺酰罗丹明B(SRB)以测量细胞毒性(Skehan等人，1990,J.Natl.Cancer Inst.82：1107-12)。
或者，在用于通过检测活细胞而非死细胞来测定哺乳动物细胞存活及增殖的定量比色分析中使用四唑鎓盐(例如MTT)(参见，例如，Mosmann,1983,J.Immunol.Methods 65：55-63)。
细胞凋亡可通过测量例如DNA片段化来定量。可利用用于DNA片段化的定量体外测定的市售亮度计方法。此类分析的实例(包括基于TUNEL(其检测片段化的DNA中经标记的核苷酸的并入)及ELISA的分析)描述于Biochemica,1999，第2期，第34至37页(罗氏分子生物(Roche Molecular Biochemicals))中。
细胞凋亡还可通过测量细胞中的形态学变化测定。例如，与细胞坏死一样，质膜完整性的损失可通过测量某些染料(例如，荧光染料，例如，例如，吖啶橙或溴化乙锭)的吸收确定。用于测量凋亡细胞数量的方法已由Duke及Cohen,《新编免疫学实验指南》(CurrentProtocols in Immunology)(Coligan等人编，1992，第3.17.1至3.17.16页)描述。细胞还可经DNA染料(例如，吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙啶)标记且观察细胞的染色质凝缩及沿内核膜的蚀边现象。可经测量以确定细胞凋亡的其他形态学变化包括(例如)细胞质凝缩；膜起泡增加及细胞收缩。
可在培养物的附着及“漂浮”部分中测量凋亡细胞的存在。例如，两部分可通过移除上清液收集；胰蛋白酶消化附着细胞；在离心清洗步骤(例如，以2000rpm进行10分钟)后合并制备物及检测凋亡(例如，通过测量DNA片段化)。(参见，例如，Piazza等人，1995,Cancer Research 55：3110-16)。
可在合适的动物模型中评估FLT3治疗性组合物的体内效应。例如，可使用异种移植癌症模型，其中将癌症外植体(explant)或继代异种移植组织引入免疫受损动物例如裸小鼠或SCID小鼠中(Klein等人，1997,Nature Medicine 3：402-408)。例如，PCT专利申请WO98/16628及美国专利案6,107,540描述人类前列腺癌的各种异种移植物模型，该模型可再现原发性肿瘤的发展、微转移及晚期疾病的特征成骨性转移的形成。可使用测量肿瘤形成的抑制、肿瘤消退或转移及类似过程的分析预测疗效。
评估细胞凋亡促进的体内分析适用于评估治疗性组合物。在一个实施方式中，可检查经该治疗性组合物治疗的携带肿瘤的小鼠的异种移植物中细胞凋亡中心的存在并与未经治疗的携带异种移植物的对照小鼠比较。经治疗的小鼠的肿瘤中存在凋亡中心的程度指示该组合物的治疗性疗效。
用于实施前述方法的治疗性组合物可调配成包含适用于所需递送方法的载剂的药物组合物。合适的载剂包括当与该治疗性组合物组合时保留该治疗性组合物的抗肿瘤功能且通常不与患者的免疫系统反应的任何材料。实施例包括(但不限于)许多标准药物载剂例如无菌磷酸盐缓冲生理盐水溶液、抑菌水及类似物中的任何一种(参见，通常，《雷明顿的药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第16版，A.Osal.编，1980)。
治疗性调配物可经溶解并经由任何可将治疗性组合物递送至肿瘤部位的途径来给予。潜在有效给予途径包括(但不限于)静脉内、非经肠、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮肤内、器官内、原位及类似途径。用于静脉内注射的优选调配物包经防腐处理的抑菌水、未经防腐处理的无菌水的溶液中和/或稀释于含有0.9％注射用无菌氯化钠(USP)的聚氯乙烯或聚乙烯包中的治疗性组合物。治疗性蛋白质制剂可经冻干并以无菌粉末形式储存，优选在真空下储存，然后于抑菌水(含有例如苄醇防腐剂)或无菌水中重建后再注射。
使用前述方法治疗癌症的剂量及给予方案将随方法及靶癌症而变化，且将通常取决于本领域中了解的许多其他因素。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物可因CHv62.21 MAb或CHv62.21pAF MAb的修饰而包含多于一种本发明ADC。例如，本发明包括包含本发明ADC的药物组合物，其中该CHv62.21 Mab是缺乏重链C端赖氨酸的抗体、具有N端翻译后修饰的抗体、缺乏重链C端赖氨酸且具有N端翻译后修饰的抗体和/或具有重链C端赖氨酸且不具有N端翻译后修饰的抗体。
例如，本发明的药物组合物包括包含两种或更多种本发明ADC的药物组合物，其中ADC的CHv62.21 MAb选自由下列1)至4)组成的组：
1)包含重链及轻链的CHv62.21 MAb，该重链由自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成且该轻链由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成；
2)包含重链及轻链的CHv62.21 MAb，该重链由自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成，其中该N端残基1(E)转化成焦谷氨酸，且该轻链由自SEQID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成；
3)包含重链及轻链的CHv62.21 MAb，该重链由自SEQ ID NO：9的残基1(Q)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成，其中将该C端残基453(K)移除，且该轻链由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成；及
4)包含重链及轻链的CHv62.21 MAb，该重链由自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成，其中该N端残基1(E)转化成焦谷氨酸并将该C端残基453(K)移除，且该轻链由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物包括包含含有由自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成的重链及由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成的轻链的CHv62.21 MAb及含有由自SEQ ID NO：9的残基1(Q)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成的重链，其中将该C端残基453(K)移除，及由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成的轻链的CHv62.21 MAb的药物组合物。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物包括包含含有由自SEQ ID NO：9的残基1(Q)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成的重链，其中将该C端残基453(K)移除，及由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成的轻链的CHv62.21 MAb及含有由自SEQ ID NO：9的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成的重链，其中该N端残基1(E)转化成焦谷氨酸并将该C端残基453(K)移除及由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成的轻链的CHv62.21 MAb的药物组合物。
在一优选实施方式中，本发明的药物组合物包括包含两种或更多种本发明ADC的药物组合物，其中该ADC的CHv62.21pAF MAb选自由下列1)至4)组成的组：
1)包含重链及轻链的CHv62.21pAF MAb，该重链由自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成且该轻链由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成；
2)包含重链及轻链的CHv62.21pAF MAb，该重链由自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成，其中该N端残基1(E)转化成焦谷氨酸，且该轻链由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成；
3)包含重链及轻链的CHv62.21pAF MAb，该重链由自SEQ ID NO：11的残基1(Q)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成，其中将该C端残基443(T)移除，且该轻链由自SEQ IDNO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成；及
4)包含重链及轻链的CHv62.21pAF MAb，该重链由自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成，其中该N端残基1(E)转化成焦谷氨酸并将该C端残基443(T)移除，且该轻链由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物包括包含含有由自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成的重链及由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成的轻链的CHv62.21pAF MAb及含有由自SEQ ID NO：11的残基1(Q)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成的重链，其中将该C端残基443(T)移除，及由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成的轻链的CHv62.21pAF MAb的药物组合物。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物包括包含含有自SEQ ID NO：11的残基1(Q)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成的重链，其中将该C端残基443(T)移除，及由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成的轻链的CHv62.21pAFMAb及含有由自SEQ ID NO：11的残基1(E)至残基453(K)范围内的氨基酸序列组成的重链，其中该N端残基1(E)转化成焦谷氨酸并将该C端残基443(T)移除，及由自SEQ ID NO：10的残基1(D)至残基214(C)范围内的氨基酸序列组成的轻链的CHv62.21pAF MAb的药物组合物。
XI.)表达FLT3的癌症的治疗
识别FLT3为在有限组的组织或细胞中正常表达，但还在癌症(例如列于表I中的那些)中表达的蛋白质为此类癌症的治疗开辟许多治疗方法。
注意，靶抗肿瘤治疗已是有用的，甚至当靶蛋白表达于正常组织或细胞上，甚至表达于正常重要器官组织上。重要器官是维持生命所必需的器官，例如心脏或结肠。非重要器官是可移除且在移除后对象仍可存活的器官。非重要器官的实施例是卵巢、乳房及前列腺。
靶蛋白在正常组织(甚至正常重要组织)中的表达不能阻挠该蛋白质的靶向剂作为某些其中该蛋白质还过表达的肿瘤的治疗剂的效用。例如，在重要器官中的表达本身并不有害。另外，可移除认为不必要的器官(例如前列腺及卵巢)而不影响寿命。最后，一些重要器官因免疫豁免(immunoprivilege)而不受正常器官表达的影响。免疫豁免器官受血液器官屏障保护而与血液隔离的器官且因此无法接触免疫疗法。免疫豁免器官的实施例是脑及睪丸。
因此，抑制FLT3蛋白活性的治疗方法适用于罹患表达FLT3的癌症(例如，例如，那些阐述于表I中的癌症)的患者。这些治疗方法通常分为三类。第一类调节FLT3功能，因为其与肿瘤细胞生长有关，从而导致肿瘤细胞生长的抑制或延迟或诱发将其杀死。第二类包含抑制FLT3蛋白与其结合配偶体或与其他蛋白质的结合或缔合的各种方法。第三类包含抑制FLT3基因的转录或FLT3mRNA的翻译的各种方法。
因此，可评估癌症患者的FLT3表达的存在及程度，优选使用肿瘤组织的免疫组织化学评定；定量FLT3成像；或其他可靠地指示FLT3表达的存在及程度的技术。若适用，则肿瘤切片或手术样本的免疫组织化学分析优选用于此目的。本领域中熟知用于肿瘤组织的免疫组织化学分析的方法。
XIII.)FLT3作为基于抗体的疗法的标靶
FLT3是用于基于抗体的治疗性策略的具吸引力的标靶。本领域中已知多种用于靶向细胞外及细胞内分子的抗体策略(参见，例如，补体及ADCC介导的杀死及胞内抗体的使用)。因为相对于相应正常细胞，FLT3由各种谱系的癌细胞表达，所以制备FLT3-免疫反应性组合物的全身性给予，从而显示极佳敏感性且不会因免疫反应性组合物结合至非靶器官及组织引起的毒性、非特异性和/或非靶效应。与FLT3的结构域特异性反应的抗体适用于全身性治疗表达FLT3的癌症，优选以抗体药物偶联物(即ADC)形式，其中该组合物具有毒素或治疗剂。
本领域技术人员了解抗体可用以特异性靶向及结合免疫原性分子(例如显示于图1中的FLT3序列的免疫原性区)。另外，本领域技术人员了解将抗体结合至细胞毒剂为惯例(参见，例如，Slevers等人，Blood 93：11 3678-3684(1999年6月1日))。当将细胞毒性和/或治疗剂直接递送至细胞时，例如通过将它们结合至对由细胞表示的分子(例如，FLT3)具有特异性的抗体，该细胞毒剂将发挥其对那些细胞的已知生物效应(即，细胞毒性)。
本领域中已知用于使用抗体-细胞毒剂偶联物以杀死细胞的各种组合物及方法。在癌症的内容中，典型方法需要向罹患肿瘤的哺乳动物给予生物有效量的偶联物，该偶联物包含连接至靶向剂(例如，FLT3 MAb，优选CHv62.21或CHv62.21pAF)的选定的细胞毒性和/或治疗剂，该靶向剂结合所表达、易结合或定位于细胞表面上的抗原(例如，FLT3)。典型的实施方式是将细胞毒性和/或治疗剂递送至表达FLT3的细胞的方法，该方法包括将该细胞毒剂偶联至免疫特异性结合至FLT3表位的抗体，并将该细胞曝露于抗体药物偶联物(ADC)。另一说明性实施方式是治疗怀疑罹患转移性癌症的对象的方法，该方法包括向该对象非经肠给予包含治疗有效量的偶联至细胞毒性和/或治疗剂的抗体的药物组合物的步骤。
使用FLT3抗体的癌症免疫疗法可根据已成功应用于其他类型癌症的治疗中的各种方法完成，其他类型癌症包括(但不限于)结肠癌(Arlen等人，1998,Crit.Rev.Immunol.18：133-138)、多发性骨髓瘤(Ozaki等人，1997,Blood 90：3179-3186；Tsunenari等人，1997,Blood 90：2437-2444)、胃癌(KaspRzyk等人，1992,Cancer Res.52：2771-2776)、B细胞淋巴瘤(Funakoshi等人，1996,J.Immunother.Emphasis TumorImmunol.19：93-101)、白血病(Zhong等人，1996,Leuk.Res.20：581-589)、结肠直肠癌(Moun等人，1994,Cancer Res.54：6160-6166；Velders等人，1995,Cancer Res.55：4398-4403)及乳腺癌(Shepard等人，1991,J.Clin.Immunol.11：117-127)。一些治疗方法涉及裸抗体结合至毒素或放射性同位素，例如Y91或I131分别结合至抗CD20抗体(例如，ZevalinTM,IDECPharmaceuticals Corp.或BexxarTM,Coulter Pharmaceuticals)，同时其他治疗方法涉及抗体及其他治疗剂的共给予，例如HerceptinTM(曲妥珠单抗)及太平洋紫杉醇(Genentech,Inc.)。在一优选实施方式中，该抗体将偶联细胞毒剂(同上)，优选命名为MMAE的奥瑞司他汀衍生物(西雅图遗传学公司(Seattle Genetics))。
尽管FLT3抗体疗法适用于癌症的所有阶段，但抗体疗法可尤其适用于晚期或转移性癌症中。使用本发明的抗体疗法的治疗适用于已接受一或多轮化学疗法的患者中。或者，将本发明的抗体疗法与化学疗法或放射方案组合用于尚未接受化学疗法治疗的患者中。另外，抗体疗法可容许使用剂量减少的伴随化学疗法，特别就无法良好耐受化学治疗剂的毒性的患者而言。Fan等人，(Cancer Res.53：4637-4642,1993)；Prewett等人，(International J.of Onco.9：217-224,1996)及Hancock等人，(Cancer Res.51：4575-4580,1991)描述各种抗体连同化学治疗剂的使用。
治疗表I中所述的癌症的FLT3单抗包括启动强效抗肿瘤免疫反应的那些或具有直接细胞毒性的那些。在这方面，FLT3单抗(MAb)可通过补体介导或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)机制引起肿瘤细胞溶解，它们皆需要免疫球蛋白分子的完整的Fc部分与补体蛋白上的效应细胞Fc受体位点相互作用。另外，对肿瘤生长发挥直接生物效应的FLT3 MAb适用于治疗表达FLT3的癌症。细胞毒性MAb直接起作用的机制包括：细胞生长的抑制；细胞分化的调节；肿瘤血管形成因子概况的调节及细胞凋亡的诱发。特定FLT3 MAb发挥抗肿瘤效应的机制使用任何数量的评估细胞死亡的体外分析，例如ADCC、补体介导的细胞溶解等等分析评估，如本领域中通常已知。
因此，本发明的治疗方法中使用的优选单抗为完全人类的那些或以高亲和力特异性结合至目标FLT3抗原的那些。
XIV.)FLT3 ADC混合物
本发明的治疗方法涵盖给予单一FLT3 ADC及不同MAb(即，FLT3 MAb或结合另一蛋白质的MAb)的组合或混合物。此类MAb混合物由于含有靶向不同表位的MAb、利用不同效应机制或将直接细胞毒性Mab与依赖于免疫效应功能的MAb组合而可具有某些优点。组合的此种MAb可显示协同治疗效应。另外，FLT3 MAb可伴随其他治疗性方式，包括(但不限于)各种化学治疗剂及生物药剂、雄激素阻断剂、免疫调节剂(例如，IL-2、GM-CSF)、手术或放射给予。在一优选实施方式中，该FLT3 MAb以偶联形式给予。
FLT3 ADC调配物经由可将抗体递送至肿瘤细胞的任何途径给予。给予途径包括(但不限于)静脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮肤内等。治疗通常涉及经由可接受的给予途径(例如静脉内注射(IV))重复给予FLT3 ADC制剂，其剂量范围通常包括(但不限于)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25mg/kg体重。一般而言，每周10至1000mg MAb的剂量范围是有效的且耐受性良好。
基于利用(曲妥珠单抗)治疗转移性乳腺癌的临床经验，MAb制剂的每kg患者体重约4mg的IV初始装载剂量且接着每周每kg约2mg的IV剂量表示可接受的给药方案。优选地，该初始装载剂量以90分钟或更长时间的输注形式给予。该定期维持剂量以30分钟或更长时间的输注形式给予，其限制条件为初始剂量耐受良好。如本领域技术人员知晓，在特定情况下，各种因素可影响理想剂量方案。此类因素包括(例如)所用MAb的结合亲和力及半衰期；患者中的FLT3表达程度；循环排出FLT3抗原的程度；所需稳态抗体浓度水平；治疗频率；及化学治疗或其他药剂与本发明的治疗方法组合使用的影响及特定患者的健康状态。
任选地，应于给定样品中评估患者的FLT3含量(例如，循环FLT3抗原和/或FLT3表达细胞的含量)以帮助判定最有效给药方案等。此类评估还用于整个治疗中的监测目的及适用于结合评估其他参数(例如，膀胱癌治疗中的尿细胞学和/或ImmunoCyt含量，或以此类推，前列腺癌疗法中的血清PSA含量)估量治疗成果。
本发明的一目的在于提供FLT3 ADC，其抑制或延迟表达FLT3的肿瘤细胞的生长。本发明的另一目的在于提供使用此类FLT3 ADC及(具体地)使用此类FLT3ADC与其他药物或免疫活性治疗的组合来抑制血管形成及其他生物功能并从而减少哺乳动物(优选人类)的肿瘤生长的方法。
XV.)组合疗法
在一个实施方式中，当肿瘤(包括人类肿瘤)经FLT3 ADC结合化学治疗剂或放射或其组合治疗时产生协同作用。换言之，通过FLT3 ADC对肿瘤生长的抑制相较于当组合化学治疗剂或放射或其组合时增强超过预期。可例如通过组合治疗对肿瘤生长的抑制超过仅FLT3 ADC的治疗所预期的效应或使用FLT3 ADC及化学治疗剂或放射的治疗的累加效应来显示协同作用。优选地，通过癌症的缓解证实协同作用，其中自FLT3 ADC的治疗或使用FLT3ADC及化学治疗剂或放射的累加组合的治疗未预期缓解。
使用FLT3 ADC及化学疗法或放射或二者的组合抑制肿瘤细胞的生长的方法包括在开始化学疗法或放射疗法之前、期间或之后以及其任何组合(即，在开始化学疗法和/或放射疗法之前及期间、之前及之后、期间及之后或之前、期间及之后)给予FLT3 ADC。例如，FLT3 ADC通常在开始放射疗法和/或化学疗法前1至60天，优选3至40天，更好5至12天给予。然而，取决于治疗方案及具体患者需求，该方法可以提供最有效治疗并最终延长患者生命的方式进行。
化学治疗剂的给予可以各种方式完成，包括通过非经肠及经肠途径全身性给予。在一个实施方式中，该FLT3 ADC及化学治疗剂作为独立分子进行给予。化学治疗剂或化学疗法的特定实施例包括顺铂、达喀尔巴嗪(dacarbazine，DTIC)、放线菌素(dactinomycin)、二氯甲二乙胺(氮芥)、链脲菌素(streptozocin)、环磷酰胺、卡莫司汀(carmustine，BCNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)、多柔比星(阿霉素)、道诺霉素、丙卡巴肼(procarbazine)、丝裂霉素、阿糖胞苷(cytarabine)、依托泊苷、胺甲喋呤、5-氟尿嘧啶、长春花碱、长春新碱、博来霉素(bleomycin)、太平洋紫杉醇(紫杉醇)、多西他赛(紫杉德(taxotere))、阿地白介素(aldesleukin)、天冬酰胺酶、白消安(busulfan)、卡铂、克拉屈滨(cladribine)、达喀尔巴嗪、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨、羟基脲、依弗酰胺(ifosfamide)、干扰素α、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、霉法兰(melphalan)、巯嘌呤(mercaptopurine)、普卡霉素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培加帕酶(pegaspargase)、喷司他汀、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素、链脲菌素、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、睪内酯(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶芥(uracilmustard)、长春瑞滨、吉西他滨(gemcitabine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、紫杉醇及其组合。
组合FLT3 ADC使用的放射源可在所治疗患者外部或内部。当该放射源在患者外部时，该疗法称为外粒子束放射疗法(EBRT)。当该放射源在患者内部时，该疗法称为近程放射疗法(BT)。
上文描述的治疗性方案可进一步与额外癌症治疗剂和/或方案(例如额外化学疗法、癌症疫苗、信号转导抑制剂、对治疗异常细胞生长或癌症有用的药剂、抗体(例如，如描述于WO/2005/092380(辉瑞公司(Pfizer))中的抗CTLA-4抗体)或通过结合至IGF-1R及细胞因子来抑制肿瘤生长的其他配体)组合。
当哺乳动物经受额外化学疗法时，可使用上文描述的化学治疗剂。另外，可使用生长因子抑制剂、生物反应调节剂、抗激素疗法、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、血管形成抑制剂及抗雄激素剂。例如，可使用抗激素剂，例如抗雌激素剂，例如Nolvadex(他莫昔芬)，或抗雄激素剂，例如Casodex(4'-氰基-3-(4-氟苯基磺酰基)-2-羟基-2-甲基-3-'-(三氟甲基)丙酰苯胺)。
上文治疗方法可与各种手术、化学疗法或放射疗法方案中的任何一种组合。本发明的治疗方法可使用低剂量的化学疗法(或其他疗法)和/或频率较低的给予，这针对所有患者且尤其针对无法良好耐受化学治疗剂毒性的那些为一优点。
XVI.)试剂盒/制品
用于本文描述的实验室、预后、预防、诊断及治疗性应用的试剂盒在本发明的范围内。此类试剂盒可包含分成各区室以容纳一个或多个容器(例如小瓶、管及类似物)的载器、包装或容器，各容器包含本方法中待使用的各分离元件之一以及包含使用(例如本文描述的使用)说明书的标签或插页。例如，该容器可包含经或可经可检测物标记的抗体。试剂盒可包含含有药物单元的容器。该试剂盒可包括图2A、2B和/或2C或图3A、3B和/或3C中的氨基酸序列的全部或部分或其类似物或编码此类氨基酸序列的核酸分子。
本发明的试剂盒将通常包含上文描述的容器及一个或多个与其相关的其他容器，该其他容器包含商业及用户立场所需的材料(包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器)；列有内含物和/或使用说明书的载器、包装、容器、小瓶和/或管标签及具有使用说明书的包装插页。
标签可存在于容器上或可与容器一起存在以指示组合物用于特定疗法或非治疗性应用，例如预后、预防、诊断或实验室应用，且还可指示针对体内或体外使用指导(例如本文描述的那些)。与试剂盒一起包括在内或包括于试剂盒上的插页或标签还可包括指导及或其他信息。该标签可位于容器上或伴随容器。当形成卷标的字母、数字或其他字符模制或蚀刻于容器本身中时，标签可位于容器上；当标签存在于还容纳容器的贮器或载器内时，标签可伴随容器，例如，作为包装插页。该卷标可指示组合物用于诊断、治疗、预防或预后病症，例如阐述于表I中的组织癌症。
术语“试剂盒”及“制品”可作为同义词使用。
在本发明的另一实施方式中，提供含有组合物(例如抗体或抗体药物偶联物(ADC)，例如适用于组织癌症(例如阐述于表I中的那些)的诊断、预后、预防和/或治疗的材料)的制品。该制品通常包含至少一个容器及至少一个标签。合适的容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器及试管。该容器可由各种材料例如玻璃、金属或塑料形成。该容器可容纳氨基酸序列、小分子、核酸序列、细胞群体和/或抗体。在另一实施方式中，容器包含用于评估细胞及组织中的FLT3蛋白表达或用于相关实验室、预后、诊断、预防及治疗目的的抗体、其结合片段或特异性结合蛋白；关于此类用途的指示和/或指导可包括于此种容器上或与此种容器一起包括在内，用于这些目的的试剂及其他组合物或工具还可包括于此种容器上或与此种容器一起包括在内。
容器可另外容纳有效治疗、诊断、预后或预防病症的组合物且可具有无菌存取口(例如，该容器可为静脉内溶液包或具有可通过皮下注射针刺破的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂可为可特异性结合FLT3的抗体或特异性结合FLT3的抗体药物偶联物。
制品可进一步包含第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和/或右旋糖溶液。其可进一步包括依据商业及用户立场所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、搅拌器、针、注射器和/或具有使用指示和/或说明的包装插页。
本文揭示内容的其他实施方式包括描述于下列项目(clause)中的实施方式：
项目1是抗体的实施方式，其中该抗体包含具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDRH3、具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDRL2及具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDRL3。在替代实施方式中，该抗体包含如通过Chothia方法测定的如表V中所示的CDR。在其他替代实施方式中，该抗体包含如通过Contact方法测定的如表V中所示的CDR。
项目2是另一实施方式，其中该抗体是项目1的抗体，且其中该抗体包含自SEQ IDNO：11的第1个E至第123个S范围内的氨基酸序列组成的重链可变区且包含由自SEQ ID NO：10的第1个D至第108个R范围内的氨基酸序列组成的轻链可变区。
项目3是另一实施方式，其中该抗体是前述项目中任一项的抗体，且其中该抗体包含由通过依据ATCC登录号PTA-121831保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的抗体的重链可变区的氨基酸序列组成的重链可变区且包含由通过依据ATCC登录号PTA-121831保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)产生的抗体的轻链的氨基酸序列组成的轻链可变区；或其中该抗体包含由通过依据ATCC登录号PTA-121836保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的抗体的重链可变区的氨基酸序列组成的重链可变区且包含由通过依据ATCC登录号PTA-121836保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)产生的抗体的轻链的氨基酸序列组成的轻链可变区。
项目4是另一实施方式，其中该抗体是前述项目中任一项的抗体，且其中该抗体包含IgG亚型的Fc区。
项目5是另一实施方式，其中该抗体是前述项目的抗体，且其中该Fc区包含在重链的氨基酸位置124的非天然氨基酸的取代，且其中该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸(pAF)。
项目6是另一实施方式，其中该抗体是前述项目中任一项的抗体，且其中该抗体包含由SEQ ID NO：11的氨基酸编号1至452的氨基酸序列组成的重链且包含由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个范围内的氨基酸序列组成的轻链。在项目6的替代实施方式中，该抗体是项目1或项目2的抗体，其中该抗体包含由SEQ ID NO：11的氨基酸编号1至452的氨基酸序列组成的重链且包含由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个范围内的氨基酸序列组成的轻链。
项目7是另一实施方式，其中该抗体是前述项目中任一项的抗体，且其中该抗体包含由自SEQ ID NO：11的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链且包含由自SEQID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链。在项目7的替代实施方式中，该抗体是项目1或项目2的抗体，其中该抗体包含由自SEQ ID NO：11的第1个E至第453个K范围内的氨基酸序列组成的重链且包含由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
项目8是另一实施方式，其中该抗体是前述项目中任一项的抗体，且其中该抗体包含由通过依据美国菌种保存中心(ATCC)登录号PTA-121831保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的抗体的重链的氨基酸序列组成的重链，且包含由通过依据ATCC登录号PTA-121831保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的抗体的轻链的氨基酸序列组成的轻链。项目8的替代实施方式是项目5的抗体，其中该抗体包含由通过依据美国菌种保存中心(ATCC)登录号PTA-121831保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的抗体的重链的氨基酸序列组成的重链，且包含由通过依据ATCC登录号PTA-121831保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的抗体的轻链的氨基酸序列组成的轻链。
项目9是另一实施方式，其中该抗体是前述项目中任一项的抗体，且其中该抗体包含由通过依据ATCC登录号PTA-121836保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的抗体的重链的氨基酸序列组成的重链，且包含由通过依据ATCC登录号PTA-121836保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)产生的抗体的轻链的氨基酸序列组成的轻链。项目9的替代实施方式是项目1至5中任一项的抗体，其中该抗体包含由通过依据ATCC登录号PTA-121836保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的抗体的重链的氨基酸序列组成的重链，且包含由通过依据ATCC登录号PTA-121836保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)产生的抗体的轻链的氨基酸序列组成的轻链。
项目10是另一实施方式，其中该抗体是前述项目中任一项的抗体，且其中该重链或该重链可变区的第1个E被焦谷氨酸盐取代。
项目11是另一实施方式，其中该抗体是项目1至5中任一项的抗体，且其中该抗体包含由自SEQ ID NO：11的第1个E至第452个G范围内的氨基酸序列组成的重链，且其中将该重链或该重链可变区的第1个E修饰为焦谷氨酸盐，且其中该抗体包含由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链。项目11的替代实施方式是项目1至6中任一项的抗体，其中该抗体包含由自SEQ ID NO：11的第1个E至第452个G范围内的氨基酸序列组成的重链，且其中将该重链或该重链可变区的第1个E修饰为焦谷氨酸盐，且其中该抗体包含由自SEQ ID NO：10的第1个D至第214个C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
项目12是另一实施方式，其包含前述项目中任一项的抗体的CDR的抗原结合片段，且其中该抗原结合片段结合FLT-3。
项目13是另一实施方式，其是前述项目的抗原结合片段，其中该抗原结合片段选自：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、经分离的VH及经分离的VL。
项目14是抗体，其包含项目12或项目13的抗原结合片段。
项目15是另一实施方式，其是与前述项目1至10或14中任一项的抗体具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的抗体，且其中该抗体包含前述项目中任一项的抗体的CDR。
项目16是另一实施方式，其是项目15的抗体，该抗体以与项目15的相应抗体相同的亲和力结合FLT3，且不实质抑制FL结合至FLT3。
项目17是另一实施方式，其为编码项目1至10或14中任一项的抗体的一种或多种分离核酸。
项目18是另一实施方式，其为编码项目12或13的抗体或片段的一种或多种分离核酸。
项目19是项目17或18的核酸的另一实施方式，其与相应项目的核酸具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。
项目20是另一实施方式，其为一种或多种包含项目17或项目18或项目19的一种或多种分离核酸的表达载体。在项目20的一个实施方式中，具有一种表达前述项目中任一项的抗体的重链及轻链的表达载体。在另一实施方式中，项目20的表达载体包含两个启动子。在替代实施方式中，项目20的表达载体包含一个启动子。在项目20的一不同实施方式中，具有两种表达载体，它们中的一种表达重链，且它们中的另一种表达轻链。在另一实施方式中，项目20的各表达载体包含相同启动子。在又另一实施方式中，项目20的各表达载体包含不同启动子。
项目21是另一实施方式，其是包含前述项目(项目20)的一种或多种表达载体的重组宿主细胞。
项目22是另一实施方式，其是通过培养前述项目(项目21)的重组宿主细胞产生的抗体。
项目23是另一实施方式，其是包含前述项目(项目22)的抗体及治疗剂的抗体药物偶联物。
项目24是一实施方式，其是包含结合FLT3的抗体及治疗剂的抗体药物偶联物，其中该抗体药物偶联物不实质抑制FLT3结合至FLT3配体(FL)。
项目25是另一实施方式，其是项目23或项目24的抗体药物偶联物，其进一步包含连接该抗体及该治疗剂的接头。
项目26是另一实施方式，其是项目25的抗体药物偶联物，其中该接头是非可裂解的接头。
项目27是另一实施方式，其是项目26的抗体药物偶联物，其中该接头是2-(氨氧基)乙酸。
项目28是另一实施方式，其是项目23至27中任一项的抗体药物偶联物，其中该治疗剂是细胞毒性或细胞增殖抑制剂。
项目29是另一实施方式，其是项目23至28中任一项的抗体药物偶联物，其中该治疗剂是(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-3-叠氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺。
项目30是另一实施方式，其是抗体药物偶联物，其中该抗体药物偶联物是项目23至29中任一项，且其中该抗体药物偶联物具有下式：抗体-(接头-治疗剂)p，其中该接头是2-(氨氧基)乙酸，且其中该治疗剂是(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-3-叠氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺且其中p选自：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3。
项目31是另一实施方式，其是项目30的抗体药物偶联物，其中p选自：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3。
项目32是另一实施方式，其是项目31的抗体药物偶联物，其中p选自：1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5。
项目33是另一实施方式，其是项目32的抗体药物偶联物，其中p选自：1.8、1.9及2。
项目34是另一实施方式，其是药物组合物，其中该药物组合物包含治疗有效量的如项目23至33中任一项的抗体药物偶联物。
项目35是另一实施方式，其是项目34的药物组合物，其用于治疗。
项目36是另一实施方式，其为药物组合物，其中该药物组合物根据前述项目(项目35)，其中该治疗用途是治疗癌症。
项目37是另一实施方式，其为药物组合物，其中该药物组合物根据项目34至36中任一项，其与一种或多种抗肿瘤剂组合。
项目38是另一实施方式，其是治疗对象的癌症的方法，其中该治疗对象的癌症的方法包括向该对象给予治疗有效量的如权利要求23至33中任一项的抗体药物偶联物或其药物组合物。项目37的另一实施方式是治疗对象的癌症的方法的一实施方式，其中该治疗对象的癌症的方法包括向该对象给予治疗有效量的如权利要求33至37中任一项的药物组合物。
项目39是另一实施方式，其是项目33至37中任一项的药物组合物或项目38的方法，其中该癌症包含如相较于非癌性细胞以高水平表达FLT3的一个或多个细胞。
实施例
通过以下数个实施例进一步描述及阐述本发明的各种方面，它们均无意限制本发明的范围。
实施例1
FLT3抗原
FLT3(Fms样酪氨酸激酶3受体，还称为Flk2(胎肝激酶2)、STK1(干细胞酪氨酸激酶1)及CD135)是III型受体酪氨酸激酶(RTK)中的一员。人类FLT3编码具有993个氨基酸长度的RTK，其包含具有五个类免疫球蛋白胞外结构域及两个通过激酶插入结构域连接的胞内酪氨酸激酶结构域(TKD)的膜结合受体(Stirewalt D L等人；Nat Rev Cancer；650-665(2003)。人类FLT3基因(Gene ID No.：2322(国家生物技术信息中心))位于染色体13q12上并与小鼠FLT3共享85％的氨基酸序列同源性(Rosnet O等人；Oncogene 8：173-179(1993)。FLT3表达于正常骨髓性及类淋巴性祖代细胞中且还表达于70-90％AML患者的白血病性细胞(Carow,C.E等人；Blood 87：1089-1096(1996)；Rosnet O等人；Leukemia 10：238-248(1996)且还表达于ALL中。已知FLT3涉及造血细胞的增殖、分化及凋亡。许多造血细胞产生FLT3配体(FLT3L)，其促进受体二聚化及活化，因此经由PI3激酶及MAPK路径诱发发信号级联反应(Stirewalt D L等人；Nat Rev Cancer；650-665(2003)。近似地，30％ AML患者具有FLT3内部串联复制(ITD)突变，该突变驱动受体的组成性活化及下游发信号级联反应，它们与较差疾病结果相关联(Gunawardane R N等人；Mom Cancer Ther 12：438-447(2013)。就FLT3抗原的示例性实施方式而言，参见图1。
实施例2
FLT3单抗(MAb)的产生
在一个实施方式中，针对FLT3的治疗性的单抗(“MAb”)包括将与结合至表达于细胞上的FLT3的特异性表位反应的那些。用于产生此种MAb的免疫原包括经设计以编码或含有胞外结构域或整个FLT3蛋白序列的那些；预期含有功能性基序的区域及FLT3的通过氨基酸序列的计算机分析预期具有抗原性的区域。免疫原包括肽、重组蛋白及细胞(它们内源性表达FLT3或已经改造以表达FLT3)。
使用技术(Regeneron,Tarrytown,NY)产生针对FLT3的MAb，其中经基因改造的小鼠制备具有完全人类可变区及小鼠恒定区的抗体。用重组人类FLT3蛋白免疫小鼠后产生命名为v62-1b21(还称为AGS62.21)的MAb。该FLT3 MAb(v62-1b21)特异性结合至F1T3蛋白及FlT3表达细胞(重组及内源性)。
选择后，v62-1b21(由杂交瘤细胞系天然产生)通过将抗体的人类可变序列与根据由Ambrx(La Jolla,CA)开发的ReCODE技术(参见，实施例4-使用重组DNA技术表达人类CHv62.21pAF)在重链的位置124并入非天然氨基酸的人类恒定区组合而转化为经CHO表达的完全人类天然抗体(参见，实施例3-使用重组DNA方法表达CHv62.21)。
自产生v62-1b21的杂交瘤细胞中分离mRNA后测定编码v62-1b21的序列的DNA。抗Flt3的v62-1b21重链及轻链可变核酸序列使用下列方案衍生自杂交瘤细胞。用Trizol试剂(生命技术公司(Life Technologies),Gibco BRL)溶解分泌v62-1b21的杂交瘤细胞。纯化全部RNA且第一链cDNA使用Gibco-BRL Superscript预扩增系统用寡聚(dT)12-18激活自总RNA产生。第一链cDNA然后使用人类免疫球蛋白可变重链引物及人类免疫球蛋白可变轻链引物扩增。测序PCR产物并测定可变重链及轻链区。
可变重链区及轻链区的核酸及氨基酸序列列于图2A和/或2B及图3A和/或3B中。CHv62.21 MAb与人类Ig种系的比对阐述于图4A至4B中。
实施例3
使用重组DNA方法表达CHv62.21
为了在经转染的细胞中重组表达CHv62.21 MAb，v62.21杂交瘤MAb可变重链及轻链序列分别自人类重链IgG1及人类轻链Igκ恒定区的上游进行克隆。完整CHv62.21 MAb人类重链及轻链盒自克隆载体中CMV启动子/强化子的下游进行克隆。将表达重组CHv62.21MAb的构建体转染至CHO细胞中以于Lonza GS系统中稳定表达(隆萨公司(Lonza),瑞士巴塞尔)。将自重组CHO细胞分泌的CHv62.21 Mab纯化并通过流动式细胞测量术评估对细胞表面FLT3的结合。结果显示表达于CHO细胞中的重组CHv62.21抗体结合至细胞表面上的FLT3。
结果进一步显示与自杂交瘤纯化的v62.21类似，表达于CHO细胞中的重组表达的v62.21结合FLT3。还通过ELISA评估自重组细胞分泌的CHv62.21 MAb对FLT3重组蛋白的结合。CHv62.21对FLT3蛋白的结合在衍生自CHO的MAb材料与衍生自杂交瘤细胞的MAb材料间是一致的。
于2014年12月9日将产生命名为CHv62.21的抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞送(经由联邦快递)至美国菌种保存中心(ATCC),P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108并分配登录号PTA-121831。
可变重链区及轻链区的核酸及氨基酸序列列于图2A和/或2B及图3A和/或3B中。
经过使用本领域中已知的方法(例如，蛋白酶消化、LCMS分析等)进行的实验分析，衍生自CHO细胞的CHv62.21 MAb的氨基酸修饰显示：重链的C端的赖氨酸的删除发生于大部分经纯化的CHv62.21 MAb中及重链的N端的焦谷酰胺化与重链的C端的赖氨酸的删除发生于部分经纯化的CHv62.21 MAb中。
实施例4
使用重组DNA方法表达人类CHv62.21pAF
为了在经转染的细胞中重组表达CHv62.21pAF，v62-1b21杂交瘤MAb可变重链及轻链序列分别自人类重链IgG1及人类轻链Igκ恒定区的上游进行克隆。完整CHv62.21 MAb人类重链及轻链盒自克隆载体中CMV启动子/强化子的下游进行克隆。将表达重组CHv62.21MAb的构建体转染至CHO pAFsup1-4E2细胞(Ambrx,La Jolla,CA)中，该细胞稳定表达琥珀抑制因子tRNA及pAF特异性胺酰tRNA合成酶，用于产生稳定克隆。该稳定克隆通过将pAF并入MAb中产生CHv62.21pAF。该稳定克隆经受基因扩增，接着经受亚克隆。将自稳定亚克隆分泌的CHv62.21pAF纯化并通过流动式细胞测量术评估对细胞表面FLT3的结合。结果显示表达自CHO细胞的重组CHv62.21pAF抗体结合至细胞表面上的FLT3。
于2014年12月9日将产生命名为CHv62.21pAF的抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞送(经由联邦快递)至美国菌种保存中心(ATCC),P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108并分配登录号PTA-121836。
可变重链区及轻链区的核酸及氨基酸序列列于图2C和/或2B及图3C和/或3B中。
经过使用本领域中已知的方法(例如，蛋白酶消化、LCMS分析等)进行的实验分析，衍生自CHO细胞的CHv62.21pAF MAb的氨基酸修饰显示：重链的C端的赖氨酸的删除发生于大部分经纯化的CHv62.21pAF MAb中及重链的N端的焦谷酰胺化与重链的C端的赖氨酸的删除发生于部分经纯化的CHv62.21pAF MAb中。
实施例5
接头单元AGL的产生
在一优选实施方式中，用以连接本发明的FLT3 MAb(优选CHv62.21pAF)及本发明的药物单元(优选AGD-0182)的本发明的接头单元(指示AGL)通常称为2-(氨氧基)乙酸(Chem-Impex International,Inc.,Wood Dale,IL)。
在另一实施方式中，本发明的AGL接头单元具有下式：
2-(氨氧基)乙酸
化学式：C2H5NO3
精确质量：91.0269
分子量：91.0660
m/z；91.0269(100.0％),92.0303(2.2％)
实施例6
AGD-0182药物单元的产生及合成
使用下列方法产生列于式(II)中的药物单元。首先，向CH2Cl2(20.0mL)中的Boc-Dap-OH二环己胺(10.0g,21.3mmol)及H-Phe-NH2HCl盐(6.42g,32.0mmol)的23℃搅拌悬浮液中添加DIEA(11.0g,14.9mL,85.3mmol)，接着添加DEPC(5.19g,4.80mL,0.032mol)。10h后，通过LCMS分析显示反应完成。粗反应产物用H2O(25mL x 2)清洗，接着用盐水(25mL x2)清洗。有机部分在硫酸镁垫上干燥，过滤并在真空中浓缩。粗橙色油通过使用CH2Cl2中的2％至10％甲醇作为洗脱剂的急速(flash)层析法(硅胶40μm,尺寸)纯化。获得呈黄色油状的总计7.25g的Boc-Dap-Phe-NH2(16.7mmol,78％)。LCMS RT＝1.28分钟(方法B)；ESI-MS m/z 434.19[M+H]+。
其次，向CH2Cl2(10mL)中的Boc-Dap-Phe-NH2(7.25g,16.7mmol)的23℃搅拌悬浮液中添加TFA(10mL)。5h后，通过LCMS分析显示反应完成。在真空中蒸发挥发性有机物以产生粗产物，其无需进一步纯化即可直接使用。获得呈橙色固体(13.4mmol,80％)的总计6.00g的H-Dap-Phe-NH2。LCMS RT＝0.691分钟(方法B)；ESI-MS m/z 334.17[M+H]+。
然后向DMF(10mL)中的Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-OH TFA盐(456mg,0.586mmol)及H-Dap-Phe-NH2TFA盐(457mg,1.02mmol)的23℃搅拌悬浮液中添加DIEA(0.350g,0.500mL,2.74mmol)，接着添加HATU(0.520g,1.37mmol)。10h后，通过LCMS分析显示反应完成。粗反应产物通过使用0.1％水性甲酸中的10％至90％MeCN作为洗脱剂的具有Phenomenex Gemini NX-C18 10μ管柱(150x 30mm)的制备型RP-HPLC纯化。获得呈甲酸盐(0.513mmol,75％)的总计526mg的Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2。LCMS RT＝1.81分钟(方法B)；ESI-MSm/z 980.39[M+H]+。
最后，向乙腈(10mL)中的Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2(525mg,0.513mmol)的23℃搅拌溶液中添加哌啶(5mL)。2h后，通过LCMS分析显示反应完成。向粗反应溶液中添加己烷(15mL x 3)。在真空中浓缩乙腈层。粗油通过使用0.1％水性TFA中的5％至95％MeCN作为洗脱剂的具有Phenomenex Gemini NX-C18 10μ管柱(150x 30mm)的制备型RP-HPLC纯化。获得呈TFA盐(0.406mmol,79％)的总计354mg的标题化合物。LCMS RT＝1.15分钟(方法B)；ESI-MS m/z 758.24[M+H]+；HRMS m/z 758.4915[C38H63N9O7+H]+。
前述合成产生命名为(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-3-叠氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺的下列药物单元，其如式(II)阐述：
实施例7
药物接头AGL及AGD-0182药物单元的合成
以下列方式完成AGL接头单元及AGD-0182药物单元的合成。
使用下列程序及实验方案描述方法A：
0-0.50分钟：等度80水/10乙腈/10 1％甲酸的水溶液；0.50-3.50分钟：线性梯度80水/10乙腈/10 1％甲酸的水溶液至0水/90乙腈/10 1％甲酸的水溶液；3.50-3.99分钟：等度0水/90乙腈/10 1％甲酸的水溶液；3.99-4.00分钟：线性梯度0水/90乙腈/10 1％甲酸的水溶液至80水/10乙腈/10 1％甲酸的水溶液。
使用下列过程及实验方案描述方法B：
0-0.50分钟：等度85水/5乙腈/10 1％甲酸的水溶液；0.50-1.60分钟：线性梯度85水/5乙腈/10 1％甲酸的水溶液至0水/98乙腈/2 1％甲酸的水溶液；1.60-1.80分钟：等度0水/98乙腈/2 1％甲酸的水溶液；1.80-1.90分钟：线性梯度0水/98乙腈/2 1％甲酸的水溶液至85水/5乙腈/10 1％甲酸的水溶液；1..90-2.00分钟：等度85水/5乙腈/10 1％甲酸的水溶液。
使用上述方法，合成如下：
向CH2Cl2(20.0mL)中的Boc-Dap-OH二环己胺(10.0g,21.3mmol)及H-Phe-NH2HCl盐(6.42g,32.0mmol)的23℃搅拌悬浮液中添加DIEA(11.0g,14.9mL,85.3mmol)，接着添加DEPC(5.19g,4.80mL,0.032mol)。10h后，通过LCMS分析显示反应完成。粗反应产物用H2O(25mL x 2)清洗，接着用盐水(25mL x 2)清洗。有机组分在硫酸镁垫上干燥，过滤并在真空中浓缩。粗橙色油通过使用CH2Cl2中的2％至10％甲醇作为洗脱剂的急速层析法(硅胶40μm,尺寸)纯化。获得呈黄色油状(16.7mmol,78％)的总计7.25g的Boc-Dap-Phe-NH2。LCMSRT＝1.28分钟(方法B)；ESI-MS m/z 434.19[M+H]+。
向CH2Cl2(10mL)中的Boc-Dap-Phe-NH2(7.25g,16.7mmol)的23℃搅拌悬浮液中添加TFA(10mL)。5h后，通过LCMS分析显示反应完成。在真空中蒸发挥发性有机物以产生粗产物，其无需进一步纯化即可直接使用。获得呈橙色固体(13.4mmol,80％)的总计6.00g的H-Dap-Phe-NH2。LCMS RT＝0.691分钟(方法B)；ESI-MS m/z 334.17[M+H]+。
向DMF(10mL)中的Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-OH TFA盐(456mg,0.586mmol)及H-Dap-Phe-NH2TFA盐(457mg,1.02mmol)的23℃搅拌悬浮液中添加DIEA(0.350g,0.500mL,2.74mmol)，接着添加HATU(0.520g,1.37mmol)。10h后，通过LCMS分析显示反应完成。粗反应产物通过使用0.1％水性甲酸中的10％至90％MeCN作为洗脱剂的具有Phenomenex GeminiNX-C18 10μ管柱(150x30mm)的制备型RP-HPLC纯化。获得呈甲酸盐(0.513mmol,75％)的总计526mg的Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2。LCMS RT＝1.81分钟(方法B)；ESI-MSm/z 980.39[M+H]+。
向乙腈(10mL)中的Fmoc-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2(525mg,0.513mmol)的23℃搅拌溶液中添加哌啶(5mL)。2h后，藉由LCMS分析显示反应完成。向粗反应溶液中添加己烷(15mL x 3)。在真空中浓缩乙腈层。粗油通过使用0.1％水性TFA中的5％至95％MeCN作为洗脱剂的具有Phenomenex Gemini NX-C18 10μ管柱(150x30mm)的制备型RP-HPLC纯化。获得呈TFA盐(0.406mmol,79％)的总计354mg的所得化合物(MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2)。LCMS RT＝1.15分钟(方法B)；ESI-MS m/z 758.24[M+H]+；HRMS m/z758.4915[C38H63N9O7+H]+。
向DMF(7.0mL)及DCM(15.0mL)中的MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2(2.0g,2.64mmol)及Boc-Aoa(0.53g,2.77mmol)的23℃搅拌溶液中添加HATU(1.05g,2.77mmol)，接着添加DIPEA(0.51mL,2.92mmol)。1h后，在真空中浓缩反应混合物以产生粗DMF溶液，其用150mL EtOAc进一步稀释。粗反应混合物用100mL饱和NaHCO3清洗，接着用100mL盐水清洗。有机组分在硫酸镁垫上干燥，过滤并在真空中浓缩。粗Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2通过使用CH2Cl2中的0％至5％甲醇作为洗脱剂的急速层析法(硅胶40μm,尺寸)纯化。获得呈米黄色固体的总计2.13g Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2(2.29mmol,87％)。LCMS RT＝1.46分钟(方法A)；ESI-MS m/z 931.46[M+H]+。
向二恶烷(15.0mL)中的Boc-Aoa-MeVal-Abu(3-N3)-Dil-Dap-Phe-NH2(2.1g,2.26mmol)的23℃搅拌溶液中添加二恶烷(10.0mL,40.0mmol)中的4M HCl。0.5h后，在真空中浓缩反应混合物以产生粗浅黄色油。将粗浅黄色油溶解于6mL甲醇中并缓慢添加(逐滴)至经剧烈搅拌的150mL EtOAc溶液中。自该溶液中获得白色沈淀。该白色沈淀通过过滤收集并将上清液浓缩至固体。白色沈淀及经浓缩的上清液均分多个部分通过使用0.001M盐酸中的5％至95％MeCN作为洗脱剂的具有Phenomenex Gemini 10μ,C18管柱(150x 30mm)的制备型RP-HPLC纯化。
所得产物组分经组合，浓缩且在真空中干燥18h以产生白色固体。获得总计1.31gAGL-0182-30.HCl(1.51mmol,67％)。LCMS RT＝1.16分钟(方法A)；ESI-MS m/z 831.27[M+H]+。(参见，通常表IV)。
在一优选实施方式中，AGL-0182-30具有下式：
实施例8
CHv62.21pAF MAb的抗体药物偶联
使用下列方案使用本文描述的烷氧基胺接头将CHv62.21pAF MAb结合至命名为AGL-0182-30的含有多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸的肽以产生命名为CHv62.21pAF-AGL-0182-30的本发明抗体药物偶联物(ADC)。
使用描述于标题为“药物接头AGL及AGD-0182药物单元的合成”的实施例7中的方法完成AGL-0182-30药物接头的合成。
接着，使用下列方案制备命名为cHv62.21pAF-AGL-0182-30的本发明抗体药物偶联物(ADC)。
简言之，将215.5mL以17.17mg/mL的浓度调配于最终pH为4.0的含有500mM NaCl的50mM柠檬酸盐缓冲液中的CHv62.21pAF MAb添加至9.7mL最终pH为4.0的含有500mM NaCl的50mM柠檬酸盐缓冲液、9.1mL 1.35M乙酸酰肼(溶解于水中)、7.26mL DMSO及5.08mL 50mMAGL-0182-30(溶解于DMSO中)溶液中。容许结合在28℃下进行16至24小时。过量AGL-0182-30及其他小分子反应组分通过超滤/渗滤用12倍置换体积的含有5％海藻糖的20mM组氨酸(pH 6.0)移除。
所得抗体药物偶联物(ADC)命名为CHv62.21pAF-AGL-0182-30且具有下式：
其中该Mab为CHv62.21pAF且p为1.8至2.0。阐述于此实施例中的抗体药物偶联物的平均p值通过质谱分析为约1.9。在本发明的一个实施方式中，该p值在1.5与2.5之间。
所得的本发明ADC将nnAA并入该ADC的抗体组分中，从而该药物接头经由肟键偶联且用于阐述于表I中的癌症的治疗性治疗。
实施例9
CHv62.21 MAb的表征
结合FLT3的MAb使用阐述于标题为“FLT3单抗(MAb)的产生”的实施例中的程序产生并使用本领域中已知的分析的组合进行筛选、识别及表征。
A：FACS结合
测试CHv62.21对体外生长的AML及B-ALL细胞系的结合。(参见，表VII)。简言之，使用NHS LC生物素将CHv62.21及同种型匹配对照抗体生物素化。体外指数方式生长的癌细胞用于所有实验中。通过离心获得并清洗细胞。用Fc阻断细胞以减少非特异性结合。将抗体稀释至10ug/ml最终浓度且与细胞在4℃下共培养1小时。培养结束时，清洗细胞并在4℃下用第二检测物链霉亲和素-PE抗体以最终1：200(2.5ug/ml)稀释培养1小时。清洗未结合的二抗后，通过FACS分析细胞且测定并记录几何平均荧光。如下计算荧光比率：Geo平均cHv62.21/Geo平均同种型对照＝MFR(高于同种型对照的倍数表达的量度)。
获得几何平均值及平均荧光比率(MFR)值(表VI)并显示直方图(表VII)。结果显示该CHv62.21结合表达AML及B-ALL的数种人类癌细胞系。
B：ADCC活性
测试CHv62.21及CHv62.21pAF的体外ADCC活性。简言之，使用靶细胞系EOL-1及SEM在效应细胞正常人类PBMC的存在下使用CytoTox非放射性细胞毒性分析测试裸及ADC抗FLT3单抗CHv62.21及CHv62.21pAF介导抗体依赖性细胞毒性活性(ADCC)的能力。(Promega,G1780)。
进行该分析的前一(1)天，将三(3)小瓶的效应细胞、正常人类PBMC(Hemacare,Donor ID：1888)解冻、清洗并接种于T-175细胞培养烧瓶中的以10％热灭活胎牛血清补充的RPMI-1640中。将该培养瓶在37℃及5％CO2下于培养器中储存整夜。隔天，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)自培养瓶中获得PBMC并清洗且以1.0e6个细胞/孔的浓度接种于分析缓冲剂(RPMI1640+0.1％FBS)中。获得靶细胞SEM及EOL-1连同阳性对照细胞系(Raji)，清洗并以2.0e5个细胞/孔的浓度使用分析缓冲剂接种。
将测试样品于分析缓冲剂中各稀释至2.5μg/mL的最终浓度。将相等体积的靶细胞、测试样品及效应细胞一式三份添加至96孔圆底板的孔中。该板经轻微离心并于37℃增湿培养器中培养4小时。四(4)小时培养后，该分析板经离心并获得体积为50μL的上清液且将其转移至新鲜96孔板中。通过使用比色LDH检测试剂盒；CytoTox非放射性细胞毒性分析(Promega)及于490nm下读取的吸光度读数测定该上清液中乳酸盐脱氢酶的活性。
该数据通过首先从实验、效应自发性、目标自发性及目标最大值孔的所有吸光度值中减去培养基背景孔的吸光度值的平均值进行分析。接着，标准化经修正的吸光度读数的平均值并通过使用下式计算ADCC活性：
ADCC(％)＝(实验-效应自发性-目标自发性)/(目标最大值-目标自发性)*100
图7中的结果显示CHv62.21及CHv62.21pAF MAb不显示ADCC活性。然而，阳性对照(利妥昔单抗)证实Raji细胞系中的ADCC活性。
实施例10
CHv62.21pAF-AGL-0182-30抑制体内肿瘤的生长
FLT3于肿瘤细胞中的显著表达，连同其于正常细胞中的限制性表达使得FLT3成为用于抗体疗法及(类似地)ADC疗法的良好标靶。因此，评估CHv62.21pAF-AGL-0182-30于人类ALL、AML及B-LL癌症异种移植小鼠模型中的治疗性疗效。
抗体药物偶联物对肿瘤生长及转移形成的疗效在小鼠癌症异种移植物模型(例如，皮下及原位移植)中研究。
通过在雄性SCID小鼠的右侧腹中注射与基底膜(合作研究)以1：1稀释混合的5x104至106个癌细胞而产生皮下(s.c.)肿瘤。为测试ADC对肿瘤形成的疗效，即在与肿瘤细胞注射的同一天开始注射ADC。作为对照，向小鼠注射经纯化的人类IgG或PBS；或识别不表达于人类细胞中的无关抗原的经纯化的MAb。在初步研究中，未在对照IgG或PBS间发现对肿瘤生长的差异。通过卡尺测量测定肿瘤尺寸且肿瘤体积计算为宽度2x长度/2，其中宽度是最小尺寸及长度是最大尺寸。处死具有大于1.5cm直径的皮下肿瘤的小鼠。
异种移植癌症模型的优点是研究新血管形成及血管形成的能力。肿瘤生长部分依赖于新血管发育。尽管毛细管系统及正发育的血液网络为宿主起源，但通过异种移植肿瘤调节新血管分布的启动及架构(Davidoff等人，Clin Cancer Res.(2001)7：2870；Solesvik等人，Eur J Cancer Clin Oncol.(1984)20：1295)。根据本领域中已知的程序研究抗体及小分子对新血管形成的影响，例如通过肿瘤组织的IHC分析及它们周围环境。
CHv62.21pAF-AGL-0182-30ADC抑制于表示为MV4-11的癌细胞系皮下建立的癌症异种移植物的形成。这些结果指示CHv62.21pAF-AGL-0182-30于癌症及优选那些阐述于表I中的癌症的局部及晚期阶段的治疗中的疗效。
FLT3 ADC：
如描述于标题为“FLT3单抗(MAb)的产生”的实施例中般培养针对FLT3的单抗。另外，该MAb如描述于标题为“CHv62.21pAF MAb的抗体药物偶联”的实施例中一样偶联至毒素以形成CHv62.21pAF-AGL-0182-30。通过FACS及本领域中已知的其他方法表征CHv62.21pAF及CHv62.21pAF-AGL-0182-30以测定其结合FLT3的能力。
细胞系及异种移植物：
如本领域中已知，将细胞保持于以L-谷氨酰胺及10％FBS补充的DMEM中。通过SCID小鼠中的连续繁殖保持MV4-11异种移植物。
CHv62.21pAF-AGL-0182-30在植入CB17/SCID小鼠中的人类B骨髓单核细胞性白血 病细胞系MV4-11的皮下建立的异种移植物模型中的疗效及剂量滴定。
在此实验中，将人类B骨髓单核细胞性白血病MV4-11细胞(每只小鼠3.0x106个细胞)注射于个别SCID小鼠的侧腹中并容许肿瘤生长。当平均肿瘤体积达成预定尺寸(200mm3)时，动物经肿瘤尺寸匹配并使用Study Director软件(v.2.1；Studylog Systems公司,加利福尼亚州南旧金山)将该动物以相似平均肿瘤尺寸及各组中的变异而随机分为治疗组及对照组。在药物给予当天前的下午通过腹膜内注射以20mg/kg向所有研究小鼠预装入Fc阻断剂(mLYS-1c3.1-hIgG1)。
以3个不同剂量水平(0.5、1.0及2.0mg/kg)作为单一大丸剂通过静脉内注射给药CHv62.21pAF-AGL-0182-30。使用20mM组氨酸/5％海藻糖(pH 6.0)及91.1-AGL-0182-30作为载体及ADC对照。基于在各给药前立即获得的各动物的个别体重给予所有药剂。使用卡尺测量每周两次监测各组中的肿瘤生长直至研究终止。使用Kruskal-Wallis检验进行动物处死前最后一天的肿瘤体积资料的统计学分析。使用Tukey检验程序(双侧)作出成对比较以保护实验误差率。
此研究评估CHv62.21pAF-AGL-0182-30的疗效并在皮下建立于CB17/SCID小鼠中的MV4-11人类B骨髓单核细胞性白血病异种移植物模型中比较其与其ADC对照(91.1-AGL-0182-30)。CHv62.21pAF-AGL-0182-30以3个不同剂量浓度(0.5、1.0及2.0mg/kg)作为单一剂量通过静脉内(i.v.)推注给予。91.1-AGL-0182-30作为ADC对照以2mg/kg通过静脉内注射给药。且使用20mM组氨酸/5％海藻糖(pH6.0)作为载体对照。
结果指示在载体与ACD对照的治疗间无统计学差异(p>0.9999)。当在给药开始时相较于起始肿瘤尺寸时，2.0mg/kg的CHv62.21pAF-AGL-0182-30统计学显著地消退肿瘤达100％(p<0.0001)。相较于载体对照，1.0mg/kg的CHv62.21pAF-AGL-0182-30统计学显著地抑制肿瘤生长达78.1％(p<0.0001)。CHv62.21pAF-AGL-0182-30在0.5mg/kg的剂量下于此模型中不显示任何疗效(p＝0.5344)。(图5)。
CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC)及CHv62.21pAF(裸抗体)于植入CB17SCID小鼠中 的人类B骨髓单核细胞性白血病细胞系MV4-11的皮下建立的异种移植物模型中的疗效。
在另一实验中，将人类B骨髓单核细胞性白血病MV4-11细胞(每只小鼠3.0x106个细胞)注射于个别SCID小鼠的侧腹中并容许肿瘤生长。当平均肿瘤体积达成预定尺寸(200mm3)时，动物经肿瘤尺寸匹配并使用Study Director软件(v.2.1；Studylog Systems,公司,加利福尼亚州南旧金山)将该动物以相似平均肿瘤尺寸及各组中的变异而随机分为治疗组及对照组。在药物给予当天前的下午通过腹膜内注射以20mg/kg向所有研究小鼠预装入Fc阻断剂(mLYS-1c3.1-hIgG1)。CHv62.21pAF-AGL-0182-30及ADC对照(91.1-AGL-0182-30)作为单一大丸剂通过静脉内注射以1mg/kg给药。AGS62P(a.k.a.CHv62.21pAF)及裸抗体对照(91.1-pAF)以2mg/kg作为单一大丸剂通过静脉内注射给药。基于在各给药前立即获得的各动物的个别体重给予所有药剂。使用卡尺测量每周两次监测各组中的肿瘤生长直至研究终止。使用Kruskal-Wallis检验进行动物处死前最后一天的肿瘤体积资料的统计学分析。使用Tukey检验程序(双侧)作出成对比较以保护实验误差率。
此研究评估CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC)及CHv62.21pAF(裸抗体)的疗效。
结果显示相较于ADC对照(91.1-AGL-0182.30)，CHv62.21pAF-AGL-0182-30以1.0mg/kg作为单一剂量通过静脉内注射统计学显著地抑制肿瘤生长达51.4％(p＝0.0010)。相较于裸抗体对照(91.1-pAF)，CHv62.21pAF以2.0mg/kg作为单一剂量通过静脉内注射显示无统计学差异(p＝0.6570)。此外，当相较于2.0mg/kg的CHv62.21pAF(p＝0.0134)时，该结果指示1.0mg/kg的CHv62.21pAF-AGL-0182-30统计学显著地抑制54.3％的肿瘤生长。(图6)。
CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC)及CHv62.21pAF(裸抗体)于植入CB17 SCID小鼠 中的人类B骨髓单核细胞性白血病细胞是MV4-11的皮下建立的异种移植物模型中的疗效。
在另一实验中，将人类B骨髓单核细胞性白血病MV4-11细胞(每只小鼠3.0x106个细胞)注射于个别SCID小鼠的侧腹中并容许肿瘤生长。当平均肿瘤体积达成预定尺寸(200mm3)时，动物经肿瘤尺寸匹配并使用Study Director软件(v.2.1；Studylog Systems公司,加利福尼亚州南旧金山)将该动物以相似平均肿瘤尺寸及各组中的变异而随机分为治疗组及对照组。在药物给予当天前的下午通过腹膜内注射以20mg/kg向所有研究小鼠预装入Fc阻断剂(mLYS-1c3.1-hIgG1)。CHv62.21pAF-AGL-0182-30及ADC对照(91.1-AGL-0182-30)通过静脉内注射以2mg/kg QW给药2周。AGS62P(a.k.a.CHv62.21pAF)及裸抗体对照(91.1-pAF)通过静脉内注射以2mg/kg QW给药数周。基于在各给药前立即获得的各动物的个别体重给予所有药剂。使用卡尺测量每周两次监测各组中的肿瘤生长直至研究终止。使用Kruskal-Wallis检验进行动物处死前最后一天的肿瘤体积资料的统计学分析。使用Tukey检验程序(双侧)作出成对比较以保护实验误差率。
此研究使用多剂量方案在2周时间段内评估CHv62.21pAF-AGL-0182-30(ADC)及Chv62.21pAF(裸抗体)的疗效。
结果显示相较于ADC对照(91.1-AGL-0182.30)，CHv62.21pAF-AGL-0182-30以2.0mg/kg作为多剂量通过静脉内注射在第17天统计学显著地抑制肿瘤生长达100％肿瘤消退(p＝0.0001)。相较于裸抗体对照(91.1-pAF)，CHv62.21pAF以2.0mg/kg作为多剂量通过静脉内注射显示无统计学差异。(图13)。
CHv62.21pAF-AGL-0182-30于CB17 SCID小鼠中的皮下建立的SEM-xcl异种移植物 模型中的疗效。
在另一实验中，将人类急性淋巴母细胞性白血病SEM-xcl细胞(每只小鼠1.0x106个细胞)注射于个别SCID小鼠的侧腹中并容许肿瘤生长。当平均肿瘤体积达成预定尺寸(200mm3)时，动物经肿瘤尺寸匹配并使用Study Director软件(v.2.1；Studylog System公司,加利福尼亚州南旧金山)将该动物以相似平均肿瘤尺寸及各组中的变异而随机分为治疗组及对照组。
通过静脉内注射在第0天以5.0mg/kg、2.0mg/kg或1.0mg/kg作为单一大丸剂剂量给药CHv62.21pAF-AGL-0182-30。使用相同路径及给药时间表以5.0mg/kg给药对照ADC(AGS91.1-pAF-AGL-0182-30)。使用20mM组氨酸/5％海藻糖(pH 5.2)作为载体。基于在各给药前立即获得的各动物的个别体重给予所有药剂。使用卡尺测量每周两次监测各组中的肿瘤生长直至研究终止。使用Kruskal-Wallis检验进行动物处死前最后一天的肿瘤体积资料的统计学分析。使用Tukey检验程序(双侧)作出成对比较以保护实验误差率。
结果显示当相较于对照ADC(AGS91.1-pAF-AGL-0182-30)或相较于载体对照时，所有三个剂量浓度(5.0、2.0及1.0mg/kg)的CHv62.21pAF-AGL-0182-30证实潜在抗肿瘤活性(p<0.0001)，一般而言导致大于75％的肿瘤生长抑制。此外，当以5.0mg/kg给药时，CHv62.21pAF-AGL-0182-30在相较于其初始起始肿瘤体积时显著消退肿瘤57.3％。在5.0mg/kg与2.0mg/kg或1.0mg/kg间观察到统计学显著差异。(图14)。
结论
总之，图5、6、13及14显示当相较于对照ADC及结合FLT3的裸抗体时，名为CHv62.21pAF-AGL-0182-30的FLT3 ADC显著抑制表达FLT3的肿瘤细胞的生长。因此，CHv62.21pAF-AGL-0182-30可出于治疗性目的用于治疗及控制阐述于表I中的癌症。
实施例11
用于通过使用FLT3 ADC治疗及诊断人类癌的人类临床试验
FLT3 ADC根据本发明用于特异性结合至FLT3且用于某些肿瘤(优选列于表I中的那些)的治疗中。联系这些适应症中的各者，顺利进行两种临床方法。
I.)辅助疗法：在辅助疗法中，以FLT3 ADC组合化学治疗剂或抗肿瘤剂和/或放射疗法或其组合治疗患者。原发性癌症目标(例如列于表I中的那些)在标准方案下通过向标准一线及二线疗法添加FLT3 ADC加以治疗。方案设计解决如通过下列实施例评估的有效性，包括(但不限于)减小原发性或转移性病灶的肿瘤质量；增加无进展存活期(progression free survival)；总体存活期；患者健康的改善；疾病稳定化及减小标准化学疗法及其他生物剂的常用剂量的能力。这些剂量减小容许通过减小化学治疗剂或生物剂的剂量相关毒性的额外和/或经延长的疗法。FLT3 ADC组合化学治疗剂或抗肿瘤剂用于数个辅助临床试验中。
II.)单一疗法：在肿瘤的单一疗法中结合使用FLT3 ADC，向患者给予FLT3 ADC而无化学治疗剂或抗肿瘤剂。在一个实施方式中，单一疗法在罹患大量转移性疾病的末期癌症患者中以临床方式进行。方案设计解决如通过下列实施例评估的有效性，包括(但不限于)减小原发性或转移性病灶的肿瘤质量；增加无进展存活期；总体存活期；患者健康的改善；疾病稳定化及减小标准化学疗法及其他生物剂的常用剂量的能力。
剂量
剂量方案可经调整以提供优化所需响应。例如，可给予单一大丸剂，可在一段时间内给予数个分剂量或如通过治疗性情况的紧急状态指示可成比例减小或增加该剂量。针对易于给予及剂量的均匀性将非经肠组合物调配成剂量单元形式尤其有利。如本文使用的剂量单元形式指适合作为用于待治疗的哺乳动物对象的单一剂量的物理离散单元；各单元含有经计算以产生与所需药物载剂相关联的所需治疗效应的预定量活性化合物。用于本发明的剂量单元形式的说明书通过以下决定及直接取决于：(a)抗体和/或ADC的独特特性及待达成的特定治疗性或预防性效应，及(b)针对治疗对象中的过敏而化合此种活性化合物的技术中所固有的限制性。
用于根据本发明组合给予的FLT3 ADC的治疗有效量的示例性非限制性范围约0.5至约10mg/kg；约1至约5mg/kg；至少1mg/kg；至少2mg/kg；至少3mg/kg或至少4mg/kg。其他示例性非限制性范围(例如)约0.5至约5mg/kg或(例如)约0.8至约5mg/kg或(例如)约1至约7.5mg/kg。本发明的高剂量实施方式关于大于10mg/kg的剂量。应注意剂量值可随待缓解的病症的类型及严重性变化且可包括单一剂量或多个剂量。应进一步了解就任何特定对象而言，应根据给予或监控组合物的给予者的个别需求及专业判断随时间调整具体剂量方案且本文阐述的剂量范围仅示例性且无意限制所要求组合物的范围或实务。
临床进展方案(CDP)
CDP遵循并发展FLT3 ADC结合辅助疗法或单一疗法的治疗。试验最初证明安全性及其后确定重复剂量的疗效。试验是比较标准化学疗法及标准疗法加FLT3 ADC的开放标记。如将了解，可结合患者的招募利用的一项非限制性准则是通过活检测定的它们肿瘤中的FLT3表达程度。
与基于任何蛋白质或抗体输注的治疗一样，安全顾虑主要关于(i)细胞介素释放症候群，即，低血压症、发烧、震颤、寒颤；(ii)对材料发展免疫原性反应(即，患者对抗体治疗发展人类抗体或HAMA反应)；及(iii)对表达FLT3的正常细胞的毒性。利用标准测试及随访以监测这些安全顾虑中的各者。当人类给予后，发现FLT3 ADC是安全的。
实施例12
正常及癌症患者衍生的样本中的FLT3蛋白的检测
使用抗FLT3抗体检测癌症中的FLT3蛋白在骨髓性(AML)细胞群体中患有急性淋巴细胞性白血病的患者的外周血的PBMC样品中进行评定。
A.FACS结合材料及方法
在此实验中，样品用CD45、CD33、CD34、CD3、CD20、CD38及抗Flt3生物素或同种型生物素mAb的混合物培养。用于生物素化mAb的第二检测物为链霉亲和素-PE。用链霉亲和素-PE(SAv-PE)检测试剂制备荧光减一(FMO)对照混合物且用于闸控细胞群体。An LSRII流式细胞仪(BD生物科学)用于获取资料。
在CD45+群体上门控(gate)淋巴细胞，其中识别四种不同群体，CD33+/3-/20-(骨髓性原始细胞)、CD33+/3-/34+/38-(干细胞)、CD33-/3+(T细胞)及CD33-/20+(B细胞)。用Flowjo软件9.5.4版(Tri-Star,俄勒冈州阿什兰)完成分析。将荧光值记录为几何平均值(MFI)。
B.结果
针对AML患者样品阐述于表VIII中的结果显示抗FLT3 MAb结合至所有经测试的样品的骨髓性、干细胞、T及B细胞群体。
此外，如显示于表VIII中，针对所有经测试的样品的MFIR分布图显示骨髓性、干细胞及B细胞群体中的中等变异性，而T细胞在MFIR中具有较少变异性。针对骨髓性原始细胞的平均MFIR约963.1,而针对干细胞的平均MFIR为318.2，而针对T细胞的平均MFIR为9.842，而针对B细胞的MFIR在AML中为72.60。针对正常样品的平均MFIR在骨髓性中系642.4，针对干细胞系68.29，针对T细胞系11.66及针对B细胞系13.73。
表VIII中阐述的结果的总体显示抗FLT3 MAb(例如本发明的CHv62.21 MAb及Chv62.21pAF MAb)可检测过表达于AML中的FLT3蛋白。
实施例13
通过CHv62.21pAF及CHv62.21pAF-AGL-0182-30介导的体外细胞毒性
FLT3抗体(CHv62.21pAF)及FLT3 ADC(CHv62.21pAF-AGL-0182-30)介导FLT3依赖性细胞毒性的能力使用内源性表达FLT3的人类白血病MV-4-11及MOLM-13细胞系及不表达FLT3的人类白血病细胞系Karpas299评估。
简言之，在37℃及5％CO2下将MV-4-11、MOLM-13及Karpas299细胞分别以1500、2000及3000个细胞/孔的密度接种于96孔板上的50μl完全培养基中并放置于组织培养培养器中。隔天，以每孔25μl体积的Fc阻断细胞以减少非特异性结合及于完全培养基中制备cHv62.21pAF-AGL-0182-30、同种型对照抗体-AGD-0182组合物(91.1pAF-AGL-0182-30)、cHv62.21pAF及同种型对照抗体(91.1pAF)的4x原液并将该ADC及抗体的25μl连续稀释液添加至适当孔中。在37℃及5％CO2下于组织培养培养器中用cHv62.21pAF-AGL-0182-30、91.1pAF-AGL-0182-30、cHv62.21pAF及91.1pAF处理细胞5天。培养周期结束时，将20μlPresto Blue添加至每孔中并培养2小时。使用BioTek Synergy H4板读数器使用540激发波长及590发射波长对该板进行阅读。
表IX中的结果显示抗FLT3 ADC(CHv62.21pAF-AGL-0182-30)可选择性诱发表达FLT3的MOLM-13及MV-4-11细胞系的细胞毒性，同时其无法诱发非表达FLT3的Karpas299细胞系的细胞毒性。该抗FLT3抗体(CHv62.21pAF)无法诱发MOLM-13及MV-4-11细胞系的细胞毒性。因此，这些数据证实单独FLT3 MAb CHv62.21pAF无法诱发细胞的细胞毒性。相反，仅FLT3 ADC CHv62.21pAF-AGL-0182-30可选择性杀死表达FLT3的MOLM-13及MV-4-11细胞同时其对非表达FLT3的Karpas299细胞无影响。
实施例14
CHv62.21pAF优于先前技术FLT3 MAb的优点
本发明的CHv62.21pAF MAb呈现优于其他结合FLT3的MAb的数个优点。尤其当鉴于本发明的ADC的治疗性效用而言时。例如，先前技术教导在AML患者经化学疗法治疗后，血浆FLT3配体(“FL”)的表达增加。参见，Takashi等人，Blood vol.117(12)(March 2011)。此外，已显示增加的FL显著减小FLT抑制剂的活性。同上，与单甲基奥瑞司他汀F(EB10-MMAF)结合的EB10已记录为包含抗人类FLT3抗体的ADC。(参见，Proc Amer Assoc Cancer Res，第46卷，2005)。该EB10已显示阻断FL。参见，美国专利案第8,071,099(Imclone)号。因此，本发明的目标是设计结合FLT3抗原但不结合FL的MAb。
在一项实验中，证实本发明的CHv62.21 MAb不阻断FL。简言之，重组人类FLT3-Fc购买自R&D系统。根据由Luminex提供的程序使用标准磺基-NHS/EDC化学将此蛋白质固定于经活化的Luminex微球的表面上。将该蛋白质的经His标记形式连同数种其他蛋白质偶联至Luminex微球并充当此程序中的对照。
另外，FLT3配体还购买自R&D系统。该配体使用赛默科学公司(ThermoScientific)EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(无权重式)，根据制备商的推荐而生物素化。蛋白质与磺基-NHS-LC-生物素反应两(2)小时后，通过针对DPBS的渗析移除未经并入的生物素。
固定于微球表面上的FLT3结合至其生物素化配体的能力通过使微球与各种浓度的生物素化配体(其在含有PBS、2％BSA、0.05％吐温20及0.1％叠氮化钠的缓冲液中制得)在RT下反应120分钟并轻微振荡来评定。在培养结束时，吸出该微球并清洗。结合至固定化受体的生物素化FLT3配体以链霉亲和素-R-藻红素(Moss,Inc.)检测。与微球结合的荧光用Luminex仪器测量。此评定显示5ng/mL浓度的生物素化FLT3配体足以产生稳健信号，但无法浸透与微球结合的FLT3。
最后，为评定FLT3抗体潜在阻断配体的能力，制备含有5ng/mL的生物素化FLT3配体加在研究下的10μg/mL各种抗体的混合物。将这些混合物应用于固定于微球上的FLT3并培养60分钟。在培养结束时，吸出该微球并清洗。结合至固定化受体的生物素化FLT3配体用链霉亲和素-R-藻红素(Moss,Inc.)检测。与微球结合的荧光用Luminex仪器测量。通过MFI(中值荧光强度)的减小观察具有阻断配体的能力的抗体。
图8的结果证实FLT3 MAb CHv62.21是非FL阻断剂且命名为v62-1b37.1的另一FLT3 MAb(表X)是FL阻断剂，类似于命名为EB10的先前技术FLT3 MAb(参见，美国专利案第8,071,099号)。
FLT3抗体(CHv62.21及v62-1b37.1)介导人类FLT3配体的影响的能力使用内源性表达FLT3的人类白血病EOL-1细胞系评估。还使用同种型对照抗体(mLys-1c3.1)。在37℃及5％CO2下，将该EOL-1细胞接种于50μl完全培养基中，以每孔2000个细胞的密度接种于96孔板上并放置于组织培养培养器中。隔天，用50、10或5ng/mL人类FLT3配体(于25μl完全培养基中)及10、1、0.1及0μg/mL测试抗体(于25μl完全培养基中)处理细胞。培养基单独用作未经处理的对照。在37℃及5％CO2下于组织培养培养器中将该细胞处理5天。在培养周期结束时，在室温下将100μl Cell Titer Glo添加至各孔中并培养30分钟，振荡。该板使用使用发光的BioTek Synergy H4板读数器进行阅读并使用Graphpad Prism软件作图。
图9中的结果显示v62-1b37.1在FLT3配体的存在下在高浓度下抑制生长，但CHv62.21对生长无任何影响。人类FLT3配体单独对EOL-1细胞系的生长无影响。
基于在用于癌症治疗的化学疗法后，血浆中的FL浓度增加的教导(参见，Takashi等人，同上)，显示当本发明的FLT3 MAb不阻断FL时存在优点。为证实此点，显示虽然阻断MAb的配体的细胞毒性活性在FL的存在下减小，但阻断MAb的非配体的细胞毒性活性在FL的存在下未减小。
FLT3 ADC(cHv62.21pAF-AGL-0182-30及v62-1b21.1-AGL-0129-08)在缺乏及存在人类FLT3配体(hFL)的情况下介导FLT3依赖性细胞毒性的能力使用内源性表达FLT3的人类白血病RS-4-11细胞系评估。
简言之，在37℃及5％CO2下以每孔3000个细胞的密度将RS-4-11细胞接种于96孔板上的50μl完全培养基中并放置于组织培养培养器中。隔天，该ADC以10μg/mL制备于完全培养基中并1：5连续稀释以得到总计9个点。将ADC的25μl连续稀释液添加至含有及缺乏人类FLT3配体的适当孔中(以100ng/mL每孔添加25μl)。该细胞在37℃及5％CO2下用v62-1b21.1-AGL-0129-08(表XI，参见，WO2015/183978,艾更斯司公司(Agensys,Inc.))及v62-1b37.1-AGL-0129-08加上及不加人类FLT3配体于组织培养培养器中处理5天。在培养周期结束时，向各孔添加20μl Presto Blue并培养2小时。该板使用BioTek Synergy H4板读数器使用540激发波长及590发射波长进行阅读并使用Graphpad Prism软件作图。
图10(A)及10(B)中的结果显示抗FLT3 ADC(v62-1b21.1-AGL-0129-08及v62-1b37.1-AGL-0129-08)可诱发表达FLT3的RS-4-11细胞系的细胞毒性。抗FLT3 ADC(v62-1b21.1-AGL-0129-08)在存在及缺乏人类FLT3配体的情况下具有相似细胞毒性水平。然而，与在缺乏配体存在下进行的ADC治疗相比，抗FLT3 ADC(v62-1b37.1-AGL-0129-08)的细胞毒性活性在人类FLT3配体的存在下有所减小。
在另一实验中，抗FLT3抗体(CHv62.21及v62-1b37.1)结合至表达于人类白血病MOLM-13细胞系的表面上的FLT3的能力在人类FLT3配体(hFL)的存在下评估。使用同种型对照抗体(AGS91.1-pAF)作为阴性对照。
简言之，以每孔50,000个细胞的密度将MOLM-13细胞接种于圆底96孔板上。用每孔150μl PBS清洗该板一次。以每孔50μl体积的Fc于FACS缓冲液(PBS+2％ FBS+0.1％叠氮化钠)中阻断细胞(20μg/mL)以减少非特异性结合。在4℃下将细胞培养15分钟。以100ng/mL将人类FLT3配体添加至适当的孔中并跨板1：2连续稀释以得到总计11个点。在添加生物素化FLT3抗体前在4℃下将细胞培养30分钟。培养后，以10μg/mL及1μg/mL于FACS缓冲液中制备生物素化抗FLT3抗体及同种型对照抗体并将25μl添加至孔中且在4℃下培养1小时。细胞用FACS缓冲液清洗两次并每孔100μl添加链霉亲和素-PE(Jackson免疫公司)且在4℃下培养1小时。细胞用FACS缓冲液清洗两次并在Attune细胞计数器(生命技术公司(LifeTechnologies))上阅读数且于FlowJo(树星公司(Tree Star))软件中分析。
图11(A)中的结果显示人类FLT3配体不干扰抗FLT3抗体(AGS62P)结合至MOLM-13细胞。然而，人类FLT3配体确实以剂量依赖性方式干扰抗FLT3抗体(cHv62-1b37.1)结合至MOLM-13细胞。
最后，FLT3 ADC(AGS62P1)在缺乏及存在人类FLT3配体(hFL)的情况下介导FLT3依赖性细胞毒性的能力使用内源性表达FLT3的人类白血病MOLM-13细胞系评估。使用同种型对照ADC(AGS91.1.88-pAF-AGL-0182-30)作为阴性对照。
简言之，在37℃及5％CO2下以每孔2000个细胞的密度将MOLM-13细胞接种于96孔板上的50μl完全培养基中并放置于组织培养培养器中。隔天，以每孔25μl体积的Fc阻断细胞以减少非特异性结合。将ADC于完全培养基中制备成10μg/mL最终浓度并1：5连续稀释以得到总计9个点。将ADC的12.5μl连续稀释液添加至含有及缺乏人类FLT3配体(100ng/mL，每孔添加12.5μl)的适当孔中。在37℃及5％CO2下于组织培养培养器中用AGS62P1及AGS91.1.88-pAF-AGL-0182-30加上及不加人类FLT3配体将该细胞处理5天。在培养周期结束时，将20μl Presto Blue添加至各孔中并培养2小时。使用BioTek Synergy H4板读数器使用540激发波长及590发射波长对该板阅读并使用Graphpad Prism软件作图。
图11(B)中的结果显示人类FLT3配体不干扰抗FLT3 ADC(CHv62.21pAF-AGL-0182-30)介导的MOLM-13细胞中的细胞毒性。
因此，虽然FLT3 MAb可用于治疗性情况中，但非所有FLT3 Mab都相同。图8至11中的结果显示不结合FL的FLT3 MAb呈现优于显示结合FL的FLT3 MAb的显著优点。此外，鉴于本发明的ADC的治疗效用，结果显示包含非配体阻断剂FLT3 MAb的ADC(例如CHv62.21pAF-AGL-0182-30)相较于包含配体阻断剂FLT3 MAb的ADC在FL的存在下保留抗肿瘤效应。普通技术人员了解已知FL的存在在化学治疗性治疗后增加。另外，已知FL的存在增加已显示减小FLT3抑制剂的活性。因此，图8至11中的结果表明在癌症患者中，包含非配体阻断剂FLT3MAb的ADC当相较于包含配体阻断剂FLT3 MAb的ADC时具有更好治疗指数及抗肿瘤效应。
实施例15
CHv62.21pAF-AGL-0182-30的稳定性测试
FLT3 ADC CHv62.21pAF-AGL-0182-30及使用另一细胞毒性化合物AGL-0301-20(参见，WO2014/043403,艾更斯司公司(Agensys,Inc.))的另一FLT3 ADC的稳定性经体外评估。在此实验中，人类血清(密理博(Millipore))加入0.4mg/mL各ADC及50mM最终浓度的磷酸盐pH 7.3并在37℃下于经润湿的培养器中培养。收集100μL等分试样并在-80℃下冷冻5分钟、3小时、25.25小时、51.25小时及171.2小时。收集所有样品后，进行ELISA以定量各ADC的抗体及药物组分。
结果显示CHv62.21pAF-AGL-0182-30药物抗体连接在实验的时间过程中稳定，图12(A)。然而，图12(B)显示用于v62-1b21-AGL-0301-20的药物-抗体连接不稳定，导致在实验的时间过程中显著去结合。
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表格
表I：恶性时表达FLT3的组织/细胞
急性骨髓性白血病("AML")；
急性淋巴母细胞性白血病("ALL")
B细胞淋巴母细胞白血病；
前体B细胞淋巴母细胞白血病。
表II:氨基酸缩写
单字母 三字母 全称
F Phe 苯丙氨酸
L Leu 亮氨酸
S Ser 丝氨酸
Y Tyr 酪氨酸
C Cys 半胱氨酸
W Trp 色氨酸
P Pro 脯氨酸
H His 组氨酸
Q GIn 谷氨酰胺
R Arg 精氨酸
I lle 异亮氨酸
M Met 甲硫氨酸
T Thr 苏氨酸
N Asn 天冬酰胺
K Lys 赖氨酸
V Val 缬氨酸
A Ala 丙氨酸
D Asp 天冬氨酸
E Glu 谷氨酸
G Gly 甘氨酸
表III：氨基酸取代矩阵
调适自GCG软件9.0BLOSUM62氨基酸取代矩阵(阻断取代矩阵)。值越高，在相关的天然蛋白质中越可能发现取代。
表IV.用于合成AGL-0182-30的通用方法
用于合成AGL-0182-30的通用方法
其中AA1＝氨基酸1
AA2＝氨基酸2
AAS＝氨基酸5
Dil＝多拉异亮氨酸
Dap＝多拉脯氨酸
接头＝氨氧基乙酰基
表V：分别通过Kabat、Chothia及Contact方案识别位置CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3。就CDR-H1而言，使用Kabat及Chothia编号方案列出残基编号。
*Kabat 编号
**Chothia 编号
表VI.FACS试验中的几何均值和平均荧光率(MFR)值.
细胞系 癌症类型 来源 未染色 二级检测 同种型 cHv62-1b21.1 MFR
Karpas-299 ALCL DSMZ 623 596 569 634 1
REH ALL ATCC 220 236 235 16200 69
EOL-1 AML 西格玛 282 292 281 14000 50
MOLM-13 AML DSMZ 303 313 320 14000 44
MONCMAC-1 AML 创新生物阵列 315 348 338 11400 34
MV-4-11 AML ATCC 344 355 366 2875 8
OCI-AML2 AML DSMZ 343 337 329 5646 17
PL-21 AML DSMZ 598 584 570 3715 7
SKM-1 AML DSMZ 465 449 445 3208 7
THP-1 AML ATCC 486 475 474 19700 42
RS4；11 B-ALL ATCC 184 213 213 18400 86
SEM B-ALL DSMZ 181 207 212 132000 623
NALM-1 CML ATCC 197 254 262 12900 49
表VII.显示各细胞系的FACS结合的结果的直方图
表VIII.原发性AML和正常样品中的FLT3表达
AML样品中的表达
AML样品中的FLT3表达
AML样品
骨髓性细胞 干细胞 T细胞 B细胞
均值 963.1 318.3 9.842 72.60
正常样品中的表达
正常样品中的FLT3表达
9个脐带血样品/1个正常骨髓
骨髓性细胞 干细胞 T细胞 B细胞
均值 642.4 68.29 11.66 13.73
表IX.cHv62.21pAF-AGL-0182-30和cHv62.21pAF在MOLM-13,MV-4-11和Karpas299细胞上的体外细胞毒性的评估
MOLM-13细胞毒性
MV-4-11细胞毒性
Karpas299细胞毒性
表X：v62-1b37.1的抗体序列。
v62-1b37.1重链的氨基酸序列。(SEQ ID NO：12)。
v62-1b37.1轻链的氨基酸序列。(SEQ ID NO：13)。
表XI.AGL-0129-08的化学组成
0129-08表示2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((2S,3S)-3-叠氮基-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯啶-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺基)-3-(S)-苯基丙酸甲酯
序列表
<110> 艾更斯司股份有限公司（Agensys, Inc.）
<120> 结合至FLT3蛋白的抗体药物偶联物（ADC）
<130> 511582009200
<140> 未分配
<141> 同时提供
<150> US 62/130,476
<151> 2015-03-09
<160> 34
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 3307
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 人FLT3
<400> 1
gttttacacg aggcggcatc gcagggctgg gccggcgcgg cctggggacc ccgggctccg 60
gaggccatgc cggcgttggc gcgcgacggc ggccagctgc cgctgctcgt tgttttttct 120
gcaatgatat ttgggactat tacaaatcaa gatctgcctg tgatcaagtg tgttttaatc 180
aatcataaga acaatgattc atcagtgggg aagtcatcat catatcccat ggtatcagaa 240
tccccggaag acctcgggtg tgcgttgaga ccccagagct cagggacagt gtacgaagct 300
gccgctgtgg aagtggatgt atctgcttcc atcacactgc aagtgctggt cgatgcccca 360
gggaacattt cctgtctctg ggtctttaag cacagctccc tgaattgcca gccacatttt 420
gatttacaaa acagaggagt tgtttccatg gtcattttga aaatgacaga aacccaagct 480
ggagaatacc tactttttat tcagagtgaa gctaccaatt acacaatatt gtttacagtg 540
agtataagaa ataccctgct ttacacatta agaagacctt actttagaaa aatggaaaac 600
caggacgccc tggtctgcat atctgagagc gttccagagc cgatcgtgga atgggtgctt 660
tgcgattcac agggggaaag ctgtaaagaa gaaagtccag ctgttgttaa aaaggaggaa 720
aaagtgcttc atgaattatt tgggatggac ataaggtgct gtgccagaaa tgaactgggc 780
agggaatgca ccaggctgtt cacaatagat ctaaatcaaa ctcctcagac cacattgcca 840
caattatttc ttaaagtagg ggaaccctta tggataaggt gcaaagctgt tcatgtgaac 900
catggattcg ggctcacctg ggaattagaa aacaaagcac tcgaggaggg caactacttt 960
gagatgagta cctattcaac aaacagaact atgatacgga ttctgtttgc ttttgtatca 1020
tcagtggcaa gaaacgacac cggatactac acttgttcct cttcaaagca tcccagtcaa 1080
tcagctttgg ttaccatcgt agaaaaggga tttataaatg ctaccaattc aagtgaagat 1140
tatgaaattg accaatatga agagttttgt ttttctgtca ggtttaaagc ctacccacaa 1200
atcagatgta cgtggacctt ctctcgaaaa tcatttcctt gtgagcaaaa gggtcttgat 1260
aacggataca gcatatccaa gttttgcaat cataagcacc agccaggaga atatatattc 1320
catgcagaaa atgatgatgc ccaatttacc aaaatgttca cgctgaatat aagaaggaaa 1380
cctcaagtgc tcgcagaagc atcggcaagt caggcgtcct gtttctcgga tggataccca 1440
ttaccatctt ggacctggaa gaagtgttca gacaagtctc ccaactgcac agaagagatc 1500
acagaaggag tctggaatag aaaggctaac agaaaagtgt ttggacagtg ggtgtcgagc 1560
agtactctaa acatgagtga agccataaaa gggttcctgg tcaagtgctg tgcatacaat 1620
tcccttggca catcttgtga gacgatcctt ttaaactctc caggcccctt ccctttcatc 1680
caagacaaca tctcattcta tgcaacaatt ggtgtttgtc tcctcttcat tgtcgtttta 1740
accctgctaa tttgtcacaa gtacaaaaag caatttaggt atgaaagcca gctacagatg 1800
gtacaggtga ccggctcctc agataatgag tacttctacg ttgatttcag agaatatgaa 1860
tatgatctca aatgggagtt tccaagagaa aatttagagt ttgggaaggt actaggatca 1920
ggtgcttttg gaaaagtgat gaacgcaaca gcttatggaa ttagcaaaac aggagtctca 1980
atccaggttg ccgtcaaaat gctgaaagaa aaagcagaca gctctgaaag agaggcactc 2040
atgtcagaac tcaagatgat gacccagctg ggaagccacg agaatattgt gaacctgctg 2100
ggggcgtgca cactgtcagg accaatttac ttgatttttg aatactgttg ctatggtgat 2160
cttctcaact atctaagaag taaaagagaa aaatttcaca ggacttggac agagattttc 2220
aaggaacaca atttcagttt ttaccccact ttccaatcac atccaaattc cagcatgcct 2280
ggttcaagag aagttcagat acacccggac tcggatcaaa tctcagggct tcatgggaat 2340
tcatttcact ctgaagatga aattgaatat gaaaaccaaa aaaggctgga agaagaggag 2400
gacttgaatg tgcttacatt tgaagatctt ctttgctttg catatcaagt tgccaaagga 2460
atggaatttc tggaatttaa gtcgtgtgtt cacagagacc tggccgccag gaacgtgctt 2520
gtcacccacg ggaaagtggt gaagatatgt gactttggat tggctcgaga tatcatgagt 2580
gattccaact atgttgtcag gggcaatgcc cgtctgcctg taaaatggat ggcccccgaa 2640
agcctgtttg aaggcatcta caccattaag agtgatgtct ggtcatatgg aatattactg 2700
tgggaaatct tctcacttgg tgtgaatcct taccctggca ttccggttga tgctaacttc 2760
tacaaactga ttcaaaatgg atttaaaatg gatcagccat tttatgctac agaagaaata 2820
tacattataa tgcaatcctg ctgggctttt gactcaagga aacggccatc cttccctaat 2880
ttgacttcgt ttttaggatg tcagctggca gatgcagaag aagcgatgta tcagaatgtg 2940
gatggccgtg tttcggaatg tcctcacacc taccaaaaca ggcgaccttt cagcagagag 3000
atggatttgg ggctactctc tccgcaggct caggtcgaag attcgtagag gaacaattta 3060
gttttaagga cttcatccct ccacctatcc ctaacaggct gtagattacc aaaacaagat 3120
taatttcatc actaaaagaa aatctattat caactgctgc ttcaccagac ttttctctag 3180
aagctgtctg cgtttactct tgttttcaaa gggacttttg taaaatcaaa tcatcctgtc 3240
acaaggcagg aggagctgat aatgaacttt attggagcat tgatctgcat ccaaggcctt 3300
ctcaggc 3307
<210> 2
<211> 993
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> 人FLT3
<400> 2
Met Pro Ala Leu Ala Arg Asp Gly Gly Gln Leu Pro Leu Leu Val Val
1 5 10 15
Phe Ser Ala Met Ile Phe Gly Thr Ile Thr Asn Gln Asp Leu Pro Val
20 25 30
Ile Lys Cys Val Leu Ile Asn His Lys Asn Asn Asp Ser Ser Val Gly
35 40 45
Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu Ser Pro Glu Asp Leu Gly
50 55 60
Cys Ala Leu Arg Pro Gln Ser Ser Gly Thr Val Tyr Glu Ala Ala Ala
65 70 75 80
Val Glu Val Asp Val Ser Ala Ser Ile Thr Leu Gln Val Leu Val Asp
85 90 95
Ala Pro Gly Asn Ile Ser Cys Leu Trp Val Phe Lys His Ser Ser Leu
100 105 110
Asn Cys Gln Pro His Phe Asp Leu Gln Asn Arg Gly Val Val Ser Met
115 120 125
Val Ile Leu Lys Met Thr Glu Thr Gln Ala Gly Glu Tyr Leu Leu Phe
130 135 140
Ile Gln Ser Glu Ala Thr Asn Tyr Thr Ile Leu Phe Thr Val Ser Ile
145 150 155 160
Arg Asn Thr Leu Leu Tyr Thr Leu Arg Arg Pro Tyr Phe Arg Lys Met
165 170 175
Glu Asn Gln Asp Ala Leu Val Cys Ile Ser Glu Ser Val Pro Glu Pro
180 185 190
Ile Val Glu Trp Val Leu Cys Asp Ser Gln Gly Glu Ser Cys Lys Glu
195 200 205
Glu Ser Pro Ala Val Val Lys Lys Glu Glu Lys Val Leu His Glu Leu
210 215 220
Phe Gly Met Asp Ile Arg Cys Cys Ala Arg Asn Glu Leu Gly Arg Glu
225 230 235 240
Cys Thr Arg Leu Phe Thr Ile Asp Leu Asn Gln Thr Pro Gln Thr Thr
245 250 255
Leu Pro Gln Leu Phe Leu Lys Val Gly Glu Pro Leu Trp Ile Arg Cys
260 265 270
Lys Ala Val His Val Asn His Gly Phe Gly Leu Thr Trp Glu Leu Glu
275 280 285
Asn Lys Ala Leu Glu Glu Gly Asn Tyr Phe Glu Met Ser Thr Tyr Ser
290 295 300
Thr Asn Arg Thr Met Ile Arg Ile Leu Phe Ala Phe Val Ser Ser Val
305 310 315 320
Ala Arg Asn Asp Thr Gly Tyr Tyr Thr Cys Ser Ser Ser Lys His Pro
325 330 335
Ser Gln Ser Ala Leu Val Thr Ile Val Glu Lys Gly Phe Ile Asn Ala
340 345 350
Thr Asn Ser Ser Glu Asp Tyr Glu Ile Asp Gln Tyr Glu Glu Phe Cys
355 360 365
Phe Ser Val Arg Phe Lys Ala Tyr Pro Gln Ile Arg Cys Thr Trp Thr
370 375 380
Phe Ser Arg Lys Ser Phe Pro Cys Glu Gln Lys Gly Leu Asp Asn Gly
385 390 395 400
Tyr Ser Ile Ser Lys Phe Cys Asn His Lys His Gln Pro Gly Glu Tyr
405 410 415
Ile Phe His Ala Glu Asn Asp Asp Ala Gln Phe Thr Lys Met Phe Thr
420 425 430
Leu Asn Ile Arg Arg Lys Pro Gln Val Leu Ala Glu Ala Ser Ala Ser
435 440 445
Gln Ala Ser Cys Phe Ser Asp Gly Tyr Pro Leu Pro Ser Trp Thr Trp
450 455 460
Lys Lys Cys Ser Asp Lys Ser Pro Asn Cys Thr Glu Glu Ile Thr Glu
465 470 475 480
Gly Val Trp Asn Arg Lys Ala Asn Arg Lys Val Phe Gly Gln Trp Val
485 490 495
Ser Ser Ser Thr Leu Asn Met Ser Glu Ala Ile Lys Gly Phe Leu Val
500 505 510
Lys Cys Cys Ala Tyr Asn Ser Leu Gly Thr Ser Cys Glu Thr Ile Leu
515 520 525
Leu Asn Ser Pro Gly Pro Phe Pro Phe Ile Gln Asp Asn Ile Ser Phe
530 535 540
Tyr Ala Thr Ile Gly Val Cys Leu Leu Phe Ile Val Val Leu Thr Leu
545 550 555 560
Leu Ile Cys His Lys Tyr Lys Lys Gln Phe Arg Tyr Glu Ser Gln Leu
565 570 575
Gln Met Val Gln Val Thr Gly Ser Ser Asp Asn Glu Tyr Phe Tyr Val
580 585 590
Asp Phe Arg Glu Tyr Glu Tyr Asp Leu Lys Trp Glu Phe Pro Arg Glu
595 600 605
Asn Leu Glu Phe Gly Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val
610 615 620
Met Asn Ala Thr Ala Tyr Gly Ile Ser Lys Thr Gly Val Ser Ile Gln
625 630 635 640
Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Lys Ala Asp Ser Ser Glu Arg Glu
645 650 655
Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Met Met Thr Gln Leu Gly Ser His Glu
660 665 670
Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Leu Ser Gly Pro Ile Tyr
675 680 685
Leu Ile Phe Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Tyr Leu Arg
690 695 700
Ser Lys Arg Glu Lys Phe His Arg Thr Trp Thr Glu Ile Phe Lys Glu
705 710 715 720
His Asn Phe Ser Phe Tyr Pro Thr Phe Gln Ser His Pro Asn Ser Ser
725 730 735
Met Pro Gly Ser Arg Glu Val Gln Ile His Pro Asp Ser Asp Gln Ile
740 745 750
Ser Gly Leu His Gly Asn Ser Phe His Ser Glu Asp Glu Ile Glu Tyr
755 760 765
Glu Asn Gln Lys Arg Leu Glu Glu Glu Glu Asp Leu Asn Val Leu Thr
770 775 780
Phe Glu Asp Leu Leu Cys Phe Ala Tyr Gln Val Ala Lys Gly Met Glu
785 790 795 800
Phe Leu Glu Phe Lys Ser Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn
805 810 815
Val Leu Val Thr His Gly Lys Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu
820 825 830
Ala Arg Asp Ile Met Ser Asp Ser Asn Tyr Val Val Arg Gly Asn Ala
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850 855 860
Tyr Thr Ile Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu
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Ile Phe Ser Leu Gly Val Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Val Asp Ala
885 890 895
Asn Phe Tyr Lys Leu Ile Gln Asn Gly Phe Lys Met Asp Gln Pro Phe
900 905 910
Tyr Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Ile Ile Met Gln Ser Cys Trp Ala Phe
915 920 925
Asp Ser Arg Lys Arg Pro Ser Phe Pro Asn Leu Thr Ser Phe Leu Gly
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Cys Gln Leu Ala Asp Ala Glu Glu Ala Met Tyr Gln Asn Val Asp Gly
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Arg Val Ser Glu Cys Pro His Thr Tyr Gln Asn Arg Arg Pro Phe Ser
965 970 975
Arg Glu Met Asp Leu Gly Leu Leu Ser Pro Gln Ala Gln Val Glu Asp
980 985 990
Ser
<210> 3
<211> 1362
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CHv62.21 重链
<400> 3
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaggc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt ggctatagca taaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaatg ggtctcatcc attagtagta gtagtaatta catatactac 180
gcagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaaggg 300
tttatagctg gaactacttt tgatgctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 360
gtctcttcag catccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420
acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 660
gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080
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cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1260
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat aa 1362
<210> 4
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CHv62.21 重链
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
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210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
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290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 5
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CHv62.21 轻链
<400> 5
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ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 645
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CHv62.21 轻链
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Gly Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 7
<211> 1362
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CHv62.21 重链
<400> 7
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaggc ctggggggtc cctgagactc 60
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acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 660
gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080
cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1260
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat aa 1362
<210> 8
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CHv62.21 重链
<220>
<221> 变体
<222> 124
<223> Xaa = 对乙酰基苯基丙氨酸(pAF)
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
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Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Xaa Ser Thr Lys Gly
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Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
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Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
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Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 9
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CHv62.21 重链
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CHv62.21 轻链
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Gly Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 453
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> CHv62.21 重链
<220>
<221> 变体
<222> 124
<223> Xaa = 对乙酰基苯基丙氨酸(pAF)
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Xaa Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 12
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> v62-1b37.1 重链
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Thr Tyr Gly Pro Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 13
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<223> v62-1b37.1 轻链
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly
1 5 10
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Arg Asn Asp Leu Gly Trp Tyr
1 5
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln
1 5 10
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Leu Gln His Asn Gly Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
Leu Gln His Asn Gly Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Leu Gln His Asn Gly Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Gly Tyr Ser Ile Asn
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 24
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
1 5
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 25
Ser Gly Tyr Ser Ile Asn
1 5
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 26
Gly Tyr Ser Ile Asn
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 27
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
1 5
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 28
Ser Gly Tyr Ser Ile Asn
1 5
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 29
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 30
Ser Ser Ser Ser Asn
1 5
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 31
Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ile
1 5 10
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 32
Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人（Homo saiens）
<400> 33
Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 34
Ala Arg Glu Gly Phe Ile Ala Gly Thr Thr Phe Asp Ala Phe Asp
1 5 10 15

Claims (33)

1.一种抗体，其包含具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的CDRH2、具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDRH3、具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDRL2，及具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDRL3。
2.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体包含由自SEQ ID NO：11的第1E至第123S范围内的氨基酸序列组成的重链可变区及包含由自SEQ ID NO：10的第1D至第108R范围内的氨基酸序列组成的轻链可变区。
3.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体包含由根据ATCC登录号PTA-121831保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的抗体的重链可变区的氨基酸序列组成的重链可变区及包含由根据ATCC登录号PTA-121831保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)产生的抗体的轻链的氨基酸序列组成的轻链可变区。
4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中该抗体包含Fc区，其为IgG亚型。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗体，其中该Fc区包含在该重链的氨基酸位置124处的非天然氨基酸的取代，且其中该非天然氨基酸为对乙酰基苯丙氨酸(pAF)。
6.如权利要求1至2中任一项所述的抗体，其中该抗体包含由自SEQ ID NO：11的氨基酸编号第1E至第452G范围内的氨基酸序列组成的重链及包含由自SEQ ID NO：10的第1D至第214C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
7.如权利要求1至2中任一项所述的抗体，其中该抗体包含由自SEQ ID NO：11的第1E至该第453K范围内的氨基酸序列组成的重链及包含由自SEQ ID NO：10的第1D至第214C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
8.如权利要求5所述的抗体，其中该抗体包含由根据ATCC登录号PTA-121836保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的抗体的重链的氨基酸序列组成的重链，及包含由根据ATCC登录号PTA-121836保藏的中国仓鼠卵巢(CHO)产生的抗体的轻链的氨基酸序列组成的轻链。
9.如权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中该重链或该重链可变区的第1E被焦谷氨酸盐取代。
10.如权利要求6所述的抗体，其中该抗体包含由自SEQ ID NO：11的第1E至第452G范围内的氨基酸序列组成的重链，且其中该重链或该重链可变区的第1E修饰成焦谷氨酸盐，及其中该抗体包含由自SEQ ID NO：10的第1D至第214C范围内的氨基酸序列组成的轻链。
11.一种抗原结合片段，其包含如权利要求1至10中任一项所述的抗体的CDR，其中该抗原结合片段结合FLT-3。
12.如权利要求11的所述抗原结合片段，其中该抗原结合片段选自：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、经分离的VH及经分离的VL。
13.一种或多种分离核酸，其编码如权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
14.一种或多种表达载体，其包含如权利要求13所述的一种或多种分离核酸。
15.一种重组宿主细胞，其包含如权利要求14所述的一种或多种表达载体。
16.一种抗体或抗原结合片段，其通过培养如权利要求15所述的重组宿主细胞而产生。
17.一种抗体药物偶联物，其包含如权利要求16所述的抗体或抗原结合片段及治疗剂。
18.一种抗体药物偶联物，其包含结合FLT3但基本不抑制FLT3结合至FLT3配体(FL)的抗体或抗原结合片段及治疗剂。
19.一种抗体药物偶联物，其包含如权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段及治疗剂。
20.如权利要求17至19中任一项所述的抗体药物偶联物，其进一步包含连接该抗体或该抗原结合片段及该治疗剂的接头。
21.如权利要求20所述的抗体药物偶联物，其中该接头是非可裂解的接头。
22.如权利要求21所述的抗体药物偶联物，其中该接头是2-(氨氧基)乙酸。
23.如权利要求17至22中任一项所述的抗体药物偶联物，其中该治疗剂是(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-3-叠氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺。
24.如权利要求17至23中任一项所述的抗体药物偶联物，其中该抗体药物偶联物具有下式：
抗体-(接头-治疗剂)p，
其中该接头是2-(氨氧基)乙酸，且其中该治疗剂是(2S,3S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((S)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯啶-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-3-叠氮基-N-甲基-2-((S)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺，其中p选自：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3。
25.如权利要求24所述的抗体药物偶联物，其中p选自：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3。
26.一种药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求17至25中任一项所述的抗体药物偶联物。
27.如权利要求26所述的药物组合物，其用于治疗。
28.如权利要求27所述的药物组合物，其中该治疗用途是治疗癌症。
29.如权利要求26至28中任一项所述的药物组合物，其进一步包含一种或多种抗肿瘤剂。
30.如权利要求26至29中任一项所述的药物组合物，其中所述癌症包含相较于非癌性细胞以增加水平表达FLT3的一种或多种细胞。
31.如权利要求26至30中任一项所述的药物组合物，其中该癌症选自：急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、B细胞淋巴母细胞性白血病及前体B细胞淋巴母细胞性白血病。
32.一种治疗对象癌症的方法，其包括向该对象给予治疗有效量的如权利要求17至25中任一项所述的抗体药物偶联物或如权利要求26至30中任一项所述的药物组合物。
33.如权利要求32所述的治疗对象癌症的方法，其中该癌症选自：急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、B细胞淋巴母细胞性白血病及前体B细胞淋巴母细胞性白血病。
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