KR20200014777A - Flt3을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 - Google Patents

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바브라 존슨 사수
다니엘 엘리자벳 데틀링
세사르 아돌포 소머
익 앤디 웽
무스타파 마르 함즈
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화이자 인코포레이티드
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Abstract

본 명세서에는 Fms-유사 타이로신 카이나제 3(FLT3)에 특이적으로 결합하는 항체, FLT3에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR), 및 이러한 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포(예를 들어, FLT3-특이적 CAR-T 세포)가 제공된다. 본 발명은 또한 이러한 항체, CAR 및 조작된 면역 세포의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 예를 들어, FLT3을 발현하는 악성 세포와 연관된 병태(예를 들어, 암)의 치료를 위한 이러한 항체, CAR 및 조작된 면역 세포의 사용 방법을 제공한다.

Description

FLT3을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 전문이 참고로 본 명세서에 포함된 2017년 6월 2일자로 출원된 미국 가출원 제62/514,634호에 대한 우선권 이익을 주장한다.
모두 FLT3 특이적 항체를 개시한 2017년 6월 2일자로 출원된 미국 가출원 제62/514,574호, 및 2018년 4월 20일자로 출원된 제62/660,908호, 및 2018년 5월 31일자로 출원된 발명의 명칭이 "ANTIBODIES SPECIFIC FOR FLT3 AND THEIR USES"인 PCT 출원의 내용은 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
서열 목록에 대한 언급
본 출원은 EFS-Web을 통해서 전자적으로 출원되고, .txt 포맷으로 열거된 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. .txt 파일은 2018년 5월 24일자로 생성된 "ALGN_010_01WO_SeqList_ST25.txt""라는 파일명의 서열 목록을 포함하며, 이의 크기는 238KB이다. 이러한 .txt 파일에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
기술분야
본 명세서에는 Fms-유사 타이로신 카이나제 3(Fms-like tyrosine kinase 3: FLT3)-특이적 항체, FLT3에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)(FLT3 CAR), FLT3 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 FLT3-특이적 CAR를 포함하는 조작된 면역 세포(예를 들어, FLT3-특이적 CAR-T 세포)가 제공된다. 본 발명은 추가로 FLT3 특이적 CAR을 발현하도록 면역 세포를 조작하는 방법 및 FLT3에 연관된 병태(예를 들어, FLT3을 발현하는 악성 세포)를 치료하기 위해서 FLT3-특이적 항체 및 FLT3-특이적 CAR-T 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다.
악성종양-연관된 항원을 인식하도록 유전적으로 변형된 면역 세포의 입양 전달(adoptive transfer)은 암을 치료하기 위한 새로운 접근법으로서 유망한 것으로 제시되어 있다(문헌[Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008)] 참고). T 세포는 항원 인식 모이어티 및 T 세포 활성화 도메인으로 구성된 융합 단백질인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다(예를 들어, 문헌[Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993), 및 Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009)] 참고).
FLT3은 급성 골수성 백혈병(AML) 표적 항원이고, 건강한 세포와 비교할 때 AML 환자 블라스트에서 과발현되고, 환자 세포 대부분에서 발현된다(Carow et al, Feb 2, 1996 Blood: 87(3); Birg et al. Nov 1992 Blood: 80(10)). FLT3은 AML 환자에서 빈번하게 돌연변이되는 유전자이며, 돌연변이는 불량한 예후와 연관된다(Abu-Duhier et al. Br J Haematol. 2000 Oct;111(1):190-5, Yamamoto et al. April 15, 2001; Blood: 97 (8)). 소분자 FLT3 저해제가 임상 시험에서 활성을 나타내었지만; 그 반응은 내성 획득으로 인해서 통상적으로 일시적이다. 추가로 카이나제 저해제는 FLT3의 돌연변이된 형태를 발현하는 환자의 일부 만을 치료하여, 개선된 요법에 대한 긴급한 필요성을 강조한다.
따라서, 암, 및 특히 FLT3의 비정상적인 발현에 관련된 악성종양을 위한 대안적인 치료법이 필요하다. 본 명세서에는 이러한 요구를 해결한 방법 및 조성물이 제공된다.
본 명세서에는 Fms-유사 타이로신 카이나제 3(FLT3)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, FLT3에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR), 및 이러한 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포(예를 들어, FLT3-특이적 CAR-T 세포)가 제공된다. 또한 이러한 항체, CAR 및 면역 세포의 제조 방법이 제공된다. 추가로 예를 들어, FLT3을 발현하는 악성 세포와 연관된 병태(예를 들어, 암)의 치료를 위한 이러한 항체, CAR 및 조작된 면역 세포의 사용 방법이 제공된다. 일 양상에서, 본 명세서에는 FLT3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체가 제공되며, 여기서 항체는 표 2에 열거된 부분적인 VH 서열 중 임의의 하나를 갖는 중쇄 가변(VH) 영역 및/또는 표 2에 열거된 부분적인 VL 서열 중 임의의 하나를 갖는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 FLT3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체가 제공되며, 여기서 항체는 (a) 표 3에 열거된 상보성 결정 영역 1(CDR1), CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역 및/또는 (b) 표 3에 열거된 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다.
또한 본 명세서에는 FLT3에 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공된다. T 세포에서 FLT3 특이적 CAR의 발현은 FLT3과의 접촉 시에 T 세포를 활성화시키기에 효과적인 것으로 입증되어 있다. 본 명세서에 제공된 FLT3 특이적 CAR은 인간 FLT3에 결합하여, FLT3-발현 세포와의 접촉 시에 세포독성 활성을 나타낸다.
따라서 또 다른 양상에서, 본 명세서에는 세포외 리간드-결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공되며, 여기서 세포외 도메인은 FLT3의 세포외 도메인에 결합하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 세포외 리간드-결합 도메인, 제1 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 FLT3 CAR이 제공되며, 여기서 세포외 도메인은 FLT3 표적의 특정 도메인에 결합하는, 예를 들어, 서열번호 199(도메인 1), 서열번호 200(도메인 2), 서열번호 201(도메인 3), 서열번호 254(도메인 2-3), 서열번호 202(도메인 4) 또는 서열번호 203(도메인 5), 서열번호 254(도메인 2-3) 또는 서열번호 202(도메인 4)에 결합하는 scFv를 포함한다.
일부 실시형태에서, FLT3 특이적 CAR은 scFv를 포함하는 세포외 도메인을 포함하며, 여기서 scFv는 FLT3 표적의 도메인 4(서열번호 202)에 결합한다.
일부 실시형태에서, FLT3 특이적 CAR은 scFv를 포함하는 세포외 도메인을 포함하며, 여기서 scFv는 FLT3 표적의 도메인 2(서열번호 200)에 결합한다.
FLT3 특이적 CAR의 세포외 도메인은 scFv를 포함하며, 여기서 scFv는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하고, VH 영역 및 VL 영역 각각은 FLT3에 대해서 특이적인 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
일부 실시형태에서, VH 영역은 (i) 서열번호 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 294, 295, 296, 300, 301, 305, 306, 307, 311, 312, 316, 317 또는 318에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1); (ii) 서열번호 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 297, 298, 302, 303, 308, 309, 313, 314, 319, 320 또는 322에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 (iii) 서열번호 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 299, 304, 310, 315 또는 321에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하고/포함하거나; VL 영역은 (i) 서열번호 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 323, 326, 328, 331, 336, 338, 340, 343, 345, 348 또는 350에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1); (ii) 서열번호 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 324, 329, 332, 334, 341 또는 346에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 (iii) 서열번호 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 325, 327, 330, 333, 335, 337, 339, 342, 344, 347 또는 349에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다.
일부 실시형태에서, scFv를 포함하는 FLT3 특이적 CAR이 제공되며, 여기서 scFv는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 또는 293에 제시된 서열을 갖는 VH 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, scFV를 포함하는 FLT3 특이적 CAR이 제공되며, 여기서 scFv는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 또는 292에 제시된 서열을 갖는 VL 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, VH 영역 및 VL 영역을 포함하는 scFV를 포함하는 FLT3 특이적 CAR이 제공되며, 여기서 VH 영역은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 또는 293에 제시된 서열을 갖고; VL 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 또는 292에 제시된 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 또는 293에 제시된 서열, 또는 CDR 내에 존재하지 않는 잔기 내에 하나 또는 몇몇 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하고/포함하거나 VL 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 또는 292에 제시된 아미노산 서열, 또는 CDR 내에 존재하지 않는 아미노산 내에 하나 또는 몇몇 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 90, 91 또는 92에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 93 또는 94에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 서열번호 95에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역(VL)은 하기 CDR: 서열번호 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 172에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열번호 173에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 43, 44 또는 45에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 46 또는 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 서열번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역(VL)은 하기 CDR: 서열번호 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 148에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열번호 149에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 49, 44 또는 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 51 또는 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역(VL)은 하기 CDR: 서열번호 150에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열번호 152에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 60, 61 또는 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 63 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 서열번호 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 경쇄 가변 영역(VL)은 하기 CDR: 서열번호 156에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 157에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열번호 158에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, VL 영역은 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 각각의 CDR은 카밧(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, 카밧 정의와 코티아 정의의 조합, AbM 정의 또는 CDR의 접촉 정의에 따라서 정의된다.
일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, FLT3 특이적 CAR은 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 FLT3 특이적 CAR은 세포외 리간드-결합 도메인과 제1 막관통 도메인 사이에 줄기 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 줄기 도메인은 CD8α 힌지, IgG1 힌지 및 FcγRIIIα 힌지로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 줄기 도메인은 인간 CD8α 힌지, 인간 IgG1 힌지, 또는 인간 FcγRIIIα 힌지이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 FLT3 특이적 CAR은 1종 이상의 단클론성 항체에 대해서 특이적인 1종 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단클론성 항체에 대해서 특이적인 에피토프는 CD20 에피토프이다. 일부 실시형태에서, CD20 에피토프는 서열번호 229 또는 서열번호 230에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, FLT3 특이적 CAR은 서열번호 235, 236, 237 또는 242에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, FLT3 특이적 CAR은 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, FLT3 특이적 CAR은 서열번호 236에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 막관통 도메인은 CD8α 쇄 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, FLT3 특이적 CAR은 FLT3에 대해서 특이적이지 않은 또 다른 세포외 리간드-결합 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포외 리간드-결합 도메인(들), 제1 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인(들)은 단일 폴리펩타이드 상에 존재한다.
일부 실시형태에서, CAR은 제2 막관통 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 제1 막관통 도메인 및 세포외 리간드-결합 도메인(들)은 제1 폴리펩타이드 상에 존재하고, 여기서 제2 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인(들)은 제2 폴리펩타이드 상에 존재한다. 예시적인 실시형태에서, 제1 막관통 도메인은 고 친화도 IgE 수용체(FcεRI)의 α 쇄로부터의 막관통 도메인을 포함하고, 제2 막관통 도메인은 FcεRI의 γ 또는 β 쇄로부터의 막관통 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 공자극성 분자의 세포내 신호전달 도메인에 융합된 제3 막관통 도메인을 포함하는 제3 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 제3 막관통 도메인은 FcεRI의 γ 또는 β 쇄로부터의 막관통 도메인을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 세포 표면 막에서 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 FLT3에 대해서 특이적이지 않은 또 다른 CAR을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 자살 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 자살 폴리펩타이드는 RQR8이다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T- 림프구, 또는 헬퍼 T-림프구로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 1종 이상의 내인성 유전자의 붕괴를 포함할 수 있으며, 여기서 내인성 유전자는 TCRα, TCRβ, CD52, 글루코코티코이드 수용체(GR), 데옥시사이티딘 카이나제(dCK), 또는 면역 관문 단백질, 예를 들어, 예정사-1(programmed death-1: PD-1) 등을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 건강한 공여자로부터 획득된다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 세포는 질환 또는 장애를 앓고 있는 개체로부터 획득된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 의약으로서 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 표면 막에서 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포가 제공된다. 또 다른 양상에서, 본 명세서에는 의약으로서 사용하기 위한 FLT3 특이적 항체가 제공된다. 일부 실시형태에서, FLT3 특이적 CAR 발현 면역 세포 또는 FLT3 특이적 항체를 포함하는 의약은 FLT3 연관된 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다. 일 실시형태에서, FLT3 연관된 질환 또는 장애는 조혈 기원의 암, 예컨대, 림프종 또는 백혈병이다. 일부 실시형태에서, 암은 다발성 골수종, 악성 형질 세포 신생물, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종(nodular lymphocyte predominant Hodgkin's lymphoma), 칼러병(Kahler's diease) 및 골수종증, 형질 세포 백혈병, 형질세포종, B-세포 전림프구성 백혈병, 모발 세포 백혈병, B-세포 비호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 소포성 림프종, 버킷 림프종, 변연부 림프종, 외투 세포 림프종, 대세포 림프종, 전구 B-림프모구 림프종, 골수성 백혈병, 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulienemia), 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 림프종, 점막 관련 림프 조직 림프종, 소세포 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 버킷 림프종, 원발성 종격동(흉선) 거대 B-세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종, 림프종양 육아종증, T 세포/조직구-풍부 거대 B-세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 원발성 피부 미만성 거대 B-세포 림프종(다리 유형(leg type)), 노인의 EBV 양성 미만성 거대 B-세포 림프종, 염증 연관된 미만성 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, ALK-양성 거대 B-세포 림프종, 형질세포성 림프종, HHV8-연관 다중심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종과 버킷 림프종 사이의 중간 특징을 갖는 미분류 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종와 전통적인 호지킨 림프종 사이의 중간 특징으로 갖는 미분류 B-세포 림프종, 및 기타 조혈 세포 관련 암, 예를 들어, ALL 또는 AML로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기재된 FLT 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포를 포함하는 세포의 집단이 제공되며; 여기서 (ii) 상기 세포의 집단은 20%, 30% 또는 40%를 초과하는 줄기세포 기억 및 중심 기억 세포의 백분율을 포함하고/포함하거나 (iii) 상기 세포의 집단은 10%, 20%, 30% 또는 40%를 초과하는 FLT3 발현 세포의 용해 백분율을 달성한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR 중 임의의 하나를 발현하는 면역 세포를 조작하는 방법이 제공되며, 이 방법은 면역 세포를 제공하는 단계; 및 세포 내에 상기 FLT3 특이적 CAR을 암호화하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 단계를 포함하며; 이에 의해서 상기 면역 세포는 상기 FLT3 특이적 CAR을 발현한다.
일부 실시형태에서, 방법은 면역 세포를 제공하는 단계; 세포 내에 상기 FLT3 특이적 CAR을 암호화하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 단계; 및 FLT3에 대해서 특이적이지 않은 CAR을 암호화하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 FLT3 연관된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 제공되며, 이 방법은 표면에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 면역 세포를 제공하는 단계; 및 상기 면역 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 FLT3 연관된 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 항체를 제공하는 단계 및 상기 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기재된 바와 같은 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 항체 중 임의의 것을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 대상체에서 FLT3을 발현하는 악성 세포와 연관된 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역 세포 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 FLT3 특이적 항체를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 병태는 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 조혈 기원의 암, 예컨대, 림프종 또는 백혈병이다. 일부 실시형태에서, 암은 다발성 골수종, 악성 형질 세포 신생물, 호지킨 림프종, 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종, 칼러병 및 골수종증, 형질 세포 백혈병, 형질세포종, B-세포 전림프구성 백혈병, 모발 세포 백혈병, B-세포 비호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 소포성 림프종, 버킷 림프종, 변연부 림프종, 외투 세포 림프종, 대세포 림프종, 전구 B-림프모구 림프종, 골수성 백혈병, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 림프종, 점막 관련 림프 조직 림프종, 소세포 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 버킷 림프종, 원발성 종격동(흉선) 거대 B-세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종, 림프종양 육아종증, T 세포/조직구-풍부 거대 B-세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 원발성 피부 미만성 거대 B-세포 림프종(다리 유형), 노인의 EBV 양성 미만성 거대 B-세포 림프종, 염증 연관된 미만성 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, ALK-양성 거대 B-세포 림프종, 형질세포성 림프종, HHV8-연관 다중심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종과 버킷 림프종 사이의 중간 특징을 갖는 미분류 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종와 전통적인 호지킨 림프종 사이의 중간 특징으로 갖는 미분류 B-세포 림프종, 및 기타 조혈 세포 관련 암, 예를 들어, ALL 또는 AML로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 FLT3을 발현하는 악성 세포를 갖는 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 저해하는 방법이 제공되며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역 세포 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 FLT3 특이적 항체를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 대상체에서 FLT3을 발현하는 악성 세포의 전이를 저해하는 방법이 제공되며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역 세포 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 FLT3 특이적 항체를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 FLT3을 발현하는 악성 세포를 갖는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법이 제공되며, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역 세포 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 FLT3 특이적 항체를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법 중 임의의 것은 1종 이상의 추가 요법, 예를 들어, 단클론성 항체 및/또는 화학요법 등을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 단클론성 항체는, 예를 들어, 면역관문 저해제에 결합하는 항체, 예를 들어, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체 등일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법 중 임의의 것은 수용체 타이로신 카이나제 저해제, mTOR 저해제, 후성적 조절제, 프로테아좀 저해제, 면역조절제, 예컨대, 레날리도마이드, 헤지호그 저해제 또는 아이소시트레이트 데하이드로게나제(IDH) 저해제를, 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
도 1은 형질도입되지 않은 대조군과 비교하여, P3A1 CAR 작제물의 활성화된 T 세포로의 효율적인 형질도입을 입증한 대표적인 FACS 플롯, 및 CAR-발현 T 세포의 백분율 및 평균 형광 강도(MFI)로서의 모든 작제물에 대한 형질도입 효율을 도시한 도면이다.
도 2는 유세포 분석법에 의해서 평가된 다양한 CAR 작제물이 형질도입된 T 세포에서 활성화 마커 CD25 및 4-1BB의 발현을 도시한 도면이다.
도 3은 CD62L 및/또는 CD45RO 마커의 발현의 유세포 분석법 분석에 의해서 결정된 바와 같은 배양 이후에 CAR-T 세포의 표현형을 나타낸 도면이다.
도 4는 장기간 사멸 검정의 전체 실험 설계 및 6일에 배수 확장 및 세포독성 활성도(용해 백분율)로서 측정된 표적 세포에 대한 반복된 노출에 대한 상이한 CAR-T 세포의 반응을 도시한 도면이다.
도 5는 인간 AML의 동소 마우스 모델을 사용하여 2회 용량에서 P3A1 또는 P3E10 작제물을 발현하는 CAR-T 세포의 항종양 활성도를 도시한 도면이다. 총 플럭스(광자/초)로서 정량된 생물발광 신호를 상이한 시간 지점에서 나타낸다.
도 6은 세포 표면에서 CD20 에피토프를 포함하는 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 T 세포의 감도 대 항-CD20 항체 리툭시맙에 의해서 유도되는 보체-의존성-세포독성도(CDC)를 도시한 도면이다.
도 7은 CD20 에피토프를 발현하는 항-마우스 FLT3 CAR T 세포로 처리되고, 그 다음 리툭시맙이 투여된 마우스에서의 내인성 골수 간세포(progenitor cell)의 회복을 도시한 도면이다.
일 양상에서, 본 명세서에 개시된 본 발명은 FLT3(예를 들어, 인간 FLT3)에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 CAR을 포함하는 면역 세포(예를 들어, CAR-T 세포)를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이러한 CAR을 발현하는 면역 세포를 포함하는 조성물, 및 이러한 CAR 및 CAR 발현 면역 세포의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 FLT3 특이적 CAR 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 이러한 CAR을 발현하는 면역 세포를 사용하여 대상체에서 FLT3 매개된 병리학과 연관된 병태, 예컨대, FLT3을 발현하는 악성 세포에 의해서 매개되는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상에서, 본 명세서에 개시된 본 발명은 FLT3(예를 들어, 인간 FLT3)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 항체를 포함하는 조성물 및 이러한 항체의 사용 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서에는 이러한 항체를 사용하여, 대상체에서 FLT3-매개된 병리학과 연관된 병태, 예컨대, 암을 치료하는 방법이 제공된다.
일반적인 기술
본 발명의 실시는, 달리 제시되지 않는 한, 관련 기술분야의 기술에 포함되는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 하기 문헌, 예컨대[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]에 완전히 설명되어 있다.
정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "세포외 리간드-결합 도메인"은 리간드에 결합할 수 있거나 또는 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, 세포외 리간드-결합 도메인은 특정 질환 상태와 연관된 표적 세포 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다.
용어 "줄기도메인" 또는 "힌지 도메인"은 막관통 도메인을 세포외 리간드-결합 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 폴리펩타이드를 지칭하도록 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 특히, 줄기 도메인은 세포외 리간드-결합 도메인에게 보다 큰 가요성 및 접근성을 제공하기 위해 사용된다.
용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 신호 기능 신호를 전송하고 세포가 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "공자극성 분자"는 공자극성 리간드에 특이적으로 결합함으로써, 세포에 의한 공자극성 반응, 예컨대, 비제한적으로 증식을 매개하는, 면역 세포, T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공자극성 분자는 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 공자극성 분자의 예는 CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83와 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
"공자극성 리간드"는 T 세포 상의 동족 공자극성 신호 분자에 특이적으로 결합하여, 예를 들어, 펩타이드가 로딩된 MHC 분자와의 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공되는 1차 신호에 더하여, 증식 활성화, 분화 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는, 항원 제시 세포 상의 분자를 지칭한다. 공자극성 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공동자극 리간드(ICOS-L), 세포간 부착 분자(ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림프독소 β 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체 및 B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 공자극성 리간드는 또한 특히 T 세포 상에 존재하는 공자극성 분자, 예컨대, 비제한적으로 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83와 특이적으로 결합하는 리간드와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 위치하는 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해서 표적, 예컨대, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본 명세에서 사용되는 바와 같이, 이 용어는 무손상 다클론성 또는 단클론성 항체뿐만 아니라 이의 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄(scFv) 및 도메인 항체(예를 들어, 상어 및 낙타 항체를 포함), 및 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형상을 포함한다. 항체는 임의의 부류의 항체, 예컨대, IgG, IgA, IgE, IgD, 또는 IgM(또는 이의 하위부류)를 포함하고, 항체는 임의의 특정 부류일 필요는 없다. 중쇄의 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 부류에 배정될 수 있다. 5종의 주요 부류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라고 지칭된다. 면역글로불린의 상이한 부류의 소단위 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항원 결합 부분"은 주어진 항원(예를 들어, FLT3)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해서 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원 결합 단편" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab; Fab'; F(ab')2; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 단일 도메인 항체(dAb) 단편(Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
표적(예를 들어, FLT3 단백질)에 "특이적으로 결합"하는 항체, 항원 결합 단편, 항체 접합체는 관련 기술분야에서 널리 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 결합을 결정하는 방법 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 분자는, 이것이 대안적인 세포 또는 물질보다 특정 세포 또는 물질과 보다 빈번하게, 보다 신속하게, 더 큰 지속기간으로 그리고/또는 더 큰 친화도로 반응하거나 또는 회합하는 경우에, "특이적 결합"을 나타낸다고 언급된다. 항체는 이것이 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도로, 결합능으로, 보다 용이하게 그리고/또는 더 큰 지속기간으로 결합하는 경우에, 표적에 "특이적으로 결합"한다. 예를 들어, FLT3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체는 이것이 다른 FLT3 에피토프, 또는 비-FLT3 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도로, 결합능으로, 보다 용이하게 그리고/또는 더 큰 지속기간으로 이러한 에피토프에 결합하는 항체이다. 또한, 이러한 정의를 읽음으로써, 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 항체(또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 결합할 수 없는 것으로 이해된다. 따라서, "특이적 결합"은 배타적 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하는 것은 아니다. 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미한다.
항체의 "가변 영역"은 단독 또는 조합으로, 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각, 초가변 영역이라고도 공지된 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR)으로 이루어진다. 각각의 쇄 내의 CDR은 FR에 의해 함께 매우 근접하여 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하는 적어도 2종의 기술이 존재한다: (1) 교차-종 서열 가변성을 기초로 한 접근법(즉, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구를 기초로 한 접근법(Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948). 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, CDR은 어느 하나의 접근법에 의해 또는 둘 다의 접근법의 조합에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다.
가변 도메인의 "CDR"은 카밧의 정의, 코티아의 정의, 카밧 및 코티아 둘 다의 조합, AbM, 접촉, 및/또는 입체배좌적 정의, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 임의의 CDR 결정 방법에 따라 식별되는 가변 영역 내의 아미노산 잔기이다. 항체 CDR은 카밧 등에 의해 최초로 정의된 초가변 영역으로서 식별될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.]을 참고). CDR의 위치는 또한 코티아 등에 의해 최초로 기재된 구조적 루프 구조로서 식별될 수 있다(예를 들어, 문헌[Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989] 참고). CDR 식별에 대한 다른 접근법은 카밧 및 코티아의 절충안인, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(현재 Accelrys(등록상표))를 사용하여 유래된 "AbM 정의", 또는 문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996]에 제시된, 관찰된 항원 접촉에 기초한 CDR의 "접촉 정의"를 포함한다. 본 명세서에서 CDR의 "입체배좌적 정의"로 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 대한 엔탈피 기여를 만드는 잔기로서 식별될 수 있다(예를 들어, 문헌[Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008]을 참고). 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 그럼에도 불구하고, 특정한 잔기 또는 잔기의 군 또는 심지어는 전체 CDR이 항원 결합에 유의한 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수 있더라도, 카밧 CDR의 적어도 일부와 중첩될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, CDR은 접근법의 조합을 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본 명세서에 사용된 방법은 이들 접근법 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있다. 1개 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시형태의 경우에, CDR은 카밧, 코티아, 연장형, AbM, 접촉 및/또는 입체배좌적 정의 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단클론성 항체"는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 획득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 구성하는 개별 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연-발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론성 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지향된다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지향되는 상이한 항체를 포함하는 다클론성 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지향된다. 수식어 "단클론성"은 항체의 실질적으로 동종인 집단으로부터 획득되는 바와 같은 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용될 단클론성 항체는 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 단클론성 항체는 또한 예를 들어, 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인간화" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)인, 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 일 양상에서, 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해서 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해서 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열 중 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있지만, 이것은 항체 성능이 추가로 정밀화되고 최적화되도록 포함된다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이고, 여기서 CDR 영역 중 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 영역 중 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 최적으로는 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 포함할 것이다. 국제 특허 제WO 99/58572호에 기재된 바와 같은 변형된 Fc 영역을 갖는 항체가 바람직하다. 인간화 항체의 다른 형태는 본래 항체와 관련하여 변경된 하나 이상의 CDR(CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 또는 CDR H3)을 갖고, 이는 또한 본래 항체로부터의 하나 이상의 CDR"로부터 유래된" 하나 이상의 CDR로 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/되거나 관련 기술분야의 당업자에게 공지되거나 본 명세서에 개시된 인간 항체의 제조를 위한 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체의 이러한 정의는 적어도 하나의 인간 중쇄 폴리펩타이드 또는 적어도 하나의 인간 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다. 하나의 이러한 예는 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체이다. 인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되며, 여기서 그러한 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다(Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). 인간 항체는 또한 내인성 유전자좌 대신에 인간 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉적으로 도입한 동물, 예를 들어, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스의 면역화에 의해서 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호에 기재되어 있다. 대안적으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 지향되는 항체를 생산하는 인간 B 림프구를 불멸화시킴으로써 제조될 수 있다(이러한 B 림프구는 개체로부터 또는 cDNA의 단세포 클로닝으로부터 회수될 수 있거나 또는 시험관내에서 면역화될 수 있음)(예를 들어, 문헌[Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991] 참고); 및 미국 특허 제5,750,373호 참고).
용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고, 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대, 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고, 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
"1가 항체"는 분자당 1개의 항원 결합 부위를 포함한다(예를 들어, IgG 또는 Fab). 일부 예에서, 1가 항체는 1개 초과의 항원 결합 부위를 가질 수 있지만, 결합 부위는 상이한 항원으로부터의 것이다.
"2가 항체"는 분자당 2개의 항원 결합 부위를 포함한다(예를 들어, IgG). 일부 예에서, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 그러나, 2가 항체는 이중특이적일 수 있다.
본 발명의 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 기술, 예를 들어, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술 또는 이러한 기술의 조합 또는 관련 기술분야에 용이하게 공지된 다른 기술을 사용하여 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌[Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50, 1999 및 Fellouse, F.A., et al, J. MoI. Biol., 373(4):924-40, 2007] 참고).
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드 쇄를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 쇄 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우에, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 쇄의 조립 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합 후에, 예컨대, 표지 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어, "캡", 자연 발생 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 유사체로의 치환, 뉴클레오타이드간 변형, 예컨대, 예를 들어, 비하전된 링키지(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포아미데이트, 카바메이트 등)를 갖는 것 및 하전된 링키지(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등)를 갖는 것, 펜던트 모이어티, 예컨대, 예를 들어, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)를 갖는 것, 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 링키지(예를 들어, 알파 애노머 핵산 등)을 갖는 것뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드(들)의 비변형된 형태를 포함한다. 추가로, 당에 통상적으로 존재하는 하이드록실기 중 임의의 것이, 예를 들어, 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 추가의 뉴클레오타이드에 대한 추가의 링키지를 제조하기 위해서 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화될 수 있거나, 또는 아민 또는 1 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한, 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있는, 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 탄소환식 당 유사체, 알파- 또는 베타-애노머 당, 에피머 당, 예컨대, 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체 및 무염기성 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대, 메틸 리보사이드를 비롯한, 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스터 링키지가 대안적인 연결기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), (O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("폼아세탈")에 의해서 대체된 실시형태를 포함하지만 이들로 제한되지 않으며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H, 또는 선택적으로 에터(-O-) 링키지를 함유하는 치환된 또는 비치환된 알킬(1-20 C), 아릴, 알켄일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 아르알딜(araldyl)이다. 폴리뉴클레오타이드 내의 모든 링키지가 동일할 필요는 없다. 상기 기술은 RNA 및 DNA를 비롯한, 본 명세서에 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 항체의 "불변 영역"은 단독 또는 조합으로, 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어는 적어도 99% 순수한(즉, 오염물이 없는) 물질을 지칭한다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오타이드 삽입물의 혼입을 위한 벡터(들)의 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 그 자손은 자연적, 우발적 또는 고의적 돌연변이로 인해서 본래 모체 세포와 (형태학적 또는 게놈 DNA 상보성에서) 반드시 완전하게 동일하지는 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(들)를 생체내 형질감염시킨 세포를 포함한다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. "Fc 영역"은 네이티브 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기에서부터 또는 Pro230에서부터 이의 카복실-말단까지의 스트레치로 정의된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 카밧에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 영역인 CH2 및 CH3을 포함한다.
관련 기술분야에서 사용되는 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 네이티브 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것(감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하고, 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 이의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994; 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995]에 검토되어 있다. "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 수용체, FcRn을 포함한다(Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976; 및 Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994).
항체와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "경쟁한다"는 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편(또는 부분)이 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하여, 제1 항체와 이의 동족 에피토프의 결합의 결과가 제2 항체의 부재 하의 제1 항체의 결합과 비교할 때 제2 항체의 존재 하에서 검출 가능하게 감소되는 것을 의미한다. 제2 항체의 이의 에피토프에 대한 결합이 또한 제1 항체의 존재 하에서 검출 가능하게 감소되는 대안이 이러한 경우일 수 있지만, 반드시 필요한 것은 아니다. 즉, 제2 항체가 제1 항체의 이의 각각의 에피토프에 대한 결합을 저해하지 않으면서, 제1 항체가 제2 항체의 이의 에피토프에 대한 결합을 저해할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 동일한 정도인지, 보다 큰 정도인지, 또는 보다 적은 정도인지에 관계 없이 다른 항체와 이의 동족 에피토프 또는 리간드의 결합을 검출 가능하게 저해하는 경우, 항체는 이의 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"하는 것으로 언급된다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체 둘 다가 본 발명에 포함된다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 일어나는 기전(예를 들어, 입체 장애, 입체배좌적 변화, 또는 공통 에피토프 또는 이의 부분에 대한 결합)과 관계없이, 당업자는 본 명세서에 제공된 교시를 기반으로, 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포함되고, 본 명세서에 개시된 방법에 유용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "자가"는 환자를 치료하기 위해 사용되는 세포, 세포주 또는 세포의 집단이 상기 환자로부터 기원한 것임을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "동종"은 환자를 치료하기 위해 사용되는 세포 또는 세포의 집단이 상기 환자로부터 기원한 것이 아니라 공여자로부터 기원한 것임을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료"는 유익하거나 목적하는 임상 결과를 획득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해서, 유익하거나 목적하는 임상 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 신생물성 또는 암성 세포의 증식의 감소(또는 파괴), 신생물성 세포의 전이의 저해, FLT3 발현 종양의 크기의 수축 또는 감소, FLT3 연관 질환(예를 들어, 암)의 완화, FLT3 연관 질환(예를 들어, 암)으로부터 발생한 증상의 감소, FLT3 연관 질환(예를 들어, 암)을 앓고 있는 환자의 삶의 질의 증가, FLT3 연관 질환(예를 들어, 암)을 치료하기 위해 요구되는 다른 의약의 용량의 감소, FLT3 연관 질환(예를 들어, 암)의 진행 지연, FLT3 연관 질환(예를 들어, 암)의 치유, 및/또는 FLT3 연관 질환(예를 들어, 암)을 갖는 환자의 생존 연장.
"개선"은 FLT3 특이적 CAR 또는 FLT3 특이적 CAR-T-세포를 투여하지 않는 경우와 비교할 때 1종 이상의 증상의 감소 또는 개선을 의미한다. "개선"은 또한 증상의 지속기간의 단축 또는 감소를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 임의의 하나 이상의 유익하거나 목적하는 결과를 발생시키기에 충분한 양이다. 예방적 사용의 경우, 유익하거나 목적하는 결과는 위험의 제거 또는 감소, 중증도의 경감, 또는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 질환의 발달 동안 나타나는 이의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 비롯한, 질환의 개시의 지연을 포함한다. 치료적 사용의 경우, 유익하거나 목적하는 결과는 각종 FLT3 연관 질환 또는 병태(예를 들어, 다발성 골수종 등)의 1종 이상의 증상의 발생률의 감소 또는 개선, 질환을 치료하는 데 요구되는 다른 의약의 용량의 감소, 또 다른 의약의 효과의 증진, 및/또는 환자의 FLT3 연관 질환의 진행의 지연과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물의 유효 투여량은 예방적 또는 치료적 치료를 직접적으로 또는 간접적으로 달성하기에 충분한 양이다. 임상과 관련하여 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물의 유효 투여량은 또 다른 약물, 화합물 또는 약제학적 조성물과 함께 달성될 수 있거나 달성되지 않을 수 있다. 따라서, "유효 투여량"은 1종 이상의 치료제의 투여와 관련하여 고려될 수 있고, 단일 작용제는 1종 이상의 다른 작용제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성된다면, 유효량으로 주어진 것으로 간주될 수 있다.
"개체", "환자" 또는 "대상체"는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되고, 포유동물이다. 포유동물은 인간, 원숭이, 돼지, 기타 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트, 기니피그를 비롯한 설치류 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 대상체는 포유 동물이고, 본 명세서에서 상호 교환 가능하세 사용된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 비-인간 영장류이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 원숭이, 예를 들어, 시노몰거스 원숭이이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "벡터"는 숙주 세포 내에 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있는, 바람직하게는 이를 발현시킬 수 있는 작제물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대, 생산자 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대, 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사될 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"는 활성 성분과 조합되는 경우, 성분이 생물학적 활성을 보유하도록 하고, 대상체의 면역계와 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예는 표준 약제학적 담체, 예컨대, 인산염 완충 염수 용액, 물, 에멀션, 예컨대, 유/수 에멀션, 및 다양한 유형의 습윤제 중 임의의 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 예시적인 희석제는 인산염 완충 염수(PBS) 또는 생리(0.9%) 식염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제형화된다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005] 참고).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "kon"은 항원에 대한 항체 또는 CAR의 scFv의 회합에 대한 속도 상수를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "koff"는 항체/항원 복합체로부터의 항체 또는 CAR의 scFv의 해리에 대한 속도 상수를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "KD"는 항체-항원 상호작용 또는 scFv-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다.
본 명세서에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 실시형태를 포함(및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다. 수치 범위는 범위를 한정하는 수를 포함한다.
실시형태가 표현 "포함하는"을 사용하여 본 명세서에 기재된 경우, "로 이루어진" 및/또는 "로 본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본 발명의 양상 또는 실시형태가 마쿠쉬 군 또는 다른 대안적 그룹화와 관련하여 기재되는 경우, 본 발명은 전체적으로 열거된 전체 군, 뿐만 아니라 개별적으로 그 군의 각각의 구성원, 및 주요 군의 모든 가능한 하위군, 뿐만 아니라 군 구성원 중 하나 이상이 존재하지 않는 주요 군을 포함한다. 본 발명은 또한 청구된 발명에서 임의의 군 구성원 중 하나 이상의 명확한 배제를 고려한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우, 정의를 비롯하여, 본 명세서가 우선할 것이다. 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함한다", 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것이 이해될 것이다. 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수 용어는 단수형을 포함할 것이다.
예시적인 방법 및 물질이 본 명세서에 기재되어 있지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적이며 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
FLT3 항체
본 개시내용은 FLT3[예를 들어, 인간 FLT3(예를 들어, 수탁번호: NP_004110 또는 서열번호 198)]에 결합하고, 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 특징으로 하는 항체를 제공한다: (a) 대상체에서 FLT3을 발현하는 악성 세포와 연관된 병태(예를 들어, 암, 예컨대, AML)의 하나 이상의 증상의 치료, 예방, 개선; (b) (FLT3을 발현하는 악성 종양을 갖는) 대상체에서 종양 성장 또는 진행의 저해; (c) (FLT3을 발현하는 1종 이상의 악성 세포를 갖는) 대상체에서 FLT3을 발현하는 암(악성) 세포의 전이의 저해; (d) FLT3을 발현하는 종양의 퇴행(예를 들어, 장기간 퇴행)의 유도; (e) FLT3을 발현하는 악성 세포에서 세포독성 활성의 발휘; (f) 아직 식별되지 않은 인자와 FLT3 상호작용의 차단; 및/또는 (g) 부근에서 비-FLT3 발현 악성 세포의 성장을 사멸 또는 저해하는 방관자 효과의 유도.
일 양상에서, FLT3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체가 제공되며, 여기서 항체는, (a) (i) 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 246 또는 247에 제시된 서열을 포함하는 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1); (ii) 서열번호 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253 또는 255에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 iii) 서열번호 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 245, 250 또는 254에 제시된 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변(VH) 영역; 및/또는 (i) 서열번호 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273 또는 275에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR1; (ii) 서열번호 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266 또는 271에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 (iii) 서열번호 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272 또는 274에 제시된 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다.
또 다른 양상에서, FLT3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체가 제공되며, 여기서 항체는, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 또는 293에 제시된 서열을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 또는 292에 제시된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, FLT3에 특이적으로 결합하는 단리된 항체가 제공되며, 여기서 항체는, 서열번호 275, 289 또는 291에 제시된 서열을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열번호 274, 288 또는 290에 제시된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 표 2에 열거된 바와 같은 부분 경쇄 서열 중 임의의 하나 및/또는 표 2에 열거된 바와 같은 부분 중쇄 서열 중 임의의 하나를 갖는 항체가 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG2△a, IgG3 또는 IgG4 하위부류를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 글리코실화된 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 1종 이상의 인간 Fc 감마 수용체(들)에 대해서 감소된 결합 친화도를 갖는 불변 영역을 포함한다.
본 명세서에 제공된 항체는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 단일 쇄 (ScFv), 및/또는 인간화 항체를 포함할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간, 또는 임의의 다른 기원(키메라 또는 인간화 항체 포함)일 수 있다.
FLT3 특이적 CAR 및 이의 제조 방법
본 명세서에는 FLT3(예를 들어, 인간 FLT3(예를 들어, 서열번호 198 또는 수탁번호: NP_004110)에 결합하는 CAR이 제공된다. 본 명세서에 제공된 FLT3 특이적 CAR은 단일 쇄 CAR 및 다중쇄 CAR을 포함한다. CAR은 단클론성 항체의 항원-결합 특성을 이용하여, T 세포 특이성 및 반응성을 FLT3에 대해서 비-MHC-제한된 방식으로 재지시하는 능력을 갖는다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 T 세포에게 항원 가공과 독립적으로 항원을 인식하는 능력을 제공하며, 따라서 종양 회피의 주요 기전을 우회한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 CAR은 세포외 리간드-결합 도메인(예를 들어, 단일 쇄 가변 단편(scFv)), 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 리간드-결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 하나의 폴리펩타이드 내에, 즉, 단일 쇄 내에 존재한다. 다중쇄 CAR 및 폴리펩타이드가 또한 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 다중쇄 CAR은 막관통 도메인 및 적어도 하나의 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 막관통 도메인 및 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서 폴리펩타이드는 함께 조립되어 다중쇄 CAR을 형성한다.
일부 실시형태에서, FLT3 특이적 다중쇄 CAR은 IgE(FcεRI)에 대한 고친화도 수용체를 기반으로 한다. 비만 세포 및 호염기구 상에서 발현되는 FcεRI는 알레르기 반응을 촉발한다. FcεRI는 단일 α 소단위, 단일 β 소단위, 및 2개의 다이설파이드 γ 소단위로 구성된 사량체 복합체이다. α 소단위는 IgE-결합 도메인을 함유한다. β 및 γ 소단위는 신호 전달을 매개하는 ITAM을 함유한다. 일부 실시형태에서, FcRα 쇄의 세포외 도메인은 결실되고, FLT3 특이적 세포외 리간드-결합 도메인에 의해 대체된다. 일부 실시형태에서, 다중쇄 FLT3 특이적 CAR은 FLT3에 특이적으로 결합하는 scFv, CD8α 힌지, 및 FcRβ 쇄의 ITAM을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 FcRγ 쇄를 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포외 리간드-결합 도메인은 가요성 링커에 의해 연결된 표적 항원 특이적 단클론성 항체의 경쇄 가변(VL) 영역 및 중쇄 가변(VH) 영역을 포함하는 scFv를 포함한다. 단일 쇄 가변 영역 단편은 짧은 연결 펩타이드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결시킴으로써 제조된다(Bird et al., Science 242:423-426, 1988). 연결 펩타이드의 예는 하나의 가변 영역의 카복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 사이의 대략 3.5nm를 가교하는, 아미노산 서열 (GGGGS)3(서열번호 232)을 갖는 GS 링커이다. 다른 서열의 링커가 설계 및 사용되고 있다(상기 문헌[Bird et al., 1988]). 일반적으로, 링커는 짧은 가요성 폴리펩타이드일 수 있고, 바람직하게는 약 20개 이하의 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 그 다음, 링커는 추가 기능, 예컨대, 약물의 부착 또는 고체 지지체에 대한 부착을 위해 변형될 수 있다. 단일 쇄 변이체는 재조합방식으로 또는 합성에 의해서 생산될 수 있다. scFv의 합성 생산을 위해서, 자동화 합성기가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 생산을 위해서, scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 적합한 플라스미드가 적합한 숙주 세포, 진핵, 예컨대, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포, 또는 원핵, 예컨대, 이. 콜라이 내로 도입될 수 있다. 관심대상 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 결찰과 같은 일상적인 조작에 의해 제조될 수 있다. 생성된 scFv는 관련 기술분야에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 단리될 수 있다.
FLT3 세포외 도메인은 5개의 면역글로불린 도메인으로 구성되는데, 도메인 5는 세포 막에 가장 가깝고, 도메인 1이 가장 멀다(선형 방식으로; Verstraete, July 7, 2011; Blood: 118 (1)). 5개의 FLT3 세포외 도메인의 서열을 하기 표 1에 열거한다.
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도메인 2-3은 도메인 2 및 도메인 3의 서열(서열번호 254)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR의 세포외 리간드-결합 도메인은 FLT3 세포외 도메인의 도메인 1, 2, 3, 4 또는 5에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR의 세포외 리간드-결합 도메인은 FLT3 세포외 도메인의 도메인 1에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR의 세포외 리간드-결합 도메인은 FLT3 세포외 도메인의 도메인 2에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR의 세포외 리간드-결합 도메인은 FLT3 세포외 도메인의 도메인 3에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR의 세포외 리간드-결합 도메인은 FLT3 세포외 도메인의 도메인 4에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR의 세포외 리간드-결합 도메인은 FLT3 세포외 도메인의 도메인 5에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR의 세포외 리간드-결합 도메인은 FLT3 세포외 도메인의 도메인 2-3에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR의 세포외 리간드-결합 도메인은 FLT3 세포외 도메인의 도메인 2-3 또는 4에 결합한다.
또 다른 양상에서, FLT3에 특이적으로 결합하는 CAR이 제공되며, 여기서 CAR은, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 또는 293에 제시된 서열을 갖는 VH 영역; 및/또는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 또는 292에 제시된 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 세포외 리간드-결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, VH 및 VL은 가요성 링커에 의해서 함께 연결된다. 일부 실시형태에서, 가요성 링커는 서열번호 232에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 세포외 리간드-결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공되며, 여기서 세포외 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL)을 포함하는 단일 쇄 Fv 단편(scFv)을 포함하며, 여기서 VH 영역은 (i) 서열번호 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 294, 295, 296, 300, 301, 305, 306, 307, 311, 312, 316, 317 또는 318에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1); (ii) 서열번호 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 297, 298, 302, 303, 308, 309, 313, 314, 319, 320 또는 322에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 (iii) 서열번호 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 299, 304, 310, 315 또는 321에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다.
또 다른 양상에서, 세포외 리간드-결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공되며, 여기서 세포외 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 단일 쇄 Fv 단편(scFv)을 포함하고, 여기서 VL 영역은 (i) 서열번호 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 323, 326, 328, 331, 336, 338, 340, 343, 345, 348 또는 350에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1); (ii) 서열번호145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 324, 329, 332, 334, 341 또는 346에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 (iii) 서열번호 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 325, 327, 330, 333, 335, 337, 339, 342, 344, 347 또는 349에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다.
또 다른 양상에서, 세포외 리간드-결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공되며, 여기서 세포외 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL)을 포함하는 단일 쇄 Fv 단편(scFv)을 포함하며, 여기서 (a) VH 영역은 (i) 서열번호 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 294, 295, 296, 300, 301, 305, 306, 307, 311, 312, 316, 317 또는 318에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 상보성 결정 영역 1(CDR1); (ii) 서열번호 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 297, 298, 302, 303, 308, 309, 313, 314, 319, 320 또는 322에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 (iii) 서열번호 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 299, 304, 310, 315 또는 321에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하고; (b) VL 영역은 (i) 서열번호 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 323, 326, 328, 331, 336, 338, 340, 343, 345, 348 또는 350에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1); (ii) 서열번호 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 324, 329, 332, 334, 341 또는 346에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 (iii) 서열번호 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 325, 327, 330, 333, 335, 337, 339, 342, 344, 347 또는 349에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 CDR은 표 2에 열거된 바와 같은 부분 경쇄 서열 중 임의의 하나 및/또는 표 2에 열거된 바와 같은 부분 중쇄 서열 중 임의의 하나를 갖는 세포외 리간드-결합 도메인을 포함한다.
표 2에서, 코티아 CDR 서열이 밑줄 표시되고 카밧 CDR 서열이 볼드체인, P4F6, P4C7, P3A1, P5A3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2, 및 P7F9의 중쇄 CDR2 서열을 제외하고, 밑줄 표시된 서열은 카밧에 따른 CDR 서열이고, 볼드체는 코티아에 따른 것이다.
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Figure pct00003
Figure pct00004
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또한, 본 명세서에는 FLT3에 대한 항체의 항원 결합 도메인 또는 FLT3에 대한 CAR의 세포외 리간드-결합 도메인의 CDR 부분(코티아, 카밧 CDR, 및 CDR 접촉 영역 포함)이 제공된다. CDR 영역의 결정은 관련 기술분야의 기술 범위에 양호하게 포함된다. 일부 실시형태에서, CDR은 카밧 및 코티아 CDR의 조합("조합된 CR" 또는 "연장된 CDR"이라고도 불림)일 수 있다는 것이 이해된다. 일부 실시형태에서, CDR은 카밧 CDR이다. 다른 실시형태에서, CDR은 코티아 CDR이다. 다시 말해서, 1개 초과의 CDR을 갖는 실시형태에서, CDR은 카밧, 코티아, 조합 CDR, 또는 이들의 조합 중 임의의 것일 수 있다. 표 3은 본 명세서에 제공된 CDR 서열의 예를 제공한다.
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본 발명은 특성에 유의하게 영향을 미치지 않는 변형을 갖는 기능적으로 동등한 CAR 및 활성도 및/또는 친화도가 향상되거나 감소된 변이체를 비롯한, 표 2에 제시된 본 발명의 CAR 및 폴리펩타이드에 대한 변형을 포괄한다. 예를 들어, 아미노산 서열은 FLT3에 대해 목적하는 결합 친화도를 갖는 항체를 획득하도록 돌연변이될 수 있다. 폴리펩타이드의 변형은 관련 기술분야에서 일상적인 실시이며, 본 명세서에 상세히 기재될 필요가 없다. 변형된 폴리펩타이드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능적 활성을 유의하게 유해하게 변화시키지 않거나 또는 리간드에 대한 폴리펩타이드의 친화도를 성숙(향상)시키는 아미노산의 1개 이상의 결실 또는 부가를 갖는 폴리펩타이드, 또는 화학적 유사체의 사용을 포함한다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 혈액 순환 중 항체의 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 항체 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
치환 변이체는, 항체 분자 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고, 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이유발을 위한 최대 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경이 또한 고려된다. 보존적 치환이 표 4에 "보존적 치환"의 표제 하에 제시된다. 이러한 치환이 생물학적 활성도를 변화시키는 경우, 표 4에서의 또는 아미노산 부류를 참고하여 하기에 추가로 기재된 바와 같은 "예시적인 치환"으로 명명된 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고 그 생성물이 스크리닝될 수 있다.
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일부 실시형태에서, 본 명세서에는 FLT3에 결합하고, 하기를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 비롯한, 본 명세서에 기재된 CAR과 FLT3에 대한 결합에 대해서 경쟁하는, 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는 CAR이 제공된다: P4F6, P4C7, P3A1, P5A3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2, P7F9, P08B06EE, P04A04, P01A05, P08B03, P5F7g, P10A02g, P10A04g, P10A05g, P10A07g, P10B03g, P10B06g, P5F7g2, P5F7g3, 및 P5F7g4.
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 FLT3에 특이적으로 결합하는 CAR이 제공되며, 여기서 CAR은 서열번호 4에 제시된 서열을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열번호 3에 제시된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 FLT3에 특이적으로 결합하는 CAR이 제공되며, 여기서 CAR은 서열번호 6에 제시된 서열을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열번호 5에 제시된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 FLT3에 특이적으로 결합하는 CAR을 제공하며, 여기서 CAR은 서열번호 10에 제시된 서열을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열번호 9에 제시된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 FLT3에 특이적으로 결합하는 CAR이 제공되며, 여기서 CAR은 서열번호 20에 제시된 서열을 포함하는 VH 영역; 및/또는 서열번호 19에 제시된 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 또한 CDR 접촉 영역을 기반으로 하는 FLT3 항체에 대한 항체의 CDR 부분을 포함하는 CAR을 제공한다. CDR 접촉 영역은 항체에게 항원에 대한 특이성을 부여하는 항체의 영역이다. 일반적으로, CDR 접촉 영역은 CDR 및 버니어 구역(Vernier zone) 내의 잔기 위치를 포함하며, 이는 특이적 항원에 결합하는 항체에 대해서 적절한 루프 구조를 유지시키기 위해서 제약된다(예를 들어, 문헌[Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2007] 참고). CDR 접촉 영역의 결정은 관련 기술분야의 기술 범위에 양호하게 포함된다.
FLT3(예컨대, 인간 FLT3(예를 들어, 서열번호 198)에 대한 본 명세서에 기재된 바와 같은 FLT3 특이적 CAR의 리간드 결합 도메인의 결합 친화도(KD)는, 예를 들어, 약 0.1 내지 약 1000nM, 예를 들어, 약 0.5nM 내지 약 500nM, 또는 예를 들어, 약 1nM 내지 약 250nM일 수 있다. 일부 실시형태에서, 결합 친화도는 약 1000nm, 750nm, 500nm, 400nm, 300nm, 250nm, 200nM, 100nM, 90nM, 80nM, 70nM, 60nM, 50nM, 45nM, 40nM, 35nM, 30nM, 25nM, 20nM, 19nm, 18nm, 17nm, 16nm, 15nM, 10nM, 8nM, 7.5nM, 7nM, 6.5nM, 6nM, 5.5nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.5nM, 0.3nM 또는 0.1nM 중 임의의 것이다.
일부 실시형태에서, FLT3에 대한 본 명세서에 기재된 바와 같은 FLT3 특이적 CAR의 리간드 결합 도메인의 scFv의 결합 친화도(KD)는 약 10nM 내지 약 100nM, 약 10nM 내지 약 90nM, 약 10nM 내지 약 80nM, 약 20nM 내지 약 70nM, 약 25nM 내지 약 75nM, 또는 약 40nM 내지 약 110nM이다. 일 실시형태에서, 본 단락에 기술된 scFv의 결합 친화도는 인간 FLT3에 대한 것이다.
일부 실시형태에서, 인간 FLT3의 세포외 도메인의 도메인 4에 대한 본 명세서에 기재된 바와 같은 FLT3 특이적 CAR의 리간드 결합 도메인의 scFv의 결합 친화도(KD)는 약 1nM 내지 약 100nM, 약 10nM 내지 약 100nM, 약 20nM 내지 약 100nM, 약 25nM 내지 약 105nM, 약 40nM 내지 약 80nM, 약 40nM 내지 약 100nM, 또는 약 50nM 내지 약 100nM이다.
일부 실시형태에서, 인간 FLT3의 세포외 도메인의 도메인 2-3에 대한 본 명세서에 기재된 바와 같은 FLT3 특이적 CAR의 리간드 결합 도메인의 scFv의 결합 친화도(KD)는 약 5nM 내지 30nM, 약 5nM 내지 약 25nM, 약 10nM 내지 약 30nM, 약 10nM 내지 약 40nM, 또는 약 10nM 내지 약 25nM이다.
예시적인 실시형태에서, ScFv의 KD는 실시예 1에 개시된 바와 같이 측정된다.
일부 실시형태에서, 결합 친화도는 약 1000nm, 900nm, 800nm, 250nM, 200nM, 100nM, 50nM, 30nM, 20nM, 10nM, 7.5nM, 7nM, 6.5nM, 6nM, 5nM 중 임의의 것이다.
단클론성 항체-특이적 에피토프
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 FLT3 특이적 CAR 중 임의의 하나의 세포외 도메인은 단클론성 항체에 대해서 특이적인(즉, 이에 의해서 특이적으로 인식되는) 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 이러한 에피토프는 또한 본 명세서에서 mAb-특이적 에피토프라고 지칭된다. 이러한 실시형태에서, 세포외 도메인은 FLT3에 특이적으로 결합하는 VH 및 VL 폴리펩타이드 및 하나 이상의 단클론성 항체(mAb)에 결합하는 하나 이상의 에피토프를 포함한다. mAb-특이적 에피토프를 포함하는 CAR은 단일-쇄 또는 다중-쇄일 수 있다.
본 명세서에 기재된 CAR의 세포외 도메인 내에 단클론성 항체에 대해서 특이적인 에피토프를 포함시키는 것은 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포의 분류 및 고갈을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 이러한 특징은 또한 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포의 투여에 의해서 고갈된 내인성 FLT3 발현 세포의 회복을 촉진시킨다.
따라서 일부 실시형태에서, 본 발명은 mAb-특이적 에피토프를 포함하는 CAR을 지닌 조작된 면역 세포를 분류 및/또는 고갈시키는 방법 및 내인성 FLT3 발현 세포, 예컨대, 골수 간세포의 회복을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
몇몇 에피토프-단클론성 항체 커플; 특히, 의학적 용도를 위해서 이미 승인된 것, 예컨대, 비제한적인 예로서 CD20 에피토프/리툭시맙을 사용하여 단클론성 항체 특이적 에피토프를 포함하는 CAR을 생성시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 에피토프에 대해서 특이적인 단클론성 항체는 세포독성 약물과 접합될 수 있다. 상부에 보체계의 그래프팅된 성분(들)이 존재하는 조작된 항체를 사용함으로써 CDC 세포독성도를 촉진시키는 것이 또한 가능하다. 일부 실시형태에서, CAR-T 세포의 활성화는 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 세포를 고갈시킴으로써 조정될 수 있다.
본 발명은 또한 mAb-특이적 에피토프(들)를 발현하는 FLT3 특이적 CAR을 지닌 조작된 면역 세포를 분류하는 방법, 및 상기 CAR의 외부 리간드 결합 도메인을 표적으로 하는 항체를 사용하여 세포를 고갈시킴으로써 이러한 CAR을 지닌 조작된 면역 세포의 활성화를 조절하는 치료 방법을 포함한다.
단클론성 항체에 의해서 특이적으로 인식되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 CAR은 전문이 참고로 본 명세서에 포함된 국제 특허 제WO2016/120216호에 개시되어 있다. 에피토프는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수의 에피토프로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 의학적 용도를 위해서 승인된 단클론성 항체의 표적, 예를 들어, 비제한적으로 리툭시맙에 의해서 인식되는 CD20 에피토프 등일 수 있다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 229에 제시된 아미노산 서열을 포함한다:
CPYSNPSLC (서열번호 229).
일부 실시형태에서, 에피토프는 CAR의 scFv와 힌지 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커에 의해 분리된, 동일한 에피토프의 2개의 예가 CAR에 사용될 수 있다. 예를 들어,
Figure pct00018
에 제시된 바와 같은, 링커에 의해서 분리된, 서열번호 229에 제시된 에피토프의 2개의 카피를 포함하는 폴리펩타이드가 경쇄 가변 영역과 힌지 사이에 위치된 cAR 내에서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, VH 폴리펩타이드 및 VL 폴리펩타이드 및 mAb-특이적 에피토프(들)를 포함하는 CAR의 세포외 결합 도메인은 에피토프의 삽입 위치 및 링커의 사용에 따라서 상이한 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, mAb-특이적 에피토프를 포함하는 FLT3 특이적 CAR의 세포외 결합 도메인은 하기 구조 중 하나를 가질 수 있다:
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-;
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-;
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2;
(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2;
에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-V1-L1-V2;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x-;
(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프3-(L)x-;
(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x-;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-(L)x-에피토프2-(L)x-V2; 또는,
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-(L)x-에피토프2-(L)x-V2-(L)x-에피토프3-(L)x;
여기서,
V1은 VL이고, V2는 VH이거나, 또는 V1은 VH이고, V2는 VL이며;
L1은 VH 쇄를 VL 쇄에 연결시키기에 적합한 링커이고;
L은 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 링커이고, 세포외 결합 도메인에서 L의 각각의 존재는 동일할 수 있거나 또는 동일한 세포외 결합 도메인에서 L의 다른 존재와 상이할 수 있고, 예를 들어, SGGGG, GGGGS 또는 SGGGGS이고,
x는 0 또는 1이며, x의 각각의 존재는 서로 독립적으로 선택되며;
에피토프 1, 에피토프 2, 에피토프 3 및 에피토프 4는 mAb-특이적 에피토프이고, 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 4는 서열번호 229의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프이고, 에피토프 3은 서열번호 231의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프이다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 하기 서열을 포함한다:
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-; 또는,
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x-(여기서, V1, V2, L1, L, x 및 에피토프 1, 에피토프 2, 에피토프 3 및 에피토프 4는 상기에 정의된 바와 같음).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 FLT3 특이적 CAR 중 임의의 하나는 CD52 에피토프, CD20 에피토프, CD3 에피토프, CD41 에피토프, CD25 에피토프, CD30 에피토프, EGFR 에피토프, TNFα 에피토프, VEGF 에피토프, 보체 단백질 C5 에피토프, CD11a 에피토프, CD33 에피토프, 알파-4 인테그린 에피토프, IgE Fc 영역 에피토프, RSV 단백질 F 에피토프, IL-6 수용체 에피토프, HER2 수용체 에피토프, 인테그린 α4β7 에피토프, BAFF (B-세포 활성화 인자) 에피토프, IL-1β 에피토프, RANKL 에피토프, CTLA4 에피토프, CD34 에피토프, IL-12 에피토프, 및/또는 IL-23 에피토프로부터 선택된 1종 이상의 mAb-특이적 에피토프를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 FLT3 특이적 CAR은 알렘투주맙(alemtuzumab), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 무로모납(muromonab)-CD3, 토시투모맙(tositumomab),압식시맙(abciximab), 바실릭시맙(basiliximab), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 베바시주맙(bevacizumab), 세톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10 및/또는 우스테키누맙(ustekinumab)에 의해서 특이적으로 인식되는 에피토프로부터 선택된 1종 이상의 mAb-특이적 에피토프를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, FLT3 특이적 CAR은 표 5에 개시된 에피토프로부터 선택된 1종 이상의 mAb-특이적 에피토프를 포함한다:
Figure pct00019
본 발명에 따른 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 세포외 리간드-결합 도메인이 표적에 결합한 후 세포내 신호전달을 담당하여 면역 세포 및 면역 반응의 활성화를 생성시킨다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR이 발현되는 면역 세포의 정상 효과기 기능 중 적어도 1종을 활성화시키는 능력을 갖는다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 사이토카인의 분비를 비롯한 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR에서 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인은, 예를 들어, 제한 없이, T 세포 수용체, 및 항원 수용체 맞물림 후 협력하여 신호 전달을 개시하는 작용을 하는 보조-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 갖는 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 임의의 합성 서열일 수 있다. 세포내 신호전달 도메인은 2종의 별개의 부류의 세포질 신호전달 서열: 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것, 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여 2차 또는 공자극성 신호를 제공하는 것을 포함한다. 1차 세포질 신호전달 서열은 ITAM의 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프라고 공지된 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. ITAM은 syk/zap70 부류 타이로신 카이나제에 대한 결합 부위로서의 역할을 하는, 다양한 수용체의 세포질내 꼬리에서 발견되는 널리 정의된 신호전달 모티프이다. 본 발명에 사용된 ITAM의 예는 비제한적 예로서 TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 210에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 예를 들어, 적어도 80% 또는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 공자극성 분자의 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 41BB(젠뱅크: AAA53133.) 및 CD28(NP_006130.1)의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 공자극성 분자의 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 209 및 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 예를 들어, 적어도 80%, 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 서열번호 209 및 서열번호 214에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 예를 들어, 적어도 80%, 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
CAR은 세포의 표면 막 상에서 발현된다. 따라서, CAR은 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 CAR에 적합한 막관통 도메인은 (a) 세포, 예를 들어, 면역 세포, 예컨대, 예를 들어, 비제한적으로, 림프구 세포 또는 자연 킬러(NK) 세포의 표면에서 발현되는 능력, 및 (b) 미리 규정된 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 지시하기 위해서 리간드-결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인과 상호작용하는 능력을 갖는다. 막관통 도메인은 자연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 막관통 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 비제한적 예로서, 막관통 폴리펩타이드는 T 세포 수용체의 소단위, 예컨대, α, β, γ 또는 δ, CD3 복합체를 구성하는 폴리펩타이드, IL-2 수용체 p55(a 쇄), p75(β 쇄) 또는 γ 쇄, Fc 수용체, 특히 Fcγ 수용체 III 또는 CD 단백질의 소단위 쇄일 수 있다. 대안적으로, 막관통 도메인은 합성일 수 있고, 우세하게 소수성인 잔기, 예컨대, 류신 및 발린을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서 상기 막관통 도메인은 인간 CD8α 쇄(예를 들어, NP_001139345.1)로부터 유래된다.
막관통 도메인은 줄기 도메인(힌지 도메인이라고도 불림)에 의해서 세포외 리간드-결합 도메인에 연결된다. 줄기 도메인은 최대 300개의 아미노산, 예를 들어, 10 내지 100개의 아미노산 또는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 줄기 영역은 자연 발생 분자의 전부 또는 부분으로부터, 예컨대, CD8, CD4 또는 CD28의 세포외 영역의 전부 또는 부분으로부터, 또는 항체 불변 영역의 전부 또는 부분로부터 유래될 수 있다. 대안적으로 줄기 도메인은 자연 발생 줄기 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있거나, 또는 완전히 합성적인 줄기 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 줄기 도메인은 인간 CD8α 쇄(예를 들어, NP_001139345.1)의 부분이다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 상기 막관통 도메인 및 힌지 도메인은 서열번호 206 및 208로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 95% 97%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함하는, 인간 CD8α 쇄의 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR의 줄기 도메인은 CD8α 힌지, IgG1 힌지 또는 FcγRIIIα 힌지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 줄기 도메인은 인간 CD8α 힌지, 인간 IgG1 힌지, 또는 인간 FcγRIIIα 힌지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CAR은 FLT3에 특이적으로 결합하는 세포외 리간드-결합 도메인, CD8α 인간 힌지 및 막관통 도메인, CD3ζ 신호전달 도메인, 및 4-1BB 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
표 6은 본 명세서에 개시된 CAR에서 사용될 수 있는 도메인의 예시적인 서열을 제공한다.
Figure pct00020
Figure pct00021
표적 항원의 하향조절 또는 돌연변이는 암 세포에서 일반적으로 관찰되고, 이는 항원-손실 회피 변이체를 생성한다. 따라서, 종양 회피를 상쇄하고, 면역 세포를 표적에 대해 보다 특이적이도록 하기 위해서, FLT3 특이적 CAR은 표적 내의 상이한 요소에 동시에 결합함으로써 면역 세포 활성화 및 기능을 증대시키기 위해서, 1개 이상의 추가의 세포외 리간드-결합 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 세포외 리간드-결합 도메인은 동일한 막관통 폴리펩타이드 상에 직렬로 배치할 수 있고, 선택적으로 링커에 의해 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 상이한 세포외 리간드-결합 도메인은 CAR을 구성하는 상이한 막관통 폴리펩타이드 상에 배치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 각각의 CAR이 상이한 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는, CAR의 집단에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 면역 세포를 제공하는 단계, 및 각각의 CAR이 상이한 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는, CAR의 집단을 세포의 표면에서 발현시키는 단계를 포함하는, 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 특정한 실시형태에서, 본 발명은 면역 세포를 제공하는 단계, 및 각각 상이한 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는, CAR의 집단을 구성하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포 내에 도입시키는 단계를 포함하는, 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것이다. CAR의 집단은, 각각 상이한 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는, 적어도 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 CAR을 의미한다. 본 발명에 따른 상이한 세포외 리간드-결합 도메인은 예를 들어, 표적 내의 상이한 요소에 동시에 결합함으로써 면역 세포 활성화 및 기능을 증대시킬 수 있다. 본 발명은 또한 각각 상이한 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는, CAR의 집단을 포함하는 단리된 면역 세포에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발 명세서에는 본 명세서에 기재된 CAR 및 폴리펩타이드 중 임의의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 폴리뉴클레오타이드는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 제조 및 발현될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 본 발명의 세포 중 임의의 것을 포함하는 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)에 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 CAR 중 임의의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 하기 서열번호 245 및 서열번호 246에 제시된 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다:
P3E10 중쇄 가변 영역
Figure pct00022
P3E10 경쇄 가변 영역
Figure pct00023
.
추가의 다른 실시형태에서, 조성물은 하기 서열번호 247 및 서열번호 248에 제시된 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다.
P3A1 중쇄 가변 영역
Figure pct00024
P3A1 경쇄 가변 영역
Figure pct00025
.
추가의 다른 실시형태에서, 조성물은 하기 서열번호 249 및 서열번호 250에 제시된 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다:
P9B5 중쇄 가변 영역
Figure pct00026
P9B5 경쇄 가변 영역
Figure pct00027
추가의 다른 실시형태에서, 조성물은 하기 서열번호 251 및 서열번호 252에 제시된 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다:
P4C7 중쇄 가변 영역
Figure pct00028
P4C7 경쇄 가변 영역
Figure pct00029
.
발현 벡터, 및 폴리뉴클레오타이드 조성물의 투여가 추가로 본 명세서에 기술된다.
또 다른 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 것을 제조하는 방법이 제공된다.
임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포괄된다. 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥(암호 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 DNA 분자에 1-대-1 방식으로 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가의 암호 또는 비-암호 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수 있지만, 그러할 필요는 없고, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있지만 그러할 필요는 없다.
폴리뉴클레오타이드는 네이티브 서열(즉, 항체 또는 이의 부분을 암호화하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 면역반응성이 네이티브 면역반응성 분자에 비해서, 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 암호화된 폴리펩타이드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 바람직하게는 네이티브 항체 또는 이의 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해서, 적어도 약 70% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 심지어는 적어도 약 90% 동일성 또는 약 95% 동일성을 나타낸다.
2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은, 2개의 서열 내의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 서열이 하기에 기재된 바와 같이 최대한 상응하게 정렬되었을 때 동일한 경우에 "동일"하다고 언급된다. 전형적으로, 2개의 서열 사이의 비교는 비교 윈도우에 걸쳐 서열을 비교하고, 서열 유사성의 국지적 영역을 확인 및 비교함으로써 수행된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "비교 윈도우"는 적어도 약 20개의 인접 위치, 통상적으로는 30개 내지 약 75개, 또는 40개 내지 약 50개의 인접 위치의 분절을 지칭하고, 여기서 서열은 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교될 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 디폴트 파라미터를 사용하여, 생물정보학 소프트웨어(디엔에이스타사(DNASTAR, Inc.), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 레이저진(Lasergene) 스위트 내의 메갈라인(Megalign) 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 프로그램은 문헌[Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730]에 기재된 여러 정렬식을 구현한다.
일반적으로, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 부분은 2개 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하, 통상적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 둘 다의 서열에 존재하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 참조 서열 내의 위치의 총 수(즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
변이체는 또한 또는 대안적으로, 네이티브 유전자, 또는 이의 일부 또는 보체에 실질적으로 상동성일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 변이체는 네이티브 항체를 암호화하는 자연 발생 DNA 서열(또는 상보적 서열)에 중간 정도의 엄격한 조건 하에 혼성화될 수 있다.
적합한 "중간 정도의 엄격한 조건"은 5×SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액 중에서 사전 세척하고; 50℃ 내지 65℃, 5×SSC에서 밤새 혼성화시키고; 그 다음 0.1% SDS를 함유하는 2×, 0.5× 및 0.2×SSC 각각으로 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "고도로 엄격한 조건" 또는 "고 엄격성 조건"은 (1) 세척 동안 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어, 0.015M 염화나트륨/0.0015M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 설페이트를 50℃에서 사용하거나, (2) 혼성화 동안 변성제, 예컨대, 폼아마이드, 예를 들어, 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리바이닐피롤리돈/50mM 인산나트륨 완충제를 함유하는 50%(v/v) 폼아마이드(pH 6.5)를 750mM 염화나트륨, 75mM 시트르산나트륨과 함께 42℃에서 사용하거나, 또는 (3) 42℃에서 0.2×SSC(염화나트륨/시트르산나트륨) 중에서 세척하면서 50% 폼아마이드, 5×SSC(0.75M NaCl, 0.075M 시트르산나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5×덴하르트 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA(50㎍/㎖), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 42℃에서, 및 50% 폼아마이드를 55℃에서 사용하고, 그 다음 55℃에서 0.1×SSC 함유 EDTA로 이루어진 고-엄격성 세척을 사용하는 것이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 수용하기 위해 필요한 바와 같은, 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 인식할 것이다.
유전자 암호의 축중성의 결과로서 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 많은 뉴클레오타이드 서열이 존재한다는 것이 관련 기술분야의 당업자에게 인지될 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드 중 일부는 임의의 네이티브 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 최소 상동성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용도에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에서 구체적으로 고려된다. 추가로, 본 명세서에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자가 본 발명의 범주 내에 포함된다. 대립유전자는 뉴클레오타이드의 하나 이상의 돌연변이, 예컨대, 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있지만, 그럴 필요는 없다. 대립유전자는 표준 기술(예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 식별될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 획득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본 명세서에 상세하게 기재될 필요가 없다. 관련 기술분야의 당업자는 본 명세서에 제공되는 서열 및 상업적 DNA 합성기를 사용하여 목적하는 DNA 서열을 생산할 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 경우에, 본 명세서에 추가로 논의된 바와 같이, 목적하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적합한 벡터 내로 삽입시킬 수 있고, 이어서 벡터를 복제 및 증폭에 적합한 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해서 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 직접 흡수, 세포내이입, 형질감염, F-정합 또는 전기천공에 의해서 외인성 폴리뉴클레오타이드를 도입시킴으로써 세포가 형질전환된다. 일단 도입되면, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 세포 내에서 비-통합 벡터(예컨대, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포 게놈 내에 통합될 수 있다. 이와 같이 증폭된 폴리뉴클레오타이드는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989] 참고).
대안적으로, PCR은 DNA 서열의 재생산을 가능하게 한다. PCR 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,800,159호, 제4,754,065호 및 제4,683,202호뿐만 아니라 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.
RNA는 적절한 벡터 내의 단리된 DNA를 사용하여, 이를 적합한 숙주 세포 내에 삽입시킴으로써 획득할 수 있다. 세포가 복제되고, DNA가 RNA로 전사되면, 예를 들어, 상기 문헌[Sambrook et al., 1989]에 제시된 바와 같이 관련 기술분야의 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 RNA를 단리시킬 수 있다.
적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 작제될 수 있거나, 또는 관련 기술분야에서 입수 가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자기-복제 능력을 가질 것이고/것이거나 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는 데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어, pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript)(예를 들어, pBS SK+) 및 이의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예컨대, pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 다수의 기타 클로닝 벡터는 상업적 판매원, 예컨대, 바이오래드사(BioRad), 스트라테진사(Strategene) 및 인비트로젠사(Invitrogen)로부터 입수 가능하다.
발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 복제 가능한 폴리뉴클레오타이드 작제물이다. 이것은 발현 벡터가 숙주 세포 내에서 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제 가능해야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드, 및 PCT 공개 제WO 87/04462호에 개시된 발현 벡터(들)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다: 신호 서열; 복제 기점; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서 및 종결인자). 발현(즉, 번역)을 위해서, 또한 통상적으로 하나 이상의 번역 제어 요소, 예컨대, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈이 필요하다.
관심대상 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 기타 물질을 사용한 형질주입; 미세발사체 충격(microprojectile bombardment); 리포펙션; 및 감염(예를 들어, 벡터가 감염원, 예컨대, 백시니아 바이러스인 경우)을 비롯한 다수의 적절한 수단 중 임의의 것에 의해서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 좌우될 것이다.
본 명세서에 개시된 FLT3 특이적 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 카세트 또는 발현 벡터(예를 들어, 박테리아 숙주 세포 내로의 도입을 위한 플라스미드, 또는 곤충 숙주 세포의 형질주입을 위한 바이러스 벡터, 예컨대, 바큘로바이러스 벡터, 또는 포유동물 숙주 세포의 형질주입을 위한 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스) 내에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 리보솜 스킵 서열을 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어, 비제한적으로 2A 펩타이드 등을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 피코나바이러스(picornavirus)의 아프토바이러스(Aphthovirus) 하위군에서 식별된 2A 펩타이드는 코돈에 의해서 암호화된 2개의 아미노산 사이의 펩타이드 결합의 형성 없이 하나의 코돈에서부터 다음으로의 리보솜 "스킵"을 유발한다(문헌[Donnelly and Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008] 참고). "코돈"은, 리보솜에 의해서 하나의 아미노산 잔기로 번역되는 mRNA 상의(또는 DNA 분자의 센스 가닥 상의) 3개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 따라서, 2개의 폴리펩타이드는 폴리펩타이드가 인-프레임으로 존재하는 2A 올리고펩타이드 서열에 의해서 분리된 경우 mRNA 내의 단일, 인접 오픈 리딩 프레임으로부터 합성될 수 있다. 이러한 리보솜 스킵 기전은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 단일 메신저 RNA에 의해 암호화된 몇몇 단백질의 발현을 위해서 몇몇 벡터에 의해서 사용된다는 것이 공지되어 있다.
막관통 폴리펩타이드를 숙주 세포의 분비 경로에 안내하기 위해서, 일부 실시형태에서, 분비 신호 서열(리더 서열, 프리프로(prepro) 서열 또는 프리 서열이라고도 공지됨)이 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 벡터 서열 내에 제공된다. 분비 신호 서열은 막관통 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되고, 즉, 2개의 서열은 정확한 리딩 프레임 내에서 연결되고, 새로 합성된 폴리펩타이드를 숙주 세포의 분비 경로로 안내하도록 배치된다. 분비 신호 서열은 통상적으로 관심대상 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 대해 5'에 배치되지만, 특정 분비 신호 서열은 관심대상 핵산 서열의 다른 곳에 배치될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,037,743호(Welch 등); 미국 특허 제5,143,830호(Holland 등) 참고). 일부 실시형태에서 신호 펩타이드는 서열번호 204 또는 215에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 관련 기술분야의 당업자는, 유전자 암호의 축중성을 고려하여, 이들 폴리뉴클레오타이드 분자 사이에서 상당한 서열 변경이 가능하다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 발현을 위해서, 바람직하게는 영장류(예를 들어, 인간 또는 원숭이) 세포에서의 발현을 위해서 코돈-최적화된다. 코돈-최적화는 주어진 종의 고도로 발현된 유전자에서 일반적으로 드문 코돈의 관심대상 서열에서의, 이러한 종의 고도로 발현된 유전자에서 일반적으로 흔한 코돈에 의한 교환을 지칭하며, 이러한 코돈은 교환될 코돈으로서의 아미노산을 암호화한다.
면역 세포의 조작 방법
면역요법에서 사용하기 위한 면역 세포의 제조 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 발명에 따른 CAR을 면역 세포 내로 도입시키는 단계, 및 세포를 확장시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 세포를 제공하는 단계 및 세포의 표면에서 상기에 기재된 바와 같은 적어도 1종의 CAR을 발현시키는 단계를 포함하는, 면역 세포를 조작하는 방법에 관한 것이다. 면역 세포를 조작하는 방법은, 예를 들어, PCT 특허 출원 공개 제WO/2014/039523호, 제WO/2014/184741호, 제WO/2014/191128호, 제WO/2014/184744호, 및 제WO/2014/184143호에 기재되어 있고, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, 방법은 상기에 기재된 바와 같은 CAR을 암호화하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오타이드를 세포에 형질주입시키는 단계, 및 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계를 포함한다.
세포를 조작하기 전에, 세포의 공급원은 다양한 비제한적인 방법을 통해서 대상체로부터 획득될 수 있다. 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 비롯한, 다수의 비제한적인 공급원으로부터 획득될 수 있다. 일부 실시형태에서, 관련 기술분야의 당업자가 입수 가능하고 그에게 공지된 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 건강한 공여자로부터, 질환 또는 장애를 앓고 있는 공여자, 예를 들어, 암으로 진단된 개체로부터, 또는 감염으로 진단된 개체로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 상이한 표현형 특징을 제시하는 혼합된 세포의 집단의 일부일 수 있다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 세포 내에서의 안정적인 발현을 위해서 렌티바이러스 벡터에 존재한다.
일부 실시형태에서, 방법은 예를 들어, 비제한적으로 TCR의 성분, 면역억제제에 대한 표적, HLA 유전자, 및/또는 면역 관문 단백질, 예를 들어, PDCD1 또는 CTLA-4 등을 발현하는 적어도 1종의 유전자를 파괴 또는 불활성화시킴으로써 세포를 유전자적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 유전자를 붕괴 또는 불활성화시키는 것은, 관심대상 유전자가 기능성 단백질 형태로 발현되지 않는다는 것을 의도한다. 일부 실시형태에서, 붕괴 또는 불활성화될 유전자는, 예를 들어, 비제한적으로, TCRα, TCRβ, CD52, 글루코코티코이드 수용체(GR), 데옥시사이티딘 카이나제(DCK), PD-1 및 CTLA-4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서 방법은 선택적인 DNA 절단에 의해서 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포 내로 도입시킴으로써 1종 이상의 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서 희귀-절단 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALE-뉴클레아제) 또는 Cas9 엔도뉴클레아제일 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적화된 유전자를 불활성화시키는 능력을 증진시키기 위해서 희귀-절단 엔도뉴클레아제와 함께 추가의 촉매 도메인이 사용된다. 예를 들어, 추가의 촉매 도메인은 DNA 단부-가공 효소일 수 있다. DNA 단부-가공 효소의 비제한적 예는 5-3' 엑소뉴클레아제, 3-5' 엑소뉴클레아제, 5-3' 알칼리성 엑소뉴클레아제, 5' 플랩 엔도뉴클레아제, 헬리카제, 호스파타제, 하이드롤라제 및 주형-비의존성 DNA 중합효소를 포함한다. 이러한 촉매 도메인의 비제한적 예는 hExoI(EXO1_인간), 효모 ExoI(EXO1_YEAST), 이. 콜라이 ExoI, 인간 TREX2, 마우스 TREX1, 인간 TREX1, 소 TREX1, 레트 TREX1, TdT(말단 데옥시뉴클레오타이딜 트랜스퍼라제) 인간 DNA2, 효모 DNA2(DNA2_YEAST)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 도메인 또는 단백질 도메인의 촉매 활성 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가의 촉매 도메인은 3'-5'-엑소뉴클레아제 활성을 가질 수 있고, 일부 실시형태에서 상기 추가의 촉매 도메인은 TREX, 예를 들어, TREX2 촉매 도메인(WO2012/058458)이다. 일부 실시형태에서, 상기 촉매 도메인은 단일 쇄 TREX 폴리펩타이드에 의해 암호화된다. 추가의 촉매 도메인은 뉴클레아제 융합 단백질 또는 키메라 단백질에 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가의 촉매 도메인은 예를 들어, 펩타이드 링커를 사용하여 융합된다.
일부 실시형태에서, 방법은 적어도 표적 핵산 서열의 일부에 대해 상동성인 서열을 포함하는 외인성 핵산을 세포 내에 도입시켜, 표적 핵산 서열과 외인성 핵산 사이에 상동 재조합이 일어나도록 하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 외인성 핵산은 각각 표적 핵산 서열의 영역 5' 및 3'에 상동성인 제1 부분 및 제2 부분을 포함한다. 외인성 핵산은 또한 표적 핵산 서열의 영역 5' 및 3'와 상동성을 포함하지 않는, 제1 부분 및 제2 부분 사이에 배치된 제3 부분을 포함할 수 있다. 표적 핵산 서열의 절단 후, 표적 핵산 서열과 외인성 핵산 사이에 상동 재조합 사례가 자극된다. 일부 실시형태에서, 적어도 약 50bp, 약 100bp 초과, 또는 약 200bp 초과의 상동 서열이 공여자 매트릭스 내에서 사용될 수 있다. 외인성 핵산은, 예를 들어, 비제한적으로 약 200bp 내지 약 6000bp, 예를 들어, 약 1000bp 내지 약 2000bp일 수 있다. 공유된 핵산 상동성은 파단 부위의 상류 및 하류에 측접하는 영역에 위치되고, 도입될 핵산 서열은 2개의 아암 사이에 위치된다.
일부 실시형태에서, 핵산은 상기 절단의 상류 서열에 상동성인 제1 영역; TCRα, TCRβ, CD52, 글루코코티코이드 수용체(GR), 데옥시사이티딘 키나제(DCK), 및 면역 관문 단백질, 예를 들어, 예정사-1(PD-1) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 유전자를 불활성화시키기 위한 서열; 및 절단의 하류 서열에 상동성인 제2 영역을 연속적으로 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 도입 단계는 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 도입 또는 발현과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 일어날 수 있다. 절단 사례가 일어나는 표적 핵산 서열의 위치에 따라서, 이러한 외인성 핵산은 예를 들어, 외인성 핵산이 유전자의 오픈 리딩 프레임 내에 위치되는 경우에, 유전자를 넉-아웃시키기 위해서 사용될 수 있거나, 또는 새로운 관심대상 서열 또는 유전자를 도입시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 외인성 핵산의 사용에 의한 서열 삽입은 표적화된 기존 유전자를 유전자의 수정 또는 대체(비제한적 예로서 대립유전자 교체)에 의해서 변형하도록, 또는 표적화된 유전자의 발현(비제한적 예로서 프로모터 교체), 표적화된 유전자 수정 또는 대체를 상향- 또는 하향-조절하도록 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, TCRα, TCRβ, CD52, GR, DCK, 및 면역 관문 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자의 불활성화는 특이적 TALE-뉴클레아제에 의해 표적화된 정확한 게놈 위치에서 수행될 수 있고, 여기서 상기 특이적 TALE-뉴클레아제는 절단을 촉매하고, 여기서 외인성 핵산은 적어도 상동 재조합에 의해 통합되는 TCRα, TCRβ, CD52, GR, DCK, 면역 관문 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 표적화된 유전자를 불활성화시키기 위한 상동성 영역 및 서열을 연속적으로 포함한다. 일부 실시형태에서, 특이적 유전자 불활성화를 위해서 몇몇 TALE-뉴클레아제를 각각 사용하고, 1종의 규정된 유전자 및 몇몇 특이적 폴리뉴클레오타이드를 특이적으로 표적화함으로써, 몇몇 유전자를 연속적으로 또는 동시에 불활성화시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 TCRα, TCRβ, CD52, GR, DCK, 및 면역 관문 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가의 유전자의 불활성화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자의 불활성화는 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 세포 게놈의 표적화된 서열에서의 절단을 특이적으로 촉매하도록 적어도 1종의 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포 내로 도입시키는 단계; 및 선택적으로, 절단의 상류 서열에 상동성인 제1 영역, 세포의 게놈에 삽입될 서열, 및 절단의 하류 서열에 상동성인 제2 영역을 연속적으로 포함하는 외인성 핵산을 세포 내로 도입시키는 단계에 의해서 달성될 수 있고; 여기서 도입된 외인성 핵산은 유전자를 불활성화시키고, 적어도 1종의 관심대상 재조합 단백질을 암호화하는 적어도 1종의 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 통합시킨다. 일부 실시형태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 TCRα, TCRβ, CD52, GR, DCK, 및 면역 관문 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 유전자 내에 통합된다.
또 다른 양상에서, 세포를 유전자 변형시키는 단계는 면역억제제에 대한 표적을 발현하는 적어도 1종의 유전자를 불활성화시킴으로써 T 세포를 변형하는 것; 선택적으로 면역억제제의 존재 하에 세포를 확장시키는 것을 포함할 수 있다. 면역억제제는 몇몇 작용 기전 중 하나에 의해서 면역 기능을 억제하는 작용제이다. 면역억제제는 면역 반응의 정도 및/또는 양을 감소시킬 수 있다. 면역억제제의 비제한적 예는 칼시뉴린 저해제, 라파마이신의 표적, 인터류킨-2 α-쇄 차단제, 이노신 모노포스페이트 데히드로게나제의 저해제, 다이하이드로엽산 리덕타제의 저해제, 코티코스테로이드, 및 면역억제 항대사물을 포함한다. 일부 세포독성 면역억제제는 DNA 합성을 저해함으로써 작용한다. 다른 것은 T 세포의 활성화를 통해서 또는 헬퍼 세포의 활성화를 저해함으로써 작용할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 T 세포에서 면역억제제의 표적을 불활성화시킴으로써 T 세포에게 면역요법에 대한 면역억제 내성을 부여하는 것을 가능하게 한다. 비제한적 예로서, 면역억제제에 대한 표적은 면역억제제에 대한 수용체, 예를 들어, 비제한적으로 CD52, 글루코코티코이드 수용체(GR), FKBP 패밀리 유전자 구성원, 및 사이클로필린 패밀리 유전자 구성원일 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법의 유전자 변형은, 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 1종의 표적화된 유전자에서 절단을 특이적으로 촉매하여 표적화된 유전자를 불활성화시키도록, 조작하기 위해 제공된 세포에서 1종의 희귀-절단 엔도뉴 클레아제를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포를 조작하는 방법은 하기 단계 중 적어도 하나를 포함한다: 예컨대, 세포 배양물 또는 혈액 샘플로부터 T 세포를 제공하는 단계; 면역억제제에 대한 표적을 발현하는 T 세포에서 유전자를 선택하는 단계; DNA 절단에 의해서, 예를 들어, 이중-가닥 파괴에 의해서 면역억제제에 대한 표적을 암호화하는 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 T 세포 내로 도입시키는 단계, 및 선택적으로 면역억제제의 존재 하에서, 세포를 확장시키는 단계.
일부 실시형태에서, 방법은 예컨대, 세포 배양물 또는 혈액 샘플로부터 T 세포를 제공하는 단계; T 세포에서 유전자를 선택하는 단계(여기서 유전자는 면역억제제에 대한 표적을 발현함); DNA 절단에 의해서, 예를 들어, 이중-가닥 파괴에 의해서 면역억제제에 대한 표적을 암호화하는 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 T 세포에 형질주입시키고, T 세포 내에서 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 발현시키는 단계; 및 선택적으로 면역억제제의 존재 하에서, 세포를 확장시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 CD52 또는 GR을 특이적으로 표적화한다. 일부 실시형태에서, 불활성화를 위해 선택된 유전자는 CD52를 암호화하고, 면역억제 치료는 CD52 항원을 표적화하는 인간화 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 불활성화를 위해 선택된 유전자는 GR을 암호화하고, 면역억제 치료는 코티코스테로이드, 예컨대, 덱사메타손을 포함한다. 일부 실시형태에서, 불활성화를 위해 선택된 유전자는 FKBP 패밀리 유전자 구성원 또는 이의 변이체이고, 면역억제 치료는 타크롤리무스 또는 푸지마이신이라고도 공지되어 있는 FK506을 포함한다. 일부 실시형태에서, FKBP 패밀리 유전자 구성원은 FKBP12 또는 이의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 불활성화를 위해 선택된 유전자는 사이클로필린 패밀리 유전자 구성원 또는 이의 변이체이고, 면역억제 치료는 사이클로스포린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 TALE- 뉴클레아제(TALEN)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다.
또한, 본 명세서에는 면역요법에 적합한, T 세포를 조작하는 방법이 제공되며, 여기서 이 방법은 적어도 면역 관문 단백질을 불활성화시킴으로써 T 세포를 유전자 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서 면역 관문 단백질은 예를 들어, PD-1 및/또는 CTLA-4이다. 일부 실시형태에서, 세포를 유전자 변형시키는 방법은 적어도 1종의 면역 관문 단백질을 불활성화시킴으로써 T 세포를 변형시키는 단계; 및 세포를 확장시키는 단계를 포함한다. 면역 관문 단백질은 예정사 1(PD-1, PDCD1 또는 CD279라고도 공지됨, 수탁번호: NM―005018), 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4, CD152라고도 공지됨, 젠뱅크 수탁번호 AF414120.1), LAG3(CD223이라고도 공지됨, 수탁번호: NM―002286.5), Tim3(HAVCR2이라고도 공지됨, 젠뱅크 수탁번호: JX049979.1), BTLA(CD272라고도 공지됨, 수탁번호: NM―181780.3), BY55(CD160이라고도 공지됨, 젠뱅크 수탁번호: CR541888.1), TIGIT(VSTM3이라고도 공지됨, 수탁번호: NM―173799), B7H5(C10orf54라고도 공지됨, 마우스 vista 유전자의 동족체, 수탁번호: NM―022153.1), LAIR1(CD305라고도 공지됨, 젠뱅크 수탁번호: CR542051.1), SIGLEC10(젠뱅크 수탁번호: AY358337.1), 2B4(CD244라고도 공지됨, 수탁번호: NM―001166664.1)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 이들은 면역 세포를 직접적으로 저해한다. 예를 들어, CTLA-4는 특정 CD4 및 CD8 T 세포 상에서 발현되는 세포-표면 단백질이고; 항원 제시 세포 상에서 이의 리간드(B7-1 및 B7-2)와 결속되었을 때, T 세포 활성화 및 효과기 기능이 저해된다.
일부 실시형태에서, 세포를 조작하는 상기 방법은 하기 단계 중 적어도 하나를 포함한다: 예컨대, 세포 배양물 또는 혈액 샘플로부터 T 세포를 제공하는 단계; DNA 절단에 의해서, 예를 들어, 이중-가닥 파괴에 의해서 면역 관문 단백질을 암호화하는 1종의 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 T 세포 내로 도입시키는 단계; 및 세포를 확장시키는 단계. 일부 실시형태에서, 방법은 예컨대, 세포 배양물 또는 혈액 샘플로부터 T 세포를 제공하는 단계; DNA 절단에 의해서, 바람직하게는 이중-가닥 파괴에 의해 면역 관문 단백질을 암호화하는 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 상기 T 세포에 형질주입시키는 단계; T 세포 내에서 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 발현시키는 단계; 세포를 확장시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 PD-1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCRα 및 TCRβ로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자를 특이적으로 표적화한다. 일부 실시형태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 TALE-뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 동종 면역요법에 특히 적합할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 세포는 T 세포에서 T 세포 수용체 (TCR)의 성분을 암호화하는 적어도 1종의 유전자를 불활성화시키는 단계; 및 T 세포를 확장시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법의 유전자 변형은, 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 1종의 표적화된 유전자에서 절단을 특이적으로 촉매하여 표적화된 유전자를 불활성화시키도록, 조작하기 위해 제공된 세포에서 1종의 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 발현시키는 단계를 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포를 조작하는 방법은 하기 단계 중 적어도 하나를 포함한다: 예컨대, 세포 배양물 또는 혈액 샘플로부터 T 세포를 제공하는 단계; DNA 절단에 의해서, 예를 들어, 이중-가닥 파괴에 의해서 T 세포 수용체(TCR)의 성분을 암호화하는 적어도 1종의 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 T 세포 내로 도입시키는 단계, 및 세포를 확장시키는 단계.
일부 실시형태에서, 방법은 예컨대, 세포 배양물 또는 혈액 샘플로부터 T 세포를 제공하는 단계; DNA 절단에 의해서, 예를 들어, 이중-가닥 파괴에 의해서 T 세포 수용체(TCR)의 성분을 암호화하는 적어도 1종의 유전자를 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 상기 T 세포에 형질주입시키는 단계; T 세포 내에서 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 발현시키는 단계; 세포 표면 상에서 TCR을 발현하지 않는 형질전환된 T 세포를 분류하는 단계; 및 세포를 확장시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 TALE-뉴클레아제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다. 일부 실시형태에서, TALE-뉴클레아제는 TCRα 또는 TCRβ를 암호화하는 서열을 인식하여 절단한다. 일부 실시형태에서, TALE-뉴클레아제는 서열번호 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 또는 226에 제시된 아미노산 서열로부터 선택된 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
TALE-뉴클레아제 폴리펩타이드 서열:
반복부 TRAC_T01-L
Figure pct00030
반복부 TRAC_T01-R
Figure pct00031
반복부 TRBC_T01-L
Figure pct00032
반복부 TRBC_T01-R
Figure pct00033
반복부 TRBC_T02-L
Figure pct00034
반복부 TRBC_T02-R
Figure pct00035
반복부 CD52_T02-L
Figure pct00036
반복부 CD52_T02-R
Figure pct00037
또 다른 양상에서, 세포를 유전자 변형시키는 하나의 또 다른 단계는 T 세포 내로 pTα(또한 프리TCRα라고도 공지됨) 또는 이의 기능성 변이체를 도입시키는 단계 및 선택적으로 CD3 복합체의 자극을 통해서 세포를 확장시키는 단계를 포함하는 TCRα 결핍 T 세포를 확장시키는 방법일 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 a) 적어도 pTα의 단편을 암호화하는 핵산을 세포에 형질주입시켜 CD3 표면 발현을 지지하는 단계; b) 세포 내에서 상기 pTα를 발현시키는 단계; 및 c) 선택적으로 CD3 복합체의 자극을 통해 세포를 확장시키는 단계를 포함한다.
또한, T 세포의 확장을 위한 방법의 단계를 포함하는, 면역요법을 위한 T 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, pTα 폴리뉴클레오타이드 서열은 무작위로 또는 상동 재조합에 의해서 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 삽입은 TCRα 유전자의 불활성화와 연관될 수 있다.
pTα의 상이한 기능성 변이체가 사용될 수 있다. 펩타이드의 "기능성 변이체"는 전체 펩타이드 또는 이의 단편과 실질적으로 유사한 분자를 지칭한다. pTα 또는 이의 기능성 변이체의 "단편"은 분자의 임의의 하위세트, 즉, 전장 pTα보다 더 짧은 펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, pTα 또는 기능성 변이체는, 예를 들어, 전장 pTα 또는 C-말단 절두된 pTα 버전일 수 있다. C-말단 절두된 pTα는 C-말단 단부에서 하나 이상의 잔기가 결여된다. 비제한적 예로서, C-말단 절두된 pTα 버전은 단백질의 C-말단으로부터 18, 48, 62, 78, 92, 110 또는 114개의 잔기가 결여된다. 펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 펩타이드를 암호화하는 DNA에서의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 이러한 기능성 변이체는, 예를 들어, 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 또는 잔기의 삽입 또는 치환을 포함한다. 최종 작제물에 도달하기 위해서 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 또한 행해질 수 있되, 단 최종 작제물은 목적하는 활성도, 특히 기능성 CD3 복합체의 복원을 가져야 한다. 예시적인 실시형태에서, 이량체화에 영향을 미치도록 적어도 1종의 돌연변이가 상기에 기재된 바와 같은 상이한 pTα 버전에 도입된다. 비제한적 예로서, 돌연변이된 잔기는 인간 pTα 단백질의 적어도 W46R, D22A, K24A, R102A 또는 R117A, 또는 pTα 패밀리 또는 상동체 구성원에 대한 CLUSTALW 방법을 사용한 정렬된 위치일 수 있다. 예를 들어, 상기에 기재된 바와 같은 pTα 또는 이의 변이체는 돌연변이된 잔기 W46R 또는 돌연변이된 잔기 D22A, K24A, R102A 및 R117A를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 pTα 또는 변이체는 또한 신호-전달 도메인, 예컨대, 비제한적인 예로서 CD28, OX40, ICOS, CD27, CD137(4-1BB) 및 CD8에 융합된다. 상기 기재된 바와 같은 pTα 또는 변이체의 세포외 도메인은 TCRα 단백질의 단편, 특히, TCRα의 막관통 및 세포내 도메인에 융합될 수 있다. pTα 변이체는 또한 TCRα의 세포내 도메인에 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, pTα 버전은 세포외 리간드-결합 도메인에 융합될 수 있다. 일부 실시형태에서, pTα 또는 이의 기능성 변이체는 가요성 링커에 의해 연결된 표적 항원 특이적 단클론성 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 단편을 포함하는 단일 쇄 항체 단편(scFv)에 융합된다.
용어 "TCRα 결핍 T 세포"는 기능성 TCRα 쇄의 발현이 결여된 단리된 T 세포를 지칭한다. 이는 상이한 수단에 의해서, 비제한적 예로서, T 세포가 세포 표면 상에서 어떠한 기능성 TCRα도 발현하지 않도록 그를 조작함으로써 또는 T 세포가 표면 상에 기능성 TCRα 쇄를 거의 생산하지 않도록 그를 조작함으로써 또는 TCRα 쇄의 돌연변이되거나 절두된 형태를 발현하도록 T 세포를 조작함으로써 달성될 수 있다. TCRα 결핍 세포는 CD3 복합체를 통해 더 이상 확장될 수 없다. 따라서, 이러한 문제를 극복하고, TCRα 결핍 세포의 증식을 가능하게 하기 위해서, pTα 또는 이의 기능성 변이체를 세포 내로 도입시켜, 기능성 CD3 복합체를 회복시킨다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 T 세포 수용체(TCR)의 1종의 성분을 암호화하는 1종의 유전자를 DNA 절단에 의해 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 상기 T 세포 내에 도입시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 전기천공에 의해 직접 세포 내로 도입된 mRNA일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 내로의 물질의 전달을 위해서 살아있는 세포를 일시적으로 투과시키기 위해서 사이토펄스(cytoPulse) 기술이 사용될 수 있다. 파라미터는 최소 사망률을 갖는 높은 형질주입 효율을 위한 조건을 결정하기 위해 변형될 수 있다.
또한, T 세포를 형질주입시키는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 T 세포를 RNA와 접촉시키는 단계, 및 T 세포에 (a) 센티미터당 약 2250 내지 3000V의 전압 범위를 사용한 전기 펄스; (b) 0.1㎳의 펄스 폭; (c) 단계 (a) 및 (b)의 전기 펄스 사이에 약 0.2 내지 10㎳의 펄스 간격; (d) 약 100㎳의 펄스 폭을 갖는 약 2250 내지 3000V의 전압 범위를 사용한 전기 펄스 및 단계 (b)의 전기 펄스와 단계 (c)의 제1 전기 펄스 사이에 약 100㎳의 펄스 간격; 및 (e) 약 0.2㎳의 펄스 폭을 갖는 약 325V의 전압을 사용한 4회의 전기 펄스 및 각각 4회의 전기 펄스 사이에 2㎳의 펄스 간격으로 이루어진 신속한 펄스 순서를 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, T 세포를 형질주입시키는 방법은 상기 T 세포를 RNA와 접촉시키는 단계, 및 T 세포에 (a) 센티미터당 약 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 또는 3000V의 전압을 사용한 전기 펄스; (b) 0.1㎳의 펄스 폭; (c) 단계 (a) 및 (b)의 전기 펄스 사이에 약 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10㎳의 펄스 간격; (d) 100㎳의 펄스 폭을 갖는 약 2250, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 또는 3000V의 전압 범위를 사용한 전기 펄스 및 단계 (b)의 전기 펄스와 단계 (c)의 제1 전기 펄스 사이에 100㎳의 펄스 간격; 및 (e) 약 0.2㎳의 펄스 폭을 갖는 약 325V의 전압을 사용한 4회의 전기 펄스 및 각각 4회의 전기 펄스 사이에 약 2㎳의 펄스 간격으로 이루어진 신속한 펄스 순서를 적용하는 것을 포함한다. 상기 기재된 값 범위에 포함되는 임의의 값이 본 출원에 개시된다. 전기천공 매질은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 매질일 수 있다. 일부 실시형태에서, 전기천공 매질은 약 0.01 내지 약 1.0 밀리지멘스에 걸친 범위의 전도도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 비제한적인 예로서, RNA는 희귀-절단 엔도뉴클레아제, 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 하나의 단량체, 예컨대, 절반-TALE-뉴클레아제, CAR, 다중-쇄 키메라 항원 수용체의 적어도 하나의 성분, pTα 또는 이의 기능성 변이체, 외인성 핵산 및/또는 하나의 추가 촉매 도메인을 암호화한다.
조작된 면역 세포
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 CAR 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 것을 포함하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, CAR은 플라스미드 벡터를 통해 트랜스젠으로서 면역 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 플라스미드 벡터는 또한 예를 들어, 벡터를 수용한 세포의 식별 및/또는 선택을 제공하는 선택 마커를 함유할 수 있다.
CAR 폴리펩타이드는 세포 내에 CAR 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 도입시킨 후 세포에서 동일계에서 합성될 수 있다. 대안적으로, CAR 폴리펩타이드는 세포의 외부에서 생산되고, 이어서 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 작제물을 세포 내로 도입시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 작제물을 세포의 게놈 내로 통합시키기 위해서 안정적인 형질전환 방법이 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 작제물을 일시적으로 발현시키고 폴리뉴클레오타이드 작제물이 세포의 게놈 내로 통합되지 않도록 하기 위해서 일시적 형질전환 방법이 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 바이러스-매개 방법이 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 적합한 수단, 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스), 리포솜 등에 의해서 세포 내로 도입될 수 있다. 일시적 형질전환 방법은 예를 들어, 비제한적으로 미세주사, 전기천공 또는 입자 충격을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 벡터, 예를 들어, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터 등 내에 포함될 수 있다.
본 명세서에는 또한 본 명세서에 제공된 상기에 기술된 세포 조작 방법에 의해서 획득된 단리된 세포 및 세포주가 제공된다. 일부 실시형태에서, 단리된 세포는 상기에 기술된 바와 같은 적어도 1종의 CAR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 세포는 CAR의 집단을 포함하는데, 각각의 CAR은 상이한 세포외 리간드-결합 도메인을 포함한다.
본 명세서에는 또한 상기에 기술된 방법 중 임의의 하나에 따라서 획득된 단리된 면역 세포가 제공된다. 이종 DNA를 발현할 수 있는 임의의 면역 세포가 관심대상 CAR을 발현시킬 목적으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CAR 중 임의의 하나를 발현시키는 데 사용되는 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, CAR을 발현시키는 데 사용되는 면역 세포는, 예를 들어, 비제한적으로 줄기세포로부터 유래될 수 있다. 줄기세포는 성체 줄기세포, 비-인간 배아 줄기세포, 보다 특별하게는 비-인간 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 간세포, 골수 줄기세포, 유도된 만능 줄기세포, 전능 줄기세포 또는 조혈 줄기세포일 수 있다. 대표적인 인간 줄기세포는 CD34+ 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포 표면 막에서 본 발명의 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포는 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%를 초과하는 줄기세포 기억 및 중심 기억 세포의 백분율을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 막에서 본 발명의 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포는 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 60%, 또는 약 20% 내지 약 70%의 줄기세포 기억 및 중심 기억 세포의 백분율을 포함한다.
일부 실시형태에서, 줄기세포 기억 및 중심 기억 세포의 백분율은 실시예 2d에 개시된 바와 같이 측정된다.
본 명세서에 기재된 CAR 중 임의의 하나를 발현시키는 데 사용되는 면역 세포는 또한 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만 세포, NK-세포, B-세포, 또는 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T-림프구 또는 헬퍼 T-림프구로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 CD4+ T-림프구 및 CD8+ T-림프구로 이루어진 군으로부터 유래될 수 있다.
일 실시형태에서, 면역 세포는 본 명세서에 기재된 CAR 중 임의의 하나를 발현하는 염증성 T-림프구이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 본 명세서에 기재된 CAR 중 임의의 하나를 발현하는 세포독성 T-림프구이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 본 명세서에 기재된 CAR 중 임의의 하나를 발현하는 조절 T-림프구이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 본 명세서에 기재된 CAR 중 임의의 하나를 발현하는 헬퍼 T-림프구이다.
또한 본 명세서에는 상기에 기술된 방법 중 임의의 것에 따른 형질전환된 T 세포로부터 획득된 세포주가 제공된다. 또한 본 명세서에는 면역억제 치료에 대해서 내성인 변형된 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 단리된 세포는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 면역 세포는, 예를 들어, 비제한적으로 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 일반적으로 기술된 바와 같은 방법을 사용하여, T 세포의 유전자 변형 이전에 또는 이후에 활성화 및 확장될 수 있다. T 세포는 시험관내에서 또는 생체내에서 확장될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 T 세포는, 예를 들어, T 세포의 표면 상의 CD3 TCR 복합체 및 공자극성 분자를 자극시키는 작용제와 접촉시켜 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성시킴으로써 확장될 수 있다. 예를 들어, 화학물질, 예컨대, 칼슘 이오노포어(ionophore) A23187, 포볼(phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA), 또는 유사분열촉진 렉틴, 예컨대, 파이토헤마글루티닌(PHA)이 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성시키기 위해서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포 집단은 시험관내에서, 예를 들어, 표면 상에 고정된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해서, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 카이나제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해서 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공자극성을 위해서, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극시키기에 적절한 조건 하에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청(예를 들어, 우태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFp, 및 TNF, 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 기타 첨가제를 비롯한, 증식 및 생존에 필요한 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, 엑스-비보(X-vivo) 5(론자사(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 기타 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트(plasmanate), 및 환원제, 예컨대, N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 배지는 무혈청 또는 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 규정된 호르몬 세트, 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된, 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민이 첨가된, RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, 엑스-비보 1, 및 엑스-비보 20, 옵티마이저(Optimizer)를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양물 중에만 포함되고, 대상체 내에 주입될 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하는 데 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기 + 5% CO2) 하에 유지된다. 상이한 자극 횟수에 노출된 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 세포는 조직 또는 세포와의 공배양에 의해 확장될 수 있다. 세포는 또한 생체내에서, 예를 들어, 대상체에게 세포를 투여한 후 대상체의 혈액에서 확장될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 단리된 세포는 CD52, GR, PD-1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, HLA, TCRα 및 TCRβ로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 불활성화된 유전자를 포함하고/포함하거나 CAR, 다중-쇄 CAR 및/또는 pTα 트랜스젠을 발현한다. 일부 실시형태에서, 단리된 세포는 다중-쇄 CAR을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 단리된 세포는 CD52와 GR, CD52와 TCRα, CDR52와 TCRβ, GR과 TCRα, GR과 TCRβ, TCRα와 TCRβ, PD-1과 TCRα, PD-1과 TCRβ, CTLA-4와 TCRα, CTLA-4와 TCRβ, LAG3과 TCRα, LAG3과 TCRβ, Tim3과 TCRα, Tim3과 TCRβ, BTLA와 TCRα, BTLA와 TCRβ, BY55와 TCRα, BY55와 TCRβ, TIGIT와 TCRα, TIGIT와 TCRβ, B7H5와 TCRα, B7H5와 TCRβ, LAIR1과 TCRα, LAIR1과 TCRβ, SIGLEC10과 TCRα, SIGLEC10과 TCRβ, 2B4와 TCRα, 2B4와 TCRβ로 이루어진 군으로부터 선택된 2종의 불활성화된 유전자를 포함하고/포함하거나 CAR, 다중-쇄 CAR 및 pTα 트랜스젠을 발현한다.
일부 실시형태에서, TCR은 TCRα 유전자 및/또는 TCRβ 유전자(들)를 불활성화시킴으로써 본 발명에 따른 세포 내에서 기능적이지 않게 된다. 일부 실시형태에서, 개체로부터 유래된 변형된 세포를 획득하는 방법이 제공되며, 여기서 세포는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 신호전달 경로와 독립적으로 증식할 수 있다. 이러한 방법에 의해서 획득될 민감성인, MHC 신호전달 경로와 독립적으로 증식할 수 있는 변형된 세포가 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 개시된 변형된 세포는 이를 필요로 하는 개체를 숙주대이식편(HvG) 거부 및 이식편대숙주병(GvHD)에 대해서 치료하는 데 사용될 수 있고; 따라서, 본 발명의 범주는 이를 필요로 하는 개체를 숙주대이식편(HvG) 거부 및 이식편대 숙주병(GvHD)에 대해서 치료하는 방법이며, 이 방법은 상기 개체에게 유효량의 불활성화된 TCRα 및/또는 TCRβ 유전자를 포함하는 변형된 세포를 투여함으로써 상기 개체를 치료하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역 세포는 1종 이상의 화학요법 약물에 내성이도록 조작된다. 화학요법 약물은 예를 들어, 퓨린 뉴클레오타이드 유사체(PNA)일 수 있고, 따라서 면역 세포를 입양 면역요법 및 화학요법을 조합한 암 치료에 적합하도록 만들 수 있다. 예시적인 PNA는, 예를 들어, 클로파라빈, 플루다라빈 및 시타라빈을 단독으로 또는 조합하여 포함한다. PNA는 데옥시사이티딘 카이나제(deoxycytidine kinase: dCK)에 의해서 모노-, 다이-, 및 트라이-포스페이트 PNA로 대사된다. 이의 트라이-포스페이트 형태는 ATP와 DNA 합성과 경쟁하고, 아포토시스 촉진제(pro-apoptotic agent)로서 작용하고, 리보 뉴클레오타이드 리덕타제(ribonucleotide reductase: RNR)의 강력한 저해제이며, 트라이뉴클레오타이드 생산과 관련된다. 불활성화된 dCK 유전자를 포함하는 FLT3 특이적 CAR-T 세포가 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, dCK 넉아웃 세포는, 예를 들어, mRNA의 전기천공에 의해서 dCK 유전자에 대해 지향되는 특정 TAL-뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 T 세포를 형질주입시킴으로써 제조된다. dCK 넉아웃 FLT3 특이적 CAR-T 세포는, 예를 들어, 클로로파라빈 및/또는 플루다라빈을 비롯한, PNA에 대해서 내성이고, FLT3-발현 세포에 대한 T 세포 세포독성 활성을 유지한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 단리된 세포 또는 세포주는 pTα 또는 이의 기능성 변이체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 세포 또는 세포주는 TCRα 유전자를 불활성화시킴으로써 추가로 유전자 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR-T 세포는 자살 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, RQR8 등을 포함한다(예를 들어, 전문이 참고로 본 명세서에 포함된 국제 특허 제WO2013153391A호 참고). 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 CAR-T 세포에서, 자살 폴리펩타이드는 CAR-T 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시형태에서, 자살 폴리펩타이드는 서열번호 227에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
Figure pct00038
자살 폴리펩타이드는 또한 아미노 말단에 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 자살 폴리펩타이드는 서열번호 228에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
Figure pct00039
자살 폴리펩타이드가 CAR-T 세포의 표면에서 발현되는 경우, 폴리펩타이드의 리툭시맙 에피토프에 대한 리툭시맙의 결합은 세포의 용해를 유발한다. 세포 표면에서 발현된 폴리펩타이드당 리툭시맙의 1개 초과의 분자가 결합할 수 있다. 폴리펩타이드의 각각의 리툭시맙 에피토프 리툭시맙의 개별 분자에 결합할 수 있다. FLT3 특이적 CAR-T 세포의 결실은 예를 들어, 리툭시맙을 대상체에게 투여함으로써 생체내에서 발생할 수 있다. 전달된 세포를 결실시키기 위한 결정은, 예를 들어, 독성의 허용 가능하지 않은 수준이 검출된 경우와 같이, 전달된 세포에 기인되는, 대상체에서 바람직하지 않은 효과가 검출됨으로써 발생할 수 있다.
일부 실시형태에서, 환자에게 투여 시, 세포 표면에서 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR 중 임의의 하나를 발현하는 조작된 면역 세포는 환자의 내인성 FLT3 발현 세포를 감소, 사멸 또는 용해시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR 중 임의의 하나를 발현하는 조작된 면역 세포에 의한 FLT3을 발현하는 내인성 세포 또는 FLT3을 발현하는 세포주의 세포의 감소 또는 용해 백분율은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 초과이다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 FLT3 특이적 CAR 중 임의의 것을 발현하는 조작된 면역 세포에 의한 FLT3을 발현하는 내인성 세포 또는 FLT3을 발현하는 세포주의 세포의 감소 또는 용해 백분율은 약 5% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 95%, 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 50%, 약 25% 내지 약 75%, 또는 약 25% 내지 약 60%이다. 일 실시형태에서, 내인성 FLT3 발현 세포는 내인성 FLT3을 발현하는 골수 세포이다.
일 실시형태에서, 세포 표면 막에서 본 발명의 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포에 의한, 표적 세포, 예를 들어, FLT3을 발현하는 세포주의 감소 또는 용해 백분율은 실시예 2e에 개시된 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
CAR-양성 면역 세포의 분류 방법
일 양상에서, 면역 세포의 집단의 시험관내 분류 방법이 제공되며, 여기서 면역 세포의 집단의 하위세트는 본 명세서에 기재된 단클론성 항체에 대해서 특이적인 에피토프를 포함하는 FLT3 특이적 CAR 중 임의의 하나를 발현하는 조작된 면역 세포를 포함한다. 방법은 면역 세포의 집단을 에피토프에 대해서 특이적인 단클론성 항체와 접촉시키는 단계 및 단클론성 항체에 결합하는 면역 세포를 선택하여 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포가 풍부한 세포의 집단을 획득하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 에피토프에 대해서 특이적인 상기 단클론성 항체는 형광단에 선택적으로 접합된다. 이러한 실시형태에서, 단클론성 항체에 결합하는 세포를 선택하는 단계는 형광 활성화 세포 분류법(Fluorescence Activated Cell Sorting: FACS)에 의해서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 에피토프에 대해서 특이적인 상기 단클론성 항체는 자성 입자에 선택적으로 접합된다. 이러한 실시형태에서, 단클론성 항체에 결합하는 세포를 선택하는 단계는 자성 활성화 세포 분류법(Magnetic Activated Cell Sorting: MACS)에 의해서 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 262의 mAb-특이적 에피토프를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 262의 mAb-특이적 에피토프를 포함하고, 면역 세포의 집단과 접촉시키는 데 사용되는 항체는 QBEND-10이다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 229의 mAb-특이적 에피토프를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 229의 mAb-특이적 에피토프를 포함하고, 면역 세포의 집단과 접촉시키는 데 사용되는 항체는 리툭시맙이다.
일부 실시형태에서, 상기에 기술된 면역 세포의 시험관내 분류 방법을 사용하는 경우 수득되는 FLT3 CAR-발현 면역 세포의 집단은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 FLT3 CAR-발현 면역 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기에 기술된 CAR-발현 면역 세포의 시험관내 분류 방법을 사용하는 경우 수득되는 FLT3 CAR-발현 면역 세포의 집단은 적어도 85%의 FLT3 CAR-발현 면역 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 시험관내 분류 방법에서 사용되는 mAb는 지지체, 예컨대, 당업자에 의해서 일상적으로 인지되는, 예컨대, 칼럼 또는 비드 상에 이미 결합되어 있다. 일부 실시형태에서, CAR을 발현하는 면역 세포는 T-세포이다.
본 발명에 따라서, 수용자에게 투여될 세포는 공급원 집단으로부터 시험관내에서 풍부해질 수 있다. 공급원 집단을 확장시키는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 관련 기술분야의 당업자에게 공지된 밀도 원심분리, 면역-자성 비드 정제, 친화도 크로마토그래피 및 형광 활성화 세포 분류법의 조합을 사용하여, 항원, 예컨대, 예컨대, CD34 항원을 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
유세포 분석법이 관련 기술분야에서 널리 사용되며, 이것은 세포의 집단 내에서 특정 세포 유형을 분류 및 정량하기 위해서 당업자에게 널리 공지된 방법이다. 일반적으로, 유세포 분석법은 주로 광학 수단에 의해서 세포의 성분 또는 구조적 특징부를 정량하는 방법이다. 상이한 세포 유형은 구조적 특징부를 정량함으로써 구별될 수 있기 때문에, 유세포 분석법 및 세포 분류법을 사용하여 혼합물 중에서 상이한 표현형의 세포를 계수 및 분류할 수 있다.
유세포 분석 분석법은 2가지 기본적인 단계를 포함한다: 1) 선택된 세포 유형을 하나 이상의 표지된 마커로 표지하는 단계, 및 2) 집단 중의 세포의 총 수에 대해서, 표지된 세포의 수를 결정하는 단계.
세포 유형을 표지하는 일차 방법은 표지된 항체를 특정 세포 유형에 의해서 발현되는 마커에 결합시키는 것이다. 이러한 항체는 형광 화합물로 직접적으로 표지되거나 또는 예를 들어, 제1 항체를 인식하는 형광-표지된 제2 항체를 사용하여 간접적으로 표지된다.
일부 실시형태에서, CAR을 발현하는 면역 세포를 분류하는 데 사용되는 방법은 자성-활성화 세포 분류법(MACS)이다.
자성-활성화 세포 분류법(MACS)은, 초상자성 나노입자 및 칼럼을 사용함으로써 표면 항원(CD 분자)에 따라서 다양한 세포 집단을 분리하는 방법이다. 순수한 세포 집단을 얻는데 몇몇 단순한 단계가 존재한다. 단일-세포 현탁액 중의 세포를 마이크로비드로 자성으로 표지한다. 샘플을 강자성 구체로 구성된 칼럼에 적용하는데, 이것은 세포-친화적인 코팅으로 피복되어 세포의 신속하고 온화한 분리를 가능하게 한다. 비표지된 세포는 통과되는 반면, 자성 표지된 세포는 칼럼 내에 유지된다. 통과액을 비표지된 세포 분획으로서 수집할 수 있다. 짧은 세척 단계 이후에, 칼럼을 분리기로부터 제거하고, 자성 표지된 세포를 칼럼으로부터 용리시킨다.
일부 실시형태에서, CAR을 발현하는 면역 세포의 분류 방법에서 사용되는 mAb는 알렘투주맙, 이브리투모맙 튜세탄, 무로모납-CD3, 토시투모맙, 압식시맙, 바실릭시맙, 브렌툭시맙 베도틴, 세툭시맙, 인플릭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 세톨리주맙 페골, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 젬투주맙, 나탈리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 라니비주맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 베돌리주맙, 아달리무맙, 벨리무맙, 카나키누맙, 데노수맙, 골리무맙, 이필리무맙, 오파투무맙, 파니투무맙, QBEND-10 및/또는 우스테키누맙으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 mAb는 리툭시맙이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 mAb는 QBEND-10이다.
치료 응용
FLT3 특이적 CAR을 발현하는, 상기에 기재된 방법에 의해서 획득된 단리된 세포 또는 이러한 단리된 세포로부터 유래된 세포주는 의약으로서 사용될 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 개시된 FLT 3 특이적 항체는 의약으로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 의약은 FLT3-연관된 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, FLT3-연관된 질환 또는 병태는 FLT3을 발현하는 악성 세포, 예를 들어, 암을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 조혈 기원의 암, 예컨대, 림프종 또는 백혈병이다. 일부 실시형태에서, 암은 다발성 골수종, 악성 형질 세포 신생물, 호지킨 림프종, 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종, 칼러병 및 골수종증, 형질 세포 백혈병, 형질세포종, B-세포 전림프구성 백혈병, 모발 세포 백혈병, B-세포 비호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 소포성 림프종, 버킷 림프종, 변연부 림프종, 외투 세포 림프종, 대세포 림프종, 전구 B-림프모구 림프종, 골수성 백혈병, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 림프종, 점막 관련 림프 조직 림프종, 소세포 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 버킷 림프종, 원발성 종격동(흉선) 거대 B-세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종, 림프종양 육아종증, T 세포/조직구-풍부 거대 B-세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 원발성 피부 미만성 거대 B-세포 림프종(다리 유형), 노인의 EBV 양성 미만성 거대 B-세포 림프종, 염증 연관된 미만성 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, ALK-양성 거대 B-세포 림프종, 형질세포성 림프종, HHV8-연관 다중심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종과 버킷 림프종 사이의 중간 특징을 갖는 미분류 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종와 전통적인 호지킨 림프종 사이의 중간 특징으로 갖는 미분류 B-세포 림프종, 또는 기타 조혈 세포 관련 암이다. 예시적인 실시형태에서 암은 AML이다. 예시적인 실시형태에서 암은 ALL이다.
일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 단리된 세포, 또는 단리된 세포로부터 유래된 세포주 또는 항체는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
본 명세서에는 또한 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 발명의 면역 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 발명의 형질전환된 면역 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 본 발명의 항체를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 T 세포는 강력한 생체내 T 세포 확장을 경험할 수 있고, 연장된 시간 동안 지속될 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 개선, 치유 또는 예방적일 수 있다. 본 발명의 방법은 자가유래 면역요법의 일부 또는 동종이계 면역요법 치료의 일부일 수 있다. 본 발명은 동종이계 면역요법에 특히 적합하다. 공여자로부터의 T 세포는 표준 프로토콜을 사용하여 비-동종반응성 세포로 형질전환될 수 있고, 필요한 경우, 재생산되어 한 명 또는 여러 대상체에게 투여될 수 있는 CAR-T 세포를 생산할 수 있다. 이러한 CAR-T 세포 요법은 "오프 더 쉘프(off the shelf)" 치료 제품으로서 입수 가능할 수 있다.
개시된 방법과 함께 사용될 수 있는 세포는 이전 부분에 기재되어 있다. 치료제는, 예를 들어, 암으로 진단된 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 암은, 예를 들어, 비제한적으로, 상기에 열거된 암 중 임의의 것을 비롯한, B 림프구와 관련된 암을 포함한다. 본 발명의 CAR 및 CAR-T 세포로 치료될 암의 유형은 특정 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다. 일부 실시형태에서, 치료는 항체 요법, 화학요법, 사이토카인 요법, 수지상 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저 광 요법 및 방사선 요법의 군으로부터 선택된 암에 대한 1종 이상의 요법과 조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료는 면역억제 치료를 경험한 환자에게 투여될 수 있다. 사실상, 본 발명은 일반적으로 이러한 면역억제제에 대한 수용체를 암호화하는 유전자의 불활성화로 인해서 적어도 1종의 면역억제제에 대해서 내성이 생긴 세포 또는 세포의 집단에 관련된다. 이러한 양상에서, 면역억제 치료는 대상체에서 본 발명에 따른 T 세포의 선택 및 확장을 도와야 한다. 본 발명에 따른 세포 또는 세포의 집단의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식(implantation) 또는 이식술(transplantation)에 의한 것을 비롯한, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 대상체에게 피하로, 피내로, 종양내로, 결절내로, 수질내로, 근육내로, 정맥내 또는 림프내 주사에 의해서, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 세포 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다.
일부 실시형태에서, 세포 또는 세포의 집단의 투여는, 예를 들어, 체중 ㎏당 약 104 내지 약 109개의 세포의 투여를 포함할 수 있고, 상기 범위 내의 세포의 수의 모든 정수 값이 포함된다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 세포의 집단의 투여는, 체중 ㎏당 약 105 내지 106개의 세포의 투여를 포함할 수 있고, 상기 범위 내의 세포의 수의 모든 정수 값이 포함된다. 세포 또는 세포의 집단은 1회 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포의 상기 유효량은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포의 상기 유효량은 시간의 경과에 따라서 1회 초과의 용량으로 투여될 수 있다. 투여 시기는 관리 의사의 판단에 포함되고, 대상체의 임상적 병태에 좌우된다. 세포 또는 세포의 집단은 임의의 공급원, 예컨대, 혈액 은행 또는 공여자로부터 획득될 수 있다. 개별 요구는 다양하지만, 특정 질환 또는 병태에 대해서 부여되는 세포 유형의 유효량의 최적 범위의 결정은 관련 기술분야의 기술 내에 있다. 유효량은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 투여량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 존재한다면, 공동 치료의 유형, 치료의 빈도 및 목적하는 효과의 특성에 좌우될 것이다. 일부 실시형태에서, 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 조성물의 유효량은 비경구로 투여된다. 일부 실시형태에서, 투여는 정맥내 투여일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 종양 내의 주사에 의해 직접적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 세포는 작용제를 사용한 치료, 예컨대, 단클론성 항체 요법, CCR2 길항제(예를 들어, INC-8761), 항바이러스 요법, 시도포비어 및 인터류킨-2, 시타라빈(ARA-C라고도 공지됨) 또는 MS 환자를 위한 나탈리지맙 치료 또는 건선 환자를 위한 에팔리즈티맙 치료 또는 PML 환자를 위한 다른 치료를 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 임의의 수의 관련 치료 양식과 함께(예를 들어, 이전에, 동시에 또는 이후에) 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, FLT3 특이적 CAR-T 세포는 하기 중 1종 이상과 함께 대상체에게 투여된다: 항-PD-1 항체 (예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙 또는 PF-06801591), 항-PD-L1 항체(예를 들어, 아벨루맙, 아테졸리주맙, 또는 두발루맙), 항-OX40 항체(예를 들어, PF-04518600), 항-4-1BB 항체(예를 들어, PF-05082566), 항-MCSF 항체(예를 들어, PD-0360324), 항-GITR 항체, 및/또는 항-TIGIT 항체. 일부 실시형태에서, 서열번호 236에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 FLT3 특이적 CAR은 항-PD-L1 항체 아벨루맙과 함께 대상체에게 투여된다. 추가 실시형태에서, 본 발명의 T 세포는 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506, 항체 또는 다른 면역절제제, 예컨대, CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 기타 항체 요법, 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인 및/또는 방사선조사와 조합하여 사용될 수 있다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린을 저해하거나(사이클로스포린 및 FK506), 또는 성장 인자 유도 신호전달에 중요한 p70S6 카이나제를 저해한다(라파마이신)(Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). 추가 실시형태에서, 본 발명의 T 세포는 수용체 타이로신 카이나제 저해제, 예컨대, 미도스타우린(Midostaurin) 및 수니티닙(Sunitinib), mTOR 저해제, 예컨대, 라파마이신 및 에버롤리무스, 후성적 조절제, 예컨대, 보모스타트(Vormostat), 프로테아좀 저해제, 예컨대, 보테조밉(Bortezomib), 면역조절제, 예컨대, 레날리도마이드, 헤지호그 저해제, 예컨대, 에리스모데깁(Erismodegib) 및 PF-04449913 또는 아이소시트레이트 데하이드로게나제(IDH) 저해제, 예컨대, AG-120 및 AG-221과 조합하여 사용될 수 있다. 추가 실시형태에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 화학치료제, 예컨대, 플루다라빈을 사용한 T 세포 절제 요법, 외부-빔 방사선 요법(XRT), 사이클로포스파마이드 또는 항체, 예컨대, OKT3 또는 CAMPATH와 함께 (예를 들어, 이전에, 동시에 또는 이후에) 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 세포 조성물은 B-세포 절제 요법, 예컨대, CD20과 반응하는 작용제, 예를 들어, 리툭산 이후에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대상체에게 고용량 화학요법에 의한 표준 치료에 이어서 말초 혈액 줄기세포 이식이 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이식 후, 대상체에게 본 발명의 확장된 면역 세포의 주입이 제공된다. 일부 실시형태에서, 확장된 세포는 수술 전에 또는 이후에 투여된다.
일부 실시형태에서, 상기 세포가 투여된 대상체로부터 FLT3 특이적 CAR-발현 조작된 면역 세포를 고갈시키는 방법이 제공된다. 고갈은 저해 또는 제거에 의해서 수행될 수 있다.
일 양상에서, 단클론성 항체에 대해서 특이적인 에피토프를 포함하는 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포를 고갈시키는 방법은 상기 조작된 면역 세포를 에피토프에 대해서 특이적인 단클론성 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단클론성 항체에 대해서 특이적인 에피토프를 포함하는 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포가 투여된 대상체로부터 고갈시키는 방법은 에피토프에 대해서 특이적인 단클론성 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 대상체에게 CAR의 세포외 도메인에 존재하는 에피토프에 대해서 특이적인 단클론성 항체를 투여하는 것은, 대상체로부터 조작된 CAR-발현 면역 세포의 활성도를 제거 또는 저해한다. 일 양상에서, 조작된 CAR을 발현하는 면역 세포의 고갈은 FLT3 발현 세포의 내인성 집단의 회복을 가능하게 한다.
일 양상에서, 본 발명은 세포 표면에서 단클론성 항체에 대해서 특이적인 에피토프를 포함하는 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포가 투여된 대상체에서 내인성 FLT3-발현 세포의 회복을 촉진시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 대상체에게 에피토프에 대해서 특이적인 단클론성 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 FLT3 발현 세포는 내인성 FLT3을 발현하는 골수 세포이다. 일 양상에서, 용어 "회복"은 내인성 FLT3 발현 세포의 수의 증가를 지칭한다. 내인성 FLT3 발현 세포의 수는 내인성 FLT3 발현 세포의 증식의 증가로 인해서 그리고/또는 FLT3 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포에 의한 내인성 FLT3 발현 세포의 제거의 감소로 인해서 증가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단클론성 항체를 대상체에게 투여하는 것은 FLT3 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포를 고갈시키고, 대상체에서, 내인성 FLT3-발현 세포, 예를 들어, 내인성 FLT3-발현 골수 간세포의 수를 증가시킨다. 일 실시형태에서, 단클론성 항체를 대상체에게 투여하는 것은 단클론성 항체의 투여 이전의 내인성 FLT3 발현 세포의 수와 비교할 때, 내인성 FLT3 발현 세포의 수를 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%만큼 증가시킨다.
일 양상에서, 대상체에서 FLT3-매개된 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 대상체에게 세포 표면에서 하나 이상의 단클론성 항체에 대해서 특이적인 하나 이상의 에피토프를 포함하는 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 조작된 면역 세포를 투여하는 단계; 및 (b) 그 다음, 대상체에게 에피토프에 대해서 특이적인 하나 이상의 단클론성 항체를 투여함으로써 대상체로부터 조작된 면역 세포를 고갈시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR-발현 조작된 면역 세포를 고갈시키는 방법에서 사용되는 mAb는 알렘투주맙, 이브리투모맙 튜세탄, 무로모납-CD3, 토시투모맙, 압식시맙, 바실릭시맙, 브렌툭시맙 베도틴, 세툭시맙, 인플릭시맙, 리툭시맙, 베바시주맙, 세톨리주맙 페골, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 젬투주맙, 나탈리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 라니비주맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 베돌리주맙, 아달리무맙, 벨리무맙, 카나키누맙, 데노수맙, 골리무맙, 이필리무맙, 오파투무맙, 파니투무맙, QBEND-10, 우스테키누맙 및 이들의 조합물로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 단클론성 항체에 대해서 특이적인 상기 에피토프(mAb-특이적 에피토프)는 CD20 에피토프 또는 미모토프, 예를 들어, 서열번호 229이고, 에피토프에 대해서 특이적인 mAb는 리툭시맙이다.
일부 실시형태에서, 단클론성 항체를 대상체에게 투여하는 단계는 대상체에게 단클론성 항체를 주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 에피토프-특이적 mAb의 양은 대상체에서 CAR-발현 면역 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 제거하기에 충분하다.
일부 실시형태에서, 단클론성 항체를 대상체에게 투여하는 단계는 대상체에게 375㎎/㎡의 리툭시맙을 주 1회 또는 수 회 주입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, mAb-특이적 에피토프를 포함하는 CAR을 발현하는 면역 세포(CAR-발현 면역 세포)가 에피토프-특이적 mAb를 사용한 CDC 검정에서 고갈된 경우, 살아있는 CAR-발현 면역 세포의 양은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%만큼 감소된다.
일부 실시형태에서, 세포독성 약물은 CAR-발현 면역 세포를 고갈시키는 데 사용되는 에피토프-특이적 mAb에 커플링된다. 단클론성 항체의 표적화 능력과 세포독성 약물의 세포-사멸 능력을 조합함으로써, 항체-약물 접합체(ADC)는 약물 단독의 사용과 비교할 때 건강한 조직과 병든 조직 사이의 민감한 차별을 가능하게 한다. 몇몇 ADC가 시장에서 승인되었고; 특히 링커에 대한 이의 제조 기술은 하기 선행 기술에 빈번하게 제시되어 있다(Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; 미국 특허 제4,975,278호).
일부 실시형태에서, 주입될 에피토프-특이적 mAb는 보체 의존성 세포독성도(CDC)를 촉진시킬 수 있는 분자와 사전에 접합된다. 따라서, 보체계는 유기체로부터 병원균을 제거하는 항체의 능력을 돕거나 보완한다. 몇몇 중 하나의 의해서 자극되는 경우, 세포-사멸 막 공격 복합체의 반응 및 활성화의 대규모 증폭으로서 활성화 캐스케이드가 촉발된다. 상이한 분자, 예컨대, 글리칸을 사용하여 mAb를 접합시킬 수 있다[Courtois, A, Gac-Breton, S., Berthou, C, Guezennec, J., Bordron, A. and Boisset, C. (2012), Complement dependent cytotoxicity activity of therapeutic antibody fragments is acquired by immunogenic glycan coupling, Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458; http://www.ejbiotechnology.info DOI: 10.2225/voll5-issue5).
키트
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 FLT3 특이적 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, FLT3 특이적 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조작된 면역 세포, 또는 FLT 특이적 항체를 포함하는 1개 이상의 용기, 및 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법 중 임의의 것에 따른 사용에 대한 설명서를 포함한다. 일반적으로, 이들 설명서는 상기에 기재된 치료적 치료를 위한 조작된 면역 세포의 투여의 설명을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 면역 세포 또는 항체의 사용에 관한 설명서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다회-용량 패키지) 또는 소단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급되는 설명서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상의 서면 설명서이지만, 기계-판독 가능한 설명서(예를 들어, 자성 또는 광학 저장 디스크 상에 존재하는 설명서)가 또한 허용 가능하다.
본 발명의 키트는 적합한 포장재 내에 존재한다. 적합한 포장재는 바이알, 병, 자(jar), 가요성 포장재(예를 들어, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 또한, 특정 장치, 예컨대, 흡입기, 비강 투여 장치(예를 들어, 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대, 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 포장재가 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 적어도 1종의 활성제는 FLT3 특이적 CAR 또는 FLT3 특이적 항체이다. 용기는 추가로 제2 약제학적 활성제를 포함할 수 있다.
키트는 선택적으로 추가 성분, 예컨대, 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 그와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다.
하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되고, 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다. 실제로, 본 명세서에 제시되고 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 관련 기술분야의 당업자에게 자명할 것이고, 이는 첨부된 청구범위의 범주에 포함된다.
본 발명의 대표적인 물질은 2017년 6월 1일자로, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)(미국 버니지아주 20110-2209 머내서스 10801 유니버시티 블러버드 소재)에 기탁되었다. ATCC 수탁번호 PTA-124228을 갖는 벡터 P3E10-VL은 P3E10 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이고, ATCC 수탁번호 PTA-124227을 갖는 벡터 P3E10-VH는 P3E10 중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이다. 기탁은 특허 절차의 목적에 대한 미생물 기탁의 국제 승인 및 이러한 조약(부다페스트 조약) 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다. 이것은 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 가능한 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 조항 하에 ATCC로부터 입수 가능할 것이고, 이는 화이자사(Pfizer, Inc.)와 ATCC 사이의 협정에 따르며, 이것은 관련 미국 특허의 등록 시에 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개 시에(어느 것이든 더 빠른 시기), 공공에 대한 기탁 배양물의 자손의 영구적이고 비제한적인 이용 가능성을 보장하고, 35 U.S.C. 섹션 122 및 이에 따른 미국 특허청장의 규칙(886 OG 638에 대한 특정한 언급이 있는 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함)에 따라서 미국 특허청장에 의해서 자격이 인정된 것에 대한 자손의 이용 가능성을 보장한다.
본 출원의 양수인은 기탁된 물질의 배양물이 적합한 조건 하에서 배양되는 경우 사멸하거나 또는 손실 또는 파괴되는 경우에, 그 물질을 통지 하에 또 다른 동일한 것으로 신속하게 대체할 것에 동의하였다. 기탁된 물질의 이용 가능성은 특허법에 따른 임의의 정부의 권한 하에 보장된 권리에 반하여 본 발명을 실시하는 것에 대한 허가로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1: 37℃에서 인간 FLT3/ FLT3 항체 상호작용의 동력학 및 친화도의 결정
본 실시예는 37℃에서 다양한 항-FLT3 항체의 동력학 및 친화도를 결정한다. 모든 실험은 바이아코어(Biacore) T200 표면 플라즈몬 공명 바이오센서(GE 라이프사이언시스사(GE Lifesciences), 미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재) 상에서 수행하였다.
10mM HEPES, 150mM NaCl, 0.05%(v/v) Tween-20, pH 7.4의 전개 완충액를 사용하여 25℃에서 센서 칩 제조를 수행하였다. 바이아코어 CM4 센서 칩의 모든 플로우 셀을 400mM EDC와 100mM NHS의 1:1(v/v) 혼합물로 7분 동안, 10㎕/min의 유량에서 활성화시킴으로써 항-인간 Fc 센서 칩을 활성화시켰다. 항-인간 Fc 시약(염소 항-인간 IgG Fc, 서던바이오테크(SouthernBiotech) 카탈로그 #2081-01)을 10mM 아세트산나트륨 pH 4.5 중에서 30㎍/㎖로 희석시키고, 7분 동안 20㎕/min에서 모든 플로우 셀 상에 주입하였다. 모든 플로우 셀을 150mM 붕산염 완충제 pH 8.5 중의 100mM 에틸렌다이아민으로 7분 동안 10㎕/min에서 차단시켰다.
10mM HEPES, 150mM NaCl, 0.05%(v/v) Tween-20, pH 7.4, 1㎎/㎖ BSA의 전개 완충액를 사용하여 37℃에서 실험을 수행하였다. FLT3 항체를 비희석 상청액으로부터 10㎕/min의 유량에서 1분 동안 하류 플로우 셀(플로우 셀 2, 3 및 4) 상에 포획하였다. 상이한 항체를 각각의 플로우 셀 상에 포획하였다. 플로우 셀 1을 참조 표면으로서 사용하였다. FLT3 항체의 포획 이후에, 분석물(완충제, hFLT3)을 30㎕/min으로 모든 플로우 셀 상에 2분 동안 주입하였다. 분석물 주입 후에, 해리를 10분 동안 모니터링하고, 그 다음 모든 플로우 셀을 75mM 인산의 3회 1분 주입으로 재생시켰다. 각각의 포획된 FLT3 항체의 경우, 하기 분석물 주입을 수행하였다: 완충제, 11nM hFLT3, 33nM hFLT3, 100nM hFLT3 및 300nM hFLT3. 완충제 사이클을 각각의 포획된 FLT3 항체에 대해서 이중-참조 목적을 위해서 수집하였다(문헌[Myszka, D.G. Improving biosensor analysis. J. Mol. Recognit. 12, 279-284 (1999)]에 기술된 바와 같은 이중-참조). 이중-참조 센서그램을 질량 이동 결합 모델을 사용하여 단순 1:1 랭뮈어에 광범위하게 피팅하였다.
시험된 항-FLT3 항체에 대한 동력학 및 친화도를 하기 표 7에 나타낸다. 표 7에 제시된 항체는 동일한 명칭을 갖는 표 8에 제시된 CAR과 동일한 VH 영역 및 VL 영역을 공유한다.
Figure pct00040
실시예 2: FLT3 특이적 CAR-T 세포의 생성
a) 플라스미드
표 8에 열거된 하기 코돈-최적화된 FLT3 CAR 서열을 합성하고, EcoRI(5') 및 MluI(3') 제한 부위를 사용하여(따라서 IRES-Puro 카세트를 제거하여) 렌티바이러스 벡터, 예컨대, pLVX-EF1a-IRES-Puro(클론테크사(Clontech)) 내에서 서브클로닝하였다.
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
일부 실험에서, CAR을 암호화하는 서열은 형광 단백질, 예컨대, BFP(청색 형광 단백질) 뒤에 이어지고, 자가-절단 2A 펩타이드를 암호화하는 서열에 의해서 이러한 서열로부터 분리된다. psPAX2, HIV-1 gag-pol 패키징 플라스미드, 및 pMD2.G, VSV-G 발현 플라스미드를 사용하여 렌티바이러스를 생산하였다.
b) T 세포 활성화 및 렌티바이러스 형질도입
Pan T 세포 단리 키트(밀테니이 바이오테크사(Miltenyi Biotec))를 사용하여 무손상 T 세포를 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)으로부터 단리시키고, 항체를 인간 CD2, CD3 및 CD28(T 세포 활성화/확장 키트 - 밀테니이 바이오테크사)에 대해서 3일 동안 활성화시켰다. 6웰 플레이트 내에서 서브-컨플루언트(sub-confluent) HEK-293T/17(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)) 세포의 일시적 형질주입에 의해서 렌티바이러스 벡터(LV)를 생산하였다. 간략하면, pLVX, psPAX2 및 pMD2.G 플라스미드를 각각 리포펙타민 2000(인비트로젠사)를 사용하여, 제조사의 설명서에 따라서 4:3:1비로 형질주입시켰다. 다음 날, 배지를 T 세포 배양 배지(X-vivo-15 배지 중의 5% 인간 AB 혈청(론자사)으로 대체하고, 형질주입 48h 후, LV 상청액을 수거하고, 0.45㎛ 시린지 필터(밀리포어사(Millipore))를 통해서 여과시켰다. 활성화된 T 세포를 40ng/㎖ IL-2를 함유하는 T 세포 배양 배지 중에 0.25 x 106개 세포/㎖로 시딩하고, 동일한 부피의 새로운 LV 상청액을 첨가함으로써 형질도입시켰다. 하기 CAR 작제물을 포함하는 LV를 본 실험에서 사용하였다: P1A5, P1B4, P3A1, P3E10, P4C7, P4H11, P7H3, P9B5, P12B6 및 P14G2. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 3일 동안 배양하고, 유세포 분석법 분석을 위해서 사용하거나 또는 20ng/㎖의 IL-2를 함유하는 새로운 T 세포 배지 중에서 확장시켰다.
c) 유세포 분석법에 의한 형질도입 효율의 측정
상이한 FLT3 CAR 렌티바이러스 작제물의 형질도입 효율을 결정하기 위해서, 유세포 분석법 분석을 형질도입 72시간 후 T 세포 상에서 수행하였다. 간략하면, 단일 세포를 전진 스캐터 및 측면 스캐터 파라미터를 사용하여 게이팅하고, BFP 양성 세포의 백분율로서 형질도입 효율을 계산하였다. 다른 예에서, CAR 분자에서 CD20 에피토프에 결합하는 항-CD20 항체 리툭시맙으로의 염색에 의해서, 그 다음 FITC-접합된 항-인간 IgG에 의해서 CAR-발현 세포를 검출하였다. 도 1은, 활성화된 T 세포가 다양한 효율(30% 내지 70%)로 상이한 FLT3 CAR 작제물로 효과적으로 형질도입되었다는 것을 나타낸다.
d) FLT3FLT3 CAR-T 세포는 배양 동안 분화하지만 기억 T 세포 하위세트의 높은 백분율을 유지한다.
배양 동안 CAR-T 세포 상에서 활성화 마커 CD25 및 4-1BB(CD137)의 발현은 T 세포 소모와 연관되어 있고, 효과기 기억 표현형을 향한 분화를 증가시켰다(Long et al., 2015). 본 실험에서, P1A5, P1B4, P3A1, P3E10, P4C7, P4H11, P7H3, P9B5, P12B6 및 P14G2 CAR로 형질도입된 T 세포를 자극 후 10일에 CD25 및 CD137 항체로 염색하고, 유세포 분석법에 의해서 분석하였다. T 세포 활성화도를 CD25 및 4-1BB에 대해서 양성인 CAR-T 세포의 백분율에 의해서 결정하였다. 형질도입되지 않은(NT) T 세포 집단을 비교를 위해서 포함시켰다(도 2). 일부 FLT3FLT3 CAR(P1A5, P12B6 및 P14G2)의 발현은 "활성화된" 상태와 연관되었지만(도 2), P9B5, P3E10, P4C7 및 P3A1를 비롯한 나머지 FLT3FLT3 CAR의 발현은 형질도입되지 않은 세포와 대등한 활성화 마커의 수준을 초래하였다(도 2). 활성화 마커 발현의 더 높은 수준은 CAR-T 세포의 증가된 분화로 번역되며, 이것은 세포 표면 상에서 CD62L 및 CD45RO의 발현을 측정함으로써 자극 후 15일에 평가될 수 있다. 본 실험에서, CAR-T 세포를 특이적 항체를 사용하여 이러한 마커로 염색하고, 분화도 증가를 사용하여 4개의 상이한 카테고리 또는 하위세트로 분류하였다: 1) CD62L고 CD45RO저 줄기세포 기억(Tscm) 세포; 2) CD62L고 CD45RO고 중심 기억(Tcm) 세포; CD62L저 CD45RO고 효과기 기억(Tem) 세포; 및 CD62L저 CD45RO저 효과기(Teff) 세포. 도 3은, 자극 후 15일에 P9B5 CAR-T 세포(저 분화) 및 P14G2 CAR-T 세포(고 분화) 및 상이한 FLT3FLT3 CAR-T 세포 모두의 T 세포 하위세트 조성물에 대한 대표적인 FACS 플롯을 나타낸다. "활성화된" 표현형을 나타내는 CAR-T 세포는 또한 배양 마지막까지 더 분화된 표현형(즉, Tem 세포의 더 높은 백분율 및 Tscm 세포의 더 낮은 백분율)을 나타내었다(도 3). 특히, P9B5, P3A1, P7H3 및 P3E10 FLT3 CAR의 발현은 줄기세포 기억 및 중심 기억 세포의 높은 백분율과 연관되었는데, 이것은 ALL 및 CLL 대상체에서 증가된 지속성 및 항종양 효능과 상관관계가 있었다(Xu et al., Blood. 2014;123(24):3750-3759).
e) 시험관내 증식 및 장기간 사멸 활성도 검정
동족 항원을 발현하는 표적 세포를 증식시키고, 용해시키는 CAR-T 세포의 능력은 시험관내에서 의의 활성도를 평가하는 효율적인 방식이다. 발광에 의해서 표적 세포 생존력을 모니터링하기 위해서, FLT3-발현 Molm13 세포를 안정적으로 형질도입시켜 루시퍼라제 유전자를 발현시켰다. 이어서, 이러한 Luc+ 표적 세포를 FLT3 CAR-T 세포와 함께 인큐베이션시키고, CAR-T 세포의 사멸 활성도뿐만 아니라 증식을 각각 형광 및 생존 세포 계수에 의해서 측정하였다. 효과기 세포(CAR-T 세포)에게 스트레스를 주도록 설계된 보다 엄격한 검정을 위해서, 새로운 표적 세포를 초기 배양물에 주기적으로 첨가하고, 배양 이후에 형광에 의해서 CAR-T 세포의 장기간 사멸 활성도를 결정하였다(도 4). 줄기세포 기억 및 중심 기억 T 세포의 더 높은 증식 능력과 일관되게, P9B5, P3A1, P7H3 및 P3E10 CAR-T 세포 집단은 시험관내에서 더 높은 표적-의존성 확장 및 장기간 세포독성 활성도를 나타낸 반면, 더 높은 분화도를 갖는 CAR-T 세포, 예컨대, P12B6 및 P14G2는 표적 세포의 존재 하에서 불량하게 확장되었고, 감소된 사멸 활성도를 가졌다.
f) 동소 마우스 검정에서 FLT3 특이적 CAR-T 세포의 활성도
본 실시예는 Eol1 동소 모델을 사용하여 FLT3 CAR-T 세포로의 AML의 처리를 설명한다. FLT3 CAR-T 세포의 생체내 효능 연구를 동소 모델에서, 루시퍼라제 및 GFP를 발현하는 Eol1 세포를 사용하여 수행하였다. 삼십만개의 Eol1 Luc2AGFP 세포를 6 내지 8주령의 암컷 CB17/SCID 동물에게 꼬리 정맥을 통해서 정맥내로 주사하였다. D-루시페린(레기스 테크놀로지스사(Regis Technologies), 미국 일리노이주 모톤 그로브 소재)(15㎎/㎖으로 동물당 200uL)의 복강내 주사, 그 다음 아이소플루오란으로의 마취 및 이후의 전신 생물발광 영상화(bioluminescence imaging: BLI)는 종양 부담의 모니터링을 가능하게 한다. 종양 세포에 의해서 발현된 루시퍼라제와 루시페린 간의 상호작용에 의해서 방출된 생물발광 신호를 IVIS 스펙트럼 CT(퍼킨 엘머사(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주 소재)를 사용한 영상화에 의해서 캡처하고, Living Image 4.4(캘리퍼 라이프 사이언시스사(Caliper Life Sciences), 미국 캘리포니아주 알라메다 소재)를 사용하여 총 플럭스(광자/초)로서 정량하였다.
총 플럭스가 모든 동물에 대해서 30E6의 평균에 도달했을 때(종양 이식 후 10일), 동물을 3개의 군으로 무작위화하였다. 각각의 군에게 하기 세포 중 하나를 투여하였다: 1) 대조군으로서 사용된 형질도입되지 않은 T 세포, 2) P3E10을 발현하는 FLT3 CAR-T 세포("P3E10 V1") 또는 3) P3A1을 발현하는 FLT3 CAR-T 세포("P3A1 v1"), 세포 1 내지 3 모두는 TCRα를 보유한다. FLT3 CAR-T 세포를 상기 실시예에 기술된 바와 같이 제조하였다. FLT3 CAR 작제물 P3E10 및 P3A1을 상기 표 8에 나타낸다. 2.5 또는 5백만개의 대조군(NT) 또는 FLT3 CAR-T(P3E10 또는 P3A1) 세포의 단일 용량을 볼러스(bolus) 꼬리 정맥 주사를 통해서 투여하였다. 동물이 Eol1 동소 모델에 대한 종점인 총 체중의 15%를 초과하게 감량되었을 때 동물을 죽였다.
연구로부터의 결과를 도 5에 요약한다. 단일 용량의 5백만개의 P3E10 또는 P3A1 FLT3 CAR-T 세포 또는 2.5백만개의 P3E10 FLT3 CAR-T 세포는, 음성 대조군과 비교할 때 종양 이식 13 내지 43일 이후로부터 더 낮은 총 플럭스를 유발하였다. 따라서, FLT3 CAR-T 세포로의 처리는 음성 대조군과 비교할 때 종양 진행을 저해하였다.
이러한 결과는 FLT3 CAR-T 세포가 종양 진행을 저해하는 데 효과적임을 입증한다.
실시예 3: CD20 에피토프를 발현하는 FLT3 특이적 CAR T 세포의 고갈
a) CD20 에피토프를 발현하는 FLT3 특이적 CAR T 세포는 리툭시맙의 존재 하에서 보체-의존성 세포독성도(CDC)에 감응성이다.
항-CD20 항체의 존재 하에서 보체에 대한 FLT3 특이적 CAR T 세포의 감도를 CDC 검정을 사용하여 시험관내에서 평가하였다. 본 실험을 위해서, 세포외 도메인에 CD20 에피토프를 함유하는 FLT3 CAR의 발현을 위해서 렌티바이러스 작제물이 형질도입된 T 세포를 리툭시맙(100㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 25%의 보체(AbD 세로테크(AbD serotec))와 혼합하고, 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 바이오틴일화된 FLT3 단백질을 사용한 유세포 분석법 분석에 의해서 FLT3 CAR-T 세포의 고갈을 결정하였다. 도 6은, FLT3 CAR 및 CD20 에피토프 발현하는 세포는 항체 및 보체의 존재 하에서 효율적으로 고갈된 반면, CD20 에피토프를 발현하지 않는 대조군 FLT3 특이적 CAR T 세포는 최소한으로 영향을 받았음을 나타낸다.
이러한 결과는, CD20 에피토프를 발현하는 FLT3 특이적 CAR-T 세포가 리툭시맙 및 보체의 존재 하에서 시험관내에서 고갈될 수 있다는 것을 입증한다.
b) 리툭시맙 투여 이후의 FLT3 CAR T 세포의 고갈은 NSG 마우스에서 FLT3-발현 골수 전구체의 회복을 가능하게 한다.
CD20 에피토프를 발현하는 FLT3 특이적 CAR T 세포의 고갈을 매개하고, 골수 회복을 가능하게 하는 항-CD20 항체 리툭시맙의 능력을 마우스에서 시험하였다. 본 실험에서, 마우스를 골수 전구체의 표면 상의 마우스 FLT3 단백질에 결합할 수 있는 FLT3 CAR(α-마우스 FLT3 CAR T)를 발현하고, 리툭시맙에 의해서 인식되는 CD20 에피토프를 포함하는 T 세포 또는 마우스 FLT3 단백질에 대해서 무시할 만한 결합을 갖는 대조군 CAR을 발현하는 T 세포로 처리하였다. 골수 세포의 유세포 분석법 분석을 사용하여, 대조군 CAR T 세포를 제공받은 마우스 또는 미처리 마우스와 비교할 때 전구체의 감소로서 인지되는, FLT3-발현 조혈 전구체에 대한 CAR T 세포 세포독성 활성도를 입증하였다(도 7, 패널 B). CAR T 세포 사멸 활성도의 확인 이후에, 마우스에게 4일의 연속일 동안 리툭시맙을 제공하였고, 순환하는 잔류 CAR T 세포를 13일에 열거하였다. 도 7, 패널 C는, 이러한 마우스의 혈액 중의 FLT3 CAR T 세포가, 리툭시맙을 제공받지 않은 대조군에 비해서 고갈되었다는 것을 나타낸다. 마지막으로, 골수 세포의 유세포 분석법 분석은, 리툭시맙을 제공받은 마우스 만(20일) 골수 회복을 나타내었다는 것을 입증하였다(도 7, 패널 D).
본 실험은, CD20 에피토프를 발현하는 FLT3 CAR T 세포의 리툭시맙-의존성 고갈이 FLT3-발현 조직, 예컨대, 골수에 대한 손상을 완화시켜서, 잔류하는 간세포로부터의 신속한 회복을 가능하게 한다는 것을 입증한다.
개시된 교시가 다양한 응용, 방법, 키트 및 조성물과 관련하여 기재되었지만, 본 명세서의 교시 및 하기 청구된 발명을 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 가능할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 상기 실시예는 개시된 교시를 보다 양호하게 설명하기 위해서 제공되고, 본 명세서에 제시된 교시의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 교시가 이들 예시적인 실시형태와 관련하여 기재되었지만, 이러한 예시적인 실시형태의 다수의 변경 및 변형이 과도한 실험 없이 가능하다는 것을 당업자는 용이하게 이해할 것이다. 모든 이러한 변경 및 변형은 본 교시의 범주에 포함된다.
특허, 특허 출원, 논문, 교재 등을 비롯한, 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌 및 그에 인용된 참고문헌은 그들이 이미 포함되지 않은 정도로, 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 정의된 용어, 용어 사용, 기재된 기술 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 포함된 문헌 및 유사한 자료 중 하나 이상이 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우, 본 출원이 우선한다.
상기 설명 및 실시예는 본 발명의 특정 구체적인 실시형태를 상술하고, 본 발명자들에 의해서 고려되는 최적의 방식을 기재한다. 그러나, 상기를 본문에서 아무리 상세하게 나타내 보일 수 있을지라도, 본 발명이 다수의 방식으로 실시될 수 있고, 본 발명이 첨부된 청구범위 및 이의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 하는 것으로 인지될 것이다.
ATCC PTA-124227 20170601 ATCC PTA-124228 20170601
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cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctctggcgg cacattctct agctacgcca tccagtgggt gcggcaggca 120 ccaggacagg gcctggagtg gatgggagga atcgtgggaa gctggggcct ggcaaactac 180 gcccagaagt ttcagggcag agtgaccatc accaccgata agtctacaag caccgcctat 240 atggagctgt cctctctgag gtccgaggac acagccgtgt actattgcgc cacctccgcc 300 ttcggcgagc tggcatcttg gggacagggc acactggtga ccgtgagctc c 351 <210> 246 <211> 325 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial nucleotide sequence <400> 246 gagatcgtgc tgacacagag cccaggcacc ctgtccctgt ctccaggaga gagggccaca 60 ctgtcctgta gggccagcca gtccgtgcct tctagccagc tggcctggta ccagcagaag 120 ccaggccagg cccccagact gctgatctat gacgcctcct ctagagccac aggcatccca 180 gataggttct ctggcagcgg ctccggcacc gactttacac tgaccatctc caggctggag 240 cccgaggatt tcgccgtgta ctattgccag cagtacggca gctcccctct gacatttggc 300 cagggcacca aggtggagat caagg 325 <210> 247 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial nucleotide sequence <400> 247 caggtgcagc tggtgcagag cggagcagag gtgaagaagc ccggcagctc cgtgaaggtg 60 tcttgcaagg ccagcggcgg cacattctct agctacgata tctcttgggt gaggcaggcc 120 ccaggccagg gactggagtg gatgggagga atcatccccg tgagcggaag ggcaaactac 180 gcacagaagt ttcagggccg ggtgaccatc accacagaca agtccacatc taccgcctat 240 atggagctgt cctctctgag aagcgaggat acagccgtgt actattgcgc cagagtgagg 300 cctacctact ggccactgga ctattggggc cagggcacac tggtgaccgt gagctcc 357 <210> 248 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial nucleotide sequence <400> 248 gacatccaga tgacccagtc cccatctagc ctgagcgcct ccgtgggcga tagagtgaca 60 atcacctgta gggcctctca gagcatctcc tcttacctga attggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctacgca gcaagctccc tgcagtccgg agtgccatct 180 cggttctccg gctctggcag cggcacagac tttacactga ccatctctag cctgcagcct 240 gaggatttcg ccacctacta ttgccagcag tcctattcta caccactgac ctttggccag 300 ggcacaaagg tggagatcaa g 321 <210> 249 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial nucleotide sequence <400> 249 gaggtgcagc tgctggagag cggcggcggc ctggtgcagc ctggcggctc tctgagactg 60 agctgcgcag catccggctt catctttgcc tcttacgcaa tgagctgggt gaggcaggcc 120 cctggcaagg gactggagtg ggtgagcgag atcagctcct ctggcggcag caccacatat 180 gccgactccg tgaagggccg cttcacaatc agccgggaca actctaagaa taccctgtac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac acagccgtgt actattgcgc cagagataga 300 gtgatggccg gcctgggcta tgacccattt gattactggg gccagggcac actggtgacc 360 gtgagctcc 369 <210> 250 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial nucleotide sequence <400> 250 cagagcgtgc tgacccagcc accttccgcc tctggaacac ccggccagag ggtgaccatc 60 agctgttccg gctctagctc caacatcggc tccaattacg tgtattggta ccagcagctg 120 cccggcacag cccctaagct gctgatctac agaaacaatc agaggccatc tggcgtgccc 180 gaccgcttct ctggcagcaa gtccggcacc tctgccagcc tggcaatcag cggactgcgg 240 tccgaggacg aggccgatta ctattgcgca gcatgggacg attccctgtc tggagtggtg 300 tttggcggcg gcacaaagct gaccgtgctg 330 <210> 251 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial nucleotide sequence <400> 251 caggtgcagc tggtgcagag cggagcagag gtgaagaagc ctggcagctc cgtgaaggtg 60 tcttgcaagg ccagcggcgg cacattctct agctacacca tctcctgggt gcggcaggcc 120 ccaggccagg gactggagtg gatgggagga atcatcccag ccttcggcat cgccaactac 180 gcccagaagt ttcagggccg cgtgacaatc accgccgaca agtccacatc taccgcctat 240 atggagctgt cctctctgcg gagcgaggat accgccgtgt actattgcgc caagggcggc 300 agctactccc tggactattt tgatatctgg ggccagggca cactggtgac cgtgagctcc 360 <210> 252 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial nucleotide sequence <400> 252 gagatcgtgc tgacacagtc ccctggcacc ctgtctctga gcccaggcga gagggccaca 60 ctgtcctgta gggcatctca gtacgtgtcc gcctctctgc tggcctggta tcagcagaag 120 cctggccagg ccccaagact gctgatctac ggagcatcca caagagccac cggcatcccc 180 gacaggttca gcggctccgg ctctggaacc gacttcaccc tgaccatctc tagactggag 240 cctgaggact tcgccgtgta ctattgccag cagtatgcca ggtctagcac atttggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 253 <211> 1455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial nucleotide sequence <400> 253 atggctctgc ccgtcaccgc tctgctgctg ccactggccc tgctgctgca cgccgctcgc 60 ccccaggtgc agctggtcca gagcggagcc gaggtgaaga aaccaggcag ctccgtgaag 120 gtcagctgca aggccagcgg cgggacattc tctagttacg ccatccagtg ggtgcggcag 180 gcccctggcc agggactgga atggatggga ggcattgtcg gctcttgggg gctggccaac 240 tacgctcaga agtttcaggg cagagtgacc atcaccacag ataaatcaac aagcactgca 300 tatatggagc tgtcaagcct gaggagcgaa gacaccgccg tctactattg cgcaacatct 360 gccttcggcg agctggctag ttggggacag gggacactgg tgactgtctc ctctggggga 420 ggaggatcag gaggaggagg aagcggagga ggaggctccg agattgtgct gactcagagc 480 cccggcaccc tgagcctgtc tcctggagaa cgggctacac tgagctgtag agcaagtcag 540 tcagtgccta gttcacagct ggcctggtac cagcagaagc ccggacaggc tcctagactg 600 ctgatctatg acgccagctc cagggctaca ggcattccag atcgcttcag cggatccggc 660 tctgggactg actttaccct gacaatctcc aggctggagc ctgaagattt cgccgtgtac 720 tattgccagc agtacggctc tagtccactg acatttggac agggcactaa ggtcgagatc 780 aaaactacca caccagcacc acgaccacct acccctgcac caacaattgc ctctcagcct 840 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10 <210> 346 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb CDRH2 <400> 346 Asp Ala Phe Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 347 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb CDRH3 <400> 347 Gln Gln Tyr Gly Thr Pro Pro Ile Thr 1 5 <210> 348 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb CDRH1 <400> 348 Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Asp Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 349 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb CDRH3 <400> 349 Gln Gln Tyr Ser Ala Ser Pro Ile Thr 1 5 <210> 350 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb CDRH1 <400> 350 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 351 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 351 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 352 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 352 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 353 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptide <400> 353 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (87)

  1. Fms-유사 타이로신 카이나제 3(Fms-like tyrosine kinase 3: FLT3) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로서, 세포외 리간드-결합 도메인, 제1 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하되, 상기 세포외 리간드-결합 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고, 상기 scFv는 서열번호 202(FLT3의 도메인 4) 또는 서열번호 200(FLT3의 도메인 2)에 결합하는, FLT3 특이적 CAR.
  2. Fms-유사 타이로신 카이나제 3(FLT3) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 세포외 리간드-결합 도메인, 제1 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하되, 상기 세포외 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고,
    (a) 상기 VH 영역은 (i) 서열번호 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 294, 295, 296, 300, 301, 305, 306, 307, 311, 312, 316, 317 또는 318에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 상보성 결정 영역 1(complementarity determining region one: CDR1); (ii) 서열번호 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 297, 298, 302, 303, 308, 309, 313, 314, 319, 320 또는 322에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 (iii) 서열번호 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 299, 304, 310, 315 또는 321에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하고/포함하거나;
    (b) 상기 VL 영역은 (i) 서열번호 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 323, 326, 328, 331, 336, 338, 340, 343, 345, 348 또는 350에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 상보성 결정 영역 1(CDR1); (ii) 서열번호 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 324, 329, 332, 334, 341 또는 346에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 상보성 결정 영역 2(CDR2); 및 (iii) 서열번호 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 325, 327, 330, 333, 335, 337, 339, 342, 344, 347 또는 349에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VL 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  3. Fms-유사 타이로신 카이나제 3(FLT3) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 세포외 리간드-결합 도메인, 제1 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하되, 상기 세포외 도메인은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 또는 293에 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변(VH) 영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  4. Fms-유사 타이로신 카이나제 3(FLT3) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 세포외 리간드-결합 도메인, 제1 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하되, 상기 세포외 도메인은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 또는 292에 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  5. Fms-유사 타이로신 카이나제 3(FLT3) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 세포외 리간드-결합 도메인, 제1 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하되, 상기 세포외 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고, 상기 VH 영역은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 또는 293에 제시된 서열을 포함하고; 상기 VL 영역은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 또는 292에 제시된 서열을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  6. Fms-유사 타이로신 카이나제 3FLT3) 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)로서, 세포외 리간드-결합 도메인, 제1 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하되, 상기 세포외 도메인은 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고,
    (a) 상기 VH 영역은 서열번호 49, 44 또는 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 51 또는 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 상기 VL 영역은 서열번호 150에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열번호 152에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하거나,
    (b) 상기 VH 영역은 서열번호 90, 91 또는 92에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 서열번호 93 또는 94에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 서열번호 95에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 상기 VL 영역은 서열번호 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 서열번호 172에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 서열번호 173에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  7. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 영역은 상기 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 또는 293에 제시된 서열, 또는 CDR 내에 존재하지 않는 잔기 내에 하나 또는 몇몇 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하고/포함하거나 상기 VL 영역은 상기 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 또는 292에 제시된 아미노산 서열, 또는 CDR 내에 존재하지 않는 아미노산 내에 하나 또는 몇몇 보존적 아미노산 치환을 갖는 이의 변이체를 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 영역은 상기 서열번호 49, 44 또는 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 상기 서열번호 51 또는 52에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 상기 서열번호 53에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 상기 VL 영역은 상기 서열번호 150에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 상기 서열번호 151에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 상기 서열번호 152에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 영역은 상기 서열번호 90, 91 또는 92에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 상기 서열번호 93 또는 94에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 상기 서열번호 95에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 상기 VL 영역은 상기 서열번호 171에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 상기 서열번호 172에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 상기 서열번호 173에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  10. 제8항에 있어서, 상기 VH 영역은 상기 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL 영역은 상기 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  11. 제9항에 있어서, 상기 VH 영역은 상기 서열번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL 영역은 상기 서열번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 영역은 상기 서열번호 43, 44 또는 45에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 상기 서열번호 46 또는 47에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 상기 서열번호 48에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 상기 VL 영역은 상기 서열번호 147에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 상기 서열번호 148에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 상기 서열번호 149에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  13. 제12항에 있어서, 상기 VH 영역은 상기 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL 영역은 상기 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 영역은 상기 서열번호 60, 61 또는 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 상기 서열번호 63 또는 64에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및 상기 서열번호 65에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함하고; 상기 VL 영역은 상기 서열번호 156에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 상기 서열번호 157에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및 상기 서열번호 158에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  15. 제14항에 있어서, 상기 VH 영역은 상기 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL 영역은 상기 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB 도메인을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제2 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB 도메인을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 리간드-결합 도메인과 상기 제1 막관통 도메인 사이에 줄기 도메인을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  21. 제20항에 있어서, 상기 줄기 도메인은 CD8α 힌지, IgG1 힌지 및 FcγRIIIα 힌지로 이루어진 군으로부터 선택되는, FLT3 특이적 CAR.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단클론성 항체에 대해서 특이적인 1종 이상의 에피토프를 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  23. 제22항에 있어서, 상기 에피토프는 CD52 에피토프, CD20 에피토프, CD3 에피토프, CD41 에피토프, CD25 에피토프, CD30 에피토프, EGFR 에피토프, TNFα 에피토프, VEGF 에피토프, 보체 단백질 C5 에피토프, CD11a 에피토프, CD33 에피토프, 알파-4 인테그린 에피토프, IgE Fc 영역 에피토프, RSV 단백질 F 에피토프, IL-6 수용체 에피토프, HER2 수용체 에피토프, 인테그린 α4β7 에피토프, BAFF(B-세포 활성화 인자) 에피토프, IL-1β 에피토프, RANKL 에피토프, CTLA4 에피토프, CD34 에피토프, IL-12 에피토프, IL-23 에피토프 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, FLT3 특이적 CAR.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 에피토프는 알렘투주맙(alemtuzumab), 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 무로모납(muromonab)-CD3, 토시투모맙(tositumomab), 압식시맙(abciximab), 바실릭시맙(basiliximab), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 베바시주맙(bevacizumab), 세톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10 또는 우스테키누맙(ustekinumab)에 의해서 특이적으로 인식되는 에피토프인, FLT3 특이적 CAR.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에피토프는 CD20 에피토프인, FLT3 특이적 CAR.
  26. 제25항에 있어서, 상기 CD20 에피토프는 서열번호 229에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  27. 제1항에 있어서, 상기 FLT3 특이적 CAR은 서열번호 235, 236, 237 또는 242에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  28. 제1항에 있어서, 상기 FLT3 특이적 CAR은 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  29. 제1항에 있어서, 상기 FLT3 특이적 CAR은 서열번호 236에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 막관통 도메인은 CD8α 쇄 막관통 도메인을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, FLT3에 대해서 특이적이지 않은 제2 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 리간드-결합 도메인(들), 상기 제1 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인(들)은 단일 폴리펩타이드 상에 존재하는, FLT3 특이적 CAR.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 막관통 도메인을 포함하되, 상기 제1 막관통 도메인 및 상기 세포외 리간드-결합 도메인(들)은 제1 폴리펩타이드 상에 존재하고, 상기 제2 막관통 도메인 및 상기 세포내 신호전달 도메인(들)은 제2 폴리펩타이드 상에 존재하며, 상기 제1 막관통 도메인은 고 친화도 IgE 수용체(FcεRI)의 α 쇄로부터의 막관통 도메인을 포함하고, 상기 제2 막관통 도메인은 FcεRI의 γ 또는 β 쇄로부터의 막관통 도메인을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  34. 제33항에 있어서, 공자극성 분자로부터의 세포내 신호전달 도메인에 융합된 제3 막관통 도메인을 포함하는 제3 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 제3 막관통 도메인은 FcεRI의 상기 γ 또는 β 쇄로부터의 막관통 도메인을 포함하는, FLT3 특이적 CAR.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 FLT3 특이적 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  36. 제35항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 ATCC 수탁번호 PTA-124227을 갖는 벡터의 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  37. 제35항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 ATCC 수탁번호 PTA-124228을 갖는 벡터의 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  38. 제35항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 253에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  39. 제35항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 248에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  40. 제35항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 247에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  41. 제35항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 246에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  42. 제35항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 245에 제시된 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 발현 벡터.
  44. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 FLT3 특이적 CAR을 발현하는, 조작된 면역 세포.
  45. 제44항에 있어서, FLT3에 대해서 특이적이지 않은 또 다른 CAR을 포함하는, 조작된 면역 세포.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 자살 폴리펩타이드(suicide polypeptide)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조작된 면역 세포.
  47. 제46항에 있어서, 상기 자살 폴리펩타이드는 RQR8인, 조작된 면역 세포.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T- 림프구 또는 헬퍼 T-림프구로부터 유래되는, 조작된 면역 세포.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 내인성 유전자의 붕괴를 포함하되, 상기 내인성 유전자는 TCRα, TCRβ, CD52, 글루코코티코이드 수용체(glucocorticoid receptor: GR), 데옥시사이티딘 카이나제(deoxycytidine kinase: dCK) 또는 면역 관문 단백질을 암호화하는, 조작된 면역 세포.
  50. 제49항에 있어서, 상기 면역 관문 단백질은 예정사(programmed death)-1(programmed death: PD-1)인, 조작된 면역 세포.
  51. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 건강한 공여자로부터 획득되는, 조작된 면역 세포.
  52. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 질환 또는 장애를 앓고 있는 공여자로부터 획득되는, 조작된 면역 세포.
  53. 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 조작된 면역 세포.
  54. 제53항에 있어서, 상기 의약은 다발성 골수종, 악성 형질 세포 신생물, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종(nodular lymphocyte predominant Hodgkin's lymphoma), 칼러병(Kahler's diease) 및 골수종증, 형질 세포 백혈병, 형질세포종, B-세포 전림프구성 백혈병, 모발 세포 백혈병, B-세포 비호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 소포성 림프종, 버킷 림프종, 변연부 림프종, 외투 세포 림프종, 대세포 림프종, 전구 B-림프모구 림프종, 골수성 백혈병, 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulienemia), 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 림프종, 점막 관련 림프 조직 림프종, 소세포 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 버킷 림프종, 원발성 종격동(흉선) 거대 B-세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종, 림프종양 육아종증, T 세포/조직구-풍부 거대 B-세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 원발성 피부 미만성 거대 B-세포 림프종(다리 유형(leg type)), 노인의 EBV 양성 미만성 거대 B-세포 림프종, 염증 연관된 미만성 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, ALK-양성 거대 B-세포 림프종, 형질세포성 림프종, HHV8-연관 다중심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종과 버킷 림프종 사이의 중간 특징을 갖는 미분류 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종와 전통적인 호지킨 림프종 사이의 중간 특징으로 갖는 미분류 B-세포 림프종, 및 기타 조혈 세포 관련 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료에 사용하기 위한 것인, 조작된 면역 세포.
  55. 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FLT3 특이적 CAR은 ScFv를 포함하는 세포외 도메인을 포함하되,
    - 상기 scFv는 10nM 내지 80nM을 포함하는 KD로 인간 FLT3의 세포외 도메인에 결합하거나,
    - 상기 scFv는 1nM 내지 100nM을 포함하는 KD로 인간 FLT3의 세포외 도메인의 도메인 4에 결합하거나,
    - 상기 scFv는 5nM 내지 30nM을 포함하는 KD로 인간 FLT3의 세포외 도메인의 도메인 2-3에 결합하는, 조작된 면역 세포.
  56. 제44항 내지 제55항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포를 포함하는 세포의 집단으로서,
    (ii) 상기 세포의 집단은 20%, 30% 또는 40%를 초과하는 줄기세포 기억 및 중심 기억 세포의 백분율을 포함하고/포함하거나,
    (iii) 상기 세포의 집단은 10%, 20%, 30% 또는 40%를 초과하는 FLT3 발현 세포의 용해 백분율을 달성하는, 세포의 집단.
  57. FLT3 특이적 CAR을 발현하는 면역 세포의 조작 방법으로서,
    a. 면역 세포를 제공하는 단계; 및
    b. 상기 세포 내에 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 FLT3 특이적 CAR을 암호화하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 단계
    를 포함하되;
    이에 의해서 상기 면역 세포는 상기 FLT3 특이적 CAR을 발현하는, 면역 세포의 조작 방법.
  58. 면역 세포의 조작 방법으로서,
    a. 면역 세포를 제공하는 단계;
    b. 상기 세포 내에 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 FLT3 특이적 CAR을 암호화하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 단계; 및
    c. 상기 세포 내에 FLT3에 대해서 특이적이지 않은 CAR을 암호화하는 적어도 1종의 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 단계
    를 포함하는, 면역 세포의 조작 방법.
  59. 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서,
    a. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 FLT3 특이적 CAR을 발현하는 면역 세포의 집단을 제공하는 단계; 및
    b. 상기 면역 세포의 집단을 상기 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는, 치료 방법.
  60. 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포를 포함하는, 약제학적 조성물.
  61. FLT3과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 FLT3과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제60항의 약제학적 조성물 또는 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하는, FLT3과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 FLT3과 연관된 질환 또는 장애는 암인, FLT3과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 암은 다발성 골수종, 악성 형질 세포 신생물, 호지킨 림프종, 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종, 칼러병 및 골수종증, 형질 세포 백혈병, 형질세포종, B-세포 전림프구성 백혈병, 모발 세포 백혈병, B-세포 비호지킨 림프종(NHL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML), 소포성 림프종, 버킷 림프종, 변연부 림프종, 외투 세포 림프종, 대세포 림프종, 전구 B-림프모구 림프종, 골수성 백혈병, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 변연부 림프종, 점막 관련 림프 조직 림프종, 소세포 림프구성 림프종, 외투 세포 림프종, 버킷 림프종, 원발성 종격동(흉선) 거대 B-세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종, 림프종양 육아종증, T 세포/조직구-풍부 거대 B-세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 원발성 피부 미만성 거대 B-세포 림프종(다리 유형), 노인의 EBV 양성 미만성 거대 B-세포 림프종, 염증 연관된 미만성 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, ALK-양성 거대 B-세포 림프종, 형질세포성 림프종, HHV8-연관 다중심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종과 버킷 림프종 사이의 중간 특징을 갖는 미분류 B-세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종와 전통적인 호지킨 림프종 사이의 중간 특징으로 갖는 미분류 B-세포 림프종, 및 기타 조혈 세포 관련 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, FLT3과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  64. FLT3을 발현하는 악성 세포를 갖는 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 저해하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제60항의 약제학적 조성물 또는 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 종양 성장 또는 진행을 저해하는 방법.
  65. FLT3을 발현하는 악성 세포의 전이의 저해를 필요로 하는 대상체에서 FLT3을 발현하는 악성 세포의 전이를 저해하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제60항의 약제학적 조성물 또는 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 전이를 저해하는 방법.
  66. FLT3을 발현하는 악성 세포를 갖는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제60항의 약제학적 조성물 또는 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항의 조작된 면역 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 종양 퇴행을 유도하는 방법.
  67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 뉴클레오사이드 유사체 요법을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 유사체 요법은 플루다라빈(fludarabine) 또는 클로파라빈(clofarabine)인, 방법.
  69. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 수용체 타이로신 카이나제 저해제, mTOR 저해제, 또는 후성적 조절제, 프로테아좀 저해제, 면역조절제, 헤지호그 저해제 또는 아이소시트레이트 데하이드로게나제(Isocitrate Dehydrogenase: IDH) 저해제 또는 이들의 조합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  70. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 프로테아좀 저해제, 면역조절제 또는 헤지호그 저해제 또는 이들의 조합물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 레날리도마이드를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  72. 면역 세포의 집단의 시험관내 분류 방법으로서, 상기 면역 세포의 집단의 하위세트는 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 포함하되, 상기 시험관내 분류 방법은,
    a. 상기 면역 세포의 집단을 에피토프에 대해서 특이적인 단클론성 항체와 접촉시키는 단계; 및
    b. 상기 단클론성 항체에 결합하는 상기 면역 세포를 선택하여 조작된 면역 세포가 풍부한 세포의 집단을 획득하는 단계
    를 포함하는, 면역 세포의 집단의 시험관내 분류 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 에피토프에 대해서 특이적인 상기 단클론성 항체는 형광단에 접합되고, 선택적으로 상기 단클론성 항체에 결합하는 상기 세포를 선택하는 단계는 형광 활성화 세포 분류법(Fluorescence Activated Cell Sorting: FACS)에 의해서 수행되는, 면역 세포의 집단의 시험관내 분류 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 에피토프에 대해서 특이적인 상기 단클론성 항체는 자성 입자에 접합되고, 선택적으로 상기 단클론성 항체에 결합하는 상기 세포를 선택하는 단계는 자성 활성화 세포 분류법(Magnetic Activated Cell Sorting: MACS)에 의해서 수행되는, 면역 세포의 집단의 시험관내 분류 방법.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에피토프는 CD 20 에피토프인, 면역 세포의 집단의 시험관내 분류 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 CD20 에피토프는 서열번호 229에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 선택적으로, 상기 단클론성 항체는 리툭시맙인, 면역 세포의 집단의 시험관내 분류 방법.
  77. 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 면역 세포가 풍부한 상기 세포의 집단은 적어도 70%의 FLT3 CAR-발현 면역 세포를 포함하는, 면역 세포의 집단의 시험관내 분류 방법.
  78. 대상체로부터 조작된 면역 세포를 고갈시키는 방법으로서, 상기 대상체는 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 면역 세포를 투여받았고, 상기 방법은 상기 대상체에게 상기 에피토프에 대해서 특이적인 단클론성 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 조작된 면역 세포를 고갈시키는 방법.
  79. 제76항에 있어서, 상기 에피토프는 CD20 에피토프인, 조작된 면역 세포를 고갈시키는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 CD20 에피토프는 서열번호 229에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 선택적으로, 상기 단클론성 항체는 리툭시맙인, 조작된 면역 세포를 고갈시키는 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체는 보체계를 활성화시킬 수 있는 분자에 접합되는, 조작된 면역 세포를 고갈시키는 방법.
  82. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 약물이 상기 단클론성 항체에 커플링되는, 조작된 면역 세포를 고갈시키는 방법.
  83. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항의 FLT3 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 면역 세포가 투여된 대상체에서 내인성 FLT3-발현 골수 간세포(progenitor cell)의 회복을 촉진시키는 방법으로서, 상기 에피토프에 대해서 특이적인 단클론성 항체를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 내인성 FLT3-발현 골수 간세포의 회복을 촉진시키는 방법
  84. 제83항에 있어서, 상기 에피토프는 CD20 에피토프인, 내인성 FLT3-발현 골수 간세포의 회복을 촉진시키는 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 CD20 에피토프는 서열번호 229에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 선택적으로, 상기 단클론성 항체는 리툭시맙인, 내인성 FLT3-발현 골수 간세포의 회복을 촉진시키는 방법.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단클론성 항체는 보체계를 활성화시킬 수 있는 분자에 접합되는, 내인성 FLT3-발현 골수 간세포의 회복을 촉진시키는 방법.
  87. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 약물이 상기 단클론성 항체에 커플링되는, 내인성 FLT3-발현 골수 간세포의 회복을 촉진시키는 방법.
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