TW201902919A - 靶向flt3之嵌合抗原受體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供特異性結合至Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)之抗體、特異性結合至FLT3之嵌合抗原受體(CAR)，及表現此等CAR之經工程改造之免疫細胞(例如FLT3特異性CAR-T細胞)。本發明亦提供製備此等抗體、CAR及經工程改造之免疫細胞之方法。本發明亦提供使用此等抗體、CAR及經工程改造之免疫細胞，例如用於治療與表現FLT3之惡性細胞相關之病狀(例如癌症)。

Description

靶向FLT3之嵌合抗原受體
本發明提供Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)特異性抗體、特異性結合於FLT3之嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors；CAR) (FLT3 CAR)、編碼FLT3 CAR之聚核苷酸及包含FLT3特異性CAR之經工程改造之免疫細胞(例如FLT3特異性CAR-T細胞)。本發明進一步關於用於工程改造免疫細胞以表現FLT3特異性CAR之方法及使用FLT3特異性抗體及FLT3特異性CAR-T細胞治療與FLT3相關之病狀(例如表現FLT3之惡性細胞)之方法。
經基因修飾以識別惡性相關之抗原之的免疫細胞之授受性轉移可作為治療癌症之新型方法(參見例如Brenner等人, Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010)；Rosenberg等人, Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008))。T細胞可經基因修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)、由抗原識別部分及T細胞活化結構域構成之融合蛋白(參見例如Eshhar等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993)，及Sadelain等人, Curr. Opin. Immunol, 21(2): 215-223 (2009))。
FLT3係急性骨髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia；AML)標靶抗原，與健康細胞相比在AML患者胚細胞上過度表現，且在大多數患者細胞上表現(Carow等人, 1996年2月2日 Blood: 87(3)；Birg等人 1992年11月 Blood: 80(10))。FLT3係AML患者中經常突變之基因，且突變與不良預後相關(Abu-Duhier等人 Br J Haematol. 2000年10月;111(1):190-5，Yamamoto等人 2001年4月15日; Blood: 97 (8))。小分子FLT3抑制劑已在臨床試驗中展示活性；然而，該等反應由於獲得抗性通常為暫態的。另外，激酶抑制劑僅治療一定百分比之表現FLT3之突變形式的患者，從而突出對改善療法之迫切需求。
因此，需要用於癌症及尤其涉及FLT3之異常表現之惡性疾病的替代治療。本發明提供解決此需要之方法及組合物。
本發明提供特異性結合於Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)之抗體或其抗原結合片段、特異性結合於FLT3之嵌合抗原受體(CAR)及表現此類CAR之經工程改造之免疫細胞(例如FLT3特異性CAR-T細胞)。亦提供製備此類抗體、CAR及免疫細胞。進一步提供使用此類抗體、CAR及經工程改造之免疫細胞例如治療與表現FLT3之惡性細胞相關之病狀(例如癌症)。在一個態樣中，本文中提供特異性結合於FLT3之分離抗體，其中該抗體包含具有表2中所列之部分VH序列中之任一者的重鏈可變(VH)區及/或具有表2中所列之部分VL序列中之任一者的輕鏈可變(VL)區。
在另一態樣中，本文中提供特異性結合於FLT3之分離抗體，其中該抗體包含：(a)包含表3中所列之互補決定區1 (CDR1)、CDR2及CDR3序列之重鏈可變(VH)區及/或(b)包含表3中所列之CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變(VL)區。
本文亦提供結合於FLT3之嵌合抗原受體(CAR)。經證明，在接觸FLT3時，T細胞中之FLT3特異性CAR之表現可有效活化T細胞。本文中提供之FLT3特異性CAR結合人類FLT3且在接觸FLT3表現細胞時展現細胞毒活性。
因此，在另一態樣中，本文中提供FLT3特異性嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外配位體結合域、第一跨膜域及胞內信號傳導域，其中該胞外域包含結合於FLT3之胞外域之單鏈可變片段(scFv)。在一些實施例中，本文提供FLT3 CAR，其包含胞外配位體結合域、第一跨膜域及胞內信號傳導域，其中該胞外域包含結合於FLT3標靶之特定結構域、例如結合於SEQ ID NO: 199 (結構域1)、SEQ ID NO: 200 (結構域2)、SEQ ID NO: 201 (結構域3)、SEQ ID NO: 254 (結構域2-3)、SEQ ID NO: 202 (結構域4)或SEQ ID NO: 203 (結構域5)、SEQ ID NO: 254 (結構域2-3)或SEQ ID NO: 202 (結構域4)之scFv。
在一些實施例中，FLT3特異性CAR包含胞外域，該胞外域包含scFv，其中該scFv結合於FLT3標靶之結構域4 (SEQ ID NO: 202)。
在一些實施例中，FLT3特異性CAR包含胞外域，該胞外域包含scFv，其中該scFv結合於FLT3標靶之結構域2 (SEQ ID NO: 200)。
FLT3特異性CAR之胞外域包含scFv，其中該scFv包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，VH區及VL區各自包含對FLT3具有特異性之三個互補決定區(CDR)。
在一些實施例中，VH區包含(i)具有示於SEQ ID NO: 37、38、39、43、44、45、49、50、54、55、56、60、61、62、66、67、68、72、73、74、78、79、80、84、85、86、90、91、92、96、97、98、102、103、104、108、109、110、114、115、116、120、121、122、126、127、128、132、133、134、138、139、140、294、295、296、300、301、305、306、307、311、312、316、317或318中之胺基酸序列之VH互補決定區1 (CDR1)；(ii)具有示於SEQ ID NO: 40、41、46、47、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76、81、82、87、88、93、94、99、100、105、106、111、112、117、118、123、124、129、130、135、136、141、142、297、298、302、303、308、309、313、314、319、320或322中之胺基酸序列之VH互補決定區2 (CDR2)；及(iii)具有示於SEQ ID NO: 42、48、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、299、304、310、315或321中之胺基酸序列之VH互補決定區3 (CDR3)；及/或VL區包含(i)具有示於SEQ ID NO: 144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、323、326、328、331、336、338、340、343、345、348或350中之胺基酸序列之VL互補決定區1 (CDR1)；(ii)具有示於SEQ ID NO: 145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、324、329、332、334、341或346中之胺基酸序列之VL互補決定區2 (CDR2)；及(iii)具有示於SEQ ID NO: 146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、325、327、330、333、335、337、339、342、344、347或349中之胺基酸序列之VL互補決定區3 (CDR3)。
在一些實施例中，提供包含scFv之FLT3特異性CAR，其中該scFv包含具有示於SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中之序列之VH區。
在一些實施例中，提供包含scFv之FLT3特異性CAR，其中該scFv包含具有示於SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中之序列之VL區。
在一些實施例中，提供包含scFv之FLT3特異性CAR，該scFv包含VH區及VL區，其中VH區具有示於SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中之序列；且VL區具有示於SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中之序列。
在一些實施例中，VH區包含示於SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中之序列，或其在並非位於CDR內之殘基中具有一個或若干個保守胺基酸取代之變異體及/或VL區包含示於SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中之胺基酸序列，或其在並非位於CDR內之胺基酸中具有一個或若干個胺基酸取代之變異體。
在一些實施例中，VH區包含：包含示於SEQ ID NO: 90、91或92中之胺基酸序列之VH CDR1；包含示於SEQ ID NO: 93或94中之胺基酸序列之VH CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 95中之胺基酸序列之VH CDR3；且輕鏈可變區(VL)包含以下CDR：包含示於SEQ ID NO: 171中之胺基酸序列之VL CDR1；包含示於SEQ ID NO: 172中之胺基酸序列之VL CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 173中之胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，VH區包含示於SEQ ID NO: 20中之胺基酸序列且VL區包含示於SEQ ID NO: 19中之胺基酸序列。
在一些實施例中，VH區包含：包含示於SEQ ID NO: 43、44或45中之胺基酸序列之VH CDR1；包含示於SEQ ID NO: 46或47中之胺基酸序列之VH CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 48中之胺基酸序列之VH CDR3；且輕鏈可變區(VL)包含以下CDR：包含示於SEQ ID NO: 147中之胺基酸序列之VL CDR1；包含示於SEQ ID NO: 148中之胺基酸序列之VL CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 149中之胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，VH區包含示於SEQ ID NO: 4中之胺基酸序列且VL區包含示於SEQ ID NO: 3中之胺基酸序列。
在一些實施例中，VH區包含：包含示於SEQ ID NO: 49、44或50中之胺基酸序列之VH CDR1；包含示於SEQ ID NO: 51或52中之胺基酸序列之VH CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 53中之胺基酸序列之VH CDR3；且輕鏈可變區(VL)包含以下CDR：包含示於SEQ ID NO: 150中之胺基酸序列之VL CDR1；包含示於SEQ ID NO: 151中之胺基酸序列之VL CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 152中之胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，VH區包含示於SEQ ID NO: 6中之胺基酸序列且VL區包含示於SEQ ID NO: 5中之胺基酸序列。
在一些實施例中，VH區包含：包含示於SEQ ID NO: 60、61或62中之胺基酸序列之VH CDR1；包含示於SEQ ID NO: 63或64中之胺基酸序列之VH CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 65中之胺基酸序列之VH CDR3；且輕鏈可變區(VL)包含以下CDR：包含示於SEQ ID NO: 156中之胺基酸序列之VL CDR1；包含示於SEQ ID NO: 157中之胺基酸序列之VL CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 158中之胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，VH區包含示於SEQ ID NO: 10中之胺基酸序列且VL區包含示於SEQ ID NO: 9中之胺基酸序列。
在一些實施例中，各CDR係根據以下各者定義：Kabat定義、Chothia定義、Kabat定義及Chothia定義之組合、AbM定義或CDR之接觸定義。
在一些實施例中，胞內信號傳導域包含CD3ζ信號傳導域。在實施例中，胞內信號傳導域包含4-1BB結構域。在一些實施例中，FLT3特異性CAR包含第二胞內信號傳導域。在一些實施例中，第二胞內信號傳導域包含4-1BB結構域。
在一些實施例中，本文所揭示之FLT3特異性CAR可包含胞外配位體結合域與第一跨膜域之間的莖結構域。在一些實施例中，莖結構域選自由以下組成之群：CD8α鉸鏈、IgG1鉸鏈及FcγRIIIα鉸鏈。在一些實施例中，莖結構域係人類CD8α鉸鏈、人類IgG1鉸鏈或人類FcγRIIIα鉸鏈。
在一些實施例中，本文所揭示之FLT3特異性CAR可包含對一或多種單株抗體具有特異性之一或多種抗原決定基。在一些實施例中，對單株抗體具有特異性之抗原決定基係CD20抗原決定基。在一些實施例中，CD20抗原決定基包含示於SEQ ID NO: 229或SEQ ID NO: 230中之胺基酸序列。
在一些實施例中，FLT3特異性CAR包含示於SEQ ID NO: 235、236、237或242中之胺基酸序列。在一些實施例中，FLT3特異性CAR包含示於SEQ ID NO: 235中之胺基酸序列。在一些實施例中，FLT3特異性CAR包含示於SEQ ID NO: 236中之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一跨膜域包含CD8α鏈跨膜域。
在一些實施例中，FLT3特異性CAR可包含對FLT3不具有特異性之另一胞外配位體結合域。
在一些實施例中，胞外配位體結合域、第一跨膜域及胞內信號傳導域位於單一多肽上。
在一些實施例中，CAR可包含第二跨膜域，其中第一跨膜域及胞外配位體結合域位於第一多肽上，且其中第二跨膜域及胞內信號傳導域位於第二多肽上。在一例示性實施例中，第一跨膜域包含來自高親和力IgE受體(FcεRI)之α鏈之跨膜域且第二跨膜域包含來自FcεRI之γ或β鏈之跨膜域。
在一些實施例中，CAR可包含第三多肽，該第三多肽包含融合至來自共刺激分子之胞內信號傳導域之第三跨膜域，其中該第三跨膜域包含來自FcεRI之γ或β鏈之跨膜域。
在另一態樣中，本文中提供分離之聚核苷酸，其包含編碼本文所述之FLT3特異性CAR之核酸序列。
在另一態樣中，本文中提供表現載體，其包含編碼本文所述之FLT3特異性CAR之聚核苷酸。
在另一態樣中，本文中提供經工程改造之免疫細胞，其在其細胞表面膜處表現本文所述之FLT3特異性CAR。在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞可包含對FLT3不具有特異性之另一CAR。在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞可包含編碼自殺多肽之聚核苷酸。在一些實施例中，自殺多肽係RQR8。
在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞衍生自發炎性T淋巴球、細胞毒性T淋巴球、調節T淋巴球或輔助T淋巴球。
在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞可包含破壞一或多種內源基因，其中該內源性基因編碼TCRα、TCRβ、CD52、糖皮質激素受體(GR)、脫氧胞苷激酶(dCK)或諸如計劃性死亡-1 (PD-1)之免疫檢查點蛋白。
在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞獲自健康供體。在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞獲自罹患疾病或病症之個體。
在另一態樣中，本文中提供用作藥劑之經工程改造之免疫細胞，其在其細胞表面膜處表現如本文所述之FLT3特異性CAR。在另一態樣中，本文中提供用作藥劑之FLT3特異性抗體。在一些實施例中，包含表現FLT3特異性CAR之免疫細胞或FLT3特異性抗體之藥劑係用於治療FLT3相關之疾病或病症。在一個實施例中，FLT3相關之疾病或病症係造血源之癌症，諸如淋巴瘤或白血病。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：多發性骨髓瘤、惡性漿細胞贅瘤、霍奇金氏淋巴瘤、結節性淋巴球為主型之霍奇金氏淋巴瘤、卡勒氏病及骨髓瘤病、漿細胞白血病、漿細胞瘤、B細胞前淋巴球性白血病、毛細胞白血病、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma；NHL)、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia；AML)、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia；CLL)、急性淋巴球性白血病(acute lymphocytic leukemia；ALL)、慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia；CML)、濾泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、前驅體B淋巴母細胞淋巴瘤、骨髓性白血病、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴球性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、結邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、富T細胞/組織細胞大B細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性皮膚瀰漫性大B細胞淋巴瘤(腿型)、老年人之EBV陽性瀰漫性大B細胞淋巴瘤、與發炎相關之瀰漫性大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、在HHV8相關之多中心卡斯曼病中出現之大B細胞淋巴瘤、具有瀰漫性大B細胞淋巴瘤與伯基特淋巴瘤之間的中間特徵之未經分類B細胞淋巴瘤、具有瀰漫性大B細胞淋巴瘤與典型霍奇金淋巴瘤之間的中間特徵之未經分類B細胞淋巴瘤、以及其他造血細胞相關之癌症，例如ALL或AML。
在一個態樣中，本文中提供細胞群，其包含表現本文所述之FLT特異性CAR的經工程改造之免疫細胞，其中(ii)該細胞群包含大於20%、30%或40%之幹細胞記憶及中央記憶細胞之百分比，及/或(iii)該細胞群達成大於10%、20%、30%或40%之FLT3表現細胞之溶解百分比。
在另一態樣中，本文中提供工程改造表現本文所述之FLT3特異性CAR中之任一者的免疫細胞之方法，該方法包含：提供免疫細胞；及將編碼該FLT3特異性CAR之至少一種聚核苷酸引入細胞中；其中該免疫細胞表現該FLT3特異性CAR。
在一些實施例中，該方法包含提供免疫細胞；將編碼該FLT3特異性CAR之至少一種聚核苷酸引入細胞中；及引入編碼對FLT3不具有特異性之CAR之至少一種聚核苷酸。
在另一態樣中，本文中提供治療患有FLT3相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包含：提供在表面處表現如本文所述之FLT3特異性CAR之免疫細胞；及向該個體投與該免疫細胞。本發明亦提供治療患有FLT3相關之疾病或病症之個體的方法，該方法包含提供本文所述之FLT3特異性抗體及向該個體投與該等抗體。
在一些實施例中，本文中提供醫藥組合物，其包含表現如本文所述之FLT3特異性CAR的經工程改造之免疫細胞。在其他實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含本文所述之FLT3特異性抗體中之任一者。
在另一態樣中，本文中提供治療個體中之與表現FLT3之惡性細胞相關的病狀之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含如本文所述之經工程改造之免疫細胞或如本文所述之FLT3特異性抗體。在一些實施例中，病狀係癌症。在一些實施例中，癌症係造血源之癌症，諸如淋巴瘤或白血病。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：多發性骨髓瘤、惡性漿細胞贅瘤、霍奇金氏淋巴瘤、結節性淋巴球為主型之霍奇金氏淋巴瘤、卡勒氏病及骨髓瘤病、漿細胞白血病、漿細胞瘤、B細胞前淋巴球性白血病、毛細胞白血病、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、濾泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、前驅體B淋巴母細胞淋巴瘤、骨髓性白血病、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴球性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、結邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、富T細胞/組織細胞大B細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性皮膚瀰漫性大B細胞淋巴瘤(腿型)、老年人之EBV陽性瀰漫性大B細胞淋巴瘤、與發炎相關之瀰漫性大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、在HHV8相關之多中心卡斯曼病中出現之大B細胞淋巴瘤、具有瀰漫性大B細胞淋巴瘤與伯基特淋巴瘤之間的中間特徵之未經分類B細胞淋巴瘤、具有瀰漫性大B細胞淋巴瘤與典型霍奇金淋巴瘤之間的中間特徵之未經分類B細胞淋巴瘤、以及其他造血細胞相關之癌症，例如ALL或AML。
在另一態樣中，本文中提供抑制具有表現FLT3之惡性細胞之個體中的腫瘤生長或進展之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之包含如本文所述之經工程改造的免疫細胞之醫藥組合物，或向個體投與包含如本文所述之FLT3特異性抗體之醫藥組合物。
在另一態樣中，本文中提供抑制個體中之表現FLT3之惡性細胞的癌轉移之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之包含如本文所述之經工程改造的免疫細胞之醫藥組合物或向個體投與包含如本文所述之FLT3特異性抗體之醫藥組合物。
在另一態樣中，本文中提供誘導具有表現FLT3之惡性細胞之個體中的腫瘤消退之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之包含如本文所述之經工程改造的免疫細胞之醫藥組合物或向個體投與包含如本文所述之FLT3特異性抗體之醫藥組合物。
在一些實施例中，以上方法中之任一者進一步包含投與一或多種額外療法，諸如單株抗體及/或化學治療。在一些實施例中，單株抗體可為例如結合於檢查點抑制劑之抗體，諸如抗PD-1抗體或抗-PD-L1抗體。在一些實施例中，以上方法中之任一者進一步包含向個體投與受體酪胺酸激酶抑制劑、mTOR抑制劑、表觀遺傳調節劑、蛋白酶體抑制劑、諸如來那度胺(lenalidomide)之免疫調節劑、刺蝟(Hedgehog)抑制劑或異檸檬酸去氫酶(IDH)抑制劑。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2017年6月2日申請之美國臨時申請案第62/514,634號之優先權，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
均揭示FLT3特異性抗體之2017年6月2日申請之美國臨時申請案第62/514,574號及2018年4月20日申請之美國臨時申請案第62/660,908號，及2018年5月31日申請之名稱為「ANTIBODIES SPECIFIC FOR FLT3 AND THEIR USES」之PCT申請案的內容以全文引用之方式併入本文中。參考序列表
本申請案經由EFS-Web以電子方式申請且包括呈.txt格式之以電子方式提交之序列表。該.txt文件含有2018年5月24日創建且大小為238 KB之名稱為「ALGN_010_01WO_SeqList_ST25.txt」之序列表。此.txt文件中所含之序列表係說明書之一部分且以全文引用的方式併入本文中。
在一個態樣中，本文所揭示之本發明提供嵌合抗原受體(CAR)及包含特異性結合於FLT3 (例如人類FLT3)之CAR (例如CAR-T細胞)之免疫細胞。本發明亦提供編碼此等CAR之聚核苷酸、包含表現此等CAR之免疫細胞之組合物，以及製備及使用此等CAR及表現CAR之免疫細胞的方法。本發明亦提供使用FLT3特異性CAR及表現如本文所述之此等CAR之免疫細胞，治療個體中之與FLT3介導之病理相關的病狀(諸如由表現FLT3之惡性細胞介導之癌症)之方法。
在一個態樣中，本文所揭示之本發明提供特異性結合於FLT3 (例如人類FLT3)之抗體。本發明亦提供包含此等抗體之組合物及使用此等抗體之方法。舉例而言，本文提供使用此等抗體治療個體中之與FLT3介導之病理相關的病狀(諸如癌症)之方法。通用技術
除非另外指明，否則本發明之實施將採用在此項技術內之分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術。 此類技術完全解釋於文獻中，諸如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版(Sambrook等人, 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait編, 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編, 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney編, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather及P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths及D.G. Newell編, 1993-1998) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir及C.C. Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller及M.P. Calos編, 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等人編, 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編, 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan等人編, 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley及Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway及P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: a practical approach (D. Catty.編, IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd及C. Dean編, Oxford University Press, 2000)；Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti及J.D. Capra編, Harwood Academic Publishers, 1995)。定義
如本文所用之術語「胞外配位體結合域」係指能夠結合能夠與細胞表面分子相互作用之配位體之多肽。舉例而言，所選胞外配位體結合域可識別在與特定疾病狀態相關之靶細胞上充當細胞表面標記物之配位體。
術語「莖結構域」或「鉸鏈結構域」在本文中可互換地使用以係指用以將跨膜域連接至胞外配位體結合域之任何多肽。特定言之，莖結構域用於為胞外配位體結合域提供更高可撓性及可接近性。
術語「胞內信號傳導域」係指轉導效應信號功能信號及引導細胞執行特異性功能之蛋白質部分。
如本文所用之「共刺激分子」係指與共刺激配位體特異性結合，進而藉由細胞調節共刺激反應(諸如但不限於增殖)之免疫細胞(例如T細胞)上之同源結合搭配物。共刺激分子包括但不限於I類MHC分子、BTLA及Toll配位體受體。共刺激分子之實例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配位體，及其類似物。
「共刺激配位體」係指抗原呈遞細胞上特異性結合T細胞上之同源共刺激信號分子，由此提供信號之分子，除例如TCR/CD3複合體與裝載有肽之MHC分子結合所提供之初級信號外，該信號亦介導T細胞反應，包括但不限於增殖活化、分化及類似反應。共刺激配位體可包括但不限於CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激配位體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、結合Toll配位體受體之促效劑或抗體，及與B7-H3特異性結合之配位體。共刺激配位體亦尤其涵蓋與T細胞上存在之共刺激分子特異性結合的抗體，該共刺激分子諸如但不限於CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配位體。
「抗體」係能夠經由至少一個位於免疫球蛋白分子之可變區之抗原識別位點特異性結合於諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等標靶之免疫球蛋白分子。如本文所用，術語不僅涵蓋完整的多株或單株抗體，且亦涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv)、單鏈(scFv)及結構域抗體(包括例如鯊魚及駱駝科抗體)，及包含抗體之融合蛋白，以及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他經修飾之組態。抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA、IgE、IgD或IgM (或其子類），且該抗體無需為任何特定類別。免疫球蛋白可視其重鏈之恆定區之抗體胺基酸序列而歸為不同類別。免疫球蛋白有五個主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中數個類別可進一步分成亞類（同型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別之免疫球蛋白之次單元結構及三維組態為熟知的。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合片段」或「抗原結合部分」係指保留特異性結合於給定抗原(例如FLT3)之能力之完整抗體的一或多個片段。抗體之抗原結合功能可由完整抗體之片段執行。術語抗體之「抗原結合片段」內所涵蓋之結合片段的實例包括Fab；Fab'；F(ab')2 ；由VH及CH1結構域組成之Fd片段；由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；單結構域抗體(dAb)片段(Ward等人, Nature 341:544-546, 1989)，及經分離之互補決定區(CDR)。
「特異性結合」於標靶(例如FLT3蛋白)之抗體、抗原結合片段、抗體結合物或多肽係此項技術中充分理解之術語，且測定此類特異性結合之方法亦為此項技術中所熟知。若相比與替代細胞或物質反應或締合，分子以更長的持續時間及/或以更高的親和力更頻繁地、更加快速地與特定細胞或物質反應或締合，則稱該分子展現「特異性結合」。若抗體相比於結合於其他物質以更高的親和力、親合力、更加容易地及/或以更長的持續時間結合，則抗體「特異性結合」於標靶。舉例而言，特異性結合於FLT3抗原決定基之抗體係相比於其結合於其他FLT3抗原決定基或非FLT3抗原決定基以更高的親和力、親合力、更加容易地及/或以更長的持續時間結合此抗原決定基之抗體。藉由閱讀此定義亦應理解，例如特異性結合於第一標靶之抗體(或部分或抗原決定基)可能或可能不會特異性結合於第二標靶。因此，「特異性結合」不必需要(儘管其可包括)排他性結合。提及結合一般但未必意謂特異性結合。
抗體之「可變區」係指單獨或呈組合形式之抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。如此項技術中已知，各自由三個互補決定區(CDR)連接之四個構架區(FR)組成之重鏈及輕鏈之可變區亦稱為高變區。各鏈中之CDR由FR緊密結合在一起且與來自另一個鏈之CDR結合在一起，促進形成抗體之抗原結合位點。存在至少兩種用於測定CDR之技術：(1)基於交叉物種序列變化性之方法(亦即Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (第5版, 1991, 美國國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda MD.))；及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法(Al-lazikani等人, 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948))。如本文所用，CDR可指由任一種方法或由兩種方法之組合定義之CDR。
可變域之「CDR」為可變區內之胺基酸殘基，其係根據Kabat定義、Chothia定義、Kabat與Chothia之累積、AbM、接觸及/或構形定義或此項技術中熟知之任何CDR測定方法鑑別。抗體CDR可鑑別為最初由Kabat等人定義之高變區。參見例如Kabat等人, 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, NIH, Washington D.C.。CDR之位置亦可鑑別為最初由Chothia及其他人描述之結構環結構。參見例如Chothia等人, Nature 342:877-883, 1989。CDR鑑別之其他方法包括：「AbM定義」，其係Kabat與Chothia之間的折中方案且使用Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體(現在為Accelrys®)導出；或基於觀測到之抗原接觸之CDR的「接觸定義」，其闡述於MacCallum等人, J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996中。在另一方法(在本文中稱為CDR之「構形定義」)中，CDR之位置可鑑別為向抗原結合貢獻焓之殘基。參見例如Makabe等人, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008。其他CDR邊界定義可不嚴格遵循以上方法中之一者，但仍然將與Kabat CDR之至少一部分重疊，但其可根據以下預測或實驗結果而縮短或延長：特定殘基或殘基組或甚至全部CDR不顯著影響抗原結合。如本文所用，CDR可指由此項技術中已知之任何方法，包括方法之組合所定義之CDR。本文中所用之方法可利用根據此等方法中任一者所定義之CDR。對於任何含有超過一個之CDR之給定實施例，CDR可根據Kabat定義、Chothia定義、擴展定義、AbM定義、接觸定義及/或構形定義中之任一者定義。
如本文所用，「單株抗體」係指自實質上同種之抗體群體獲得之抗體，亦即除可以少量形式存在之有可能天然產生之突變外，構成此群體之個別抗體為相同的。單株抗體針對單一抗原位點具高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相反，各單株抗體針對抗原上之單個決定子。修飾語「單株」指示抗體之特徵為自基本上均質之抗體群體獲得，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根根據本發明所使用之單株抗體可藉由首先由Kohler及Milstein, 1975, Nature 256:495所描述之融合瘤方法製造，或可藉由諸如美國專利第4,816,567號中所描述之重組DNA方法製造。舉例而言，單株抗體亦可自使用McCafferty等人，1990, Nature 348:552-554中所描述之技術生成的噬菌體庫中分離。
如本文中所使用，「人類化」抗體係指以下非人類(例如鼠類)抗體形式：含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)。在一個態樣中，人類化抗體係人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之互補決定區(CDR)之殘基經具有所需特異性、親和力及能力之來自非人類物種(供體抗體) (諸如小鼠、大鼠或兔)之CDR之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基置換為相應非人類殘基。此外，人類化抗體可包含以下殘基：既不存在於受體抗體中亦不存在於所導入之CDR或構架序列中，但包括該等殘基以進一步改進且優化抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含實質上所有至少一個及通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有CDR區與非人類免疫球蛋白之彼等域相對應且所有或實質上所有FR區為人類免疫球蛋白共同序列之彼等區。人類化抗體最佳亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區或結構域(Fc)，通常人類免疫球蛋白之恆定區或結構域。較佳為具有如WO 99/58572中所描述經修飾之Fc區的抗體。人類化抗體之其他形式具有一或多個相對於原始抗體改變之CDR (CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2或CDR H3)，亦稱為一或多個「來源於」來自原始抗體之一或多個CDR的CDR。
如本文所用，「人類抗體」意謂具有對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列之抗體，及/或使用用於製備熟習此項技術者已知或本文所揭示之人類抗體之技術中的任一者製備之抗體。此人類抗體之定義包括包含至少一種人類重鏈多肽或至少一種人類輕鏈多肽之抗體。一個此類實例係包含小鼠輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。可使用此項技術中已知之各種技術來產生人類抗體。在一個實施例中，人類抗體選自噬菌體文庫，其中噬菌體文庫表現人類抗體(Vaughan等人, Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996；Sheets等人, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998；Hoogenboom及Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991；Marks等人, J. Mol. Biol., 222:581, 1991)。人類抗體亦可藉由將已藉由轉殖基因方法引入人類免疫球蛋白基因座代替內源性基因座的動物(例如內源性免疫球蛋白基因已部分或完全不活化之小鼠)免疫接種來製得。此方法描述於美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號及第5,661,016號中。可替代地，人類抗體可藉由使產生針對標靶抗原之抗體的人類B淋巴球(此類B淋巴球可自個體或自cDNA之單細胞選殖回收或可在活體外已進行免疫接種)永生化來製備。參見例如Cole等人 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 第77頁, 1985；Boerner等人, J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991；及美國專利第5,750,373號。
術語「嵌合抗體」意欲係指可變區序列來源於一個物種且恆定區序列來源於另一物種之抗體，諸如可變區序列來源於小鼠抗體且恆定區序列來源於人類抗體之抗體。
「單價抗體」包含每分子一個抗原結合位點(例如IgG或Fab)。在一些實例中，單價抗體可具有超過一個抗原結合位點，但結合位點來自不同抗原。
「二價抗體」包含每分子兩個抗原結合位點(例如IgG)。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原特異性。然而，二價抗體可為雙特異性的。
本發明之抗體可使用此項技術中熟知之技術製備，例如重組技術、噬菌體呈現技術、合成技術或此類技術或此項技術中易知之其他技術(參見例如Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50, 1999及Fellouse, F.A.等人, J. MoI. Biol., 373(4):924-40, 2007)。
如此項技術中已知，如在本文中可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸鏈，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾核苷酸或鹼及/或其類似物或任何可藉由DNA或RNA聚合酶併入鏈中之受質。聚核苷酸可包含經修飾核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，可在鏈組合之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。核苷酸之序列可間雜有非核苷酸組分。聚核苷酸可進一步在聚合之後諸如藉由與標記組分結合而修飾。其他類型之修飾包括例如「蓋」；用類似物取代天然存在之核苷酸中之一或多者；核苷酸間修飾，諸如彼等具有不帶電鍵(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之修飾，彼等含有諸如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、訊號肽、聚-L-離胺酸等)之附掛部分之修飾、彼等具有嵌入劑 (例如吖啶、補骨脂素等)之修飾、彼等含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)之修飾、彼等含有烷基化劑之修飾、彼等具有修飾鍵(例如α變旋異構核酸等)之修飾以及聚核苷酸之未經修飾之形式。此外，一般存在於糖中之任何羥基可例如藉由膦酸酯基、磷酸酯基置換，藉由標準保護基保護，或經活化以製備與額外核苷酸之額外鍵聯，或可結合至固體支撐物。5'及3'末端OH可經磷酸化或經1至20個碳原子之胺或有機封端基團取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之類似形式之核糖或去氧核糖，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-或β-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)；哌喃醣、呋喃醣、景天庚酮糖、非環類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核糖苷)。一或多個磷酸二酯鍵可藉由替代性鍵聯基團置換。此等替代性鍵聯基團包括但不限於其中磷酸酯經P(O)S (「硫代酸酯」)、P(S)S (「二硫代酸酯」)、(O)NR2 (「醯胺基」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 (「甲縮醛」)置換之實施例，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚(-O-)鍵、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳醛基之經取代或未經取代之烷基(1-20 C)。聚核苷酸中並非所有鍵需要一致。前述描述適用於本文所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
如此項技術中已知，抗體之「恆定區」係指單獨或組合形式之抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區。
如本文所用，「基本上純」係指純度為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或甚至至少99%之材料(亦即不含污染物)。
「宿主細胞」包括可為或已成為用於併入聚核苷酸插入物之載體之受體的個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單個宿主細胞之後代，且後代可能歸因於自然、偶然或故意突變而不一定與原始母細胞完全一致(在形態或基因組DNA補體方面)。宿主細胞包括活體內經本發明之聚核苷酸轉染之細胞。
如此項技術中已知，術語「Fc區」係用以定義免疫球蛋白重鏈之C端區。「Fc區」可為天然序列Fc區或變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區邊界可變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自處於位置Cys226之胺基酸殘基或自Pro230伸展至其羧基端。Fc區中之殘基編號為如在Kabat中EU指數之編號。(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991。) 免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恆定區：CH2及CH3。
如此項技術中所用，「Fc受體」及「FcR」係描述結合至抗體之Fc區的受體。較佳FcR係天然序列人類FcR。此外，較佳FcR係結合IgG抗體(γ受體)者，且其包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體(包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式)。FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，兩者具有類似胺基酸序列，胺基酸序列差異主要係在其細胞質結構域。FcR在Ravetch及Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991；Capel等人, Immunomethods, 4:25-34, 1994；及de Haas等人, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995中綜述。「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其負責輸送母體IgG至胎兒(Guyer等人, J. Immunol., 117:587, 1976；及Kim等人, J. Immunol., 24:249, 1994)。
如本文所用關於抗體之術語「競爭」意謂第一抗體或其抗原結合片段(或部分)以充分類似於第二抗體或其抗原結合部分之結合方式結合至抗原決定基，使得相較於不存在第二抗體時的第一抗體之結合，第一抗體與其同源抗原決定基在第二抗體存在下之結合結果係可偵測性地減少。替代方案可以是以下狀況但不一定需要是如此狀況：在第一抗體存在下第二抗體與其抗原決定基之結合亦可偵測性地減少。亦即，第一抗體可抑制第二抗體與其抗原決定基之結合，而第二抗體並不抑制第一抗體與其各別抗原決定基之結合。然而，當各抗體無論在相同、較大或較小的程度上可偵測性地抑制另一抗體與其同源抗原決定基或配位體之結合時，該等抗體稱為彼此「交叉競爭」結合其各別抗原決定基。本發明涵蓋競爭及交叉競爭抗體兩者。無論該競爭或交叉競爭發生之機制(例如位阻、構形變化或結合於共同抗原決定基或其部分)如何，熟練技術人員基於本文中所提供之教示內容將瞭解，此類競爭及/或交叉競爭抗體涵蓋於且可適用於本文中所揭示之方法中。
如本文所用，「自體」意謂用於治療患者之細胞、細胞株或細胞群係源自該患者。
如本文所用，「同種異體」意謂用於治療患者之細胞或細胞群並非源自該患者，而係源自供體。
如本文中所使用，「治療」為用於獲得有益或所需臨床結果之方法。出於本發明之目的，有利或所需臨床結果包括但不限於以下中之一或多者：減少(或毀壞)贅生性或癌細胞之增殖、抑制贅生性細胞之癌轉移、收縮或減小FLT3表現腫瘤之尺寸、緩解FLT3相關疾病(例如癌症)、減少由FLT3相關疾病(例如癌症)引起之症狀、提高FLT3相關疾病(例如癌症)患者之生活品質、降低所需用於治療FLT3相關疾病(例如癌症)之其他藥物之劑量、延緩FLT3相關疾病(例如癌症)之進程、治癒FLT3相關疾病(例如癌症)及/或延長FLT3相關疾病(例如癌症)患者之存活期。
「改善」意謂相比於不投與FLT3特異性CAR或FLT3特異性CAR T細胞減輕或改善一或多個症狀。「改善」亦包括縮短或降低症狀之持續時間。
如本文中所使用，藥物、化合物或醫藥組合物之「有效劑量」或「有效量」為足以影響任何一或多種有利或所需結果之量。對於預防性用途，有益或所要結果包括消除或降低疾病之風險、減輕疾病之嚴重程度或延緩疾病發作，其中疾病包括疾病、其併發症及在疾病發展期間所呈現之中間病理性表型之生物化學、組織及/或行為症狀。出於醫療用途，有益或所要結果包括諸如以下之臨床結果：降低各種FLT3相關疾病或病狀(諸如多發性骨髓瘤)之一或多個症狀之發生率或將其改善；降低治療疾病所需之其他藥品之劑量；提高另一藥品之效果；及/或延遲患者之FLT3相關疾病之進展。有效劑量可以一或多種投藥形式投與。出於本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量為足以直接或間接實現預防性或治療性治療之量。如在臨床情形下所理解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可或不可連同另一藥物、化合物或醫藥組合物一起達成。因此，「有效劑量」可視為處於投與一或多種治療劑的情形下，且若連同一或多種其他試劑，可達成或已達成所需結果，則單個藥劑可視為以有效量給出。
「個人」、「患者」或「個體」在本文中可互換地使用且係哺乳動物。哺乳動物包括但不限於人類、猴子、豬、其他農畜、運動動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、包括小鼠、大鼠、豚鼠之嚙齒動物等。個體係哺乳動物且在本文中可互換地使用。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，個體係非人類靈長類。在一些實施例中，個體係人類或猴，例如食蟹獼猴。
如本文所用，「載體」意指構築體，其能夠傳遞，且在一些實施例中表現宿主細胞中之一或多個所關注的基因或序列。載體之實例包括但不限於病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑締合之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體，及某些真核細胞，諸如生產細胞。
如本文所用，「表現控制序列」意謂引導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子，諸如構成性或誘導性啟動子；或強化子。表現控制序列可操作地連接於待轉錄之核酸序列。
如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」包括在與活性成分組合時使成分保留生物活性且與個體之免疫系統不具有反應性的任何材料。實例包括但不限於標準醫藥上之載劑中任一者，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)及各種類型之濕潤劑。對於霧劑或非經腸投藥之例示性稀釋劑為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理鹽水(0.9%)。包含此類載劑之組合物藉由熟知之習知方法調配(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A. Gennaro，編，Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990；及Remington, The Science and Practice of Pharmacy第21版，Mack Publishing, 2005)。
如本文所用之術語「kon 」係指CAR之抗體或scFv與抗原締合之速率常數。
如本文所用之術語「koff 」係指CAR之抗體或scFv自抗體/抗原複合物解離之速率常數。
如本文所用之術語「KD 」係指抗體-抗原相互作用或scFv-抗原相互作用之平衡解離常數。
本文中提及「約」某一值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。數值範圍包括界定該範圍之數字。
應理解在本文中任何地方之實施例皆用語言「包含」描述，或亦提供用術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」所描述之類似實施例。
在本發明之態樣或實施例根據馬庫西群組(Markush group)或其他替代分組進行描述的情況下，本發明不僅涵蓋整體列出之整個群組，而且亦個別涵蓋群組之每一成員及主群組之所有可能子組，且亦涵蓋缺乏一或多個群組成員之主群組。本發明亦設想明確排除所主張之發明中之任何群組成員中之一或多者。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬之技術者通常所理解相同之意義。倘若有衝突，本說明書(包括定義)將占主導。在整個本說明書及申請專利範圍中，措詞「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises/comprising)」之變異體應理解為意謂包括所述整數或整數群但不排除任何其他整數或整數群。除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
本文描述例示性方法及物質，但類似或等效於本文所述之方法及物質之方法及物質亦可用於本發明之實踐或測試。該等材料、方法及實例僅具說明性且不希望具限制性。FLT3 抗體
本發明提供結合於FLT3 [例如人類FLT3 (例如寄存編號：NP_004110或SEQ ID NO: 198)]且特徵為具有以下特徵中之任一者或多者的抗體：(a)治療、預防、改善個體中與表現FLT3之惡性細胞相關之病狀(例如諸如AML之癌症)的一或多個症狀；(b)抑制個體(具有表現FLT3之惡性腫瘤)中之腫瘤生長或進展；(c)抑制個體(具有表現FLT3之一或多種惡性細胞)中表現FLT3之癌症(惡性)細胞之癌轉移；(d)誘導表現FLT3之腫瘤之消退(例如長期消退)；(e)發揮表現FLT3之惡性細胞中的細胞毒活性；(f)阻斷與其他尚待鑑別之因素的FLT3相互作用；及/或(g)誘導附近殺滅或抑制非FLT3表現惡性細胞之生長的旁觀者效應。
在一個態樣中，提供特異性結合於FLT3之分離抗體，其中該抗體包含(a)重鏈可變(VH)區，其包含(i)包含示於37、38、39、43、44、45、49、50、54、55、56、60、61、62、66、67、68、72、73、74、78、79、80、84、85、86、90、91、92、96、97、98、102、103、104、108、109、110、114、115、116、120、121、122、126、127、128、132、133、134、138、139、140、246或247中之序列之VH互補決定區1 (CDR1)；(ii)包含示於SEQ ID NO: 40、41、46、47、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76、81、82、87、88、93、94、99、100、105、106、111、112、117、118、123、124、129、130、135、136、141、142、248、249、251、252、253或255中之序列之VH CDR2；及iii)包含示於SEQ ID NO: 42、48、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、245、250或254中之序列之VH CDR3；及/或輕鏈可變(VL)區，其包含(i)包含示於SEQ ID NO: 144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、257、261、263、265、268、270、273或 275中之序列之VL CDR1；(ii)包含示於SEQ ID NO: 145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、259、266或271中之序列之VL CDR2；及(iii)包含示於SEQ ID NO: 146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、256、258、260、262、264、267、269、272或274中之序列之VL CDR3。
在另一態樣中，提供特異性結合於FLT3之分離抗體，其中該抗體包含：包含示於SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中之序列之VH區；及/或包含示於SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中之序列之VL區。
在一些實施例中，提供特異性結合於FLT3之分離抗體，其中抗體包含：包含示於SEQ ID NO: 275、289或291中之序列；及/或包含示於SEQ ID NO: 274、288或290中之序列之VL區。
在一些實施例中，提供具有如表2中所列之部分輕鏈序列中之任一者及/或如表2中所列之部分重鏈序列中之任一者的抗體。
在一些實施例中，本文所述之抗體包含恆定區。在一些實施例中，本文所述之抗體屬於人類IgG1、IgG2或IgG2Δa、IgG3或IgG4子類。在一些實施例中，本文所述之抗體包含糖基化恆定區。在一些實施例中，本文所述之抗體包含具有與一或多種人類Fc γ受體之降低之結合親和力的恆定區。
本文所提供之抗體可涵蓋單株抗體、多株抗體、抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、單鏈(ScFv)及/或人類化抗體。抗體可為小鼠、大鼠、人類或任何其他來源(包括嵌合或人類化抗體)。FLT3 特異性 CAR 及其製備方法
本文提供結合於FLT3 (例如人類FLT3 (例如SEQ ID NO: 198)或寄存編號：NP_004110)之CAR。本文提供之FLT3特異性CAR包括單鏈CAR及多鏈CAR。CAR具有以非MHC限制性方式重引導針對FLT3之T細胞特異性及反應性之能力，採用單株抗體之抗原結合特性。非MHC限制性抗原識別賦予表現CAR之T細胞不依賴抗原加工識別抗原，從而繞過主要的腫瘤逃逸機制的能力。
在一些實施例中，本文中提供之CAR包含胞外配位體結合域(例如單鏈可變片段(scFv))、跨膜域及胞內信號傳導域。在一些實施例中，胞外配位體結合域、跨膜域及胞內信號傳導域係於一個多肽中，亦即於單鏈內。本文亦提供多鏈CAR及多肽。在一些實施例中，多鏈CAR包含：包含跨膜域及至少一個胞外配位體結合域之第一多肽，及包含跨膜域及至少一個胞內信號傳導域之第二多肽，其中該等多肽組合在一起形成多鏈CAR。
在一些實施例中，FLT3特異性多鏈CAR係基於IgE之高親和力受體(FcεRI)。肥大細胞及嗜鹼細胞上所表現之FcεRI會觸發過敏反應。FcεRI係由單個α子單元、單個β子單元及二硫鍵連接之二個γ子單元構成之四聚複合物。α子單元含有IgE結合域。β及γ子單元含有介導信號轉導之ITAM。在一些實施例中，FcRα鏈之胞外域缺失且經FLT3特異性胞外配位體結合域置換。在一些實施例中，多鏈FLT3特異性CAR包含特異性結合於FLT3之scFv、CD8α鉸鏈及FcRβ鏈之ITAM。在一些實施例中，CAR可能包含或可能不包含FcRγ鏈。
在一些實施例中，胞外配位體結合域包含scFv，該scFv包含標靶抗原特異性單株抗體之輕鏈可變(VL)區及重鏈可變(VH)區由可撓性連接子連接。單鏈可變區片段係由使用短連接肽連接輕及/或重鏈可變區製得(Bird等人, Science 242:423-426, 1988)。連接肽之實例係具有胺基酸序列(GGGGS)3 (SEQ ID NO: 232)之GS連接子，其橋接一個可變區之羧基端與另一可變區之胺基端之間約3.5 nm。已設計及使用其他序列之連接子(Bird等人, 1988，見上文)。一般而言，連接子可為短撓性多肽，例如由約20個或更少個胺基酸殘基構成。連接子可繼而經修飾用於其他功能，諸如藥物附著或附著於固體支撐物。可以重組或以合成產生單鏈變異體。對於合成產生scFv，可使用自動化合成器。對於重組產生scFv，可將含有編碼scFv之聚核苷酸之合適質體引入合適的真核(諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞)或原核(諸如大腸桿菌)宿主細胞中。編碼相關scFv之聚核苷酸可藉由諸如接合聚核苷酸之常規操作製造。所得scFv可使用此項技術中已知之標準蛋白質純化技術分離。
FLT3胞外域由5種免疫球蛋白結構域構成，其中結構域5離細胞膜最近，且結構域1最遠(以線性方式；Verstraete, 2011年7月7日; Blood: 118 (1))。五種FLT3胞外結構域之序列列於下表1中。 表1
結構域2-3包含結構域2及結構域3之序列(SEQ ID NO: 254)。
在一些實施例中，本文所述之FLT3特異性CAR之胞外配位體結合域結合於FLT3胞外域之結構域1、2、3、4或5。
在一些實施例中，本文所述之FLT3特異性CAR之胞外配位體結合域結合於FLT3胞外域之結構域1。
在一些實施例中，本文所述之FLT3特異性CAR之胞外配位體結合域結合於FLT3胞外域之結構域2。
在一些實施例中，本文所述之FLT3特異性CAR之胞外配位體結合域結合於FLT3胞外域之結構域3。
在一些實施例中，本文所述之FLT3特異性CAR之胞外配位體結合域結合於FLT3胞外域之結構域4。
在一些實施例中，本文所述之FLT3特異性CAR之胞外配位體結合域結合於FLT3胞外域之結構域5。
在一些實施例中，本文所述之FLT3特異性CAR之胞外配位體結合域結合於FLT3胞外域之結構域2-3。
在一些實施例中，本文所述之FLT3特異性CAR之胞外配位體結合域結合於FLT3胞外域之結構域2-3或4。
在另一態樣中，提供特異性結合於FLT3之CAR，其中CAR包含胞外配位體結合域，其包含：具有示於SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中之序列之VH區；及/或具有示於SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中之序列之VL區。在一些實施例中，VH及VL藉由可撓性連接子連接在一起。在一些實施例中，可撓性連接子包含示於SEQ ID NO: 232中之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供FLT3特異性嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外配位體結合域、第一跨膜域及胞內信號傳導域，其中該胞外域包含單鏈Fv片段(scFv)，該單鏈Fv片段(scFv)包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中該VH區包含(i)具有示於SEQ ID NO: 37、38、39、43、44、45、49、50、54、55、56、60、61、62、66、67、68、72、73、74、78、79、80、84、85、86、90、91、92、96、97、98、102、103、104、108、109、110、114、115、116、120、121、122、126、127、128、132、133、134、138、139、140、294、295、296、300、301、305、306、307、311、312、316、317或318中之胺基酸序列之VH互補決定區1 (CDR1)；(ii)具有示於SEQ ID NO: 40、41、46、47、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76、81、82、87、88、93、94、99、100、105、106、111、112、117、118、123、124、129、130、135、136、141、142、297、298、302、303、308、309、313、314、319、320或322中之胺基酸序列之VH互補決定區2 (CDR2)；及(iii)具有示於SEQ ID NO: 42、48、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、299、304、310、315或321中之胺基酸序列之VH互補決定區3 (CDR3)。
在另一態樣中，提供FLT3特異性嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外配位體結合域、第一跨膜域及胞內信號傳導域，其中該胞外域包含單鏈Fv片段(scFv)，該單鏈Fv片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中該VL區包含(i)具有示於SEQ ID NO: 144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、323、326、328、331、336、338、340、343、345、348或350中之胺基酸序列之VL互補決定區1 (CDR1)；(ii)具有示於SEQ ID NO: 145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、324、329、332、334、341或346中之胺基酸序列之VL互補決定區2 (CDR2)；及(iii)具有示於SEQ ID NO: 146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、325、327、330、333、335、337、339、342、344、347或349中之胺基酸序列之VL互補決定區3 (CDR3)。 在另一態樣中，提供FLT3特異性嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外配位體結合域、第一跨膜域及胞內信號傳導域，其中該胞外域包含單鏈Fv片段(scFv)，該單鏈Fv片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中(a) VH區包含(i)具有示於SEQ ID NO: 37、38、39、43、44、45、49、50、54、55、56、60、61、62、66、67、68、72、73、74、78、79、80、84、85、86、90、91、92、96、97、98、102、103、104、108、109、110、114、115、116、120、121、122、126、127、128、132、133、134、138、139、140、294、295、296、300、301、305、306、307、311、312、316、317或318中之胺基酸序列之VH互補決定區1 (CDR1)；(ii)具有示於SEQ ID NO: 40、41、46、47、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76、81、82、87、88、93、94、99、100、105、106、111、112、117、118、123、124、129、130、135、136、141、142、297、298、302、303、308、309、313、314、319、320或322中之胺基酸序列之VH互補決定區2 (CDR2)；及(iii)具有示於SEQ ID NO: 42、48、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、299、304、310、315或321中之胺基酸序列之VH互補決定區3 (CDR3)；且(b) VL區包含(i)具有示於SEQ ID NO: 144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、323、326、328、331、336、338、340、343、345、348或350中之胺基酸序列之VL互補決定區1 (CDR1)；(ii)具有示於SEQ ID NO: 145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、324、329、332、334、341或346中之胺基酸序列之VL互補決定區2 (CDR2)；及(iii)具有示於SEQ ID NO: 146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、325、327、330、333、335、337、339、342、344、347或349中之胺基酸序列之VL互補決定區3 (CDR3)。
在一些實施例中，本發明之CAR包含胞外配位體結合域，其具有表2中所列之部分輕鏈序列中之任一者及/或表2中所列之部分重鏈序列中之任一者。
在表2中，帶下劃線之序列係根據Kabat之CDR序列且呈粗體之序列係根據Chothia，除了 P4F6、P4C7、P3A1、P5A3、P9B5、P9F1、P1B4、P1B11、P7H3、P3E10、P1A5、P5F7、P4H11、P15F7、P12B6、P8B6、P14G2及P7F9之重鏈CDR2序列，其中Chothia CDR序列帶下劃線且Kabat CDR序列呈粗體。 表2
本文亦提供對FLT3之抗體之抗原結合結構域的CDR部分或對FLT3之CAR之胞外配位體結合域的CDR部分(包括Chothia、Kabat CDR及CDR接觸區)。此項技術中完全能夠測定CDR區。應理解在一些實施例中，CDR可為Kabat及Chothia CDR之組合(亦稱為「組合CR」或「延長CDR」)。在一些實施例中，CDR係Kabat CDR。在其他實施例中，CDR係Chothia CDR。換言之，在具有超過一種CDR之實施例中，CDR可為Kabat、Chothia、組合CDR或其組合中之任一者。表3提供本文中提供之CDR序列之實例。 表3
本發明涵蓋表2中所示之本發明CAR及變異體之修飾，包括具有不顯著影響其特性之修飾之功能上等效CAR及具有增強或降低之活性及/或親和力之變異體。舉例而言，胺基酸序列可突變以獲得具有對FLT3之所需結合親和力之抗體。多肽修飾為此項技術中之常規實踐且不必在本文中詳細描述。經修飾多肽之實例包括具有胺基酸殘基之保守取代、胺基酸之一或多個缺失或添加的多肽，該等胺基酸不使功能活性產生顯著有害變化，或其使多肽對其配位體之親和力或化學類似物之使用成熟(增強)。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或多於一百個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或與抗原決定基標籤融合之抗體。抗體分子之其他插入型變異體包括與抗體在血液循環中之半衰期增加的酶或多肽之抗體的N或C端的融合體。
取代變異體將抗體分子中之至少一個胺基酸殘基移除且將不同殘基插入其位置。受到最大關注之取代型突變誘發位點包括高變區，但亦涵蓋FR變化。保守取代示於標題為「保守取代」之表4中。若此類取代導致生物活性變化，則可引入表4中命名為「例示性取代」或如下文關於胺基酸類別所進一步描述之更多實質性變化，且篩檢產物。 表4：胺基酸取代
在一些實施例中，本文中提供包含結合於FLT3且與本文所述之CAR競爭結合於FLT3之胞外配位體結合域的CAR，其包括包含胞外域之CAR，該胞外域包含P4F6、P4C7、P3A1、P5A3、P9B5、P9F1、P1B4、P1B11、P7H3、P3E10、P1A5、P5F7、P4H11、P15F7、P12B6、P8B6、P14G2、P7F9、P08B06EE、P04A04、P01A05、P08B03、P5F7g、P10A02g、P10A04g、P10A05g、P10A07g、P10B03g、P10B06g、P5F7g2、P5F7g3及P5F7g4。
在一些實施例中，本文中提供特異性結合於FLT3之CAR，其中該CAR包含：包含示於SEQ ID NO: 4中之序列之VH區；及/或包含示於SEQ ID NO: 3中之序列之VL區。在一些實施例中，本文中提供特異性結合於FLT3之CAR，其中該CAR包含：包含示於SEQ ID NO: 6中之序列之VH區；及/或包含示於SEQ ID NO: 5中之序列之VL區。在一些實施例中，本發明提供特異性結合於FLT3之CAR，其中該CAR包含：包含示於SEQ ID NO: 10中之序列之VH區；及/或包含示於SEQ ID NO: 9中之序列之VL區。在一些實施例中，本文中提供特異性結合於FLT3之CAR，其中該CAR包含：包含示於SEQ ID NO: 20中之序列之VH區；及/或包含示於SEQ ID NO: 19中之序列之VL區。
在一些實施例中，本發明亦提供CAR，其包含基於CDR接觸區對FLT3抗體之抗體之CDR部分。CDR接觸區為賦予抗體對抗原之特異性的抗體區域。一般而言，CDR接觸區包括CDR中之殘基位置及游標區(Vernier zone)，其經限定以維持抗體結合特定抗原之適當環結構。參見例如Makabe等人, J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2007。此項技術中完全能夠測定CDR接觸區。
如本文所述之FLT3特異性CAR之配位體結合域對FLT3 (諸如人類FLT3 (例如(SEQ ID NO: 198))之結合親和力(KD )可為例如約0.1至約1000 nM、例如在約0.5nM與約500 nM之間或例如在約1 nM與約250 nM之間。在一些實施例中，結合親和力為約1000 nm、750 nm、500 nm、400 nm、300 nm、250 nm、200 nM、100 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、45 nM、40 nM、35 nM、30 nM、25 nM、20 nM、19 nm、18 nm、17 nm、16 nm、15 nM、10 nM、8 nM、7.5 nM、7 nM、6.5 nM、6 nM、5.5 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.5 nM、0.3 nM或0.1 nM中之任一者。
在一些實施例中，如本文所述之FLT3特異性CAR之配位體結合域的scFv對FLT3之結合親和力(KD )為約10 nM至約100 nM、約10 nM至約90 nM、約10 nM至約80 nM、約20 nM至約70 nM、約25 nM至約75 nM或約40 nM至約110 nM。在一個實施例中，此段落中所描述之scFv之結合親和力係針對人類FLT3。
在一些實施例中，如本文所述之FLT3特異性CAR之配位體結合域的scFv對人類FLT3之胞外域之結構域4的結合親和力(KD )為約1 nM至約100 nM、約10 nM至約100 nM、約20 nM至約100 nM、約25 nM至約105 nM、約40 nM至約80 nM、約40 nM至約100 nM或約50 nM至約100 nM。
在一些實施例中，如本文所述之FLT3特異性CAR之配位體結合域的scFv對人類FLT3之胞外域之結構域2-3的結合親和力(KD )為約5 nM至30 nM、約5 nM至約25 nM、約10 nM至約30 nM、約10 nM至約40 nM或約10 nM至約25 nM。
在一例示性實施例中，如實例1所揭示量測scFv之KD 。
在一些實施例中，結合親和力小於約以下中之任一者：1000 nm、900 nm、800 nm、250 nM、200 nM、100 nM、50 nM、30 nM、20 nM、10 nM、7.5 nM、7 nM、6.5 nM、6 nM、5 nM。單株抗體特異性抗原決定基
在一些實施例中，本文所揭示之FLT3特異性CAR中之任一者的胞外域可包含對單株抗體具有特異性(亦即由其特異性識別)之一或多種抗原決定基。此等抗原決定基在本文中亦稱為mAb特異性抗原決定基。在此等實施例中，胞外域包含特異性結合於FLT3之VH及VL多肽及結合於一或多種單株抗體(mAb)之一或多種抗原決定基。包含mAb特異性抗原決定基之CAR可為單鏈或多鏈。
在本文所述之CAR之胞外域中包括對單株抗體具有特異性之抗原決定基允許分選及清除表現CAR之經工程改造之免疫細胞。在一些實施例中，此特徵亦促進藉由投與表現CAR之經工程改造之免疫細胞清除之內源性FLT3表現細胞的恢復。
因此，在一些實施例中，本發明係關於一種用於分選及/或清除具有包含mAb特異性抗原決定基之CAR的經工程改造之免疫細胞之方法及一種用於促進內源性FLT3表現細胞，諸如骨髓祖細胞恢復之方法。
可使用若干抗原決定基單株抗體偶合產生包含單株抗體特異性抗原決定基之CAR；詳言之，已經過批准用於醫療用途之彼等，諸如作為非限制性實例之CD20抗原決定基/利妥昔單抗。
在一些實施例中，對抗原決定基具有特異性之單株抗體可與細胞毒性藥物結合。亦有可能藉由使用接枝補體系統之組分的經工程改造之抗體促進CDC細胞毒性。在一些實施例中，可藉由使用識別抗原決定基之抗體清除細胞來調節CAR-T細胞之活化。
本發明亦涵蓋用於分選具有表現mAb特異性抗原決定基之FLT3特異性CAR的經工程改造之免疫細胞之方法及治療方法，在該治療方法中，具有此等CAR之經工程改造之免疫細胞的活化係藉由使用靶向該等CAR之外部配位體結合域之抗體清除細胞來調節。
包含由單株抗體特異性識別之一或多種抗原決定基之CAR揭示於以全文引用之方式併入本文中之WO2016/120216中。抗原決定基可選自此項技術中已知之任何數目之抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基可為經批准用於醫療用途之單株抗體之標靶，諸如但不限於由利妥昔單抗識別之CD20抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基包含示於SEQ ID NO: 229中之胺基酸序列。 CPYSNPSLC (SEQ ID NO: 229)
在一些實施例中，抗原決定基可位於scFv與CAR之鉸鏈之間。在一些實施例中，由連接子分離之同一抗原決定基之兩個實例可用於CAR中。舉例而言，如GSGGGGSCPYSNPSLC SGGGGSCPYSNPSLC SGGGGS (SEQ ID NO: 230)中所展示，由連接子分離之包含示於SEQ ID NO: 229中之抗原決定基的2個複本之多肽可用於CAR內，位於輕鏈可變區與鉸鏈之間。
在一些實施例中，視抗原決定基之插入位置及連接子之用途而定，包含VH及VL多肽及mAb特異性抗原決定基之CAR之胞外結合結構域可具有不同結構。舉例而言，包含mAb特異性抗原決定基之FLT3特異性CAR之胞外結合結構域可具有以下結構之一： V1 -L1 -V2 -(L)x -抗原決定基1-(L)x -； V1 -L1 -V2 -(L)x -抗原決定基1-(L)x -抗原決定基2-(L)x -； V1 -L1 -V2 -(L)x -抗原決定基1-(L)x -抗原決定基2-(L)x -抗原決定基3-(L)x -； (L)x -抗原決定基1-(L)x -V1 -L1 -V2 ； (L)x -抗原決定基1-(L)x -抗原決定基2-(L)x -V1 -L1 -V2 ； 抗原決定基1-(L)x -抗原決定基2-(L)x -抗原決定基3-(L)x -V1 -L1 -V2 ； (L)x -抗原決定基1-(L)x -V1 -L1 -V2 -(L)x -抗原決定基2-(L)x ； (L)x -抗原決定基1-(L)x -V1 -L1 -V2 -(L)x -抗原決定基2-(L)x -抗原決定基3-(L)x -； (L)x -抗原決定基1-(L)x -V1 -L1 -V2 -(L)x -抗原決定基2-(L)x -抗原決定基3-(L)x -抗原決定基4-(L)x -； (L)x -抗原決定基1-(L)x -抗原決定基2-(L)x -V1 -L1 -V2 -(L)x -抗原決定基3-(L)x -； (L)x -抗原決定基1-(L)x -抗原決定基2-(L)x -V1 -L1 -V2 -(L)x -抗原決定基3-(L)x -抗原決定基4-(L)x -； V1 -(L)x -抗原決定基1-(L)x -V2 ； V1 -(L)x -抗原決定基1-(L)x -V2 -(L)x -抗原決定基2-(L)x ； V1 -(L)x -抗原決定基1-(L)x -V2 -(L)x -抗原決定基2-(L)x -抗原決定基3-(L)x ； V1 -(L)x -抗原決定基1-(L)x -V2 -(L)x -抗原決定基2-(L)x -抗原決定基3-(L)x -抗原決定基4-(L)x ； (L)x -抗原決定基1-(L)x -V1 -(L)x -抗原決定基2-(L)x -V2 ；或 (L)x -抗原決定基1-(L)x -V1 -(L)x -抗原決定基2-(L)x -V2 -(L)x -抗原決定基3-(L)x ； 其中 V1 係VL 且V2 係VH 或V1 係VH 且V2 係VL ； L1 係適合於將VH 連接至VL 鏈之連接子； L係包含甘胺酸及絲胺酸殘基之連接子，胞外結合結構域中之L之每次出現可與同一胞外結合結構域中之L之其他出現相同或不同，例如SGGGG、GGGGS或SGGGGS且 x係0或1且x之每次出現獨立於其他者選擇；且 抗原決定基1、抗原決定基2、抗原決定基3及抗原決定基4係mAb特異性抗原決定基且可相同或不同。在一些實施例中，抗原決定基1、抗原決定基2及抗原決定基4係具有SEQ ID NO: 229之胺基酸序列之mAb特異性抗原決定基且抗原決定基3係具有SEQ ID NO: 231之胺基酸序列之mAb特異性抗原決定基。
在一些實施例中，CAR之胞外結合結構域包含以下序列 V1 -L1 -V2 -(L)x -抗原決定基1-(L)x -抗原決定基2-(L)x -；或 (L)x -抗原決定基1-(L)x -V1 -L1 -V2 -(L)x -抗原決定基2-(L)x -抗原決定基3-(L)x -抗原決定基4-(L)x -。其中V1 、V2 、L1 、L、x及抗原決定基1、抗原決定基2、抗原決定基3及抗原決定基4如上文所定義。
在一些實施例中，本文所揭示之FLT3特異性CAR中之任一者可包含選自以下之一或多種mAb特異性抗原決定基：CD52抗原決定基、CD20抗原決定基、CD3抗原決定基、CD41抗原決定基、CD25抗原決定基、CD30抗原決定基、EGFR抗原決定基、TNFα抗原決定基、VEGF抗原決定基、補體蛋白C5抗原決定基、CD11a抗原決定基、CD33抗原決定基、α-4整合素抗原決定基、IgE Fc區抗原決定基、RSV蛋白F抗原決定基、IL-6受體抗原決定基、HER2受體抗原決定基、整合素α4 β7 抗原決定基、BAFF (B細胞活化因子)抗原決定基、IL-1β抗原決定基、RANKL抗原決定基、CTLA4抗原決定基、CD34抗原決定基、IL-12抗原決定基、IL-23抗原決定基。
在一些實施例中，本文所揭示之FLT3特異性CAR可包含選自由以下各者特異性識別之抗原決定基之一或多種mAb特異性抗原決定基：阿侖單抗(alemtuzumab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、莫羅單抗-CD3 (muromonab-CD3)、托西莫單抗(tositumomab)、阿昔單抗(abciximab)、巴利昔單抗(basiliximab)、本妥昔單抗維多汀(brentuximab vedotin)、西妥昔單抗(cetuximab)、英夫利昔單抗(infliximab)、利妥昔單抗(rituximab)、貝伐單抗(bevacizumab)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)、達利珠單抗(daclizumab)、艾庫組單抗(eculizumab)、艾法珠單抗(efalizumab)、吉妥單抗(gemtuzumab)、那他珠單抗(natalizumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、托西利單抗(tocilizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、阿達木單抗(adalimumab)、貝利單抗(belimumab)、卡納單抗(canakinumab)、地諾單抗(denosumab)、戈利木單抗(golimumab)、伊匹利單抗(ipilimumab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、帕尼單抗(panitumumab)、QBEND-10及/或優特克單抗(ustekinumab)。
在一些實施例中，FLT3特異性CAR包含選自表5中揭示之抗原決定基之一或多種mAb特異性抗原決定基： 表5：可用於本發明之FLT3特異性CAR之胞外結合結構域的mAb特異性抗原決定基之實例，諸如具有其對應mAb之模擬位及抗原決定基
根據本發明之CAR之胞內信號傳導域負責在胞外配位體結合域結合於標靶之後胞內信號傳導，從而引起免疫細胞活化及免疫反應。胞內信號傳導域能夠活化表現CAR之免疫細胞之正常效應功能中的至少一者。舉例而言，T細胞之效應功能可為細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞介素之分泌。
在一些實施例中，用於CAR之胞內信號傳導域可為以下各者之細胞質序列：例如但不限於共同作用以在抗原受體結合之後起始信號轉導之T細胞受體及輔受體，以及此等序列之任何衍生物或變異體及具有相同功能能力之任何合成序列。胞內信號轉導域包含兩個不同種類之細胞質信號傳導序列：起始抗原依賴性初級活化之序列，及以獨立於抗原之方式起作用以提供二級或共刺激信號之序列。初級細胞質信號傳導序列可包含信號傳導基元，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元ITAM。ITAM係在多種受體之細胞質內尾中發現的充當syk/zap70類酪胺酸激酶之結合位點的明確界定之信號傳導基元。用於本發明之ITAM之實例可包括(作為非限制性實例)來源於TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之彼等。在一些實施例中，CAR之胞內信號傳導域可包含CD3ζ信號傳導域，其具有與示於SEQ. ID NO: 210中之胺基酸序列至少約70%、例如至少80%或至少90%、95%、97%或99%之胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之CAR之胞內信號傳導域包含共刺激分子之結構域。
在一些實施例中，本發明之CAR之胞內信號傳導域包含選自由41BB (基因銀行：AAA53133.)及CD28 (NP_006130.1)之片段組成之群的共刺激分子之一部分。在一些實施例中，本發明之CAR之胞內信號傳導域包含以下胺基酸序列：其包含與示於SEQ. ID NO: 209及SEQ. ID NO: 213中之胺基酸序列至少70%、例如至少80%或至少90%、95%、97%或99%的序列一致性。在一些實施例中，本發明之CAR之胞內信號傳導域包含以下胺基酸序列：其包含與示於SEQ. ID NO: 209及SEQ. ID NO: 214中之胺基酸序列至少70%、例如至少80%或至少90%、95%、97%或99%的序列一致性。
CAR表現在細胞之表面膜上。因此，CAR可包含跨膜域。本文所揭示之CAR之合適跨膜域能夠(a)在細胞表面處表現，該細胞例如免疫細胞，諸如但不限於淋巴球細胞或自然殺手(NK)細胞，及(b)與配位體結合域及胞內信號傳導域相互作用以針對預定靶細胞引導免疫細胞之細胞反應。跨膜域可來源於天然來源或合成來源。跨膜域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。作為非限制性實例，跨膜多肽可為T細胞受體之子單元，諸如α、β、γ或δ；構成CD3複合物之多肽；IL2受體p55 (α鏈)；p75 (β鏈)或γ鏈；Fc受體之子單元鏈，特定言之，Fcγ受體III；或CD蛋白質。可替代地，跨膜域可為合成的且可主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。在一些實施例中，該跨膜域來源於人類CD8α鏈(例如NP_001139345.1)。
跨膜域藉由莖結構域(亦稱為鉸鏈結構域)連接至胞外配位體結合域。莖結構域可包含達至300個胺基酸，例如10至100個胺基酸或25至50個胺基酸。莖區可來源於天然存在之分子的全部或一部分，諸如來源於CD8、CD4或CD28之胞外區之全部或一部分，或來源於抗體恆定區之全部或一部分。可替代地，莖結構域可為對應於天然存在之莖序列的合成序列，或可為完全合成之莖序列。在一些實施例中，該莖結構域係人類CD8α鏈之部分(例如NP_001139345.1)。在另一特定實施例中，該跨膜及鉸鏈結構域包含人類CD8α鏈之部分，例如其包含與選自由SEQ ID NO: 206及208組成之群之胺基酸序列至少70%或至少80%或至少90%、95%、97%或99%的序列一致性。在一些實施例中，本文所述之FLT3特異性CAR之莖結構域包含CD8α鉸鏈、IgG1鉸鏈或FcγRIIIα鉸鏈。在一些實施例中，莖結構域包含人類CD8α鉸鏈、人類IgG1鉸鏈或人類FcγRIIIα鉸鏈。在一些實施例中，本文所揭示之CAR可包含特異性結合FLT3之胞外配位體結合域、CD8α人類鉸鏈及跨膜域、CD3ζ信號傳導域、及4-1BB信號傳導域。
表6提供可用於本文所揭示之CAR之結構域的例示性序列。 表6：CAR組分之例示性序列
通常在癌細胞中觀測到靶抗原之下調或突變，由此產生抗原損失之逃逸變異體(escape variant)。因此，為抵消腫瘤逃逸且使免疫細胞對標靶更具特異性，FLT3特異性CAR可包含一或多個額外的胞外配位體結合域，以同時結合標靶中之不同元件進而增強免疫細胞活化及功能。在一些實施例中，該等胞外配位體結合域可串聯置放於同一跨膜多肽上，且可視情況藉由連接子隔開。在一些實施例中，該等不同胞外配位體結合域可置放於構成CAR之不同跨膜多肽上。在一些實施例中，本發明係關於CAR之群體，各CAR包含不同胞外配位體結合域。詳言之，本發明係關於工程改造免疫細胞之方法，其包含提供免疫細胞且在細胞之表面處表現CAR之群體，各CAR包含不同胞外配位體結合域。在另一特定實施例中，本發明係關於一種工程改造免疫細胞之方法，其包含提供免疫細胞及在該細胞中引入編碼構成CAR群體之多肽的聚核苷酸，該CAR群體各自包含不同胞外配位體結合域。CAR群體意謂至少兩個、三個、四個、五個、六個或超過六個CAR，其各自包含不同胞外配位體結合域。根據本發明之不同胞外配位體結合域可例如同時結合標靶中之不同元件，由此加強免疫細胞活化及功能。本發明亦係關於一種分離之免疫細胞，其包含CAR群體，該CAR群體各自包含不同胞外配位體結合域。
在另一態樣中，本文提供編碼CAR中之任一者之聚核苷酸及本文所述之多肽。聚核苷酸可藉由此項技術中已知之程序製造及表現。
在另一態樣中，本文提供包含本發明之細胞中之任一者的組合物(諸如醫藥組合物)。在一些實施例中，該組合物包含以下細胞：其包含編碼本文所述之CAR中之任一者的聚核苷酸。在另其他實施例中，該組合物包含示於下文SEQ ID NO: 245及SEQ ID NO: 246中之聚核苷酸之任一者或兩者。P3E10 重鏈可變區 P3E10 輕鏈可變區
在另其他實施例中，該組合物包含示於下文SEQ ID NO: 247及SEQ ID NO: 248中之聚核苷酸之任一者或兩者。P3A1 重鏈可變區 P3A1 輕鏈可變區 。
在另其他實施例中，該組合物包含示於下文SEQ ID NO: 249及SEQ ID NO: 250中之聚核苷酸之任一者或兩者：P9B5 重鏈可變區 。P9B5 輕鏈可變區 。
在另其他實施例中，該組合物包含示於下文SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 252中之聚核苷酸之任一者或兩者：P4C7 重鏈可變區 P4C7 輕鏈可變區
本文進一步描述聚核苷酸組合物之表現載體及投藥。
在另一態樣中，本文中提供製備本文所述之聚核苷酸中之任一者的方法。
本發明亦涵蓋與任何此類序列互補之聚核苷酸。聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股，且可為DNA (基因組、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其含有內含子且以一對一方式對應於DNA分子；及mRNA分子，其不含內含子。額外編碼或非編碼序列可能(但不必須)存在於本發明之聚核苷酸內，且聚核苷酸可能(但不必須)連接至其他分子及/或支撐物質。
聚核苷酸可包含天然序列(亦即，編碼抗體或其部分之內源序列)或可包含此類序列之變異體。聚核苷酸變異體含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入以使得經編碼之多肽之免疫反應性相對於天然免疫反應性分子不降低。對於經編碼之多肽之免疫反應性的影響可通常如本文所描述評估。變異體一般展現與編碼天然抗體或其部分之聚核苷酸序列至少約70%之一致性或至少約80%之一致性或甚至至少約90%或95%之一致性。
在如下文所述之最大對應比對時，若兩個序列中之核苷酸或胺基酸序列相同，則兩個聚核苷酸或多肽序列稱為「一致」。兩個序列之間的比較通常藉由在比較窗口比較序列以鑑別且比較局部區之序列相似性來進行。如本文中所使用之「比較窗口」係指至少約20鄰近位置，通常30至約75，或40至約50之片段，其中兩個序列經最佳比對之後，序列可與鄰接位置之相同數目的參考序列相比較。
用於比較之最佳序列比對可使用生物資訊軟體之Lasergene套件中之Megalign程式(DNASTAR, Inc., Madison, WI)使用預設參數來進行。此程序體現以下參考文獻中描述之若干比對方案：Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships。在Dayhoff, M.O. (編) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC 第5卷, 第3增刊, 第345-358頁；Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes 第626-645頁 Methods in Enzymology 第183卷, Academic Press, Inc., San Diego, CA；Higgins, D.G.及Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153；Myers, E.W.及Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17；Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105；Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425；Sneath, P.H.A.及Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA；Wilbur, W.J.及Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730中。
一般而言，「序列一致性之百分比」係藉由在至少20位置之比較窗口比較兩個最佳比對序列，其中相比於用於最佳比對兩個序列之參考序列(其不包含添加或缺失)，比較窗口中之聚核苷酸或多肽序列之部分可包含20%或更少、通常5至15%或10至12%之添加或缺失(亦即空隙)。百分比藉由以下計算：測定在兩個序列中出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基之位置的數目以獲得匹配位置數，藉由參考序列中之位置之總數目除以匹配位置數(亦即窗口尺寸)且使結果乘以100以獲得序列一致性百分比。
變異體亦可或者實質上與天然基因或其部分或互補序列同源。此類聚核苷酸變異體在適當嚴格條件下能夠與編碼天然抗體(或互補序列)之天然產生DNA序列雜交。
適合的「適度嚴格條件」包括在5 X SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)之溶液中預洗滌；在50℃-65℃、5 X SSC下雜交隔夜；接著在65℃下用含有0.1% SDS之2X、0.5X及0.2X SSC中之每一者洗滌兩次，歷時20分鐘。
如本文中所使用，「高度嚴格條件」或「較高嚴格度條件」如下：(1)使用低離子強度及高溫用於洗滌，例如在50℃下0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交期間使用變性劑，諸如甲醯胺，例如在42℃下具有0.1%牛血清白蛋白之50% (v/v)甲醯胺/0.1%菲科爾(Ficoll)/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/具有750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉之pH 6.5的50 mM磷酸鈉緩衝液；或(3)在42℃下使用50%甲醯胺、5 x SSC (0.75 M NaCl，0.075 M檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 x Denhardt氏溶液、音波處理鮭魚精子DNA (50 µg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，其中在42℃下在0.2 x SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)中及在55℃下在50%甲醯胺中洗液，隨後在55℃下用由含EDTA之0.1 x SSC組成的較高嚴格度洗液洗滌。熟練技術人員將知道如何視需要調節溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及其類似物之因素。
一般熟習此項技術者將瞭解，由於基因密碼之簡併，存在許多編碼如本文所描述之多肽之核苷酸序列。一些此等聚核苷酸攜帶與任何天然基因之核苷酸序列之最小同源性。儘管如此，本發明尤其預期因密碼子使用差異而改變之聚核苷酸。此外，包含本文所提供之聚核苷酸序列之基因的對偶基因在本發明範疇內。對偶基係由於核苷酸之一或多個突變(諸如缺失、添加及/或取代)而變化的內源基因。所得mRNA及蛋白質可(但不必須)具有變化的結構或功能。對偶基因可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)來識別。
本發明之聚核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學聚核苷酸合成方法在此項技術中熟知且無需詳細描述於本文中。熟習此項技術者可使用本文所提供之序列及商用DNA合成器以產生所需DNA序列。
為使用重組方法製備聚核苷酸，包含所需序列之聚核苷酸可插入適合載體中，且繼而載體可引入適合宿主細胞中進行複製及擴增，如本文中進一步論述。聚核苷酸可藉由此項技術中已知任何方法插入宿主細胞中。細胞藉由利用直接吸收、內吞作用、轉染、F-配對或電穿孔將外源性聚核苷酸引入來轉型。一旦引入，外源性聚核苷酸可作為非整合載體(諸如質體)維持在細胞內或整合至宿主細胞基因組中。如此擴增之聚核苷酸可藉由此項技術中熟知之方法自宿主細胞分離。參見例如Sambrook等人, 1989。
可替代地，PCR允許DNA序列複製。PCR技術在此項技術中熟知且描述於美國專利第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號及第4,683,202號以及PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis等人編, Birkauswer Press, Boston, 1994。
RNA可藉由使用適當載體中之經分離DNA且將其插入適合宿主細胞內獲得。當細胞複製且DNA轉錄至RNA時，可隨後使用熟習此項技術者熟知方法分離RNA，例如，如Sambrook等人,1989前述所闡述。
適合選殖載體可根據標準技術構築，或可選自大量在此項技術中可供使用之選殖載體。雖然所選選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞變化，但適用選殖載體將一般能夠自我複製，可具有特定限制核酸內切酶之單一標靶，及/或可載有可用於選擇含有載體之純系的標記物之基因。適合實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript (例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體，諸如pSA3及pAT28。此等及許多其他選殖載體可購自諸如BioRad、Strategene及Invitrogen之商業供應商。
表現載體通常為含有根據本發明之聚核苷酸之可複製聚核苷酸構築體。暗示表現載體作為游離基因體或作為染色體DNA之整體部分在宿主細胞中必須為可複製的。適合表現載體包括(但不限於)質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體及PCT公開案第WO 87/04462號中所揭示之表現載體。載體組分可一般包括(但不限於)以下一或多者：信號序列；複製起點；一或多種標記物基因；適合轉錄控制元件(諸如啟動子、強化子及終止子)。對於表現(亦即轉譯)，亦通常需要一或多種轉譯控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯啟動位點及終止密碼子。
含有所關注聚核苷酸之載體可藉由許多適當手段中之任一者引入宿主細胞中，該等手段包括電穿孔、採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-右旋糖苷或其他物質之轉染；微彈轟擊；脂質體轉染；及感染(例如其中載體為諸如痘瘡病毒之傳染劑)。引入載體或聚核苷酸之選擇將常常視宿主細胞之特徵而定。
編碼本文所揭示之FLT3特異性CAR之聚核苷酸可存在於表現卡匣或表現載體中(例如用於引入至細菌宿主細胞中之質體或諸如用於轉染昆蟲宿主細胞之桿狀病毒載體的病毒載體，或諸如用於轉染哺乳動物宿主細胞之慢病毒之質體或病毒載體)。在一些實施例中，聚核苷酸或載體可包括編碼核糖體跳躍序列之核酸序列，諸如但不限於編碼2A肽之序列。2A肽係在小核糖核酸病毒之口蹄疫病毒亞群中鑑別，其引起核糖體自一個密碼子「跳躍」至下一密碼子，同時不會在由該等密碼子編碼之兩個胺基酸之間形成肽鍵(參見(Donnelly及Elliott 2001；Atkins, Wills等人 2007；Doronina, Wu等人 2008))。「密碼子」意謂mRNA上(或在DNA分子之有義股上)由核糖體轉譯成一個胺基酸殘基之三個核苷酸。因此，當兩個多肽藉由同框之2A寡肽序列隔開時，可由mRNA內之單一、相鄰開放閱讀框架合成該等多肽。此類核糖體跳躍機制為此項技術中所熟知且已知將由表現由單一信使RNA編碼之若干蛋白質的若干載體所使用。
為將跨膜多肽引導至宿主細胞之分泌路徑中，在一些實施例中，分泌信號序列(又稱為前導序列、前原序列或前序列)以聚核苷酸序列或載體序列形式提供。分泌信號序列可操作地連接於跨膜核酸序列，亦即，兩個序列接合於正確閱讀框架中且經安置以將新合成之多肽引導至宿主細胞之分泌路徑中。分泌信號序列通常安置在編碼所關注多肽之核酸序列的5'端，不過某些分泌信號序列可安置在所關注核酸序列中之其他地方(參見例如，Welch等人, 美國專利第5,037,743號；Holland等人, 美國專利第5,143,830號)。在一些實施例中，信號肽包含示於SEQ ID NO: 204或215中之胺基酸序列。熟習此項技術者將認識到，考慮到遺傳密碼之簡併性，在此等聚核苷酸分子中可能存在相當大的序列變化。在一些實施例中，本發明之核酸序列經密碼子優化以在哺乳動物細胞中表現，例如在靈長類動物(例如人類或猴)細胞中表現。密碼子優化係指在給定物種之高度表現基因中一般罕見的所關注之密碼子序列經此類物種之高度表現基因中一般常見之密碼子替換，此類密碼子編碼與所替換之密碼子相同的胺基酸。工程改造免疫細胞之方法
本文中提供製備用於免疫療法之免疫細胞之方法。在一些實施例中，該等方法包含獲得免疫細胞，將根據本發明之CAR引入免疫細胞，及擴增細胞。在一些實施例中，本發明係關於工程改造免疫細胞之方法，其包含：提供細胞及在細胞之表面處表現如上文所述之至少一種CAR。用於工程改造免疫細胞之方法描述於例如PCT專利申請公開案第WO/2014/039523號、第WO/2014/184741號、第WO/2014/191128號、第WO/2014/184744號及第WO/2014/184143號中，該等申請案各自以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，該方法包含：用編碼如上文所述之CAR之至少一種聚核苷酸轉染細胞，及在細胞中表現聚核苷酸。
在工程改造細胞之前，細胞源可經由多種非限制性方法獲自個體。細胞可獲自眾多非限制性來源，包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、肋膜積液、脾組織及腫瘤。在一些實施例中，可使用可供使用且熟習此項技術者已知之任何數目之T細胞株。在一些實施例中，細胞可來源於健康供體或來源於患有疾病或病症之供體，例如診斷患有癌症之個體或來源於診斷患有感染之個體。在一些實施例中，細胞可為呈現不同表現型特徵之混合細胞群之部分。
在一些實施例中，聚核苷酸存在於慢病毒載體中以在細胞中穩定表現。
在一些實施例中，該方法可進一步包含藉由破壞或不活化至少一種基因來基因修飾細胞之步驟，該基因表現例如但不限於TCR之組分、免疫抑制劑之標靶、HLA基因、及/或諸如PDCD1或CTLA-4之免疫檢查點蛋白。藉由破壞或不活化基因，希望所關注基因不以功能蛋白形式表現。在一些實施例中，待破壞或不活化之基因選自由以下組成之群：例如但不限於TCRα、TCRβ、CD52、糖皮質激素受體(GR)、脫氧胞苷激酶(DCK)、PD-1及CTLA-4。在一些實施例中，該方法包含藉由將稀切核酸內切酶引入細胞中使一或多種基因不活化，該稀切核酸內切酶能夠藉由選擇性DNA裂解使基因選擇性不活化。在一些實施例中，稀切核酸內切酶可為例如轉錄活化劑樣效應子核酸酶(TALE-核酸酶)或Cas9核酸內切酶。
在一些實施例中，額外催化區用於稀切核酸內切酶以增強其使靶向基因不活化之能力。舉例而言，額外的催化區可為DNA末端處理酶。DNA末端處理酶之非限制性實例包括5-3'核酸外切酶、3-5'核酸外切酶、5-3'鹼性核酸外切酶、5'側翼核酸內切酶、解螺旋酶、磷酸酶、水解酶及模板無關DNA聚合酶。此類催化區之非限制性實例由蛋白質結構域或選自由以下組成之群之蛋白質結構域的催化活性衍生物構成：hExoI (EXO1_HUMAN)、酵母菌ExoI (EXO1_YEAST)、大腸桿菌(E . coli ) ExoI、人類TREX2、小鼠TREX1、人類TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、TdT (末端脫氧核苷酸轉移酶)人類DNA2、酵母菌DNA2 (DNA2_YEAST)。在一些實施例中，額外催化區可具有3'-5'外切核酸酶活性，且在一些實施例中，該額外催化區係TREX，例如TREX2催化區(WO2012/058458)。在一些實施例中，該催化區由單鏈TREX多肽編碼。額外催化區可融合至核酸酶融合蛋白或嵌合蛋白。在一些實施例中，額外催化區係使用例如肽連接子融合。
在一些實施例中，該方法進一步包含以下步驟：將至少包含與標靶核酸序列之一部分同源之序列的外源核酸引入細胞中，使得在標靶核酸序列與外源核酸之間出現同源重組。在一些實施例中，該外源核酸包含分別與標靶核酸序列之5'區及3'區同源之第一部分及第二部分。外源核酸亦可包含安置於第一部分與第二部分之間的第三部分，其不包含與標靶核酸序列之5'區及3'區的同源性。在裂解標靶核酸序列之後，刺激標靶核酸序列與外源核酸之間的同源重組事件。在一些實施例中，可在供體基質內使用至少約50 bp、大於約100 bp或大於約200 bp之同源序列。外源核酸可為例如但不限於約200 bp至約6000 bp、例如約1000 bp至約2000 bp。共用核酸同源性位於側接斷裂部位上游及下游之區域，且引入之核酸序列位於兩個臂之間。
在一些實施例中，核酸依次包含具有與該裂解上游序列之同源性之第一區；使選自由以下組成之群之靶向基因不活化的序列：TCRα、TCRβ、CD52、糖皮質激素受體(GR)、脫氧胞苷激酶(DCK)及諸如計劃性死亡-1 (PD-1)之免疫檢查點蛋白；及具有與裂解下游序列之同源性之第二區。聚核苷酸引入步驟可與引入或表現稀切核酸內切酶同時、之前或之後發生。視其中發生斷裂事件之標靶核酸序列之位置而定，此類外源核酸可用於敲除基因(例如當外源核酸位於基因之開放閱讀框架內時)，或引入所關注之新序列或基因。藉由使用此類外源核酸進行之序列插入可藉由基因之校正或置換(作為非限制性實例之對偶基因交換)用以修飾現有靶向基因，或用於上調或下調靶向基因之表現(作為非限制性實例之啟動子交換)、靶向基因校正或置換。在一些實施例中，選自由以下組成之群之基因的不活化可在由特異性TALE核酸酶靶向之精確的基因組位置處進行：TCRα、TCRβ、CD52、GR、DCK及免疫檢查點蛋白，其中該特異性TALE核酸酶催化一裂解且其中外源核酸至少依次包含具有同源性之區域及使選自由以下組成之群之一種靶向基因不活化的序列：TCRα、TCRβ、CD52、GR、DCK、由同源重組整合之免疫檢查點蛋白。在一些實施例中，可藉由以下使若干基因依次或同時不活化：分別使用若干TALE核酸酶且特異性靶向一種界定基因及若干特異性聚核苷酸，以實現特異性基因不活化。
在一些實施例中，該方法包含使選自由以下組成之群之一或多種額外基因不活化：TCRα、TCRβ、CD52、GR、DCK及免疫檢查點蛋白。在一些實施例中，基因不活化可藉由以下實現：將至少一種稀切核酸內切酶引入至細胞中，使得稀切核酸內切酶特異性催化細胞基因組之靶向序列中之裂解；及視情況將外源核酸引入至細胞中，該外源核酸依次包含具有與裂解上游序列之同源性之第一區、待插入於細胞之基因組中之序列及具有與裂解下游序列之同源性之第二區；其中所引入之外源核酸使基因不活化且整合編碼所關注之至少一種重組蛋白之至少一種外源聚核苷酸序列。在一些實施例中，該外源聚核苷酸序列整合於編碼選自由以下組成之群之蛋白質的基因內：TCRα、TCRβ、CD52、GR、DCK及免疫檢查點蛋白。
在另一態樣中，基因修飾細胞之步驟可包含：藉由使表現免疫抑制劑之標靶之至少一種基因不活化來修飾T細胞，及；視情況在免疫抑制劑存在下擴增細胞。免疫抑制劑係藉由若干作用機制中之一者抑制免疫功能之試劑。免疫抑制劑可削弱免疫反應之範圍及/或吞滅(voracity)。免疫抑制劑之非限制性實例包括鈣調神經磷酸酶抑制劑、雷帕黴素(rapamycin)之標靶、介白素-2 α鏈阻斷劑、肌苷單磷酸去氫酶之抑制劑、二氫葉酸還原酶之抑制劑、皮質類固醇及免疫抑制抗代謝物。某些細胞毒性免疫抑制劑係藉由抑制DNA合成發揮作用。其他者可經由活化T細胞或藉由抑制輔助細胞之活化來發揮作用。根據本發明之方法是藉由使T細胞中之免疫抑制劑之標靶不活化來賦予對T細胞之免疫抑制抗性以實現免疫療法。作為非限制性實例，免疫抑制劑之標靶可為用於免疫抑制劑之受體，諸如但不限於CD52、糖皮質激素受體(GR)、FKBP家族基因成員及親環蛋白家族基因成員。
在一些實施例中，該方法之基因修飾涉及在所提供之用於工程改造之細胞中表現一種稀切核酸內切酶，使得稀切核酸內切酶特異性催化一種靶向基因中之裂解，進而使靶向基因不活化。在一些實施例中，工程改造細胞之方法包含以下步驟中之至少一者：提供T細胞，諸如來自細胞培養物或血液樣品之T細胞；選擇表現免疫抑制劑之標靶之T細胞中的基因；將能夠藉由DNA裂解選擇性不活化之稀切核酸內切酶引入T細胞中，例如藉由雙股斷裂編碼免疫抑制劑之標靶之基因，及視情況在免疫抑制劑存在下擴增細胞。
在一些實施例中，該方法包含：提供T細胞，諸如來自細胞培養物或血液樣品之T細胞；選擇T細胞中之基因，其中該基因表現免疫抑制劑之標靶；用編碼能夠藉由DNA裂解選擇性不活化之稀切核酸內切酶之核酸轉染T細胞，例如藉由雙股斷裂編碼免疫抑制劑之標靶之基因，及將稀切核酸內切酶表現於T細胞中；以及視情況在免疫抑制劑存在下擴增細胞。
在一些實施例中，稀切核酸內切酶特異性靶向CD52或GR。在一些實施例中，經選擇用於不活化之基因編碼CD52，且免疫抑制治療包含靶向CD52抗原之人類化抗體。在一些實施例中，經選擇用於不活化之基因編碼GR，且免疫抑制治療包含諸如地塞米松(dexamethasone)之皮質類固醇。在一些實施例中，經選擇用於不活化之基因係FKBP家族基因成員或其變異體且免疫抑制治療包含又稱為他克莫司(Tacrolimus)或藤黴素之FK506。在一些實施例中，FKBP家族基因成員係FKBP12或其變異體。在一些實施例中，經選擇用於不活化之基因係親環蛋白家族基因成員或其變異體且免疫抑制治療包含環孢靈。
在一些實施例中，稀切核酸內切酶可為例如大範圍核酸酶、鋅指核酸酶或TALE核酸酶(TALEN)。在一些實施例中，稀切核酸內切酶係TALE核酸酶。
本文亦提供適用於免疫療法之工程改造T細胞之方法，其中該等方法包含：藉由至少使免疫檢查點蛋白不活化基因修飾T細胞。在一些實施例中，免疫檢查點蛋白係例如PD-1及/或CTLA-4。在一些實施例中，基因修飾細胞之方法包含：藉由使至少一種免疫檢查點蛋白不活化修飾T細胞；及擴增細胞。免疫檢查點蛋白包括但不限於計劃性死亡1 (PD-1，又稱為PDCD1或CD279，寄存編號：NM_005018)、細胞毒性T淋巴細胞抗原4 (CTLA-4，又稱為CD152，基因銀行寄存編號AF414120.1)、LAG3 (又稱為CD223，寄存編號：NM_002286.5)、Tim3 (又稱為HAVCR2，基因銀行寄存編號：JX049979.1)、BTLA 又稱為CD272，寄存編號：NM_181780.3)、BY55 (又稱為CD160，基因銀行寄存編號：CR541888.1)、TIGIT (又稱為VSTM3，寄存編號：NM_173799)、B7H5 (又稱為C10orf54、小鼠vista基因之同系物，寄存編號：NM_022153.1)、LAIR1 (又稱為CD305，基因銀行寄存編號：CR542051.1)、SIGLEC10 基因庫寄存編號：AY358337.1)、2B4 (又稱為CD244，寄存編號：NM_001166664.1)，其直接抑制免疫細胞。舉例而言，CTLA-4係在某些CD4及CD8 T細胞上表現之細胞表面蛋白；當由其配位體(B7-1及B7-2)在抗原呈現細胞上結合時，抑制T細胞活化及效應功能。
在一些實施例中，該工程改造細胞之方法包含以下步驟中之至少一者：提供T細胞，諸如來自細胞培養物或血液樣品之T細胞；將能夠藉由DNA裂解選擇性不活化之稀切核酸內切酶引入T細胞中，例如藉由雙股斷裂編碼免疫檢查點蛋白之一種基因；及擴增細胞。在一些實施例中，該方法包含：提供T細胞，諸如來自細胞培養物或血液樣品之T細胞；用編碼能夠藉由DNA裂解選擇性不活化之稀切核酸內切酶之核酸轉染該T細胞，例如藉由雙股斷裂編碼免疫抑制劑之標靶之基因；將稀切核酸內切酶表現於T細胞中；擴增細胞。在一些實施例中，稀切核酸內切酶特異性靶向選自由以下組成之群之基因：PD-1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、TCRα及TCRβ。在一些實施例中，稀切核酸內切酶可為大範圍核酸酶、鋅指核酸酶或TALE核酸酶。在一些實施例中，稀切核酸內切酶係TALE核酸酶。
在一些實施例中，本發明可尤其適用於同種異體免疫療法。在此類實施例中，細胞可藉由包含以下之方法修飾：使編碼T細胞中之T細胞受體(TCR)之組分的至少一種基因不活化；及擴增T細胞。在一些實施例中，該方法之基因修飾依賴於在所提供之用於工程改造之細胞中表現一種稀切核酸內切酶，使得稀切核酸內切酶特異性催化一種靶向基因中之裂解，進而使靶向基因不活化。在一些實施例中，該用於工程改造細胞之方法包含以下步驟中之至少一者：提供T細胞，諸如來自細胞培養物或血液樣品之T細胞；將能夠藉由DNA裂解選擇性不活化之稀切核酸內切酶引入T細胞中，例如藉由雙股斷裂編碼T細胞受體(TCR)之組分之至少一種基因；及擴增細胞。
在一些實施例中，該方法包含：提供T細胞，諸如來自細胞培養物或血液樣品之T細胞；用編碼能夠藉由DNA裂解選擇性不活化之稀切核酸內切酶之核酸轉染該T細胞，例如藉由雙股斷裂編碼T細胞受體(TCR)之組分之至少一種基因；將稀切核酸內切酶表現於T細胞中；分選轉型T細胞，其不在其細胞表面上表現TCR；及擴增細胞。
在一些實施例中，稀切核酸內切酶可為大範圍核酸酶、鋅指核酸酶或TALE核酸酶。在一些實施例中，稀切核酸內切酶係TALE核酸酶。在一些實施例中，TALE核酸酶識別及裂解編碼TCRα或TCRβ之序列。在一些實施例中，TALE核酸酶包含選自示於SEQ ID NO: 219、220、221、222、223、224、225或226中之胺基酸序列之多肽序列。 TALE核酸酶多肽序列：重複 TRAC _ T01 - L 。重複 TRAC_T01-R 。重複 TRBC_T01-L 。重複 TRBC_T01-R 。重複 TRBC_T02-L 。重複 TRBC_T02-R 。重複 CD52_T02-L 。重複 CD52_T02-R 。
在另一態樣中，基因修飾細胞之另一步驟可為擴增TCRα缺陷T細胞之方法，其包含將pTα (又稱為preTCRα)或其功能變異體引入T細胞中及視情況經由CD3複合物之刺激擴增該細胞。在一些實施例中，該方法包含：a)用編碼至少一個pTα片段之核酸轉染該細胞以支持CD3表面表現；b)將該pTα表現於該細胞中；及c)視情況經由CD3複合物之刺激擴增該細胞。
亦提供製備用於免疫療法之T細胞之方法，其包含用於擴增T細胞之方法步驟。在一些實施例中，可隨機地或藉由同源重組引入pTα聚核苷酸序列。在一些實施例中，該插入可與TCRα基因之不活化相關聯。
可使用pTα之不同功能變異體。肽之「功能變異體」係指實質上類似於完整肽或其片段之分子。pTα或其功能變異體之「片段」係指該分子之任何亞群，亦即比全長pTα短之肽。在一些實施例中，pTα或功能變異體可為例如全長pTα或C端截斷pTα型式。C端截斷pTα在C端末端中缺乏一或多個殘基。作為非限制性實例，C端截斷pTα型式缺乏該蛋白質之C端之18個、48個、62個、78個、92個、110個或114個殘基。肽之胺基酸序列變異體可藉由編碼該肽之DNA突變製備。此功能變異體包括例如胺基酸序列內殘基之缺失或插入或取代。亦可製備缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，限制條件為最終構築體具有所需活性，尤其功能CD3複合物之復原。在一個例示性實施例中，將至少一種突變引入如上文所述之不同pTα型式中以影響二聚作用。作為非限制性實例，突變殘基可為人類pTα蛋白質之至少W46R、D22A、K24A、R102A或R117A或pTα家族或同系物成員上使用CLUSTALW方法之比對位置。舉例而言，如上文所述之pTα或其變異體包含突變殘基W46R或突變殘基D22A、K24A、R102A及R117A。在一些實施例中，該pTα或變異體亦融合至信號轉導結構域，諸如CD28、OX40、ICOS、CD27、CD137 (4-1BB)及CD8作為非限制性實例。如上文所述之pTα或變異體之胞外域可融合至TCRα蛋白質之片段，尤其TCRα之跨膜及胞內域。pTα變異體亦可融合至TCRα之胞內域。
在一些實施例中，pTα型式可融合至胞外配位體結合域。在一些實施例中，pTα或其功能變異體融合至單鏈抗體片段(scFv)，其包含藉由可撓性連接子連接之標靶抗原特異性單株抗體之輕及重可變片段。
術語「TCRα缺陷T細胞」係指缺乏功能TCRα鏈之表現之經分離T細胞。此可藉由不同手段實現，作為非限制性實例，藉由工程改造T細胞使得其不在其細胞表面上表現任何功能TCRα；或藉由工程改造T細胞使得其在其表面上產生極少功能TCRα鏈；或藉由工程改造T細胞以表現TCRα鏈之突變或截斷形式。TCRα缺陷細胞可不再經由CD3複合物擴增。因此，為解決此問題且允許TCRα缺陷細胞之增殖，將pTα或其功能變異體引入細胞中，因此復原功能CD3複合物。在一些實施例中，該方法進一步包含將稀切核酸內切酶引入該等T細胞中，該稀切核酸內切酶能夠藉由DNA裂解使編碼T細胞受體(TCR)之一種組分之一種基因選擇性不活化。在一些實施例中，稀切核酸內切酶係TALE核酸酶。
在一些實施例中，編碼根據本發明之多肽之聚核苷酸可為例如藉由電穿孔直接引入細胞中之mRNA。在一些實施例中，可使用cytoPulse技術短暫滲透活細胞以將材料遞送至細胞中。可修改參數以便確定病狀從而以最小死亡率實現高轉染效率。
本文亦提供轉染T細胞之方法。在一些實施例中，該方法包含：使T細胞與RNA接觸且將由以下組成之靈敏脈衝序列塗覆於T細胞：(a)電壓範圍為每公分約2250至3000 V之電脈衝；(b) 0.1 ms之脈衝寬度；(c)在步驟(a)與(b)之電脈衝之間的約0.2至10 ms之脈衝時間間隔；(d)電壓範圍為約2250至3000 V、脈衝寬度為約100 ms且在步驟(b)之電脈衝與步驟(c)之第一電脈衝之間的約100 ms之脈衝時間間隔之電脈衝；及(e)電壓為約325 V、脈衝寬度為約0.2 ms且在4個電脈衝中之每一者之間的2 ms之脈衝時間間隔的四種電脈衝。在一些實施例中，轉染T細胞之方法包含使該T細胞與RNA接觸及將包含以下各者之靈敏脈衝序列塗覆至T細胞：(a)電壓為每公分約2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000 V之電脈衝；(b) 0.1 ms之脈衝寬度；(c)及步驟(a)與(b)之電脈衝之間的約0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 ms之脈衝時間間隔；(d)電壓範圍為約2250、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000 V、脈衝寬度為100 ms及步驟(b)之電脈衝與步驟(c)之第一電脈衝之間的100 ms之脈衝時間間隔的一種電脈衝；及(e)電壓為約325 V、脈衝寬度為約0.2 ms及4種電脈衝中之每一者之間的約2 ms脈衝時間間隔之4種電脈衝。本申請案中揭示包括於上文所述之值範圍中之任何值。電穿孔媒介可為此項技術中已知之任何適合之媒介。在一些實施例中，電穿孔媒介具有跨越約0.01至約1.0毫西門子範圍之導電性。
在一些實施例中，作為非限制性實例，RNA編碼稀切核酸內切酶、諸如半TALE核酸酶之稀切核酸內切酶之一種單體、CAR、多鏈嵌合抗原受體之至少一種組分、pTα或其功能變異體、外源核酸及/或一種額外催化區。經工程改造之免疫細胞
本發明亦提供經工程改造之免疫細胞，其包含本文所述之CAR聚核苷酸中之任一者。在一些實施例中，可經由質體載體將CAR引入免疫細胞中作為轉基因。在一些實施例中，質體載體亦可含有例如選擇標記物，該選擇標記物提供接受載體之細胞之鑑別及/或選擇。
在將編碼CAR多肽之聚核苷酸引入細胞中之後，可在細胞中原位合成CAR多肽。可替代地，CAR多肽可在細胞外部製備，且隨後引入細胞中。將聚核苷酸構築體引入細胞中之方法係此項技術中已知的。在一些實施例中，可使用穩定的轉型方法將聚核苷酸構築體整合至細胞之基因組中。在其他實施例中，可使用暫態轉型方法短暫表現聚核苷酸構築體，且聚核苷酸構築體並不整合於細胞之基因組中。在其他實施例中，可使用病毒介導之方法。可藉由任何適合手段，諸如重組病毒載體(例如反轉錄病毒、腺病毒)、脂質體及類似者引入聚核苷酸中。暫態轉型方法包括(例如但不限於)顯微注射、電穿孔或粒子轟擊。聚核苷酸可包括於載體(諸如質體載體或病毒載體)中。
本文亦提供藉由工程改造本文所提供之細胞之上文所描述方法獲得的經分離細胞及細胞株。在一些實施例中，經分離細胞包含如上文所述之至少一種CAR。在一些實施例中，經分離細胞包含CAR群體，各CAR包含不同胞外配位體結合域。
本文亦提供根據上文所述之方法中之任一者所獲得的經分離免疫細胞。能夠表現異源DNA之任何免疫細胞均可用於表現所關注CAR之目的。在一些實施例中，用於表現本文所述之CAR中之任一者的免疫細胞係T細胞。在一些實施例中，用於表現CAR之免疫細胞可來源於(例如但不限於)幹細胞。幹細胞可為成體幹細胞、非人類胚胎幹細胞，更尤其非人類幹細胞、臍帶血幹細胞、祖細胞、骨髓幹細胞、誘導性多能幹細胞、分化全能幹細胞或造血幹細胞。代表性人類幹細胞係CD34+細胞。
在一些實施例中，在其細胞表面膜處表現本發明之FLT3特異性CAR的經工程改造之免疫細胞包含大於10%、20%、30%、40%、50%或60%之幹細胞記憶及中央記憶細胞的百分比。在一些實施例中，在其細胞表面膜處表現本發明之FLT3特異性CAR的經工程改造之免疫細胞包含約10%至約60%、約10%至約50%、約10%至約40%、約15%至約50%、約15%至約40%、約20%至約60%或約20%至約70%之幹細胞記憶及中央記憶細胞的百分比。
在一些實施例中，幹細胞記憶及中央記憶細胞之百分比係如實例2d中所揭示進行量測。
用於表現本文所述之CAR中之任一者的免疫細胞亦可為樹突狀細胞、殺手樹突狀細胞、肥大細胞、NK細胞、B細胞或選自由以下組成之群的T細胞：發炎性T淋巴球、細胞毒性T淋巴球、調節T淋巴球或輔助T淋巴球。在一些實施例中，細胞可來源於由CD4+ T淋巴球及CD8+ T淋巴球組成之群。
在一個實施例中，免疫細胞係表現本文所述之CAR中之任一者的發炎性T淋巴球。在一個實施例中，免疫細胞係表現本文所述之CAR中之任一者的細胞毒性T淋巴球。在一個實施例中，免疫細胞係表現本文所述之CAR中之任一者的調節T淋巴球。在一個實施例中，免疫細胞係表現本文所述之CAR中之任一者的輔助T淋巴球。
本文亦提供根據上文所描述之方法中之任一者自經轉型T細胞獲得之細胞株。本文亦提供對免疫抑制治療具有抵抗性之經修飾細胞。在一些實施例中，根據本發明之經分離細胞包含編碼CAR之聚核苷酸。
本發明之免疫細胞可在基因修飾T細胞之前或之後，使用一般如以下各者所描述之方法活化及擴增：例如但不限於美國專利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；及美國專利申請公開案第20060121005號。T細胞可在活體外或活體內擴增。一般而言，本發明之T細胞可例如藉由與試劑接觸擴增，該試劑刺激T細胞之表面上之CD3 TCR複合物及共刺激分子以產生T細胞之活化信號。舉例而言，可使用化學物質，諸如鈣離子載體A23187、佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或促有絲分裂凝集素(如植物血球凝集素(PHA))來產生T細胞之活化信號。
在一些實施例中，T細胞群體可在活體外，例如藉由接觸抗CD3抗體或其抗原結合片段，或固定在表面上之抗-CD2抗體，或藉由接觸蛋白激酶C活化因子(例如苔蘚蟲素)與鈣離子載體之組合進行刺激。為了共刺激T細胞表面上之輔助分子，使用結合輔助分子之配位體。舉例而言，可以使T細胞群體與抗CD3抗體及抗CD28抗體在適於刺激T細胞增殖之條件下接觸。適合於T細胞培養之條件包括適當培養基(例如，最低必需培養基，或RPMI培養基1640，或X-vivo 5 (Lonza))，其可含有增殖及存活所需之因子，包括血清(例如胎牛血清或人血清)、介白素-2 (IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFp及TNF，或熟練技術人員已知用於生長細胞之任何其他添加劑。用於細胞生長之其他添加劑包括(但不限於)界面活性劑、人血漿蛋白粉，及還原劑，諸如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1及X-Vivo 20、優化劑(Optimizer)，添加有胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，無血清或補充有適量血清(或血漿)或一組確定的激素，及/或足以使T細胞生長及擴增之量的細胞介素。抗生素(例如青黴素及鏈黴素)僅包括於實驗培養物中，而不在待輸注至個體之細胞培養物中。將靶細胞維持在支持生長所需之條件下，例如合適溫度(例如37℃)及氛圍(例如空氣加5% CO2 )。暴露於不同刺激時間之T細胞可展現不同特徵。
在一些實施例中，本發明之細胞可藉由與組織或細胞共同培養來擴增。細胞亦可在活體內，例如在將該細胞投與個體中之後於個體之血液中擴增。
在一些實施例中，根據本發明之經分離細胞包含一種選自由以下組成之群的不活化基因：CD52、GR、PD-1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、HLA、TCRα及TCRβ及/或表現CAR、多鏈CAR及/或pTα轉基因。在一些實施例中，經分離細胞包含聚核苷酸，該等聚核苷酸編碼包含多鏈CAR之多肽。在一些實施例中，根據本發明之經分離細胞包含兩種選自由以下組成之群的不活化基因：CD52及GR、CD52及TCRα、CDR52及TCRβ、GR及TCRα、GR及TCRβ、TCRα及TCRβ、PD-1及TCRα、PD-1及TCRβ、CTLA-4及TCRα、CTLA-4及TCRβ、LAG3及TCRα、LAG3及TCRβ、Tim3及TCRα、Tim3及TCRβ、BTLA及TCRα、BTLA及TCRβ、BY55及TCRα、BY55及TCRβ、TIGIT及TCRα、TIGIT及TCRβ、B7H5及TCRα、B7H5及TCRβ、LAIR1及TCRα、LAIR1及TCRβ、SIGLEC10及TCRα、SIGLEC10及TCRβ、2B4及TCRα、2B4及TCRβ及/或表現CAR、多鏈CAR及pTα轉基因。
在一些實施例中，藉由使TCRα基因及/或TCRβ基因不活化來使TCR在根據本發明之細胞中不起作用。在一些實施例中，提供用以獲得來源於個體之經修飾細胞之方法，其中細胞可獨立於主要組織相容複合體(major histocompatibility complex；MHC)信號傳導路徑增殖。本發明之範疇涵蓋易於藉由此方法獲得之經修飾細胞，該等經修飾細胞可獨立於MHC信號傳導路徑增殖。本文所揭示之經修飾細胞可用於針對移植物抗宿主(Host versus Graft；HvG)排斥及移植物抗宿主疾病(Graft versus Host Disease；GvHD)治療有需要之個體；因此針對移植物抗宿主(HvG)排斥及移植體對抗宿主疾病(GVHD)治療有需要之個體之方法處於本發明之範疇內，該方法包含藉由向該個體投與有效量之包含不活化TCRα及/或TCRβ基因之經修飾細胞治療該個體。
在一些實施例中，免疫細胞經工程改造以對一或多種化學療法藥物具有抵抗性。化學療法藥物可為例如嘌呤核苷酸類似物(PNA)，因此製備適用於組合授受性免疫療法及化學療法之癌症治療的免疫細胞。例示性PNA包括例如單獨或呈組合形式之氯法拉濱(clofarabine)、氟達拉賓(fludarabine)及阿糖胞苷(cytarabine)。PNA由脫氧胞苷激酶(dCK)代謝為單磷酸酯PNA、二磷酸酯PNA、及三磷酸酯PNA。其三磷酸酯形式與ATP競爭DNA合成，充當促凋亡劑，且係涉及三核苷酸產生之核糖核苷酸還原酶(RNR)之強效抑制劑。本文提供包含不活化dCK基因之FLT3特異性CAR T細胞。在一些實施例中，dCK基因敲除細胞利用例如mRNA之電穿孔，藉由使用編碼針對dCK基因之特異性TAL核酸酶之聚核苷酸轉染T細胞製得。dCK基因敲除FLT3特異性CAR-T細胞對PNA (包括例如氯法拉濱及/或氟達拉賓)具有抵抗性，且維持對FLT3表現細胞之T細胞細胞毒活性。
在一些實施例中，本發明之經分離細胞或細胞株可包含pTα或其功能變異體。在一些實施例中，經分離細胞或細胞株可進一步藉由使TCRα基因不活化來基因修飾。
在一些實施例中，CAR-T細胞包含編碼自殺多肽(諸如RQR8)之聚核苷酸。參見例如WO2013153391A，其以全文引用之方式併入本文中。在包含聚核苷酸之CAR-T細胞中，自殺多肽在CAR-T細胞之表面處表現。在一些實施例中，自殺多肽包含示於SEQ ID NO: 227中之胺基酸序列。 。
自殺多肽亦可包含胺基端處之信號肽。在一些實施例中，自殺多肽包含示於SEQ ID NO: 228中之胺基酸序列。 。
當自殺多肽在CAR-T細胞之表面處表現時，利妥昔單抗與多肽之利妥昔單抗抗原決定基結合造成細胞溶解。在細胞表面處表現之每個多肽可結合超過一個利妥昔單抗分子。多肽之各利妥昔單抗抗原決定基可結合單獨之利妥昔單抗分子。可例如藉由向個體投與利妥昔單抗在活體內發生FLT3特異性CAR-T細胞之刪除。(諸如在偵測到不可接受之毒性水準時)決定刪除轉移細胞可起因於在個體中偵測到由轉移細胞引起之非期望影響。
在一些實施例中，在向患者投與後，在其細胞表面表現本文所述之FLT3特異性CAR中之任一者的經工程改造之免疫細胞可降低、殺滅或溶解患者之內源性FLT3表現細胞。在一個實施例中，FLT3表現內源性細胞或藉由表現本文所述之FLT3特異性CAR中之任一者的經工程改造之免疫細胞表現FLT3之細胞株的細胞之百分比降低或溶解為至少約或大於10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。在一個實施例中，FLT3表現內源性細胞或藉由表現本文所述之FLT3特異性CAR中之任一者的經工程改造之免疫細胞表現FLT3之細胞株的細胞之百分比降低或溶解為約5%至約95%、約10%至約95%、約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約10%至約60%、約10%至約50%、約10%至約40%、約20%至約90%、約20%至約80%、約20%至約70%、約20%至約60%、約20%至約50%、約25%至約75%或約25%至約60%。在一個實施例中，內源性FLT3表現細胞係內源性FLT3表現骨髓細胞。
在一個實施例中，靶細胞(例如藉由在其細胞表面膜處表現本發明之FLT3特異性CAR之經工程改造的免疫細胞表現FLT3之細胞株)之百分比降低或溶解可使用實例2e中所揭示之分析量測。用於分選 CAR 陽性免疫細胞之方法
在一個態樣中，提供用於活體外分選免疫細胞群體之方法，其中免疫細胞群體之子集包含表現FLT3特異性CAR中之任一者的經工程改造之免疫細胞，該等FLT3特異性CAR包含對本文所述之單株抗體具有特異性之抗原決定基。該方法包含使免疫細胞群體與對抗原決定基具有特異性之單株抗體接觸及選擇結合於單株抗體之免疫細胞以獲得富集於表現FLT3特異性CAR的經工程改造之免疫細胞之細胞群。
在一些實施例中，對該抗原決定基具有特異性之該單株抗體視情況與螢光團結合。在此實施例中，選擇結合於單株抗體之細胞之步驟可藉由螢光活化細胞分選術(FACS)進行。在一些實施例中，對該抗原決定基具有特異性之該單株抗體視情況與磁性顆粒結合。在此實施例中，選擇結合於單株抗體之細胞之步驟可藉由磁性活化細胞分選(MACS)進行。
在一些實施例中，CAR之胞外結合結構域包含SEQ ID NO: 262之mAb特異性抗原決定基。在一些實施例中，CAR之胞外結合結構域包含SEQ ID NO: 262之mAb特異性抗原決定基且用於接觸免疫細胞群體之抗體係QBEND-10。
在一些實施例中，CAR之胞外結合結構域包含SEQ ID NO: 229之mAb特異性抗原決定基。在一些實施例中，CAR之胞外結合結構域包含SEQ ID NO: 229之mAb特異性抗原決定基且用於接觸免疫細胞群體之抗體係利妥昔單抗。
在一些實施例中，在使用活體外分選上文所述之免疫細胞之方法時獲得的表現FLT3 CAR之免疫細胞之群體包含至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%表現FLT3 CAR之免疫細胞。在一些實施例中，在使用活體外分選上文所述之CAR表現免疫細胞之方法時獲得的表現FLT3 CAR之免疫細胞之群體包含至少85%表現FLT3 CAR之免疫細胞。
在一些實施例中，活體外分選方法中所用之mAb先前結合於諸如管柱之支撐物上或諸如熟習此項技術者常規獲得之珠粒上。在一些實施例中，表現CAR之免疫細胞係T細胞。
根據本發明，向受體投與之細胞可在活體外自源種群富集。擴增源種群之方法為此項技術中所熟知，且可包括使用熟習此項技術者已知之以下各者選擇表現諸如CD34抗原之抗原的細胞：密度離心、免疫磁珠純化、親和性層析法和螢光活化細胞分選。
流式細胞量測術廣泛用於此項技術中且係一般技術者熟知用以分選和定量細胞群內特異性細胞型之方法。一般而言，流式細胞量測術係主要藉由光學手段定量細胞之組分或結構特徵之方法。因為不同細胞型可藉由定量結構特徵區分，所以可使用流式細胞量測術及細胞分選計數及分選混合物中不同表現型之細胞。
流式細胞分析涉及兩個基本步驟：1)用一或多種經標記標記物標記所選定細胞類型，及2)測定相對於群體中細胞之總數目經標記細胞之數目。
標記細胞型之主要方法係藉由將經標記抗體結合於由特異性細胞型表現之標記物。抗體係使用螢光化合物直接標記或使用例如識別第一抗體之經螢光標記之第二抗體間接標記。
在一些實施例中，用於分選表現CAR之免疫細胞的方法係磁性活化細胞分選(MACS)。
磁性活化細胞分選(MACS)係視其表面抗原(CD分子)而定藉由使用超順磁奈米粒子及柱分離各種細胞群之方法。需要若干簡單步驟獲得純細胞群。單細胞懸浮液中之細胞係使用微珠磁性標記。將樣品塗覆於由鐵磁性球體構成之管柱，該等球體覆蓋有允許快速溫和地分離細胞之細胞友好塗層。未經標記之細胞穿過管柱而經磁性標記之細胞保留在管柱內。可收集流過物作為未標記細胞溶離份。在短暫的洗滌步驟之後，自分離器移除管柱，且自管柱溶離經磁性標記之細胞。
在一些實施例中，用於分選表現CAR之免疫細胞之方法中所用的mAb係選自阿侖單抗、替伊莫單抗、莫羅單抗-CD3、托西莫單抗、阿昔單抗、巴利昔單抗、本妥昔單抗維多汀、西妥昔單抗、英夫利昔單抗、利妥昔單抗、貝伐單抗、聚乙二醇化賽妥珠單抗、達利珠單抗、艾庫組單抗、艾法珠單抗、吉妥單抗、那他珠單抗、奧馬珠單抗、帕利珠單抗、蘭尼單抗、托西利單抗、曲妥珠單抗、維多珠單抗、阿達木單抗、貝利單抗、卡納單抗、地諾單抗、戈利木單抗、伊匹利單抗、奧伐木單抗、帕尼單抗、QBEND-10及/或優特克單抗。在一些實施例中，該mAb係利妥昔單抗。在另一實施例中，該mAb係QBEND-10。療法應用
表現FLT3特異性CAR之藉由上文所述方法獲得之經分離細胞或來源於此類經分離細胞之細胞株可用作藥劑。類似地，本文所揭示之FLT 3特異性抗體可用作藥劑。在一些實施例中，此類藥劑可用於治療FLT3相關疾病或病狀。在一些實施例中，FLT3相關疾病或病狀包含表現FLT3之惡性細胞，例如癌症。在一些實施例中，癌症係造血源之癌症，諸如淋巴瘤或白血病。在一些實施例中，癌症係多發性骨髓瘤、惡性漿細胞贅瘤、霍奇金氏淋巴瘤、結節性淋巴球為主型之霍奇金氏淋巴瘤、卡勒氏病及骨髓瘤病、漿細胞白血病、漿細胞瘤、B細胞前淋巴球性白血病、毛細胞白血病、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、濾泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、前驅體B淋巴母細胞淋巴瘤、骨髓性白血病、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴球性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、結邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、富T細胞/組織細胞大B細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性皮膚瀰漫性大B細胞淋巴瘤(腿型)、老年人之EBV陽性瀰漫性大B細胞淋巴瘤、與發炎相關之瀰漫性大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、在HHV8相關之多中心卡斯曼病中出現之大B細胞淋巴瘤、具有瀰漫性大B細胞淋巴瘤與伯基特淋巴瘤之間的中間特徵之未經分類B細胞淋巴瘤、具有瀰漫性大B細胞淋巴瘤與典型霍奇金淋巴瘤之間的中間特徵之未經分類B細胞淋巴瘤、以及其他造血細胞相關之癌症。在一例示性實施例中，癌症係AML。在一例示性實施例中，癌症係ALL。
在一些實施例中，根據本發明之經分離細胞或來源於經分離細胞之細胞株或抗體可用於製造用於治療有需要之個體中之癌症的藥劑。
本文亦提供用於治療個體之方法。在一些實施例中，該方法包含向有需要之個體提供本發明之免疫細胞。在一些實施例中，該方法包含向有需要之個體投與本發明之經轉型免疫細胞的步驟。在一些實施例中，該方法包含向有需要之個體投與本發明之抗體。
在一些實施例中，本發明之T細胞可經歷穩定的活體內T細胞擴增且可保留一段較長時間量。
本發明之治療方法可為改善的、治癒性的或預防性的。本發明之方法可為自體免疫療法之部分或同種異體免疫療法治療之部分。本發明尤其適用於同種異體免疫療法。可使用標準方案將來自供體之T細胞轉型為非同種異體反應性細胞且視需要複製，進而產生可向一個或若干個體投與之CAR-T細胞。此類CAR-T細胞療法可提供為「現成的」療法產物。
可用於所揭示之方法的細胞描述於前一節中。治療可用於治療診斷患有例如癌症之個體。可治療之癌症包括(例如但不限於)涉及B淋巴球之癌症，包括以上列出之癌症中之任一者。用本發明之CAR及CAR-T細胞治療之癌症類型包括但不限於某些白血病或淋巴性惡性疾病。亦包括成人腫瘤/癌症及兒科腫瘤/癌症。在一些實施例中，治療可與選自以下基團之針對癌症之一或多種療法組合：抗體療法、化學療法、細胞介素療法、樹突狀細胞療法、基因療法、激素療法、雷射光療法及輻射療法。
在一些實施例中，可向經歷免疫抑制治療之個體投與治療。實際上，本發明一般依賴於由於編碼此類免疫抑制劑之受體的基因不活化而對至少一種免疫抑制劑產生抗性的細胞或細胞群。在此態樣中，免疫抑制治療應幫助在個體內選擇及擴增根據本發明之T細胞。根據本發明之細胞或細胞群可以任何便利方式投與，包括藉由氣霧劑吸入、注射、攝取、輸注、植入或移植。可經皮下、皮內、瘤內、結節內、髓內、肌肉內、藉由靜脈內或淋巴管內注射，或經腹膜內向個體投與本文所描述之組合物。在一些實施例中，藉由靜脈內注射投與本發明之細胞組合物。
在一些實施例中，細胞或細胞群之投藥可包含投與例如約104 至約109 個細胞/千克體重(包括彼等範圍內細胞數目之全部整數值)。在一些實施例中，細胞或細胞群之投藥可包含投與約105 至約106 個細胞/千克體重(包括彼等範圍內細胞數目之全部整數值)。可投與一或多次劑量之細胞或細胞群。在一些實施例中，可以單次劑量投與該等有效量之細胞。在一些實施例中，可經一定時間段以超過一次劑量投與該等有效量之細胞。投藥時序係在主治醫師之判斷內且視個體之臨床病狀而定。細胞或細胞群可自任何來源獲得，諸如血庫或供體。儘管個體需要變化，但針對特定疾病或病狀之給定細胞型的最佳有效量範圍之確定係在此項技術之技能範圍內。有效量意謂提供治療或預防益處之量。所投與之劑量將視接受者之年齡、健康狀況及體重；同時治療(若存在)之種類；治療頻率；及所需作用之性質而定。在一些實施例中，有效量之細胞或包含彼等細胞之組合物係非經腸投與。在一些實施例中，投藥可為靜脈內投藥。在一些實施例中，藉由腫瘤內注射直接投與。
在本發明之一些實施例中，向個體投與細胞與包括但不限於以下之任何數目之相關治療模式的組合：使用諸如單株抗體療法之試劑的治療、CCR2拮抗劑(例如INC-8761)、抗病毒療法、西多福韋(cidofovir)及介白素-2、阿糖胞苷(又稱為ARA-C)或用於MS患者之那他珠單抗治療或用於牛皮癬患者之依法利珠單抗治療或用於PML患者之其他治療。在一些實施例中，向個體投與FLT3特異性CAR-T細胞與以下中之一或多者的組合：抗PD-1抗體(例如納武單抗、派立珠單抗(pembrolizumab)或PF-06801591)、抗PD-L1抗體(例如艾維路單抗(avelumab)、阿特唑單抗(atezolizumab)或德瓦魯單抗(durvalumab))、抗OX40抗體(例如PF-04518600)、抗4-1BB抗體(例如PF-05082566)、抗MCSF抗體(例如PD-0360324)、抗GITR抗體、及/或抗TIGIT抗體。在一些實施例中，向個體投與包含示於SEQ ID NO: 236中之胺基酸序列之FLT3特異性CAR與抗PD-L1抗體艾維路單抗的組合。在其他實施例中，本發明之T細胞可與化學療法、輻射、免疫抑制劑(諸如環孢素、硫唑嘌呤、甲胺喋呤、黴酚酸酯及FK506)、抗體或其他免疫燒蝕劑(諸如CAMPATH)、抗CD3抗體或其他抗體療法、細胞毒素、氟達拉濱(fludaribine)、環孢素、FK506、雷帕黴素(rapamycin)、黴酚酸、類固醇、FR901228、細胞介素及/或照射組合使用。此等藥物抑制鈣依賴性磷酸酶鈣調神經磷酸酶(環孢靈及FK506)或抑制對於生長因子誘導之信號傳導重要之p70S6激酶(雷帕黴素)(Henderson, Naya等人1991；Liu, Albers等人1992；Bierer, Hollander等人1993)。在其他實施例中，本發明之T細胞可與以下各者組合使用：諸如米哚妥林(Midostaurin)及舒尼替尼(Sunitinib)之受體酪胺酸激酶抑制劑、諸如雷帕黴素(Rapamycin)及依維莫司(Everolimus)之mTOR抑制劑、諸如福摩斯泰(Vormostat)之表觀遺傳調節劑、諸如硼替佐米(Bortezomib)之蛋白酶體抑制劑、諸如來那度胺之免疫調節劑、諸如伊莫德吉(Erismodegib)及PF-04449913之刺蝟(Hedgehog)抑制劑或諸如AG-120及AG-221之異檸檬酸去氫酶(IDH)抑制劑。在另一實施例中，向個體投與本發明之細胞組合物與骨髓移植；使用化學治療劑(諸如氟達拉濱)、外部射線輻射療法(XRT)、環磷醯胺或抗體(諸如OKT3或CAMPATH)進行之T細胞消融療法之組合(例如，在投與細胞組合物之前、同時或之後投與)。在一些實施例中，本發明之細胞組合物在B細胞消融療法(諸如與CD20反應之試劑，例如美羅華(Rituxan))之後投與。舉例而言，在一些實施例中，個體可經歷使用高劑量化學療法，隨後周邊血液幹細胞移植之標準治療。在某些實施例中，在移植後，個體接受本發明之擴增免疫細胞輸注。在一些實施例中，在手術之前或之後投與擴增之細胞。
在一些實施例中，提供自投與該等細胞之個體清除表現FLT3特異性CAR之經工程改造的免疫細胞之方法。清除可藉由抑制或消除。
在一個態樣中，用於清除表現包含對單株抗體具有特異性之抗原決定基之FLT3特異性CAR的經工程改造之免疫細胞之方法包含使該經工程改造之免疫細胞與對抗原決定基具有特異性之單株抗體接觸。
在一些實施例中，用於自投與表現包含對單株抗體具有特異性之抗原決定基之FLT3特異性CAR的經工程改造之免疫細胞之個體清除的方法包含向個體投與對抗原決定基具有特異性之單株抗體。在此等實施例中，向個體投與存在於CAR之胞外域中之對抗原決定基具有特異性的單株抗體消除或抑制來自個體之經工程改造之CAR表現免疫細胞的活性。在一個態樣中，清除經工程改造之CAR表現免疫細胞允許恢復內源性FLT3表現細胞群。
在一個態樣中，本發明係關於用於促進個體中之內源性FLT3表現細胞恢復之方法，該個體經投與在細胞表面處表現包含對單株抗體具有特異性之抗原決定基之FLT3特異性CAR的經工程改造之免疫細胞，該方法包含向個體投與對抗原決定基具有特異性之單株抗體。在一些實施例中，內源性FLT3表現細胞係內源性FLT3表現骨髓細胞。在一個態樣中，術語「恢復」係指增加內源性FLT3表現細胞之數目。內源性FLT3表現細胞之數目可由於內源性FLT3表現細胞之增殖增加及/或由於表現FLT3 CAR之經工程改造之免疫細胞所引起的內源性FLT3表現細胞之消除減少而增加。在一些實施例中，向個體投與單株抗體清除個體中表現FLT3 CAR之經工程改造之免疫細胞且增加內源性FLT3表現細胞(例如內源性FLT3表現骨髓祖細胞)。在一個實施例中，相比於在投與單株抗體之前內源性FLT3表現細胞之數目，向個體投與單株抗體將內源性FLT3表現細胞之數目增加至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。
在一個態樣中，提供治療個體中之FLT3介導之病狀的方法，該方法包含：(a)向個體投與在細胞表面處表現包含對一或多種單株抗體具有特異性之一或多種抗原決定基之FLT3特異性CAR的經工程改造之免疫細胞；及(b)隨後藉由向個體投與一或多種對抗原決定基具有特異性之單株抗體自個體清除經工程改造之免疫細胞。
在一些實施例中，用於清除表現CAR之經工程改造之免疫細胞的方法中所用之mAb係選自阿侖單抗、替伊莫單抗、莫羅單抗-CD3、托西莫單抗、阿昔單抗、巴利昔單抗、本妥昔單抗維多汀、西妥昔單抗、英夫利昔單抗、利妥昔單抗、貝伐單抗、聚乙二醇化賽妥珠單抗、達利珠單抗、艾庫組單抗、艾法珠單抗、吉妥單抗、那他珠單抗、奧馬珠單抗、帕利珠單抗、蘭尼單抗、托西利單抗、曲妥珠單抗、維多珠單抗、阿達木單抗、貝利單抗、卡納單抗、地諾單抗、戈利木單抗、伊匹利單抗、奧伐木單抗、帕尼單抗、QBEND-10、優特克單抗以及其組合。
在一些實施例中，對單株抗體具有特異性之該抗原決定基(mAb特異性抗原決定基)係CD20抗原決定基或模擬位(例如SEQ ID NO. 229)且對抗原決定基具有特異性之mAb係利妥昔單抗。
在一些實施例中，向個體投與單株抗體之步驟包含用單株抗體輸注個體。在一些實施例中，向個體投與之抗原決定基特異性mAb之量足以消除個體中之至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90% CAR表現免疫細胞。
在一些實施例中，向個體投與單株抗體之步驟包含每週一次或若干次用375 mg/m2 利妥昔單抗輸注個體。
在一些實施例中，當在CDC分析中使用抗原決定基特異性mAb清除表現包含mAb特異性抗原決定基之CAR之免疫細胞(CAR表現免疫細胞)時，可存活的CAR表現免疫細胞之量減少，例如減少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
在一些實施例中，細胞毒性藥物與用於清除CAR表現免疫細胞之抗原決定基特異性mAb偶合。藉由組合單株抗體之靶向能力與細胞毒性藥物之細胞殺滅能力，相比於單獨藥物之用途，抗體-藥物結合物(ADC)允許健康組織與患病組織之間的敏感辨別。若干ADC獲得市場批准；其製備技術(尤其在連接子上)詳細呈現於以下先前技術(Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212；Trail等人 (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337；Syrigos及Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz及Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172；美國專利第4,975,278號)中。
在一些實施例中，待輸注之抗原決定基特異性mAb預先與能夠促進補體依賴性細胞毒性(CDC)之分子結合。因此，補體系統有助於或補充抗體自生物體清除病原體之能力。在受若干中之一者刺激時，隨反應之大規模擴增及細胞殺滅攻膜複合物之活化觸發活化級聯。可使用不同分子結合mAb，諸如聚糖[Courtois, A, Gac-Breton, S., Berthou, C, Guezennec, J., Bordron, A.及Boisset, C. (2012), Complement dependent cytotoxicity activity of therapeutic antibody fragments is acquired by immunogenic glycan coupling, Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458; http://www.ejbiotechnology.info DOI: 10.2225/voll5-issue5]。套組
本發明亦提供用於本方法中之套組。本發明之套組包括一或多個容器，該等容器包含如本文所述之編碼FLT3特異性CAR之聚核苷酸、包含編碼FLT3特異性CAR之聚核苷酸的經工程改造之免疫細胞或FLT特異性抗體以及根據本文所述之本發明之方法中的任一者之使用說明書。一般而言，此等說明書包含用於上述療法治療之經工程改造之免疫細胞的投藥描述。
與使用如本文所述之經工程改造之免疫細胞或抗體相關的說明書一般包括關於預期治療之劑量、給藥時程及投藥途徑的資訊。容器可為單位劑量、散裝(例如多劑量包裝)或次單位劑量。本發明之套組中供應之說明書為通常在標記或藥品說明書(例如套組中包括之紙片)上之書面說明書，但機器可讀說明書(例如磁化或光學儲存盤上載有的說明書)亦為可接受的。
本發明之套組呈適合包裝形式。適合的包裝包括(但不限於)小瓶、瓶子、罐、可撓性包裝(例如密封聚酯薄膜(Mylar)或塑膠袋)及其類似物。亦涵蓋用於與特定裝置，諸如吸入器、經鼻裝置(例如霧化器)或輸注裝置(諸如小型泵)組合之包裝。套組可具有無菌進入孔(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。容器亦可具有無菌進入孔(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑係FLT3特異性CAR或FLT3特異性抗體。容器可進一步包含第二醫藥活性劑。
套組可視情況提供諸如緩衝劑之額外組分及說明性資訊。通常，套組包含容器及在容器上或與容器相聯之標籤或藥品說明書。
提供以下實例僅為達成說明之目的，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。實際上，除了本文所示及所述之修改之外，本發明之各種修改將由熟習此項技術者根據前文描述顯而易知，且屬於所附申請專利範圍之範疇內。
本發明之代表性物質於2017年6月1日寄存於美國弗吉尼亞州20110-2209馬納薩斯10801大學大街之美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)。ATCC寄存編號為PTA-124228之載體P3E10-VL為編碼P3E10輕鏈可變區之聚核苷酸，且ATCC寄存編號為PTA-124227之載體P3E10-VH為編碼P3E10重鏈可變區之聚核苷酸。按照國際承認用於專利程序的微生物寄存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure) (布達佩斯條約(Budapest Treaty))及其下條例之規定進行存放。此保證維持自寄存之日起30年之寄存物之活力培養。 寄存將由ATCC在布達佩斯條約之條款下提供，且受制於Pfizer Inc.與ATCC之間的協議，其保證在相關美國專利發佈後或在任何美國或外國專利申請案對公眾公佈後(不分先後)，公眾可永久且無限制地利用寄存培養物之子代，且保證由美國專利及商標局委員根據35 U.S.C.第122節及依據其之委員規則(包括特定參考886 OG 638之37 C.F.R.第1.14節)經授權所確定者可利用子代。
本申請案之受讓人已同意，若在適合條件下培養時，處於寄存之物質的培養物死亡或丟失或破壞，則將通知以即時用另一相同物質置換該等物質。寄存物質之可供使用性不解釋為許可在違反由任何政府部門根據其專利法律授予權利之情況下實踐本發明。實例 實例 1 ： 在 37 ℃ 下人類 FLT3 / FLT3 抗體相互作用之動力學及親和力測定
此實例測定在37℃下各種抗FLT3抗體之動力學及親和力。全部實驗均在Biacore T200表面電漿子共振生物感測器(GE Lifesciences，Piscataway NJ)上進行。
使用10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.05% (v/v) Tween-20，pH值為7.4之操作緩衝液在25℃下進行感測器晶片製備。抗人類Fc感測器晶片係藉由在10 µL/min之流動速率下，用400 mM EDC及100 mM NHS之1:1 (v/v)混合物將Biacore CM4感測器晶片之全部流量槽活化7分鐘製得。在10 mM醋酸鈉pH 4.5中將抗人類Fc試劑(山羊抗人類IgG Fc，SouthernBiotech目錄號2081-01)稀釋至30 µg/mL且以20 µL/min注射於全部流量槽上，歷時7分鐘。全部流量槽均在10 µL/min下用150 mM硼酸鹽緩衝液pH 8.5中之100 mM乙二胺封端，歷時7分鐘。
實驗在37℃下使用10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.05% (v/v) Tween-20，pH 7.4、1 mg/mL BSA之操作緩衝液進行。在10 µL/min之流動速率下歷時1分鐘自未經稀釋之上清液捕獲FLT3抗體至下游流量槽(流量槽2、3及4)上。各流量槽上捕獲不同抗體。流量槽1用作參考表面。在捕獲FLT3抗體之後，在30 µL/min下歷時兩分鐘將分析物(緩衝液，hFLT3)注射於全部流量槽上。在分析物注射之後，持續10分鐘監測解離，之後用三次75 mM磷酸之1分鐘注射使全部流量槽再生。對於各捕獲之FLT3抗體，進行以下分析物注射：緩衝液、11 nM hFLT3、33 nM hFLT3、100 nM hFLT3及300 nM hFLT3。收集各捕獲之FLT3抗體之緩衝液循環液以用於雙重參考目的(如Myszka, D.G. Improving biosensor analysis.J . Mol . Recognit . 12 , 279-284 (1999)中所描述之雙重參考)。雙重參考感測器圖譜經全局擬合於簡單1 : 1 朗格繆爾與質量遷移 結合模型。
所測試抗FLT3抗體之動力學及親和力參數示於表7中。表7中展示之抗體之VH區及VL區與具有同一名稱之表8中展示之CAR相同。表 7 實例 2 ： 產生 FLT3 特異性 CAR - T 細胞 a ) 質體
使用EcoRI (5')及MluI (3')限制位點將下表8中所列之以下經密碼子優化FLT3 CAR序列合成及次選殖為豆狀病毒載體，諸如pLVX-EF1a-IRES-Puro (Clontech) (因此去除IRES-Puro卡匣)。表 8 ： 例示性 FLT3 特異性 CAR
在某些實驗中，編碼CAR之序列之前為編碼諸如藍色螢光蛋白(Blue Fluorescent Protein；BFP)之序列且藉由編碼自裂解2A肽之序列與此類序列分離。慢病毒係使用psPAX2、HIV-1 gag-pol包裝質體、及pMD2.G、VSV-G表現質體製備。b ) T 細胞活化及慢病毒轉導
使用PanT細胞分離套組(Miltenyi Biotec)使未接觸之T細胞與人類周邊血液單核細胞(PBMC)分離且用對人類CD2、CD3及CD28之抗體活化三天(T細胞活化/擴增套組-Miltenyi Biotec)。慢病毒載體(LV)係藉由在6孔培養板中暫態轉染亞匯合HEK-293T/17 (美國典型培養物保藏中心(ATCC))細胞製備。簡言之，根據製造商之說明書使用脂染胺2000 (Invitrogen)分別以4:3:1比值轉染pLVX、psPAX2及pMD2.G質體。第二天，用T細胞培養基(X-vivo-15介質(Lonza)中之5%人類AB血清)置換培養基，且在轉染48 h之後收集LV上清液且經由0.45 μm針筒過濾器(Millipore)過濾。在含有40 ng/ml IL-2之T細胞培養基中以0.25 × 106 個細胞/毫升接種經活化T細胞且藉由添加相等體積之新鮮LV上清液轉導。將包含以下CAR構築體之LV用於此等實驗：P1A5、P1B4、P3A1、P3E10、P4C7、P4H11、P7H3、P9B5、P12B6及P14G2。在37℃及5% CO2下將細胞培養三天且將其用於流式細胞量測分析或在含有20 ng/ml IL-2之新鮮T細胞介質中擴增。c ) 藉由流式細胞量測術進行之轉導效率之量測
為測定不同FLT3 CAR慢病毒構築體之轉導效率，在轉導72 h之後對T細胞進行流式細胞量測分析。簡言之，單細胞係使用正向散射及側面散射參數以及經計算為BFP陽性細胞之百分比之轉導效率閘化。在其他實例中，CAR表現細胞係藉由利用結合CAR分子中之CD20抗原決定基之抗CD20抗體利妥昔單抗，之後FITC結合抗人類IgG進行染色來偵測。圖1展示在不同效率(30%至70%)下用不同FLT3 CAR構築體有效轉導經活化T細胞。d ) FLT3FLT3 CAR T 細胞在培養期間分化但維持高百分比之記憶 T 細胞亞群
在培養期間活化標記物CD25及4-1BB (CD137)對CAR T細胞之表現與T細胞清除相關且增加朝向效應子記憶表型分化(Long等人, 2015)。在此實驗中，在刺激十天後用CD25及CD137抗體染色經P1A5、P1B4、P3A1、P3E10、P4C7、P4H11、P7H3、P9B5、P12B6及P14G2 CAR轉導T細胞且藉由流式細胞量測術進行分析。T細胞活化度係藉由對CD25及4-1BB呈陽性之CAR-T細胞之百分比測定。包括未經轉導之(NT) T細胞群以用於比較(圖2)。某些FLT3FLT3 CAR (P1A5、P12B6及P14G2)之表現與「活化」態相關(圖2)而包括P9B5、P3E10、P4C7及P3A1之其他FLT3FLT3 CAR之表現產生可與未經轉導之細胞相當之活化標記物量(圖2)。較高的活化標記物表現量轉譯至增加之CAR-T細胞分化，其可藉由利用量測在其細胞表面上之CD62L及CD45RO表現進行之15天後刺激來評估。在此實驗中，CAR-T細胞使用特異性抗體利用此類標記物染色且利用增加之分化程度分為四種不同類別或亞群：1) CD62L高 CD45RO低 幹細胞記憶(Tscm)細胞；2) CD62L高 CD45RO高 中央記憶(Tcm)細胞；CD62L低 CD45RO高 效應子記憶(Tem)細胞；及CD62L低 CD45RO低 效應子(Teff)細胞。圖3展示在15天後刺激時P9B5 CAR-T細胞(低分化)及P14G2 CAR-T細胞(高分化)以及全部不同FLT3FLT3 CAR-T細胞之T細胞亞群組合物的代表性FACS曲線。展現「活化」表型之CAR-T細胞亦展示到培養結束時更多的分化表型(亦即較高之Tem細胞百分比及較低之Tscm細胞百分比) (圖3)。詳言之，P9B5、P3A1、P7H3及P3E10 FLT3 CAR之表現與高百分比幹細胞記憶及中央記憶細胞相關，其與ALL及CLL個體中之提高的持久性及抗腫瘤功效相關(Xu 等人 , Blood . 2014 ; 123 ( 24 ): 3750 - 3759 )。e ) 活體外增殖及長期殺滅活性分析
CAR-T細胞增殖及溶解表現同源抗原之靶細胞之能力係評估其活體外活性之有效方式為藉由發光監測靶細胞存活性，FLT3表現Molm13細胞經穩定轉導以表現螢光素酶基因。此等Luc+靶細胞隨後與FLT3 CAR-T細胞一起培育且CAR-T細胞之殺滅活性以及增殖係分別藉由發光及活細胞計數量測。對於經設計以應激效應細胞(CAR-T細胞)之更加嚴格的分析，將新靶細胞週期性添加至初始培養物且在培養結束時藉由發光測定CAR-T細胞之長期殺滅活性(圖4)。與幹細胞記憶及中央記憶T細胞之較高增殖能力一致，P9B5、P3A1、P7H3及P3E10 CAR-T細胞群展示在活體外較高的標靶依賴性擴增及長期細胞毒活性而具有較高分化程度之CAR-T細胞(諸如P12B6及P14G2)在靶細胞存在下擴增不良且具有降低之殺滅活性。f ) 正位小鼠分析中之 FLT3 特異性 CAR - T 細胞之活性
此實例說明使用Eol1正位模型利用FLT3 CAR-T細胞治療AML。在正位模型中使用表現螢光素酶及GFP之Eol1細胞進行FLT3 CAR-T細胞之活體內功效研究。經由尾部靜脈將三十萬Eol1 Luc2AGFP細胞靜脈內注射於6-8週齡雌性CB17/SCID動物。D-螢光素(Regis Technologies，Morton Grove，IL)之腹膜內注射(15 mg/mL下200微升/動物)，繼之以利用異氟醚之麻醉及後續全部身體生物發光成像(BLI)能夠實現腫瘤負荷之監測。藉由腫瘤細胞所表現之螢光素酶與螢光素之間的相互作用發射之生物發光信號藉由使用IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer，MA)之成像捕獲且使用Living Image 4.4 (Caliper Life Sciences，Alameda，CA)以總通量(光子/秒)定量。
當對於全部動物而言總通量達到平均30E6 (腫瘤植入10天後)時，動物隨機分為三個組。各組經投與以下細胞中之一者：1)用作對照之未經轉導之T細胞；2) 表現P3E10之FLT3 CAR-T細胞(「P3E10 V1」)，或3)表現P3A1之FLT3 CAR-T細胞 (「P3A1 v1」)。細胞1-3均具有TCRα。如上文實例中所描述製備FLT3 CAR-T細胞。FLT3 CAR構築體P3E10及P3A1示於上表8中。經由快速尾部靜脈注射投與單次劑量之2.5或5百萬個對照(NT)或FLT3 CAR-T (P3E10或P3A1)細胞。當動物損失大於15%之總體重(Eol1正位模型之終點)時，結束其生命。
研究結果概括於圖5中。相比於陰性對照，單次劑量之5百萬P3E10或P3A1 FLT3 CAR-T細胞或2.5百萬P3E10 FLT3 CAR-T細胞導致自13-43天後腫瘤植入物之總通量降低。因此，用FLT3 CAR-T細胞治療相比於陰性對照抑制腫瘤進展。
此等結果表明FLT3 CAR-T細胞可有效抑制腫瘤進展。實例 3 ： 清除表現 CD20 抗原決定基之 FLT3 特異性 CAR T 細胞 a)表現CD20抗原決定基之FLT3特異性CAR T細胞在利妥昔單抗存在下對補體依賴性細胞毒性(CDC)敏感
使用CDC分析在活體外評估在抗CD20抗體存在下FLT3特異性CAR T細胞對補體之敏感度。對於此實驗，在存在或不存在利妥昔單抗(100 µg/mL)情況下使用於在胞外域中表現含有CD20抗原決定基之FLT3 CAR之經慢病毒構築體轉導的T細胞與25%補體(AbD serotec)混合且在37℃及5% CO2 下培育4小時。FLT3 CAR T細胞之清除係使用生物素標記之FLT3蛋白藉由流式細胞量測分析測定。圖6展示表現FLT3 CAR及CD20抗原決定基之細胞在抗體及補體存在下有效清除，而不表現CD20抗原決定基之對照FLT3特異性CAR T細胞受影響程度最低。
此等結果表明表現CD20抗原決定基之FLT3特異性CAR-T細胞可在利妥昔單抗及補體存在下活體外清除。 b)在利妥昔單抗投藥之後FLT3 CAR T細胞之清除允許NSG小鼠中FLT3表現骨髓祖細胞之恢復。
在小鼠中測試抗CD20抗體利妥昔單抗介導表現CD20抗原決定基之FLT3特異性CAR T細胞之清除及促進骨髓恢復的能力。在此實驗中，用T細胞治療小鼠，該等T細胞表現可在骨髓祖細胞之表面上結合於小鼠FLT3蛋白且包含由利妥昔單抗識別之CD20抗原決定基之FLT3 CAR (α-小鼠FLT3 CAR T)或幾乎不結合於小鼠FLT3蛋白之對照CAR。使用骨髓細胞之流式細胞量測分析表明對FLT3表現造血祖細胞之CAR T細胞細胞毒活性，視為相比於接受對照CAR T細胞之小鼠或未經治療之小鼠祖細胞減少(圖7，B圖)。在證實CAR T細胞殺滅活性之後，給予小鼠利妥昔單抗，歷時四個連續日且在第13天藉由流式細胞量測術枚舉循環的殘餘CAR T細胞。圖7，C圖展示相比於不接受利妥昔單抗之對照組，此等小鼠之血液中之FLT3 CAR T細胞清除。最後，骨髓細胞之流式細胞量測分析證明僅接受利妥昔單抗(第20天)之小鼠展示骨髓恢復(圖7，D圖)。
此實驗表明表現CD20抗原決定基之FLT3 CAR T細胞之利妥昔單抗依賴性清除減輕對諸如骨髓之FLT3表現組織的損傷，從而允許自殘餘祖細胞之快速骨髓恢復。
雖然已參考不同申請案、方法、套組及組合物描述所揭示教示，但將瞭解在不背離本文中之教示及下文所主張之本發明情況下可進行不同變化及修改。提供前述實例以更好地說明所揭示之教示，且不意欲限制本文中呈現教示之範疇。儘管已在此等例示性實施例方面描述本發明教示內容，但熟練技術人員將容易理解在無不當實驗情況下此等例示性實施例之大量變化及修改為可能的。所有此類變化及修改在當前教示之範疇內。
本文中所引用之全部參考文獻(包括專利案、專利申請案、論文、課本及類似者)及其中引用的參考文獻至其尚未引用之程度，在此以全文引用之方式併入本文中。在所併入文獻及類似材料中之一或多者(包括但不限於定義之術語、術語用法、所描述之技術等)與本申請案不同或抵觸的情況下，以本申請案為準。
前述描述及實例詳述本發明的某些特定實施例，且描述本發明人預期之最佳模式。然而，將瞭解，無論以文字呈現之前述內容如何詳細，本發明可以許多方式實踐，且本發明應根據所附申請專利範圍及其任何等效物解釋。
圖1展示代表性FACS圖，其表明相對於未經轉導之對照，用P3A1 CAR構築體實現之經活化T細胞之有效轉導，及全部構築體隨CAR表現T細胞之百分比及平均螢光強度(MFI)而變之轉導效率。
圖2展示利用藉由流式細胞量測術評估之各種CAR構築體轉導之T細胞中的活化標記物CD25及4-1BB之表現。
圖3展示如藉由CD62L及/或CD45RO標記物之表現之流式細胞測量術分析所測定，在培養結束時CAR-T細胞之表型。
圖4展示長期殺滅分析之總體實驗設計及在第6天隨倍數擴增及細胞毒活性(溶解百分比)量測之不同CAR-T細胞對重複暴露於靶細胞之反應。
圖5展示使用人類AML之正位小鼠模型，在兩種劑量下表現P3A1或P3E10構築體之CAR-T細胞之抗腫瘤活性。在不同時間點展示定量為總通量(光子/秒)之生物發光信號。
圖6展示在細胞表面表現包含CD20抗原決定基之FLT3特異性CAR之T細胞對藉由抗CD20抗體利妥昔單抗誘導之補體依賴細胞毒性(CDC)之敏感度。
圖7展示用表現CD20抗原決定基之抗小鼠FLT3CAR T細胞治療且隨後用利妥昔單抗投與之小鼠中之內源性骨髓祖細胞的恢復。

Claims (87)

  1. 一種Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)特異性嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外配位體結合域、第一跨膜域及胞內信號傳導域，其中該胞外配位體結合域包含單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段(scFv)包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中該scFv結合至SEQ ID NO: 202 (FLT3之結構域4)或SEQ ID NO: 200 (FLT3之結構域2)。
  2. 一種Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)特異性嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外配位體結合域、第一跨膜域及胞內信號傳導域，其中該胞外域包含單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段(scFv)包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中 (a)該VH區包含(i)具有示於SEQ ID NO: 37、38、39、43、44、45、49、50、54、55、56、60、61、62、66、67、68、72、73、74、78、79、80、84、85、86、90、91、92、96、97、98、102、103、104、108、109、110、114、115、116、120、121、122、126、127、128、132、133、134、138、139、140、294、295、296、300、301、305、306、307、311、312、316、317或318中之胺基酸序列之VH互補決定區1 (CDR1)；(ii)具有示於SEQ ID NO: 40、41、46、47、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76、81、82、87、88、93、94、99、100、105、106、111、112、117、118、123、124、129、130、135、136、141、142、297、298、302、303、308、309、313、314、319、320或322中之胺基酸序列之VH互補決定區2 (CDR2)；及(iii)具有示於SEQ ID NO: 42、48、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、299、304、310、315或321中之胺基酸序列之VH互補決定區3 (CDR3)；及/或 (b)該VL區包含(i)具有示於SEQ ID NO: 144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、323、326、328、331、336、338、340、343、345、348或350中之胺基酸序列之VL互補決定區1 (CDR1)；(ii)具有示於SEQ ID NO: 145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、324、329、332、334、341或346中之胺基酸序列之VL互補決定區2 (CDR2)；及(iii)具有示於SEQ ID NO: 146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、325、327、330、333、335、337、339、342、344、347或349中之胺基酸序列之VL互補決定區3 (CDR3)。
  3. 一種Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)特異性嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外配位體結合域、第一跨膜域及胞內信號傳導域，其中該胞外域包含單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段(scFv)包含具有示於SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中之序列之重鏈可變(VH)區。
  4. 一種Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)特異性嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外配位體結合域、第一跨膜域及胞內信號傳導域，其中該胞外域包含單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段(scFv)包含具有示於SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中之序列之輕鏈可變(VL)區。
  5. 一種Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)特異性嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外配位體結合域、第一跨膜域及胞內信號傳導域，其中該胞外域包含單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段(scFv)包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中該VH區包含示於SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中之序列；且該VL區包含示於SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中之序列。
  6. 一種Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)特異性嵌合抗原受體(CAR)，其包含胞外配位體結合域、第一跨膜域及胞內信號傳導域，其中該胞外域包含單鏈可變片段(scFv)，該單鏈可變片段(scFv)包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中 (a)該VH區包含：包含示於SEQ ID NO: 49、44或50中之胺基酸序列之VH CDR1；包含示於SEQ ID NO: 51或52中之胺基酸序列之VH CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 53中之胺基酸序列之VH CDR3；且該VL區包含：包含示於SEQ ID NO: 150中之胺基酸序列之VL CDR1；包含示於SEQ ID NO: 151中之胺基酸序列之VL CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 152中之胺基酸序列之VL CDR3，或 (b)該VH區包含：包含示於SEQ ID NO: 90、91或92中之胺基酸序列之VH CDR1；包含示於SEQ ID NO: 93或94中之胺基酸序列之VH CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 95中之胺基酸序列之VH CDR3；且該VL區包含：包含示於SEQ ID NO: 171中之胺基酸序列之VL CDR1；包含示於SEQ ID NO: 172中之胺基酸序列之VL CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 173中之胺基酸序列之VL CDR3。
  7. 如請求項2至5中任一項之FLT3特異性CAR，其中該VH區包含示於SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中之序列，或其具有一個或若干個保守胺基酸取代在非位於CDR內之殘基中之變異體及/或該VL區包含示於SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中之胺基酸序列，或其具有一個或若干個保守胺基酸取代在非位於CDR內之胺基酸中之變異體。
  8. 如請求項1至7中任一項之FLT3特異性CAR，其中該VH區包含：包含示於SEQ ID NO: 49、44或50中之胺基酸序列之VH CDR1；包含示於SEQ ID NO: 51或52中之胺基酸序列之VH CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 53中之胺基酸序列之VH CDR3；且該VL區包含：包含示於SEQ ID NO: 150中之胺基酸序列之VL CDR1；包含示於SEQ ID NO: 151中之胺基酸序列之VL CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 152中之胺基酸序列之VL CDR3。
  9. 如請求項1至7中任一項之FLT3特異性CAR，其中該VH區包含：包含示於SEQ ID NO: 90、91或92中之胺基酸序列之VH CDR1；包含示於SEQ ID NO: 93或94中之胺基酸序列之VH CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 95中之胺基酸序列之VH CDR3；且該VL區包含：包含示於SEQ ID NO: 171中之胺基酸序列之VL CDR1；包含示於SEQ ID NO: 172中之胺基酸序列之VL CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 173中之胺基酸序列之VL CDR3。
  10. 如請求項8之FLT3特異性CAR，其中該VH區包含示於SEQ ID NO: 6中之胺基酸序列且該VL區包含示於SEQ ID NO: 5中之胺基酸序列。
  11. 如請求項9之FLT3特異性CAR，其中該VH區包含示於SEQ ID NO: 20中之胺基酸序列且該VL區包含示於SEQ ID NO: 19中之胺基酸序列。
  12. 如請求項1至7中任一項之FLT3特異性CAR，其中該VH區包含：包含示於SEQ ID NO: 43、44或45中之胺基酸序列之VH CDR1；包含示於SEQ ID NO: 46或47中之胺基酸序列之VH CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 48中之胺基酸序列之VH CDR3；且該VL區包含：包含示於SEQ ID NO: 147中之胺基酸序列之VL CDR1；包含示於SEQ ID NO: 148中之胺基酸序列之VL CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 149中之胺基酸序列之VL CDR3。
  13. 如請求項12之FLT3特異性CAR，其中該VH區包含示於SEQ ID NO: 4中之胺基酸序列且該VL區包含示於SEQ ID NO: 3中之胺基酸序列。
  14. 如請求項1至7中任一項之FLT3特異性CAR，其中該VH區包含：包含示於SEQ ID NO: 60、61或62中之胺基酸序列之VH CDR1；包含示於SEQ ID NO: 63或64中之胺基酸序列之VH CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 65中之胺基酸序列之VH CDR3；且該VL區包含：包含示於SEQ ID NO: 156中之胺基酸序列之VL CDR1；包含示於SEQ ID NO: 157中之胺基酸序列之VL CDR2；及包含示於SEQ ID NO: 158中之胺基酸序列之VL CDR3。
  15. 如請求項14之FLT3特異性CAR，其中該VH區包含示於SEQ ID NO: 10中之胺基酸序列且該VL區包含示於SEQ ID NO: 9中之胺基酸序列。
  16. 如請求項1至15中任一項之FLT3特異性CAR，其中該胞內信號傳導域包含CD3ζ信號傳導域。
  17. 如請求項1至15中任一項之FLT3特異性CAR，其中該胞內信號傳導域包含4-1BB結構域。
  18. 如請求項1至17中任一項之FLT3特異性CAR，其包含第二胞內信號傳導域。
  19. 如請求項18之FLT3特異性CAR，其中該第二胞內信號傳導域包含4-1BB結構域。
  20. 如請求項1至19中任一項之FLT3特異性CAR，其在該胞外配位體結合域與該第一跨膜域之間包含莖結構域。
  21. 如請求項20之FLT3特異性CAR，其中該莖結構域選自由以下組成之群：CD8α鉸鏈、IgG1鉸鏈及FcγRIIIα鉸鏈。
  22. 如請求項1至21中任一項之FLT3特異性CAR，其包含對單株抗體具有特異性之一或多種抗原決定基。
  23. 如請求項22之FLT3特異性CAR，其中該抗原決定基選自由以下組成之群：CD52抗原決定基、CD20抗原決定基、CD3抗原決定基、CD41抗原決定基、CD25抗原決定基、CD30抗原決定基、EGFR抗原決定基、TNFα抗原決定基、VEGF抗原決定基、補體蛋白C5抗原決定基、CD11a抗原決定基、CD33抗原決定基、α-4整合素抗原決定基、IgE Fc區抗原決定基、RSV蛋白F抗原決定基、IL-6受體抗原決定基、HER2受體抗原決定基、整合素α4 β7 抗原決定基、BAFF (B細胞活化因子)抗原決定基、IL-1β抗原決定基、RANKL抗原決定基、CTLA4抗原決定基、CD34抗原決定基、IL-12抗原決定基、IL-23抗原決定基，以及其組合。
  24. 如請求項22或23之FLT3特異性CAR，其中該抗原決定基係可被以下特異性識別之抗原決定基：阿侖單抗(alemtuzumab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、莫羅單抗-CD3 (muromonab-CD3)、托西莫單抗(tositumomab)、阿昔單抗(abciximab)、巴利昔單抗(basiliximab)、本妥昔單抗維多汀(brentuximab vedotin)、西妥昔單抗(cetuximab)、英夫利昔單抗(infliximab)、利妥昔單抗(rituximab)、貝伐單抗(bevacizumab)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)、達利珠單抗(daclizumab)、艾庫組單抗(eculizumab)、艾法珠單抗(efalizumab)、吉妥單抗(gemtuzumab)、那他珠單抗(natalizumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、托西利單抗(tocilizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、阿達木單抗(adalimumab)、貝利單抗(belimumab)、卡納單抗(canakinumab)、地諾單抗(denosumab)、戈利木單抗(golimumab)、伊匹利單抗(ipilimumab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、帕尼單抗(panitumumab)、QBEND-10或優特克單抗(ustekinumab)。
  25. 如請求項22至24中任一項之FLT3特異性CAR，其中該抗原決定基係CD20抗原決定基。
  26. 如請求項25之FLT3特異性CAR，其中該CD20抗原決定基包含示於SEQ ID NO: 229中之胺基酸序列。
  27. 如請求項1之FLT3特異性CAR，其中該FLT3特異性CAR包含示於SEQ ID NO: 235、236、237或242中之胺基酸序列。
  28. 如請求項1之FLT3特異性CAR，其中該FLT3特異性CAR包含示於SEQ ID NO: 235中之胺基酸序列。
  29. 如請求項1之FLT3特異性CAR，其中該FLT3特異性CAR包含示於SEQ ID NO: 236中之胺基酸序列。
  30. 如請求項1至29中任一項之FLT3特異性CAR，其中該第一跨膜域包含CD8α鏈跨膜域。
  31. 如請求項1至30中任一項之FLT3特異性CAR，其包含對FLT3不具有特異性之第二胞外配位體結合域。
  32. 如請求項1至31中任一項之FLT3特異性CAR，其中該(等)胞外配位體結合域、該第一跨膜域及胞內信號傳導域係於單一多肽上。
  33. 如請求項1至32中任一項之FLT3特異性CAR，其包含第二跨膜域，其中該第一跨膜域及該(等)胞外配位體結合域係於第一多肽上，且其中該第二跨膜域及該(等)胞內信號傳導域係於第二多肽上，其中該第一跨膜域包含來自高親和力IgE受體(FcεRI)之α鏈之跨膜域且該第二跨膜域包含來自FcεRI之γ或β鏈之跨膜域。
  34. 如請求項33之FLT3特異性CAR，其包含第三多肽，該第三多肽包含融合至來自共刺激分子之胞內信號傳導域之第三跨膜域，其中該第三跨膜域包含來自該FcεRI之γ或β鏈之跨膜域。
  35. 一種聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至34中任一項之FLT3特異性CAR之核酸序列。
  36. 如請求項35之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含具有ATCC寄存編號PTA-124227之載體之核酸序列。
  37. 如請求項35之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含具有ATCC寄存編號PTA-124228之載體之核酸序列。
  38. 如請求項35之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含示於SEQ ID NO: 253中之核酸序列。
  39. 如請求項35之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含示於SEQ ID NO: 248中之核酸序列。
  40. 如請求項35之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含示於SEQ ID NO: 247中之核酸序列。
  41. 如請求項35之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含示於SEQ ID NO: 246中之核酸序列。
  42. 如請求項35之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含示於SEQ ID NO: 245中之核酸序列。
  43. 一種表現載體，其包含如請求項35至42中任一項之聚核苷酸。
  44. 一種經工程改造之免疫細胞，其表現如請求項1至34中任一項之FLT3特異性CAR。
  45. 如請求項44之經工程改造之免疫細胞，其包含對FLT3不具有特異性之另一CAR。
  46. 如請求項44或45之經工程改造之免疫細胞，其包含編碼自殺多肽之聚核苷酸。
  47. 如請求項46之經工程改造之免疫細胞，其中該自殺多肽係RQR8。
  48. 如請求項44至47中任一項之經工程改造之免疫細胞，其中該免疫細胞衍生自發炎性T淋巴球、細胞毒性T淋巴球、調節T淋巴球或輔助T淋巴球。
  49. 如請求項44至48中任一項之經工程改造之免疫細胞，其包含一或多種內源基因之破壞，其中該內源性基因編碼TCRα、TCRβ、CD52、糖皮質激素受體(GR)、脫氧胞苷激酶(dCK)或免疫檢查點蛋白。
  50. 如請求項49之經工程改造之免疫細胞，其中該免疫檢查點蛋白係計劃性死亡-1 (PD-1)。
  51. 如請求項44至50中任一項之經工程改造之免疫細胞，其中該免疫細胞獲自健康供體。
  52. 如請求項44至50中任一項之經工程改造之免疫細胞，其中該免疫細胞獲自患有疾病或病症之供體。
  53. 如請求項44至52中任一項之經工程改造之免疫細胞，其用作藥劑。
  54. 如請求項53之經工程改造之免疫細胞，其中該藥劑用於治療選自由以下組成之群之癌症：多發性骨髓瘤、惡性漿細胞贅瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、結節性淋巴球為主型之霍奇金氏淋巴瘤、卡勒氏病(Kahler's disease)及骨髓瘤病、漿細胞白血病、漿細胞瘤、B細胞前淋巴球性白血病、毛細胞白血病、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia；AML)、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia；CLL)、急性淋巴球性白血病(acute lymphocytic leukemia；ALL)、慢性骨髓性白血病(chronic myeloid leukemia；CML)、濾泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、邊緣區淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、前驅體B淋巴母細胞淋巴瘤、骨髓性白血病、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulienemia)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴球性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、結(nodal)邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤(effusion lymphoma)、淋巴瘤樣肉芽腫、富T細胞/組織細胞大B細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性皮膚瀰漫性大B細胞淋巴瘤(腿型)、老年人之EBV陽性瀰漫性大B細胞淋巴瘤、與發炎相關之瀰漫性大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、在HHV8相關之多中心卡斯曼病(Castleman disease)中出現之大B細胞淋巴瘤、具有瀰漫性大B細胞淋巴瘤與伯基特淋巴瘤之間的中間特徵之未經分類B細胞淋巴瘤、具有瀰漫性大B細胞淋巴瘤與典型霍奇金淋巴瘤之間的中間特徵之未經分類B細胞淋巴瘤、以及其他造血細胞相關之癌症。
  55. 如請求項44至54中任一項之經工程改造之免疫細胞，其中該FLT3特異性CAR包含胞外域，該胞外域包含scFv， 其中該scFv以包含於10 nM與80 nM之間的KD 結合至人類FLT3之胞外域，或 其中該scFv以包含於1 nM與100 nM之間的KD 結合至人類FLT3之胞外域的結構域4，或 其中該scFv以包含於5 nM與30 nM之間的KD 結合至人類FLT3之胞外域的結構域2-3。
  56. 一種細胞群，其包含如請求項44至55中任一項之經工程改造之免疫細胞，其中 (ii)該細胞群包含大於20%、30%或40%之幹細胞記憶細胞及中央記憶細胞之百分比，及/或 (iii)該細胞群達成大於10%、20%、30%或40%之FLT3表現細胞之溶解百分比。
  57. 一種工程改造表現FLT3特異性CAR之免疫細胞之方法，其包含： a. 提供免疫細胞；及 b. 將編碼如請求項1至34中任一項之FLT3特異性CAR之至少一種聚核苷酸引入至該細胞中； 藉此該免疫細胞表現該FLT3特異性CAR。
  58. 一種工程改造免疫細胞之方法，其包含： a. 提供免疫細胞； b. 將編碼如請求項1至34中任一項之FLT3特異性CAR之至少一種聚核苷酸引入至該細胞中；及 c. 將編碼對FLT3不具有特異性之CAR之至少一種聚核苷酸引入至該細胞中。
  59. 一種治療有需要之個體之方法，其包含： a. 提供表現如請求項1至34中任一項之FLT3特異性CAR之免疫細胞的群體；及 b. 向該個體投與該免疫細胞之群體。
  60. 一種醫藥組合物，其包含如請求項44至52中任一項之經工程改造之免疫細胞。
  61. 一種治療有需要之個體中與FLT3相關的疾病或病症之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項60之醫藥組合物或如請求項44至52中任一項之經工程改造之免疫細胞。
  62. 如請求項61之方法，其中與FLT3相關之疾病或病症係癌症。
  63. 如請求項62之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：多發性骨髓瘤、惡性漿細胞贅瘤、霍奇金氏淋巴瘤、結節性淋巴球為主型之霍奇金氏淋巴瘤、卡勒氏病及骨髓瘤病、漿細胞白血病、漿細胞瘤、B細胞前淋巴球性白血病、毛細胞白血病、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、濾泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、大細胞淋巴瘤、前驅體B淋巴母細胞淋巴瘤、骨髓性白血病、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴球性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症、結邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、富T細胞/組織細胞大B細胞淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性皮膚瀰漫性大B細胞淋巴瘤(腿型)、老年人之EBV陽性瀰漫性大B細胞淋巴瘤、與發炎相關之瀰漫性大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK陽性大B細胞淋巴瘤、漿母細胞淋巴瘤、在HHV8相關之多中心卡斯曼病中出現之大B細胞淋巴瘤、具有瀰漫性大B細胞淋巴瘤與伯基特淋巴瘤之間的中間特徵之未經分類B細胞淋巴瘤、具有瀰漫性大B細胞淋巴瘤與典型霍奇金淋巴瘤之間的中間特徵之未經分類B細胞淋巴瘤、以及其他造血細胞相關之癌症。
  64. 一種抑制具有表現FLT3之惡性細胞之個體中腫瘤生長或進展之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項60之醫藥組合物或如請求項44至52中任一項的經工程改造之免疫細胞。
  65. 一種抑制有需要之個體中表現FLT3的惡性細胞轉移之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項60之醫藥組合物或如請求項44至52中任一項的經工程改造之免疫細胞。
  66. 一種誘導具有表現FLT3之惡性細胞之個體中腫瘤消退之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項60之醫藥組合物或如請求項44至52中任一項的經工程改造之免疫細胞。
  67. 如請求項61至66中任一項之方法，其中該方法包含向該個體投與核苷類似物療法。
  68. 如請求項67之方法，其中該核苷類似物療法係氟達拉賓(fludarabine)或氯法拉濱(clofarabine)。
  69. 如請求項61至66中任一項之方法，其中該方法包含向該個體投與受體酪胺酸激酶抑制劑、mTOR抑制劑、表觀遺傳(epigenetic)調節劑、蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑、Hedgehog抑制劑或異檸檬酸去氫酶(IDH)抑制劑或其組合。
  70. 如請求項61至66中任一項之方法，其中該方法包含向該個體投與蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑或Hedgehog抑制劑或其組合。
  71. 如請求項61至66中任一項之方法，其中該方法包含向該個體投與來那度胺(lenalidomide)。
  72. 一種用於活體外分選免疫細胞群體之方法，其中該免疫細胞群體之子集包含表現如請求項22至26中任一項之FLT3特異性嵌合抗原受體(CAR)的經工程改造之免疫細胞，該方法包含： a. 使該免疫細胞群體與對該抗原決定基具有特異性之單株抗體接觸；及 b. 選擇結合至該單株抗體之免疫細胞以獲得經工程改造之免疫細胞經富集之細胞群。
  73. 如請求項72之方法，其中對該抗原決定基具有特異性之單株抗體係經共軛至螢光團，且視情況選擇結合至該單株抗體之細胞的步驟係藉由螢光活化細胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorting；FACS)進行。
  74. 如請求項72之方法，其中對該抗原決定基具有特異性之單株抗體係經共軛至磁性顆粒，且視情況選擇結合至該單株抗體之細胞的步驟係藉由磁性活化細胞分選(Magnetic Activated Cell Sorting；MACS)進行。
  75. 如請求項72至74中任一項之方法，其中該抗原決定基係CD 20抗原決定基。
  76. 如請求項75之方法，其中該CD20抗原決定基具有示於SEQ ID NO: 229中之胺基酸序列，且視情況該單株抗體係利妥昔單抗。
  77. 如請求項72至76中任一項之方法，其中該經工程改造之免疫細胞經富集之細胞群包含至少70%的表現FLT3 CAR之免疫細胞。
  78. 一種用於自個體清除(depleting)經工程改造之免疫細胞之方法，其中該個體已投與表現如請求項22至26中任一項之FLT3特異性嵌合抗原受體(CAR)之經工程改造之免疫細胞，該方法包含向該個體投與對該抗原決定基具有特異性之單株抗體。
  79. 如請求項76之方法，其中該抗原決定基係CD20抗原決定基。
  80. 如請求項79之方法，其中該CD20抗原決定基具有示於SEQ ID NO: 229中之胺基酸序列，且視情況該單株抗體係利妥昔單抗。
  81. 如請求項78至80中任一項之方法，其中該單株抗體係經共軛至可活化補體系統之分子。
  82. 如請求項78至80中任一項之方法，其中細胞毒性藥物係經偶合至該單株抗體。
  83. 一種用於促進個體中內源性表現FLT3之骨髓祖細胞恢復的方法，該個體經投與表現如請求項22至26中任一項之FLT3特異性嵌合抗原受體(CAR)的經工程改造之免疫細胞，該方法包含向患者投與對該抗原決定基具有特異性之單株抗體。
  84. 如請求項83之方法，其中該抗原決定基係CD20抗原決定基。
  85. 如請求項84之方法，其中該CD20抗原決定基具有示於SEQ ID NO: 229中之胺基酸序列，且視情況該單株抗體係利妥昔單抗。
  86. 如請求項83至85中任一項之方法，其中該單株抗體係經共軛至可活化該補體系統之分子。
  87. 如請求項83至85中任一項之方法，其中細胞毒性藥物係經偶合至該單株抗體。
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