BR112019024604A2

BR112019024604A2 - Receptores de antígenos quiméricos que alvejam flt3

Info

Publication number: BR112019024604A2
Application number: BR112019024604-5A
Authority: BR
Inventors: Johnson Sasu Barbra; Barbra Johnson Sasu; Elizabeth Dettling Danielle; Danielle Elizabeth DETTLING; Adolfo Sommer Cesar; Cesar Adolfo Sommer; Andy Yeung Yik; Yik Andy Yeung; Marc HAMZE Moustafa; Moustafa Marc Hamze
Original assignee: Pfizer Inc.
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2020-06-23
Also published as: MX2019013923A; CA3062328A1; TW201902919A; CN110831970A; IL270896A; JP7317718B2; TW202323272A; SG10202108528QA; NZ759042A; TWI778068B; PE20191847A1; RU2019143419A3; RU2019143419A; PH12019502637A1; US20230181634A1; CO2019013654A2; JP2023134419A; WO2018222935A1; AU2018278321A1; JP2020522252A

Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam especificamente à tirosina quinase 3 similar a Fms (FLT3), receptores quiméricos de antígeno (CARs) que se ligam especificamente a FLT3 e células imunológicas modificadas que expressam esses CARs (por exemplo, células CAR-T específicas de FLT3). A invenção também fornece a produção de tais anticorpos, CARs e células imunológicas projetadas. A invenção também fornece o uso de tais anticorpos, CARs e células imunológicas projetadas, por exemplo, para o tratamento de uma condição associada a células malignas que expressam FLT3 (por exemplo, câncer).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RECEPTO- RES DE ANTÍGENOS QUIMÉRICOS QUE ALVEJAM FLT3". Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

[0001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido Provisório nº US 62/514.634, depositado em 2 de junho de 2017, cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0002] O conteúdo dos Pedidos Provisórios nº* US 62/514.574, depositado em 2 de junho de 2017 e 62/660.908, depositado em 20 de abril de 2018, e um Pedido PCT intitulado "ANTIBODIES SPECIFIC FOR FLT3 AND THEIR USES", depositado em 31 de maio de 2018, divulga anticorpos específicos de FLT3, são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Referência à Listagem De Sequências

[0003] Este pedido está sendo arquivado eletronicamente via EFS- Web e inclui uma listagem de sequências enviada eletronicamente no formato .txt. O arquivo .txt contém uma listagem de sequências intitu- lada "ALGN 010 01WO SegqList ST25.txt" criada em 24 de maio de 2018 e com um tamanho de 238 KB. A listagem de sequências contida neste arquivo .txt faz parte do relatório descritivo e é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Campo

[0004] São fornecidos no presente documento anticorpos especiífi- cos de tirosina quinase 3 (FLT3) similares a Fms, receptores quiméri- cos de antígeno (CARs) que se ligam especificamente a FLT3 (CARs FLT3), polinucleotídeos que codificam CARs FLT3 e células imunoló- gicas projetadas que compreendem os CARs específicos de FLT3 (por exemplo, células CAR-T FLT3). A invenção refere-se ainda a métodos de engenharia de células imunológicas para expressar CARs especifi- cos de FLT3 e métodos de uso de anticorpos específicos de FLT3 e células CAR-T específicas de FLT3 para o tratamento de condições associadas a FLT3 (por exemplo, células malignas que expressam FLT3). Antecedentes da Invenção

[0005] A transferência adotiva de células imunológicas genetica- mente modificadas para reconhecer antígenos associados à maligni- dade se mostra promissora como uma nova abordagem para o trata- mento do câncer (ver, por exemplo, Brenner et al., Current Opinion in Immunology, 22(2): 251-257 (2010); Rosenberg et al., Nature Reviews Cancer, 8(4): 299-308 (2008)). As células T podem ser geneticamente modificadas para expressar receptores quiméricos de antígeno (CARs), proteínas de fusão constituídas por uma porção de reconhe- cimento de antígeno e domínios de ativação de células T (ver, por exemplo, Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (2): 720-724 (1993), e Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol, 21 (2): 215-223 (2009)).

[0006] FLT3 é um antígeno-alvo da Leucemia Mieloide Aguda (LMA), é superexpresso nas explosões de pacientes com LMA quando comparado às células saudáveis e é expresso na maioria das células dos pacientes (Carow et al, 2 de fevereiro de 1996 Blood: 87(3) Birg et al. Novembro de 1992 Blood: 80(10)). O FLT3 é um gene frequente- mente mutado em pacientes com LMA, e as mutações estão associa- das a um mau prognóstico (Abu-Duhier et al. Ir. J. Haematol. Outubro de 2000; 111(1): 190-5, Yamamoto et al. 15 de abril de 2001; Blood: 97(8)). Os inibidores de FLT3 de moléculas pequenas mostraram ativi- dade em ensaios clínicos; no entanto, as respostas são geralmente transitórias devido à aquisição de resistência. Adicionalmente, os inibi- dores de quinase tratam apenas uma porcentagem de pacientes que expressam a forma mutada de FLT3, destacando a necessidade ur- gente de terapias melhoradas.

[0007] Por conseguinte, existe uma necessidade de tratamentos alternativos para o câncer e, em particular, malignidades que envol- vem a expressão aberrante de FLT3. No presente documento são for- necidos métodos e composições relacionados a essa necessidade. Sumário da Invenção

[0008] São fornecidos no presente documento anticorpos ou frag- mentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especifica- mente à tirosina quinase 3 similar a Fms (FLT3), receptores quiméri- cos de antígeno (CARs) que se ligam especificamente ao FLT3 e célu- las imunológicas projetadas que expressam esses CARs (por exem- plo, células CAR-T específicas de FLT3). Também é fornecida a pro- dução de tais anticorpos, CARs e células imunológicas. Além disso, é também fornecido o uso de tais anticorpos, CARs e células imunológi- cas projetadas, por exemplo, para o tratamento de uma condição as- sociada a células malignas que expressam FLT3 (por exemplo, cân- cer). Em um aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo isolado que se liga especificamente a FLT3, em que o anticorpo com- preende uma região variável de cadeia pesada (VH) com qualquer uma das sequências parciais de VH listadas na Tabela 2 e/ou uma re- gião variável de cadeia leve (VL) com qualquer uma das sequências parciais de VL listadas na Tabela 2.

[0009] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um anticorpo isolado que se liga especificamente a FLT3, em que o anti- corpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo as sequências da região determinante de comple- mentariedade (CDR1), CDR2 e CDR3 listadas na Tabela 3 e/ou (b) uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as sequên- cias CDR1, CDR2 e CDR3 listadas na Tabela 3.

[0010] Também são fornecidos no presente documento receptores quiméricos de antígeno (CARs) que se ligam a FLT3. Demonstrou-se que a expressão de CARs específicos de FLT3 em células T é eficaz para ativar as células T em contato com FLT3. Os CARs específicos de FLT3 fornecidos no presente documentos ligam-se a FLT3 humano e exibem atividade citotóxica em contato com células que expressam FLT3.

[0011] Por conseguinte, em outro aspecto, é fornecido no presente documento um receptor de antígeno quimérico específico de FLT3 (CAR) que compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular, um primeiro domínio transmembranar e um domínio de sinalização in- tracelular, em que o domínio extracelular compreende um fragmento variável de cadeia única (scFv) que se liga ao domínio extracelular de FLT3. Em algumas modalidades, são fornecidos no presente docu- mento CARs FLT3 que compreendem um domínio de ligação ao ligan- te extracelular, um primeiro domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular, em que o domínio extracelular compreende um scFv que se liga a domínios particulares do alvo FLT3, por exem- plo, ligando-se à SEQ ID NO: 199 (Domínio 1), SEQ ID NO: 200 (Do- mínio 2), SEQ ID NO: 201 (Domínio 3), SEQ ID NO: 254 (Domínio 2- 3), SEQ ID NO: 202 (Domínio 4) ou SEQ ID NO: 203 (Domínio 5), SEQ ID NO: 254 (Domínio 2-3) ou SEQ ID NO: 202 (Domínio 4).

[0012] Em algumas modalidades, os CARs específicos de FLT3 compreendem um domínio extracelular compreendendo um scFv, em que o scFv se liga ao domínio 4 do alvo FLT3 (SEQ ID NO: 202).

[0013] Em algumas modalidades, os CARs específicos de FLT3 compreendem um domínio extracelular compreendendo um scFv, em que o scFv se liga ao domínio 2 do alvo FLT3 (SEQ ID NO: 200).

[0014] O domínio extracelular de CARs específicos de FLT3 com- preende um scFv, em que o scFv compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), as re- giões VH e VL compreendendo três regiões determinantes de com- plementariedade (CDRs) específicas de FLT3.

[0015] Em algumas modalidades, a região VH compreende (i) uma região determinante de complementariedade VH um (CDR1) tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 294, 295, 296, 300, 301, 305, 306, 307, 311, 312, 316, 317 ou 318; (ii) uma região determinante de complementariedade VH dois (CDR2) tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 297, 298, 302, 303, 308, 309, 313, 314, 319, 320 ou 322; e (iii) uma região determinante de complementariedade VH três (CDR3) tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 299, 304, 310, 315 ou 321; e/ou a região VL compreende (i) uma regi- ão determinante de complementariedade VL um (CDR1) tendo a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 323, 326, 328, 331, 336, 338, 340, 343, 345, 348 ou 350; (ii) uma regi- ão determinante de complementariedade VL dois (CDR2) tendo a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 324, 329, 332, 334, 341 ou 346; e (iii) uma região determinante de complementariedade VL três (CDR3) tendo a sequência de aminoáci- dos mostrada na SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 325, 327, 330, 333, 335, 337, 339, 342, 344, 347 ou 349.

[0016] Em algumas modalidades, são fornecidos CARs especiífi- cos de FLT3 compreendendo um scFv, em que o scFv compreende uma região VH tendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2,4,6,8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 ou 293.

[0017] Em algumas modalidades, são fornecidos CARs especiífi- cos de FLT3 compreendendo um scFV, em que o scFv compreende uma região VL com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1,3,5,7,9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 ou 292.

[0018] Em algumas modalidades, são fornecidos CARs especiífi- cos de FLT3 compreendendo um scFV compreendendo uma região VH e uma região VL, em que a região VH tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2, 4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 ou 293 ; e a região VL tem a sequência mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 ou 292.

[0019] Em algumas modalidades, a região VH compreende a se- quência mostrada na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 ou 293, ou uma variante da mesma com uma ou várias substituições conservadoras de aminoácidos em resíduos que não estão dentro de uma CDR e/ou uma região VL compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 ou 292, ou uma variante da mesma com uma ou várias substituições de aminoácidos em ami- noácidos que não estão dentro de uma CDR.

[0020] Em algumas modalidades, a região VH compreende uma CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na

SEQ ID NO: 90, 91 ou 92; uma CDR2 VH compreendendo a sequên- cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 93 ou 94; e uma CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 95; e uma região variável da cadeia leve (VL) compreendendo as seguintes CDRs: uma CDR1 VL compreendendo a sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID NO: 171; uma CDR2 VL compreenden- do a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 172; e uma CDR3 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 173.

[0021] Em algumas modalidades, a região VH compreende a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 20 e a região VL compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:

19.

[0022] Em algumas modalidades, a região VH compreende uma CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 43, 44 ou 45; uma CDR2 VH compreendendo a sequên- cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 46 ou 47; e uma CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 48; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo as seguintes CDRs: uma CDR1 VL compreendendo a sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID NO: 147; uma CDR2 VL compreenden- do a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 148; e uma CDR3 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 149.

[0023] Em algumas modalidades, a região VH compreende a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4 e a região VL compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3.

[0024] Em algumas modalidades, a região VH compreende uma CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 49, 44 ou 50; uma CDR2 VH compreendendo a sequên-

cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 51 ou 52; e uma CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 53; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo as seguintes CDRs: uma CDR1 VL compreendendo a sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID NO: 150; uma CDR2 VL compreenden- do a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 151; e uma CDR3 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 152.

[0025] Em algumas modalidades, a região VH compreende a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6 e a região VL compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5.

[0026] Em algumas modalidades, a região VH compreende uma CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 60, 61 ou 62; uma CDR2 VH compreendendo a sequên- cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63 ou 64; e uma CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 65; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo as seguintes CDRs: uma CDR1 VL compreendendo a sequência de ami- noácidos mostrada na SEQ ID NO: 156; uma CDR2 VL compreenden- do a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 157; e uma CDR3 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 158.

[0027] Em algumas modalidades, a região VH compreende a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10 e a região VL compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 9.

[0028] Em algumas modalidades, cada CDR é definida de acordo com a definição de Kabat, a definição de Chothia, a combinação da definição de Kabat e a definição de Chothia, a definição de ADM ou a definição de contato de CDR.

[0029] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intrace-

lular compreende um domínio de sinalização de CD36. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio 4-1BB. Em algumas modalidades, o CAR específico de FLT3 compreende um segundo domínio de sinalização intracelular. Em al- gumas modalidades, o segundo domínio de sinalização intracelular compreende um domínio 4-1BB.

[0030] Em algumas modalidades, os CARs específicos de FLT3 descritos neste documento podem compreender um domínio de haste entre o domínio de ligação ao ligante extracelular e o primeiro domínio transmembranar. Em algumas modalidades, o domínio de haste é se- lecionado do grupo que consiste em: uma dobradiça CD8a, uma do- bradiça I9gG1 e uma dobradiça FeyRlilla. Em algumas modalidades, o domínio de haste é uma dobradiça CD8a humana, uma dobradiça IgG1 humana ou uma dobradiça FeyRllla humana.

[0031] Em algumas modalidades, os CARs específicos de FLT3 descritos neste documento podem compreender um ou mais epítopos específicos de um ou mais anticorpos monoclonais. Em algumas mo- dalidades, o epítopo específico de um anticorpo monoclonal é um epí- topo CD20. Em algumas modalidades, o epítopo CD20 compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 229 ou SEQ ID NO: 230.

[0032] Em algumas modalidades, o CAR específico de FLT3 com- preende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 235, 236, 237 ou 242. Em algumas modalidades, o CAR específico de FLT3 compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:

235. Em algumas modalidades, o CAR específico de FLT3 compreen- de a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 236.

[0033] Em algumas modalidades, o primeiro domínio transmem- branar compreende um domínio transmembranar de cadeia CD8a.

[0034] Em algumas modalidades, o CAR específico de FLT3 pode compreender outro domínio de ligação ao ligante extracelular que não é específico para FLT3.

[0035] Em algumas modalidades, o domínio (ou domínios) de liga- ção ao ligante extracelular, o primeiro domínio transmembranar e o domínio (ou domínios) de sinalização intracelular estão em um único polipeptídeo.

[0036] Em algumas modalidades, o CAR pode compreender um segundo domínio transmembranar, em que o primeiro domínio trans- membranar e o domínio (ou domínios) de ligação ao ligante extracelu- lar estão em um primeiro polipeptídeo e em que o segundo domínio transmembranar e o domínio (ou domínios) de sinalização intracelular estão em um segundo polipeptídeo. Em uma modalidade exemplifica- dora, o primeiro domínio transmembranar compreende um domínio transmembranar da cadeia a do receptor de IgE de alta afinidade (FceRI) e o segundo domínio transmembranar compreende um domí- nio transmembranar da cadeia y ou B do FceRI.

[0037] Em algumas modalidades, o CAR pode compreender um terceiro polipeptídeo compreendendo um terceiro domínio transmem- branar fundido a um domínio de sinalização intracelular de uma molé- cula coestimuladora, em que o terceiro domínio transmembranar com- preende um domínio transmembranar da cadeia y ou B de FceRI.

[0038] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácidos nu- cleicos que codifica o CAR específico de FLT3 aqui descrito.

[0039] Em outro aspecto, é fornecido no presente documento um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo que codifica o CAR específico de FLT3 aqui descrito.

[0040] Em outro aspecto, é aqui fornecida uma célula imunológica projetada que expressa em sua membrana da superfície celular um CAR específico de FLT3 descrito neste documento. Em algumas mo-

dalidades, a célula imunológica projetada pode compreender outro CAR que não é específico para FLT3. Em algumas modalidades, a cé- lula imunológica projetada pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo suicida. Em algumas modalidades, o polipep- tídeo suicida é ROR8.

[0041] Em algumas modalidades, a célula imunológica projetada é derivada de um linfócito T inflamatório, um linfócito T citotóxico, um linfócito T regulador ou um linfócito T auxiliar.

[0042] Em algumas modalidades, a célula imunológica projetada pode compreender uma interrupção de um ou mais genes endógenos, em que o gene endógeno codifica TORa, TORB, CD52, receptor de glicocorticoide (GR), desoxicitidina quinase (dCK) ou uma proteína de ponto de verificação imunológica, como, por exemplo, morte progra- mada-1 (PD-1).

[0043] Em algumas modalidades, a célula imunológica projetada é obtida de um doador saudável. Em algumas modalidades, a célula imunológica projetada é obtida de um indivíduo atingido por uma do- ença ou distúrbio.

[0044] Em outro aspecto, é fornecida neste documento uma célula imunológica projetada que expressa em sua membrana da superfície celular um CAR específico de FLT3, conforme descrito neste docu- mento para uso como medicamento. Em algumas modalidades, o me- dicamento que compreende as células imunológicas que expressam CAR específico de FLT3 ou anticorpos específicos de FLT3 é para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio associado a FLT3. Em uma modalidade, a doença ou distúrbio associado a FLT3 é um câncer de origem hematopoiética, como um linfoma ou leucemia. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em mi- eloma múltiplo, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma nodular predominante de linfodito de Hodgkin, doen-

ça de Kahler e mielomatose, leucemia de células plasmáticas, plasmo- citoma, leucemia prolinocítica de células B, leucemia de células pilo- sas, linfoma não Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide crônica (LMC), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de zona marginal, linfoma de células do manto, linfoma de células grandes, linfoma precursor de linfoblastos B, leucemia mie- loide, macroglobulienemia de Waldenstrom, linfoglobulienemia difusa de células B grandes, linfoma folicular, linfoma da zona marginal, lin- foma do tecido linfático associado à mucosa, linfoma de células pe- quenas, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma pri- mário de grandes células mediastinais (tímicas), linfoma linfoplasmáti- co, macroglobulinemia de Waldenstrôm, linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma da zona marginal esplênico, linfoma intravas- cular de células B grandes, linfoma de derrame primário, granulomato- se linfomatoide, linfoma de células B grandes rico em células/histió- citos, linfoma do sistema nervoso central primário, linfoma de grandes células B cutâneas primárias (tipo perna), linfoma difuso de grandes células B positivo EBV dos idosos, linfoma difuso de grandes células B associado à inflamação, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de grandes células B ALK positivo, linfoma plasmablástico, lin- foma de grandes células B surgindo na doença de Castleman multi- cêntrica associada a HHV8, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de grandes células B e linfoma de Burkitt, linfoma de células B não classificado com ca- racterísticas intermediárias entre linfoma difuso de grandes células B e linfoma de Hodgkin clássico, e outro câncer relacionado a células he- matopoiéticas, por exemplo, ALL ou LMA.

[0045] Em um aspecto, é fornecida neste documento uma popula- ção de células compreendendo células imunológicas projetadas que expressam CARs específicos de FLT aqui descritos, em que (ii) a dita população de células compreende uma porcentagem de memória de células-tronco e células de memória central superior a 20%, 30% ou 40 % e/ou (iii) a dita população de células atinge uma lise percentual de células que expressam FLT3 maior que 10%, 20%, 30% ou 40%.

[0046] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um méto- do de engenharia de uma célula imunológica que expressa qualquer um dos CARs específicos de FLT3 descritos neste documento, em que o método compreende: fornecer uma célula imunológica; e intro- duzir na célula pelo menos um polinucleotídeo que codifica o dito CAR específico de FLT3; em que a dita célula imunológica expressa o dito CAR específico de FLT3.

[0047] Em algumas modalidades, o método compreende fornecer uma célula imunológica; introduzir na célula pelo menos um polinu- cleotídeo que codifica o dito CAR específico de FLT3; e introduzir pelo menos um polinucleotídeo que codifica um CAR que não é específico para FLT3.

[0048] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método de trata- mento de um indivíduo que sofre de uma doença ou distúrbio associa- do ao FLT3, em que o método compreende: fornecer uma célula imu- nológica que expressa na superfície um CAR específico de FLT3, co- mo descritoneste documento; e administrar as ditas células imunoló- gicas ao dito indivíduo. A invenção também fornece métodos de trata- mento de indivíduos que sofrem de uma doença ou distúrbio associa- do a FLT3, em que o método compreende fornecer anticorpos especí- ficos de FLT3 descritos neste documento e administrar os ditos anti- corpos ao dito indivíduo.

[0049] Em algumas modalidades, é fornecida neste documento uma composição farmacêutica compreendendo uma célula imunológi- ca projetada que expressa CARs específicos de FLT3, como descrito neste documento. Em outras modalidades, a invenção fornece compo- sições farmacêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos es- pecíficos de FLT3 aqui descritos.

[0050] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um método de tratamento de uma condição associada a células malignas que ex- pressam FLT3 em um indivíduo que compreende administrar a um in- divíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz da compo- sição farmacêutica compreendendo uma célula imunológica projetada como descrito neste documento ou anticorpos específicos de FLT3 como descrito neste documento. Em algumas modalidades, a condi- ção é um câncer. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de origem hematopoiética, como um linfoma ou leucemia. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em mi- eloma múltiplo, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma nodular predominante de linfodito de Hodgkin, doen- ça de Kahler e mielomatose, leucemia de células plasmáticas, plasmo- citoma, leucemia prolinocítica de células B, leucemia de células pilo- sas, linfoma não Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide crônica (LMC), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de zona marginal, linfoma de células do manto, linfoma de células grandes, linfoma precursor de linfoblástico B, leucemia mie- loide, macroglobulienemia de Waldenstrom, linfoglobulienemia difusa de grandes células B, linfoma folicular, linfoma da zona marginal, lin- foma de tecido linfático associado à mucosa, linfoma linfocítico de cé- lulas pequenas, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfo- ma primário de grandes células B mediastinais (tímicas), linfoma linfo- plasmático, macroglobulinemia de Waldenstrôm, linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma da zona marginal esplênica, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de derrame primário, gra-

nulomatose linfomatoide, linfoma de células B grandes rico em célu- las/histiócitos, linfoma do sistema nervoso central primário, linfoma cu- tâneo primário difuso de grandes células B (tipo perna), linfoma difuso de grandes células B positivo EBV dos idosos, linfoma difuso de célu- las B grande associado à inflamação, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de células B grandes ALK positivo, linfoma plasmá- tico de plasma, linfoma de células B surgindo na doença de Castleman multicêntrica associada a HHV8, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Burkitt, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B gran- des e linfoma de Hodgkin clássico, e outro câncer relacionado a célu- las hematopoiéticas, por exemplo, ALL ou LMA.

[0051] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um méto- do para inibir o crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo que tem células malignas expressando FLT3, compreendendo admi- nistrar ao indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica compreendendo uma célula imunológica projetada, como descrito neste documento ou um anticorpo específico de FLT3, como descrito neste documento para o indivíduo.

[0052] Em outro aspecto, é fornecidoneste documento um método para inibir a metástase de células malignas que expressam FLT3 em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo em necessida- de do mesmo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica compreendendo uma célula imunológica projetada como descrito nes- te documento ou um anticorpo específico de FLT3 como descrito nes- te documento para o indivíduo.

[0053] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um méto- do de indução de regressão tumoral em um indivíduo que possui célu- las malignas que expressam FLT3, compreendendo administrar ao in-

divíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz da compo- sição farmacêutica compreendendo uma célula imunológica projetada como descritoneste documento ou um anticorpo específico de FLT3 como descrito neste documento para o indivíduo.

[0054] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos acima compreende ainda administrar uma ou mais terapias adicionais, como por exemplo, um anticorpo monoclonal e/ou quimioterápico. Em algu- mas modalidades, o anticorpo monoclional pode ser, por exemplo, um anticorpo que se liga a um inibidor de ponto de verificação, como, por exemplo, um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1. Em al- gumas modalidades, qualguer um dos métodos acima compreende ainda a administração de um inibidor de receptor tirosina quinase, um inibidor de MTOR, um modulador epigenético, um inibidor de proteas- soma, um agente imunomodulador, como lenalidomida, um inibidor de Hedgehog ou um inibidor de isocitrato desidrogenase (IDH), para o indivíduo. Breve Descrição dos Desenhos

[0055] A Figura 1 mostra plotagens representativas de FACS de- monstrando transdução eficiente de células T ativadas com o construto CAR P3A1 em relação a um controle não transduzido e as eficiências de transdução para todos os construtos como porcentagem de células T que expressam CAR e intensidades médias de fluorescência (MFI).

[0056] A Figura 2 mostra a expressão dos marcadores de ativação CD25 e 4-1BB em células T transduzidas com os vários construtos de CAR avaliados por citometria de fluxo.

[0057] A Figura 3 mostra o fenótipo de células CAR-T no final da cultura, como determinado por análise por citometria de fluxo da ex- pressão dos marcadores CD62L e/ou CD45RO.

[0058] A Figura 4 mostra o projeto experimental geral do ensaio de morte a longo prazo e a resposta das diferentes células CAR-T à ex-

posição repetida às células-alvo medidas como expansão de dobras e atividade citotóxica (porcentagem de lise) no dia 6.

[0059] A Figura 5 mostra a atividade antitumoral de células CAR-T que expressam o construto P3A1 ou P3E10 em duas doses usando um modelo ortotópico de camundongo de LMA humana. Sinais biolu- minescentes quantificados como fluxo total (fótons/s) são mostrados em diferentes momentos.

[0060] A Figura 6 mostra a sensibilidade das células T que ex- pressam o CAR específico de FLT3 da superfície celular compreen- dendo epítopos CD20 à citotoxicidade dependente do complemento (CDC) induzida pelo anticorpo anti-CD20 rituximab.

[0061] A Figura 7 mostra a recuperação de células progenitoras endógenas da medula óssea em camundongos tratados com células CART FLT3 anticamundongo que expressam epítopos CD20 e subse- quentemente administrados com rituximab. Descrição Detalhada

[0062] Em um aspecto, a invenção descrita neste documento for- nece receptores quiméricos de antígeno (CARs) e células imunológi- cas compreendendo CARs (por exemplo, células CAR-T) que se ligam especificamente a FLT3 (por exemplo, FLT3 humano). A invenção também fornece polinucleotídeos que codificam esses CARs, compo- sições que compreendem células imunológicas que expressam esses CARs e métodos para fabricar e usar esses CARs e células imunológi- cas que expressam CAR. A invenção também fornece métodos para o tratamento de uma condição associada a patologias mediadas por FLT3 em um indivíduo, como câncer mediado por células malignas que expressam FLT3, usando os CARs específicos de FLT3 e células imunológicas que expressam esses CARs, como aqui descrito.

[0063] Em um aspecto, a invenção descrita neste documento for- nece anticorpos que se ligam especificamente a FLT3 (por exemplo,

FLT3 humano). A invenção também fornece composições compreen- dendo esses anticorpos e métodos de utilização desses anticorpos. Por exemplo, são fornecidos no presente documento métodos para o tratamento de uma condição associada a patologias mediadas por FLT3 em um indivíduo, como câncer, usando esses anticorpos. Técnicas Gerais

[0064] A prática da invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro do conhecimento da técnica. Tais téc- nicas são explicadas completamente na literatura, como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather e P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, e D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley e Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Mo- lecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immu- nology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical ap- proach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow e D.

Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995). Definições

[0065] O termo "domínio de ligação ao ligante extracelular", como usado no presente documento, refere-se a um polipeptídeo que é ca- paz de se ligar a um ligante capaz de interagir com uma molécula de superfície celular. Por exemplo, o domínio de ligação ao ligante extra- celular pode ser escolhido para reconhecer um ligante que atua como um marcador da superfície celular nas células-alvo associadas a um estado de doença específico.

[0066] O termo "domínio de haste" ou "domínio de dobradiça" é usado neste documento de forma intercambiável para se referir a qualquer polipeptídeo que funciona para ligar o domínio transmembra- nar ao domínio de ligação ao ligante extracelular. Em particular, os domínios de caule são usados para fornecer mais flexibilidade e aces- sibilidade ao domínio de ligação ao ligante extracelular.

[0067] O termo "domínio de sinalização intracelular" refere-se à porção de uma proteína que transduz o sinal da função de sinal efetor e direciona a célula para executar uma função especializada.

[0068] Uma "molécula coestimuladora", como usado no presente documento, refere-se ao parceiro de ligação cognato nas células imu- nológicas, por exemplo, células T, que se liga especificamente a um ligante coestimulador, mediando assim uma resposta coestimuladora pela célula, como, mas se limitando a, proliferação. As moléculas co- estimuladoras incluem, mas não estão limitadas a, uma molécula de MHC de classe |, receptor de ligante Toll e BTLA. Exemplos de molé- culas coestimulatórias incluem CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 associado à função linfo- citária (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 e um ligante que se liga especificamente a CD83 e similares.

[0069] Um "ligante coestimulatório" refere-se a uma molécula em uma célula apresentadora de antígeno que se liga especificamente a uma molécula de sinal coestimulador cognato em uma célula T, forne- cendo um sinal que, além do sinal primário fornecido por, por exemplo, ligação de um complexo TCR/CD3 com uma molécula de MHC carre- gada com peptídeo, medeia uma resposta de células T, incluindo, mas não se limitando a, a ativação de proliferação, diferenciação e simila- res. Um ligante coestimulador pode incluir, mas não está limitado a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OXA40L, |i- gante coestimulatório indutível (ICOS-L), molécula de adesão interce- lular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor B de linfotoxina, 3/TR6, ILT3, ILT4, um agonista ou anticorpo que liga o receptor do ligante Toll e um ligante que liga-se especificamente a B7-H3. Um ligante coestimulador também abrange, entre outros, um anticorpo que se liga especificamente a uma molécu- la coestimuladora presente em uma célula T, como, mas não se limi- tando a, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antí- geno-1 associado à função linfocitária (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, um ligante que se liga especificamente a CD83.

[0070] Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, como carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um local de reconhe- cimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Como utilizado neste documento, o termo abrange não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas tam- bém fragmentos dos mesmos (como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadeia única (scFv) e anticorpos de domínio (incluindo, por exemplo, anticor- pos de tubarão e de camelídeos) e proteínas de fusão compreendendo um anticorpo e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um local de reconhecimento de antí-

geno. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, como IgG, IgA, IgE, IgD ou IgM (ou sua subclasse), e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe específica. Dependendo da sequência de aminoá- cidos do anticorpo da região constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, I1gD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. As regiões constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imuno- globulinas são chamadas alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectiva- mente. As estruturas das subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

[0071] O termo "fragmento de ligação ao antígeno" ou "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, como utilizado neste documen- to, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo intacto que re- têm a capacidade de se ligar especificamente a um determinado antí- geno (por exemplo, FLT3). As funções de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser realizadas por fragmentos de um anticorpo intac- to. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "frag- mento de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem Fab; Fab'; F(ab'); um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; um fragmento de anticorpo de domínio único (dAb) (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989) e uma região determinante de complementariedade isolada (CDR).

[0072] Um anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno, um conjugado de anticorpo ou um polipeptídeo que "se liga especifica- mente" a um alvo (por exemplo, proteína FLT3) é um termo bem en- tendido na técnica, e métodos para determinar essa ligação específica também são bem conhecidos na técnica. Diz-se que uma molécula exibe "ligação específica" se reagir ou se associar mais frequentemen- te, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com uma célula ou substância específica do que com células ou subs- tâncias alternativas. Um anticorpo "liga-se especificamente" a um alvo se ele se liga com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo FLT3 é um anti- corpo que se liga a esse epítopo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outros epítopos FLT3 ou epítopos não FLT3. Entende-se também que, lendo esta defi- nição, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epítopo) que se liga especificamente a um primeiro alvo pode ou não se ligar especifica- mente a um segundo alvo. Como tal, "ligação específica" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmen- te, mas não necessariamente, a referência à ligação significa ligação específica.

[0073] Uma "região variável" de um anticorpo refere-se à região variável da cadeia leve do anticorpo ou à região variável da cadeia pe- sada do anticorpo, isoladamente ou em combinação. Como conhecido na técnica, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve consistem em quatro regiões estruturais (FR) conectadas por três regiões determi- nantes de complementariedade (CDRs) também conhecidas como re- giões hipervariáveis. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antígeno dos anti- corpos. Existem pelo menos duas técnicas para determinar as CDRs: (1) uma abordagem baseada na variabilidade da sequência entre es- pécies (isto é, Kabat et al. Sequências de proteínas de interesse imu- nológico, (5º ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); e (2) uma abordagem baseada em estudos cristalográficos de comple-

xos antígeno-anticorpo (Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273: 927-948). Como aqui utilizado, uma CDR pode se referir a CDRs defi- nidas por qualquer abordagem ou por uma combinação de ambas as abordagens.

[0074] Uma "CDR" de um domínio variável são resíduos de ami- noácidos dentro da região variável que são identificados de acordo com as definições de Kabat, Chothia, o acúmulo de Kabat e Chothia, AbM, contato e/ou definições conformacionais ou qualquer método da determinação de CDR bem conhecida na técnica. As CDRs de anti- corpos podem ser identificadas como as regiões hipervariáveis origi- nalmente definidas por Kabat et al. Ver, por exemplo, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º ed., Public Health Service, NIH, Washington DC. As posições das CDRs também podem ser identificadas como as estruturas estruturais do loop origi- nalmente descritas por Chothia e outros. Ver, por exemplo, Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989. Outras abordagens para a identifica- ção de CDR incluem a "definição de ADM", que é um compromisso en- tre Kabat e Chothia e é derivada usando o software de modelagem de anticorpos ADM da Oxford Molecular (agora Accelrys&), ou a "defini- ção de contato" de CDRs com base em contatos de antígenos obser- vados, apresentado em MacCallum et al., J. Mol.Biol., 262: 732-745,

1996. Em outra abordagem, aqui dita como a "definição conformacio- nal" de CDRs, as posições das CDRs podem ser identificadas como os resíduos que fazem contribuições entálpicas à ligação ao antígeno. Ver, por exemplo, Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283: 1156-1166, 2008. Ainda outras definições de limites de CDR podem não seguir estritamente uma das abordagens acima, mas, no entanto, se sobrepõem a pelo menos uma parte das CDRs da Kabat, embora possam ser encurtadas ou prolongadas à luz de previsões ou desco- bertas experimentais de determinados resíduos ou grupos de resíduos ou mesmo CDRs inteiras não afetam significativamente a ligação ao antígeno. Como aqui utilizado, um CDR pode se referir a CDRs defini- dos por qualquer abordagem conhecida na técnica, incluindo combina- ções de abordagens. Os métodos aqui utilizados podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer uma dessas abordagens. Para qualquer modalidade específica que contém mais de uma CDR, as CDRs podem ser definidas de acordo com qualquer uma das defini- ções de Kabat, Chothia, estendidas, ADM, de contato e/ou conformaci- onais.

[0075] Como aqui utilizado, "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancial- mente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreen- dem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em pequenas quan- tidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único local antigênico. Além disso, em contras- te com as preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente in- cluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinan- tes (epítopos), cada anticorpo monoclional é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substanci- almente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma des- crito primeiro por Kohler e Milstein, Nature 256: 495, 1975, ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante, como descrito na Patente US 4.816.567. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos geradas usando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990, por exem-

plo.

[0076] Como aqui utilizado, anticorpo "humanizado" refere-se a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) que são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fra- gmentos (como Fv, Fab, Fab', F(ab'))- ou outras subsequências de |i- gação a antígeno de anticorpos) que contêm sequência mínima deri- vada de imunoglobulina não humana. Em um aspecto, anticorpos hu- manizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região determinante de complementariedade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), como camundongo, rato, ou coelho com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural Fv (FR) da imunoglobu- lina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspon- dentes. Além disso, o anticorpo humanizado pode compreender resí- duos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas CDRs importadas ou nas sequências estruturais, mas são incluídas para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em ge- ral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos os pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, nos quais to- das ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente to- das as regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região ou domínio constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente o de uma imunoglobuli- na humana. São preferenciais anticorpos com regiões Fc modificadas como descrito em WO 99/58572. Outras formas de anticorpos humani- zados têm uma ou mais CDRs (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 ou CDR H3) que são alteradas em relação ao anticorpo origi-

nal, que também são denominadas uma ou mais CDRs "derivadas de" uma ou mais CDRs do anticorpo original.

[0077] Como usado neste documento, "anticorpo humano" signifi- ca um anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos corres- pondente à de um anticorpo produzido por um humano e/ou que foi produzido usando qualquer uma das técnicas para tornar os anticorpos humanos conhecidos pelos elementos versados na técnica ou aqui descrito. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos compreendendo pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada huma- no ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia leve humano. Um exem- plo é um anticorpo compreendendo polipeptídeos de cadeia leve muri- na e de cadeia pesada humana. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica. Em uma modalidade, o anticorpo humano é selecionado a partir de uma biblio- teca de fagos, onde essa biblioteca de fagos expressa anticorpos hu- manos (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14: 309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 6157-6162, 1998; Hoo- genboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581, 1991). Os anticorpos humanos também podem ser pro- duzidos por imunização de animais nos quais os locais de imunoglobu- lina humana foram introduzidos transgenicamente no lugar dos locais endógenos, por exemplo, camundongos nos quais os genes da imu- noglobulina endógena foram parcial ou completamente inativados. Es- sa abordagem é descrita nas Patentes nº* US 5.545.807; 5.545.806;

5.569.825; 5.625.126; 5.633.425 e 5.661.016. Alternativamente, o anti- corpo humano pode ser preparado imortalizando os linfócitos B huma- nos que produzem um anticorpo direcionado contra um antígeno-alvo (esses linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou da clo- nagem de célula única do cDNA, ou podem ter sido imunizados in vi- tro). Veja, por exemplo, Cole et al. Anticorpos Monoclonais e Terapia do Câncer, Alan R. Liss, página 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86-95, 1991; e Patente 5.750.373.

[0078] O termo "anticorpo quimérico" se refere a anticorpos nos quais as sequências de região variável são derivadas de uma espécie e as sequências de região constante são derivadas de outra espécie, como um anticorpo no qual as sequências de região variável são deri- vadas de um anticorpo de camundongo e as sequências da região constante são derivadas de um anticorpo humano.

[0079] Um "anticorpo monovalente" compreende um local de liga- ção ao antígeno por molécula (por exemplo, IgG ou Fab). Em alguns casos, um anticorpo monovalente pode ter mais de um local de ligação ao antígeno, mas os locais de ligação são de antígenos diferentes.

[0080] Um "anticorpo bivalente" compreende dois locais de ligação ao antígeno por molécula (por exemplo, IgG). Em alguns casos, os dois locais de ligação têm as mesmas especificidades de antígeno. No entanto, os anticorpos bivalentes podem ser biespecíficos.

[0081] Os anticorpos da invenção podem ser produzidos utilizando técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo, tecnologias recom- binantes, tecnologias de exibição de fagos, tecnologias sintéticas ou combinações de tais tecnologias ou outras tecnologias prontamente conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Jayasena, SD, Clin.Chem., 45: 1628-50, 1999 e Fellouse, FA, et al., J. Mol. Biol., 373 (4): 924-40, 2007).

[0082] Como conhecido na técnica, "polinucleotídeo" ou "ácido nu- cleico", conforme usado de forma intercambiável neste documento, refere-se a cadeias de nucleotídeos de qualquer comprimento e inclui DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ri- bonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificadas e/ou seus análo- gos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado a uma cadeia pela polimerase de DNA ou RNA. Um polinucleotídeo pode compreen-

der nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e seus análogos.

Se presente, a modificação da estrutura nucleotídica pode ser realizada antes ou após a montagem da cadeia.

A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídi- cos.

Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após po- limerização, como por conjugação com um componente de marcação.

Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "caps", substitui- ção de um ou mais nucleotídeos de ocorrência natural por modifica- ções análogas de internucleotídeos, como, por exemplo, aqueles com ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriéste- res, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas contendo por- ções pendentes, como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nuclea- ses, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, poli-L-lisina, etc.), aqueles com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno etc.), aqueles que contêm quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aqueles que contêm alquiladores e aqueles com ligações modificadas (por exemplo, alfa anomérico ácidos nuclei- cos, etc.), bem como formas não modificadas do (s) polinucleotídeo (s). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxila normalmente pre- sentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protetores padrão ou ativados para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados a suportes sólidos.

O OH 5' e 3' terminal pode ser fosforilado ou substituído por aminas ou porções orgânicas do grupo de cobertura de 1 a 20 átomos de carbono.

Outras hidroxilas também podem ser derivatizados para grupos protetores padrão.

Os polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- ou 2'-azido-

ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares alfa ou beta- anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou |li- xXoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedo-heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeos abásicos, como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternati- vos incluem, mas não estão limitados a, modalidades em que fosfato é substituído por P(O)JS ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR>2 ("amidato"), P(OJ)R, P(O)OR', CO ou CH, ("formacetal"), em que cada R ou R' é independentemente H ou alquila substituída ou não substituída (1-20 C) contendo opcionalmente uma ligação éter (-O-), arila, alcenila, ci- cloalquila, cicloalcenila ou araldila. Nem todas as ligações em um poli- nucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição anterior se aplica a todos os polinucleotídeos aqui referidos, incluindo RNA e DNA.

[0083] Como conhecido na técnica, uma "região constante" de um anticorpo refere-se à região constante da cadeia leve do anticorpo ou à região constante da cadeia pesada do anticorpo, isoladamente ou em combinação.

[0084] Como usado neste documento, "substancialmente puro" refere-se a material que é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pe- lo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% puro (ou seja, livre de contaminantes).

[0085] Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cul- tura de células que pode ser ou foi um destinatário de vetores para in- corporação de inserções de polinucleotídeos. As células hospedeiras incluem a progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não ser necessariamente completamente idêntica (na morfologia ou no complemento do DNA genômico) à célula original devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) dessa invenção.

[0086] Como conhecido na técnica, o termo "região Fc" é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imuno- globulina. A "região Fc" pode ser uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc variante. Embora os limites da região Fc de uma ca- deia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida para se estender de um resíduo de aminoácido na posição Cys226 ou de Pro230, ao seu ter- minal carboxila. A numeração dos resíduos na região Fc é a do índice da UE como em Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immu- nological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. A região Fc de uma imunoglobulina ge- ralmente compreende duas regiões constantes, CH2 e CH3.

[0087] Conforme usado na técnica, "receptor Fc" e "FcR" descre- vem um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR pre- ferencial é um FCcR humano de sequência nativa. Além disso, um FCcR preferencial é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor ga- ma) e inclui receptores das subclasses FecyRI, FeyRII e FeyRiIII, inclu- indo variantes alélicas e formas emendadas alternativamente desses receptores. Os receptores FcyRII incluem FCyRIIA (um "receptor ativa- dor") e FCcyRIIB (um "receptor inibidor"), que possuem sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente nos domínios citoplasmáticos dos mesmos. Os FcRs são revistos em Ravetch e Ki- net, Ann. Rev. Immunol., 9: 457-92, 1991; Capel et al., Immuno- methods, 4: 25-34, 1994; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330- 41, 1995. "FcR" também inclui o receptor neonatal FcRn, responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol., 117: 587, 1976; e Kim et al., J. Immunol. 24: 249, 1994).

[0088] O termo "competir", como usado no presente documento em relação a um anticorpo, significa que um primeiro anticorpo, ou um fragmento (ou porção) de ligação a antígeno, se liga a um epítopo de uma maneira suficientemente semelhante à ligação de um segundo anticorpo, ou uma sua porção de ligação ao antígeno, de modo que o resultado da ligação do primeiro anticorpo com seu epítopo cognato seja detectável diminuído na presença do segundo anticorpo em com- paração com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa, onde a ligação do segundo anticorpo ao seu epítopo também é detectável diminuída na presença do primeiro anti- corpo, pode, mas não precisa ser o caso. Isto é, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo ao seu epítopo sem es- se segundo anticorpo inibir a ligação do primeiro anticorpo ao seu res- pectivo epítopo. No entanto, onde cada anticorpo inibe de forma detec- tável a ligação do outro anticorpo com seu epítopo ou ligante cognato, seja na mesma, maior ou menor extensão, diz-se que os anticorpos "competem cruzadamente" entre si pela ligação de seu respectivo epí- topo (ou epítopos). Os anticorpos concorrentes e concorrentes cruza- dos são abrangidos pela invenção. Independentemente do mecanismo pelo qual essa competição ou competição cruzada ocorra (por exem- plo, impedimento estérico, alteração conformacional ou ligação a um epítopo comum ou parte dele), o elemento versado apreciaria, com base nos ensinamentos fornecidos no presente documento, que tais competidores e/ou anticorpos de competição cruzada são abrangidos e podem ser úteis para os métodos aqui descritos.

[0089] Como usado neste documento, "autólogo" significa que as células, uma linhagem celular ou a população de células usadas para o tratamento de pacientes são originárias do dito paciente.

[0090] Como usado neste documento, "alogênico" significa que as células ou a população de células usadas para o tratamento de paci- entes não são originárias do dito paciente, mas de um doador.

[0091] Conforme usado neste documento, "tratamento" é uma abordagem para obter resultados clínicos benéficos ou desejados. Pa- ra os fins desta invenção, os resultados clínicos benéficos ou deseja- dos incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes itens: reduzir a proliferação (ou destruição) de células neoplásicas ou cancerígenas, inibir a metástase de células neoplásicas, encolher ou diminuir o tamanho do tumor que expressa FLT3, remissão de uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer), diminuir os sintomas resultantes de uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer), aumentar a qualidade de vida das pessoas que sofrem de uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer), diminuir a dose de outros medicamentos necessários para tratar uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer), atrasar a progressão de uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer), cura de uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer) e/ou prolonga a sobrevivência de pacientes com uma doença associada a FLT3 (por exemplo, câncer).

[0092] "Melhorar" significa uma diminuição ou melhoria de uma ou mais sintomas, em comparação com a não administração de uma cé- lula CAR específica de FLT3 ou uma célula CAR-T específica de FLT3. "Melhorar" também inclui encurtamento ou redução na duração de um sintoma.

[0093] Como utilizado neste documento, uma "dosagem eficaz" ou "quantidade eficaz" de fármaco, composto ou composição farma- cêutica é uma quantidade suficiente para efetuar qualquer um ou mais resultados benéficos ou desejados. Para uso profilático, os resultados benéficos ou desejados incluem eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade ou atrasar o início da doença, incluindo sintomas bioquími- cos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresentados durante o desen- volvimento da doença. Para uso terapêutico, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos, como redução da incidência ou melhoria de um ou mais sintomas de várias doenças ou condições associadas a FLT3 (como, por exemplo, mieloma múltiplo), diminuindo a dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, me- lhorar o efeito de outro medicamento e/ou retardar a progressão da doença associada a FLT3 dos pacientes. Uma dosagem eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para os fins desta invenção, uma dosagem eficaz de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar o tratamento profilático ou terapêutico, direta ou indiretamente. Como é entendido no contexto clínico, uma dosagem eficaz de um medicamento, com- posto ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançada em conjunto com outro medicamento, composto ou composição farmacêu- tica. Assim, uma "dosagem eficaz" pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes terapêuticos, e um único agente pode ser considerado administrado em quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser ou é alcançado.

[0094] Um "indivíduo", "paciente" ou um "sujeito" são usados de forma intercambiável aqui e é um mamífero. Os mamíferos incluem, entre outros, seres humanos, macacos, porcos, outros animais de fa- zenda, animais esportivos, animais de estimação, primatas, cavalos, cães, gatos, roedores, incluindo ratos, ratos, porquinhos-da-índia, etc. utilizado neste documento de forma intercambiável. Em algumas mo- dalidades, o indivíduo é humano. Em algumas modalidades, o indiví- duo é um primata não humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano ou um macaco, por exemplo, um macaco cinomolgo.

[0095] Conforme usado neste documento, "vetor" significa um construto que é capaz de fornecer e, em algumas modalidades, ex- pressar um ou mais genes ou sequência (ou sequências) de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA nus, vetores de plasmídeo, cosmídeo ou fago, vetores de ex- pressão de DNA ou RNA associados a agentes de condensação ca- tiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em |i- possomas e certas células eucarióticas, como células produtoras.

[0096] Como utilizado neste documento, "sequência de controle de expressão" significa uma sequência de ácidos nucleicos que direci- ona a transcrição de um ácido nucleico. Uma sequência de controle de expressão pode ser um promotor, como um promotor constitutivo ou indutível ou um intensificador. A sequência de controle da expressão está operacionalmente ligada à sequência de ácidos nucleicos a ser transcrita.

[0097] Como usado neste documento, "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha atividade biológica e não seja reativo ao sis- tema imunológico do indivíduo. Os exemplos incluem, entre outros, qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão, como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões como emulsão de óleo/água e vários tipos de agentes umectantes. Os diluentes exempli- ficadores para administração em aerossol ou parentérica incluem solu- ção salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina normal (0,9%). As composições compreendendo esses veículos são formula- das por métodos convencionais bem conhecidos (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º edição, A. Gennaro, ed,., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21º Edição. Mack Publishing, 2005).

[0098] O termo "kKon", como utilizado neste documento, refere-se à constante de taxa para associação de um anticorpo ou scFv de um

CAR a um antígeno.

[0099] O termo "kof", como utilizado neste documento, refere-se à constante de taxa para dissociação de um anticorpo ou scFv de um CAR do complexo anticorpo/antígeno.

[00100] O termo "Kp", como utilizado neste documento, refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo- antígeno ou uma interação de scFv-antígeno.

[00101] A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro neste do- cumento inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro por si só. Por exemplo, a descrição referente a "cerca de X" inclui a descrição de "X". Intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo.

[00102] Entende-se que sempre que modalidades são descritas neste documento com a linguagem "compreendendo" outras modali- dades análogas descritas em termos de "consistindo em" e/ou "consis- tindo essencialmente em" também são fornecidas.

[00103] “Onde aspectos ou modalidades da invenção são descritos em termos de um grupo Markush ou outro agrupamento de alternati- vas, a invenção abrange não apenas o grupo inteiro listado como um todo, mas cada membro do grupo individualmente e todos os subgru- pos possíveis do grupo principal, mas também o grupo principal está ausente de um ou mais membros do grupo. A invenção também prevê a exclusão explícita de um ou mais de qualquer um dos membros do grupo na invenção reivindicada.

[00104] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é co- mumente entendido por um versado na técnica ao qual essa invenção pertence. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, prevalecerá. Ao longo desse relatório descritivo e reivindi- cações, a palavra "compreender" ou variações como "compreende" ou

"compreendendo" serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. Salvo dis- posição em contrário do contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular.

[00105] Os métodos e materiais exemplificadores são descritos neste documento, embora métodos e materiais semelhantes ou equi- valentes aos descritos neste documento também possam ser utiliza- dos na prática ou no teste da invenção. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitativos. Anticorpos FLT3

[00106] A presente invenção fornece anticorpos que se ligam ao FLT3 [por exemplo, FLT3 humano (por exemplo, número de acesso: NP 004110 ou SEQ ID NO: 198)] e caracterizado por qualquer uma ou mais das seguintes características: (a) tratar, prevenir, melhorar um ou mais sintomas de uma condição associada a células malignas que ex- pressam FLT3 em um indivíduo (por exemplo, câncer como LMA); (b) inibir o crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo (que tem um tumor maligno expressando FLT3); (c) inibir a metástase de células cancerígenas (malignas) que expressam FLT3 em um indivíduo (que possui uma ou mais células malignas que expressam FLT3); (d) indu- zir regressão (por exemplo, regressão a longo prazo) de um tumor que expressa FLT3; (e) exercer atividade citotóxica em células malignas que expressam FLT3; (f) bloquear a interação do FLT3 com outros fa- tores ainda a serem identificados; e/ou (g) induzir efeito espectador que mata ou inibe o crescimento de células malignas que expressam não FLT3 nas proximidades.

[00107] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a FLT3, em que o anticorpo compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo (i) uma região determinante de complementariedade de VH (CDR1) compreendendo a sequência mostrada em 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 246 ou 247; (ii) uma CDR2 VH compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 248, 249, 251, 252, 253 ou 255; e iii) uma CDR3 VH compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 143, 245, 250 ou 254; e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo (i) uma CDR1 VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 257, 261, 263, 265, 268, 270, 273 ou 275 ; (li) uma VL CDR2 compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 259, 266 ou 271; e (iii) uma CDR3 VL compreendendo a sequên- cia mostrada na SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 256, 258, 260, 262, 264, 267, 269, 272 ou 274.

[00108] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a FLT3, em que o anticorpo compreende: uma região VH compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2,4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 ou 293; e/ou uma região VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1,3, 5,7, 9,11, 13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 ou

292.

[00109] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a FLT3, em que o anticorpo compreende: uma região VH compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 275, 289 ou 291; e/ou uma região VL compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 274, 288 ou 290.

[00110] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo com qualquer uma das sequências parciais da cadeia leve, conforme lista- do na Tabela 2 e/ou qualquer uma das sequências parciais da cadeia pesada, conforme listado na Tabela 2.

[00111] Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste documento compreendem uma região constante. Em algumas modali- dades, os anticorpos descritos neste documento são da subclasse humana IgG1, IgG2 ou IgG2Aa, I9gG3 ou I9gG4. Em algumas modalida- des, os anticorpos descritos neste documento compreendem uma re- gião constante glicosilada. Em algumas modalidades, os anticorpos descritos neste documento compreendem uma região constante com afinidade de ligação reduzida a um ou mais receptores gama Fc hu- manos.

[00112] Os anticorpos fornecidos no presente documento podem abranger anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única (ScFv) e/ou humanizados. Os anticorpos podem ser murinos, de rato, humanos ou qualquer outra origem (incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados). CARs específicos de FLT3 e métodos de fabricação dos mesmos

[00113] São fornecidos no presente documento CARs que se ligam a FLT3 (por exemplo, FLT3 humano (por exemplo, SEQ ID NO: 198) ou número de acesso: NP 004110). Os CARs específicos de FLT3 fornecidos no presente documento incluem CARS de cadeia única e CARs de várias cadeias. Os CARs têm a capacidade de redirecionar a especificidade e a reatividade das células T para o FLT3 de maneira não restrita ao MHC, explorando as propriedades de ligação ao antí- geno dos anticorpos monoclonais. O reconhecimento de antígeno não restrito ao MHC dá às células T que expressam os CARs a capacidade de reconhecer um antígeno independentemente do processamento do antígeno, ignorando assim um mecanismo principal de fuga do tumor.

[00114] Em algumas modalidades, os CARs fornecidos no presente documento compreendem um domínio de ligação ao ligante extracelu- lar (por exemplo, um fragmento variável de cadeia única (scFv)), um domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao ligante extracelular, o domínio transmembranar e o domínio de sinalização intracelular estão em um polipeptídeo, isto é, em uma única cadeia. Os CARs de múlti- plas cadeias e polipeptídeos também são fornecidos neste documento. Em algumas modalidades, os CARs de múltiplas cadeias compreen- dem: um primeiro polipeptídeo compreendendo um domínio trans- membranar e pelo menos um domínio de ligação ao ligante extracelu- lar e um segundo polipeptídeo compreendendo um domínio trans- membranar e pelo menos um domínio de sinalização intracelular, em que os polipeptídeos se reúnem para formar um CAR de múltiplas ca- deias.

[00115] Em algumas modalidades, um CAR de múltiplas cadeias específico de FLT3 é baseado no receptor de alta afinidade para IgE (FceRI). O FceRI expresso em mastócitos e basófilos desencadeia re- ações alérgicas. FceRI é um complexo tetramérico composto por uma única subunidade a, uma única subunidade B e duas subunidades y ligadas a dissulfeto. A subunidade a contém o domínio de ligação a IgE. As subunidades B e y contêm ITAMs que medeiam a transdução de sinal. Em algumas modalidades, o domínio extracelular da cadeia FcRa é excluído e substituído por um domínio de ligação ao ligante extracelular específico de FLT3. Em algumas modalidades, o CAR es- pecífico de FLT3 de múltiplas cadeias compreende um scFv que se liga especificamente a FLT3, à dobradiça CD8a e ao ITAM da cadeia FCcRB. Em algumas modalidades, o CAR pode ou não compreender a cadeia FcRy.

[00116] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao ligante extracelular compreende um scFv compreendendo a região variável da cadeia leve (VL) e a região variável da cadeia pesada (VH) de um an- ticorpo monoclional específico do antígeno-alvo unido por um ligante flexível. Os fragmentos de região variável de cadeia única são feitos pela ligação de regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada usando um peptídeo de ligação curto (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988). Um exemplo de um peptídeo de ligação é o ligante GS que possui a sequência de aminoácidos (GGGGS); (SEQ ID NO: 232), que liga aproximadamente 3,5 nm entre o terminal carbóxi de uma região vari- ável e o terminal amino da outra região variável. Os ligantes de outras sequências foram projetados e usados (Bird et al., 1988, supra). Em geral, os ligantes podem ser polipeptídeos curtos e flexíveis, por exemplo, compostos por cerca de 20 ou menos resíduos de aminoáci- dos. Os ligantes podem, por sua vez, ser modificados para funções adicionais, como fixação de medicamentos ou fixação em suportes só- lidos. As variantes de cadeia única podem ser produzidas de forma recombinante ou sintética. Para produção sintética de scFv, um sinteti- zador automatizado pode ser usado. Para a produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado contendo polinucleotídeo que codifi- ca o scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, seja eucariótica, como levedura, planta, células de insetos ou mamífe- ros ou procariótica, como E. coli. Os polinucleotídeos que codificam o scFv de interesse podem ser feitos por manipulações de rotina, como a ligação de polinucleotídeos. O scFv resultante pode ser isolado usando técnicas padrão de purificação de proteínas conhecidas na técnica.

[00117] O domínio extracelular FLT3 é composto por 5 domínios de imunoglobulina, com o domínio 5 sendo o mais próximo da membrana celular e o domínio 1 mais distante (de maneira linear; Verstraete, 7 de julho de 2011; Blood: 118 (1)). As sequências dos cinco domínios ex- tracelulares do FLT3 estão listadas na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1 Domínio Extracelular | Sequência

RI A 1 NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPOQOSSGTVYEAAAVEVDVS

ASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLOQNRGVVSMVILKMTETQA GEYLLFIQOSEATNYTILFTVSIR (SEQ ID NO: 199) 2 NTLLYLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHE O irerorcoNmELoem RAD 3 FTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYST S O RSS AmTonTOSSSersastmentaBNÇ A 4 KGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFC o nsaPeTNENDATETN BBB

IRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFG CC asssToNSENNrUNCONSLTICETULNPOPTPEDDN SRA DNO 25) |

[00118] O domínio 2-3 compreende a sequência do domínio 2 e do domínio 3 (SEQ ID NO: 254).

[00119] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao ligante extracelular dos CARs específicos de FLT3 des- critos neste documento se liga ao domínio 1, 2, 3, 4 ou 5 do domínio extracelular de FLT3.

[00120] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao ligante extracelular dos CARs específicos de FLT3 descritos neste documento se liga ao domínio 1 do domínio extracelular de FLT3.

[00121] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao ligante extracelular dos CARs específicos de FLT3 descritos neste documento se liga ao domínio 2 do domínio extracelular de FLT3.

[00122] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao ligante extracelular dos CARs específicos de FLT3 descritos neste documento se liga ao domínio 3 do domínio extracelular de FLT3.

[00123] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao ligante extracelular dos CARs específicos de FLT3 descritos neste documen- to se liga ao domínio 4 do domínio extracelular de FLT3.

[00124] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao ligante extracelular dos CARs específicos de FLT3 descritos neste documen- to se liga ao domínio 5 do domínio extracelular de FLT3.

[00125] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao ligante extracelular dos CARs específicos de FLT3 descritos neste documen- to se liga ao domínio 2-3 do domínio extracelular de FLT3.

[00126] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao ligante extracelular dos CARs específicos de FLT3 descritos neste documen- to se liga ao domínio 2-3 ou 4 do domínio extracelular de FLT3.

[00127] Em outro aspecto, é fornecido um CAR, que se liga especi- ficamente a FLT3, em que o CAR compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular compreendendo: uma região VH com a sequên- cia mostrada na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 ou 293; e/ou uma região VL com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 ou 292. Em algumas modalidades, a VH e a VL são ligadas entre si por um ligante flexível. Em algumas modalidades, um ligante flexível compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 232.

[00128] Em outro aspecto, é fornecido um receptor de antígeno quimérico específico de FLT3 (CAR) que compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular, um primeiro domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular, em que o domínio extracelular compreende um fragmento Fv de cadeia única (scFv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que a região VH compreende (i) uma região de- terminante de complementariedade VH um (CDR1) com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 294, 295, 296, 300, 301, 305, 306, 307, 311, 312, 316, 317 ou 318; (ii) uma regi- ão determinante de complementariedade VH dois (CDR2) tendo a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 297, 298, 302, 303, 308, 309, 313, 314, 319, 320 ou 322; e (iii) uma região determinante de complementariedade VH três (CDR3) com a sequên- cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 299, 304, 310, 315 ou 321.

[00129] Em outro aspecto, é fornecido um receptor de antígeno quimérico específico de FLT3 (CAR) que compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular, um primeiro domínio transmembranar e um domínio de sinalização intracelular, em que o domínio extracelular compreende um fragmento Fv de cadeia única (scFv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que a região VL compreende (i) uma região de- terminante de complementariedade VL um (CDR1) com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 323, 326, 328, 331, 336, 338, 340, 343, 345, 348, ou 350; (ii) uma região determinante de complementariedade VL dois (CDR2) tendo a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 324, 329, 332, 334, 341 ou 346; e (iii) uma região determinante de complementariedade VL três (CDR3) com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 325, 327, 330, 333, 335, 337, 339, 342, 344, 347 ou 349.

[00130] Em outro aspecto, é fornecido um receptor de antígeno quimérico específico para FLT3 (CAR) que compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular, um primeiro domínio transmembra- nar e um domínio de sinalização intracelular, em que o domínio extra- celular compreende um fragmento Fv de cadeia única (scFv) compre- endendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região va- riável de cadeia leve (VL), em que (a) a região VH compreende (i) uma região determinante de complementariedade VH um (CDR1) com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 294, 295, 296, 300, 301, 305, 306, 307, 311, 312, 316, 317 ou 318; (ii) uma região determinante de complementariedade VH dois (CDR2) tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99,

100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 297, 298, 302, 303, 308, 309, 313, 314, 319, 320 ou 322; e (iii) uma região determinante de complementariedade VH três (CDR3) com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 299, 304, 310, 315 ou 321; e (b) a região VL compreende (i) uma região determinante de complementariedade VL um (CDR1) com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 323, 326, 328, 331, 336, 338, 340, 343, 345, 348 ou 350; (ii) uma região determinante de complementariedade VL dois (CDR2) tendo a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 324, 329, 332, 334, 341 ou 346; e (iii) uma região determinante de complementariedade VL três (CDR3) com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 325, 327, 330, 333, 335, 337, 339, 342, 344, 347 ou 349.

[00131] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compre- ende um domínio de ligação ao ligante extracelular com qualquer uma das sequências parciais da cadeia leve, conforme listado na Tabela 2 e/ou qualquer uma das sequências parciais da cadeia pesada, con- forme listado na Tabela 2.

[00132] Na Tabela 2, as sequências sublinhadas são sequências CDR de acordo com Kabat e em negrito de acordo com Chothia, exce- to as sequências CDR2 da cadeia pesada de P4F6, P4C7, P3A1, P5A3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6, P8B6, P14G2 e P7F9, nas quais a sequência CDR de Chothia está sublinhada e a sequência CDR Kabat está em negrito.

Tabela 2

PA4F6 EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASHSVSSSYLAWYQQKPGQ | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFGSYGISWVRQAPGQGL APRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY | EWMGGIIPIFEGTVTYAQKFQGRVTITADESTRTAYMELSSLRSEDTAV CQQYGSPPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 1) YYCARDSWSGATGASDTWGOQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)

P4C7 EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQYVSASLLAWYQQKPGQ | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYTISWVRQAPGQGLE APRLLIYGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY | WMGGIIPAFGIANY AQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAV CQQYARSSTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 3 ) YYCAKGGSYSLDYFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 4)

P3A1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKA | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYDISWVRQAPGQGL PKLLIYAASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC | ENMGGIIPYSGRANY AQKFQGRVTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTA QQSYSTPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 5) VYYCARVRPTYWPLDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 6)

P5A3 QSALTQPASVSGSPGOQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPG | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYYIGWVRQAPGQOGL KAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEA | EWMGGIIPWFGTANYAQKFQGRVTITADKSTNTAYMELSSLRSEDT RP DYYCSSYAGSNTVVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 7) AVYYCAADHHDSPSGYTSGGFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 8) 3

P9B5 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQALPGT | EVALLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFASYAMSWVRQAPGKGLE 8 APKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADY | WVSEISSSGGSTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV

[7 ecimams a rovacicoastaSaLtsDo: | YYCARDRVMAGLGYDPFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 10)

P9F1 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSGSNIGSNYVYWYQAQLPGT | EVALLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFSSFAMSWVRQAPGKGLE APKLLIYRNNQORPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADY | WVSDISGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA YCAAWDGSLSRPVFGTGTKLTVL (SEQ ID NO: 11) VYYCASASGGSGSYWPYMDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12)

P1B4 EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVPNEQLAWYQQKPGQ | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGVFSRYALSWVRQAPGQGL APRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY | EWMGGIIPMLGFANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTA CQQYGSPPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 13) VYYCATLDFGALDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14)

P1B11 EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSELAWYQQKPGQ | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFRSFDISWVRQAPGQGL APRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY | EWMGRIIPILGYANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAV CQQYDSSPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 15) YYCASDLGAPWAGYPFDPWGOQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 16)

P7H3 QSVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAP | EVALLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGL VLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC | EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT

Cadeia Pesada | | QVWDSSTAWVYFGGGTKLTVL(SEQIDNO:17) = "| AVYYCARGTRWWWGDAFDHWGOQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 18)

P3E10 EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVPSSQLAWYQAQKPGA | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAIQWVRQAPGQGL APRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY | EWMGGIVGSWGLANY AQKFQGRVTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDT CQQYGSSPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 19 ) AVYYCATSAFGELASWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 20)

P1A5 EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQAVDSSDLAWYQQKPGQ | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGVFSRYALSWVRQAPGQOGL APRLLIYDAYTRPSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY | EWMGGIIPMLGFANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTA CQQAYGSSPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 21) VYYCATLDFGALDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 22)

P5F7 EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQA | EVOLLESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL PRLLIYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC | EWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT QQYGSSPPTFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 23) AVYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 24)

P4H11 EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSNTYLAWYQQKPGQ | EVOLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL APRLLIYDTSSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY | EWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT a CQQYGSSLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 25) AVYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 26) Ê&

P15F7 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAP | EVOLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFNNYAMNWVRQAPGKGL 8 KLLIYAASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC | EWVSVISGSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA QQSYSIPLTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 27) VYYCASGIWDLRYWGOQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 28)

P12B6 EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSSSYLAWYQQKPGQOA | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFMSYAISWVRQAPGOGL PRLLIYGASSRASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC | EWMGGIIPIFEGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAV QQYGGSPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 29) YYCARETLIYPIPFELWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 30)

P8B6 EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSHSYLAWYQQKPGQ | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAVSWVRQAPGQOGL APRLLIYGASFRAAGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY | EWMGGIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAV CQQAYGSDPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 31) YYCAIEGIGGDLRYDGYDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 32)

P14G2 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQOKPGKA | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYVMNWVRQAPGKGL PKLLIYDASDLAORGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYY | EWVSAISGSGATTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA CQQASYNTPWTFGQOGTKVEIK (SEQ ID NO: 33) VYYCVSGLWAGGIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 34)

P7F9 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQAKPGA | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL APVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADY | EWVSAIGGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT

Cadeia Pesada | uu | YPavnpssspHWyFosaT TVE (SEG IA NS:35 AMYYCARDYYAFSDPAYGGMDVWGOQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 36) POSBOGEE | EIVLTAOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSHSYLAWYQQKPGQ | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAVSWVRQAPGQGL APRLLIYGASFRAAGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY | EWMGGIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAV CQQYGSEPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 264) YYCAIEGIGGDLRYEGYDAWGOQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 265) PO4A04 EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSQLAWYQQKPGAQ | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYYITWVRQAPGOGLE APRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY | WMGRIMPAFGWTNYAQKFOGRVTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTA CQQAYGSSLLITFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 266) VYYCASDEFGAFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 267) PO1AO5 EIVLTASPGTLSLSPGERATLSCRASQAVDSSDLAWYQHKPGQ | QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGGVFSRYALSWVRQAPGQOGL APRLLIYDAYTRPSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY | EWMGGIIPMLGFANYAQKFOGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTA CQQYGSSPLTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 268) VYYCATLDFGALDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 269) PO8BO3 DIVMTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQ | QVALVAOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYDISWVRQAPGQGL PR APRLLIYDAYTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYY | EWMGRIIPSFGAANYAQKFOGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTA o CQQAYGSPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 270) VYYCATDDGEGWTPPFGYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 271) rs P5F7 DIVMTOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQOA | EVOLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL º? PRLLIYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC | EWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA QQYGSSPPTFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 272) VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 273) P5F7g EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQA | EVOLLESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL PRLLIYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC | EWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA QQYGSSPPTFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 274) VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 275) P10A02g — | EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQDVSDLLAWYQQKPGOA | EVALLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL PRLLIYDAYTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC | EWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA QQYASSPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 276) VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 277) P10A04g — | EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQKVSDLLAWYQOQKPGOA | EVALLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL PRLLIYDAYTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC | EWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA QQYTGSPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 278) VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 279)

EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL

PRLLIYDAYSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC | EWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA | = laavesNemFeeTRENa Naa VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 281) P10A07g EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASGSVSDLLAWYQQKPGQA | EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL PRLLIYDAYSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC | EWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA QQYASYPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 282) VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 283) P10B03g EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSDLLAWYQQKPGQOA | EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL PRLLIYDAFSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC | EWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA QQYGTPPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 284) VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 285) P10B06g EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASESVSDLLAWYQQKPGQA | EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL PRLLIYDAYSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC | EWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA QQYSASPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 286) VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 287) P5F792 EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQOA | EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL o

PRLLIYDTFTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC EWVSAISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA Q QQYGSSPPTFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 288) VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 289) 8 P5F793 EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSLLAWYQQKPGQA | EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGL PRLLIYDAYTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC | EWVSAISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA QQYTGSPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 290) VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 291) P5F794 EIVLTOSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSLLAWYQQKPGQA | EVOLLESGGGLVAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL PRLLIYDAYTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC | EWVSAISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA QQYTGSPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 292) VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 293)

[00133] “Também são aqui fornecidas porções de CDR de domínios de ligação a antígenos de anticorpos para FLT3 ou porções de CDR de domínios de ligação a ligantes extracelulares de CARs para FLT3 (incluindo Chothia, CDRs de Kabat e regiões de contato de CDR). À determinação das regiões CDR está bem dentro dos conhecimentos da técnica.

Entende-se que, em algumas modalidades, as CDRs po- dem ser uma combinação de CDR de Kabat e Chothia (também de- nominadas "CRs combinadas" ou "CDRs estendidas"). Em algumas modalidades, as CDRs são as CDRs de Kabat.

Em outras modalida- des, as CDRs são as CDRs de Chothia.

Em outras palavras, em mo- dalidades com mais de uma CDR, as CDRs podem ser qualquer uma das Kabat, Chothia, CDRs de combinação ou combinações das mes- mas.

A Tabela 3 fornece exemplos de sequências de CDR aqui forne- cidas.

Tabela 3

Cadeia Pesada

PA4F6 SYGIS (SEQ ID NO: 37) (Kabat); GIIPIFGTVTYAQKFOQG (SEQ ID NO: 40) (Kabat); DSWSGATGASDT (SEQ ID NO: 42) GGTFGSY (SEQ ID NO: 38) (Chothia); IPIFGT (SEQ ID NO: 41) (Chothia) GGTFGSYGIS (SEQ ID NO: 39) (Estendida)

PA4C7 SYTIS (SEQ ID NO: 43) (Kabat); GIIPAFGIANYAQKFOQG (SEQ ID NO: 46) (Kabat); GGSYSLDYFDI (SEQ ID NO: 48) GGTFSSY (SEQ ID NO: 44) (Chothia) IPAFGI (SEQ ID NO: 47) (Chothia) GGTFSSYTIS (Estendida) (SEQ ID NO: 45)

P3A1 SYDIS (SEQ ID NO: 49) (Kabat); GIIPVYSGRANYAQKFOQOG (SEQ ID NO: 51) (Kabat); | VRPTYWPLDY (SEQ ID NO: 53) GGTFSSY (SEQ ID NO: 44) (Chothia); IPVSGR (SEQ ID NO: 52) (Chothia) o GGTFSSYDIS (SEQ ID NO: 50) (Estendida) z

P5A3 SYYIG (SEQ ID NO: 54) (Kabat); GIIPWFGTANYAQKFOQG (SEQ ID NO: 57) (Kabat); DHHDSPSGYTSGGFDV (SEQ |D o GGTFSSY (SEQ ID NO: 55) (Chothia); IPWFGT (SEQ ID NO: 58) (Chothia) NO: 59) GGTFSSYYIG (SEQ ID NO: 56) (Estendida)

P9B5 SYAMS (SEQ ID NO: 60) (Kabat); EISSSGGSTTYADSVKG (SEQ ID NO: 63) (Kabat); | DRVMAGLGYDPFDY (SEQ ID NO: GFIFASY (SEQ ID NO: 61) (Chothia); SSSGGS (SEQ ID NO: 64) (Chothia) 65) GFIFASYAMS (SEQ ID NO: 62) (Estendida)

P9F1 SFAMS (SEQ ID NO: 66) (Kabat); DISGSGASTYYADSVKG (SEQ ID NO: 69) (Kabat); | ASGGSGSYWPYMDP (SEQ ID NO: GFIFSSF (SEQ ID NO: 67) (Chothia); SGSGAS (SEQ ID NO: 70) (Chothia) 71) GFIFSSFAMS (SEQ ID NO: 68) (Estendida)

P1B4 RYALS (SEQ ID NO: 72) (Kabat); GIIPMLGFANYAQKFQG (SEQ ID NO: 75) (Kabat); LDFGALDY (SEQ ID NO: 77) GGVFSRY (SEQ ID NO: 73) (Chothia); IPMLGF (SEQ ID NO: 76) (Chothia) GGVFSRYALS (SEQ ID NO: 74) (Estendida)

P1B11 SFDIS (SEQ ID NO: 78) (Kabat); RIIPILGYANYAQKFOQG (SEQ ID NO: 81) (Kabat); DLGAPWAGYPFDP (SEQ ID NO: GGTFRSF (SEQ ID NO: 79) (Chothia); IPILGY (SEQ ID NO: 82) (Chothia) 83) GGTFRSFDIS (SEQ ID NO: 80) (Estendida) P7H3 SYAMH (SEQ ID NO: 84) (Kabat); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 87) (Kabat); GTRWWWGDAFDH (SEQ ID NO: GFTFSSY (SEQ ID NO: 85) (Chothia); SGSGGS (SEQ ID NO: 88) (Chothia) 89) GFTFSSYAMH (SEQ ID NO: 86) (Estendida) P3E10 SYAIQ (SEQ ID NO: 90) (Kabat); GIVGSWGLANYAQKFQG (SEQ ID NO: 93) (Kabat); | SAFGELAS (SEQ ID NO: 95) GGTFSSY (SEQ ID NO: 91) (Chothia); VGSWGL (SEQ ID NO: 94) (Chothia) GGTFSSYAIQ (SEQ ID NO: 92) (Estendida) P1A5 RYALS (SEQ ID NO: 96) (Kabat); GIIPMLGFANYAQKFQG (SEQ ID NO: 99) (Kabat); LDFGALDY (SEQ ID NO: 101) GGVFSRY (SEQ ID NO: 97) (Chothia); IPMLGF (SEQ ID NO: 100) (Chothia) o GGVFSRYALS (SEQ ID NO: 98) (Estendida) o& P5F7 SYAMN (SEQ ID NO: 102) (Kabat); SISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 105) (Kabat); | DISPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: E GFTFSSY (SEQ ID NO: 103) (Chothia); SGGGRS (SEQ ID NO: 106) (Chothia) 107) GFTFSSYAMN (SEQ ID NO: 104) (Estendida) P4H11 SYAMN (SEQ ID NO: 108) (Kabat); SISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 111) (Kabat); | DISPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: GFTFSSY (SEQ ID NO: 109) (Chothia); SGGGRS (SEQ ID NO: 112) (Chothia) 113) GFTFSSYAMN (SEQ ID NO: 110) (Estendida) P15F7 NYAMN (SEQ ID NO: 114) (Kabat); VISGSGGTTYYADSVKG (SEQ ID NO: 117) (Kabat); | GIWDLRY (SEQ ID NO: 119) GFTFNNY (SEQ ID NO: 115) (Chothia); SGSGGT (SEQ ID NO: 118) (Chothia) GFTFNNYAMN (SEQ ID NO: 116) (Estendida) P12B6 SYAIS (SEQ ID NO: 120) (Kabat); GIIPIFGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 123) (Kabat); ETLIYPIPFEL GGTFMSY (SEQ ID NO: 121) (Chothia); IPIFGI (SEQ ID NO: 124) (Chothia) (SEQ ID NO: 125) GGTFMSYAIS (SEQ ID NO: 122) (Estendida) P8B6 SYAVS (SEQ ID NO: 126) (Kabat); GIIPIFGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 129) (Kabat); EGIGGDLRYDGYDA (SEQ ID NO:

GGTFSSY (SEQ ID NO: 127) (Chothia); IPIFGI (SEQ ID NO: 130) (Chothia) 131) ease na Ev

P14G2 NYVMN (SEQ ID NO: 132) (Kabat); AISGSGATTYYADSVKG (SEQ ID NO: 135) (Kabat); | GLWAGGI (SEQ ID NO: 137)

GFTFSNY (SEQ ID NO: 133) (Chothia); SGSGAT (SEQ ID NO: 136) (Chothia) GFTFSNYVMN (SEQ ID NO: 134) (Estendida)

P7F9 SYAMS (SEQ ID NO: 138) (Kabat); AIGGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 141) (Kabat); | DYYAFSDPAYGGMDV (SEQ ID NO: GFTFSSY (SEQ ID NO: 139) (Chothia); GGSGGS (SEQ ID NO: 142) (Chothia) 143)

GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 140) (Estendida)

POS8BOGEE | SYAVS (SEQ ID NO: 294) (Kabat); GIIPIFGIANYAQKFQG (SEQ ID NO: 297) (Kabat); EGIGGDLRYEGYDA (SEQ ID NO: GGTFSSY (SEQ ID NO: 295) (Chothia); IPIFGI (SEQ ID NO: 298) (Chothia) 299)

GGTFSSYAVS (SEQ ID NO: 296) (Estendida)

PO4A04 SYYIT (SEQ ID NO: 300) RIMPAFGWTNYAQKFOQG (SEQ ID NO: 302) (Kabat) | DEFGAFDV (SEQ ID NO: 304) R GGTFSSY (SEQ ID NO: 295) (Chothia) MPAFGW (SEQ ID NO: 303) (Chothia) R GGTFSSYYIT (SEQ ID NO: 301) (Estendida) º?

PO1A05 RYALS (SEQ ID NO: 305) (Kabat); IPMLGF (SEQ ID NO: 308) (Chothia) LDFGALDY (SEQ ID NO: 3110)

GGVFSRY (SEQ ID NO: 306) (Chothia); GGIIPMLGFANYAQKFOG (SEQ ID NO: 309) GGVFSRYALS (SEQ ID NO: 307) (Estendida) (Kabat)

PO8BO03 SYDIS (SEQ ID NO: 311) (Kabat); RIIPSFGAANYAQKFQG (SEQ ID NO: 313) (Kabat) DDGEGWTPPFGY (SEQ ID NO: GGTFSSY (SEQ ID NO: 295) (Chothia); IPSFGA (SEQ ID NO: 314) (Chothia ) 315)

GGTFSSYDIS (SEQ ID NO: 312) (Estendida)

P5F7g; SYAMN (SEQ ID NO: 316) (Kabat); SISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 319) (Kabat); | DISPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO:

P10A02g9; | GFTFSSY (SEQ ID NO: 317) (Chothia); SGGGRS (SEQ ID NO: 320) (Chothia) 321)

P10A049g; GFTFSSYAMN (SEQ ID NO: 318) (Estendida)

P10A05g;

P10A079; P10B03g;

DO O P5F792; SYAMN (SEQ ID NO: 316) (Kabat); AISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 322) (Kabat); | DISPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: P5F793 GFTFSSY (SEQ ID NO: 317) (Chothia); SGGGRS (SEQ ID NO: 320) (Chothia) 321) e aaa, |MTeeme P5F794 SYAMS (SEQ ID NO: 138) (Kabat); AISGGGRSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 322) (Kabat); | DISPSDVGWGYGFDI (SEQ ID NO: EEE PoE GFTFSSYAMS (SEQ ID NO: 140) (Estendida) a PBR ERES g ê

& z $ o

[00134] A invenção abrange modificações nos CARs e polipeptí- deos da invenção mostrados na Tabela 2, incluindo CARs funcional- mente equivalentes com modificações que não afetam significativa- mente suas propriedades e variantes que possuem atividade ou afini- dade aprimorada ou diminuída. Por exemplo, a sequência de aminoá- cidos pode ser mutada para obter um anticorpo com a afinidade de ligação desejada ao FLT3. A modificação de polipeptídeos é uma prá- tica rotineira na técnica e não precisa ser descrita em detalhes neste documento. Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptí- deos com substituições conservadoras de resíduos de aminoácidos, uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que não alteram significativamente a atividade funcional de maneira prejudicial ou que amadurecem (aumentam) a afinidade do polipeptídeo para seu ligante ou usam de análogos químicos.

[00135] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões de terminal amino e/ou carboxila com o comprimento variando de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intrasequentes de resíduos de aminoácidos únicos ou múlti- plos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila N-terminal ou o anticorpo fundido a uma etiqueta de epítopo. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo inclu- em a fusão ao terminal N ou C do anticorpo de uma enzima ou poli- peptídeo que aumenta a meia-vida do anticorpo na circulação sanguí- nea.

[00136] As variantes de substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os locais de maior interesse para a mutagêne- se substitucional incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações na FR também são contempladas. As substituições conservadoras são mostradas na Tabela 4, sob o título "substituições conservadoras". Se tais substituições resultarem em uma mudança na atividade biológica,

poderão ser introduzidas alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 4, ou conforme descrito abaixo em referência às classes de aminoácidos e os produtos selecionados. Tabela 4: Substituições de aminoácidos Resíduo Original (Aminoácido de | Substituições — Con- eo e [noere te Var er AE Pre |

[00137] Em algumas modalidades, é fornecido no presente docu- mento um CAR compreendendo um domínio de ligação ao ligante ex- tracelular que se liga ao FLT3 e compete pela ligação ao FLT3 com um CAR aqui descrito, incluindo o CAR compreendendo um domínio extracelular compreendendo P4F6, P4C7, P3A1, P5A3, P9B5, P9F1, P1B4, P1B11, P7H3, P3E10, P1A5, P5F7, P4H11, P15F7, P12B6,

P8B6, P14G2, P7F9, POSBOGEE, PO4A04, PO1AOS, POSBO3, P5F79, P10A02g, P1O0AO04g, P1IOAO5g, P1OAO7g, P1IOBO3g, P10B06g, P5F792, P5F793 e P5F794.

[00138] Em algumas modalidades, é fornecido no presente docu- mento um CAR, que se liga especificamente a FLT3, em que o CAR compreende uma região VH compreendendo uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 4; e/ou uma região VL compreendendo uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, é fornecido no presente documento um CAR, que se liga especificamente a FLT3, em que o CAR compreende uma região VH compreendendo uma sequên- cia mostrada na SEQ ID NO: 6; e/ou uma região VL compreendendo uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, a invenção fornece um CAR, que se liga especificamente a FLT3, em que o CAR compreende uma região VH compreendendo uma sequên- cia mostrada na SEQ ID NO: 10; e/ou uma região VL compreendendo uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, é fornecido no presente documento um CAR, que se liga especifica- mente a FLT3, em que o CAR compreende uma região VH compreen- dendo uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 20; e/ou uma região VL compreendendo uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 19.

[00139] Em algumas modalidades, a invenção também fornece CARs compreendendo porções de CDR de anticorpos para anticorpos FLT3 com base nas regiões de contato da CDR. As regiões de contato da CDR são regiões de um anticorpo que conferem especificidade ao anticorpo para um antígeno. Em geral, as regiões de contato da CDR incluem as posições dos resíduos nas zonas CDR e Vernier que são restritas a fim de manter uma estrutura de alça adequada para o anti- corpo se ligar a um antígeno específico. Ver, por exemplo, Makabe et al., J. Biol.Chem. 283: 1156-1166, 2007. A determinação das regiões de contato da CDR está bem dentro dos conhecimentos da técnica.

[00140] A afinidade de ligação (Kp) do domínio de ligação ao ligante do CAR específico de FLT3 como descrito neste documento para FLT3 (tais como FLT3 humano (por exemplo, (SEQ ID NO: 198) pode ser, por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 1.000 nm, por exemplo, en- tre cerca de 0,5 nM a cerca de 500 nM ou, por exemplo, entre cerca de 1 nM a cerca de 250 nM. Em algumas modalidades, a afinidade de |i- gação é de cerca de 1.000 nm, 750 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nm, 18 nm, 17 nm, 16 nm, 15 nM, 10 nM, 8 nM, 7,5 nM, 7 NM, 6,5 NM, 6 NM, 5,5 NM, 5 NM, 4 NM, 3 NM, 2 nM, 1 NM, 0,5 nM, 0,3 NM ou 0,1 nM.

[00141] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação (Kp) de scFv do domínio de ligação ao ligante do CAR específico de FLT3 co- mo descrito neste documento para FLT3 é de cerca de 10 nM a cerca de 100 nM, cerca de 10 nM a cerca de 90 nm, cerca de 10 nM a cerca de 80 nM, sobre 20 nM a cerca de 70 nM, cerca de 25 nM a cerca de 75 NM ou cerca de 40 nM a cerca de 110 nM. Em uma modalidade, as afinidades de ligação do scFv descritas neste parágrafo são para o FLT3 humano.

[00142] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação (Kp) de scFv do domínio de ligação ao ligante do CAR específico de FLT3 co- mo descrito neste documento para o domínio 4 do domínio extracelular de FLT3 humano é de cerca de 1 nM a cerca de 100 nM, cerca de 10 NM a cerca de 100 nM, cerca de 20 nM a cerca de 100 nM, cerca de nM a cerca de 105 nM, cerca de 40 nM a cerca de 80 nM, cerca de 40 nM a cerca de 100 nM ou cerca de 50 nM a cerca de 100 nM.

[00143] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação (Kp) de scFv do domínio de ligação ao ligante do CAR específico de FLT3 co- mo descrito neste documento para o domínio 2-3 do domínio extrace- lular de FLT3 humano é cerca de 5 nM a 30 nM, cerca de 5 nM até cerca de 25 nM, cerca de 10 nM a cerca de 30 nM, cerca de 10 nM a cerca de 40 nM ou cerca de 10 nM a cerca de 25 nM.

[00144] Em uma modalidade exemplificadora, a Ko dos ScFv é me- dida tal como descrito no Exemplo 1.

[00145] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é inferior a cerca de 1.000 nm, 900 nm, 800 nm, 250 nM, 200 nM, 100 nM, 50 NM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7,5 nM, 7 NM, 6,5 NM, 6 NM, 5 nM. Epítopos específicos de anticorpos monoclonais

[00146] Em algumas modalidades, o domínio extracelular de qual- quer um dos CARs específicos de FLT3 descritos neste documento pode compreender um ou mais epítopos específicos para (isto é, es- pecificamente reconhecidos por) um anticorpo monoclonal. Esses epí- topos são também ditos neste documento como epítopos específicos de mAb. Nessas modalidades, o domínio extracelular compreende os polipeptídeos VH e VL que se ligam especificamente a FLT3 e um ou mais epítopos que se ligam a um ou mais anticorpos monoclonais (mAbs). Os CARs compreendendo os epítopos específicos de mAb podem ser de cadeia única ou de cadeia múltipla.

[00147] A inclusão de epítopos específicos para anticorpos mono- clonais no domínio extracelular dos CARs descritos neste documento permite a classificação e o esgotamento de células imunológicas proje- tadas que expressam os CARs. Em algumas modalidades, esse recur- so também promove a recuperação de células endógenas que expres- sam FLT3 que foram esgotadas pela administração de células imuno- lógicas projetadas que expressam os CARSs.

[00148] Por conseguinte, em algumas modalidades, a presente in- venção refere-se a um método para classificar e/ou esgotar as células imunológicas projetadas dotadas de CARs compreendendo epítopos específicos de mAb e um método para promover a recuperação de cé- lulas que expressam FLT3 endógeno, como células progenitoras da medula óssea.

[00149] Vários pares de epíitopo-anticorpo monoclonal podem ser usados para gerar CARs compreendendo epítopos específicos de an- ticorpo monoclonal; em particular, aqueles já aprovados para uso mé- dico, como o epítopo CD20/rituximabe como um exemplo não limitati- vo.

[00150] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal especiífi- co para o epítopo pode ser conjugado com um fármaco citotóxico. Também é possível promover a citotoxicidade do CDC usando anti- corpos manipulados nos quais componentes ou componentes enxer- tados do sistema complemento. Em algumas modalidades, a ativação das células CAR-T pode ser modulada esgotando as células usando um anticorpo que reconhece o epítopo.

[00151] A invenção também abrange métodos para classificar as células imunológicas projetadas dotadas de CARs específicos de FLT3 que expressam o epítopo (ou epítopos) específico de mAb e métodos terapêuticos em que a ativação das células imunológicas projetadas dotadas com esses CARs é modulada esgotando as células usando um anticorpo que tem como alvo o domínio de ligação ao ligante ex- terno dos ditos CARs.

[00152] Os CARs que compreendem um ou mais epítopos especifi- camente reconhecidos por um anticorpo monoclonal são descritos no documento WO2016/120216, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade. O epítopo pode ser selecionado a partir de qualquer número de epítopos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o epítopo pode ser um alvo de um anticorpo monoclonal aprovado para uso médico, como, por exemplo, sem limitação, o epí- topo CD20 reconhecido pelo rituximab. Em algumas modalidades, o epítopo compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 229.

CPYSNPSLC (SEQ ID NO: 229)

[00153] Em algumas modalidades, o epítopo pode ser localizado entre o scFv e a dobradiça de um CAR. Em algumas modalidades, du- as instâncias do mesmo epítopo, separadas por ligantes, podem ser usadas no CAR. Por exemplo, um polipeptídeo compreendendo 2 có- pias do epítopo mostrado na SEQ ID NO: 229, separado por ligantes, como mostrado em GSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSCPYSNPS- LCSGGGGS (SEQ ID NO: 230), pode ser usado dentro de um CAR, localizado entre a região variável de cadeia leve e a dobradiça.

[00154] Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelu- lar do CAR compreendendo os polipeptídeos VH e VL e os epítopos específicos de mAb pode ter estruturas diferentes, dependendo da po- sição de inserção do epítopo e do uso de ligantes. Por exemplo, o do- mínio de ligação extracelular do CAR específico de FLT3 compreen- dendo epítopos específicos de mAb pode ter uma das seguintes estru- turas: V1-L1-V2-(L).-Epítopo 1-(L)-; V1-L1-V2-(L).-Epítopo1-(L).-Epíitopo2-(L)x; V1-L1-V2-(L).-Epítopo1-(L).-Epítopo2-(L).-Epítopo3-(L)x; (L).-Epítopo1-(L).-V1-L1-V2; (L).-Epítopo1-(L).-Epíitopo2-(L).-V1-L1-V>; Epítopo1-(L).-Epíitopo2-(L).-Epítopo3-(L).-V1-L1-V2; (L).-Epítopo1-(L).x-V1-L1-V2-(L).-Epíitopo2-(L)x; (L),-Epítopo1-(L).x-V1-L1-V2-(L).-Epíitopo2-(L).-Epíitopo3-(L)x-; (L).-Epítopo1-(L)-V1-L1-V2-(L),-Epítopo2-(L).-Epítopo3-(L).-Epítopo4- (L)x; (L).-Epítopo1-(L).-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2-(L).-Epítopo3-(L)x-; (L).-Epítopo1-(L).-Epítopo2-(L).-V1-L1-V2-(L).-Epítopo3-(L).-Epítopo4- (L); V1-(L).-Epítopo1-(L).-V2;

V1-(L).-Epítopo1-(L).x-V2-(L).-Epítopo2-(L)x; V1-(L).-Epítopo1-(L)x-V2-(L).-Epítopo2-(L).-Epítopo3-(L)x; V1-(L).-Epítopo1-(L)x-V2-(L).-Epíitopo2-(L).-Epítopo3-(L).-Epitopo4-(L)x; (L).-Epítopo1-(L).-V1-(L).-Epítopo2-(L).x-V2; Ou, (L).-Epítopo1-(L).-V1-(L).-Epítopo2-(L).-V2-(L).-Epítopo3-(L); em que, V1: é uma V. e Vo é Va ou V1 é Vu e Voé Vi; L1 é um ligante apropriado para ligar a cadeia Vx à cadeia V.;

[00155] Lé um ligante que compreende resíduos de glicina e seri- na, e cada ocorrência de L no domínio de ligação extracelular pode ser idêntica ou diferente de outra ocorrência de L no mesmo domínio de ligação extracelular, por exemplo, SGGGG, GGGGS ou SGGGGS e, x é O ou1e cada ocorrência de x é selecionada independentemente das outras; e,

[00156] O Epítopo 1, o Epítopo 2, o Epítopo 3 e o Epítopo 4 são epítopos específicos de mAb e podem ser idênticos ou diferentes. Em algumas modalidades, o Epítopo 1, o Epítopo 2 e o Epítopo 4 são um epítopo específico do mAb com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 229 e o Epítopo 3 é um epítopo específico do mAb com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 231.

[00157] Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelu- lar do CAR compreende a seguinte sequência V1-L1-V2-(L).-Epítopo1-(L).-Epítopo2-(L)x-; ou, (L).-Epítopo1-(L).-V1-L1-V2-(L),-Epítopo2-(L).-Epítopo3-(L).-Epítopo4- (L)--, em que V1, V2, L1, L, x e Epítopo 1, Epítopo 2, Epítopo 3 e Epítopo 4 são conforme definido acima.

[00158] Em algumas modalidades, qualquer um dos CARs especiífi- cos de FLT3 descritos neste documento pode compreender um ou mais epítopos específicos de mAb selecionados a partir de um epítopo CD52, um epítopo CD20, um epítopo CD3, um epítopo CD41, um epí-

topo CD25, um epítopo CD30, um EGFR epítopo, um epítopo TNFa, um epítopo VEGF, um epítopo da proteína C5 do complemento, um epítopo CD11a, um epítopo CD33, um epítopo alfa-4 integrina, um epí- topo da região IgE Fc, um epítopo da região Fc da IgE, um epítopo da proteína F do RSV, um epítopo do receptor da IL-6, um epítopo do re- ceptor HER2, um epítopo da integrina a4B7, um epítopo BAFF (fator de ativação das células B), um epítopo IL-18B, um epítopo RANKL, um epítopo CTLA4, um epítopo CD34, um epítopo IL-12 e/ou um epítopo de IL-23.

[00159] Em algumas modalidades, os CARs específicos de FLT3 descritos neste documento podem compreender um ou mais epítopos específicos de mAb selecionados a partir de epítopos reconhecidos especificamente por alemtuzumab, ibritumomabe tiuxetano, muromo- nab-CD3, tositumomab, abciximab, basiliximab, brentuximabe vedoti- na, cetuximab, infliximab, infliximab,, certolizumabe pegol, daclizumab, eculizumab, efalizumab, gemtuzumab, natalizumab, omalizumab, pali- vizumab, ranibizumab, tocilizumab, trastuzumab, vedolizumab, ada- limumab, belimumab, canakinumab, iposumab.

[00160] Em algumas modalidades, os CARs específicos de FLT3 compreendem um ou mais epítopos específicos de mAb selecionados a partir dos epítopos descritos na Tabela 5: Tabela 5: Exemplos de epítopos específicos de mAb que podem ser usados no domínio de ligação extracelular dos CARs específicos de FLT3 da invenção, como, por exemplo, mimotopos e epítopo com seu mMAb correspondente

[00161] O domínio de sinalização intracelular de um CAR de acordo com a invenção é responsável pela sinalização intracelular após a li- gação do domínio de ligação ao ligante extracelular ao alvo, resultando na ativação da célula imunológica e na resposta imunológica. O domí- nio de sinalização intracelular tem a capacidade de ativar pelo menos uma das funções efetoras normais da célula imunológica na qual o CAR é expresso. Por exemplo, a função efetora de uma célula T pode ser uma atividade citolítica ou atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas.

[00162] Em algumas modalidades, um domínio de sinalização intra- celular para uso em um CAR pode ser as sequências citoplasmáticas, por exemplo, sem limitação, do receptor de células T e correceptores que atuam em conjunto para iniciar a transdução de sinal após o en- volvimento do receptor de antígeno, bem como qualquer derivado ou variante dessas sequências e qualquer sequência sintética que tenha a mesma capacidade funcional. Os domínios de sinalização intracelu- lar compreendem duas classes distintas de sequências de sinalização citoplasmáticas: aquelas que iniciam a ativação primária dependente de antígeno e aquelas que agem de maneira independentemente de antígeno para fornecer um sinal secundário ou coestimulador. As se- quências de sinalização citoplasmáticas primárias podem compreen- der motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ati-

vação baseados em tirosina de imunoreceptores de ITAMs. ITAMs são motivos de sinalização bem definidos encontrados na cauda intracito- plasmática de uma variedade de receptores que servem como locais de ligação para tirosina quinases da classe syk/zap70. Exemplos de ITAM utilizados na invenção podem incluir como exemplos não limitati- vos os derivados de TORG, FcRy, FcRB, FcRe, CD3y, CD3ô, CD3e, CD5, CD22, CD79a, CD79b e CD66d. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular do CAR pode compreender o do- mínio de sinalização CD37 que possui sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, por exemplo, pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, 95%, 97% ou 99 % de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ. ID NO: 210. Em algu- mas modalidades, o domínio de sinalização intracelular do CAR da invenção compreende um domínio de uma molécula coestimuladora.

[00163] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intrace- lular de um CAR da invenção compreende uma parte da molécula co- estimuladora selecionada do grupo que consiste no fragmento de 41BB (GenBank: AAA53133.) e CD28 (NP 006130.1). Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular do CAR da inven- ção compreende a sequência de aminoácidos que compreende pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de ami- noácidos mostrada em SEQ. ID NO: 209 e SEQ. ID NO: 213. Em al- gumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular do CAR da invenção compreende a sequência de aminoácidos que compreende pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos mostrada em SEQ. ID NO: 209 e SEQ. ID NO: 214.

[00164] Os CARs são expressos na membrana superficial da célula. Assim, o CAR pode compreender um domínio transmembranar. Os domínios transmembranares adequados para um CAR descrito neste documento têm a capacidade de (a) serem expressos na superfície de uma célula, por exemplo, uma célula imunológica, como, por exemplo, sem limitação, células linfocitárias ou células natural killer (NK), e (b) interagem com o domínio de ligação ao ligante e o domínio de sinali- zação intracelular para direcionar a resposta celular da célula imunoló- gica contra uma célula-alvo predefinida. O domínio transmembranar pode ser derivado de uma fonte natural ou de uma fonte sintética. O domínio transmembranar pode ser derivado de qualquer proteína ou membrana transmembranar ligada à membrana. Como exemplos não limitativos, o polipeptídeo transmembranar pode ser uma subunidade do receptor de células T, como a, B, y ou 5, polipeptídeo que constitui o complexo CD3, receptor de IL-2 p55 (uma cadeia), p75 (cadeia B) ou y cadeia, cadeia de subunidade de receptores Fc, em particular recep- tor Ill de Fcy, ou proteínas CD. Alternativamente, o domínio de trans- membranar pode ser sintético e pode compreender resíduos predomi- nantemente hidrofóbicos, como leucina e valina. Em algumas modali- dades, o dito domínio transmembranar é derivado da cadeia CD8a humana (por exemplo, NP 001139345.1).

[00165] O domínio transmembranar está ligado ao domínio de liga- ção ao ligante extracelular por um domínio de haste (também chama- do domínio de dobradiça). Um domínio de haste pode compreender até 300 aminoácidos, por exemplo, 10 a 100 aminoácidos ou 25 a 50 aminoácidos. A região de haste pode ser derivada a partir de toda ou parte das moléculas que ocorrem naturalmente, tais como a partir de toda ou parte da região extracelular de CD8, CD4 ou CD28, ou de toda ou parte de uma região constante de anticorpo. Alternativamente, o domínio de haste pode ser uma sequência sintética que corresponde a uma sequência de haste que ocorre naturalmente ou pode ser uma sequência de haste totalmente sintética. Em algumas modalidades, o dito domínio de haste é uma parte da cadeia CD8a humana (por exemplo, NP 001139345.1). Em outra modalidade específica, os ditos domínios transmembranar e dobradiça compreendem uma parte da cadeia CD8a humana, por exemplo, que compreende pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90%, 95% 97% ou 99% de identi- dade de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 206 e 208. Em algumas modalida- des, o domínio de haste dos CARs específicos de FLT3 descritos nes- te documento compreende uma dobradiça CD8a, uma dobradiça I9G1 ou uma dobradiça FceyRllla. Em algumas modalidades, o domínio de haste compreende uma dobradiça CD8a humana, uma dobradiça I9G1 humana ou uma dobradiça FeyRllla humana. Em algumas modalida- des, os CARs descritos neste documento podem compreender um domínio de ligação ao ligante extracelular que se liga especificamente aos domínios de dobradiça e transmembrana humanas FLT3, CD8a, o domínio de sinalização de CD36 e o domínio de sinalização de 4-1BB.

[00166] A Tabela 6 fornece sequências exemplificadoras de domí- nios que podem ser utilizados nos CARs descritos neste documento.

Tabela 6: Sequências exemplificadoras de componentes CAR RR cemnenenda Amada RS Dobradiça IgG1 EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHED | 207

PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA

LHNHYTQKSLSLSPGK Domínio de Sinalização Intracelular (ISD) CD37 RVKFSRSADAPAY QOGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK | 210 3 NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALH = MOALPPR 8 de Cadeia FceRI a) FCeRIB-AITAM (Cadeia FceRI B sem ITAM) MDTESNRRANLALPQEPSSVPAFEVLEISPQEVSSGRLLKSASSPPLHTWLTVLK | 212

KEQEFLGVTOQILTAMICLCFGTVVCSVLDISHIEGDIFSSFKAGYPFWGAIFFSISG

MLSIISERRNATYLVRGSLGANTASSIAGGTGITILIINLKKSLAYIHIHSCOKFFETK oo ne ca cNAS)

[00167] A regulação negativa ou mutação dos antígenos-alvo é co- mumente observada nas células cancerígenas, criando variantes de escape de perda de antígeno.

Assim, para compensar a fuga do tumor e tornar a célula imunológica mais específica ao alvo, o CAR específi- co do FLT3 pode compreender um ou mais domínios adicionais de li- gação ao ligante extracelular, para ligar simultaneamente diferentes elementos no alvo, aumentando assim a ativação e a função da célula imunológica.

Em algumas modalidades, os domínios de ligação ao |i- gante extracelular podem ser colocados em conjunto no mesmo poli- peptídeo transmembranar e, opcionalmente, podem ser separados por um ligante.

Em algumas modalidades, os ditos domínios de ligação a ligantes extracelulares diferentes podem ser colocados em diferentes polipeptídeos transmembranares que compõem o CAR.

Em algumas modalidades, a invenção refere-se a uma população de CARs, cada CAR compreendendo um domínio de ligação ao ligante extracelular diferente.

Em particular, a invenção refere-se a um método de enge- nharia de células imunológicas que compreende o fornecimento de uma célula imunológica e a expressão na superfície da célula de uma população de CARs, cada CAR compreendendo diferentes domínios extracelulares de ligação a ligantes.

Em outra modalidade particular, a invenção se refere a um método de engenharia de uma célula imuno- lógica que compreende o fornecimento de uma célula imunológica e a introdução nos polinucleotídeos celulares que codificam polipeptídeos que compõem uma população de CAR, cada um compreendendo dife- rentes domínios de ligação a ligantes extracelulares.

Por população de CARs, entende-se pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis ou mais CARs, cada um compreendendo diferentes domínios de ligação ao ligante extracelular.

Os diferentes domínios extracelulares de ligação ao ligante de acordo com a invenção podem, por exemplo, ligar simul- taneamente diferentes elementos no alvo, aumentando assim a ativa- ção e a função das células imunológicas.

A invenção também se refere a uma célula imunológica isolada que compreende uma população de

CARs, cada uma compreendendo diferentes domínios de ligação ao ligante extracelular.

[00168] Em outro aspecto, são fornecidos no presente documento polinucleotídeos que codificam qualquer um dos CARs e polipeptídeos descritos neste documento. Os polinucleotídeos podem ser produzidos e expressos por procedimentos conhecidos na técnica.

[00169] Em outro aspecto, são fornecidas neste documento com- posições (como composições farmacêuticas) compreendendo qual- quer uma das células da invenção. Em algumas modalidades, a com- posição compreende uma célula compreendendo um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos CARs descritos neste documento. Em ainda outras modalidades, a composição compreende um ou ambos os polinucleotídeos mostrados na SEQ ID NO: 245 e na SEQ ID NO: 246 abaixo: Região variável da cadeia pesada P3E10

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCAG GCAGCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCTGGCGGCACATTC TCTAGCTACGCCATCCAGTGGGTGCGGCAGGCACCAGGACAGGG CCTGGAGTGGATGGGAGGAATCGTGGGAAGCTGGGGCCTGGCA AACTACGCCCAGAAGTTTCAGGGCAGAGTGACCATCACCACCGAT AAGTCTACAAGCACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCTCTGAGGTCC GAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCACCTCCGCCTTCGGCGA

GCTGGCATCTTGGGGACAGGGCACACTGGTGACCGTGAGCTCC (SEQ ID NO: 245) Região variável da cadeia leve P3E10

GAGATCGTGCTGACACAGAGCCCAGGCACCCTGTCCCTGTCTCC AGGAGAGAGGGCCACACTGTCCTGTAGGGCCAGCCAGTCCGTGC CTTCTAGCCAGCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCC CCCAGACTGCTGATCTATGACGCCTCCTCTAGAGCCACAGGCATC CCAGATAGGTTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTTACACTG ACCATCTCCAGGCTGGAGCCCGAGGATTTCGCCGTGTACTATTGC

CAGCAGTACGGCAGCTCCCCTCTGACATTTGGCCAGGGCACCAA GGTGGAGATCAAGG (SEQ ID NO: 246)

[00170] Em ainda outras modalidades, a composição compreende um ou ambos os polinucleotídeos mostrados na SEQ ID NO: 247 e SEQ ID NO: 248 abaixo: Região variável da cadeia pesada P3A1

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCCG GCAGCTCCGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCCAGCGGCGGCACATTC TCTAGCTACGATATCTCTTGGGTGAGGCAGGCCCCAGGCCAGGG ACTGGAGTGGATGGGAGGAATCATCCCCGTGAGCGGAAGGGCAA ACTACGCACAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCATCACCACAGAC AAGTCCACATCTACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCTCTGAGAAGC GAGGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGAGTGAGGCCTACCTAC

TGGCCACTGGACTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGTGAG CTCC (SEQ ID NO: 247) Região variável da cadeia leve P3A1

GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCTAGCCTGAGCGCCTCCGT GGGCGATAGAGTGACAATCACCTGTAGGGCCTCTCAGAGCATCTC CTCTTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAA GCTGCTGATCTACGCAGCAAGCTCCCTGCAGTCCGGAGTGCCAT CTCGGTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACAGACTTTACACTGACCA TCTCTAGCCTGCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTATTGCCAGC

AGTCCTATTCTACACCACTGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGTGG AGATCAAG (SEQ ID NO: 248).

[00171] Em ainda outras modalidades, a composição compreende um ou ambos os polinucleotídeos mostrados na SEQ ID NO: 249 e SEQ ID NO: 250 abaixo: Região variável da cadeia pesada P9B5

GAGGTGCAGCTGCTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCTG GCGGCTCTCTGAGACTGAGCTGCGCAGCATCCGGCTTCATCTTTG CCTCTTACGCAATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGA CTGGAGTGGGTGAGCGAGATCAGCTCCTCTGGCGGCAGCACCAC ATATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACAATCAGCCGGGACA ACTCTAAGAATACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCG AGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGAGATAGAGTGATGGCC

GGCCTGGGCTATGACCCATTTGATTACTGGGGCCAGGGCACACT GGTGACCGTGAGCTCC (SEQ ID NO: 249).

Região variável da cadeia leve P9B5

CAGAGCGTGCTGACCCAGCCACCTTCCGCCTCTGGAACACCCGG CCAGAGGGTGACCATCAGCTGTTCCGGCTCTAGCTCCAACATCG GCTCCAATTACGTGTATTGGTACCAGCAGCTGCCCGGCACAGCCC CTAAGCTGCTGATCTACAGAAACAATCAGAGGCCATCTGGCGTGC CCGACCGCTTCTCETGGCAGCAAGTCCGGCACCTCTGCCAGCCTG GCAATCAGCGGACTGCGGTCCGAGGACGAGGCCGATTACTATTG

CGCAGCATGGGACGATTCCCTGTCTGGAGTGGTGTTTGGCGGCGÇ GCACAAAGCTGACCGTGCTG (SEQ ID NO: 250). Em ainda outras modalidades, a composição compreende um ou ambos os polinucleotídeos mostrados na SEQ ID NO: 251 e SEQ ID NO: 252 abaixo: Região variável da cadeia pesada P4C7

CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTG

GCAGCTCCGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCCAGCGGCGGCACATTC TCTAGCTACACCATCTCCTGGGTGCGGCAGGCCCcCAGGCCAGGG

ACTGGAGTGGATGGGAGGAATCATCCCAGCCTTCGGCATCGCCA ACTACGCCCAGAAGTTTCAGGGCCGCGTGACAATCACCGCCGAC AAGTCCACATCTACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGGAGC GAGGATACCGCCGTGTACTATTGCGCCAAGGGCGGCAGCTACTC

CCTGGACTATTTTGATATCTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACCGT GAGCTCC (SEQ ID NO: 251) Região variável da cadeia leve P4C7

GAGATCGTGCTGACACAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGAGCCC AGGCGAGAGGGCCACACTGTCCTGTAGGGCATCTCAGTACGTGT CCGCCTCTCTGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCC CCAAGACTGCTGATCTACGGAGCATCCACAAGAGCCACCGGCAT CCCCGACAGGTTCAGCGGCTCCGGCTCTGGAACCGACTTCACCC TGACCATCTCTAGACTGGAGCCTGAGGACTTCGCCGTGTACTATT

GCCAGCAGTATGCCAGGTCTAGCACATTTGGCCAGGGCACCAAG GTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 252)

[00172] Os vetores de expressão e administração de composições polinucleotídicas são ainda descritos neste documento.

[00173] Em outro aspecto, é aqui fornecido um método para produ- zir qualquer um dos polinucleotídeos descritos neste documento.

[00174] Os polinucleotídeos complementares a essas sequências também são abrangidos pela invenção. Os polinucleotídeos podem ser de fita simples (codificante ou anti-sentido) ou de fita dupla, e podem ser moléculas de DNA (genômica, cDNA ou sintética) ou RNA. As mo- léculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm fíntrons e correspondem a uma molécula de DNA de maneira individual, e molé- culas de mRNA, que não contêm íntrons. Sequências codificantes ou não codificantes adicionais podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da invenção, e um polinucleotídeo pode, mas não precisa, estar ligado a outras moléculas e/ou materiais de su- porte.

[00175] Os polinucleotíideos podem compreender uma sequência nativa (isto é, uma sequência endógena que codifica um anticorpo ou uma porção do mesmo) ou pode compreender uma variante dessa se- quência. As variantes de polinucleotídeo contêm uma ou mais substi- tuições, adições, deleções e/ou inserções, de modo que a imunorreati- vidade do polipeptídeo codificado não seja diminuída em relação a uma molécula imunorreativa nativa. O efeito na imunorreatividade do polipeptídeo codificado pode geralmente ser avaliado como descrito neste documento. As variantes exibem, de maneira genérica, pelo me- nos cerca de 70% de identidade, ou pelo menos cerca de 80% de identidade, ou mesmo pelo menos cerca de 90% ou 95% de identida- de de uma sequência polinucleotídica que codifica um anticorpo nativo ou uma porção dele.

[00176] Diz-se que duas sequências polinucleotídicas ou polipeptí- dicas são "idênticas" se a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos nas duas sequências for a mesma quando alinhada para a correspon- dência máxima, conforme descrito abaixo. As comparações entre duas sequências são normalmente realizadas comparando as sequências em uma janela de comparação para identificar e comparar regiões lo- cais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação", como utilizada neste documento, refere-se a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, geralmente 30 a cerca de 75 ou 40 a cerca de 50, nas quais uma sequência pode ser comparada a uma se- quência de referência com o mesmo número de contíguas após as duas sequências estarem perfeitamente alinhadas.

[00177] O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido usando o programa Megalign no pacote Lasergene de sof- tware de bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, WI), usando parâ- metros padrão. Esse programa incorpora vários esquemas de alinha- mento descritos nas seguintes referências: Dayhoff, MO, 1978, A mo- del of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Em Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, páginas 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes páginas 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. e Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, EW. e Muller W., 1988,

CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. e Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Nu- merical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. e Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

[00178] Geralmente, a "porcentagem de identidade de sequência" é determinada pela comparação de duas sequências idealmente alinha- das em uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a porção da sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na jane- la de comparação pode compreender adições ou deleções (ou seja, lacunas) de 20% ou menos, geralmente de 5 a 15% ou 10 a 12%, em comparação com as sequências de referência (que não incluem adi- ções ou exclusões) para o alinhamento ideal das duas sequências. À porcentagem é calculada determinando o número de posições nas quais as bases de ácido nucleico idênticas ou o resíduo de aminoácido ocorrem em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na sequência de referência (ou seja, o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para gerar a porcentagem de identidade da sequência.

[00179] As variantes podem também, ou alternativamente, ser substancialmente homólogas a um gene nativo, ou a uma porção ou complemento do mesmo. Tais variantes de polinucleotídeos são capa- zes de hibridar sob condições moderadamente rigorosas com uma se- quência de DNA que ocorre naturalmente que codifica um anticorpo nativo (ou uma sequência complementar).

[00180] "Condições moderadamente rigorosas" adequadas incluem pré-lavagem em uma solução de 5X SSC, SDS a 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridação a 50 ºC a 65 ºC, 5X SSC, durante a noite; seguido de lavagem duas vezes a 65 ºC por 20 minutos com 2X, 0,5X e 0,2X

SSC contendo SDS a 0,1%.

[00181] Como utilizado neste documento, "condições altamente rigorosas" ou "condições de alto rigor" são aquelas que: (1) empregam baixa força iônica e alta temperatura para lavagem, por exemplo, clo- reto de sódio 0,015 M/citrato 0,0015 M/citrato de sódio 0,0015 M/dodecilssulfato 0,1% a 50; (2) empregam durante a hibridação um agente desnaturante, como formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) com albumina sérica bovina a 0,1%/Ficoll 0,1%/Ficoll/polivi- nilpirrolidona a 0,1%/tampão fosfato de sódio 50 mM a pH 6,5 com clo- reto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42 ºC; ou (3) empre- gam formamida a 50%, 5X SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, 5X so- lução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), SDS a 0,1% e sulfato de dextrano a 10% a 42 ºC, com lavagens a 42 ºC em 0,2X SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida a 50% a 55 ºC, seguido por uma lavagem altamente rigorosa consistindo em 0,1X SSC contendo EDTA a 55 “ºC. O elemento versado na técnica reconhecerá como ajustar a temperatura, força iônica etc., conforme necessário, para acomodar fatores como comprimento da sonda e si- milares.

[00182] Será apreciado por aqueles versados na técnica que, como resultado da degenerescência do código genético, existem muitas se- quências nucleotídicas que codificam um polipeptídeo como descrito neste documento. Alguns destes polinucleótidos apresentam homolo- gia mínima com a sequência nucleotídica de qualquer gene nativo. No entanto, polinucleotídeos que variam devido a diferenças no uso de códons são contemplados especificamente pela invenção. Além disso, os alelos dos genes que compreendem as sequências polinucleotídi- cas fornecidas neste documento estão dentro do escopo da invenção. Os alelos são genes endógenos que são alterados como resultado de uma ou mais mutações, como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA e a proteína resultantes podem, mas não pre- cisam, ter uma estrutura ou função alterada. Os alelos podem ser iden- tificados usando técnicas padrão (como hibridação, amplificação e/ou comparação de sequência de banco de dados).

[00183] Os polinucleotídeos desta invenção podem ser obtidos usando síntese química, métodos recombinantes ou PCR. Os métodos de síntese química de polinucleotídeos são bem conhecidos na técnica e não precisam ser descritos em detalhes neste documento. Um espe- cialista na técnica pode usar as sequências fornecidas neste docu- mento e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma sequên- cia de DNA desejada.

[00184] Para preparar polinucleotídeos usando métodos recombi- nantes, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência desejada pode ser inserido em um vetor adequado, e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação, como discutido mais adiante neste documento. Os poli- nucleotídeos podem ser inseridos nas células hospedeiras por qual- quer meio conhecido na técnica. As células são transformadas através da introdução de um polinucleotídeo exógeno por captação direta, en- docitose, transfecção, acasalamento de F ou eletroporação. Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da cé- lula como um vetor não integrado (como um plasmídeo) ou integrado ao genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo assim amplificado pode ser isolado da célula hospedeira por métodos bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989.

[00185] —Alternativamente, a PCR permite a reprodução de sequên- cias de DNA. A tecnologia de PCR é bem conhecida na técnica e é descrita nas Patentes nºº US 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e

4.683.202, bem como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

[00186] O RNA pode ser obtido usando o DNA isolado em um vetor apropriado e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quan- do a célula se replica e o DNA é transcrito no RNA, o RNA pode então ser isolado usando métodos bem conhecidos dos elementos versados na técnica, como estabelecido em Sambrook et al., 1989, supra, por exemplo.

[00187] Os vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão ou podem ser selecionados a partir de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira a ser usada, os vetores de clonagem úteis geral- mente têm a capacidade de se autorreplicar, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição específica e/ou podem transportar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones contendo o vetor. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK*) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, poCR1, RP4, DNAs fágicos e vetores bifuncionais, como pSA3 e pAT28. Esses e muitos outros vetores de clonagem estão disponíveis em fornecedores comerciais, como BioRad, Strategene e Invitrogen.

[00188] Os vetores de expressão são geralmente construtos polinu- cleotídicos replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Está implícito que um vetor de expressão deve ser replicá- vel nas células hospedeiras como epissomas ou como parte integrante do DNA cromossômico. Os vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a plasmídeos, vetores virais, incluindo adeno- vírus, vírus adeno-associados, retrovírus, cosmídeos e vetor (ou veto- res) de expressão descritos na publicação PCT nº WO 87/04462. Os componentes do vetor geralmente podem incluir, mas não estão limi-

tados a um ou mais dos seguintes itens: uma sequência de sinal; uma origem de replicação; um ou mais genes marcadores; elementos de controle transcricionais adequados (como promotores, intensificadores e terminador). Para expressão (isto é, tradução), um ou mais elemen- tos de controle de tradução também são geralmente necessários, co- mo locais de ligação ao ribossomo, locais de iniciação da tradução e códons de parada.

[00189] Os vetores contendo os polinucleotídeos de interesse po- dem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer um de vários meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano ou outras substâncias; bombardeio de microprojetos; lipofecção; e in- fecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso como o ví- rus vaccinia). A escolha de introduzir vetores ou polinucleotídeos de- penderá frequentemente das características da célula hospedeira.

[00190] Um polinucleotídeo que codifica um CAR específico de FLT3 descrito neste documento pode existir em um cassete de ex- pressão ou vetor de expressão (por exemplo, um plasmídeo para in- trodução em uma célula hospedeira bacteriana ou um vetor viral, como um vetor de baculovírus, para transfecção de uma célula hospedeira de inseto ou um plasmídeo ou vetor viral, como um lentivírus para transfecção de uma célula hospedeira de mamífero). Em algumas mo- dalidades, um polinucleotídeo ou vetor pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica sequências de pulo ribossômico, como, por exemplo, sem limitação, uma sequência que codifica um peptídeo 2A. Os peptídeos 2A, que foram identificados no subgrupo Aphthovirus de picornavírus, causam um "salto" ribossômico de um códon para ou- tro sem a formação de uma ligação peptídica entre os dois aminoáci- dos codificados pelos códons (ver Donnelly e Elliott 2001; Atkins Wills et al.2007; Doronina, Wu et al. 2008)). Por "códon" entende-se três nucleotídeos em um mRNA (ou na cadeia de sentido de uma molécula de DNA) que são traduzidos por um ribossomo em um resíduo de aminoácido. Assim, dois polipeptídeos podem ser sintetizados a partir de uma única estrutura de leitura aberta contígua dentro de um mMRNA quando os polipeptídeos são separados por uma sequência de oli- gopeptídeos 2A que está na estrutura. Tais mecanismos ribossômicos de salto são bem conhecidos na técnica e são conhecidos por serem usados por vários vetores para a expressão de várias proteínas codifi- cadas por um único RNA mensageiro.

[00191] Para direcionar polipeptídeos transmembranares para a via secretora de uma célula hospedeira, em algumas modalidades, uma sequência de sinal secretora (também conhecida como sequência lí- der, sequência prepro ou pré-sequência) é fornecida em uma sequên- cia polinucleotídica ou sequência vetorial. A sequência de sinal secre- tora está operacionalmente ligada à sequência de ácidos nucleicos transmembranar, isto é, as duas sequências são unidas na estrutura de leitura correta e posicionadas para direcionar o polipeptídeo recém- sintetizado para a via secretora da célula hospedeira. Sequências de sinal secretoras são comumente posicionadas em 5' para a sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo de interesse, embora certas sequências de sinal secretoras possam ser posicionadas em outro lugar na sequência de ácidos nucleicos de interesse (ver, por exemplo, Welch et al., Patente nº US 5.037.743; Holland et al., Patente nº US 5.143.830). Em algumas modalidades, o peptídeo sinal compre- ende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 204 ou

215. Os elementos versados na técnica reconhecerão que, tendo em vista a degenerescência do código genético, é possível uma variação considerável da sequência entre essas moléculas polinucleotídicas. Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucleicos da in- venção são otimizadas por códon para expressão em células de ma-

míferos, por exemplo, para expressão em células de primatas (por exemplo, humanos ou macacos). A otimização de códons refere-se à troca em uma sequência de interesse de códons que geralmente são raros em genes altamente expressos de uma determinada espécie por códons que geralmente são frequentes em genes altamente expressos de tais espécies, tais códons que codificam os aminoácidos como os códons que estão sendo trocados. Métodos de Engenharia de uma Célula Imunológica

[00192] Os métodos de preparação de células imunológicas para uso em imunoterapia são fornecidos neste documento. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a obtenção de células imuno- lógicas, a introdução de um CAR de acordo com a invenção nas células imunológicas e a expansão das células. Em algumas modalidades, a in- venção refere-se a um método de engenharia de uma célula imunológica compreendendo: fornecer uma célula e expressar na superfície da célula pelo menos um CAR como descrito acima. Os métodos para engenharia de células imunológicas são descritos, por exemplo, nas Publicações de Pedido de Patente PCT WO/2014/039523, WO/2014/184741, WO/2014/ 191128, WO/2014/184744 e WO/2014/184143, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, o método compreende: transfectar a célula com pelo menos um polinucleotídeo que codifica o CAR, conforme descrito acima, e expressar os polinucleotídeos na célula.

[00193] Antes da engenharia das células, uma fonte de células po- de ser obtida de um indivíduo através de uma variedade de métodos não limitativos. As células podem ser obtidas de várias fontes não limi- tativas, incluindo células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido linfonodal, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascites, derrame pleural, tecido do ba- ço e tumores. Em algumas modalidades, pode ser utilizado qualquer número de linhas de células T disponíveis e conhecidas dos elementos versados na técnica. Em algumas modalidades, as células podem ser derivadas de um doador saudável ou de um doador que sofre de uma doença ou distúrbio, por exemplo, um indivíduo diagnosticado com câncer ou de um indivíduo diagnosticado com uma infecção. Em al- gumas modalidades, as células podem ser parte de uma população mista de células que apresentam características fenotípicas diferentes.

[00194] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos estão pre- sentes em vetores lentivirais para expressão estável nas células.

[00195] Em algumas modalidades, o método pode ainda compre- ender uma etapa de modificação genética de uma célula interrompen- do ou inativando pelo menos um gene que expressa, por exemplo, sem limitação, um componente do TCR, um alvo para um agente imu- nossupressor, um gene HLA e/ou uma proteína de ponto de verifica- ção imune, como, por exemplo, PDCD1 ou CTLA-4. Ao interromper ou inativar um gene, pretende-se que o gene de interesse não seja ex- presso em uma forma funcional de proteína. Em algumas modalida- des, o gene a ser interrompido ou inativado é selecionado a partir do grupo que consiste em, por exemplo, sem limitação, em TORa, TCRB, CDB52, receptor de glicocorticoide (GR), desoxicitidina quinase (DCK), PD-1 e CTLA-4. Em algumas modalidades, o método compreende a inativação de um ou mais genes, introduzindo nas células uma endo- nuclease de corte raro capaz de inativar seletivamente um gene por clivagem seletiva de DNA. Em algumas modalidades, a endonuclease de corte raro pode ser, por exemplo, uma nuclease efetora do tipo ati- vador de transcrição (nuclease TALE) ou endonuclease Cas9.

[00196] Em algumas modalidades, um domínio catalítico adicional é usado com uma endonuclease de corte raro para aumentar sua capa- cidade de inativar genes direcionados. Por exemplo, um domínio cata- lítico adicional pode ser uma enzima de processamento final de DNA.

Exemplos não limitativos de enzimas de processamento final de DNA incluem exonucleases de 5-3', exonucleases de 3-5', exonucleases alcalinas de 5-3', endonucleases de retalho de 5', helicases, fosfatase, hidrolases e polimerases de DNA independentes do modelo. Exemplos não limitativos desse domínio catalítico compreendem um domínio pro- teico ou derivado cataliticamente ativo do domínio proteico seleciona- do do grupo que consiste em hExol (EXO1 HUMAN), levedura Exol (EXO1 YEAST), E. coli Exol, TREX2 humano, TREX1 de camundon- go, TREX1 humano, TREX1 bovino, TREX1 de rato, TdT (desoxinu- cleotidil transferase terminal) DNA2 humano, DNA2 de levedura (DNA2 OEAST). Em algumas modalidades, um domínio catalítico adi- cional pode ter uma atividade de exonuclease 3'-5' e, em algumas mo- dalidades, o dito domínio catalítico adicional é TREX, por exemplo, um domínio catalítico TREX2 (WO2012/058458). Em algumas modalida- des, o dito domínio catalítico é codificado por um polipeptídeo TREX de cadeia única. O domínio catalítico adicional pode ser fundido com uma proteína de fusão de nuclease ou proteína quimérica. Em algu- mas modalidades, o domínio catalítico adicional é fundido usando, por exemplo, um ligante peptídico.

[00197] Em algumas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de introduzir nas células um ácido nucleico exógeno com- preendendo pelo menos uma sequência homóloga a uma porção da sequência de ácidos nucleicos-alvo, de modo que a recombinação homóloga ocorra entre a sequência de ácidos nucleicos-alvo e o ácido nucleico exógeno. Em algumas modalidades, o dito ácido nucleico exógeno compreende primeira e segunda porções que são homólogas à região 5' e 3' da sequência de ácidos nucleicos-alvo, respectivamen- te. O ácido nucleico exógeno também pode compreender uma terceira porção posicionada entre a primeira e a segunda porção que não compreende nenhuma homologia com as regiões 5' e 3' da sequência de ácidos nucleicos-alvo. Após a clivagem da sequência-alvo de ácido nucleico, é estimulado um evento de recombinação homóloga entre a sequência alvo de ácido nucleico e o ácido nucleico exógeno. Em al- gumas modalidades, sequências homólogas de pelo menos cerca de 50 pb, maiores que cerca de 100 pb ou maiores que cerca de 200 pb podem ser usadas dentro da matriz doadora. O ácido nucleico exóge- no pode ser, por exemplo, sem limitação, de cerca de 200 pb a cerca de 6.000 pb, por exemplo, de cerca de 1.000 pb a cerca de 2.000 pb. Homologias de ácido nucleico compartilhadas estão localizadas em regiões que flanqueiam a montante e a jusante do local da ruptura, e a sequência de ácidos nucleicos a ser introduzida está localizada entre os dois braços.

[00198] Em algumas modalidades, um ácido nucleico compreende sucessivamente uma primeira região de homologia para sequências a montante da dita clivagem; uma sequência para inativar um gene-alvo selecionado do grupo que consiste em TCRa, TORB, CD52, receptor de glicocorticoide (GR), desoxicitidina quinase (DCK) e uma proteína de ponto de verificação imune, como, por exemplo, morte programada 1 (PD-1); e uma segunda região de homologia para sequências a ju- sante da clivagem. A etapa de introdução do polinucleotídeo pode ser simultânea, antes ou depois da introdução ou expressão da endonu- clease de corte raro. Dependendo da localização da sequência-alvo de ácido nucleico em que ocorreu o evento de ruptura, esse ácido nuclei- co exógeno pode ser usado para nocautear um gene, por exemplo, quando o ácido nucleico exógeno está localizado dentro da área de leitura aberta do gene ou para introduzir novas sequências ou novos genes de interesse. As inserções de sequência usando esse ácido nu- cleico exógeno podem ser usadas para modificar um gene existente direcionado, pela correção ou substituição do gene (troca de alelos como um exemplo não limitativo) ou para regular ou diminuir a expres-

são do gene-alvo (troca de promotor como exemplo não limitativo), a correção ou substituição do gene-alvo. Em algumas modalidades, a inativação de um gene selecionado do grupo que consiste em TCRa, TCRB, CD52, GR, DCK e proteínas de ponto de verificação imune, po- de ser feita em um local genômico preciso direcionado por uma nu- clease TALE específica, em que a dita TALE específica de nuclease catalisa uma clivagem e em que o ácido nucleico exógeno compreen- de sucessivamente pelo menos uma região de homologia e uma se- quência para inativar um gene-alvo selecionado a partir do grupo que consiste em TOCRa, TORB, CD52, GR, DOCK, proteína de ponto de veri- ficação imune, que é integrada por recombinação homóloga. Em al- gumas modalidades, vários genes podem ser, sucessivamente ou ao mesmo tempo, inativados usando várias nucleases TALE, respectiva- mente, e visando especificamente um gene definido e vários polinu- cleotídeos específicos para inativação de genes específicos.

[00199] Em algumas modalidades, o método compreende a inativa- ção de um ou mais genes adicionais selecionados a partir do grupo que consiste em TOCRa, TORB, CD52, GR, DCK e proteínas de ponto de verificação imune. Em algumas modalidades, a inativação de um gene pode ser realizada introduzindo nas células pelo menos uma en- donuclease de corte raro, de modo que a endonuclease de corte raro catalise especificamente a clivagem em uma sequência direcionada do genoma celular; e opcionalmente, introduza nas células um ácido nu- cleico exógeno que compreende sucessivamente uma primeira região de homologia para sequências a montante da clivagem, uma sequên- cia a ser inserida no genoma da célula e uma segunda região de ho- mologia para sequências a jusante da clivagem; em que o ácido nu- cleico exógeno introduzido inativa um gene e integra pelo menos uma sequência polinucleotídica exógena que codifica pelo menos uma pro- teína recombinante de interesse. Em algumas modalidades, a sequên-

cia polinucleotídica exógena é integrada dentro de um gene que codifi- ca uma proteína selecionada do grupo que consiste em TCRa, TCRB, CD52, GR, DCK e proteína de ponto de verificação imune.

[00200] Em outro aspecto, uma etapa de células geneticamente modificadas pode compreender: modificar células T inativando pelo menos um gene que expressa um alvo para um agente imunossupres- sor e; expansão das células, opcionalmente na presença do agente imunossupressor. Um agente imunossupressor é um agente que su- prime a função imune por um dos vários mecanismos de ação. Um agente imunossupressor pode diminuir a extensão e/ou voracidade de uma resposta imune. Exemplos não limitativos de agentes imunossu- pressores incluem inibidores da calcineurina, alvos da rapamicina, blo- queadores da cadeia a da interleucina-2, inibidores da inosina mono- fosfato desidrogenase, inibidores da redutase do ácido di-hidrofólico, corticosteroides e antimetabólitos imunossupressores. Alguns imunos- supressores citotóxicos agem inibindo a síntese de DNA.Outros po- dem atuar através da ativação de células T ou inibindo a ativação de células auxiliares. Os métodos de acordo com a invenção permitem conferir resistência imunossupressora às células T para imunoterapia, inativando o alvo do agente imunossupressor nas células T. Como exemplos não limitativos, os alvos para o agente imunossupressor po- dem ser um receptor para um agente imunossupressor, como por exemplo, sem limitação CD52, receptor de glicocorticoide (GR), mem- bros do gene da família FKBP e membros do gene da família ciclofili- na.

[00201] Em algumas modalidades, a modificação genética do mé- todo invoca a expressão, em células fornecidas para projetar, de uma endonuclease de corte raro, de modo que a endonuclease de corte raro catalise especificamente a clivagem em um gene-alvo, inativando assim o gene-alvo. Em algumas modalidades, um método de enge-

nharia de células compreende pelo menos uma das seguintes etapas: fornecer uma célula T, como de uma cultura celular ou de uma amos- tra de sangue; selecionar um gene na célula T que expressa um alvo para um agente imunossupressor; introduzir na célula T uma endonu- clease de corte raro capaz de inativar seletivamente por clivagem de DNA, por exemplo, quebrar com fita dupla o gene que codifica um alvo para o agente imunossupressor e expandir as células, opcionalmente na presença do agente imunossupressor.

[00202] Em algumas modalidades, o método compreende: fornecer uma célula T, tal como de uma cultura celular ou de uma amostra de sangue; selecionar um gene na célula T em que o gene expressa um alvo para um agente imunossupressor; transfectar a célula T com áci- do nucleico que codifica uma endonuclease de corte raro capaz de inativar seletivamente por clivagem de DNA, por exemplo, quebrar com fita dupla o gene que codifica um alvo para o agente imunossu- pressor e expressar as endonucleases de corte raro nas células T; e expansão das células, opcionalmente na presença do agente imunos- supressor.

[00203] Em algumas modalidades, a endonuclease de corte raro visa especificamente CD52 ou GR. Em algumas modalidades, o gene selecionado para inativação codifica CD52, e o tratamento imunossu- pressor compreende um anticorpo humanizado direcionado ao antíge- no CD52.Em algumas modalidades, o gene selecionado para inativa- ção codifica GR, e o tratamento imunossupressor compreende um cor- ticosteroide como a dexametasona. Em algumas modalidades, o gene selecionado para inativação é um membro do gene da família FKBP ou uma variante do mesmo e o tratamento imunossupressor compre- ende FK506, também conhecido como Tacrolimus ou fujimicina. Em algumas modalidades, o membro do gene da família FKBP é FKBP12 ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o gene seleci-

onado para inativação é um membro do gene da família ciclofilina ou uma variante do mesmo e o tratamento imunossupressor compreende ciclosporina.

[00204] Em algumas modalidades, a endonuclease de corte raro pode ser, por exemplo, uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco ou uma nuclease TALE (TALEN). Em algumas modalidades, a endonuclease de corte raro é uma nuclease TALE.

[00205] “Também são fornecidos no presente documento métodos de engenharia de células T, adequados para imunoterapia, em que os métodos compreendem: modificação genética de células T por inativa- ção de pelo menos a proteína do ponto de verificação imune. Em al- gumas modalidades, a proteína do ponto de verificação imune é, por exemplo, PD-1 e/ou CTLA-4. Em algumas modalidades, os métodos de modificação genética de uma célula compreendem: modificação de células T desativando pelo menos uma proteína de ponto de verifica- ção imune; e expandindo as células. As proteínas do ponto de verifica- ção imune incluem, mas não estão limitadas a, morte programada 1 (PD-1, também conhecida como PDCD1 ou CD279, número de aces- so: NM - 005018), antígeno citotóxico de linfócitos T citotóxicos 4 (CTLA-A4, também conhecido como CD152, GenBank número de aces- so AF414120.1), LAG3 (também conhecido como CD223, número de acesso: NM-002286.5), Tim3 (também conhecido como HAVCR2, nú- mero de acesso do GenBank: JX049979.1), BTLA (também conhecido como CD272, número de acesso: NM-181780.3), BY55 (também conhe- cido como CD160, número de acesso ao GenBank: CR541888.1), TIGIT (também conhecido como VSTM3, número de acesso: NM-173799), B7H5 (também conhecido como C100orf54, homólogo do gene da vista do camundongo, número de acesso: NM-022153.1), LAIR1 (também co- nhecido como CD305, número de acesso ao GenBank: CR542051.1), SIGLEC10 (número de acesso ao GeneBank: AY358337.1), 2B4 (tam-

bém conhecido como CD244, número de acesso: NM-001166664.1), que inibem diretamente células imunológicas. Por exemplo, CTLA-4 é uma proteína da superfície celular expressa em certas células T CD4 e CD8; quando ativados por seus ligantes (B7-1 e B7-2) nas células apresentadoras de antígenos, a ativação das células T e a função efe- tora são inibidas.

[00206] Em algumas modalidades, o dito método para projetar célu- las compreende pelo menos uma das seguintes etapas: fornecer uma célula T, como de uma cultura celular ou de uma amostra de sangue; introduzir na célula T uma endonuclease de corte raro capaz de inati- var seletivamente por clivagem de DNA, por exemplo, por quebra de fita dupla de um gene que codifica uma proteína de ponto de verifica- ção imune; e expandindo as células. Em algumas modalidades, o mé- todo compreende: fornecer uma célula T, tal como de uma cultura ce- lular ou de uma amostra de sangue; transfectar a dita célula T com ácido nucleico que codifica uma endonuclease de corte raro capaz de inativar seletivamente por clivagem de DNA, por exemplo, por quebra de fita dupla de um gene que codifica uma proteína de ponto de verifi- cação imune; expressar as endonucleases de corte raro nas células T; expandindo as células. Em algumas modalidades, a endonuclease de corte raro visa especificamente um gene selecionado a partir do grupo que consiste em: PD-1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCRa e TORB. Em algumas modalida- des, a endonuclease de corte raro pode ser uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco digital ou uma nuclease TALE.Em algumas modalidades, a endonuclease de corte raro é uma nuclease TALE.

[00207] Em algumas modalidades, a presente invenção pode ser particularmente adequada para imunoterapia alogênica. Em tais moda- lidades, as células podem ser modificadas por um método que com- preende: inativar pelo menos um gene que codifica um componente do receptor de células T (TOR) nas células T; e expandindo as células T. Em algumas modalidades, a modificação genética do método baseia- se na expressão, em células fornecidas para projetar, de uma endonu- clease de corte raro, de modo que a endonuclease de corte raro cata- lise especificamente a clivagem em um gene-alvo, inativando assim o gene-alvo. Em algumas modalidades, o dito método para projetar célu- las compreende pelo menos uma das seguintes etapas: fornecer uma célula T, tal como de uma cultura celular ou de uma amostra de san- gue; introduzir na célula T uma endonuclease de corte raro capaz de inativar seletivamente por clivagem de DNA, por exemplo, por quebra de fita dupla pelo menos um gene que codifica um componente do re- ceptor de célula T (TOR) e expansão das células.

[00208] Em algumas modalidades, o método compreende: fornecer uma célula T, tal como de uma cultura celular ou de uma amostra de sangue; transfectar a dita célula T com ácido nucleico que codifica uma endonuclease de corte raro capaz de inativar seletivamente por clivagem de DNA, por exemplo, por quebra de fita dupla pelo menos um gene que codifica um componente do receptor de célula T (TCR); expressar as endonucleases de corte raro nas células T; classificando as células T transformadas, que não expressam TCR em sua superfí- cie celular; e expandindo as células.

[00209] Em algumas modalidades, a endonuclease de corte raro pode ser uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco ou uma nuclease TALE. Em algumas modalidades, a endonuclease de corte raro é uma nuclease TALE. Em algumas modalidades, as nucleases TALE reconhecem e clivam uma sequência que codifica TORa ou TCRB. Em algumas modalidades, uma nuclease TALE compreende uma sequência polipeptídica selecionada a partir da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 ou 226.

Sequências de polipeptídeos TALE-nuclease: Repetir TRAC TO01-L LTPQQVVAIlASNGGGKQALETVQORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNN GGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETVQRL

LPVLCQOAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPE QVVAIlASHDGGKQALETVQORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQ

ALETVOQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQ AHGLTPEQVVAIlASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIA

SNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQ

RLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTP QQVVAIlASNGGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGK QALETVOQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETVQRLLPVL

CQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPQQVV AIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 219). Repetir TRAC TO1-R LTPEQVVAIlASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNG

GGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLL

PVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQ VVAIASNNGGKQALETVOQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQA LETVORLLPVLCQOAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETVORLLPVLCQ

AHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIA SNNGGKQALETVOQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETV

QRLLPVLCQAAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLT PEQVVAIlASHDGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGG KQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQALETVORLLPV LCQAQAHGLTPQQVVAIlASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQV VAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 220). Repetir TRBC TO01-L LTPQQVVAIlASNNGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNG GGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNNGGKQALETVQRLL

PVLCQAQAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQ QVVAIlASNGGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNGGGK QALETVORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNNGGKQALETVQRLLPVL

CQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAI ASNNGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQALET VORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQALETVQORLLPVLCQAHG

LTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGG GKQALETVOQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQALETVOQRLLP

VLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQV VAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 221).

Repetir TRBC TO1-R NPQRSTVWYLTPQQVVAIlASNNGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTP QQVVAIlASNGGGKQALETVOQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGG

KQALETVORLLPVLCQAQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPV LCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVV AIlASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALE

TVORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVORLLPVLCQAH GLTPQQVVAIlASNGGGKQALETVORLLPVLCQAQAHGLTPQQVVAIASN GGGKQALETVORLLPVLCQAAHGLTPQQVVAIlASNNGGKQALETVOR

LLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVOQRLLPVLCQAHGLTP QQVVAIlASNNGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGG

KQALETVORLLPVLCQAQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPV LCQAAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 222). Repetir TRBC T02-L LTPEQVVAIlASHDGGKQALETVOQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHD GGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQALETVQRLL

PVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQ VVAIlASHDGGKQALETVOQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQA

LETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVOQRLLPVLCQ AHGLTPQQVVAIlASNNGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIA

SNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQ RLLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLT PQQVVAIlASNGGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGG

KQALETVORLLPVLCQAQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPV LCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQALETVOQRLLPVLCQAHGLTPQQV VAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 223).

Repetir TRBC T02-R LTPQQVVAIlASNNGGKQALETVQORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNN

GGKQALETVORLLPVLCQAQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLL

PVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQ VVAIlASNNGGKQALETVOQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQAL ETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETVOQRLLPVLCQA HGLTPEQVVAIlASHDGGKQALETVOQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIAS NGGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQALETVQ RLLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLT PQQVVAIlASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGG KQALETVORLLPVLCQAQAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETVQRLLPV LCQAAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETVOQRLLPVLCQAHGLTPQQV VAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 224). Repetir CD52 T02-L LTPQQVVAIlASNGGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHD GGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQALETVQRLL PVLCQAQAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPE QVVAIlASHDGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQ ALETVORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETVORLLPVLC

QAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIA SHDGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETV

QRLLPVLCAQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGL

TPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGG KQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQALETVQRLLPV

LCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVV AIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 225).

Repetir CD52 T02-R LTPQQVVAIlASNGGGKQALETVQORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNN

GGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLL

PVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPE QVVAIASHDGGKQALETVQORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIlASNGGGK

QALETVORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVORLLPVL

CQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAI ASHDGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIlASHDGGKQALET VORLLPVLCQAAHGLTPQQVVAIlASNGGGKQALETVORLLPVLCQAH GLTPQQVVAIlASNNGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASN

GGGKQALETVORLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQAL

LPVLCQOAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQ QVVAIASNGGGRPALE (SEQ ID NO: 226).

[00210] Em outro aspecto, uma outra etapa da célula geneticamen- te modificada pode ser um método de expansão de células T deficien- tes em TOCRa, que compreende a introdução na célula T pTa (também conhecida como preTCRa) ou uma variante funcional da mesma e ex- pansão das células, opcionalmente através da estimulação do Com- plexo CD3. Em algumas modalidades, o método compreende: a) trans- fecção das células com ácido nucleico que codifica pelo menos um fragmento de pTa para suportar a expressão da superfície do CD3; b) expressar o dito pTa nas células; e c) expansão das células, opcio- nalmente através da estimulação do complexo CD3.

[00211] "Também são fornecidos métodos de preparação de células T para imunoterapia, compreendendo etapas do método de expansão para células T. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica pTa pode ser introduzida aleatoriamente ou por recombinação homó- loga. Em algumas modalidades, a inserção pode ser associada à inati-

vação do gene TCRa.

[00212] Diferentes variantes funcionais de pTa podem ser usadas. Uma "variante funcional" do peptídeo refere-se a uma molécula subs- tancialmente semelhante ao peptídeo inteiro ou a um fragmento do mesmo. Um "fragmento" do pTa ou sua variante funcional refere-se a qualquer subconjunto da molécula, ou seja, um peptídeo mais curto que o pTa de comprimento total. Em algumas modalidades, pTa ou variantes funcionais podem ser, por exemplo, pTa de comprimento to- tal ou uma versão de pTa truncada no terminal C. O pTa truncado no terminal C não possui na extremidade do terminal C um ou mais resí- duos. Como exemplos não limitativos, a versão pTa truncada no termi- nal C carece de 18, 48, 62, 78, 92, 110 ou 114 resíduos do terminal C da proteína. Uma variante de sequência de aminoácido do peptídeo pode ser preparada por mutações no DNA que codifica o peptídeo. Tais variantes funcionais incluem, por exemplo, deleções ou inserções ou substituições de resíduos na sequência de aminoácidos. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição também pode ser feita para chegar à construção final, desde que o construto final possua a atividade desejada, em particular a restauração de um complexo CD3 funcional. Em uma modalidade exemplificadora, pelo menos uma mu- tação é introduzida nas diferentes versões de pTa como descrito aci- ma para afetar a dimerização. Como exemplo não limitativo, o resíduo mutado pode ser pelo menos W46R, D22A, K24A, R102A ou R117A da proteína pTa humana ou posições alinhadas usando o método CLUSTALW na família pTa ou membro do homólogo. Por exemplo, pTa ou variante do mesmo como descrito acima compreendem o resí- duo mutado WA46R ou os resíduos mutados D22A, K24A, R102A e R117A. Em algumas modalidades, o dito pTa ou variantes também são fundidos com um domínio transdutor de sinal, como CD28, OX40, ICOS, CD27, CD13 7 (4-1BB) e CD8 como exemplos não limitativos. O domínio extracelular de pTa ou variantes como descrito acima pode ser fundido com um fragmento da proteína TOCRa, particularmente o domínio transmembranar e intracelular de TORa. As variantes de pTa também podem ser fundidas ao domínio intracelular de TORA.

[00213] Em algumas modalidades, as versões de pTa podem ser fundidas com um domínio de ligação ao ligante extracelular. Em algu- mas modalidades, pTa ou sua variante funcional é fundida a um frag- mento de anticorpo de cadeia única (scFv) compreendendo o fragmen- to variável leve e pesado de um anticorpo monoclonal específico do antígeno-alvo unido por um ligante flexível.

[00214] O termo "célula T deficiente em TORa" refere-se a uma cé- lula T isolada que não possui expressão de uma cadeia TCRa funcio- nal. Isso pode ser realizado por diferentes meios, como exemplos não limitativos, projetando uma célula T de modo que não expresse ne- nhum TCRa funcional em sua superfície celular ou projetando uma cé- lula T de modo que produza muito pouca cadeia funcional de TORa em sua superfície ou por engenharia de uma célula T para expressar a forma mutada ou truncada da cadeia TORa. As células deficientes em TCRa não podem mais ser expandidas através do complexo CD3. As- sim, para superar esse problema e permitir a proliferação de células deficientes em TOCRa, pTa ou sua variante funcional é introduzida nas células, restaurando assim um complexo CD3 funcional. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a introdução nas ditas en- donucleases de corte raro de células T capazes de inativar seletiva- mente por clivagem de DNA um gene que codifica um componente do receptor de célula T (TCR). Em algumas modalidades, a endonuclease de corte raro é uma nuclease TALE.

[00215] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codifi- cam polipeptídeos de acordo com a presente invenção podem ser MRNAs que são introduzidos diretamente nas células, por exemplo,

por eletroporação. Em algumas modalidades, a tecnologia cytoPulse pode ser usada para permeabilizar transitoriamente células vivas para entrega de material nas células. Os parâmetros podem ser modifica- dos para determinar condições de alta eficiência de transfecção com mortalidade mínima.

[00216] Também são fornecidos no presente documento métodos de transfecção de células T. Em algumas modalidades, o método compreende: contatar uma célula T com RNA e aplicar à célula T uma sequência de pulso ágil que consiste em: (a) um pulso elétrico com uma faixa de tensão de cerca de 2.250 a 3.000 V por centímetro; (b) uma largura de pulso de 0,1 ms; (c) um intervalo de pulso de cerca de 0,2 a 10 ms entre os pulsos elétricos da etapa (a) e (b); (d) um pulso elétrico com uma faixa de tensão de cerca de 2.250 a 3.000 V com uma largura de pulso de cerca de 100 ms e um intervalo de pulso de cerca de 100 ms entre o pulso elétrico da etapa (b) e o primeiro pulso elétrico da etapa (c ); e (e) quatro pulsos elétricos com uma tensão de cerca de 325 V com uma largura de pulso de cerca de 0,2 ms e um intervalo de pulso de 2 ms entre cada um dos 4 pulsos elétricos. Em algumas modalidades, um método de transfectar célula T compreen- dendo o contato da dita célula T com RNA e aplicando à célula T uma sequência de pulso ágil compreendendo: (a) um pulso elétrico com uma voltagem de cerca de 2.250, 2.300, 2.350, 2.400, 2.450, 2.500,

2.550, 2.400, 2.450, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900 ou 3.000 V por centímetro; (b) uma largura de pulso de 0,1 ms; (c) e um intervalo de pulso de cerca de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ms entre os pulsos elétricos da etapa (a) e (b); (d) um pulso elétrico com uma faixa de tensão de cerca de 2.250, de 2.250, 2.300, 2.350, 2.400, 2.450,

2.500, 2.400, 2.450, 2.500, 2.600, 2.700, 2.800, 2.900 ou 3.000 V com uma largura de pulso de 100 ms e um intervalo de pulso de 100 ms entre o pulso elétrico da etapa (b) e o primeiro pulso elétrico da etapa

(c); e (e) 4 pulsos elétricos com uma tensão de cerca de 325 V com uma largura de pulso de cerca de 0,2 ms e um intervalo de pulso de cerca de 2 ms entre cada um dos 4 pulsos elétricos.Quaisquer valores incluídos na faixa de valores descritos acima são descritos no presente pedido. O meio de eletroporação pode ser qualquer meio adequado conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o meio de eletropo- ração tem condutividade em uma faixa que varia de 0,01 a 1,0 miliSi- emens.

[00217] Em algumas modalidades, como exemplos não limitativos, um RNA codifica uma endonuclase de corte raro, um monômero da endonuclease de corte raro, como meia TALE-nuclease, um CAR, pelo menos um componente do receptor de antígeno quimérico de várias cadeias, uma pTa ou sua variante funcional, um ácido nucleico exóge- no e/ou um domínio catalítico adicional. Células imunológicas projetadas

[00218] A invenção também fornece células imunológicas projeta- das compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos CAR descritos neste documento. Em algumas modalidades, um CAR pode ser intro- duzido em uma célula imunológica como um transgene através de um vetor plasmídico. Em algumas modalidades, o vetor plasmídeo tam- bém pode conter, por exemplo, um marcador de seleção que fornece identificação e/ou seleção de células que receberam o vetor.

[00219] Os polipeptídeos CAR podem ser sintetizados in situ na cé- lula após a introdução de polinucleotídeos que codificam os polipeptí- deos CAR na célula. Alternativamente, os polipeptídeos CAR podem ser produzidos fora das células e depois introduzidos nas células. Os métodos para introduzir um construto polinucleotídica nas células são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, métodos de trans- formação estáveis podem ser usados para integrar o construto de poli- nucleotídeo no genoma da célula. Em outras modalidades, métodos de transformação transitórios podem ser utilizados para expressar transi- toriamente o construto polinucleotídica e o construto polinucleotídica não integrada no genoma da célula. Em outras modalidades, métodos mediados por vírus podem ser usados. Os polinucleotídeos podem ser introduzidos na célula por qualquer meio adequado, como por exem- plo, vetores virais recombinantes (por exemplo, retrovírus, adenoví- rus), lipossomas e similares. Os métodos de transformação transitória incluem, por exemplo, sem limitação, microinjeção, eletroporação ou bombardeio de artigos. Os polinucleotídeos podem ser incluídos em vetores, como por exemplo vetores plasmídicos ou vetores virais.

[00220] Também são fornecidas neste documento células isoladas e linhas celulares obtidas pelos métodos acima descritos de engenha- ria de células fornecidos no presente documento. Em algumas modali- dades, uma célula isolada compreende pelo menos um CAR como descrito acima. Em algumas modalidades, uma célula isolada compre- ende uma população de CARs, cada CAR compreendendo diferentes domínios de ligação ao ligante extracelular.

[00221] “Também são fornecidas neste documento células imunoló- gicas isoladas obtidas de acordo com qualquer um dos métodos des- critos acima. Qualquer célula imunológica capaz de expressar DNAs heterólogos pode ser usada com a finalidade de expressar o CAR de interesse. Em algumas modalidades, a célula imunológica usada para expressar qualquer um dos CARs descritos neste documento é uma célula T. Em algumas modalidades, uma célula imunológica usada pa- ra expressar CARs pode ser derivada, por exemplo, sem limitação, de uma célula-tronco. As células-tronco podem ser células-tronco adultas, células-tronco embrionárias não humanas, mais particularmente célu- las-tronco não-humanas, células-tronco do cordão umbilical, células progenitoras, células-tronco da medula óssea, células-tronco pluripo- tentes induzidas, células-tronco totipotentes ou células-tronco hemato-

poiéticas . As células-tronco humanas representativas são células CD34*.

[00222] Em algumas modalidades, as células imunológicas projeta- das que expressam em sua membrana da superfície celular um CAR específico de FLT3 da invenção compreendem uma porcentagem de memória de células-tronco e células de memória central superior a 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 60%. Em algumas modalidades, as cé- lulas imunológicas projetadas que expressam em sua membrana da superfície celular um CAR específico de FLT3 da invenção compreen- dem uma porcentagem de memória de células-tronco e células de memória central de cerca de 10% a cerca de 60%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 10% a cerca de 40%, cerca de 15% a cerca de 50%, cerca de 15% a cerca de 40%, cerca de 20% a cerca de 60% Ou cerca de 20% a cerca de 70%.

[00223] Em algumas modalidades, a porcentagem de memória de células-tronco e células de memória central é medida como descrito no Exemplo 2d.

[00224] A célula imunológica usada para expressar qualquer um dos CARs descritos neste documento também pode ser uma célula dendrítica, célula dendrítica assassina, mastócito, célula NK, célula B ou célula T selecionada do grupo que consiste em T-linfócitos inflama- tórios, T- linfócitos citotóxicos, T-linfócitos regulatórios ou T-linfócitos auxiliares. Em algumas modalidades, a célula pode ser derivada do grupo que consiste em linfócitos T-linfócitos CD4* e T-linfócitos CD8*.

[00225] Em uma modalidade, a célula imunológica é um linfócito T inflamatório que expressa qualquer um dos CARs descritos neste do- cumento. Em uma modalidade, a célula imunológica é um T-linfócito citotóxico que expressa qualquer um dos CARs descritos neste do- cumento. Em uma modalidade, a célula imunológica é um T-linfócito regulador que expressa qualquer um dos CARs descritos neste do-

cumento. Em uma modalidade, a célula imunológica é um T-linfócito auxiliar que expressa qualquer um dos CARs descritos neste docu- mento.

[00226] Também são fornecidas neste documento linhas celulares obtidas a partir de uma célula T transformada de acordo com qualquer um dos métodos descritos acima. Também são fornecidas neste do- cumento células modificadas resistentes a um tratamento imunossu- pressor. Em algumas modalidades, uma célula isolada de acordo com a invenção compreende um polinucleotídeo que codifica um CAR.

[00227] As células imunológicas da invenção podem ser ativadas e expandidas, antes ou depois da modificação genética das células T, usando métodos como geralmente descritos, por exemplo, sem limita- ção, nas Patentes US 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964;

5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869;

7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; e Publicação do Pedido de Patente nº US 20060121005. As células T podem ser expandidas in vitro ou in vivo. Geralmente, as células T da invenção podem ser expandidas, por exemplo, por contato com um agente que estimula um complexo de TCR de CD3 e uma molécula coestimuladora sobre a superfície das células T para criar um sinal de ativação para as células T. Por exemplo, produtos químicos como io- nóforo de cálcio A23187, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) ou lecti- nas mitogênicas como fito-hemaglutinina (PHA) podem ser usados pa- ra criar um sinal de ativação para as células T.

[00228] Em algumas modalidades, as populações de células T po- dem ser estimuladas in vitro por contato com, por exemplo, um anti- corpo anti-CD3, ou um fragmento de ligação a antígeno, ou um anti- corpo anti-CD2 imobilizado em uma superfície, ou por contato com um ativador da proteína quinase C (por exemplo, briostatina) em conjunto com um ionóforo de cálcio. Para a coestimulação de uma molécula acessória na superfície das células T, é usado um ligante que se liga à molécula acessória. Por exemplo, uma população de células T pode ser contatada com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, sob condições apropriadas para estimular a proliferação das células T. As condições apropriadas para a cultura de células T incluem um meio apropriado (por exemplo, meio essencial mínimo ou meio RPMI 1640 ou, X-vivo 5, (Lonza)) que pode conter fatores necessários para a pro- liferação e viabilidade, incluindo soro (por exemplo, soro bovino fetal ou humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-y, IL-4, I1L-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFp e TNF ou quaisquer outros aditivos para o crescimento de células conhecidas do elemento versado na técnica. Outros aditivos para o crescimento das células incluem, mas não se limitam a, tensoativo, plasmanato e agentes redutores, como N- acetilcisteína e 2-mercaptoetano. O meio pode incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 e X-Vivo 20, Optimizer, com aminoácidos adicionados, piruvato de sódio e vitaminas, livres de soro ou suplementado com uma quantidade apropriada de soro (ou plasma) ou um conjunto definido de hormônios e/ou uma quantidade de citocina (ou citocinas) suficiente para o crescimento e expansão das células T. Os antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomici- na, são incluídos apenas em culturas experimentais, não em culturas de células que devem ser infundidas em um indivíduo. As células-alvo são mantidas sob condições necessárias para suportar o crescimento, por exemplo, uma temperatura apropriada (por exemplo, 37 ºC) e uma atmosfera (por exemplo, ar mais 5% de CO;>). As células T que foram expostas a tempos de estimulação variados podem exibir característi- cas diferentes.

[00229] Em algumas modalidades, as células da invenção podem ser expandidas cocultivando com tecido ou células. As células também podem ser expandidas in vivo, por exemplo, no sangue do indivíduo após a administração da célula no indivíduo.

[00230] Em algumas modalidades, uma célula isolada de acordo com a presente invenção compreende um gene inativado selecionado do grupo que consiste em CD52, GR, PD-1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1I, SIGLEC10, 2B4, HLA, TCRa e TCRB e/ou expressa um CAR, um CAR de várias cadeias e/ou um transgene pTa. Em algumas modalidades, uma célula isolada compre- ende polinucleotídeos que codificam polipeptídeos compreendendo um CAR de várias cadeias. Em algumas modalidades, a célula isolada de acordo com a presente invenção compreende dois genes inativados selecionados do grupo que consiste em: CD52 e GR, CD52 e TCRa, CDR52 e TCRB, GR e TCRa, GR e TCRB, TCRa e TCRB, PD- 1 e TCRa, PD-1 e TCRB, CTLA-4 e TCRa, CTLA-4 e TCRB, LAG3 e TCRa, LAG3 e TCRB, Tim3 e TORa, Tim3 e TOCRB, BTLA e TCRa, BTLA e TCRB, BY55 e TCRa, BY55 e TCRB, TIGIT e TORa, TIGIT e TCRB, B7H5 e TOCRa, B7H5 e TORB, LAIRI e TORa, LAIR1I e TCRB, SIGLEC10 e TCRa, SIGLEC10 e TCRB, 2B4 e TCRa, 2B4 e TCRB e/ou expressam um CAR, um CAR de múltiplas cadeias e um transge- ne de pTa.

[00231] Em algumas modalidades, o TCR é tornado não funcional nas células de acordo com a invenção por inativação do gene TORa e/ou gene (ou genes) TCRB. Em algumas modalidades, é fornecido um método para obter células modificadas derivadas de um indivíduo, em que as células podem proliferar independentemente da via de sina- lização do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). As célu- las modificadas, que podem proliferar independentemente da via de sinalização do MHC, suscetíveis de serem obtidas por este método, estão incluídas no escopo da presente invenção. As células modifica- das descritas neste documento podem ser utilizadas no tratamento de indivíduos necessitados contra a rejeição do hospedeiro versus enxer-

to (HvG) e a doença do enxerto versus hospedeiro (GvHD); portanto, no escopo da presente invenção, existe um método para o tratamento de indivíduos necessitados contra a rejeição do hospedeiro versus en- xerto (HvG) e a doença do enxerto versus hospedeiro (GvVHD) com- preendendo o tratamento do indivíduo, administrando ao dito indivíduo uma quantidade eficaz de células modificadas compreendendo inati- vadas Genes TCRa e/ou TCRB.

[00232] Em algumas modalidades, as células imunológicas são pro- jetadas para serem resistentes a um ou mais medicamentos quimiote- rápicos. O fármaco de quimioterapia pode ser, por exemplo, um análo- go de nucleotídeo de purina (PNA), tornando assim a célula imunológi- ca adequada para o tratamento do câncer, combinando imunoterapia adotada e quimioterapia. Exemplos de ANP incluem, por exemplo, clo- farabina, fludarabina e citarabina, isoladamente ou em combinação. Os PNAs são metabolizados pela desoxicitidina cinase (dCK) em PNA mono, di e trifosfato. Suas formas de trifosfato competem com o ATP pela síntese de DNA, atuam como agentes pró-apoptóticos e são po- tentes inibidores da ribonucleotídeo redutase (RNR), que está envolvi- da na produção de trinucleotídeos. São fornecidas neste documento células CAR-T específicas de FLT3 compreendendo um gene dCK ina- tivado. Em algumas modalidades, as células knockout para dCK são feitas por transfecção de células T usando polinucleotídeos que codifi- cam nulcease de TAL específica direcionada contra genes dCK por, por exemplo, eletroporação de mMRNA. As células knockout CAR-T es- pecíficas de FLT3 do dCK são resistentes aos PNAs, incluindo, por exemplo, clorofarabina e/ou fludarabina, e mantêm a atividade citotóxi- ca das células T em relação às células que expressam FLT3.

[00233] Em algumas modalidades, células ou linhas de células iso- ladas da invenção podem compreender uma pTa ou uma variante fun- cional da mesma. Em algumas modalidades, uma célula ou linhagem celular isolada pode ser ainda geneticamente modificada pela inativa- ção do gene TCRa.

[00234] Em algumas modalidades, a célula CAR-T compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo suicida, como, por exem- plo, ROR8. Ver, por exemplo, WOZ2013153391A, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Nas células CAR-T compreendendo o polinucleotídeo, o polipeptídeo suicida é expresso na superfície de uma célula CAR-T. Em algumas modalidades, o poli- peptídeo suicida compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 227. CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSN- PSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGA- VHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS LVITLYCNHRNRRRVCK- CPRPVNG (22).

[00235] O polipeptídeo suicida também pode compreender um pep- tídeo sinal no terminal amino. Em algumas modalidades, o polipeptí- deo suicida compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 228. MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGT- FSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIAS- QPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLS- LVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV (SEQ ID NO: 228).

[00236] Quando o polipeptídeo suicida é expresso na superfície de uma célula CAR-T, a ligação do rituximabe aos epítopos de rituximabe do polipeptídeo causa lise da célula. Mais de uma molécula de rituxi- mab pode se ligar por polipeptídeo expresso na superfície celular. Ca- da epítopo de rituximabe do polipeptídeo pode se ligar a uma molécula separada de rituximab. A eliminação de células CAR-T específicas de FLT3 pode ocorrer in vivo, por exemplo, administrando rituximab a um indivíduo. A decisão de excluir as células transferidas pode resultar de efeitos indesejáveis detectados no indivíduo que são atribuíveis às cé- lulas transferidas, como por exemplo, quando são detectados níveis inaceitáveis de toxicidade.

[00237] Em algumas modalidades, após administração a um paci- ente, células imunológicas projetadas que expressam em sua superfí- cie celular qualquer um dos CARs específicos de FLT3 descritos nes- te documento pode reduzir, matar ou lisar células que expressam FLT3 endógenas do paciente. Em uma modalidade, uma redução per- centual ou lise de células endógenas que expressam FLT3 ou células de uma linha de células que expressam FLT3 por células imunológicas projetadas que expressam qualquer um dos CARs específicos de FLT3 descritos neste documento é pelo menos igual ou superior a 10%, 15%, 20 %, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%.Em uma modalidade, uma redu- ção percentual ou lise de células endógenas que expressam FLT3 ou células de uma linhagem celular que expressa FLT3 por células imu- nológicas projetadas que expressam qualquer um dos CARs especiífi- cos de FLT3 descritos neste documento é de cerca de 5% a cerca de 95%, cerca de 10% a cerca de 95%, cerca de 10% a cerca de 90%, cerca de 10% a cerca de 80%, cerca de 10% a cerca de 70%, cerca de 10% a cerca de 60%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 10% a cerca de 40%, cerca de 20% a cerca de 90%, cerca de 20% a cerca de 80%, cerca de 20% a cerca de 70%, cerca de 20% a cerca de 60%, cerca de 20% a cerca de 50%, cerca de 25% a cerca de 75%, ou cer- ca de 25% a cerca de 60%. Em uma modalidade, as células endóge- nas que expressam FLT3 são células endógenas que expressam FLT3 da medula óssea.

[00238] Em uma modalidade, a porcentagem de redução ou lise das células-alvo, por exemplo, uma linhagem celular que expressa FLT3, por células imunológicas projetadas que expressam em sua membrana da superfície celular um CAR específico de FLT3 da inven- ção pode ser medido usando o ensaio descrito no Exemplo 2e. Método para classificar células imunológicas positivas para CAR

[00239] Em um aspecto, são fornecidos métodos para classificação in vitro de uma população de células imunológicas, em que um sub- conjunto da população de células imunológicas compreende células imunológicas projetadas que expressam qualquer um dos CARs espe- cíficos de FLT3 compreendendo epítopos específicos para anticorpos monoclonais descritos neste documento. O método compreende o contato da população de células imunológicas com um anticorpo mo- noclonal específico para os epítopos e a seleção das células imunoló- gicas que se ligam ao anticorpo monoclonal para obter uma população de células enriquecidas em células imunológicas projetadas que ex- pressam o CAR específico de FLT3.

[00240] Em algumas modalidades, o dito anticorpo monoclonal es- pecífico para o dito epítopo é opcionalmente conjugado com um fluoró- foro. Nessa modalidade, a etapa de seleção das células que se ligam ao anticorpo monoclonal pode ser realizada por Classificação de Célu- las Ativadas por Fluorescência (FACS). Em algumas modalidades, o dito anticorpo monoclonal específico para o dito epítopo é opcional- mente conjugado com uma partícula magnética. Nessa modalidade, a etapa de seleção das células que se ligam ao anticorpo monoclonal pode ser realizada por Classificação Magnética de Células Ativadas (MACS).

[00241] Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelu- lar do CAR compreende um epítopo específico de mAb da SEQ ID NO: 262. Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular do CAR compreende um epítopo específico do mAb da SEQ ID NO: 262 e o anticorpo usado para entrar em contato com a população de células imunológicas é QBEND-10.

[00242] Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelu- lar do CAR compreende um epítopo específico do mAb da SEQ ID NO: 229. Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular do CAR compreende um epítopo específico do mAb da SEQ ID NO: 229 e o anticorpo usado para contatar a população de células imuno- lógicas é o rituximab.

[00243] Em algumas modalidades, a população de células imunoló- gicas que expressam CAR FLT3, obtida ao usar o método de classifi- cação in vitro de células imunológicas descrito acima, compreende pe- lo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 % ou 95% das células imunológicas que expressam CAR do FLT3 .Em algumas modalida- des, a população de células imunológicas que expressam CAR de FLT3 obtidas ao usar o método para classificação in vitro de células imunológicas que expressam CAR descrito acima, compreende pelo menos 85% de células imunológicas que expressam CAR de FLT3.

[00244] Em algumas modalidades, os mAbs usados no método de classificação in vitro são previamente ligados a um suporte, como uma coluna ou contas, como as realizadas rotineiramente pelos elementos versados na técnica. Em algumas modalidades, as células imunológi- cas que expressam os CAR são células T.

[00245] De acordo com a invenção, as células a serem administra- das ao receptor podem ser enriquecidas in vitro a partir da população de origem. Os métodos de expansão de populações de fontes são bem conhecidos na técnica e podem incluir a seleção de células que expressam um antígeno, como o antígeno CD34, usando combinações de centrifugação de densidade, purificação imunomagnética de esfe- ras, cromatografia de afinidade e classificação de células ativadas por fluorescência, conhecidas por aqueles elementos versados na técnica.

[00246] A citometria de fluxo é amplamente utilizada na técnica e é um método bem conhecido dos versados na técnica para classificar e quantificar tipos de células específicos dentro de uma população de células. Em geral, a citometria de fluxo é um método para quantificar componentes ou características estruturais das células principalmente por meios ópticos. Uma vez que diferentes tipos de células podem ser distinguidos pela quantificação de características estruturais, a citome- tria de fluxo e a classificação de células podem ser usadas para contar e classificar células de diferentes fenótipos em uma mistura.

[00247] Uma análise citométrica de fluxo envolve duas etapas bási- cas: 1) rotular os tipos de células selecionados com um ou mais mar- cadores marcados e 2) determinar o número de células marcadas em relação ao número total de células na população.

[00248] O método primário de marcação de tipos de células é a |li- gação de anticorpos marcados a marcadores expressos pelo tipo de célula específico. Os anticorpos são marcados diretamente com um composto fluorescente ou indiretamente marcados usando, por exem- plo, um segundo anticorpo marcado com fluorescência que reconhece o primeiro anticorpo.

[00249] Em algumas modalidades, o método usado para classificar as células imunológicas que expressam um CAR é a Classificação Magnética de Células Ativadas (MACS).

[00250] A classificação celular ativada magneticamente (MACS) é um método para a separação de várias populações celulares, depen- dendo de seus antígenos de superfície (moléculas CD), usando nano- partículas e colunas superparamagnéticas. São necessárias algumas etapas simples para obter populações celulares puras. As células em uma suspensão de célula única são magneticamente marcadas com microesferas. A amostra é aplicada a uma coluna composta por esfe- ras ferromagnéticas, que são cobertas com um revestimento amigo das células, permitindo uma separação rápida e suave das células. As células não marcadas passam, enquanto as células marcadas magne-

ticamente são retidas na coluna. O fluxo pode ser coletado como a porção celular não rotulada. Após uma curta etapa de lavagem, a co- luna é removida do separador e as células marcadas magneticamente são eluídas da coluna.

[00251] Em algumas modalidades, o mAb usado no método para classificar células imunológicas que expressam o CAR é escolhido en- tre alemtuzumab, ibritumomabe tiuxetano, muromonab-CD3, tositu- momab, abciximab, basiliximab, brentuximabe vedotina, cetuximab, infliximab, rituximab, bevacizuma, eculizumab, efalizumab, gemtuzu- mab, natalizumab, omalizumab, palivizumab, ranibizumab, tocilizumab, trastuzumab, vedolizumab, adalimumab, belimumab, canacinumab, denosumab, golimumab, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, QBEND-10 e/ou ustekinumab. Em algumas modalidades, o dito mAb é o rituximab. Em outra modalidade, o dito mAb é QBEND-10. Aplicações terapêuticas

[00252] As células isoladas obtidas pelos métodos descritos acima, ou linhas de células derivadas dessas células isoladas, que expressam CARs específicos de FLT3 podem ser usadas como medicamento. Do mesmo modo, os anticorpos específicos de FLT 3 aqui descritos po- dem ser utilizados como um medicamento. Em algumas modalidades, esse medicamento pode ser usado para o tratamento de uma doença ou condição associada ao FLT3. Em algumas modalidades, a doença associada a FLT3 ou uma condição compreende células malignas que expressam FLT3, por exemplo, câncer. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de origem hematopoiética, como um linfoma ou leucemia. Em algumas modalidades, o câncer é neoplasia maligna de células plasmáticas de mieloma múltiplo, linfoma de Hodgkin, linfócito nodular predominante, linfoma de Hodgkin predominante, doença de Kahler e mielomatose, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, leucemia prolinocítica de células B, leucemia de células B, linfoma não

Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide crônica (LMC), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de Burkitt, linfoma da zona marginal, linfoma de células do manto, linfoma de células grandes, linfoma precursor do linfócito B, leucemia mieloide, macroglobulienemia de Waldenstrom, linfoma difuso de grandes célu- las B, linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma de tecido lin- fático associado à mucosa, linfoma de células pequenas linfocíticas, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma de grandes células B mediastinal primário (tímico), linfoma linfoplasmático, macro- globulinemia de Waldenstrôm, linfoma nodal de células B da zona marginal, linfoma da zona marginal esplênica, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de derrame primário, granulomatose linfo- matoide, linfoma de células B grandes rico em células/histiocito, linfo- ma do sistema nervoso central primário, linfoma cutâneo difuso primá- rio de grandes células B (tipo de perna), linfoma difuso de células B grandes positivo para EBV dos idosos, linfoma difuso de grandes célu- las B associado à inflamação, linfoma de grandes células B intravascu- lar, linfoma de grandes células B positivo para ALK, linfoma plasma- blástico, linfoma de grandes células B surgindo em HHV8 associado à doença de Castleman multicêntrica, linfoma de células B não classifi- cado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Burkitt, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Hodgkin clássico ou outros cânceres relaciona- dos a células hematopoiéticas. Em uma modalidade exemplificadora, o câncer é LMA. Em uma modalidade exemplificadora, o câncer é ALL.

[00253] Em algumas modalidades, uma célula isolada de acordo com a invenção, ou linha de células derivada das células isoladas, ou um anticorpo pode ser utilizado na fabricação de um medicamento pa-

ra tratamento de um câncer em um indivíduo que dele necessite.

[00254] Também são fornecidos no presente documento métodos para o tratamento de sujeitos. Em algumas modalidades, o método compreende o fornecimento de uma célula imunológica da invenção a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o método compreende uma etapa de administração de células imunoló- gicas transformadas da invenção a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o método compreende a adminis- tração de um anticorpo da invenção a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[00255] Em algumas modalidades, as células T da invenção podem sofrer uma expansão robusta de células T in vivo e podem persistir por um período prolongado de tempo.

[00256] Os métodos de tratamento da invenção podem ser melho- radores, curativos ou profiláticos. O método da invenção pode ser parte de uma imunoterapia autóloga ou parte de um tratamento de imunotera- pia alogênica. A invenção é particularmente adequada para imunoterapia alogênica. As células T dos doadores podem ser transformadas em célu- las não alorreativas usando protocolos padrão e reproduzidas conforme necessário, produzindo assim células CAR-T que podem ser administra- das a um ou vários indivíduos. Essa terapia celular CAR-T pode ser disponibilizada como um produto terapêutico "pronto para uso".

[00257] As células que podem ser usadas com os métodos descri- tos são descritas na seção anterior. O tratamento pode ser usado para tratar indivíduos diagnosticados com, por exemplo, câncer. Os cânce- res que podem ser tratados incluem, por exemplo, sem limitação, cân- ceres que envolvem linfócitos B, incluindo qualquer um dos cânceres listados acima. Os tipos de câncer a serem tratados com as CARs e as células CAR-T da invenção incluem, mas não estão limitados a certas leucemias ou neoplasias linfoides. Tumores/câncer de adultos e tumo-

res/câncer pediátricos também estão incluídos. Em algumas modali- dades, o tratamento pode estar em combinação com uma ou mais te- rapias contra o câncer selecionadas do grupo de terapia com anticor- pos, quimioterapia, terapia com citocinas, terapia com células dendriíti- cas, terapia genética, terapia hormonal, terapia com luz laser e terapia com radiação.

[00258] Em algumas modalidades, o tratamento pode ser adminis- trado nos indivíduos submetidos a um tratamento imunossupressor. De fato, a invenção geralmente se baseia em células ou em uma po- pulação de células, que foram resistentes a pelo menos um agente imunossupressor devido à inativação de um gene que codifica um re- ceptor para esse agente imunossupressor. Neste aspecto, o tratamen- to imunossupressor deve ajudar na seleção e expansão das células T de acordo com a invenção dentro do indivíduo. A administração das células ou população de células de acordo com a invenção pode ser realizada de qualquer maneira conveniente, incluindo por inalação, in- jeção, ingestão, transfusão, implantação ou transplante de aerossol. As composições descritas neste documento podem ser administradas a um indivíduo por via subcutânea, intradérmica, intratumoral, intrano- dal, intramedular, intramuscular, por injeção intravenosa ou intralinfáti- ca, ou intraperitonealmente. Em algumas modalidades, as composi- ções celulares da invenção são administradas por injeção intravenosa.

[00259] Em algumas modalidades, a administração das células ou a população de células pode compreender a administração de, por exemplo, cerca de 10º a cerca de 10º células por kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dos números de células dentro des- ses intervalos. Em algumas modalidades, a administração das células ou população de células pode compreender a administração de cerca de 105º a 10º células por kg de peso do corpo, incluindo todos os valo- res inteiros de números de células dentro dessas faixas. As células ou a população de células pode ser administrada em uma ou mais doses. Em algumas modalidades, a dita quantidade eficaz de células pode ser administrada como uma dose única. Em algumas modalidades, a dita quantidade eficaz de células pode ser administrada como mais de uma dose durante um período de tempo. O momento da administração está dentro do julgamento do médico responsável e depende da condição clínica do indivíduo. As células ou a população de células podem ser obtidas de qualquer fonte, como um banco de sangue ou um doador. Embora as necessidades individuais variem, a determinação de faixas ótimas de quantidades efetivas de um determinado tipo de célula para uma doença ou condições particulares, dentro dos conhecimentos da técnica. Uma quantidade eficaz significa uma quantidade que fornece um benefício terapêutico ou profilático. A dosagem administrada de- penderá da idade, saúde e peso do receptor, tipo de tratamento simul- tâneo, se houver, frequência do tratamento e natureza do efeito dese- jado. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de células ou composição compreendendo essas células é administrada parenteri- camente. Em algumas modalidades, a administração pode ser uma administração intravenosa. Em algumas modalidades, uma adminis- tração pode ser feita diretamente por injeção dentro de um tumor.

[00260] Em algumas modalidades da invenção, as células são ad- ministradas a um indivíduo em conjunto com (por exemplo, antes, si- multaneamente ou após) qualquer número de modalidades de trata- mento relevantes, incluindo, mas não limitado a, tratamento com agen- tes como terapia de anticorpo monoclonal, antagonista de CCR2 (por exemplo, INC-8761), terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, trata- mento com citarabina (também conhecido como ARA-C) ou natalizii- mab para pacientes com EM ou tratamento com efaliztimabe para pa- cientes com psoríase ou outros tratamentos para pacientes com LMP. Em algumas modalidades, as células CAR-T específicas de FLT3 são administradas a um indivíduo em conjunto com um ou mais dos se- guintes itens: um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, nivolumab, pem- brolizumab ou PF-06801591), um anti-PD- Anticorpo L1 (por exemplo, avelumab, atezolizumab ou durvalumab), um anticorpo anti-OX40 (por exemplo, PF-04518600), um anticorpo anti-4-1BB (por exemplo, PF- 05082566), um anticorpo anti-MCSF (por exemplo, PD-0360324), um anticorpo anti-GITR e/ou um anticorpo anti-TIGIT.

Em algumas moda- lidades, um CAR específico de FLT3 compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 236 é administrado a um indiví- duo em conjunto com o anticorpo avelumabe anti-PD-L1. Em outras mo- dalidades, as células T da invenção podem ser usadas em combinação com quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores, como ciclos- porina, azatioprina, metotrexato, micofenolato e FK506, anticorpos ou outros agentes imunoablativos como CAMPATH, anticorpos anti-CD3 ou outras terapias de anticorpos, citocina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citocinas e/ou irradiação.

Esses fármacos inibem a fosfatase calcineurina dependen- te de cálcio (ciclosporina e FK506) ou inibem a p70S6 quinase que é importante para a sinalização induzida por fator de crescimento (rapa- micina) (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). Em outras modalidades, as células T da inven- ção podem ser usadas em combinação com inibidores do Receptor Tirosina Quinase, como Midostaurina e Sunitinib, inibidores de MTOR como Rapamacina e Everolimus, moduladores epigenéticos como Vormostate, inibidores de proteassoma como Bortezomib, agentes imunomoduladores como inibidores de Hedgehog como Erismodegib e PF-04449913 ou inibidores de Isocitrato Desidrogenase (IDH), como AG-120 e AG-221. Em uma modalidade adicional, as composições ce- lulares da invenção são administradas a um indivíduo em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) o transplante de medula óssea, terapia ablativa de células T usando agentes quimiote- rápicos, como fludarabina, terapia de radiação com feixe externo (XRT), ciclofosfamida ou anticorpos como OKT3 ou CAMPATH. Em algumas modalidades, as composições celulares da invenção são ad- ministradas após terapia ablativa de células B, como agentes que rea- gem com CD20, por exemplo, Rituxan. Por exemplo, em algumas mo- dalidades, os indivíduos podem ser submetidos a tratamento padrão com quimioterapia em altas doses seguida de transplante de células- tronco do sangue periférico. Em certas modalidades, após o transplan- te, os indivíduos recebem uma infusão das células imunológicas ex- pandidas da invenção. Em algumas modalidades, as células expandi- das são administradas antes ou após a cirurgia.

[00261] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para esgotar células imunológicas projetadas que expressam CAR especifi- cas de FLT3 de um indivíduo administrado com as ditas células. A de- pleção pode ser por inibição ou eliminação.

[00262] Em um aspecto, um método para esgotar células imunoló- gicas projetadas que expressam um CAR específico de FLT3 compre- endendo um epítopo específico para um anticorpo monoclonal com- preende o contato da dita célula imunológica projetada com um anti- corpo monoclonal específico para o epítopo.

[00263] Em algumas modalidades, um método para esgotar de um indivíduo administrado com células imunológicas projetadas que ex- pressa um CAR específico de FLT3 compreendendo um epítopo espe- cífico para um anticorpo monoclonal compreende administrar ao indi- víduo um anticorpo monoclonal específico para o epítopo. Nessas mo- dalidades, a administração do anticorpo monoclional específico para o epítopo presente no domínio extracelular do CAR ao indivíduo elimina ou inibe a atividade de células imunológicas que expressam o CAR manipuladas do indivíduo. Em um aspecto, a depleção de células imu-

nológicas que expressam CAR modificadas permite a recuperação de uma população endógena de células que expressam FLT3.

[00264] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para promover a recuperação de células endógenas que expressam FLT3 em um indivíduo administrado com células imunológicas projetadas que ex- pressam na superfície celular um CAR específico de FLT3 compre- endendo um epítopo específico para um anticorpo monoclonal, em que o método compreende a administração de um monoclonal anticorpo específico para o epítopo do indivíduo. Em algumas modalidades, as células endógenas que expressam FLT3 são células endógenas que expressam FLT3 da medula óssea. Em um aspecto, o termo "recupe- ração" refere-se ao aumento do número de células endógenas que expressam FLT3. O número de células endógenas que expressam FLT3 pode aumentar devido ao aumento na proliferação de células endógenas que expressam FLT3 e/ou devido à redução na eliminação de células endógenas que expressam FLT3 por células imunológicas projetadas que expressam CAR de FLT3. Em algumas modalidades, a administração do anticorpo monoclonal ao indivíduo esgota as células imunológicas projetadas que expressam CAR de FLT3 e aumenta o número de células endógenas que expressam FLT3, por exemplo, cé- lulas progenitoras da medula óssea que expressam FLT3 endógenas no indivíduo. Em uma modalidade, a administração do anticorpo mo- noclonal ao indivíduo aumenta o número de células que expressam FLT3 endógenas em pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, em comparação com o número de células que expressam FLT3 endógenas antes da administração do anticorpo monoclional.

[00265] Em um aspecto, é fornecido um método para o tratamento de uma condição mediada por FLT3 em um indivíduo, em que o méto- do compreende: (a) administrar ao indivíduo células imunológicas pro-

jetadas que expressam em CARs específicos de FLT3 à superfície ce- lular compreendendo um ou mais epítopos específicos para um ou mais anticorpos monoclonais; e (b) subsequentemente esgotar as cé- lulas imunológicas projetadas do indivíduo, administrando um ou mais anticorpos monoclonais específicos para o epítopo do indivíduo.

[00266] Em algumas modalidades, os mAbs usados no método pa- ra depleção de células imunológicas modificadas por CAR são seleci- onados dentre alemtuzumab, ibritumomabe tiuxetano, muromonab- CD3, tositumomab, abciximab, basiliximab, brentuximab vedotina, ce- tuximab, infliximab, rizumab, rituximab, daclizumab, eculizumab, efa- lizumab, gemtuzumab, natalizumab, omalizumab, palivizumab, ranibi- zumab, tocilizumab, trastuzumab, vedolizumab, adalimumab, belimu- mab, canakinumab, denosumab, golimumab, usimetal, panimumab, QBEND-10, ustequinumab e combinações dos mesmos.

[00267] Em algumas modalidades, o dito epítopo específico para um anticorpo monoclonal (epítopo específico do mAb) é um epítopo ou mimotopo CD20, por exemplo, SEQ ID NO. 229 e o mAb específico para o epítopo é o rituximab.

[00268] Em algumas modalidades, a etapa de administração de um anticorpo monoclonal ao indivíduo compreende infundir o indivíduo com o anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, a quantidade de mAb específico do epítopo administrado ao indivíduo é suficiente para eliminar pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da célula que expressa CAR no indivíduo.

[00269] Em algumas modalidades, a etapa de administração de um anticorpo monoclonal para o indivíduo compreende a infusão do indiví- duo com 375 mg/m? de rituximab, uma vez ou várias vezes por semana.

[00270] Em algumas modalidades, quando células imunológicas que expressam um CAR compreendendo um epítopo específico de mAb (células imunológicas que expressam CAR) são esgotadas em um ensaio CDC usando mAb específico de epítopo, a quantidade de células imunológicas que expressam CAR viáveis diminui, por exem- plo, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%.

[00271] Em algumas modalidades, um fármaco citotóxico é acopla- do aos mAbs específicos do epítopo que são usados para esgotar as células imunológicas que expressam CAR. Através da combinação de capacidades de direcionamento de anticorpos monoclonais com a ca- pacidade de morte celular de fármacos citotóxicos, o conjugado de an- ticorpo-fármaco (ADC) permite uma discriminação sensível entre teci- do saudável e doente quando comparado com o uso isolado do fárma- co. Aprovações de mercado foram recebidas para várias ADCSs; a tec- nologia para fabricá-los - principalmente em ligantes - é apresentada em abundância na técnica anterior a seguir (Payne, G. (2003) Cancer Cell 3: 207-212; Trail et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-172; Patente 4.975.278).

[00272] Em algumas modalidades, o mAb específico do epítopo a ser infundido é conjugado previamente com uma molécula capaz de promover citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Portanto, o sistema de complemento ajuda ou complementa a capacidade dos anticorpos de limpar patógenos do organismo. Quando estimulado por um de vários, é desencadeada uma cascata de ativação como uma am- plificação maciça da resposta e ativação do complexo de ataque à mem- brana de morte celular. Podem ser utilizadas moléculas diferentes para conjugar o mMAb, como os glicanos [Courtois, A, Gac-Breton, S., Berthou, C, Guezennec, J., Bordron, A. e Boisset, C. (2012), a atividade de citoto- xicidade dependente do complemento de fragmentos de anticorpos tera- pêuticos é adquirida por acoplamento imunogênico de glicano, Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458; http://www .ejbiotechnolo-

gy.info DOI: 10.2225/voll5-issue5). Kits

[00273] A invenção também fornece kits para uso nos métodos ins- tantâneos. Os kits da invenção incluem um ou mais recipientes que compreendem um polinucleotídeo que codifica um CAR específico de FLT3, uma célula imunológica projetada que compreende um polinu- cleotídeo que codifica um CAR específico de FLT3 ou um anticorpo específico para FLT, conforme descrito neste documento, e instruções para uso de acordo com qualquer um dos os métodos da invenção descritos neste documento.Geralmente, estas instruções compreen- dem uma descrição da administração da célula imunológica projetada para os tratamentos terapêuticos descritos acima.

[00274] As instruções relacionadas ao uso das células imunológicas ou anticorpos manipulados como descritas neste documento geralmente incluem informações sobre dosagem, esquema de dosagem e via de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens com várias doses) ou doses sub-unitárias. As instruções fornecidas nos kits da invenção são geralmente instruções escritas em uma etiqueta ou bula (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções transportadas em um disco de armazenamento magnético ou óptico) também são aceitáveis.

[00275] Os kitsdestainvenção estão em embalagens adequadas. À embalagem adequada inclui, mas não está limitada a, frascos, garra- fas, jarros, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou sacos de plástico) e similares. Também são contempladas embalagens para uso em combinação com um dispositivo específico, como um inalador, um dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo de infusão, como uma minibomba. Um kit pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente também pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um CAR específico de FLT3 ou um anticorpo especí- fico de FLT3. O recipiente pode ainda compreender um segundo agen- te farmaceuticamente ativo.

[00276] Os kits podem opcionalmente fornecer componentes adici- onais, como buffers e informações interpretativas. Normalmente, o kit compreende um recipiente e uma etiqueta ou bula ou associados ao recipiente.

[00277] Os exemplos a seguir são oferecidos apenas para fins ilus- trativos e não pretendem limitar o escopo da invenção de forma algu- ma. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas mostra- das e descritas neste documento, tornar-se-ão evidentes para os ele- mentos versados na técnica a partir da descrição anterior e se enqua- dram no escopo das reivindicações anexas.

[00278] Os materiais representativos da presente invenção foram depositados na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va.20110-2209, EUA, em 1º de junho de 2017. O vetor P3E10-VL com o número de acesso ATCC PTA-124228 é um polinucleotídeo que codifica a região variável da cadeia leve P3E10 e o vetor P3E10-VH com o número de acesso ATCC PTA-124227 é um polinucleotídeo que codifica a região variável da cadeia pesada P3E10. O depósito foi realizado de acordo com as disposições do Tra- tado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para fins de procedimentos e regulamentos de pa- tentes (Tratado de Budapeste). Isso garante a manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data do depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC nos termos do Tratado de Budapeste e indivíduo a um acordo entre a Pfizer, Inc. e a ATCC, que garante disponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cultura do depósito ao público mediante a emissão de a patente pertinente dos EUA ou ao abrir ao público qualquer pedido de patente americano ou estrangeiro, o que ocorrer primeiro, e assegura a disponibilidade da progênie para uma determinada pelo comissário de patentes e marcas registradas dos EUA de acordo com a Seção 122 da USC e as regras do Comissário nos termos da mesma (incluindo 37 Seção 1.14 do CFR, com referência específica a 886 OG 638).

[00279] O cessionário do presente pedido concordou que, se uma cultura dos materiais depositados morrer ou for perdida ou destruída quando cultivada em condições adequadas, os materiais serão pronta- mente substituídos mediante notificação por outro da mesma. A disponi- bilidade do material depositado não deve ser interpretada como uma |i- cença para praticar a invenção em violação dos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo, de acordo com suas leis de patentes. Exemplos Exemplo 1: Determinação da cinética e afinidade das interações de anticorpos humanos FLT3/FLT3 a 37 ºC

[00280] Este exemplo determina a cinética e a afinidade de vários anticorpos anti-FLT3 a 37 ºC. Todas as experiências foram realizadas num biossensor de ressonância Plasmon de superfície Biacore T200 (GE Lifesciences, Piscataway NJ).

[00281] A preparação do chip sensor foi realizada a 25 ºC com um tampão de 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 0,05% (v/v) de Tween-20, pH 7,4. Um chip sensor anti-Fc humano foi produzido ati- vando todas as células de fluxo de um chip sensor Biacore CM4 com uma mistura 1: 1 (v/v) de EDC 400 mM e NHS 100 mM por 7 minutos, a uma taxa de fluxo de 10 ul/min. Um reagente Fc anti-humano (IgG

Fc anti-humano de cabra, SouthernBiotech Catálogo nº 2081-01) foi diluído para 30 pg/ml em acetato de sódio 10 mM pH 4,5 e injetado em todas as células de fluxo por 7 minutos a 20 ul/min. Todas as células de fluxo foram bloqueadas com etilenodiamina 100 mM em tampão borato 150 mM pH 8,5 por 7 minutos a 10 ul/min.

[00282] As experiências foram realizadas a 37 ºC usando um tam- pão de corrida de HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 a 0,05% (v/v), Tween-20, pH 7,4, 1 mg/ml de BSA. Os anticorpos FLT3 foram capturados de sobrenadantes não diluídos nas células de fluxo a ju- sante (células de fluxo 2, 3 e 4) a uma taxa de fluxo de 10 ul/min por 1 minuto. Diferentes anticorpos foram capturados em cada célula de flu- xo. A célula de fluxo 1 foi usada como superfície de referência. Após a captura dos anticorpos FLT3, o analito (tampão, hFLT3) foi injetado a ul/min em todas as células de fluxo por dois minutos. Após a inje- ção do analito, a dissociação foi monitorada por 10 minutos, seguida pela regeneração de todas as células de fluxo com três injeções de 1 minuto de ácido fosfórico 75 mM. Para cada anticorpo FLT3 capturado, foram realizadas as seguintes injeções de analito: tampão, 11 nM de hFLT3, 33 nM de hFLT3, 100 nM de hFLT3 e 300 nM de hFLT3. Os ciclos de tampão foram coletados para cada anticorpo FLT3 capturado para fins de dupla referência (dupla referência como descrito em Myszka, DG Improving biosensor analysis. J. Mol. Reconhecer. 12, 279-284 (1999)). Os diagramas de sensores de dupla referência foram adaptados globalmente a um Langmuir 1:1 simples com modelo de ligação de transporte de massa.

[00283] Os parâmetros de cinética e afinidade para os anticorpos anti-FLT3 testados são mostrados na Tabela 7. Os anticorpos mostra- dos na Tabela 7 compartilham as mesmas regiões VH e VL que os CARs mostrados na Tabela 8 com o mesmo nome.

Tabela 7 Formato igê [Domínio [ka (Ms) |ki(11s) [teímin [Kin TKa(nm) Te (Ms) [ki(1s) [te(min' [Ko (nv) paro | 1 [140Enos jasomos [az — fas — at — |1325%05 [190603 Per | [1606mos [120508 faz — 77 — faz — [1276r0s [164603 PRA as asceros ecoa fo ea TT roreros [167eos dog [1567 PSA | 23 — osoEros [100602 [12 — [fz — [198 — [810604 |175E02? PoBs 123 — [1206r04 [470504 [aaa — [mM 15 [380604 [og7eos Port 23 — [1806ros |as0602 [os — fm — | 2266705 [286602 f0o4 — 1265 PiBa ja [1806sos 58050 (2 sr e 1206x05 [3,276-03 ã [Bm fa 206705 [550605 far fa | sem [257603 x Pra | 4 [osoeros [180503 [66 — fz — os — [2056r0s [18760 ê Pato | 4 [1806ros [190502 fog — fts — | — |1726r05 [112602 Pias á —170Er06 [34reDs az — foto | [2506x05 [292604 Para ja > j1,16E+O6 [469604 fase [P1GI2 fá —J617Eros [2926-04 Ja foar 65 [paes fa 1206-068 [151804 jr fogao PSA 4 > 553605 [101E-04 [ia oa PsFT ja lessEtos [152604 | 76 =——>—>—Jjo24 =| >> 1,89E+05 |[1,97E-04 jarro a eteeso4 [144602 1 = 1as3 | >>> J1,60E+05 [9,33E-03 P1sFz 5 => l1,40E+05 [5506-038 faaÚúÚúÚú jar P1i2B6 js => j1,10E+o5 Jaaomos aaa

A Pres Tres ka (1/Ms) [ka(11s) [te(min [Ko(nM) [Kd(nM) [k(1Ms) |ks(1s) Ko (nM) 7105x04 [5205085 az Bo Ro DT REA aaa PBB6 as06roa f2306os fito e O [rsez |s — 1a0emos [110503 tor fa | fossem [30560 1106x05 [130508 Too “fr 18 faze [24160 Exemplo 2: Geração de Células CAR-T Específicas de FLT3 a) Plasmídeos

[00284] As seguintes sequências de CAR FLT3 otimizadas por códon listadas na Tabela 8 abaixo foram sintetiza- ]

N das e subclonadas em um vetor lentiviral como pLVX-EF1a-IRES-Puro (Clontech) usando os locais de restrição EcoR| z (5') e Mlul (3') (removendo assim o cassete IRES-Puro). ?

Tabela 8: CARs Específicos de FLT3 Exemplificadores

P1A5 — | MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGVFSRYALSW | Peptídeo sinal CD8a; VRQAPGQOGLEWMGGIIPMLGFANYAQKFOGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAV | p1A5 VHVL VH: YYCATLDFGALDYWGQGTLVTVSSGGEESCEGESCGEGESEIVLTASPGTLSLSPG | | jnante GS; ERATLSCRASQAVDSSDLAWYQQKPGQAPRLLIVDAYTRPSGIPDRFSGSGSGTDF | 5145 VAVL VL: TLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLR — PEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQ | Dobradiça CD8a; PEMRPVOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNL | Domínio TM de CD8a; GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERR | 41BB ISD; RGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 233) CD3ZISD s<

P1B4 | MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGVFSRYALSW | Peptídeo sinal CD8a; 2 VRQAPGQOGLEWMGGIIPMLGFANYAQKFOGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAV | p1B4 VHVL VH: 8 YYCATLDFGALDYWGQGTLVTVSSGGEESCEGESGEGESEIVLTASPGTLSLSPG | | jnante GS; ERATLSCRASQSVPNEQLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDF | 5124 vovl vL: TLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSPPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLR — PEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQ | Dobradiça CD8a; PEMRPVOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNL | Domínio TM de CD8a; GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERR | 41BB ISD; RGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 234) CD3ZISD

P3A1 | MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYDISW | Peptídeo sinal CD8a; VRQAPGQOGLEWMGGIIPVYSGRANYAQKFQGRVTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTAV | paA1 VHVL VH: YYCARVRPTYWPLDYWGOQGTLVTVSSGGGESCEGESCEGESDIQMTASPSSLSA | | jnante GS;

SVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQOKPGKAPKLLIVAASSLOSGVPSRFSGSGSGTD |p3a1 VHVL VL; FTLTISSLOPEDFATYYCQQSYSTPLTFGAGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSL | pobradiça CD8a: RPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFK | 5 mio TM de CD8a:

QPFMRPVOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGONQLYNELN LGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGER | 41BB1SD; RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 235) CD3g1ISD P3E10 | MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAIQW | Peptídeo sinal CD8a; VRQAPGQOGLEWMGGIVGSWGLANYAQKFOGRVTITTDKSTSTAYMELSSLRSEDTA | pae10 VHVL VH: VYYCATSAFGELASWGQGTLVTVSSGGGESCEGESCGEGESEIVLTASPGTLSLSP | | jnante GS; GERATLSCRASQSVPSSQLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTD | 5312409 VHVL VU: a FTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSL = ' NS RPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFK | Dobradiça CD8a; z QPFMRPVOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQANQLYNELN | Domínio TM de CD8a; o LGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQOKDKMAEAYSEIGMKGER | 41BBISD; RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 236) CD3ZISD P4C7 | MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYTISW | Peptídeo sinal CD8a; VRQAPGOGLEWMGGIIPAFGIANYAQKFOGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAV | p4c7 VHVL VH: YYCAKGGSYSLDYFDIWGQGTLVTVSSGGEGESCEGESCEGESEIVLTASPGTLSLS | | jyante GS; PGERATLSCRASQYVSASLLAWYQQKPGQAPRLLIVGASTRATGIPDRFSGSGSGT | 5107 vAvL VL: DFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYARSSTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSL = RPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFK | Dobradiça CD8a; QPFMRPVOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQANQLYNELN | Domínio TM de CD8a; LGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQOKDKMAEAYSEIGMKGER | 41BBISD;

| RRGKGHOGIYOGLSTATIKDIVOALHMGALPPRISEGIONO25M = ensgiso

P4H11 | MALPVTALLLPLALLLHAARPEVOQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNW | Peptídeo sinal CD8a; VRQAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA | p4H11 VHVL VH; VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSSGGEESCEGESCEGESEIVLTASP | | igante GS: GTLSLSPGERATLSCRASQSVSNTYLAWYQQKPGQAPRLLIYDTSSRATGIPDRFSG | 51114 VHVLVL: SGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSLTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIAS - QPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKK | Pobradiça CD8a; LLYIFKQPEMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGANAL | Domínio TM de CD8a; YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIG |41BBISD; MKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 238) CD3ÇISD a

P5F7 —| MALPVTALLLPLALLLHAARPEVOQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNW | Peptídeo sinal CD8a; 8 VRQAPGKGLEWVSSISGGGRSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA | psF7 VHVL VH; E VYYCARDLSPSDVGWGYGFDIWGQGTLVTVSSGGGESCEGESCEGESEIVLTASP | | inante GS: ATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQOKPGQAPRLLIYDTFTRATGIPARFSGS | 5557 voy! vL: GSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPTFGQGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTIA = SQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRK | Pobradiça CD8a; KLLYIFKQPEMRPVOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQANQ | Domínio TM de CD8a; LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI |41BBISD; GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 239) CD3ÇISD

P7H3 | MALPVTALLLPLALLLHAARPEVOQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHW | Peptídeo sinal CD8a; VRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA |p7H3 VHVL VH; VYYCARGTRWWWGDAFDHWGQGTLVTVSSGGGESCEGESGEGESASVLTAPP | | jnante GS:

SVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVAWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSN | p7H3 VHVL VL: SGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSTAWVFGGGTKLTVLTTTPAPRPPTPAPTI | popradiça CD8a: ASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGR | 55 mínio TM de CD8a:

KKLLYIFKQPFMRPVOTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGON QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSE | 21BB1SD; IGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 240) CD3g1ISD P8B6 —| MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAVSW | Peptídeo sinal CD8a; VRQAPGOGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFOGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVY | pgB6 VHVL VH: YCAIEGIGGDLRYDGYDAWGQGTLVTVSSGGEESCEGESCEGESENVLTASPGTL | | jnante GS; SLSPGERATLSCRASQSVSHSYLAWYQQKPGQAPRLLIVGASFRAAGIPDRFSGSG | 55535 vei vL: a SGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSDPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIAS — ' o QPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKK | Dobradiça CD8a; z LLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQANAL | Domínio TM de CD8a; o YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIG |41BBISD; MKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 241) CD3ZISD P9B5 —| MALPVTALLLPLALLLHAARPEVOQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFASYAMSW | Ppeptídeo sinal CD8a; VRQAPGKGLEWVSEISSSGGSTTYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV | paB5 VHVL VH: YYCARDRVMAGLGYDPFDYWGQGTLVTVSSGGGESCEGESCEGESASVLTAPP | | rante GS; SASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQALPGTAPKLLIVRNNORPSGVPDRFS | pops VHVL VL: GSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGVVFGGGTKLTVLTTTPAPRPPTP — APTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCK | Dobradiça CD8a; RGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQ | Domínio TM de CD8a; GONQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQOKDKMAE |41BBISD;

| [AYSEIGVKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKOTYDALHNOALPAR (SEC ID NO 242) [cnagish

P12B6 | MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFMSYAISW | Peptídeo sinal CD8a; VRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVY | p12B6 VHVL VH: YCARETLIYPIPFELWGQGTLVTVSSGGEESGEGESCEGESEIVLTASPGTLSLSPG | | inante GS: ERATLSCRASQIVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRASGIPDRFSGSGSGTDFT | 5,586 VHVL VL: LTISRLEPEDFAVYYCQQYGGSPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLR - PEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQ | Dobradiça CD8a; PFEMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGANQLYNELNL | Domínio TM de CD8a; GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERR | 41BB ISD; RGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 243) CD3ÇISD a

P14G2 | MALPVTALLLPLALLLHAARPEVOQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYVMNW | Peptídeo sinal CD8a; S VRQAPGKGLEWVSAISGSGATTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV | p14G2 VHVL VH; E YYCVSGLWAGGIWGQGTLVTVSSGGGESCEGESGEGESDIQMTASPSSLSASVG | | ;gante GS: DRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASDLORGVPSRFSGSGSGTDFTL | 51462 VHVLVL: TISSLOPEDFATYYCQQSYNTPWTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRP - EACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQP | Dobradiça CD8a; FMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLG | Domínio TM de CD8a; RREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRR | 41BB ISD; GKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 244) CD3ÇISD

[00285] Em algumas experiências, a sequência que codifica o CAR é precedida por uma sequência que codifica uma proteína fluorescente como BFP (Blue Fluorescent Protein) e separada dessa sequência por uma sequência que codifica um peptídeo 2A autoclivável. Os lentivírus foram produzidos usando psPAX2, um plasmídeo de empacotamento gag-pol de HIV-1 e pMD2.G, um plasmídeo de expressão de VSV-G. b) Ativação de Células T e Transdução Lentiviral

[00286] As células T intocadas foram isoladas de células mononu- cleares do sangue periférico humano (PBMCs) usando o kit de isola- mento de células T Pan (Miltenyi Biotec) e ativadas por três dias com anticorpos contra CD2, CD3 e CD28 humano ((Kkit de ativação/expan- são de células T - Miltenyi Biotec). Os vetores lentivirais (LV) foram produzidos por transfecção transitória de células subconfluentes HEK- 293T/17 (American Type Culture Collection (ATCC)) em placas de 6 poços. Resumidamente, plVX, psPAX2 e pMD2. Os plasmídeos G foram transfectados na razão de 4:3:1, respectivamente, usando Lipo- fectamine 2000 (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. No dia seguinte, o meio foi substituído por meio de cultura de células T (soro AB humano a 5% em meio X-vivo-15 (Lonza)) e, 48 horas após a transfecção, o sobrenadante do VE foi colhido e filtrado através de um filtro de seringa de 0,45 um (Millipore). As células T activadas foram semeadas a 0,25 x 10º células/ml em meio de cultura de células T con- tendo 40 ng/ml de IL-2 e transduzidas por adição de um volume igual de sobrenadante fresco do VE. Os VE que compreendem os seguintes construtos CAR foram utilizados nessas experiências: P1A5, P1B4, P3A1, P3E10, P4C7, P4H11, P7H3, P9B5, P12B6 e P14G2. As célu- las foram cultivadas a 37 ºC e CO2 a 5% por três dias e utilizadas para análise por citometria de fluxo ou expandidas em meio de célula T fresco contendo 20 ng/ml de IL-2.

c) Medição da Eficiência da Transdução por Citometria de Fluxo

[00287] Para determinar a eficiência da transdução dos diferentes construtos lentivirais do CAR FLT3, a análise por citometria de fluxo foi realizada em células T 72 h após a transdução. Resumidamente, célu- las únicas foram bloqueadas usando parâmetros de dispersão direta e dispersão lateral e a eficiência de transdução calculada como a por- centagem de células positivas para BFP. Em outros casos, as células que expressam CAR foram detectadas por coloração com anticorpo anti-CD20 rituximab, que liga os epítopos CD20 na molécula CAR, se- guido por IgG anti-humana conjugada com FITC. A Figura 1 mostra que as células T ativadas foram efetivamente transduzidas com os di- ferentes construtos de FLT3 CAR com eficiências variadas (30% a 70%).

d) Células CAR-T FLT3FLT3 se diferenciam durante a cultura, mas mantêm uma alta porcentagem de subconjuntos de células T de me- mória

[00288] A expressão dos marcadores de ativação CD25 e 4-1BB (CD137) nas células CAR-T durante a cultura foi associada à exaustão das células T e ao aumento da diferenciação em relação ao fenótipo da memória efetiva (Long et al., 2015). Nessa experiência, as células T transduzidas com os P1A5, P1B4, P3A1, P3E10, P4C7, P4H11, P7H3, P9B5, P12B6 e P14G2 CAR foram coradas com anticorpos CD25 e CD137 dez dias após a estimulação e analisadas por citometria de flu- xo. O grau de ativação das células T foi determinado pela porcenta- gem de células CAR-T positivas para CD25 e 4-1BB. Uma população de células T não transduzidas (NT) foi incluída para comparação (Figu- ra 2). A expressão de alguns CARs FLT3FLT3 (P1A5, P12B6 e P14G2) foi associada a um estado "ativado" (Figura 2), enquanto a expressão de outros CARs FLT3FLT3, incluindo P9B5, P3E10, P4C7 e P3A1, resultou em níveis de marcadores de ativação comparáveis às células não transduzidas (Figura 2). Níveis mais altos de expressão do marcador de ativação se traduzem em aumento da diferenciação das células CAR-T, que podem ser avaliadas no dia 15 após a estimula- ção, medindo a expressão de CD62L e CD45RO em sua superfície celu- lar. Nesta experiência, as células CAR-T foram coradas com esses mar- cadores usando anticorpos específicos e classificadas em quatro catego- rias ou subconjuntos diferentes com crescente grau de diferenciação: 1) células com memória de células-tronco CD62Lº*-TA CD45RoPAA (Tscm); 2) células CD62LA-TA CD45RO*-TA de memória central (Tem); células CD62L8AXA CD45RO**-MA de memória efetiva (Tem); e células efetoras CD62L8AXA Cp45ROPAM*A (Teff). A Figura 3 mostra gráficos representativos de FACS para células P9B5 CAR-T (baixa diferencia- ção) e células P14G2 CAR-T (alta diferenciação) e a composição do subconjunto de células T de todas as diferentes células CAR-T FLT3FLT3 no dia 15 após a estimulação. As células CAR-T que exi- bem um fenótipo "ativado" também mostraram um fenótipo mais dife- renciado (ou seja, maior porcentagem de células Tem e menor porcen- tagem de células Tscm) até o final da cultura (Figura 3). Em particular, a expressão dos CARs P9B5, P3A1, P7H3 e P3E10 FLT3 foi associa- da a uma alta porcentagem de memória de células-tronco e células de memória central, as quais foram correlacionadas com maior persistên- cia e eficácia antitumoral em indivíduos com LLA e CLL (Xu et al. Blo- od. 2014; 123 (24): 3750-3759).

e) Ensaio de Proliferação In Vitro e Atividade de Morte a Longo Prazo

[00289] A capacidade das células CAR-T de proliferar e lisar as cé- lulas-alvo que expressam o antígeno cognato é uma maneira eficaz de avaliar sua atividade in vitro. Para monitorar a viabilidade das células- alvo por luminescência, as células Molm13 que expressam FLT3 foram transduzidas de maneira estável para expressar o gene da luciferase. Essas células-alvo Luc* foram então incubadas com células FLT3

CAR-T e a atividade de morte, bem como a proliferação de células CAR-T, foi medida por luminescência e contagem viável de células, respectivamente. Para um ensaio mais rigoroso projetado para estres- sar as células efetoras (células CAR-T), novas células-alvo foram adi- cionadas periodicamente à cultura inicial e a atividade de morte a lon- go prazo das células CAR-T determinada por luminescência no final da cultura ( Figura 4). Consistente com a maior capacidade proliferativa de células T e memória central, as populações de células CAR-T P9B5, P3A1, P7H3 e P3E10 apresentaram maior expansão dependen- te do alvo e atividade citotóxica a longo prazo in vitro, enquanto as cé- lulas CAR-T com um maior grau de diferenciação, como P12B6 e P14G2, expandiu-se mal na presença de células-alvo e reduziu a ativi- dade de morte. f) Atividade de Células CAR-T Específicas de FLT3 em um Ensaio Or- totópico de Camundongo

[00290] Esse exemplo ilustra o tratamento da LMA com células CAR-T FLT3 usando o modelo ortotópico Eol1. O estudo de eficácia in vivo das células CAR-T FLT3 foi realizado com células Eol1, expres- sando luciferase e GFP, em um modelo ortotópico. Trezentas mil célu- las Eol1 Luc2AGFP foram injetadas por via intravenosa através da veia da cauda em animais CB17/SCID fêmeas com 6 a 8 semanas de idade. A injeção intraperitoneal de D-luciferina (Regis Technologies, Morton Grove, IL) (200 ul por animal a 15 mg/ml), seguida de aneste- sia com isofluorano e subsequente imagem de bioluminescência de corpo inteiro (BLI), permite o monitoramento da carga tumoral. Os si- nais bioluminescentes emitidos pela interação entre luciferase expres- sa pelas células tumorais e luciferina foram capturados por imagem usando um IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer, MA) e quantificados co- mo fluxo total (fótons/s) usando Living Image 4.4 (Caliper Life Scien- ces, Alameda, CA).

[00291] “Quando o fluxo total atingiu uma média de 30E6 para todos os animais (dia 10 após o implante do tumor), os animais foram ran- domizados em três grupos. Cada grupo recebeu uma das seguintes células: 1) células T não transduzidas usadas como controle, 2) célu- las FLT3 CAR-T expressando P3E10 ("P3E10 V1") ou 3) células FLT3 CAR-T expressando P3A1 ("P3A1 V1"). Todas as células 1-3 possuem TCRa. As células FLT3 CAR-T foram preparadas como descrito no exemplo acima. Os construtos FLT3 CAR P3E10 e P3A1 são mostra- dos na Tabela 8 acima. Uma dose única de 2,5 ou 5 milhões de célu- las de controle (NT) ou FLT3 CAR-T (P3E10 ou P3A1) foi administrada por injeção de cauda de bolus. Os animais tiveram término quando perderam mais de 15% do peso corporal total, um ponto final para os modelos ortotópicos Eol1.

[00292] Os resultados do estudo estão resumidos na Figura 5. Uma dose única de 5 milhões de células P3E10 ou P3A1 FLT3 CAR-T ou 2,5 milhões de células P3E10 FLT3 CAR-T resultou em menor fluxo total entre os dias 13 e 43 após o implante do tumor em comparação com o controle negativo. Assim, o tratamento com células FLT3 CAR-T inibiu a progressão do tumor em comparação com o controle negativo.

[00293] Esses resultados demonstram que as células FLT3 CAR-T são eficazes para inibir a progressão do tumor. Exemplo 3: Depleção de Células T CAR Rspecíficas de FLT3 que ex- pressam Epítopos CD20

[00294] a) As células CAR-T específicas de FLT3 que expressam epítopos CD20 são sensíveis à citotoxicidade dependente de comple- mento (CDC) na presença de rituximab.

[00295] A sensibilidade das células CAR-T FLT3 específicas para complementar a presença de um anticorpo anti-CD20 foi avaliada in vitro usando um ensaio CDC. Para esta experiência, as células T transduzidas com um construto lentiviral para a expressão de um epí-

topo CD20 contendo CAR FLT3 no domínio extracelular foram mistu- radas com 25% de complemento (AbD serotec) na presença ou au- sência de rituximabe (100 pg/ml) e incubada a 37 ºC e 5% de CO2 du- rante 4 horas. A depleção de células CAR-T FLT3 foi determinada por análise de citometria de fluxo usando a proteína FLT3 biotinilada. À Figura 6 mostra que as células que expressam os epítopos de CAR FLT3 e CD20 foram eficientemente esgotadas na presença do anticor- po e complemento, enquanto as células T de controle específicas de CAR FLT3 que não expressam os epítopos CD20 foram minimamente afetadas.

[00296] Esses resultados demonstram que células CAR-T específi- cas de FLT3 que expressam epítopos CD20 podem ser esgotadas in vitro na presença de rituximab e complemento.

[00297] b)Adepleção de células CAR-T FLT3 após a administração de rituximabe permite a recuperação de progenitores da medula óssea que expressam FLT3 em camundongos NSG

[00298] A capacidade do anticorpo anti-CD20 rituximabe para me- diar a depleção de células T CAR-FLT3 específicas que expressam epítopos CD20 e facilitar a recuperação da medula óssea foi testada em camundongos. Nesse experimento, os camundongos foram trata- dos com células T que expressam um CAR FLT3 que pode se ligar à proteína FLT3 do camundongo na superfície dos progenitores da me- dula óssea (CARTs FLT3 de a-camundongo) e compreendendo um epítopo CD20 reconhecido pelo rituximab ou um CAR controle, com ligação insignificante à proteína FLT3 de camundongo. A análise por citometria de fluxo de células da medula óssea foi usada para demons- trar a atividade citotóxica das células CAR-T contra progenitores he- matopoiéticos que expressam FLT3, vistos como uma redução de pro- genitores em comparação com camundongos que receberam células CAR-T de controle ou com camundongos não tratados (Figura 7, Pai-

nel B). Após confirmação da atividade de morte das células CAR-T, os camundongos receberam rituximabe por quatro dias consecutivos e as células CAR-T residuais em circulação foram enumeradas por citome- tria de fluxo no dia 13. A Figura 7, o painel C mostra que as células CAR-T FLT3 no sangue desses camundongos foram esgotadas em comparação com o grupo controle, que não recebeu rituximab. Final- mente, a análise por citometria de fluxo das células da medula óssea demonstrou que apenas os camundongos que receberam rituximabe (dia 20) apresentaram recuperação da medula óssea (Figura 7, Painel D).

[00299] Essa experiência demonstra que a depleção dependente do rituximabe das células T FLT3 CAR que expressam epítopos CD20 mitiga os danos aos tecidos que expressam FLT3, como a medula ós- sea, permitindo uma rápida recuperação da medula óssea a partir de células progenitoras residuais.

[00300] Embora os ensinamentos descritos tenham sido descritos com referência a várias aplicações, métodos, kits e composições, será apreciado que várias alterações e modificações podem ser feitas sem se afastarem dos ensinamentos neste documento e da invenção rei- vindicada abaixo. Os exemplos anteriores são fornecidos para melhor ilustrar os ensinamentos descritos e não se destinam a limitar o esco- po dos ensinamentos apresentados neste documento. Embora os pre- sentes ensinamentos tenham sido descritos em termos dessas moda- lidades exemplares, o especialista na técnica entenderá prontamente que inúmeras variações e modificações dessas modalidades exempla- res são possíveis sem experimentação indevida. Todas essas varia- ções e modificações estão dentro do escopo dos ensinamentos atuais.

[00301] Todas as referências citadas neste documento, incluindo patentes, pedidos de patente, papéis, livros de texto e similares, e as referências citadas, na medida em que ainda não sejam, são incorpo-

radas neste documento por referência em sua totalidade. No caso de um ou mais da literatura incorporada e materiais similares diferirem ou contradizerem esta aplicação, incluindo, entre outros termos definidos, uso de termos, técnicas descritas ou controles de aplicação semelhan- tes.

[00302] A descrição e exemplos anteriores detalham certas modali- dades específicas da invenção e descrevem o melhor modo contem- plado pelos inventores. Será apreciado, no entanto, que não importa quão detalhados os itens acima possam aparecer no texto, a invenção pode ser praticada de várias maneiras e a invenção deve ser interpre- tada de acordo com as reivindicações anexas e quaisquer equivalen- tes das mesmas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Receptor de antígeno quimérico específico de tirosina quinase 3 (FLT3) semelhante a Fms (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular, um primeiro domínio transmembranar e um domínio de sinalização intra- celular, em que o domínio de ligação ao ligante extracelular compre- ende um fragmento variável de cadeia única (scFv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que o scFv se liga à SEQ ID NO: 202 (Domínio 4 de FLT3) ou SEQ ID NO: 200 (Domínio 2 de FLT3).

2. Receptor de antígeno quimérico específico de tirosina quinase 3 (FLT3) semelhante a Fms (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular, um primeiro domínio transmembranar e um domínio de sinalização intra- celular, em que o domínio extracelular compreende um fragmento va- riável de cadeia única (scFv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que (a) a região VH compreende (i) uma região determinante de complementariedade VH um (CDR1) com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 37, 38, 39, 43, 44, 45, 49, 50, 54, 55, 56, 60, 61, 62, 66, 67, 68, 72, 73, 74, 78, 79, 80, 84, 85, 86, 90, 91, 92, 96, 97, 98, 102, 103, 104, 108, 109, 110, 114, 115, 116, 120, 121, 122, 126, 127, 128, 132, 133, 134, 138, 139, 140, 294, 295, 296, 300, 301, 305, 306, 307, 311, 312, 316, 317 ou 318; (ii) uma região determinante de complementariedade VH dois (CDR2) tendo a sequência de aminoáci- dos mostrada na SEQ ID NO: 40, 41, 46, 47, 51, 52, 57, 58, 63, 64, 69, 70, 75, 76, 81, 82, 87, 88, 93, 94, 99, 100, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 123, 124, 129, 130, 135, 136, 141, 142, 297, 298, 302, 303, 308, 309, 313, 314, 319, 320 ou 322; e (iii) uma região determinante de complementariedade VH três (CDR3) com a sequência de aminoáci-

dos mostrada na SEQ ID NO: 42, 48, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, 131, 137, 143, 299, 304, 310, 315 ou 321; e/ou (b) a região VL compreende (i) uma região determinante de complementariedade VL um (CDR1) com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 323, 326, 328, 331, 336, 338, 340, 343, 345, 348 ou 350; (ii) uma região determinante de com- plementariedade VL dois (CDR2) tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 145, 148, 151, 154, 157, 160, 163, 166, 169, 172, 175, 178, 181, 184, 187, 190, 193, 196, 324, 329, 332, 334, 341 ou 346; e (iii) uma região determinante de complementariedade VL três (CDR3) com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 146, 149, 152, 155, 158, 161, 164, 167, 170, 173, 176, 179, 182, 185, 188, 191, 194, 197, 325, 327, 330, 333, 335, 337, 339, 342, 344, 347 ou 349.

3. Receptor de antígeno quimérico específico de tirosina quinase 3 (FLT3) semelhante a Fms (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular, um primeiro domínio transmembranar e um domínio de sinalização intra- celular, em que o domínio extracelular compreende um fragmento va- riável de cadeia única (scFv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2, 4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271,273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 ou 293.

4. Receptor de antígeno quimérico específico de tirosina quinase 3 (FLT3) semelhante a Fms (CAR) caracterizado peloo fato de que compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular, um primeiro domínio transmembranar e um domínio de sinalização intra- celular, em que o domínio extracelular compreende um fragmento va-

riável de cadeia única (scFv) compreendendo uma região variável da cadeia leve (VL) com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1,3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 ou 292.

5. Receptor de antígeno quimérico específico de tirosina quinase 3 (FLT3) semelhante a Fms (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular, um primeiro domínio transmembranar e um domínio de sinalização intra- celular, em que o domínio extracelular compreende um fragmento va- riável de cadeia única (scFv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que a região VH compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 ou 293; e a região VL compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1,3,5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 ou 292.

6. Receptor de antígeno quimérico específico de tirosina quinase 3 (FLT3) semelhante a Fms (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao ligante extracelular, um primeiro domínio transmembranar e um domínio de sinalização intra- celular, em que o domínio extracelular compreende um fragmento va- riável de cadeia única (scFv) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que (a) a região VH compreende uma CDR1 VH compreenden- do a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 49, 44 ou 50; uma CDR2 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mos- trada na SEQ ID NO: 51 ou 52; e uma CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 53; e a região VL compreende uma CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoá-

cidos mostrada na SEQ ID NO: 150; uma CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 151; e uma CDR3 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 152, ou (b) a região VH compreende uma CDR1 VH compreenden- do a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 90, 91 ou 92; uma CDR2 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mos- trada na SEQ ID NO: 93 ou 94; e uma CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 95; e a região VL compreende uma CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoá- cidos mostrada na SEQ ID NO: 171; uma CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 172; e uma CDR3 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 173.

7. CAR específico de FLT3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291 ou 293, ou uma variante da mesma com uma ou mais várias substituições de aminoácidos con- servadoras em resíduos que não estão dentro de uma CDR e/ou regi- ão VL compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1,3, 5,7, 9,11, 13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290 ou 292 ou uma variante com uma ou várias substituições de aminoácidos em aminoácidos que não estão dentro de uma CDR.

8. CAR específico de FLT3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende uma CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoá- cidos mostrada na SEQ ID NO: 49, 44 ou 50; uma CDR2 VH compre-

endendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 51 ou 52; e uma CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 53; e a região VL compreende uma CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 150; uma CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 151; e uma CDR3 VL compreendendo a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 152.

9. CAR específico de FLT3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende uma CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoá- cidos mostrada na SEQ ID NO: 90, 91 ou 92; uma CDR2 VH compre- endendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 93 ou 94; e uma CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 95; e a região VL compreende uma CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 171; uma CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 172; e uma CDR3 VL compreendendo a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 173.

10. CAR específico de FLT3, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende a sequên- cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6 e a região VL compre- ende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5.

11. CAR específico de FLT3, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende a sequên- cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 20 e a região VL com- preende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19.

12. CAR específico de FLT3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende uma CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoá- cidos mostrada na SEQ ID NO: 43, 44 ou 45; uma CDR2 VH compre-

endendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 46 ou 47; e uma CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 48; e a região VL compreende uma CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 147; uma CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 148; e uma CDR3 VL compreendendo a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 149.

13. CAR específico de FLT3, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende a sequên- cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4 e a região VL compre- ende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3.

14. CAR específico de FLT3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende uma CDR1 VH compreendendo a sequência de aminoá- cidos mostrada na SEQ ID NO: 60, 61 ou 62; uma CDR2 VH compre- endendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 63 ou 64; e uma CDR3 VH compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 65; e a região VL compreende uma CDR1 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 156; uma CDR2 VL compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 157; e uma CDR3 VL compreendendo a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 158.

15. CAR específico de FLT3, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a região VH compreende a sequên- cia de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10 e a região VL com- preende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 9.

16. CAR específico de FLT3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização de CD3C.

17. CAR específico de FLT3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de 4-1BB.

18. CAR de FLT3 específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende um segundo domínio de sinalização intracelular.

19. CAR específico de FLT3, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o segundo domínio de sinalização intracelular compreende um domínio 4-1BB.

20. CAR específico de FLT3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de haste entre o domínio de ligação ao ligante extracelular e o primeiro domínio transmembranar.

21. CAR de FLT3 específico, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o domínio de haste é selecionado do grupo que consiste em: uma dobradiça CD8a, uma dobradiça I9G1 e uma dobradiça FcyRllla.

22. CAR específico de FLT3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais epítopos específicos para um anticorpo monoclonal.

23. CAR específico de FLT3, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o epítopo é selecionado a partir do grupo que consiste em: um epítopo CD52, um epítopo CD20, um epí- topo CD3, um epítopo CD41, um epítopo CD25, um epítopo CD30, um epítopo EGFR, um epítopo TNFa, um epítopo VEGF, um epítopo da proteína C5 do complemento, um epítopo CD11a, um epítopo CD33, um epítopo alfa-4 integrina, um epítopo da região IgE Fc, um epítopo da proteína F RSV, um epítopo receptor da IL-6, um epítopo receptor HER2, um epítopo integrina a4B7, um epítopo BAFF (fator de ativação das células B), um epítopo IL-18B, um epítopo RANKL, um epítopo

CTLAA, um epítopo CD34, um epítopo IL-12, um epítopo IL-23 e com- binações dos mesmos.

24. CAR de FLT3 específico, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o epítopo é um epítopo espe- cificamente reconhecido por alemtuzumab, ibritumomabe tiuxetano, muromonab-CD3, tositumomab, abciximab, basiliximab, brentuximabe vedotina, cetuximab, infliximab, rizximab, bevacxizumab, eculizumab, efalizumab, gemtuzumab, natalizumab, omalizumab, palivizumab, ra- nibizumab, tocilizumab, trastuzumab, vedolizumab, adalimumab, be- limumab, canacinumab, denosumab, golimumab, ipilimumab, ofatu- mumab, panitumumab, QBEND-10 ou ustequinumab.

25. CAR de FLT3 específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que o epítopo é um epítopo CD20.

26. CAR específico de FLT3, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o epítopo CD20 compreende a se- quência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 229.

27. CAR específico de FLT3, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o CAR específico de FLT3 compre- ende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 235, 236, 237 ou 242.

28. CAR específico de FLT3, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o CAR específico de FLT3 compre- ende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 235.

29. CAR específico de FLT3, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o CAR específico de FLT3 compre- ende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 236.

30. CAR de FLT3 específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o primeiro domínio transmembranar compreende um domínio transmembranar da cadeia CD8a.

31. CAR de FLT3 específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que compreende um segundo domínio de ligação ao ligante extracelular que não é es- pecífico para FLT3.

32. CAR de FLT3 específico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o domínio (ou domínios) de ligação ao ligante extracelular, o primeiro domínio transmembranar e o domínio (ou domínios) de sinalização intracelular estão em um único polipeptídeo.

33. CAR específico de FLT3, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que compreende um segundo domínio transmembranar, em que o primeiro domínio transmembranar e o domínio (ou domínios) de ligação ao ligante ex- tracelular estão em um primeiro polipeptídeo e em que o segundo do- mínio transmembranar e o domínio (ou domínios) de sinalização intra- celular estão em um segundo polipeptídeo, em que o primeiro domínio transmembranar compreende um domínio transmembranar da cadeia a do receptor de IgE de alta afinidade (FceRI) e o segundo domínio transmembranar compreende um domínio transmembranar da cadeia y ou B de FceRI.

34. CAR específico de FLT3, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compreende um terceiro polipeptí- deo compreendendo um terceiro domínio transmembranar fundido a um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimulado- ra, em que o terceiro domínio transmembranar compreende um domí- nio transmembranar da cadeia y ou B de FceRI.

35. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compre- ende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o CAR específi- co de FLT3, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a

34.

36. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a sequên- cia de ácidos nucleicos do vetor com o número de acesso ATCC PTA-

124227.

37. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a sequên- cia de ácidos nucleicos do vetor com o número de acesso ATCC PTA-

124228.

38. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a sequên- cia de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 253.

39. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a sequên- cia de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 248.

40. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a sequên- cia de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 247.

41. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a sequên- cia de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 246.

42. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 35, ca- racterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a sequên- cia de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 245.

43. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 35 a 42.

44. Célula imunológica projetada caracterizada pelo fato de que expressa um CAR específico de FLT3, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 34.

45. Célula imunológica projetada, de acordo com a reivindi- cação 44, caracterizada pelo fato de que compreende outro CAR que não é específico para FLT3.

46. Célula imunológica projetada, de acordo com a reivindi- cação 44 ou 45, caracterizada pelo fato de que compreende um poli- nucleotídeo que codifica um polipeptídeo suicida.

47. Célula imunológica projetada, de acordo com a reivindi- cação 46, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo suicida é RQORB8.

48. Célula imunológica projetada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 47, caracterizada pelo fato de que a célu- la imunológica é derivada de um linfócito T inflamatório, um linfócito T citotóxico, um linfócito T regulador ou um linfócito T auxiliar.

49. Célula imunológica projetada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 48, caracterizada pelo fato de que com- preende um rompimento de um ou mais genes endógenos, em que o gene endógeno codifica TORa, TORB, CD52, receptor de glicocorticoi- de (GR), desoxicitidina quinase (dCK) ou uma proteína de ponto de verificação imune.

50. Célula imunológica projetada, de acordo com a reivindi- cação 49, caracterizada pelo fato de que a proteína do ponto de verifi- cação imune é morte programada-1 (PD-1).

51. Célula imunológica projetada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 50, caracterizada pelo fato de que a célu- la imunológica é obtida de um doador saudável.

52. Célula imunológica projetada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 50, caracterizada pelo fato de que a célu- la imunológica é obtida de um doador que sofre de uma doença ou dis- túrbio.

53. Célula imunológica projetada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 52, caracterizada pelo fato de ser para uso como um medicamento.

54. Célula imunológica projetada, de acordo com a reivindi- cação 53, caracterizada pelo fato de que o medicamento é para uso no tratamento de um câncer selecionado do grupo que consiste em mi- eloma múltiplo, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma nodular predominante de linfócitos linfoma de Hod- gkin, doença de Kahler e mielomatose, leucemia de células plasmáti- cas, plasmocitoma, leucemia prolinocítica de células B, leucemia de células cabeludas, linfoma não Hodgkin de células B (LNH), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (LLC), , leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia mieloide crônica (LMC), linfoma foli- cular, linfoma de Burkitt, linfoma de zona marginal, linfoma de células do manto, linfoma de células grandes, linfoma precursor de linfoblásti- co B, leucemia mieloide, macroglobulienemia de Waldenstrom, linfoma de células B grandes difusas, linfoma folicular, linfoma de zona margi- nal, tecido associado à mucosa linfoma, linfoma linfocítico de peque- nas células, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma primário de grandes células B mediastinais (tímicas), linfoma linfo- plasmático, macroglobulinemia de Waldenstrôm, linfoma das células B da zona marginal nodal, linfoma esplênico da zona marginal, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de derrame primário, gra- nulomatose linfomatoide, linfoma de células B grandes rico em células Tihistiócitos, linfoma primário do sistema nervoso central, linfoma cu- tâneo difuso primário de células B grandes (tipo perna), linfoma difuso de células B grandes positivo para EBV dos idosos, linfoma difuso de células B grandes associado à inflamação, linfoma de células B gran- des intravascular, linfoma de células B grandes positivo para ALK, lin- foma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge na do- ença de Castleman multicêntrica associada ao HHVB8, linfoma de célu-

las B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Burkitt, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Hodgkin clássico e outras células hematopoiéticas relacionadas ao câncer.

55. Célula imunológica projetada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 54, caracterizada pelo fato de que o CAR específico de FLT3 compreende um domínio extracelular compreen- dendo um ScFv, - em que o scFv se liga ao domínio extracelular de FLT3 humano com uma Kp compreendida entre 10 nM e 80 nM, ou - em que o scFv se liga ao domínio 4 do domínio extracelu- lar de FLT3 humano com uma Kp compreendida entre 1 nM e 100 nM, ou - em que o scFv se liga ao domínio 2-3 do domínio extrace- lular de FLT3 humano com uma Kp compreendida entre 5 nM e 30 nM.

56. População de células caracterizada pelo fato de que compreende células imunológicas projetadas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 44 a 55, em que (ii) a dita população de células compreende uma porcenta- gem de células de memória de células-tronco e células de memória central superior a 20%, 30% ou 40% e/ou (iii) a dita população de células atinge uma porcentagem de lise de células que expressam FLT3 maior que 10%, 20%, 30% ou 40%.

57. Método de engenharia de uma célula imunológica que expressa um CAR específico de FLT3 caracterizado pelo fato de que compreende: a. fornecer uma célula imunológica; e b. introduzir na célula pelo menos um polinucleotídeo que codifica CAR específico de FLT3, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 34; em que a célula imunológica expressa o CAR específico de FLT3.

58. Método de engenharia de uma célula imunológica ca- racterizado pelo fato de que compreende: a. fornecer uma célula imunológica; b. introduzir na célula pelo menos um polinucleotídeo que codifica CAR específico de FLT3, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 34; e c. introduzir na célula pelo menos um polinucleotídeo que codifica um CAR que não é específico para FLT3.

59. Método para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende: a. fornecer uma população de células imunológicas que expressam um CAR específico de FLT3, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 34; e b. administrar a dita população de células imunológicas ao dito indivíduo.

60. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende as células imunológicas projetadas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 44 a 52.

61. Método para tratar uma doença ou distúrbio associado ao FLT3 em um indivíduo em necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 60, ou das células imunológicas projetadas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 44 a 52.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio associado ao FLT3 é um câncer.

63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é selecionado a partir do grupo que con- siste em um mieloma múltiplo, neoplasia maligna de células plasmáti- cas, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin predominante de linfócito nodular, doença de Kahler e mielomatose, leucemia de células plas- máticas, plasmocitoma, prolinfocitose de células B leucemia, leucemia de células pilosas, linfoma não Hodgkin de células B (LNH), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia lin- focítica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMC), linfoma mieloide crônico (LMC), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma da zona marginal, linfoma de células do manto, linfoma de células grandes, lin- foma precursor de linfoblastos B, leucemia mieloide, macroglobulie- nemia de Waldenstrom, linfoglobulienemia difusa de células B gran- des, linfoma folicular, linfoma da zona marginal, linfoma de células lin- focitárias associado à mucosa, linfoma de células pequenas, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma primário de grandes células B mediastinais (tímicas), linfoma linfoplasmático, macroglobuli- na de Waldenstrôm, linfoma de células B da zona marginal nodal, lin- foma de zona marginal esplênico, linfoma de células B grandes intra- vascular, linfoma de derrame primário, granulomatose linfomatoide, linfoma de células B grandes rico em células/histiócitos, linfoma do sis- tema nervoso central primário, linfoma cutâneo primário difuso de cé- lulas B (tipo perna), linfoma difuso de células B grandes positivo para EBV dos idosos, linfoma difuso de células B grandes associado à in- flamação, linfoma de células B grandes intravascular, linfoma de célu- las B grandes positivo para ALK, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge na doença de Castleman multicêntrica associada ao HHVB8, linfoma de células B não classificado com carac- terísticas intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Burkitt, linfoma de células B não classificado com caracte- rísticas intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e clássico Linfoma de Hodgkin e outras células hematopoiéticas relacio- nadas ao câncer.

64. Método para inibir o crescimento ou progressão do tu- mor em um indivíduo que possui células malignas que expressam FLT3 caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, co- mo definida na reivindicação 60, ou das células imunológicas projeta- das, como definidas em qualquer uma das reivindicações 44 a 52, ao indivíduo.

65. Método para inibir a metástase de células malignas que expressam FLT3 em um indivíduo em necessidade do mesmo caracte- rizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica, como definida na rei- vindicação 60, ou células imunológicas projetadas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 44 a 52, ao indivíduo.

66. Método para induzir regressão tumoral em um indivíduo que possui células malignas que expressam FLT3 caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efi- caz da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 60, ou células imunológicas projetadas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 44 a 52, ao indivíduo.

67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 61 a 66, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar uma terapia analógica de nucleosídeo ao indivíduo.

68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracteriza- do pelo fato de que a terapia análoga a nucleosídeo é fludarabina ou clofarabina.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 61 a 66, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de um inibidor de Receptor Tirosina Quinase, um inibi- dor de MTOR, um modulador epigenético, um inibidor de proteassoma, um agente imunomodulador, um inibidor de Hedgehog ou um inibidor de Isocitrato Desidrogenase (IDH) ou combinação dos mesmos ao in- divíduo.

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 61 a 66, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de um inibidor de proteassoma, um agente imunomodu- lador ou um inibidor de Hedgehog ou uma combinação dos mesmos ao indivíduo.

71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 61 a 66, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de lenalidomida ao indivíduo.

72. Método para classificação in vitro de uma população de células imunológicas, em que um subconjunto da população de células imunológicas compreende células imunológicas projetadas que ex- pressam um receptor de antígeno quimérico específico de FLT3 (CAR), como definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizado pelo fato de que o método compreende: a. colocar em contato a população de células imunológicas com um anticorpo monoclonal específico para o epítopo; e b. selecionar as células imunológicas que se ligam ao an- ticorpo monoclonal para obter uma população de células enriquecidas em células imunológicas projetadas.

73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo monoclonal específico para o epítopo é conjugado com um fluoróforo e, opcionalmente, a etapa de selecionar as células que se ligam ao anticorpo monoclonal é realizada por Clas- sificação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS).

74. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracteriza- do pelo fato de que o anticorpo monoclonal específico para o epítopo é conjugado com uma partícula magnética e, opcionalmente, a etapa de selecionar as células que se ligam ao anticorpo monoclonal é realizada por Classificação Magnética de Células Ativadas (MACS).

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 72 a 74, caracterizado pelo fato de que o epítopo é um epítopo CD20.

76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracteriza- do pelo fato de que o epítopo CD20 tem uma sequência de aminoáci- dos mostrada na SEQ ID NO: 229 e, opcionalmente, o anticorpo mo- noclonal é o rituximab.

77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 72 a 76, caracterizado pelo fato de que a população de células enriquecidas em células imunológicas projetadas compreende pelo menos 70% de células imunológicas que expressam CAR FLT3.

78. Método para depleção de células imunológicas projeta- das pelo indivíduo, em que o indivíduo foi administrado com células imunológicas projetadas que expressam um receptor de antígeno qui- mérico (CAR) específico de FLT3 (CAR), como definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizado pelo fato de que o mé- todo compreende administrar ao indivíduo um anticorpo monocional específico para o epítopo.

79. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracteriza- do pelo fato de que o epítopo é um epítopo CD20.

80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracteriza- do pelo fato de que o epítopo CD20 tem uma sequência de aminoáci- dos mostrada na SEQ ID NO: 229 e, opcionalmente, o anticorpo mo- noclonal é o rituximab.

81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 78 a 80, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é conjugado com uma molécula que pode ativar o sistema de comple- mento.

82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 78 a 80, caracterizado pelo fato de que um fármaco citotóxico é acoplado ao anticorpo monoclional.

83. Método para promover a recuperação de células proge- nitoras da medula óssea que expressam FLT3 endógenas em um indi- víduo administrado com células imunológicas projetadas que expres- sam um receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de FLT3 (CAR), como definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um an- ticorpo monoclonal específico para o epítopo ao paciente.

84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracteriza- do pelo fato de que o epítopo é um epítopo CD20.

85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracteriza- do pelo fato de que o epítopo CD20 tem uma sequência de aminoáci- dos mostrada na SEQ ID NO: 229 e, opcionalmente, o anticorpo mo- noclonal é o rituximab.

86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 85, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal é conjugado com uma molécula que pode ativar o sistema de comple- mento.

87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 83 a 85, caracterizado pelo fato de que um fármaco citotóxico é acoplado ao anticorpo monoclional.