JP7241463B2 - 外因性免疫受容体を有する操作されたt細胞の濃縮のための抗体の使用及び操作されたt細胞の枯渇における使用のための抗体 - Google Patents
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操作されたT細胞の濃縮
第1の態様では、本発明は、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物から、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞を濃縮するための方法であって
a)外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物を準備する工程;
b)T細胞混合物を、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体と接触させて、抗体-操作されていないT細胞複合体の形成を可能とする工程;
c)T細胞混合物から、抗体-操作されていないT細胞複合体を分離し、それによって、操作されたT細胞が濃縮された調製物を得る工程
を含む方法に関する。
i.T細胞を準備する工程;
ii.外因性免疫受容体をコードする核酸(単数)又は核酸(複数)を準備する工程;
iii.核酸(単数)又は核酸(複数)をT細胞中へ導入して、それによって、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物を準備する工程
を含む。
を別々に、例えば、IRESによって、又は本明細書に記載の自己切断型ペプチド配列を使用することによって、コードし得る。
別の実施形態では、上記の本発明による方法は、前記方法のいずれか1つにより得ることができる操作されたT細胞が濃縮された調製物を提供する。そのような調製物は、上記方法に供されない調製物と比較して、高いパーセンテージの操作されたT細胞を含む。前記方法のいずれかにより得ることができる濃縮された操作されたT細胞のそのような調製物は、内在性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていない及び良好に操作されていないT細胞が、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体を使用してそこから分離された、濃縮された操作されたT細胞の調製物としても定義され得る。そのような調製物は、濃縮された操作されたT細胞が内因性アルファベータT細胞受容体を実質的に含まない、濃縮された操作されたT細胞の調製物としても定義され得る。そのような調製物は、濃縮された操作されたT細胞が内因性アルファベータT細胞受容体を実質的に含まず、選択可能なマーカーも含まない、濃縮された操作されたT細胞の調製物としても定義され得る。そのような調製物は、濃縮された操作されたT細胞が、内因性アルファベータT細胞受容体を実質的に含まず、選択可能なマーカーも含まず、外因性免疫受容体と結合する抗体によって選択されていない、濃縮された操作されたT細胞の調製物としても定義され得る。
別の実施態様では、上で定義された外因性免疫受容体に特異的に結合する抗体が、上記方法のいずれか1つによって得ることができる前記外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞が濃縮された調製物で処置されたときに有害事象を患う対象の処置における使用のために提供される。上で説明されたとおり、本発明の方法のいずれか1つによって得ることができる濃縮された操作されたT細胞は、医学的処置において有用である。それにもかかわらず、そのような処置は、ある場合には、投与された、濃縮された操作されたT細胞による有害な副作用をもたらし得る。副作用は、制御されない増殖又は活性化、或いは抗原の例えば、対象の健康な細胞に対する予期しない抗原の活性化であり得る。したがって、そのようなシナリオでは、対象に投与された操作されたT細胞を選択的に除去(枯渇させる)ことが望ましい。これは、操作されたT細胞、すなわち、外因性免疫受容体を含むT細胞を特異的に標的化する抗体を投与することによって達成され得る。前記抗体は、内因性アルファベータT細胞又は内因性ガンマデルタT細胞のような内因性T細胞を標的としない。この方法で、外因性免疫受容体に加えて、例えば、自殺遺伝子又は操作されたT細胞を選択的に殺滅することを可能とする他の遺伝子をコードする更なる遺伝子構築物を操作されたT細胞に含めることはもはや必要でない。
することにより、ヒト免疫受容体がマウス化され得、すなわち、ヒト免疫受容体の一部がマウス受容体の対応する部分に交換され得る。対応する部分は、例えば、図10に示されるようなヒト及びマウス配列を整列化することによって容易に得られ得る。よって、マウス化は、免疫受容体の配列の一部を、マウス起源の対応する部分で置換することを含み、そのような部分は、例えば、10~50アミノ酸の長さであるが、一部(単数)(又は一部(複数))は、2つの配列間で対応する及び異なる領域の一部である、1つ又は複数のアミノ酸も含み得る。
1.外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物から、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞を濃縮するための方法であって:
a)外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物を準備する工程;
b)T細胞混合物を、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体と接触させて、抗体-操作されていないT細胞複合体の形成を可能とする工程;
c)T細胞混合物から、抗体-操作されていないT細胞複合体を分離し、それによって、操作されたT細胞が濃縮された調製物を得る工程
を含む方法。
i.T細胞を準備する工程;
ii.外因性免疫受容体をコードする核酸(単数)又は核酸(複数)を準備する工程;
iii.核酸(単数)又は核酸(複数)をT細胞中に導入して、それによって、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物を準備する工程、
を含む、実施形態1による方法。
外因性免疫受容体、すなわち、ガンマデルタT細胞受容体を有する操作されたヒトT細胞の濃縮
Daudi、K562、MDA-MB231、BV173、OPM2及びPhoenix-Ampho細胞を、American Type Culture Collectionから得た。ご厚意により、OPM2-ルシフェラーゼ(OPM2-Luc)及びRPMI8226/S-luc (RPMI-Luc)をAnton Martensから、SCC9をNiels Bovenschenから(両者とも、University Medical Center Utrecht, The Netherlands)並びにDaudiルシフェラーゼ(Daudi-Luc)をGenmab (Utrecht, The Netherlands)から提供された。EBV-形質転換されたリンパ芽球様細胞株(EBV-LCL)(Warrenら、Tissue antigens 59, 293~303頁、(2002)は、Tuna Mutis (University Medical Center, The Netherlands)から贈与された。PBMCは、the Sanquin Blood Bank (Amsterdam, The Netherlands)から又はthe Institute for Transfusion Medicine and Immunohematology, Frankfurt, Germanyから得たバフィーコートから単離した。AML患者からのPBMCサンプルは、Matthias Theobald (Mainz, Germany)から及びthe University Medical Center Utrecht Biobankから贈与され、GCP及びヘルシンキ宣言に従って収集した。
腫瘍反応性の高いγ9δ2TCR鎖遺伝子、ガンマクローンG115及びデルタクローン5を、コンビナトリアルTCR鎖交換により得て、コドン最適化し(Geneart Life Technologies社、Regensburg, Germany)、γ鎖-IRES-ネオマイシン又はδ鎖-IRES-ピューロマイシンのいずれかを含有する単一のTCR鎖ベクターとしてのレトロウイルスベクターpBullet中にクローニングした。G115及びデルタクローン5は、配列番号3及び4に列挙した配列を含む。更に、2つの異なる2Aペプチドリンカー配列、F2A及びT2A並びにTCR鎖の順番(γ9-F2A-δ2;δ2-F2A-γ9;γ9-T2A-δ2;γ9-T2A-δ2) (Fig 1A)を交換することによって、両TCR鎖を含有する4つの異なるトランス遺伝子カセットをデザインした(Szymczakら、Nature biotechnology 22、589~594頁、(2004))。これらのTCRカセットを、最適化したレトロウイルスベクターpMP71 (Engelsら、Hum Gene Ther 14、1155~1168頁、(2003))中にクローニングして、両TCR鎖を同時に発現させた。MDM2/HLA-A2 TCR由来のアルファ鎖(Stanislawskiら、Nat Immunol 2、962~970頁、(2001))及びp53/HLA-A2 TCR由来のベータ鎖(Kuballら、Immunity 22、117~129頁、(2005))からなるナンセンスマウスTCRを、対照TCRとして、pBullet及びpMP71レトロウイルスベクター系の両方において使用した。pMP71における切断型神経成長因子受容体も、レトロウイルス形質導入実験(pM71:DNGFR)において対照として使用した。標準的な方法を使用する形質導入によって、ドナーT細胞にレトロウイルスベクターを導入した。標準的なアッセイを使用して、F2A及びT2Aが両方とも外因性γ9δ2T細胞受容体の発現をもたらし、特異的溶解を誘導し、並びに例えば、Daudi又はOPM2癌細胞株においてIFN-γ産生を誘導したことがわかった。形質導入されたドナーT細胞のFACS分析におけるγ9δ2TCRの平均蛍光強度を測定することによって決定して、ペプチドリンカーT2Aが高い発現レベルをもたらすことがわかった。更に、γ9-T2A-δ2は、最高のIFN-γ産生をもたらした。γ9-T2A-δ2ベクターを更なる実験において使用した。
pMP71: γ-T2A-δでαβT細胞に形質導入し、ビオチン標識抗αβTCR抗体(クローンBW242/412、Miltenyi Biotec社、Germany)とともにインキュベートし、その後、磁性ビーズにカップリングした抗ビオチン抗体(anti-biotin MicroBeads, Miltenyi Biotec社)とともにインキュベートした。次に、細胞懸濁液をLDカラムに添加し、αβTCR陽性のT細胞を、製造者のプロトコール(Miltenyi Biotec社)に従って、MACS細胞分離によって枯渇させた。
濃縮後、先に記載のT細胞増殖プロトコール(Riddell及びGreenberg、Journal of immunological methods 128、189~201頁、(1990))を利用して、γδTCR T細胞を増殖させた。この手順は、結果として、シングルαβTCR陽性T細胞のほぼ完全な枯渇(51%から0.4%まで)及びγδTCRシングル陽性T細胞の劇的な増加(20%から77%まで)をもたらした(図4A)。重要なのは、残ったαβTCR/γδTCRダブル陽性T細胞が、内因性αβTCRの比較的低い表面発現を特徴としたことであった。この表現型は、T細胞が高度に活性化され、増殖性である場合、刺激の5日後まで安定であった。しかしながら、T細胞がより静止状態にある場合、この表現型は、9日目にαβTCR/γδTCRダブル陽性T細胞の主要集団(68%)及びγδTCRシングル陽性T細胞の減少したパーセンテージ(25%)に変化した(図4A)。
濃縮されたγδTCR-操作されたT細胞生成物の臨床的効力を評価し、pB:γδTCR T細胞と呼ばれる、pBulletレトロウイルス形質導入方法及び抗生物質選択系(Vossら、Methods in molecular medicine 109、229~256頁、(2005))により生成したγδTCR-操作されたT細胞と比較した。末梢血αβT細胞の形質導入、抗生物質(pBullet)又は濃縮による、アルファベータTCRビーズ(pMP71)による選択及び続くT細胞増殖後に、両調製物を評価した。γδTCR陽性T細胞のパーセンテージは、濃縮されたγδTCR T細胞生成物については高かったが、細胞あたりのγδTCR複合体数も、MFIにより測定して、pB:γδTCR T細胞に比較して、2倍超に増加した。更に、3つの試験した腫瘍細胞株の溶解は、pB:γδTCR T細胞に比較して、pMP71:γ-T2A-δベクターカセットで形質導入した濃縮されたγδTCR-操作されたT細胞調製物によって亢進した。これらの調製物の抗腫瘍活性を試験するために、γδTCR-操作されたT細胞の養子移入のためのヒト化マウス腫瘍モデルにおいてインビボで試験した。
結果は、操作されたT細胞、すなわち、ガンマデルタT細胞受容体(ガンマクローンG115及びデルタクローン5)を提供されたT細胞を、アルファベータT細胞受容体に結合する抗体(BW242)を使用して濃縮することが、形質導入されていない細胞の除去を結果としてもたらすことを示す。更に、発現された外因性免疫受容体が、内因性アルファベータT細胞受容体の下方制御をもたらす。そのような濃縮された操作されたT細胞調製物は、抗腫瘍効果の改善及びアロ反応性の低減又は消失を提供する。更に、そのような濃縮された、操作されたT細胞調製物は、高度に改善されたインビボでの腫瘍制御を提供する。
外因性免疫受容体、すなわち、操作されたアルファベータT細胞受容体を有する操作されたヒトT細胞の濃縮
腫瘍特異的γδTCRの導入は、操作されたT細胞における内因性αβTCRの発現を下方制御することを示した(上記実施例1を参照されたい)。その結果として、操作されたT細胞は、操作されていないαβT細胞に比較して、その表面上の内因性αβTCRのはるかに低い密度を示す。これは、使用した外因性免疫受容体のタイプに限定されない効果である。マウスアルファベータT細胞受容体を、ヒトT細胞を操作するための外因性免疫受容体として使用した。ヒトアルファベータT細胞を、モノクローナル抗体αβTCR-mAbクローンBW242を使用するMACSによって除去した。したがって、MACSによる単離の後、マウスαβTCRを発現するように再指示されたヒトαβT細胞は、その表面上の内因性αβTCRの減少したレベルを示す(図6A、MACSの前及び後を比較する)。したがって、ヒトアルファベータT細胞受容体に特異的な抗体を使用することによって、マウスアルファベータT細胞受容体を有する操作されたT細胞を濃縮することができる。
ヒトNY-ESO-1 αβTCR、キメラNY-ESO-1 αβTCR又はヒトTCRα鎖を含むマウス化βM3を発現するJurMa細胞を、NY-ESO-1特異的ペンタマーで染色し、ペンタマー結合について陽性の細胞画分の平均蛍光強度(MFI)をフローサイトメトリーによって測定した。NY-ESO-1 完全なヒトαβTCR、完全なマウス定常領域を有するキメラNY-ESO-1 αβTCR及びヒトTCRα鎖を有するマウス化βM3は、すべて、NY-ESO-1特異的ペンタマーと結合することが示された。
BW242 MACS分離技術が、操作されたヒトアルファベータT細胞受容体を有する操作されたT細胞を濃縮するために使用できるか否かを決定した。混合細胞集団を使用した。いかなるアルファベータT細胞受容体も発現しないT細胞、野生型アルファベータT細胞受容体を発現するT細胞及び所望の特異性を有するアルファベータT細胞受容体を発現する細胞であって、この受容体が任意選択で改変されてBW242との結合を抑制する細胞を含むT細胞集団。したがって、トランスジェニックTCR、NY-ESO-1/HLA-A2-特異的αβTCRを発現するT細胞を、1:1の割合で、WT1-特異的ヒトαβTCR-トランスジェニック細胞と混合した。その後、これらの細胞混合物の精製を、αβTCR1 mAbでコーティングした免疫磁性ビーズを使用することによって評価し、未結合の細胞画分をフローサイトメトリーによって分析した(図9)。ヒト-マウスキメラαβTCR、すなわち、αhuMU/βhuMU-TCR、αhu/βM3-TCR又はαM2/βM3-TCRで改変した細胞を、混合集団から効率的に濃縮した(Vβ4染色を含むパネルを参照されたい、13%から42%までのパーセンテージ増加)一方、完全なヒトNY-ESO-1又はWT1-特異的αβTCRのいずれかを発現する細胞は、素通り画分中で検出しなかった(Vβ21染色を含むパネルを参照されたい、45%から約1%までのパーセンテージ減少)。注目すべきは、TCR陰性の細胞もmAb BW242によってそのままであるため、形質導入されない細胞は結果として生じた集団中に残留する。これは、少なくともTCRβ中のドメイン3のマウス化が、腫瘍反応性のαβTCRの濃縮には十分であることを示す。
ヒトαβTCR及びマウス化ヒトキメラαβTCRを発現するJurMa細胞を提供した(αhu/βM3)。TCRβ鎖を特異的に標的とする抗体、H57-597 (Biolegend社、San Diegeo、CA 92121から、例えば、カタログ番号109201で購入)を提供した。H57-597は、アルメニアンハムスターIgG1アイソタイプである。溶解のパーセンテージを、標準的なクロム放出アッセイを使用して評価した。マウス化ヒトαβTCRを有するJurMa細胞は、4倍の溶解増加を示した。これは、H57-597が、完全なヒトαβTCRよりもマウス化ヒトαβTCRを有するJurMa細胞を選択的に殺滅することを示す。
配列番号1~4は、TCRのアミノ酸配列を列挙する。可変領域には下線を付していない。可変領域中のイタリック配列は、CDR3領域に対応する。鎖の定常領域を、下線を付して列挙する。
Claims (6)
- 外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞が濃縮された調製物を得るための方法であって
a)
-マウス化された定常領域を含む外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞であって、内因性アルファベータT細胞受容体の発現が抑制された、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞、及び
-内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞
を含むT細胞混合物を準備する工程であって、
工程a)が、
i.T細胞を準備する工程;
ii.外因性免疫受容体をコードする核酸(単数)又は核酸(複数)を準備する工程;及び、
iii.核酸(単数)又は核酸(複数)をT細胞中に導入して、それによって、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞及び内因性アルファベータT細胞受容体を有する操作されていないT細胞を含むT細胞混合物を準備する工程、
を含む、工程;
b)T細胞混合物を、内因性アルファベータT細胞受容体に特異的に結合する抗体と接触させて、抗体-操作されていないT細胞複合体の形成を可能とする工程;
c)T細胞混合物から、抗体-操作されていないT細胞複合体を除去し、それによって、外因性免疫受容体を有する操作されたT細胞が濃縮された調製物を得る工程
を含む方法。 - 外因性免疫受容体をコードすることに加えて、核酸(単数)又は核酸(複数)が、別個に発現される選択マーカーをコードしない、請求項1に記載の方法。
- 外因性免疫受容体が、操作されたアルファベータT細胞受容体又は操作されたガンマデルタT細胞受容体である、請求項1又は2に記載の方法。
- 操作されていない及び操作されたT細胞がヒトアルファベータT細胞であり、抗体が、BW242/412であり、外来性免疫受容体が、操作されたヒトアルファベータT細胞受容体であり、ヒトアルファベータT細胞受容体の操作が、T細胞受容体ベータ鎖のドメイン3の改変を含み、改変がドメイン3のマウス化を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 外因性免疫受容体が、ガンマデルタT細胞受容体である、請求項1又は2に記載の方法。
- ガンマデルタT細胞受容体がヒトガンマデルタT細胞受容体である、請求項5に記載の方法。
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