TW202242114A - 用於獲得結合至跨膜蛋白之抗體以及抗體生成細胞的方法 - Google Patents

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Abstract

所揭示為用於獲得表現結合跨膜蛋白之抗體之細胞的方法、自此類細胞生成抗體的方法、跨膜蛋白及其片段之抗體、及編碼抗體之核酸。具體而言，本發明基於使用脂質雙層膜支架蛋白複合物，涉及用於獲得表現結合至跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞的方法，以向細胞呈現跨膜蛋白抗原。

Description

用於獲得結合至跨膜蛋白之抗體以及抗體生成細胞的方法
本發明一般涉及表現結合至跨膜蛋白之抗體的細胞、其生成方法、跨膜蛋白的抗體及其片段、以及編碼抗體的核酸。具體來說，本發明基於使用脂質雙層膜支架蛋白複合物，涉及用於獲得表現結合至跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞的方法，以向細胞呈現跨膜蛋白抗原。
跨膜蛋白，諸如G-蛋白偶聯受體（GPCR）及離子通道，是近半數所有FDA核准小分子藥物的靶點，但迄今僅有極少的抗體已被核准用於治療。參見Santo等人，自然綜述藥物發現 (Nat. Rev . Drug Disc.) 16:19 (2017)。通常，用於篩選抗體或抗體生成細胞之方法已無效或無法獲得結合跨膜蛋白的抗體。例如，分離及封裝多跨距跨膜蛋白至載體中，諸如在外溶體、類病毒顆粒以及蛋白脂質體中，不確定是否存在足量的生物活性蛋白或構象準確的跨膜蛋白。此外，表現GPCR之細胞尚未非常成功作為篩選試劑，且衍生自跨膜膜蛋白之小肽由於其缺乏構形內文而很少成功獲得相關抗體。因此，需要用於獲得及生成跨膜蛋白之抗體的新方法。
本文揭示獲得跨膜蛋白之抗體的方法，其利用脂質雙層膜支架蛋白複合物來將跨膜蛋白抗原呈現給抗體。該方法使用包含有所關注之跨膜蛋白以及天然存在之細胞膜中常見之脂質及膜支架蛋白的複合物，以在其天然構形中向抗體呈現跨膜蛋白。如此，於本揭示方法中使用脂質雙層膜支架蛋白複合物，以辨識及收集結合至天然可存取之跨膜蛋白上的表位之抗體群體（或表現抗體之細胞）、特定抗體亞群(subset)（或表現抗體之細胞），諸如，例如細胞外域或其部分。因此，本發明方法繞過了對於藉由點突變及其它已知技術進行耗時篩選、辨識及選擇表位特定抗體的需要，以確定特定抗體是否辨識出所關注之跨膜蛋白的所需部分。
在一態樣中，提供一種用於獲得針對所關注之跨膜蛋白表現抗體之抗體或細胞群的方法，其包含將一抗體生成細胞群體與呈現所關注之跨膜蛋白或其部分的脂質雙層膜支架蛋白複合物接觸。
在一些實施例中，該方法包含使抗體生成細胞群體與涵蓋所關注之跨膜蛋白或其部分之脂質雙層膜支架蛋白複合物接觸，以允許由複合物呈現之跨膜蛋白抗原與細胞表面上之抗體之間的結合，並收集結合之抗體生成細胞。
在一些實施例中，抗體生成細胞群體是由一種特定類型組織、器官或細胞之細胞組成的均質細胞群體。在其它實施例中，抗體生成細胞群體是由來自超過一種類型之組織、器官或細胞之細胞組成的異質細胞群體。在某些實施例中，抗體生成細胞群體包含來自脾臟、淋巴結、骨髓或其它器官中之一或多者的組織衍生細胞。在一些實施例中，抗體生成細胞群體包含淋巴細胞。在特定實施例中，抗體生成細胞群體包含血液細胞。在某些實施例中，抗體生成細胞群體包含周邊血球、B細胞、漿細胞、漿細胞骨髓瘤或其組合。在特定實施例中，抗體生成細胞群體為B細胞的群體。在一個實施例中，抗體生成細胞群體係由記憶B細胞所構成。在一個實施例中，抗體生成細胞群體包含重組細胞，諸如，例如融合瘤。
在一些實施例中，該方法包含自動物獲得抗體生成細胞群體。在某些實施例中，抗體生成細胞群體係自在用所關注之跨膜蛋白或編碼相同之核酸免疫原免疫接種之後製造針對所關注跨膜蛋白之抗體的動物獲得。在某些實施例中，該動物或經免疫接種的動物為哺乳動物。在一些實施例中，哺乳動物為小鼠、大鼠、山羊、人類、倉鼠、豬、猴或天竺鼠。在一些實施例中，該哺乳動物不是人類。在特定實施例中，非人類哺乳動物為小鼠、大鼠或山羊。在特定實施例中，該哺乳動物為小鼠。在該等方法的另一實施例中，哺乳動物為人類，諸如，例如，已暴露於免疫原之人類。
在某些實例中，動物經免疫接種。在某些實施例中，該經免疫接種地動物係經基因工程改造。舉例而言，動物可為經基因工程改造之動物，使得動物不自內源基因座表現所關注之跨膜蛋白。在某些實施例中，經基因工程改造之動物為非人類哺乳動物，諸如，例如小鼠、山羊或大鼠，其包含編碼人類免疫球蛋白重鏈(IgH)及人類免疫球蛋白輕鏈(IgL)可變區域的核酸序列。在一些實施例中，經基因工程改造的動物包含編碼人類免疫球蛋白重鏈及人類免疫球蛋白輕鏈可變區的核酸序列，且亦缺少編碼所關注跨膜蛋白之內源性基因。在特定實施例中，經免疫接種、經基因工程改造之動物為小鼠或大鼠，諸如，例如包含人類化IgH基因座及/或人類化Igκ輕鏈基因座的VELOCIMMUNE ®小鼠。在一些實施例中，經免疫接種、經基因工程改造之動物為包含人類化IgH基因座及人類化Igκ輕鏈基因座的小鼠，其缺少編碼所關注之跨膜蛋白之內源性小鼠基因。在一個實施例中，一種經基因工程改造之小鼠，其包括有編碼人類免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白λ輕鏈（Igλ）可變區之DNA。在一特定實施例中，經基因工程改造之小鼠包括編碼人類免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白λ輕鏈(Igλ)可變區之DNA，且亦缺少編碼所關注之跨膜蛋白之內源性小鼠基因。
在一些實施例中，抗體生成細胞係從使用所關注的免疫原之跨膜蛋白進行免疫接種的動物獲得。在某些實施例中，動物已經以編碼所關注之跨膜蛋白之至少一部分的核酸免疫接種，或用所關注之跨膜蛋白之至少一部分免疫接種。在一些實施例中，動物已用編碼所關注之全長跨膜蛋白的核酸進行免疫接種。在其它實施例中，動物已用編碼一部分所關注之跨膜蛋白之核酸進行免疫接種。在特定的實施例中，該核酸不編碼所關注之全長跨膜蛋白的胺基端及/或羧基端部分。在其他實施例中，動物已用編碼所關注之跨膜蛋白或其部分之核酸免疫接種，該核酸涵蓋於能表現核酸之載體中，諸如例如質體、表現載體、類病毒顆粒(VLP)、細胞、外溶體及脂質體。在一些實施例中，動物已用所關注之跨膜蛋白或其部分免疫接種。在某些實施例中，該動物已用所關注之全長跨膜蛋白進行免疫接種。在特定實施例中，所關注免疫原之跨膜蛋白係經截短，且不包含所關注之全長跨膜蛋白的胺基端及/或羧基端部分。在某些實施例中，所關注的跨膜蛋白或核酸免疫原係經修飾以包含一或多個可偵測的元件，諸如標記、標記物或特徵。在一些實施例中，該免疫原包括可偵測標記。在特定實施例中，可偵測標記為FLAG標籤、組胺酸標籤（His標籤）、Avi標籤、BirA標籤或其組合。在一些實施例中，所關注的免疫原之跨膜蛋白具有FLAG標籤及His標籤。在特定實施例中，可偵測標記或標記位於免疫原之胺基端或羧基端。在特定實施例中，動物已經以涵蓋在脂質雙層膜支架蛋白複合物中的所關注的跨膜蛋白或其部分進行免疫接種。
在某些實施例中，動物係以編碼所關注之嵌合跨膜蛋白之核苷酸序列免疫接種，其包括所關注之人類跨膜蛋白的一部分，其可操作地連接至所關注之跨膜蛋白之非人類同源物的一部分。非人類同源物可來自例如人類、黑猩猩、萊茵猴、兔、馬、綿羊、大鼠、小鼠、犬、雞或山羊。 在某些實施例中，編碼所關注之嵌合跨膜蛋白的核苷酸序列亦包含編碼可偵測元件（諸如，例如His標籤、FLAG標籤、Avi標籤或Bir-A標籤）之核苷酸序列。在其它實施例中，動物係用所關注之嵌合跨膜蛋白或其部分免疫接種，其包含所關注之人類跨膜蛋白的一部分，其可操作地連接至所關注之跨膜蛋白之非人類同源物的一部分。在一個實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含可偵測元件，諸如，例如His標籤、FLAG標籤、Avi標籤或Bir-A標籤。
在某些實例中，動物係以兩種或更多種免疫原免疫接種，諸如，例如，蛋白或肽、諸如DNA或RNA之核酸序列、經修飾之蛋白或編碼DNA、VLP及含有所關注之跨膜蛋白或其部分的脂質雙層膜支架蛋白複合物。
該方法包含將抗體生成細胞群體與涵蓋所關注之跨膜蛋白或其部分之脂質雙層膜支架蛋白複合物接觸，以獲得表現與所關注之跨膜蛋白結合之抗體的抗體生成細胞群體。
該脂質雙層膜支架蛋白複合物包含至少一種膜支架蛋白(MSP)及脂質。在一些實施例中，該脂質雙層膜支架蛋白複合物包含至少一種MSP及複數個脂質。在某些實施例中，該脂質雙層膜支架蛋白複合物包含至少二種或剛好二種MSP。在其它實施例中，該脂質雙層膜支架蛋白複合物包含三個或更多種MSP。在某些實例中，該脂質雙層膜支架蛋白包含至少一種膜支架蛋白，諸如MSP1E3D1、MSP1D1、MSP2N3及MSP2N2。在一實施例中，該脂質雙層膜支架蛋白複合物包括兩個MSP1E3D1蛋白。在一些實施例中，多個MSP相同。在其它實施例中，脂質雙層膜支架蛋白複合物中之多個MSP為不同的。
在一些實施例中，脂質雙層膜支架蛋白複合物含有至少一個經標記之含有可偵測元件（諸如標籤、標記物或特徵）的MSP。在特定實施例中，該脂質雙層膜支架蛋白複合物含有兩個經標記之MSP及脂質雙層。在一些實施例中，MSP蛋白包括可偵測標記，諸如螢光團。在特定的實施例中，可偵測的元件是位於複合物之一或多種MSP上的BirA標籤或Avi標籤。在例示性實施例中，一或多種MSP係藉由化學生物素化MSP，或藉由將Avi標籤引入至MSP編碼序列中進行生物素化。
該脂質雙層膜支架蛋白複合物亦包含複數個脂質，諸如神經脂質及/或磷脂質。複合物的脂質雙層可由單類型脂質或多種類型的脂質組成。在一些實施例中，脂質雙層膜支架蛋白複合物包含在膜支架蛋白周圍形成圓盤形「盤狀」磷脂雙層之脂質。在某些實施例中，該脂質雙層係由以下脂質中的一或多者組成：神經鞘磷脂、卵磷脂及其衍生物。在特定實施例中，脂質雙層係包括1-二油醯基卵磷脂(DOPC)、1-棕櫚醯基 2-油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、1-硬脂醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼(SOPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)及磷脂醯絲胺酸(PS)及磷脂醯肌醇(PI)或其組合。在一例示性實施例中，脂質雙層包含複數個POPC磷脂質。
用於該方法中的脂質雙層膜支架蛋白複合物亦包含至少一個所關注之跨膜蛋白或其部分，其藉由複合物作為可與抗體生成細胞生成的抗體結合的抗原，而呈現給細胞群。複合物所呈現之所關注之跨膜蛋白可為具有至少一個細胞外域及至少一個跨膜結構域之天然存在的蛋白。在一些實施例中，由該複合物呈現之所關注之跨膜蛋白為人類蛋白。在其它實施例中，所關注之跨膜蛋白為非人類蛋白，諸如小鼠、大鼠、靈長類、倉鼠、細菌、病毒蛋白質或類似物。在某些實施例中，所關注之跨膜蛋白係自其天然存在形式修飾而得。所關注之例示性之經修飾跨膜蛋白可包含以下一或多個對其天然胺基酸序列之改變：胺基酸取代、胺基酸缺失、胺基酸插入。在一個實施例中，所關注之跨膜蛋白係經修飾以缺失，亦即，「截短」部分跨膜蛋白，諸如，例如，全長蛋白之N端及/或C端結構域。在一些實施例中，結合於脂質雙層膜支架蛋白複合物中之所關注之跨膜蛋白包含胺基端、一或多個細胞外環結構域、一或多個跨膜結構域、一或多個細胞內域、C端或其組合中之穩定突變。在一個實施例中，所關注之跨膜蛋白為配位體活化蛋白，其中該所關注之跨膜蛋白在配位體存在或不存在下改變構形（亦即，具有活化與非活化狀態）。在另一實施例中，結合於脂質雙層膜支架蛋白複合物中之所關注之跨膜蛋白為嵌合蛋白，其包含所關注之人類跨膜蛋白的一部分，其可操作地連接至所關注之跨膜蛋白之非人類同源物的一部分。在某些實施例中，所關注之跨膜蛋白包含可偵測元件，諸如，例如，His標籤、FLAG標籤、Avi標籤、Bir-A標籤或其組合。在特定實施例中，由該複合物呈現之所關注之跨膜蛋白包含His標籤及FLAG標籤。
在某些實例中，所關注之跨膜蛋白為GPCR蛋白、四跨膜蛋白或離子通道蛋白。在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白為GPCR蛋白，諸如，例如CCR5、ADORA2A、ADRB3、C3AR1、ADRA2A、GLP1R、CCR4、CCR8及CXCR4。在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白為CCR5或其部分。在一些具體例中，所關注之跨膜蛋白為ADRA2A或其部分。在某些實施例中，所關注之跨膜蛋白為ADORA2A或其部分。在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白為C3AR1或其部分。
在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白為四跨膜蛋白，諸如，例如TSPAN 1到TSPAN19、TSPAN21、TSPAN23、TSPAN 31、TSPAN 32、TSPAN 33、UPK1B、PRPH2、CD151、CD53、CD37、CD82、CD63、CD81、CD9、CD82、CD63、CLND6及CLND9。在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白為CD63或其部分。在其他實施例中，所關注之跨膜蛋白為離子通道蛋白，諸如，例如，電壓門控離子通道蛋白。在特定的實施例中，電壓門控離子通道蛋白為電壓依賴性鈣通道或電壓門控鉀通道蛋白。在一些實施例中，離子通道蛋白為鈣活化鉀通道蛋白、鈉通道蛋白、鈣通道蛋白或氯化物通道。在該等方法之特定實施例中，所關注之跨膜蛋白為離子通道蛋白，諸如，例如，BKCa、 MaxiK、Sk、NaV1、CACNG1、CAV、CIC或暫態受體電位通道蛋白(TRP)。在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白為NaV1蛋白或其部分。在特定實施例中，所關注之跨膜蛋白為NaV1.7蛋白或其部分。在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白為CACNG1蛋白或其部分。
在該等方法的某些實施例中，該複合物所呈現之所關注之跨膜蛋白結合至抗體生成細胞之細胞表面上的抗體。在一些實施例中，該抗體結合至位於所關注之跨膜蛋白之特定域上之表位（存在於所關注之跨膜蛋白上的結合域），諸如，例如所關注之跨膜蛋白之細胞外域。在特定實施例中，該抗體結合至位於所關注之跨膜蛋白之N端結構域之細胞外部分的表位。在一些實施例中，該抗體結合至位於所關注之跨膜蛋白之細胞外環上的表位或所關注之跨膜蛋白之C端結構域之細胞外部分。在某些實施例中，該抗體結合至所關注之跨膜蛋白之C端結構域的表位。在一些實施例中，該抗體結合至位於所關注之跨膜蛋白之細胞外環上的表位。在一些實施例中，該抗體結合至位於所關注之跨膜蛋白之細胞內域上的表位。
該方法亦可包含將抗體生成細胞群體與可偵測元件接觸，該可偵測之元件結合至所關注之蛋白或生物標記物之細胞表面。舉例而言，自經免疫接種之動物獲得之抗體生成細胞的異源族群可與結合至B細胞表面蛋白（例如IgG）之螢光標記抗體接觸。藉由偵測抗體與B細胞之間的結合且自群體分離結合細胞，抗體生成細胞B細胞之亞群可隨後自群體獲得。在某些實施例中，抗體生成細胞群體可與螢光標記之抗體接觸，該抗體結合至B細胞表面蛋白同時使細胞與含有所關注之跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物接觸，或細胞可於不同時間點接觸。
在某些實施例中，該等方法亦可包含使抗體生成細胞群體與阻斷劑接觸。舉例而言，抗體生成細胞群體可與分子（諸如，辨識或結合至所關注之跨膜蛋白的一部分、MSP蛋白之一部分或可偵測標記（諸如His標籤或FLAG標籤）之肽或化合物）接觸。在此類實施例中，抗體生成細胞係與一或多種阻斷劑一起培育，以容許阻斷劑與抗體生成細胞所製造之抗體之間的結合，其結合位於阻斷劑上的表位。
該方法亦可包含洗滌一群細胞（諸如抗體生成細胞），持續一段時間以自結合細胞移除未結合材料或細胞。
抗體生成細胞所生成的抗體與脂質雙層膜支架蛋白複合物所呈現之存在於所關注之跨膜蛋白上之結合域（表位）之間的結合可被偵測，且可收集與跨膜蛋白結合之抗體生成細胞。舉例而言，在一些實施例中，結合係藉由所關注之跨膜蛋白之構形變化、細胞中所關注之跨膜蛋白之活化或失活，或藉由使用一或多個可偵測標記物來偵測。在某些實施例中，使用用於單細胞分離的高通量技術，諸如螢光活化細胞分選（FACS），可偵測呈現與所關注跨膜蛋白抗原結合之抗體的抗體生成細胞，並從群體中之其它抗體生成細胞分離。在一個實施例中，FACS係藉由偵測由附著在其所包含之複合物或所關注之跨膜蛋白的可偵測標記所發射之信號，用來辨識及分離經結合至脂質雙層膜支架蛋白複合物所呈現之所關注之脂質的跨膜蛋白的單抗體生成細胞。在特定實施例中，該信號由以下一或多個可偵測標記發射：生物素/鏈黴親和素-PE複合物或螢光分子。
該方法亦可包含自抗體生成細胞獲得或分離抗體或編碼抗體之核酸。
在某些實施例中，編碼抗體（例如基因）或其部分之核酸係從抗體生成細胞分離而得。在一些實施例中，核酸編碼抗體之可變域。在某些實施例中，核酸編碼抗體重鏈或其片段。在其它實施例中，核酸編碼抗體輕鏈或其片段。在某些實例中，自抗體生成細胞分離的核酸編碼全長抗體。在一些實施例中，該方法包含自抗體生成細胞、包括有編碼細胞表現之抗體重鏈可變區之核苷酸序列的核酸、及包括有編碼細胞表現之抗體之輕鏈可變區的核苷酸序列的核酸分離。
在該等方法的某些實施例中，編碼抗體之核酸在宿主細胞中表現。在一些實施例中，包括有核酸之宿主細胞係在表現全長抗體之條件下培養，且隨後可製造該抗體且分離以用於進一步使用。在某些實施例中，宿主細胞包括編碼抗體之可變域的核酸，且細胞在表現可變域之條件下培養。在一些實施例中，宿主細胞包括編碼抗體之可變重鏈(V H) 結構域的核酸，且細胞在表現V H結構域之條件下培養。在一些實施例中，宿主細胞包括編碼抗體之可變輕鏈(V L) 結構域的核酸，且細胞在表現V L結構域之條件下培養。在特定實施例中，宿主細胞包括編碼抗體之V H結構域的核酸及編碼抗體之V L結構域的核酸，且細胞在表現V H結構域及V L結構域之條件下培養。
因此，在本發明之一個態樣中，提供包含編碼特異於使用本揭示之方法所分離之所關注之跨膜蛋白的抗體之核酸分子。在一些實施例中，提供一種細胞，其包括編碼特異於所關注之跨膜蛋白之抗體之可變重鏈（V H）結構域的核酸。在一些實施例中，提供一種細胞，其包括編碼特異於所關注之跨膜蛋白之抗體之可變輕鏈（V L）結構域的核酸。在一些實施例中，提供一種細胞，其包括編碼特異於所關注之跨膜蛋白的抗體之V H結構域的核酸，及編碼該抗體之V L結構域的核酸。在一些實施例中，該細胞為真核細胞。在某些實施例中，該細胞為哺乳動物細胞。在一實施例中，該細胞可為以下細胞類型中之一或多者：中國倉鼠卵巢（CHO）細胞（例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO）、COS（例如COS-7）、腎臟（例如HEK293、293 ESN、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21）、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431（表皮）、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0及MMT細胞以及腫瘤細胞。在一些實施例中，該細胞為CHO細胞。
所揭示方法之此等及其他目的、特徵及優點將由於與附圖結合而得之方法之各種態樣於以下詳細描述而變得顯而易見。
相關申請案之交互參考
本申請案主張2020年12月23日申請之美國臨時申請案第63/130,044號之優先權，其全部內容經由引用併入本文。 序列表的結合參照
ASCII文本檔案中的序列表(名為36526_10465TW01_SequenceListing.txt，30 KB)，創建於2021年12月7日，並藉由EFS-Web提交至美國專利商標局，在此經由引用併入本文。
本發明所揭示為利用脂質雙層膜支架蛋白複合物來將跨膜蛋白抗原呈現給細胞所製造之抗體的方法。脂質雙層膜支架蛋白複合物包含所關注之跨膜蛋白或其部分，以及通常在自然存在之細胞膜中發現的脂質及膜支架蛋白，從而以其天然構象向抗體呈現跨膜蛋白抗原。因此，在本發明方法中使用脂質雙層膜支架蛋白複合物，以辨識及收集群體中的特定抗體亞群（或表現抗體的細胞），其與自然界可獲得的跨膜蛋白上之表位結合，諸如，例如細胞外域。
不侷限於任一理論，本發明所揭露的方法顯示使用呈現所關注抗原之跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物進行免疫接種的動物，及從經免疫接種的動物中分離出的抗體生成細胞，可以辨識對構象準確的跨膜蛋白上的表位生成特異性抗體的細胞。
此外，抗體及編碼抗體之核酸可藉由例如單細胞分離及收集技術(諸如FACS)直接從抗體生成細胞中分離。因此，本發明亦提供一種有效和高效的方法，其用於直接從抗體生成細胞群中獲得對跨膜蛋白具有親和性的抗體。藉由點突變及其他已知技術，該方法繞過耗時篩選、辨識及選擇表位特定抗體的需要，以確定特定抗體是否辨識所關注之跨膜蛋白之所需部分。
在本發明之一個態樣中，提供一種獲得表現特異於所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體或細胞群的方法，其包括將抗體生成細胞群與呈現所關注之跨膜蛋白或其部分之脂質雙層膜支架蛋白複合物接觸。在一個實施例中，該方法包含將自動物獲得之抗體生成細胞群體與涵蓋所關注之跨膜蛋白或其部分之脂質雙層膜支架蛋白複合物接觸，以容許跨膜蛋白（即，抗原）與細胞表面上之抗體之間的結合，並收集細胞群體中之結合抗體生成細胞。
在下列描述中，將遵循有關術語使用的某些慣例。一般而言，本文中所使用之術語意欲與那些本領域具有通常知識者所已知的術語之含義一致地解釋。在實踐本發明時，使用符合本技術領域之分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學、及免疫學中之許多習知技術。這些技術更詳細描述於，例如，分子選殖：實驗指南(Molecular Cloning: a Laboratory Manual)第4版，J.F. Sambrook與D.W. Russell編制，冷泉港實驗室出版物2012；免疫療法重組抗體（Recombinant Antibodies for Immunotherapy），Melvyn Little編制，劍橋大學出版物2009年；「寡核苷酸的合成（Oligonucleotide Synthesis）」（M. J. Gait編制，1984）；「動物細胞培養（Animal Cell Culture）」（R. I. Freshney編制，1987）；「酵素學方法(Methods in Enzymology)」（學術出版社公司）；「分子生物學的當前協定（Current Protocols in Molecular Biology）」（F. M. Ausubel等人編制，1987，並定期更新）；「PCR：聚合酶鏈反應（PCR:The Polymerase Chain Reaction）」，（Mullis等人編制，1994）；「分子選殖實踐指南（A Practical Guide to Molecular Cloning）」（Perbal Bernard V.，1988）；「噬菌體展示技術：實驗室手冊（Phage Display:A Laboratory Manual）」（Barbas等人，2001）。這些參考文獻和其他包含標準協定之參考文獻的內容為本領域的技術人員廣泛知曉並依賴，包含有製造商的說明，其在此藉由引用併入作為本發明的一部分。 免疫生成抗體生成細胞
動物免疫接種可藉由本領域中已知之任何方法完成。參見例如E. Harlow及D. Lane「抗體實驗室手冊，冷泉港(Antibodies A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor)」（1988）；Malik及Lillehoj，抗體技術：學術出版社（Antibody techniques:Academic Press），1994，CA。舉例而言，免疫原可以經由各種途徑（包含但不限於靜脈內或腹膜內注射)伴隨或未伴隨佐劑直接向動物（諸如哺乳動物）投與，其中佐劑可有助於刺激免疫反應。本領域已知的佐劑包含但不限於，完整和不完整的弗氏佐劑、MPL+TDM 佐劑系統(Sigma)、或RIBI（胞壁醯二肽）。參見Human Press，(2000) NJ的O'Hagan，疫苗佐劑。術語「免疫原」係指包括有抗原（諸如，所關注之跨膜蛋白或編碼其之核酸）之組成物，其抗原特異性抗體係藉由宿主免疫反應生成。術語「抗原」係指能與結合劑（諸如抗體或其片段）結合之分子或分子的一部分。抗原亦可用於製造可與各抗原之表位結合的抗體。
免疫原可做為蛋白質、編碼蛋白質或其片段的核酸序列、肽片段、蛋白融合或藉由含有所關注之免疫原編碼基因或蛋白免疫原或其肽片段的載體向宿主動物投與。在活體內使用宿主的細胞表現機制，免疫接種過程可誘發來自宿主的免疫反應並表現抗原（諸如所關注之跨膜蛋白）。
各種免疫接種技術為本領域中已知的，且可用於進行該方法。舉例而言，動物可藉由注射免疫原(諸如編碼所關注之跨膜蛋白之至少一部分之核酸、所關注之跨膜蛋白之至少一部分、包含此類核酸、所關注之跨膜蛋白或其部分的載體)來免疫接種。
在某些實例中，動物係以編碼所關注之跨膜蛋白或其部分之核酸免疫接種。在某些實施例中，動物係以編碼所關注之全長跨膜蛋白之核酸免疫接種。在特定實施例中，動物係以編碼所關注之全長人類跨膜蛋白之核酸免疫接種。在其它實施例中，動物係以編碼所關注之全長非人類跨膜蛋白之核酸免疫接種。在特定實施例中，動物係以編碼所關注之全長小鼠跨膜蛋白之核酸免疫接種。
術語「核酸」或「核酸序列」或「核苷酸序列」係指單股或雙股形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋包含有已知核苷酸類似物或經修飾之骨架殘基或鍵結的核酸，其為合成的、天然存在的及非自然存在的，其具有與參考核酸相似的結合特性，且係以與參考核苷酸相似的方式代謝。術語「編碼核酸」或「編碼之核酸」係指編碼胺基酸序列，諸如肽、蛋白質、可偵測元件或標籤及/或調節元件之DNA或RNA序列。「基因」係指編碼包括一或多種多肽、蛋白質或酶之全部或部分的胺基酸序列的DNA核酸序列，且可以或可不包含內含子以及調節DNA序列，諸如，啟動子或增強子序列、5'-非轉譯區或3’-非轉譯區，其影響了例如，基因或基因製品表現的條件。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中係用以指經由肽鍵連接之胺基酸殘基的聚合物。該術語包含胺基酸聚合物，其中一或多種胺基酸殘基係對應天然存在之胺基酸以及天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物的人工化學模擬物。術語「蛋白質」係指大型多肽。舉例而言，在本發明中，蛋白質可為全長或內源性蛋白。術語「肽」通常係指短多肽，諸如，例如蛋白質或多肽之片段或部分。如本文所用，多肽或蛋白質之「片段」或「部分」係指小於全長多肽或蛋白表現製品之任何多肽部分。片段或部分可「截短」或全長蛋白之缺失類似物，其中已自全長蛋白移除一或多個胺基酸殘基。舉例而言，在本發明中，肽可描述為「截短蛋白」或「蛋白之部分」或「蛋白之片段」。在某些實例中，所關注之跨膜蛋白的「部分」包含所關注之跨膜蛋白的至少整個跨膜部分。「截短蛋白」可為所關注之跨膜蛋白的一部分，其不包含全長蛋白之胺基端及/或羧基端部分。合成多肽、肽及蛋白質可例如使用自動化多肽合成器或藉由本領域中已知之重組技術合成。
術語「跨膜蛋白」及「所關注之跨膜蛋白」在本文中可交替使用，意指其附接至細胞或胞器的膜上並嵌入其中的 蛋白質或其多肽部分。因此，跨膜蛋白為穿越膜且因此由至少一個跨越結構域之膜構成的蛋白質。在一些實例中，該跨膜蛋白亦包含至少一個細胞質結構域及/或至少一個細胞外結構域。細胞質結構域可為胺基端結構域、羧基端結構域及細胞內循環結構域之一或多者。細胞外結構域可為胺基端結構域、羧基端結構域及細胞外環結構域中之一或多者。在一些實例中，所關注之跨膜蛋白之細胞外域包含N端細胞外域、C端細胞外域、及/或在所關注之跨膜蛋白之一或多個跨膜域之間的細胞外環結構域。跨膜蛋白可為衍生自任何生物體(包含但不限於原核生物、真核生物及病毒)之天然存在之蛋白。在某些實施例中，跨膜蛋白可為人類、黑猩猩、萊茵猴、兔子、馬、綿羊、大鼠、小鼠、犬、雞或山羊蛋白。在某些實例中，該跨膜蛋白為哺乳動物蛋白，諸如人類、小鼠、大鼠或靈長類跨膜蛋白。在特定實施例中，所關注之跨膜蛋白為人類蛋白。在特定實施例中，所關注之跨膜蛋白為非人類蛋白。在一個實施例中，所關注之跨膜蛋白為小鼠蛋白。
在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白係如本文所描述來修飾。所關注之例示性之經修飾跨膜蛋白可包含以下一或多個對其天然胺基酸序列之改變：胺基酸取代、胺基酸缺失、胺基酸插入。在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白係經修飾以缺失，即，「截短」部分跨膜蛋白，諸如，例如全長蛋白之n端及/或c端結構域。在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白包含胺基端、一或多個細胞外環結構域、一或多個跨膜結構域、一或多個細胞內域、c端或其組合中之穩定突變。在某些實施例中，該跨膜蛋白為嵌合跨膜蛋白。在某些實施例中，所關注之經修飾跨膜蛋白包含一或多個可偵測元件，諸如，例如，His標籤、FLAG標籤、Avi標籤或Bir-A標籤。在特定實施例中，所關注之跨膜蛋白包含His標籤及FLAG標籤。
在一些實施例中，跨膜蛋白為配位體活化蛋白，其中該跨膜蛋白在配位體存在或不存在（即，具有活化及非活化狀態）下改變構形。舉例而言，配位體活化跨膜蛋白可結合至細胞內或細胞外結構域上之配位體，由此結合引起了一或多個結構域中的構象變化，這調節細胞中的信號傳輸。在某些實例中，所關注之跨膜蛋白為溶質載體轉運蛋白（SLC）、受體、具有激酶活性之受體、第I型生長因數受體、G蛋白偶聯受體（GPCR）、離子通道蛋白或四跨膜蛋白。在某些實例中，所關注之跨膜蛋白為GPCR蛋白、四跨膜蛋白或離子通道蛋白。在一個實施例中，所關注之跨膜蛋白為SLC蛋白。
在一個實施例中，所關注之跨膜蛋白為GPCR蛋白。用於本發明方法中的多個GPCR為本領域中所熟知的。參見例如Foord等人，藥理學評論 （ Pharmacol . Rev.）（2005） 57：279-288，其全部於本文中以參考文獻方式納入。因此，GPCR可為腺苷受體、β腎上腺素受體、神經緊張素受體、蕈毒鹼酸受體、5-羥色胺受體、腎上腺素受體、過敏毒素受體、血管張力素受體、愛帕琳肽受體、鈴蟾素受體、舒緩肽受體、大麻受體、趨化激素受體、膽囊收縮素受體、多巴胺受體、內皮素受體、遊離脂肪酸受體、膽酸受體、甘丙胺素受體、腸動素受體、飢餓肽受體、醣蛋白荷爾蒙受體、GnRH受體、組織胺受體、衍生自KiSS1的肽受體、白三烯和脂氧素受體、水解磷酯受體、黑色素-濃縮荷爾蒙受體、黑皮質素受體、褪黑激素受體、神經調節素U受體、神經肽受體、N-甲醯化勝肽家族受體、菸鹼酸受體、鴉片類受體、視紫蛋白樣受體、食慾激素受體、P2Y受體、肽P518受體、血小板活化因數受體、前動力蛋白受體、泌乳素釋放肽受體、前列腺類受體、蛋白酶活化受體、鬆弛素受體、生長抑制素受體、SPC/LPC受體、速激肽受體、微量胺基受體、促甲狀腺素釋放荷爾蒙受體、尾加壓素受體、血管收縮素/催產素受體、孤GPCR、鈣調節激素受體、促皮質素釋放因子受體、升糖素受體、副甲狀腺受體、VIP/PACAP受體、LNB7TM受體、GABA受體、代謝型麩胺酸受體、以及鈣感應器受體中之任一者。
在某些實施例中，所關注之跨膜蛋白為GPCR蛋白，諸如，例如CCR5、ADORA2A、ADRB3、C3AR1、ADRA2A、GLP1R、CCR4、CCR8及CXCR4。在一特定實施例中，該跨膜蛋白為選自以下GPCR蛋白之GPCR蛋白：CCR5、ADORA2A、ADRB3、C3AR1、ADRA2A、GLP1R、CCR4、CCR8或CXCR4。在一個實施例中，跨膜蛋白為CCR5。在另一實施例中，跨膜蛋白為ADORA2A。在其它實施例中，跨膜蛋白為C3AR1。在又另一個實施例中，跨膜蛋白為ADRA2A。在其它實施例中，跨膜蛋白為GLP1R。
在某些實例中，跨膜蛋白為四跨膜蛋白。在某些實例中，所關注之跨膜蛋白為四跨膜蛋白，諸如，例如TSPAN 1 到TSPAN19、TSPAN21、TSPAN23、TSPAN 31、TSPAN 32、TSPAN 33、UPK1B、PRPH2、CD151、CD53、CD37、CD82、CD81、CD9、CD63、TCD63、CLND6及CLND9。在一些實施例中，跨膜蛋白為CD63。在另一實施例中，CLDN6。在其它實施例中，跨膜蛋白為CLDN9。
在其它實施例中，所關注之跨膜蛋白為離子通道蛋白。在一個實施例中，離子通道蛋白為電壓門控離子通道蛋白。在一特定具體例中，電壓門控離子通道蛋白為電壓依賴性鈣通道γ-1次單元(CACNG1)或電壓門控鉀通道蛋白，諸如，例如KVS或KIRS。在其它實施例中，該離子通道蛋白為鈣活化鉀通道蛋白（例如，BKCa、MaxiK或Sk）、電壓門化鈉通道蛋白，諸如，例如NaV1蛋白（例如，電壓門控通道α次單元9 (NaV1.7)、電壓門控通道α單元2 (NaV1.2)、鈣通道蛋白（例如，CAV）、或氯通道蛋白（例如，CIC）。在一些實施例中，離子通道蛋白為暫態受體電位通道(TRP)蛋白。在特定實施例中，TRP為典型跨膜蛋白(TRPC)、辣椒素受體(TRPV)、美拉司他汀(TRPM)、多囊蛋白(TRPP)、黏脂蛋白(TRPML)或跨膜錨蛋白1 (TRPA1)，諸如典型TRP(TRPC)、辣椒素受體(TRPV)、美拉司他汀(TRPM)、多囊蛋白(TRPP)、黏脂蛋白(TRPML)、跨膜錨蛋白1 (TRPA1)。在一特定實施例中，所關注之跨膜蛋白為BKCa、MaxiK、Sk、NAV 1.7、CACNG1、CAV、CIC或TRP。
在某些實施例中，所關注的跨膜蛋白為電壓門控鈉通道蛋白。該電壓門控鈉通道家族具有九個已知成員，其中跨膜段及細胞外環區域中的胺基酸具有大於50%一致性。這些通道的蛋白質被命名為NaV1.1至NaV1.9，一般稱為「NaV1蛋白」，編碼NaV1.1至NaV1.9的基因名稱稱為 Scn1a至 Scn11a。NaV1蛋白中之每一者具有四個重複結構域，每一者含有六個跨膜區段。第四段是高度保守的，並作為通道的電壓感測器。此通道之電壓敏感性係因位於第四區段中之每第三位置處的陽性胺基酸（Nicholls等人，（2012）「從神經元到大腦(From Neuron to Brain)」，第5版第86頁，其全部內容藉由引用併入本文）。當經跨膜電壓之變化刺激時，此區段朝細胞膜之細胞外側移動，使得該通道變為對離子有滲透性。該等離子係經由一孔進行，其可分成兩個區域。孔之較外部（即，細胞較外處）部分係由四個結構域中每個域之第五和第六跨膜區段（亦稱為P-環）之間的區域形成。該區域是孔體較窄的部分，負責其離子選擇性。該孔之內部部分（亦即，更多細胞質）係藉由該四個結構域的第五及第六跨膜區段組合而形成。具體而言，人類NaV1.1蛋白對應於存取編號P35498.2中所闡述之胺基酸序列；人類NaV1.2蛋白對應於存取編號Q99250.3中闡述之胺基酸序列；人類NaV1.3蛋白對應於存取編號Q9NY46.2中闡述之胺基酸序列；人類NaV1.4蛋白對應於存取編號P35499.4中所闡述之胺基酸序列；人類NaV1.5蛋白對應於存取編號Q14524.2中所闡述之胺基酸序列；人類NaV1.6蛋白對應於存取編號Q9UQD0.1中所闡述之胺基酸序列；人類NaV1.7蛋白對應於存取編號Q15858.3中所闡述之胺基酸序列；人類NaV1.8蛋白對應於存取編號Q9Y5Y9.2中所闡述之胺基酸序列；人類NaV1.9蛋白對應於存取編號Q9UI33.2中所闡述之胺基酸序列。
在一此類實施例中，所關注之跨膜蛋白為NaV1蛋白。在特定實施例中，所關注之跨膜蛋白為NAV1.7。NaV1.7係在背根神經節、交感神經元、許旺細胞及神經腎上腺素細胞的感受疼痛(疼痛)神經元中表現。NaV1.7是薄膜可激發性的關鍵成分，且對於疼痛的感覺相當重要。人類 SCN9A基因中的獲得功能突變已與疼痛症候群有關，而功能喪失突變係與深度的疼痛不敏感有關。如由來自以下14個動物物種之NaV1.7蛋白的例示性同源序列比對中所明顯看出，NaV1.7在跨物種間為高度保守的。人類 NaV1.7蛋白對應於登記編號Q15858.3中闡述之胺基酸序列；黑猩猩NaV1.7同源物對應於登記編號XP_016804947.1中所闡述之胺基酸序列；萊茵斯猴NaV1.7蛋白對應於登記編號XP_014965766.1中所闡述之胺基酸序列；飛狐猴NaV1.7蛋白對應於登記編號XP_008588371.1中所闡述之胺基酸序列；牛NaV1 7蛋白對應於登記編號NP_001104257.2中所闡述之胺基酸序列；綿羊NaV1.7蛋白對應於登記編號XP_004004679.1中所闡述之胺基酸序列；阿拉伯駱駝NaV1.7蛋白對應於登記編號XP_010980767.1中所闡述之胺基酸序列；殺人鯨NaV1.7蛋白對應於登記編號XP_004267302.1中所闡述之胺基酸序列；馬NaV1.7蛋白對應於登記編號XP_001496473.1中所闡述之胺基酸序列；狗NaV1.7蛋白對應於登記編號XP_022270547.1中所闡述之胺基酸序列；小鼠NaV1.7蛋白對應於編碼Q62205.2中闡述之胺基酸序列；大鼠NaV1.7蛋白對應於登記編號O08562.1中所闡述之胺基酸序列；兔子NaV1.7蛋白對應於編碼Q28644.1中所闡述之胺基酸序列；以及雞NaV1.7蛋白對應於登記編號NP_001280211.1中所闡述之胺基酸序列。
在一特定實施例中，所關注之跨膜蛋白為人類NaV1.7。在另一實施例中，所關注之跨膜蛋白為小鼠NaV1.7。
在其它實施例中，所關注之跨膜蛋白為NaV1.2。NaV1.2係表現於中樞神經元和周邊神經元。人類 SCN2A基因（編碼NaV1.2）之突變已與幾種癲癇病症及自閉症譜系病症相關。NaV1.2在物種之間為高度保守的，如由來自14個動物物種之NaV1.2蛋白的例示性序列比對中所明顯看出。包含於比對中之例示性序列的登記編號為：人類NaV1.2同源物對應於登記編號Q99250.3中所闡述之胺基酸序列；黑猩猩NaV1.2同源物對應於登記編號XP_003820970.1中所闡述之胺基酸序列；萊茵斯猴NaV1.2蛋白對應於登記編號XP_001100368.1中所闡述之胺基酸序列；飛狐猴NaV1.2蛋白對應於登記編號XP_008582720.1中所闡述之胺基酸序列；牛NaV1.2蛋白對應於登記編號NP_001137581.1中所闡述之胺基酸序列；綿羊NaV1.2蛋白對應於登記編號XP_014948870.1中所闡述之胺基酸序列；阿拉伯駱駝NaV1.2蛋白對應於登記編號XP_010980763.1中所闡述之胺基酸序列；殺人鯨NaV1.2蛋白對應於登記編號XP_004283641.1中闡述之胺基酸序列；馬NaV1.2蛋白對應於登記編號XP_014588001.1中所闡述之胺基酸序列；小鼠NaV1.2蛋白對應於登記編號NP_001092768.1中所闡述之胺基酸序列；大鼠NaV1.2蛋白對應於登記編號P04775.1中所闡述之胺基酸序列；兔子NaV1.2蛋白對應於登記編號XP_008256915.1中所闡述之胺基酸序列；雞NaV1 2蛋白對應於登記編號NP_001280210.1中所闡述之胺基酸序列；以及綠海龜NaV1.2蛋白對應於登記編號XP_007056690.1中所闡述之胺基酸序列。
在一特定實施例中，所關注之跨膜蛋白為人類NaV1.2同源物。在另一實施例中，所關注之跨膜蛋白為小鼠NaV1.2同源物。
在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白為CACNG1蛋白。在一個實施例中，所關注之跨膜蛋白為人類CACNG1蛋白。在另一實施例中，所關注之跨膜蛋白為非人類CACNG1蛋白。
在某些實例中，所關注之跨膜蛋白為SLC蛋白。SLC蛋白已被表徵且為本領域具有通常知識者所熟知。舉例而言，已辨識出數百個人類跨膜SLC蛋白，其係組織成多個SLC蛋白家族，如例如在Lin, L.等人中所述，自然 綜述藥物發現（ Rev. Drug Disc）(2015) 14:8第543-560頁，其全部內容以引用方式併入本文。因此，在某些實施例中，所關注之跨膜蛋白為SLC蛋白，諸如，例如SLCO1A2、SLCO1B1、SLCO1B3、SLCO1B7、SLCO1C1、SLCO2A1、SLCO2B1、SLCO3A1、SLCO4A1、SLCO4C1、SLCO5A1、SLCO6A1、SLC1A1、SLC1A2、SLC1A3、SLC1A4、SLC1A5、SLC1A6、SLC1A7、SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A6、SLC2A7、SLC2A8、SLC2A9、SLC2A10、SLC2A11、SLC2A12、SLC2A13、SLC2A14、SLC3A1、SLC3A2、SLC4A1、SLC4A2、SLC4A3、SLC4A4、SLC4A5、SLC4A7、SLC4A8、SLC4A9、SLC4A10、SLC4A11、SLC5A1、SLC5A2、SLC5A3、SLC5A4、SLC5A5、SLC5A6、SLC5A7、SLC5A8、SLC5A9、SLC5A10、SLC5A11、SLC5A12、SLC6A1、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、SLC6A5、SLC6A6、SLC6A7、SLC6A8、SLC6A9、SLC6A10P、SLC6A11、SLC6A12、SLC6A13、SLC6A14、SLC6A15、SLC6A16、SLC6A17、SLC6A18、SLC6A19、SLC6A20、SLC6A21P、SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A5、SLC7A6、SLC7A7、SLC7A8、SLC7A9、SLC7A10、SLC7A11、SLC7A13、SLC7A14、SLC7A15P、SLC8A1、SLC8A2、SLC8A3、SLC8B1、SLC9A1、SLC9A2、SLC9A3、SLC9A4、SLC9A5、SLC9A6、SLC9A7、SLC9A8、SLC9A9、SLC9B1、SLC9B2、SLC9C1、SLC9C2、SLC10A1、SLC10A2、SLC10A3、SLC10A4、SLC10A5、SLC10A6、SLC10A7、SLC11A1、SLC11A2、SLC12A1、SLC12A2、SLC12A3、SLC12A4、SLC12A5、SLC12A6、SLC12A7、SLC12A8、SLC12A9、SLC13A1、SLC13A2、SLC13A3、SLC13A4、SLC13A5、SLC14A1、SLC14A2、SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3、SLC15A4、SLC15A5、SLC16A1、SLC16A2、SLC16A3、SLC16A4、SLC16A5、SLC16A6、SLC16A7、SLC16A8、SLC16A9、SLC16A10、SLC16A11、SLC16A12、SLC16A13、SLC16A14、SLC17A1、SLC17A2、SLC17A3、SLC17A4、SLC17A5、SLC17A6、SLC17A7、SLC17A8、SLC17A9、SLC18A1、SLC18A2、SLC18A3、SLC18B1、SLC19A1、SLC19A2、SLC19A3、SLC20A1、SLC20A2、SLC22A1、SLC22A2、SLC22A3、SLC22A4、SLC22A5、SLC22A6、SLC22A7、SLC22A8、SLC22A9、SLC22A10、SLC22A11、SLC22A12、SLC22A13、SLC22A14、SLC22A15、SLC22A16、SLC22A17、SLC22A18、SLC22A20P、SLC22A23、SLC22A24、SLC22A25、SLC22A31、SLC23A1、SLC23A2、SLC23A3、SLC23A4P、SLC24A1、SLC24A2、SLC24A3、SLC24A4、SLC24A5、SLC25A1、SLC25A2、SLC25A3、SLC25A4、SLC25A5、SLC25A6、UCP1、UCP2、UCP3、SLC25A10、SLC25A11、SLC25A12、SLC25A13、SLC25A14、SLC25A15、SLC25A16、SLC25A17、SLC25A18、SLC25A19、SLC25A20、SLC25A21、SLC25A22、SLC25A23、SLC25A24、SLC25A25、SLC25A26、SLC25A27、SLC25A28、SLC25A29、SLC25A30、SLC25A31、SLC25A32、SLC25A33、SLC25A34、SLC25A35、SLC25A36、SLC25A37、SLC25A38、SLC25A39、SLC25A40、SLC25A41、SLC25A42、SLC25A43、SLC25A44、SLC25A45、SLC25A46、SLC25A47、SLC25A48、MTCH1、MTCH2、SLC25A51、SLC25A52、SLC25A53、SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A4、SLC26A5、SLC26A6、SLC26A7、SLC26A8、SLC26A9、SLC26A10、SLC26A11、SLC27A1、SLC27A2、SLC27A3、SLC27A4、SLC27A5、SLC27A6、SLC28A1、SLC28A2、SLC28A3、SLC29A1、SLC29A2、SLC29A3、SLC29A4、SLC30A1、SLC30A2、SLC30A3、SLC30A4、SLC30A5、SLC30A6、SLC30A7、SLC30A8、SLC30A9、SLC30A10、SLC31A1、SLC31A2、SLC32A1、SLC33A1、SLC34A1、SLC34A2、SLC34A3、SLC35A1、SLC35A2、SLC35A3、SLC35A4、SLC35A5、SLC35B1、SLC35B2、SLC35B3、SLC35B4、SLC35C1、SLC35C2、SLC35D1、SLC35D2、SLC35D3、SLC35E1、SLC35E2A、SLC35E2B、SLC35E3、SLC35E4、SLC35F1、SLC35F2、SLC35F3、SLC35F4、SLC35F5、SLC35F6、SLC35G1、SLC35G2、SLC35G3、SLC35G4、SLC35G5、SLC35G6、SLC36A1、SLC36A2、SLC36A3、SLC36A4、SLC37A1、SLC37A2、SLC37A3、SLC37A4、SLC38A1、SLC38A2、SLC38A3、SLC38A4、SLC38A5、SLC38A6、SLC38A7、SLC38A8、SLC38A9、SLC38A10、SLC38A11、SLC39A1、SLC39A2、SLC39A3、SLC39A4、SLC39A5、SLC39A6、SLC39A7、SLC39A8、SLC39A9、SLC39A10、SLC39A11、SLC39A12、SLC39A13、SLC39A14、SLC40A1、SLC41A1、SLC41A2、SLC41A3、RHAG、RHBG、RHCG、SLC43A1、SLC43A2、SLC43A3、SLC44A1、SLC44A2、SLC44A3、SLC44A4、SLC44A5、SLC45A1、SLC45A2、SLC45A3、SLC45A4、SLC46A1、SLC46A2、SLC46A3、SLC47A1、SLC47A2、SLC48A1、FLVCR1、FLVCR2、SLC49A3、SLC49A4、SLC50A1、SLC51A、SLC51B、SLC52A1、SLC52A2、SLC52A3、XPR1、MPC1、MPC2、MPC1L、LETM1、LETM2、LETMD1、SFXN1、SFXN2、SFXN3、SFXN4、SFXN5、NIPA1、NIPA2、NIPAL1、NIPAL2、NIPAL3、NIPAL4、MAGT1、TUSC3、MFSD2A、MFSD2B、MFSD4A、MFSD4B、MFSD5、ANKH、SPNS1、SPNS2、SPNS3、TMEM165、NPC1、NPC1L1、SLC66A1、SLC66A2、SLC66A3、CTNS及MPDU1。
術語「內源性」係指天然表現於宿主生物體中、或來源於細胞、組織或生物體中之多肽或多核苷酸或其它組成物。「外源性」係指來源於細胞、組織或生物體之外或為特定宿主生物體外之多肽、多核苷酸或其它組成物。
在該等方法的一些實施例中，動物係以編碼一部分所關注之跨膜蛋白的核酸免疫接種。在某些實施例中，該核酸編碼所關注之全長跨膜蛋白的截短版本。在一些實施例中，所關注之截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之一或多個細胞外環結構域、胺基端及/或羧基端部分。在特定實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白的胺基端部分。在其它實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之羧基端部分。在一些實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之細胞外環結構域。
在一些實施例中，動物係以編碼所關注之跨膜蛋白或其部分(該部分涵蓋於可表現核酸之載體中)之核酸免疫接種。用於免疫接種中之載體的非限制性實例包含載體，諸如質體、表現載體、以及類病毒顆粒(VLP)、細胞(諸如經照射細胞、外溶體及脂質體)。術語「載體」係用來指用於將編碼資訊轉移至宿主細胞的任何分子（例如，核酸、質體或病毒）。載體之實例為「表現載體」，其為以重組或合成方式生成之核酸構築體，具有允許在宿主細胞中轉錄特定核酸之一系列特異核酸元件。表現載體可為質體、病毒或核酸片段的一部分。在某些實例中，表現載體包含可操作地連接至啟動子進行轉錄之核酸。術語「可操作地連接」係指核酸表現控制序列（諸如，例如啟動子或轉錄因子結合位點陣列）與第二核酸序列之間的功能連繫，其中該表現控制序列引導對應於第二序列的核酸之轉錄。
在一些實施例中，動物係以包括有編碼所關注之跨膜蛋白或其部分之核酸的載體免疫接種。在特定實施例中，動物係以包括有編碼所關注之跨膜蛋白或其部分之核酸的表現載體免疫接種。在一個實施例中，動物係以包括有編碼所關注之跨膜蛋白或其部分之核酸的質體免疫接種。
在某些實例中，免疫原係藉由一或多次注射隨時間向宿主動物投與，諸如藉由靜脈內注射或腹膜內注射。在某些實施例中，該免疫原係藉由1、2、3、4或更多次注射向宿主哺乳動物投與。在特定實施例中，免疫原係藉由3次單獨注射投與。
向動物投與之免疫原的量可容易地由熟習此項技術者使用已知方法測定。
在某些實例中，將核酸免疫原係以至少0.1 mg/mL、至少0.5 mg/mL、至少1.0 mg/mL、至少1.5 mg/mL、至少2.0 mg/mL、至少3.0 mg/mL、至少4.0 mg/mL、至少5.0 mg/mL、至少6.0 mg/mL、至少7.0 mg/mL、至少8.0 mg/mL、至少9.0 mg/mL、至少9.5 mg/mL、至少10.0 mg/mL、至少10.5 mg/mL或更多的濃度注射入動物中。在某些實施例中，將核酸免疫原以0.5 mg/mL至20 mg/mL、0.5 mg/mL至15 mg/mL、0.5 mg/mL至12 mg/mL、0.5 mg/mL至11 mg/mL、1.0 mg/mL至15 mg/mL、1.0 mg/mL至5 mg/mL、1.0 mg/mL至4 mg/mL、1.0 mg至3 mg/mL、1.0 mL至2 mL、2.0 mg/mL至12 mg/mL、5.0 mg/mL至12 mg/mL、7.0 mg/mL至12 mg/mL、8.0 mg/mL至12 mg/mL、8.0 mg/mL至11 mg/mL、9.0 mg/mL至11 mg/mL、或9.5 mg/mL至10.5 mg/mL之濃度注射至動物中。在特定實施例中，該核酸免疫原以0.5 mg/mL、0.7 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.8 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL、3.5 mg/mL、4.0 mg/mL、4.5 mg/mL、5.0 mg/mL、5.5 mg/mL、6.0 mg/mL、6.5 mg/mL、7.0 mg/mL、7.5 mg/mL、8.0 mg/mL、8.5 mg/mL、9.0 mg/mL、9.5 mg/mL、10.0 mg/mL、10.5 mg/mL、11.0 mg/mL、11.5 mg/mL、12.0 mg/mL、12.5 mg/mL、13.0 mg/mL、13.5 mg/mL、14.0 mg/mL、14.5 mg/mL、15.0 mg/mL、15.5 mg/mL或更高之濃度注射至動物中。在一特定實施例中，將核酸免疫原以1.6 mg/mL之濃度注射至動物中。在一個實施例中，將核酸免疫原以10 mg/mL之濃度注射至動物中。
在一些實施例中，動物係以所關注之跨膜蛋白或其部分免疫接種。在某些實施例中，所關注之跨膜蛋白或其部分為人類來源。在其他實施例中，動物係以所關注之非人類跨膜蛋白免疫接種。在一些實施例中，動物係以編碼所關注之全長小鼠跨膜蛋白之核酸免疫接種。在一些實施例中，動物係以所關注之全長跨膜蛋白免疫接種。在特定實施例中，所關注之跨膜蛋白係經截短。在一些實施例中，所關注之截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之一或多個細胞外環結構域、胺基端及/或羧基端部分。在特定實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白的胺基端部分。在其它實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之羧基端部分。在一個實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之細胞外環結構域。
在某些實例中，將蛋白質或肽免疫原以至少0.1 mg/mL、至少0.2 mg/mL、至少0.3 mg/mL、至少0.4 mg/mL、至少0.5 mg/mL、至少0.6 mg/mL、至少0.7 mg/mL、至少0.8 mg/mL、至少0.9 mg/mL、至少1.0 mg/mL、至少2.0 mg/mL、至少3.0 mg/mL、至少4.0 mg/mL、至少5.0 mg/mL、至少10.0 mg/mL或更高之濃度向動物投予。在某些實施例中，該蛋白質或肽免疫原以包含0.1 mg/mL至20 mg/mL、0.1 mg/mL至15 mg/mL、0.1 mg/mL至10 mg/mL、0.1 mg/mL至8.0 mg/mL、0.1 mg/mL至7.0 mg/mL、0.1 mg/mL至6.0 mg/mL、0.1 mg/mL至5.0 mg/mL、0.1 mg/mL至3.0 mg/mL、0.1 mg/mL至2.0 mg/mL、0.1 mg/mL至1.0 mg/mL、0.2 mg/mL至10.0 mg/mL、0.2 mg/mL至7.0 mg/mL、0.2 mg/mL至6.0 mg/mL、0.2 mg/mL至5.0 mg/mL、0.2 mg/mL至3 mg/mL、0.2 mg/mL至2 mg/mL、0.2 mg/mL至1 mg/mL、0.5 mg/mL至10.0 mg/mL、0.5 mg/mL至7.0 mg/mL、0.5 mg/m 至5.0 mg/mL、0.5 mg/mL至3.0 mg/mL、0.5 mg/mL至2.0 mg/mL、0.5 mg/mL至1.0 mg/mL、1.0 mg/mL至 5.0 mg/mL、1.0 mg/mL至3.0 mg/mL、1.0 mg/mL至 2.0 mg/mL、2.0 mg/mL至10.0 mg/mL、5.0 mg/mL至10.0 mg/mL之濃度注射至之動物中。在特定實施例中，該蛋白質或肽免疫原以0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.3 mg/mL、0.35 mg/mL、0.4 mg/mL、0.45 mg/mL、0.5 mg/mL、0.55 mg/mL、0.6 mg/mL、0.65 mg/mL、0.7 mg/mL、0.75 mg/mL、0.8 mg/mL、0.85 mg/mL、0.9 mg/mL、0.95 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.8 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL、3.5 mg/mL、4.0 mg/mL、4.5 mg/mL、5.0 mg/mL、5.5 mg/mL、6.0 mg/mL、6.5 mg/mL、7.0 mg/mL、7.5 mg/mL、8.0 mg/mL、8.5 mg/mL、9.0 mg/mL、9.5 mg/mL、10.0 mg/mL、12.0 mg/mL、15.0 mg/mL、20.0 mg/mL或更多之濃度注射至之動物中。在一特定實施例中，將蛋白質或肽免疫原以0.9 mg/mL之濃度注射至之動物中。在一個實施例中，將蛋白質或肽免疫原以0.5 mg/mL之濃度注射至動物中。在另一實施例中，將蛋白質或肽免疫原以1.9 mg/mL之濃度注射至動物中。在一特定實施例中，將蛋白質或肽免疫原以2.5 mg/mL之濃度注射至動物中。
在某些實施例中，動物係以編碼所關注之嵌合跨膜蛋白或所關注之嵌合跨膜蛋白之核苷酸序列免疫接種。如本文所用，術語「嵌合」係指編碼蛋白質之蛋白或核酸，其具有衍生自不同物種之部分。舉例而言，嵌合蛋白可具有一或多個人類結構域及至少一個非人類結構域，或反之亦然。編碼嵌合蛋白之核酸可具有例如編碼可操作地連接至編碼至少一個蛋白結構域的非人類基因之一或多個蛋白結構域的人類基因。
在一非限制性實例中，嵌合核酸包含編碼跨膜蛋白之第一部分的一部分人類基因，其可操作地連接至編碼該跨膜蛋白之不同部分的一部分小鼠基因。在一些實施例中，動物係以編碼所關注之嵌合跨膜蛋白之DNA免疫接種，其包含編碼人類跨膜蛋白之一或多個細胞外環結構域的人類基因序列以及編碼來自跨膜蛋白之小鼠同源物之胺基端域及/或羧基末端域的小鼠基因序列。在其它實施例中，動物係以編碼所關注之嵌合跨膜蛋白之DNA免疫接種，其包含編碼來自人類跨膜蛋白之胺基端域及/或羧基末端域的DNA以及編碼跨膜蛋白之小鼠同源物之一或多個細胞外環結構域的DNA。在一個實施例中，動物係以編碼所關注之嵌合跨膜蛋白之DNA免疫接種，其包含編碼來自人類跨膜蛋白之一或多個細胞外環結構域之基因序列以及編碼來自跨膜蛋白之小鼠同源物之胺基端結構域的序列。在特定實施例中，動物係以編碼所關注之嵌合跨膜蛋白的DNA免疫接種，其包含編碼來自人類跨膜蛋白之胺基端域的基因序列以及編碼來自跨膜蛋白之小鼠同源物之一或多個細胞外環結構域的基因序列。在某些實施例中，編碼所關注之嵌合跨膜蛋白的核苷酸序列亦經修飾成包含編碼可偵測元件（諸如，例如His標籤、FLAG標籤、Avi標籤或Bir-A標籤）之核苷酸序列。
在一些實施例中，動物係以所關注之嵌合跨膜蛋白免疫接種，其包含可操作地連接至所關注之跨膜蛋白之一部分非人類同源物的一部分所關注之人類跨膜蛋白。在一些實施例中，動物係以所關注之嵌合跨膜蛋白免疫接種，其包含來自所關注之人類跨膜蛋白之一或多個細胞外環結構域以及來自跨膜蛋白之小鼠同源物之胺基末端域及/或羧基末端域。在一些實施例中，動物係以所關注之嵌合跨膜蛋白免疫接種，其包含來自人類跨膜蛋白之一或多個細胞外環結構域以及來自跨膜蛋白之小鼠同源物之胺基末端域。在一些實施例中，動物係以所關注之嵌合跨膜蛋白免疫接種，其包含來自人類跨膜蛋白之胺基末端域及/或羧基末端域以及來自跨膜蛋白之小鼠同源物的一或多個細胞外環結構域。在一些實施例中，動物係以所關注之嵌合跨膜蛋白免疫接種，其包含來自人類跨膜蛋白之胺基末端域以及來自跨膜蛋白之小鼠同源物的一或多個細胞外環結構域。在某些實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白亦包含可偵測元件，諸如，例如，His標籤、FLAG標籤、Avi標籤或Bir-A標籤。在一個實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含His標籤及FLAG標籤。
在某些實施例中，所關注之跨膜蛋白或核酸免疫原係經修飾。在一些實施例中，該免疫原為經修飾之所關注的跨膜蛋白或編碼相同的DNA，包含一或多個穩定胺基酸取代。在一些實施例中，經修飾之跨膜蛋白或編碼相同之核酸包含一或多個可偵測元件，諸如標記、標記物或特徵。在一個實施例中，經修飾之免疫原為所關注之跨膜蛋白，其包括可偵測標記。在一特定實施例中，可偵測標記為FLAG標籤、Avi標籤、組胺酸標籤（His標籤）、Bir-A標籤或其組合。在特定實施例中，可偵測標記或標記位於跨膜蛋白免疫原之胺基端或羧基端。在一個實施例中，跨膜蛋白免疫原具有FLAG標籤，且His標籤附著於羧基端。
用於該方法中之蛋白質可藉由本領域中已知之方法製造。舉例而言，所關注之跨膜蛋白或其部分可由適合之核酸編碼且表現於細胞中。編碼所關注之跨膜蛋白的適合之核酸分子可使用如本領域中所熟知的標準選殖技術、點突變及PCR製造。合適的表現系統包含例如在細菌或酵母菌中之固有的或誘導性表現系統、病毒表現系統（諸如桿狀病毒）、森林腦炎病毒及慢病毒、或在昆蟲或哺乳動物細胞內之暫態轉染。合適的宿主細胞包含大腸桿菌、乳酸乳球菌、酵母菌、粟酒裂殖酵母菌、畢赤酵母 (Pichia pastoris) 、秋行軍蟲及粉紋夜蛾細胞 。適合之哺乳動物宿主細胞包含HEK 293、COS、CHO、NSO、DT40。合適的昆蟲宿主細胞包含Sf9及S2細胞。
在某些實施例中，包括有所關注之跨膜蛋白或其部分之蛋白免疫原係表現於細胞中，該免疫原蛋白是由細胞製造且經純化，以提供用於免疫接種之純化蛋白免疫原。
在特定實施例中，動物可以涵蓋於載體中之所關注之跨膜蛋白或其部分免疫接種，諸如，例如，脂質雙層膜支架蛋白複合物、VLP、細胞、外溶體及脂質體。
「脂質雙層膜支架蛋白複合物」意指一種與，即，至少一種膜支架蛋白（MSP）結合之包含脂質雙層之複合物的組成物。已描述脂質雙層膜支架蛋白複合物。參見，例如，Inagaki, S.等人，奈米碟片中膜蛋白的生物物理表徵（Biophysical Characterization of Membrane Proteins in Nanodiscs.）， 方法（ Methods）(2013) 59(3):287-300，其全部內容藉由引用明確併入本文。可形成脂質雙層膜支架蛋白複合物，例如，作為由兩個膜支架蛋白包圍及穩定之盤狀磷脂雙層。不受任何一種理論束縛，複合物形成和功能係由MSP與脂質之比率及MSP之長度調節。舉例而言，可調整脂質與MSP之比率以生成脂質雙層膜支架蛋白複合物之均質或雜族群。此外，為了提供類原生環境，MSP蛋白應大到足以形成一複合物，其提供用於形成所關注之跨膜蛋白或蛋白質及脂質雙層兩者的空間。
如本文所用，術語「膜支架蛋白」或「MSP」係指一類衍生自兩親脂蛋白元A-I （Apo-AI）的兩親螺旋蛋白，如例如Schuler, M.等人， 分子生物學方法（ Methods Mol Biol）2013； 974: 415–433所描述，其全部內容藉由引用併入本文。膜支架蛋白包含兩親螺旋，其包括有與脂質疏水尾部接觸的螺旋內側的疏水性殘基，以及向外定向（遠離脂質）的親水殘基。 膜支架蛋白可經由在一部分MSP胺基酸序列中缺失或插入一或多個螺旋結構域而為不同尺寸，其允許形成不同大小的脂質雙層-MSP複合物。多個MSP之結構及功能被認為與脂質結合蛋白之鞘脂激活蛋白家族不同。
在一些實例中，脂質雙層膜支架蛋白複合物包含選自以下例示性多個MSP的至少一種膜支架蛋白：MSP1、MSP2、MSP1E1、MSP1E2、MSP1E3、MSP1E3D1、MSP1D1、MSP1D2、MSP2N1、MSP2N3及MSP2N2。
在一些實施例中，膜支架蛋白為MSP1，其包括結構FX-H1-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10 [SEQ ID NO: 12]，其中FX為膜支架蛋白的N端結構域，其具有胺基酸序列MGHHHHHHIEGR [SEQ ID NO：1]、H1為Helix 1，其具有胺基酸序列LKLLDNWDSVTSTFSKLREQLG [SEQ ID NO：2]、H2為Helix 2，其具有胺基酸序列PVTQEFWDNLEKETEGLRQEMS [SEQ ID NO：3]、H3為Helix 3，其具有胺基酸序列KDLEEVKAKVQ [SEQ ID NO：4]、H4為Helix 4，其具有胺基酸序列PYLDDFQKKWQEEMELYRQKVE [SEQ ID NO：5]、H5為Helix 5，其具有胺基酸序列PLRAELQEGARQKLHELQEKLS [SEQ ID NO：6]、H6為Helix 6，其具有胺基酸序列PLGEEMRDRARAHVDALRTHLA [SEQ ID NO：7]、H7為Helix 7，其具有胺基酸序列PYSDELRQRLAARLEALKENGG [SEQ ID NO：8]、H8為Helix 8，其具有胺基酸序列ARLAEYHAKATEHLSTLSEKAK [SEQ ID NO：9]、H9為Helix 9，其具有胺基酸序列PALEDLRQGLL [SEQ ID NO: 10]，且H10為Helix 10，其具有胺基酸序列PVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ [SEQ ID NO：11]。在一些實施例中，膜支架蛋白為MSP2，其包括結構FX-H1-H2-H3-H4- H5-H6-H7-H8-H9-H10-GT-H1-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10 [SEQ ID NO：13]。在一些實施例中，膜支架蛋白為延伸的膜支架蛋白，其包含插入至MSP1胺基酸序列中之一或多個22個胺基酸之兩親螺旋體。在一此類實施例中，該延伸膜支架蛋白為MSP1E1，其包括有結構FX-H1-H2-H3-H4-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10 [SEQ ID NO: 14]，其中MSP1之胺基酸序列藉由具有重複的「H4」來延伸。在另一實施例中，延伸膜支架蛋白為MSP1E2，其包括有結構FX-H1-H2-H3-H4-H5-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10 [SEQ ID NO: 15]，其中MSP1之胺基酸序列藉由具有重複的「H4-H5」來延伸。在又一個實施例中，延伸膜支架蛋白為MSP1E3，其包括有結構FX-H1-H2-H3-H4-H5-H6- H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10 [SEQ ID NO: 16]，其中MSP1之胺基酸序列藉由具有重複的「H4-H5-H6」來延伸。
在某些實施例中，膜支架蛋白為MSP1D1，其包括有結構TEV- H1Δ(1–11)- H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10 [SEQ ID NO: 17]，其中TEV為具有胺基酸序列MGHHHHHHH DYDIPTTENLYFQG [SEQ ID NO: 18]之經修飾N-末端結構域，以及H1Δ(1–11)為截短H1螺旋結構域，其具有胺基酸序列STFSKLREQLG [SEQ ID NO：19]。在一些實施例中，膜支架蛋白為MSP1D2，其包括結構TEV-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10 [SEQ ID NO：20]。在其它實施例中，該膜支架蛋白為MSP2N1，其具有結構TEV-H1Δ(1–11)-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10-GT-H1Δ(1–11)-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8- H9-H10 [SEQ ID NO：21]。在另一實施例中，該膜支架蛋白為MSP2N2，其具有結構TEV- H1Δ(1–11)- H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10-GT- H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10 [SEQ ID NO：22]。在又一實施例中，該膜支架蛋白為MSP2N3，其具有結構TEV-H1Δ(1–11)-H2-H3-H4- H5-H6-H7-H8-H9-H10-GT-H1Δ(1–17)-H2-H3-H4-H5-H6-H7-H8-H9-H10 [SEQ ID NO: 24],其中H1Δ(1–17)為截短H1螺旋結構域，其具有胺基酸序列REQLG [SEQ ID NO：23]。
在某些實施例中，該脂質雙層膜支架蛋白複合物包含兩個MSP。在一實施例中，脂質雙層膜支架蛋白複合物為盤狀磷脂雙層，其以一帶狀方式被兩個MSP（例如，兩個MSP分子）包圍。 在一實施例中，脂質雙層膜支架蛋白複合物為由兩個MSP1E3D1分子包圍的盤狀磷脂雙層。
在一些實施例中，脂質雙層膜支架蛋白複合物包含可偵測標記。在某些實施例中，該脂質雙層膜支架蛋白複合物含有至少兩個標記的膜支架蛋白與複數個脂質。在特定實施例中，脂質雙層膜支架蛋白複合物含有兩個標記的膜支架蛋白和脂質雙層。在一些實施例中，經標記之膜支架蛋白為相同或不同的。可偵測標記可為本領域中已知之任何可偵測標記。例如，可偵測標記包含螢光分子、His標籤及FLAG標籤。在例示性實施例中，一或多個膜支架蛋白係用可偵測標記物（諸如Bir-A標籤或用於生物素化之Avi標籤）標記。在一特定實施例中，脂質雙層膜支架蛋白複合物中的所有MSP係經生物素化。生物素化可藉由例如化學方法使膜支架蛋白生物素化，或藉由遺傳方式將Avi標籤或Bir-A標籤引入至編碼序列的MSP核酸中並使用已知技術製造經修飾的蛋白來進行。
重建脂質雙層膜支架蛋白複合物的脂質雙層部分。脂質可形成脂質雙層，諸如，例如，神經脂質及/或磷脂質。複合物之脂質組成物可變化，例如，基於特定跨膜蛋白或所關注蛋白的原生細胞類型，以包含在複合物中。舉例而言， 大腸桿菌膜含有70-80%磷脂醯乙醇胺、15-20%磷脂醯甘油及5%心磷脂，而大鼠肝細胞膜係由14-20%磷脂醯乙醇胺、32-47%磷脂醯膽鹼、8%磷脂醯肌醇、4-8%磷脂絲胺酸及13-14%之鞘磷脂所構成。參見Inagaki, S.等人，方法（ Methods）(2013) 59(3):287-300。因此，脂質雙層膜支架蛋白複合物的脂質組成物可包含單類型脂質或多於單類型的脂質。在某些實施例中，形成脂質雙層膜支架蛋白複合物的脂質為合成的或重組製造的脂質。
在一些實施例中，脂質雙層係包含以下脂質中之一或多者：鞘磷脂、磷脂醯膽鹼及其衍生物。於一特定實施例中，該脂質雙層係由1-二油醯基卵磷脂(DOPC)、1-棕櫚醯基 2-油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、1-硬脂醯基-2-油醯基磷脂醯膽鹼(SOPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)及磷脂醯絲胺酸(PS)、棕櫚醯基-2-油醯基- sn-甘油-3-磷醯-(1′- rac-甘油)(POPG)、1-棕櫚醯基-2- sn-甘油-3-磷醯-L-絲胺酸(POPS)及磷脂醯肌醇(PI)或其組合。在某些實施例中，該脂質雙層包含複數個POPC磷脂質。
在一些實施例中，脂質雙層膜支架蛋白複合物包含在膜支架蛋白周圍形成盤狀磷脂雙層之脂質，其包括有複數個以下脂質中之一或多者：POPC、POPG和POPS。在特定實施例中，脂質雙層膜支架蛋白複合物包含複數個POPC脂質，其形成圍繞兩個膜支架蛋白之盤狀磷脂雙層。在一個實施例中，MSP與脂質之比率係包含介於1：100和1：150、1：110和1：140、1：120和1：140、1：120和1：140、1：120-1：130和1：125和1：135之間。在其他實施例中，MSP與脂質之比率係包含1：100、1：110、1：111、1：112、1：113、1：114、1：115、1：116、1：117、1：118、1：119、1：120、1：121、1：122、1：123、1：124、1：125、1：126、1：127、1：128、1：129、1：130、1：131、1：132、1：133、1：134、1：135、1：136、1：137、1：138、1：139、1：140、1：141、1：142、1：143、1：144、1：145、1：146、1：147、1：148、1：149、或1：150。
在某些實例中，脂質雙層膜支架蛋白複合物亦包含至少一種抗原。在特定實施例中，抗原為所關注之跨膜蛋白或其部分。在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白為所關注之全長跨膜蛋白、所關注之截短跨膜蛋白、所關注之嵌合跨膜蛋白。在一些實施例中，所關注之截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之一或多個細胞外環結構域、胺基端及/或羧基端部分。在特定實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白的胺基端部分。在某些實施例中，所關注之截短跨膜蛋白包含所關注之跨膜蛋白之至少整個跨膜部分。在其它實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之羧基端部分。在一個實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之細胞外環結構域。在一些實施例中，截短蛋白包含所關注之跨膜蛋白之細胞外域，諸如N端細胞外域、C端細胞外域、及/或細胞外環結構域，其位於所關注之跨膜蛋白之一或多個跨膜域之間。在其它實施例中，抗原為所關注之嵌合跨膜蛋白或其部分，如本文所描述。
在一些實施例中，包括有抗原，諸如，所關注之跨膜蛋白或其部分之脂質雙層膜支架蛋白複合物包含抗原之單一分子（例如，跨膜蛋白或其部分/每一脂質雙層-MSP複合物或跨膜蛋白或其部分/每一奈米碟盤之一個複本）。在一些實施例中，包括有抗原之脂質雙層膜支架蛋白複合物包含抗原之多個分子（例如，跨膜蛋白或其部分/每一脂質雙層-MSP複合物或跨膜蛋白或其部分/每一奈米碟盤之多個複本）。
可使用本領域已知的方法，進行包含那些含有所關注之跨膜蛋白或其部分的脂質雙層膜支架蛋白複合物的形成。參見，例如，Bayburt TH等人，生物化學與生物物理學集刊( Arch Biochem Biophys) (2006) 450:215–222，其中的全部內容係藉由引用併入本文。一般而言，脂質雙層膜支架蛋白複合物之形成包含藉由混合脂質、MSP及如適用之跨膜蛋白來自組裝複合物。通常，跨膜蛋白係使用一或多種清潔劑純化。在一些實施例中，純化之跨膜蛋白係與脂質及MSP混合，以形成包括有跨膜蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物。在一些實施例中，在一或多種洗滌劑（例如，在洗滌劑溶解部分中）存在下，提供經純化之跨膜蛋白，且與脂質及MSP混合，且隨後移除一或多種洗滌劑以誘導複合物結構之形成。
在一些實例中，純化步驟可用以從那些不包含所關注之蛋白的複合物（即空複合物）中分離出包含所關注之蛋白的複合物。純化可藉由將一或多個可偵測標記加入至包含在複合物中之所關注之跨膜蛋白（諸如親和性標籤）上，及選擇該一或多個標籤來實現。用作親和力標籤之例示性可偵測標籤包含但不限於由固定金屬親和性層析法（IMAC）可辨識之His標籤、用於FLAG M1抗FLAG免疫親和性層析法之FLAG標籤及使用1D4樹脂之1D4標籤。尺寸排除層析亦可藉由進行例如SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳及西方墨點法分析來辨識及/或確認包含所關注之跨膜蛋白或其部分之脂質雙層膜支架蛋白複合物的存在。在所關注之跨膜蛋白及MSP兩者皆包含可偵測標記之實施例中，MSP上的至少一個標籤和所關注的跨膜蛋白上的一個標籤可以不同。
在特定實施例中，含有所關注之跨膜蛋白或其部分之脂質雙層膜支架蛋白複合物可藉由首先將所關注之跨膜蛋白溶解於洗滌劑(諸如，例如N-十二烷基–　D-麥芽糖苷(DDM）)中而形成，然後與可溶膽酸鹽磷脂及膜支架蛋白混合，隨後再移除該洗滌劑。在一些實例中，該洗滌劑可使用生物珠粒自混合物中萃取，其允許組裝整合所關注之純化跨膜蛋白的盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物。加入所關注之跨膜蛋白的盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物可接著自不包含使用親和純化珠粒之跨膜蛋白的盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物分離出來。舉例而言，當所關注之跨膜蛋白在其c端或n端含有相應「標籤」序列時，具有抗「標籤」抗體（例如，FLAG標籤、His標籤、HA標籤及其類似物，此類標籤為本領域具通常知識者所熟知）之珠粒。可藉由尺寸排除層析法達成進一步純化。
在某些實例中，嵌入於脂質雙層膜支架蛋白複合物之免疫原係以至少0.1 mg/mL、至少0.2 mg/mL、至少0.3 mg/mL、至少0.4 mg/mL、至少0.5 mg/mL、至少0.6 mg/mL、至少0.7 mg/mL、至少0.8 mg/mL、至少0.9 mg/mL、至少1.0 mg/mL、至少2.0 mg/mL、至少3.0 mg/mL、至少4.0 mg/mL、至少5.0 mg/mL、至少10.0 mg/mL之濃度向動物投予。在某些實施例中，將免疫原以包含0.2 mg/mL至20 mg/mL、0.5 mg/mL至15 mg/mL、0.5 mg/mL至10 mg/mL、0.5 mg/mL至7.0 mg/mL、0.5 mg/mL至5.0 mg/mL、1.0 mg/mL至10 mg/mL、1.0 mg/mL至5.0 mg/mL、1.0 mg/mL至4.0 mg/mL、1.0 mg/mL至3.0 mg/mL、1.0 mg/mL至2.0 mg/mL或2.0 mg/mL至5.0 mg/mL之濃度注射至動物中。在特定的實施例中，將免疫原以0.5 mg/mL、0.55 mg/mL、0.6 mg/mL、0.65 mg/mL、0.7 mg/mL、0.75 mg/mL、0.8 mg/mL、0.85 mg/mL、0.9 mg/mL、0.95 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL,、1.8 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL、3.5 mg/mL、4.0 mg/mL、4.5 mg/mL、5.0 mg/mL、5.5 mg/mL、6.0 mg/mL、6.5 mg/mL、7.0 mg/mL、7.5 mg/mL、8.0 mg/mL、8.5 mg/mL、9.0 mg/mL、9.5 mg/mL、10.0 mg/mL、12.0 mg/mL、15.0 mg/mL、20.0 mg/mL或更多之濃度注射至動物中。在一個實施例中，將嵌入於脂質雙層膜支架蛋白複合物中之所關注免疫原之跨膜蛋白以濃度為0.5 mg/mL注射至動物中。
在某些實施例中，動物可用表現免疫原的細胞免疫接種，諸如經照射細胞。在一特定實施例中，如本文所述，動物可用表現所關注免疫原之跨膜蛋白、其經修飾版本或其部分之細胞免疫接種。
在一些實施例中，動物可用在動物中表現所關注之跨膜蛋白的VLP或外溶體免疫接種。在特定實施例中，動物可用包含編碼所關注之跨膜蛋白、其經修飾版本或其部分之核酸的VLP免疫接種。
在一些實例中，如本文所述，動物係以兩種或更多種免疫原免疫接種，諸如，例如蛋白質或肽、經修飾之蛋白質或肽、核酸、經修飾之核酸、VLP及含有所關注之跨膜蛋白或其部分之脂質雙層膜支架蛋白複合物。
待免疫接種之動物可為任何動物。在某些實施例中，該動物為哺乳動物。在一些實施例中，哺乳動物為小鼠、大鼠、山羊、人類、倉鼠、豬、猴或天竺鼠。在一些實施例中，該哺乳動物不是人類。在特定實施例中，非人類哺乳動物為小鼠、大鼠或山羊。在一特定實施例中，哺乳動物為小鼠。在另一實施例中，哺乳動物為人類，諸如，例如已暴露於免疫原之人類。
在某些實例中，經免疫接種的動物係經基因工程改造。基因修飾可藉由已知方法進行，諸如那些用於缺失或中斷編碼蛋白質之基因之方法。 舉例而言，動物可為經基因工程改造的，使得動物不表現來自內源性基因座（例如，剔除）之所關注之跨膜蛋白（即，抗原）。舉例說明，經基因工程改造之非人類哺乳動物為不能表現所關注之內源性小鼠跨膜蛋白的小鼠，例如，由於對內源性小鼠跨膜蛋白之基因座的基因修飾或該內源性基因之失活（例如，完全或部分缺失）所致。
在某些實施例中， 該經基因工程改造之動物為非人類哺乳動物，諸如，例如小鼠、山羊或大鼠，其基因組中（例如，經由雜交或多基因靶向策略）包含：（i）人類化免疫球蛋白重鏈基因座，其包括一或多個人類可變重鏈基因片段；（ii）人類化免疫球蛋白重鏈基因座，其包括一或多個人類可變輕鏈基因片段；及/或（iii）人類化免疫球蛋白輕鏈基因座（例如，κ及/或λ），其包括一或多個人類可變輕鏈基因片段。如本文所用，術語「人類化」包含經修飾以包含有人類序列。舉例而言，人類化基因座為已經修飾並包含人類序列（例如，基因片段或基因）之基因座（例如，內源性基因座）。
在一些實施例中，經基因工程改造之動物為非人類哺乳動物，諸如，例如小鼠、山羊或大鼠，其在它們的基因組中包含了包括有一或多個人類可變重鏈基因片段之人類化免疫球蛋白重鏈基因座。
在一些實施例中，經基因工程改造之動物為非人類哺乳動物，諸如，例如小鼠、山羊或大鼠，其在它們的基因組中包含了包括有一或多個人類可變輕鏈基因片段之人類化免疫球蛋白輕鏈基因座。
在一些實施例中，經基因工程改造之動物為非人類哺乳動物，諸如，例如小鼠、山羊或大鼠，其在它們的基因組中包含了包括有一或多個人類可變輕鏈基因片段之人類化免疫球蛋白輕鏈基因座（例如，κ及/或 λ）。在一個實施例中，經基因工程改造之動物包括了人類化免疫球蛋白輕鏈基因座，該免疫球蛋白輕鏈基因座包括有一或多個人類kappa可變（Vκ）基因片段。 在另一個實施例中，經基因工程改造之動物包括人類化免疫球蛋白輕鏈基因座，該免疫球蛋白輕鏈基因座包括一或多個人類λ可變（Vλ）基因片段。
在一些實施例中，包括 編碼人類免疫球蛋白重鏈可變區（V H）之核酸序列及/或編碼人類免疫球蛋白輕鏈可變區（V L）之核酸序列的經基因工程改造之動物，亦可缺乏編碼所關注之跨膜蛋白之內源性基因。
在其它實例中，動物為「野生型」動物，其表現所關注之跨膜蛋白的內源性同源物。
在一些實施例中，經基因工程改造之動物（例如，大鼠或小鼠）會製造包括尤其是重鏈之抗體，其中各重鏈包括可操作地連接至嚙齒動物（例如，大鼠或小鼠）重鏈穩定域之人類重鏈可變域。在一些實施例中，經基因工程改造之動物（例如，大鼠或小鼠）會製造包括尤其是抗體，其中各免疫球蛋白鏈包括可操作地連接至嚙齒動物（例如，大鼠或小鼠）重鏈穩定域之人類輕鏈可變域。在一些實施例中，經基因工程改造之動物（例如，大鼠或小鼠）會製造包括尤其是κ輕鏈之抗體，其中各κ輕鏈包括可操作地連接至嚙齒動物（例如，大鼠或小鼠）κ輕鏈穩定域之人類κ輕鏈可變域。在一些實施例中，經基因工程改造之動物（例如，大鼠或小鼠）會製造包括尤其是λ輕鏈之抗體，其中各λ輕鏈包括可操作地連接至人類λ輕鏈穩定域之人類λ輕鏈可變域。在一些實施例中，經基因工程改造之動物（例如，大鼠或小鼠）會製造包括有尤其是輕鏈之抗體，其中各輕鏈包括可操作地連接至嚙齒動物（例如，大鼠或小鼠）κ輕鏈穩定域之人類λ輕鏈可變域。在一些實施例中，經基因工程改造之動物（例如，大鼠或小鼠）會製造尤其是包括λ輕鏈之抗體，其中各λ輕鏈包括可操作地連接至嚙齒動物（例如，大鼠或小鼠）λ輕鏈穩定域之人類λ輕鏈可變域。
在一些實施例中，本文所述之非人類哺乳動物（例如，大鼠或小鼠）係描述於例如美國專利號第8,502,018、8,642,835、8,697,940、8,791,323、9,226,484及WO2019/113065中；所有這些內容藉由藉由引用全部併入本文。育種(或“雜交”或“雜交-育種”)可依照本領域容易獲得的實驗流程進行;請見，例如，JoVE科學教育數據庫。實驗動物研究，育種和離乳的基本原理（ Lab Animal Research, Fundamentals of Breeding and Weaning），JoVE，麻薩諸塞州劍橋市，(2018) (影音文獻)； 維持實驗室小鼠種群的育種策略，傑克遜實驗室資源手冊（ Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice, A Jackson Laboratory Resource Manual） ，©2007傑克遜實驗室；全部藉由引用併入本文。替代地，經工程化的Igλ輕鏈基因座可經工程化成包括有人類化IgH基因座及/或人類化Igκ基因座的ES細胞，且所得ES細胞係用於生成經基因工程化的動物，或將包括有人類化Igλ輕鏈基因座的基因工程化動物可與另一包括有人類化IgH基因座及/或人類化Igκ基因座之基因工程化動物配種。包括有人類化IgH基因座及/或人類化Igκ基因座之各種經基因工程改造之動物為已知的，例如，VELOCIMMUNE®品系（參見，例如，美國專利號8,502,018及/或8,642,835；該等專利中之每一者以全文引用的方式併入本文中）、XENOMOUSE™ 品系（參見，例如，Mendez, M.J.等人，1997，自然-遺傳學(Nat. Genetics) 15(2):146-56和 Jakobovits, A.等人，1995，紐約科學院年報(Ann. NY Acad. Sci.) 764:525-35，將其全部內容藉由引用併入本文）。
在一些實施例中，本文所述之經基因工程改造之動物包括如美國專利號第9,796,788；9,969,814；美國專利申請案號2011/0195454 A1、2012/0021409 A1、2012/0192300 A1、2013/0045492 A1、2013/0185821 A1、2013/0302836 A1；國際專利申請公開案號WO 2011/097603、WO 2012/148873、WO 2013/134263、WO 2013/184761、WO 2014/160179、WO 2014/160202中所述之受限的免疫球蛋白輕鏈基因座，該等專利中之每一者以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本文所述之嚙齒動物包括如WO2019/113065、WO2017214089、US20180125043及美國專利號第9,035,128；9,066,502；9,163,092；9,150,662；9,334,333；9,006,511；9,029,628；9,206,261；9,012,717；9,394,373；9,206,262；9,206,263；9,226,484；9,540,452；及9,399,683中所述之免疫球蛋白輕鏈基因座，該等專利中之每一者以全文引用的方式併入本文中。
一旦動物已經免疫接種，使用抗原特異免疫分析監測動物對免疫原的免疫反應。動物中之體液免疫反應可基於所關注之跨膜蛋白（抗原）特異血清中之抗體效價來測定。可使用多種測定來測定抗體效價，包含基於ELISA及流動式細胞測量術之測定（參見，例如，David H. Margulies，誘導免疫反應（ Induction of Immune Responses），免疫學的當前方案（ Current Protocols in Immunology），89, 1, (2.0.1-2.0.3) (2010)；Henri V. van der Heyde等人，「在實驗性之瘧疾分析抗原特異抗體及其同型」，細胞計數法（ Cytometry），第71A (4)卷: 242-250 (2007)；兩者皆藉由引用方式併入本文。在一些實施例中，測定係利用表現或經工程改造以在細胞表面上表現所關注之跨膜蛋白的細胞，且抗體效價可藉由量測與細胞之抗體結合來確定。
當已達到適當的免疫反應時，自經免疫接種動物收集細胞群。可從許多來源收集細胞，包含但不限於經免疫接種動物的脾臟、淋巴結、骨髓及周邊血。在一個實施例中，細胞為自經免疫接種動物之脾臟獲得的細胞群體，即，脾細胞群體。在一些實施例中，細胞群為含有來自經免疫接種動物之不同組織、器官或區域的細胞異質性細胞群。在特定實施例中，細胞群為自一個器官，諸如，經免疫接種動物之脾臟獲得之均質細胞群。在一實施例中，該細胞群包含來自脾臟、淋巴結及骨髓中之一或多者的組織衍生細胞。在其它實施例中，該細胞群體係從經免疫接種動物的血液獲得。
自經免疫接種動物收集之細胞包含「抗體生成細胞」，其係指天然表現抗體之細胞（由於B細胞活化之結果）或作為重組技術及基因工程（諸如融合瘤細胞）的結果。因此，術語「抗體生成細胞」涵蓋免疫細胞，諸如淋巴細胞。在某些非限制性之實例中，淋巴球可為抗原依賴性B細胞譜系，包含了記憶B細胞、漿母細胞及表現抗體之終末分化的漿細胞，以及重組細胞(諸如經改造以表現抗體之融合瘤細胞及非淋巴細胞。此外，「抗體生成細胞」涵蓋表現的抗體結合至或錨定在細胞膜上之細胞，即，細胞表面抗體及分泌抗體的細胞。
在某些實施例中，抗體生成細胞群體係來自經免疫接種動物之脾臟、淋巴結、骨髓或周邊血液。在特定實施例中，抗體生成細胞的群體包含周邊血細胞、B細胞、漿細胞、漿細胞骨髓瘤或其組合。在一些實施例中，該抗體生成細胞群體包含重組細胞，諸如，例如融合瘤。在特定實施例中，抗體生成細胞群體為淋巴細胞群體，諸如，例如B細胞。在一個實施例中，抗體生成細胞群體由記憶B細胞所構成。
此外，在一些實例中，另外的抗體生成細胞可衍生自藉由本揭示之方法獲得之抗體生成細胞的起始群體。因此，細胞株、漿細胞、記憶B細胞、融合瘤、漿細胞骨髓瘤及重組抗體表現細胞可衍生自或得自抗體生成細胞。舉例而言，抗體生成細胞可與骨髓瘤細胞融合以製造融合瘤，或以其他方式永生化，諸如以病毒（例如，EBV）感染，或可基於特定B細胞類型表現之蛋白標記物以細胞分選技術分化。
在特定實施例中，術語「抗體生成細胞」係指表現與所關注之跨膜蛋白結合之抗體的細胞。在一些實施例中，結合至所關注之跨膜蛋白的抗體係位於細胞表面上。在某些實例中，抗體生成細胞群為抗體生成細胞的異質性群體，其含有對多於一種抗原表現抗體之抗體生成細胞。在一特定實施例中，抗體生成細胞群為抗體生成細胞的異質性群體，其含有表現結合至所關注之跨膜蛋白及至少一種其它抗原之抗體的抗體生成細胞。在其它實施例中，抗體生成細胞群可為抗體生成細胞的均質群體，其含有表現僅結合至一種抗原之抗體的抗體生成細胞。在一特定實施例中，抗體生成細胞群為抗體生成細胞的均質群體，其包含表現結合至所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞。
如表1-5中所示，用各種不同免疫原及免疫原組合物免疫接種之動物會導致生成抗體生成細胞，包含表現結合至所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞群。表1-5還顯示，對不表現編碼所關注之跨膜蛋白的內源性基因之經基因工程改造的動物免疫接種，產生的抗體生產細胞表現結合至所關注之跨膜蛋白的抗體。 收集表現對所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞。
如本文所描述，對跨膜蛋白生成抗體的阻礙包含無法向製造對所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體或細胞提供足量之構象上準確的跨膜蛋白抗原。舉例而言，當自經純化之內源性跨膜蛋白的天然膜環境分離時，經純化之內源性跨膜蛋白在構象上受到破壞，且目前基於脂質及基於細胞之膜的製備導致高量非特異性結合，難以調配，且通常提供未折疊或不當摺疊之跨膜蛋白抗原的亞群。
本發明藉由利用脂質雙層膜支架蛋白複合物來將跨膜蛋白抗原呈現給由抗體生成細胞製造之抗體，克服此等障礙。更具體言之，本發明使用的複合物包含所關注之跨膜蛋白，以及天然存在之細胞膜中常見的脂質與膜支架蛋白，以在其天然構形中將跨膜蛋白呈現給抗體。因此，在本發明方法中使用脂質雙層膜支架蛋白複合物，以在與自然界中可得之跨膜蛋白上之表位結合的群體中辨識及收集特定抗體亞群（或表現抗體的細胞）。
一旦包含所關注之跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物已經形成，該複合物可用作分選劑以偵測並分離出表現結合至所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞群。舉例而言，可自如本文所述之經免疫接種之哺乳動物獲得異質性抗體生成細胞群，且隨後抗體生成細胞群可與將所關注抗原之跨膜蛋白呈現給細胞所製造之抗體的脂質雙層膜支架蛋白複合物接觸。隨後可培育複合物及抗體生成細胞群，以允許由該複合物呈現之所關注之跨膜蛋白與由細胞所製造之抗體之間的結合。接著可偵測抗體與所關注之跨膜蛋白之間的結合且可收集結合細胞以供進一步使用。
在一些實例中，自經免疫接種動物獲得之抗體生成細胞群可為異質性抗體生成細胞群，其含有對多於一種抗原表現抗體之抗體生成細胞。在特定實施例中，抗體生成細胞群為抗體生成細胞的異質群體，其含有表現結合至所關注之跨膜蛋白之抗體的某些抗體生成細胞，及表現結合至至少一種其它抗原之抗體的某些抗體生成細胞。在某些實施例中，抗體生成細胞之異質性群係包括至少0.01%、至少0.1%、至少0.5%、至少1.0%、至少1.5%、至少2.0%、至少3.0%、至少4.0%、至少5.0%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更高之表現結合至所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞。
在其它實施例中，抗體生成細胞群可為抗體生成細胞的均質群體，其含有表現僅結合至一種抗原之抗體的抗體生成細胞。在一特定實施例中，抗體生成細胞群為抗體生成細胞的均質群體，其包含表現結合至所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞。在某些實施例中，抗體生成細胞的均質群體係包含至少70%、至少80%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多的會表現結合至所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞。
在某些實施例中，在獲得抗體生成細胞的同時，可從獲自經免疫接種動物的異質細胞群中檢測和收集B細胞，以提供抗體生成B細胞群體。在一些實施例中，在從異質細胞群獲得抗原生成細胞之前，B細胞可從經免疫接種動物獲得之異質細胞群中獲得。在又一實施例中，B細胞可在自經免疫接種動物獲得之抗體生成細胞群中被偵測而獲得抗體生成B細胞群體。
在一特定實施例中，在自經免疫接種動物獲得且基於細胞表面B細胞標記物藉由FACS分離出的異質細胞群中可偵測到表現對所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成B細胞。
B細胞標記物為本技術領域中已知的。例如，可經由使用FACS偵測出適用的B細胞標記物，其包含但不限於，IgG、IgM、IgE、IgA、IgD、CD1、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、 CD23、 CD24、 CD25、CD27、 CD30、CD38、CD40、CD78、CD80、CD138、 CD319、TLR4、IL-6、 PDL-2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、IL-10及TGFβ。在一特定實施例中，可使用特異於IgG、IgM或其組合之標籤來偵測B細胞。在一個實施例中，使用特異於IgG的抗體偵測抗體生成B細胞。
在一特定實施例中，在免疫接種之後，自經免疫接種之動物收取脾細胞。在移除紅血球之後，來自經免疫接種動物的IgG +-抗原陽性B細胞群體係使用本文所述方法自異質細胞群分離出來。舉例而言，脾細胞與抗IgG抗體接觸並洗滌，以移除過量未結合之細胞及抗體。接著細胞用結合至標記B細胞標記物（諸如，抗IgG抗體）之螢光抗體（亦即，二級抗體）染色。接著，如本文所述，經染色的細胞可藉由流動式細胞測量術分析並分離供進一步使用。
在該等方法的一些實施例中，從已知具有對所關注之抗原體液免疫性的哺乳動物中收取多個周邊血液單核細胞（PBMC）。接著可分離IgG +、表現可辨識所關注抗原之抗體的抗原陽性B細胞，以進一步根據本發明方法處理。
在該等方法的一些實施例中，抗體生成細胞的群體包含抗體生成B細胞。在一這樣的實施例中，抗體生成群體包含表現對所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成B細胞，其可在自免疫接種動物獲得之異質細胞群中被偵測，且藉由將異質細胞群與呈現所關注之跨膜蛋白及結合至B細胞標記物(諸如，例如結合至B細胞表面標記物之抗體)之分子的脂質雙層膜支架蛋白複合物接觸而分離出來。舉例而言，在免疫接種之後，自經免疫接種之動物收取脾細胞。在移除紅血球後，將異質細胞群與標記的抗IgG抗體一起培育，以允許抗IgG抗體與異質細胞群中之IgG +-陽性B細胞之間的結合。同時、或隨後、或在與標記的抗IgG抗體一起培育之前，將異質細胞群與呈現所關注之跨膜蛋白之標記的脂質雙層膜支架蛋白複合體一起培育，以允許跨膜蛋白與細胞製造之抗體結合。可隨後藉由例如流動式細胞測量術獲得表現對所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成B細胞群體，以偵測並分離（收集）結合至經標記之抗IgG抗體（B細胞）及經標記之脂質雙層膜支架蛋白複合物兩者的細胞。
在一些實例中，該方法包含對如本文所述的動物進行免疫接種。
在包含接觸或培育細胞群的實例中，諸如，例如一群具有脂質雙層膜支架蛋白複合物的抗體產生細胞，該脂質雙層膜支架蛋白複合物係以0.1 mg/mL、至少0.2 mg/mL、至少0.3 mg/mL、至少0.4 mg/mL、至少0.5 mg/mL、至少0.6 mg/mL、至少0.7 mg/mL、至少0.8 mg/mL、至少0.9 mg/mL、至少1.0 mg/mL、至少2.0 mg/mL、至少3.0 mg/mL、至少4.0 mg/mL、至少5.0 mg/mL、至少10.0 mg/mL或更高之濃度提供給細胞培養基。在某些實施例中，該複合物係以含有0.2 mg/mL至20.0 mg/mL、0.2 mg/mL至15.0 mg/mL、0.2 mg/mL至10 mg/mL、0.2 mg/mL至7.0 mg/mL、0.2 mg/mL至5.0 mg/mL、0.5 mg/mL至10.0 mg/mL、0.5 mg/mL至7.0 mg/mL、0.5 mg/mL至5.0 mg/mL、1.0 mg/mL至10.0 mg/mL、1.0 mg/mL至7.0 mg/mL、或1.0 mg至5.0 mg/mL之濃度提供至細胞。在特定實施例中，該複合物係以0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.55 mg/mL、0.6 mg/mL、0.65 mg/mL、0.7 mg/mL、0.75 mg/mL、0.8 mg/mL、0.85 mg/mL、0.9 mg/mL、0.95 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.8 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL、3.5 mg/mL、4.0 mg/mL、4.5 mg/mL、5.0 mg/mL、5.5 mg/mL、6.0 mg/mL、6.5 mg/mL、7.0 mg/mL、7.5 mg/mL、8.0 mg/mL、8.5 mg/mL、9.0 mg/mL、9.5 mg/mL、10.0 mg/mL、12.0 mg/mL、15.0 mg/mL、20.0 mg/mL或以上之濃度提供至細胞。
在該等方法的一態樣中，經免疫接種動物為非人類動物或經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如以所關注之人類跨膜蛋白或其部分、編碼相同或其組合之核酸序列免疫接種之小鼠或大鼠。
在該等方法的某些實施例中，非人類動物或經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以所關注之全長人類跨膜蛋白、編碼該相同或其組合之核酸序列免疫接種，且脾細胞係自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，並且與標記的抗體一起培育成B細胞標記物（例如，螢光素標記的抗IgG抗體），以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋全長人類跨膜蛋白之生物素化的脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由複合物所呈現之所關注之人類跨膜蛋白（抗原）與細胞製造之抗體之間的結合。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素標記的（例如，Bir-A）膜支架蛋白結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至所關注之全長人類跨膜蛋白上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在該等方法的一些實施例中，非人類動物或經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以所關注之全長人類跨膜蛋白、編碼該相同或其組合之核酸序列免疫接種，且脾細胞係自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，並且與經標記之抗體一起培育成B細胞標記物（例如，螢光素標記的抗IgG抗體），以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋一部份人類跨膜蛋白之生物素化的脂質雙層膜支架蛋白複合物(諸如，截短人類跨膜蛋白)一起培育，以容許由複合物所呈現之一部份所關注之人類跨膜蛋白（抗原）上之表位與細胞製造之抗體之間的結合。隨後，細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合，然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集由複合物所呈現之表現結合至抗原上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在含有包括了所關注之跨膜蛋白之部分之脂質雙層膜支架蛋白複合物之該等方法的實施例中，由該複合物呈現之跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白。在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白為如本文所述之截短跨膜蛋白。在某些實施例中，所關注之截短跨膜蛋白包含所關注之跨膜蛋白之至少整個跨膜部分。 在某些實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白的一或多個細胞外環結構域、胺基末端及/或羧基末端部分。在一些實施例中，截短蛋白包含所關注之跨膜蛋白之細胞外域，諸如N端細胞外域、C端細胞外域、及/或細胞外環結構域，其位於所關注之跨膜蛋白之一或多個跨膜域之間。在一特定實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白的胺基端部分。在另一實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之羧基端部分。在一些實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之細胞外環結構域。
在該等方法的其它實施例中，非人類動物或經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以所關注之全長人類跨膜蛋白、編碼其相同或其組合之核酸序列免疫接種。脾細胞係自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，且與經標記之抗體一起培育成B細胞標記物（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體），以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋嵌合跨膜蛋白(包含一部份所關注之人類跨膜蛋白及一部份所關注之跨膜蛋白之非人類同源物)之生物素化的脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由複合物所呈現之所關注之嵌合跨膜蛋白（抗原）之人類部分與細胞製造之抗體之間的結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至所關注之嵌合跨膜蛋白之人類部分上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在包含使用所關注之嵌合跨膜蛋白的該等方法之實施例中，該嵌合蛋白可包含來自如本文所述之兩種不同物種之所關注之跨膜蛋白的一部分。舉例而言，嵌合跨膜蛋白可包含可操作地連接至所關注之跨膜蛋白之非人類同源物之一或多個部分的人類跨膜蛋白之一或多個部分。在一些實例中，嵌合跨膜蛋白包含所關注之跨膜蛋白之細胞外域，諸如N末端細胞外域、C末端細胞外域、及/或細胞外環結構域，其介於所關注之跨膜蛋白之一或多個跨膜域之間。該非人類同源物可為任何非人類動物，諸如，例如小鼠、大鼠、山羊、倉鼠、豬、黑猩猩、馬、綿羊、猴子及天竺鼠。在一特定實施例中，非人類哺乳動物為小鼠、大鼠或山羊。在一特定實施例中，非人類哺乳動物為小鼠。
在本發明之方法之例示性實施例中，該所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自所關注之人類跨膜蛋白的一或多個細胞外環結構域，及來自跨膜蛋白之非人類同源物之胺基末端域及/或羧基末端域。在一個實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自人類跨膜蛋白之一或多個細胞外環結構域及羧基末端域及來自跨膜蛋白之非人類同源物之胺基末端域。在另一實施例中，該所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自人類跨膜蛋白之一或多個細胞外環結構域及胺基末端域，及來自跨膜蛋白之非人類同源物之羧基末端域。在另一實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自人類跨膜蛋白之胺基末端域及羧基末端域以及來自跨膜蛋白之非人類同源物之一或多個細胞外環結構域。在一個實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自人類跨膜蛋白之胺基末端域以及一或多個細胞外環結構域及來自跨膜蛋白之非人類同源物之羧基末端域。在又另一實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自非人類同源物之一或多個細胞外環結構域以及來自跨膜蛋白之非人類同源物之胺基末端域。
在該等方法的其它實施例中，非人類動物或經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以所關注之全長人類跨膜蛋白、編碼其相同或其組合之核酸序列免疫接種。脾細胞係自經免疫接種之非人類動物分離出來，且與經標記之抗體一起培育成B細胞標記物（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體），以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋跨膜蛋白之非人類同源物之生物素化的脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由複合物所呈現之所關注之非人類跨膜蛋白（抗原）與細胞製造之交叉反應抗體之間的結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至呈現於所關注之非人類跨膜蛋白與所關注之人類跨膜蛋白上之表位之交叉反應抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在包含使用所關注之跨膜蛋白或其部分之非人類同源物的本發明方法實施例中，該非人類同源物可為任何非人類生物體。非人類生物體之某些實例包含但不限於非人類哺乳動物、爬蟲、魚類、細菌、昆蟲及病毒。在一些實施例中，非人類蛋白可來自小鼠、大鼠、山羊、倉鼠、豬、黑猩猩、馬、羊、猴及天竺鼠。在特定實施例中，非人類蛋白同源物係來自小鼠、大鼠或山羊。在一特定實施例中，非人類同源物為所關注之跨膜蛋白的小鼠同源物。
在該等方法的一些實施例中，非人類動物或經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以所關注之全長人類跨膜蛋白、編碼該相同或其組合之核酸序列免疫接種，脾細胞自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）且培育一部分的所關注之全長人類跨膜（肽阻斷劑），以允許肽阻斷劑與會特異地結合至位於該阻斷劑上之表位之細胞所製造之抗體之間的結合。亦將細胞與標記的抗體一起培育成B細胞標記物（例如，螢光素標記之抗IgG抗體），以辨識B細胞群體及涵蓋全長跨膜蛋白之具有生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物，以容許由複合物呈現之所關注之全長跨膜蛋白（抗原）與群體中剩餘的未結合細胞所製造的抗體之間的結合。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合。接著可洗滌細胞以移除與肽阻斷劑結合的所有細胞、未結合且過量的PE-鏈黴親和素以及來自分類中的B細胞標記物的標記抗體。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至不呈現於與肽阻斷劑相對應的部分之所關注之全長人類跨膜蛋白上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在包含使用阻斷劑之方法的實施例中，該阻斷劑可為任何分子，諸如，例如肽、多肽、化學化合物。在此類實施例中，該阻斷劑可為對應於一部分所關注之跨膜蛋白的多肽或肽、多肽或對應於一部分MSP蛋白之多肽、或可偵測標記物，諸如，His標籤或Flag標籤。在一些實施例中，阻斷劑包含可偵測標記。在其它實施例中，阻斷劑不包含可偵測標記。在一個實施例中，阻斷劑為所關注之跨膜蛋白的肽或多肽部分，其可與抗體生成細胞群一起培育，以容許該阻斷劑與由特異結合位於該阻斷劑上之表位的該抗體生成細胞製造之抗體之間的結合。在一個實施例中，阻斷劑為所關注之截短跨膜蛋白。在一特定實施例中，該阻斷劑為一多肽，其對應於所關注之全長跨膜蛋白的一或多個細胞外環結構域、胺基端及羧基端部分。在一特定實施例中，阻斷劑可為包括有所關注之全長跨膜蛋白之胺基端部分的多肽。在另一個實施例中，阻斷劑可為包括有所關注之全長跨膜蛋白之羧基端部分的多肽。在一個實施例中，阻斷劑可為包括有所關注之全長跨膜蛋白之細胞外環結構域的多肽。在一些實施例中，該阻斷劑包含所關注之跨膜蛋白之細胞外域，諸如N末端細胞外域、C末端細胞外域、及/或介於所關注之全長跨膜蛋白之一或多個跨膜域的細胞外環結構域。在另一個實施例中，該阻斷劑為MSP蛋白之肽或多肽部分，其可與抗體生成細胞群一起培育，以容許該阻斷劑與由特異結合至位於該阻斷劑上之表位之抗體生成細胞製造之抗體之間的結合。在又一實施例中，該阻斷劑為位於MSP或所關注之跨膜蛋白上的肽或多肽可偵測標記物，其可與抗體生成細胞群一起培育，以容許該阻斷劑與由特異結合至位於該阻斷劑上的表位該抗體生成細胞所製造之抗體之間的結合 。
在該等方法的其它實施例中，非人類動物或經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以所關注之全長人類跨膜蛋白的一部分、編碼相同或其組合之核酸序列（免疫原）免疫接種。
在一些實施例中，脾細胞是自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）中分離，且與經標記之抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。 亦將細胞與涵蓋全長人類跨膜蛋白之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由複合物所呈現之所關注之全長跨膜蛋白（抗原）和細胞所製造之抗體之間的結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至位於一部分所關注抗原之全長人類跨膜蛋白上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體，其亦對應於存在於免疫原上或由免疫原所編碼之胺基酸序列或結構域。
在該等方法的其它實施例中，非人類動物或經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以一部分所關注之全長人類跨膜蛋白（免疫原）、編碼該相同或其組合之核酸序列免疫接種，脾細胞自經免疫接種之基因工程化動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，且與標記之抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋用作免疫原之人類跨膜蛋白部分之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由複合物所呈現之所關注之人類跨膜蛋白（抗原）上之表位和細胞所製造之抗體之間的結合。隨後，細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合，然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集由複合物所呈現之表現結合至抗原上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在包含了使用所關注之跨膜蛋白之一部分的當前方法之實施例中，該跨膜蛋白之部分為不包含所關注之全長跨膜蛋白的肽或多肽。在一個實施例中，所關注之跨膜蛋白的部分可為經修飾之跨膜蛋白，其不包含所關注之全長跨膜蛋白之一或多個細胞外環結構域、胺基末端及/或羧基末端部分。在一特定實施例中，經修飾之所關注之跨膜蛋白可為截短跨膜蛋白。在一些實施例中，所關注之跨膜蛋白的部分包含可偵測標記。在其他實施例中，所關注之跨膜蛋白的部分不包含可偵測標記。在某些實施例中，所關注之截短跨膜蛋白包含所關注之跨膜蛋白之至少整個跨膜部分。在某些實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白的胺基端部分。在另一實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之羧基端部分。在一些實施例中，截短蛋白包含所關注之跨膜蛋白之細胞外域，諸如N端細胞外域、C端細胞外域、及/或細胞外環結構域，其位於所關注之跨膜蛋白之一或多個跨膜域之間。在一個實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之細胞外環結構域。
在該等方法的另一態樣中，不表現來自內源性基因之所關注之跨膜蛋白的基因改造動物係以所關注的非人類跨膜蛋白或其部分、編碼相同或其組合之核酸序列進行免疫接種。
所關注的非人類跨膜蛋白及經基因工程改造之動物可來自相同或不同的動物。所關注的非人類跨膜蛋白係可來自任何非人類生物體。非人類生物體之非限制性實例包含但不限於非人類哺乳動物、爬蟲、魚、細菌、昆蟲及病毒。在一些實施例中，該非人類跨膜蛋白係來自動物，諸如，例如小鼠、大鼠、山羊、倉鼠、豬、黑猩猩、馬、綿羊、猴及天竺鼠。在一特定實施例中，非人類為哺乳類。在其它實施例中，非人類跨膜蛋白係來自小鼠、大鼠或山羊。在一特定實施例中，非人類哺乳動物為小鼠。
在該等方法的特定實施例中，經基因工程改造之動物為非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，其係以所關注之全長非人類跨膜蛋白、編碼相同或其組合（免疫原）之核酸序列免疫接種。脾細胞自經免疫接種之基因工程化動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，且與標記之抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋全長非人類跨膜蛋白之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由複合物所呈現之所關注之跨膜蛋白（抗原）和細胞所製造之抗體之間的結合。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素標記的（例如，Bir-A）膜支架蛋白結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至所關注之全長非人類跨膜蛋白上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在該等方法的其它實施例中，一種經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以所關注之全長非人類跨膜蛋白、編碼該相同或其組合（免疫原）之核酸序列免疫接種，且脾細胞自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，且與標記之抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋所關注之全長人類跨膜蛋白之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由複合物所呈現之所關注之人類跨膜蛋白（抗原）和細胞所製造之抗體之間的結合。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素標記的（例如，Bir-A）膜支架蛋白結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至所關注之全長非人類跨膜蛋白與所關注之非人類跨膜蛋白上之表位之交叉反應抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在該等方法的一些實施例中，一種經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以所關注之全長非人類跨膜蛋白、編碼該相同或其組合（免疫原）之核酸序列免疫接種，且脾細胞自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，且與標記之抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋一部分全長非人類跨膜蛋白之生物素化之脂質雙層膜支架蛋白複合物(諸如截短跨膜蛋白)一起培育，以容許由複合物所呈現之所關注之跨膜蛋白（抗原）部分上之表位和細胞所製造之抗體之間的結合。隨後，細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合，然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集由複合物所呈現之表現結合至抗原上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在含有包括了所關注之跨膜蛋白之部分之脂質雙層膜支架蛋白複合物之該等方法的實施例中，由該複合物呈現之跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白。在一個實施例中，所關注之跨膜蛋白為截短跨膜蛋白，其不包含所關注之全長跨膜蛋白之一或多個細胞外環結構域、胺基末端及/或羧基末端部分。在某些實施例中，所關注之截短跨膜蛋白包含所關注之跨膜蛋白之至少整個跨膜部分。在一些實施例中，截短蛋白包含所關注之跨膜蛋白之細胞外域，諸如N端細胞外域、C端細胞外域、及/或細胞外環結構域，其位於所關注之跨膜蛋白之一或多個跨膜域之間。在一特定實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白的胺基端部分。在另一實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之羧基端部分。在一個實施例中，截短跨膜蛋白不包含所關注之全長跨膜蛋白之細胞外環結構域。
在該等方法的某些實施例中，一種經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以所關注之全長非人類跨膜蛋白、編碼該相同或其組合之核酸序列免疫接種，且脾細胞自經免疫接種之動物分離出來，且與標記之抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋嵌合跨膜蛋白之生物素化之脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，該嵌合跨膜蛋白包括所關注之跨膜蛋白之非人類同源物的一部分及所關注之人類跨膜蛋白的一部分，以容許由複合物所呈現之所關注之嵌合跨膜蛋白（抗原）之非人類部分和細胞所製造之抗體之間的結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至所關注之嵌合跨膜蛋白之非人類部分上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在包含使用所關注之嵌合跨膜蛋白的該等方法之實施例中，該嵌合蛋白可包含來自如本文所述之兩種不同物種之所關注之跨膜蛋白的一部分。舉例而言，嵌合跨膜蛋白可包含可操作地連接至跨膜蛋白之非人類同源物之一或多個部分的人類跨膜蛋白之一或多個部分。在一些實例中，嵌合跨膜蛋白包含所關注之跨膜蛋白之細胞外域，諸如N末端細胞外域、C末端細胞外域、及/或細胞外環結構域，其介於所關注之跨膜蛋白之一或多個跨膜域之間。 該非人類同源物可為任何非人類動物，諸如，例如小鼠、大鼠、山羊、倉鼠、豬、黑猩猩、馬、綿羊、猴子及天竺鼠。在一特定實施例中，非人類哺乳動物為小鼠、大鼠或山羊。在一特定實施例中，非人類哺乳動物為小鼠。
在本發明之方法之例示性實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自人類跨膜蛋白的一或多個細胞外環結構域，及來自跨膜蛋白之非人類同源物的胺基端結構域及/或羧基末端結構域。在一個實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含一或多個細胞外環結構域以及來自人類跨膜蛋白之羧基末端域及來自跨膜蛋白之非人類同源物之胺基末端域。在另一實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含一或多個細胞外環結構域及來自人類跨膜蛋白之胺基末端域及來自跨膜蛋白之非人類同源物之羧基末端域。在另一實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自人類跨膜蛋白之胺基末端域及羧基末端域以及來自跨膜蛋白之非人類同源物之一或多個細胞外環結構域。在一個實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自人類跨膜蛋白之胺基末端域以及一或多個細胞外環結構域及來自跨膜蛋白之非人類同源物之羧基末端域。在又另一實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自非人類同源物之一或多個細胞外環結構域以及來自跨膜蛋白之非人類同源物之胺基末端域。
在該等方法的其它實施例中，經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以所關注之全長非人類跨膜蛋白的一部分、編碼相同或其組合（免疫原）之核酸序列免疫接種。
在一此類例示性實施例中，脾細胞自經免疫接種基因工程動物分離出，且與標記抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。 亦將細胞與涵蓋全長非人類跨膜蛋白之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由複合物所呈現之所關注之全長跨膜蛋白（抗原）和細胞所製造之抗體之間的結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至一部分所關注抗原之全長非人類跨膜蛋白上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質群體，其亦對應於存在於免疫原上或由免疫原所編碼之胺基酸序列或結構域。
在該等方法的其它實施例中，一種經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以一部分所關注之全長非人類跨膜蛋白（免疫原）、編碼該相同或其組合之核酸序列免疫接種，且脾細胞自經免疫接種之非人類動物(例如，大鼠或小鼠)分離出來，且與標記之抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋用作免疫原之非人類跨膜蛋白的部分之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許在由該複合物所呈現之所關注之人類跨膜蛋白（抗原）部分上之表位和細胞所製造的抗體之間的結合。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集由複合物所呈現之表現結合至抗原上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在該等方法的另一態樣中，不表現來自內源性基因之所關注之跨膜蛋白的基因工程化動物係以所關注之嵌合跨膜蛋白或編碼其之核酸免疫接種。
在包含了使用所關注之嵌合跨膜蛋白的實例中，該嵌合蛋白可包含來自如本文所述之兩種不同物種之所關注之跨膜蛋白的部分。舉例而言，嵌合跨膜蛋白可包含可操作地連接至跨膜蛋白之非人類同源物之一或多個部分的人類跨膜蛋白之一或多個部分。 在一些實例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含所關注之人類跨膜蛋白之細胞外域，諸如N末端細胞外域、C末端細胞外域及/或細胞外環結構域，其可操作地連接至所關注之跨膜蛋白之一或多個跨膜域。 該非人類同源物可為任何非人類動物，諸如，例如小鼠、大鼠、山羊、倉鼠、豬、黑猩猩、馬、綿羊、猴子及天竺鼠。在一特定實施例中，非人類哺乳動物為小鼠、大鼠或山羊。在一特定實施例中，非人類哺乳動物為小鼠。
在本發明之方法之例示性實施例中，該所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自所關注之人類跨膜蛋白的一或多個細胞外環結構域，及來自跨膜蛋白之非人類同源物之胺基末端域及/或羧基末端域。在一個實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自人類跨膜蛋白之一或多個細胞外環結構域及羧基末端域及來自跨膜蛋白之非人類同源物之胺基末端域。在另一實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含一或多個細胞外環結構域及來自人類跨膜蛋白之胺基末端域及來自跨膜蛋白之非人類同源物之羧基末端域。在另一實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自人類跨膜蛋白之胺基末端域及羧基末端域以及來自跨膜蛋白之非人類同源物之一或多個細胞外環結構域。在一個實施例中，所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自人類跨膜蛋白之胺基末端域以及一或多個細胞外環結構域及來自跨膜蛋白之非人類同源物之羧基末端域。在又另一實施例中，該所關注之嵌合跨膜蛋白包含來自可操作地連接至跨膜結構域之非人類同源物之一或多個細胞外環結構域，及來自跨膜蛋白之非人類同源物之胺基末端域。
在該等方法的一個特定實施例中，一種經基因工程改造之非人類動物，諸如，例如小鼠或大鼠，係以含有一部分人類跨膜蛋白與跨膜蛋白之一部分非人類同源物之嵌合跨膜蛋白、編碼該相同或其組合之核酸序列免疫接種，且脾細胞自經免疫接種之非人類動物(例如，大鼠或小鼠)分離出來，且與標記之抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋所關注之全長人類跨膜蛋白（抗原）之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由複合物所呈現之人類抗原和細胞所製造之特異於所關注之嵌合跨膜蛋白之人類部分的抗體之間的結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至所關注之嵌合跨膜蛋白之人類部分上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在該等方法的另一實施例中，一種經基因工程改造之非人類動物(諸如，例如小鼠或大鼠)係以包含所關注之人類跨膜蛋白的一部分及所關注之跨膜蛋白之一部分非人類同源物之嵌合跨膜蛋白、編碼該相同或其組合之核酸序列免疫接種，脾細胞自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，並與標記抗體一起培育成B細胞標記物（例如，螢光素標記的抗IgG抗體），以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋一部份所關注之全長人類跨膜蛋白(抗原)之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由該複合物所呈現之人類抗原和特異結合所關注之嵌合跨膜蛋白之人類部分的細胞所製造的抗體之間的結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至所關注之嵌合跨膜蛋白之人類部分上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在又另一實施例中，這些方法，一種經基因工程改造之非人類動物(諸如，例如小鼠或大鼠)係以含有所關注之人類跨膜蛋白的一部分及所關注之跨膜蛋白之一部份非人類同源物之嵌合跨膜蛋白、編碼該相同或其組合之核酸序列免疫接種，脾細胞自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，並與標記抗體一起培育成B細胞標記物（例如，螢光素標記的抗IgG抗體），以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋所關注之全長非人類跨膜蛋白（抗原）之生物素化脂雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由複合物所呈現之非人類抗原和特異於所關注之嵌合跨膜蛋白之非人類部分的細胞所製造之抗體之間的結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至所關注之嵌合跨膜蛋白之非人類部分上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在該等方法的另一實施例中，一種經基因工程改造之非人類動物(諸如，例如小鼠或大鼠)係以包含所關注之人類跨膜蛋白的一部分及所關注之跨膜蛋白之一部分非人類同源物之嵌合跨膜蛋白、編碼該相同或其組合之核酸序列免疫接種，脾細胞自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，並與標記抗體一起培育成B細胞標記物（例如，螢光素標記的抗IgG抗體），以辨識B細胞群體。亦將細胞與涵蓋一部分所關注之全長非人類跨膜蛋白（抗原）之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由複合物所呈現之非人類抗原和特異於所關注之嵌合跨膜蛋白之非人類部分的細胞所製造之抗體之間的結合。然後可洗滌細胞。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至所關注之嵌合跨膜蛋白之非人類人類部分上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在該等方法的另一態樣中，非人類動物或經基因工程改造之非人類動物(諸如，例如小鼠或大鼠)係以涵蓋所關注之全長跨膜蛋白或其部分的脂質雙層膜支架蛋白複合物進行免疫接種。
在該等方法的一些實施例中，非人類動物或經基因工程改造之非人類動物(諸如，例如小鼠或大鼠)係以涵蓋所關注之全長人類跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物進行免疫接種。脾細胞係自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，並與一或複數個對應於包含在複合物中之MSP蛋白中之每一者的阻斷劑、包含在複合物中或附著於所關注之跨膜蛋白之每個可偵測標記一起培育(諸如His標籤或Flag標籤)，以容許該阻斷劑與特異結合至位於該阻斷劑上之表位的細胞所製造之抗體之間的結合。亦將細胞與標記抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。然後將細胞與涵蓋全長人類跨膜蛋白之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以允許由該複合物所呈現之所關注之全長跨膜蛋白（抗原）和群體中剩餘未結合細胞所製造之抗體之間的結合。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合。接著可洗滌細胞以移除結合至阻斷劑的所有細胞以及未結合和過量的PE-鏈黴親和素以及來自分類之B細胞標記物的標記抗體。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至所關注之全長人類跨膜蛋白上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在該等方法的一個實施例中，非人類動物或經基因工程改造之非人類動物(諸如，例如小鼠或大鼠)係以涵蓋所關注之全長人類跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物進行免疫接種。脾細胞係自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，並與一或複數個對應於包含在複合物中之MSP蛋白中之每一者的阻斷劑、包含在複合物中或附著於所關注之跨膜蛋白之每個可偵測標記一起培育(諸如His標籤或Flag標籤)，以容許該阻斷劑與特異結合至位於該阻斷劑上之表位的細胞所製造之抗體之間的結合。亦將細胞與標記抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。接著將細胞與涵蓋一部份人類跨膜蛋白之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由該複合物所呈現之所關注跨膜蛋白（抗原）的部分和群體中剩餘未結合細胞所製造之抗體之間的結合。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合。接著可洗滌細胞以移除結合至阻斷劑的所有細胞以及未結合和過量的PE-鏈黴親和素以及來自分類之B細胞標記物的標記抗體。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至該複合物所呈現之部分所關注之全長人類跨膜蛋白上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在該等方法的其它實施例中，不表現來自內源性基因的所關注之跨膜蛋白的基因工程化非人類動物(諸如，例如小鼠或大鼠)，係以涵蓋所關注之全長非人類跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物免疫接種。脾細胞係自經免疫接種之非人類動物（例如，大鼠或小鼠）分離出來，並與一或複數個對應於包含在複合物中之MSP蛋白中之每一者的阻斷劑、包含在複合物中或附著於所關注之跨膜蛋白之每個可偵測標記一起培育，諸如，His標籤或Flag標籤，以容許該阻斷劑與特異結合至位於該阻斷劑上之表位的細胞所製造之抗體之間的結合。亦將細胞與標記抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。然後細胞與涵蓋全長非人類跨膜蛋白之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由該複合物所呈現之所關注之全長跨膜蛋白（抗原）和群體中剩餘未結合細胞所製造之抗體之間的結合。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合。接著可洗滌細胞以移除結合至阻斷劑的所有細胞以及未結合和過量的PE-鏈黴親和素以及來自分類之B細胞標記物的標記抗體。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至所關注之全長非人類跨膜蛋白上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在該等方法的一些實施例中，不表現來自內源性基因的所關注之跨膜蛋白的基因工程化非人類動物(諸如，例如小鼠或大鼠)，係以涵蓋一部份所關注之全長非人類跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物免疫接種。脾細胞係自經免疫接種動物分離出來，並與一或複數個對應於包含在複合物中之MSP蛋白中之每一者的阻斷劑、包含在複合物中或附著於所關注之非人類跨膜蛋白部分之每個可偵測標記一起培育，諸如，His標籤或Flag標籤，以容許該阻斷劑與特異結合至位於該阻斷劑上之表位的細胞所製造之抗體之間的結合。亦將細胞與標記抗體（例如，經螢光素標記之抗IgG抗體）一起培育成B細胞標記物，以辨識B細胞群體。隨後將細胞與涵蓋一部份全長非人類跨膜蛋白或所關注之全長非人類跨膜蛋白(抗原)之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育，以容許由該複合物所呈現之所關注之跨膜蛋白和群體中剩餘未結合細胞所製造之抗體之間的結合。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合。接著可洗滌細胞以移除結合至阻斷劑的所有細胞以及未結合和過量的PE-鏈黴親和素以及來自分類之B細胞標記物的標記抗體。可藉由FACS偵測PE螢光及來自結合B細胞之信號（例如，螢光素標記的抗IgG信號），以辨識及收集表現結合至部分所關注之全長非人類跨膜蛋白上之表位之抗體的抗體生成B細胞的均質細胞群體。
在包含使用阻斷劑之方法的實施例中，該阻斷劑可包括任何分子，諸如，例如肽、多肽、化學化合物。在此類實施例中，該阻斷劑可為對應於一部分所關注之跨膜蛋白的多肽或肽、多肽或對應於一部分MSP蛋白之多肽、或可偵測標記物（諸如His標籤或Flag標籤）。在一些實施例中，阻斷劑包含可偵測標記。在其它實施例中，阻斷劑不包含可偵測標記。在一個實施例中，阻斷劑為所關注之跨膜蛋白的肽或多肽部分，其可與抗體生成細胞群一起培育，以容許該阻斷劑與由特異結合位於該阻斷劑上之表位的該抗體生成細胞製造之抗體之間的結合。在一個實施例中，阻斷劑為所關注之截短跨膜蛋白。在一特定實施例中，該阻斷劑為一多肽，其對應於所關注之全長跨膜蛋白的一或多個細胞外環結構域、胺基端及羧基端部分。在一特定實施例中，阻斷劑可為包括有所關注之全長跨膜蛋白之胺基端部分的多肽。在另一個實施例中，阻斷劑可為包括有所關注之全長跨膜蛋白之羧基端部分的多肽。在一個實施例中，阻斷劑可為包括有所關注之全長跨膜蛋白之細胞外環結構域的多肽。 在一些實施例中，阻斷劑為截短蛋白，其包含所關注之跨膜蛋白之細胞外域，諸如N末端細胞外域、C末端細胞外域及/或介於所關注之跨膜域蛋白之一或多個跨膜域之間的細胞外環結構域。在另一個實施例中，該阻斷劑為MSP蛋白之肽或多肽部分，其可與抗體生成細胞群一起培育，以容許該阻斷劑與由特異結合至位於該阻斷劑上之表位之抗體生成細胞製造之抗體之間的結合。在又一實施例中，該阻斷劑為位於MSP或所關注之跨膜蛋白上的肽或多肽可偵測標記物，其可與抗體生成細胞群一起培育，以容許該阻斷劑與由特異結合至位於該阻斷劑上的表位該抗體生成細胞所製造之抗體之間的結合。
所揭示方法包含偵測、分選及收集抗體生成細胞，這些抗體生成細胞結合至由涵蓋所關注之跨膜蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物所呈現之抗原。偵測、分選和收集可組合或作為不同步驟執行。偵測、分選及/或收集可包含藉由偵測複合物上的一個或多個可偵測標記，以識別由複合物呈現之所關注之跨膜蛋白所結合的細胞。結合的細胞可接著自未結合的細胞分離出來（即，分選），並被選擇以供進一步使用。
在一些實施例中，抗體生成細胞與呈現所關注之跨膜蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物之間的相互作用係藉由所關注之跨膜蛋白的構象變化、所關注之跨膜蛋白在細胞中之活化或失活、或藉由使用可偵測標記（例如，螢光分子、FLAG標籤、His標籤）而被偵測到，以辨識及捕捉含有所關注之跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物所結合的細胞。可藉由用特異於標籤的抗體免疫染色或用結合於標籤的試劑直接染色來進行偵測。許多偵測套件及技術為本領域所熟知的。
在該等方法的某些實施例中，細胞係用緩衝液洗滌約5分鐘至約60分鐘期間，以移除未結合的抗原；可使用總共10至120分鐘的多次清洗，例如，10分鐘洗滌3次或30分鐘洗滌1次；每10-15分鐘洗滌2-4次。在一個實施例中，可使用之清洗細胞的時間包括總共約10分鐘、或約15分鐘或約20分鐘、或約25分鐘、或約30分鐘、或約35分鐘、或約40分鐘、或約45分鐘、或約50分鐘、或約55分鐘或約60分鐘洗滌一次（1）。在一些實施例中，可使用之清洗細胞的時間包括每約5分鐘、或約10分鐘、或約15分鐘或約20分鐘、或約25分鐘、或約30分鐘每次洗滌兩次（2）。可以考慮額外的洗滌間隔，實質上等同於本文所述的那些洗滌間隔。
在一些實施例中，可使用螢光活化細胞分選（FACS）來進行偵測、分類及收集，以偵測、分選及選擇表現特異於跨膜蛋白之抗體的單抗體生成細胞。透過流式細胞儀分離單細胞的方案是廣為人知的 （Huang, J.等人，2013，見上）。舉例而言，與由經標記的（例如螢光標籤）脂質雙層膜支架蛋白複合物（或螢光標記之鏈黴親和素/生物素化抗原）所呈現之抗原結合的細胞可被偵測且辨識為表現專門結合至抗原（即，所關注之跨膜蛋白）之抗體的細胞，且隨後在96孔、或384孔培養盤上的各個孔中收集。
一旦收集後，可由共同細胞培養技術繁殖單抗體生成細胞，以用於隨後之DNA製備。替代地，抗體基因可直接從單一抗體生成細胞擴增，且隨後選殖至DNA載體中。
單抗體生成細胞可藉由本領域已知之替代方法分選及收集，包含但不限於手動單細胞篩選、所吸附抗原之有限稀釋及B細胞置盤，其全為本領域中所熟知的。參見，例如，Rolink等人，實驗醫學雜誌(J Exp Med) (1996)183:187-194； Lightwood, D.等人，免疫學方法雜誌（J. Immunol. Methods）(2006) 316(1-2):133-43。 自表現所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞所獲得之核酸生成抗體。
編碼抗體或其片段的核酸可自使用本文所述方法生成及獲得之抗體生成細胞中分離出來。
在一些實施例中，核酸編碼抗體之片段，諸如可變域、穩定域或其組合。在某些實施例中，自抗體生成細胞分離之核酸編碼抗體之可變域。在一些實施例中，核酸編碼抗體重鏈或其片段。在其它實施例中，核酸編碼抗體輕鏈或其片段。
在某些實例中，自抗體生成細胞分離的核酸係表現於宿主細胞中。舉例而言，自抗體生成細胞分離出之核酸可在宿主細胞（諸如哺乳動物細胞、細菌細胞或昆蟲細胞）中表現（例如，經複製且重組再製）。在一些實施例中，宿主細胞係在表現核酸之條件下培養，且隨後可製造抗體或其部分，並分離以用於進一步的使用。用於自經分離的核酸製造抗體之方法為本領域中所熟知的，且任何此類方法都可以與本公開內容結合使用。
在一些實施例中，包括有上述核酸中之一或多者的宿主細胞係在表現全長抗體之條件下培養，且隨後可製造該抗體，並分離以用於進一步使用。在某些實施例中，宿主細胞包括編碼抗體之可變域的核酸，且細胞在表現可變域之條件下培養。在其它實施例中，宿主細胞包括編碼抗體之可變重鏈（V H）結構域的核酸，且細胞在表現V H結構域之條件下培養。在另一個實施例中，該宿主細胞包括編碼抗體之可變輕鏈（V L） 結構域的核酸，且細胞係在表現V L結構域之條件下培養。在特定實施例中，該宿主細胞包括編碼抗體之V H結構域的核酸及編碼抗體之V H結構域的核酸，且細胞係在表現V H結構域及V L結構域之條件下培養。
在一些實施例中，DNA可自宿主分離以重組製造抗體。一般而言，編碼免疫球蛋白可變重鏈及可變輕鏈（即，V H、V L、Vκ及Vλ）之基因或核酸可使用RT-PCR方案與從抗體生成細胞中分離的核酸進行回收。此等RT-PCR方案為熟知且習知的技術，例如如Wang等人，免疫學方法雜誌( J. Immunol. Methods)(2000) 244:217-225及本文中所述。
一旦回收後，抗體編碼基因或核酸可選殖至IgG重鏈及輕鏈表現載體內，並藉由轉染宿主細胞表現。舉例而言，可將抗體編碼基因或核酸插入至可複製載體中以用於進一步選殖（DNA擴增）或用於在細胞中表現（穩定或暫態）。許多載體(尤其是表現載體)是可用的，或可經工程改造以包括調節抗體編碼基因或核酸之表現所需的適當調控元件。
本發明之上下文中的表現載體可為任何合適載體，包含如本文所述之染色體、非染色體及合成核酸載體（包括有一組合適表現控制元件的核酸序列）。此類載體之實例包含SV40衍生物、細菌質體、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質體、衍生自質體及噬菌體DNA之組合之載體，及病毒核酸（RNA或DNA）載體。
在一些實施例中，核酸分子係包含在裸DNA或RNA載體中，包含例如直鏈表現元件（例如如Sykes及Johnston，自然-生物技術( Nat Biotech) (1997) 12:355-59)中所述）、壓縮核酸載體（例如在US 6,077,835中所述）、或質體載體（諸如pBR322或pUC 19/18）。此類核酸載體及其用途為本技術領域中所熟知的。參見，例如US 5,589,466及US 5,973,972。
在某些實施例中，表現載體可為適合在酵母菌系統中表現之載體。可使用適合在酵母菌系統中表現的任何載體。適合載體包含例如包括有固有或誘導型啟動子（諸如酵母α因子、醇氧化酶及PGH）之載體。參見F. Ausubel等人編制，目前有關分子生物學的方案（Current Protocols in Molecular Biology），Greene Publishing及Wiley InterScience 紐約（1987）；以及Grant等人，酵素學方法( Methods in Enzymol) 153, 516-544 (1987)。
在某些實施例中，該載體包括編碼抗體之重鏈的核酸分子（或基因）及編碼抗體之輕鏈的核酸分子（或基因），其中該抗體係由已藉由本發明之方法獲得的抗體生成細胞所製造。一般而言，所用載體包含表現載體，其包括有所述核酸分子（或基因），其中該核酸分子（或基因）係可操作地連接至適於在宿主細胞中表現的表現控制序列。
載體的選擇部分依賴於所使用的宿主細胞。宿主細胞包含但不限於源於原核或真核（一般為哺乳動物）的細胞。
可以理解的是，該全長抗體核酸序列或基因可隨後選殖至一適當載體或多個載體中。替代地，經分離抗體之Fab區可選殖至與任何同型穩定區一致的一載體或多個載體中。因此，任何穩定區可用於構築經分離的抗體，包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD及IgE重鏈穩定區、或嵌合重鏈穩定區。此類穩定區可視抗體之預期用途而自任何人類或動物物種獲得。此外，抗體可變區或Fab區可在適當載體中選殖，以便以其它形式(諸如ScFv、雙抗等)之蛋白質表現。
因此，本發明亦提供編碼核酸分子之哺乳動物宿主細胞，其包括有特異於所關注之跨膜蛋白的全長抗體，其中該抗體編碼核酸或基因係自根據本發明方法所獲得之抗體生成細胞分離出。在一個實施例中，初級抗體生成細胞為自經免疫接種哺乳動物獲得之異質細胞群體分離出的B細胞。
在一些實施例中，細胞為細菌或酵母菌細胞。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。在其它實施例中， 該宿主細胞可以為，例如中國倉鼠卵巢細胞（CHO）(諸如，CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO細胞；COS（例如：COS-7）； 幹細胞；視網膜細胞；Vero細胞；CV1細胞；腎臟細胞(諸如，例如 HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21細胞)；海拉细胞；HepG2細胞；WI38；MRC 5；Colo25；HB 8065；HL-60；Jurkat或Daudi細胞；A431(表皮)細胞；CV-1、U937、3T3或L-細胞；C127細胞、SP2/0、NS-0或MMT細胞、腫瘤細胞、及衍生自前述細胞中之任一者的細胞株。在一特定實施例中，宿主細胞為CHO細胞。在一特定實施例中，宿主細胞為CHO K1細胞。
本領域熟知的該等術語一抗體及多個抗體係指免疫系统的抗原结合蛋白。如本文所述之術語「抗體」包含具有抗原結合區及其任一片段之完整全長抗體，其中該「抗原結合部分」或「抗原結合區」係保留、或單鏈(例如，單鏈可變片段（scFv）。「全長抗體」為包括有藉由雙硫鍵連接之至少兩個重（H）鏈及兩個輕（L）鏈的醣蛋白。每個重鏈係包括重鏈可變域(V H)及重鏈穩定(CH)區。重鏈穩定區係包括三個結構域CH1、CH2和CH3。每個輕鏈係包括輕鏈可變域(V L)及輕鏈穩定CL區。輕鏈穩定區係包括一個CL結構域。V H和V L區可進一步細分為高可變性區，稱為互補決定區(CDR)，其間穿插著較保守的區域，稱為框架區(FR)。每個V H和V L係由三個CDR和四個FR，以下列順序由胺基末端排列至羧基末端所組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。
如本發明所示，本發明可用於獲得結合至所關注之跨膜蛋白的抗體。從如本文所述之抗體生成細胞獲得之抗體可使用本領域中已知方法來表徵。舉例而言，可測定本文中所生成之抗體中之任一者的結合親和力、特定表位辨識或功能能力。
「結合親和力」通常係指分子（例如，抗體）之單一結合位點與其結合搭配物（例如，抗原）之間非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示，否則如本文中所使用，「結合親和力」係指反映結合對之成員（例如，抗體及抗原）之間的1：1相互作用的固有結合親和力。分子與其結合搭配物之親和力通常可由解離平衡常數（KD或K D）表示。K D（莫耳，M）值與結合親和力之間有反向關係，因此K­ D值（M）較小，分子與其結合表位之結合親和力越高。
術語「較高親和力」或「高親和力」係指通常結合較強抗原及/或較快及/或保持較久結合之抗體。一般而言，高親和力抗體需要較低濃度（M）的抗原，以藉由強的結合交互作用達成期望的作用。反之，術語「低親和力」及「較低親和力」係用於反映弱結合力的術語，諸如當與其它結合分子（例如，抗體）相比時，分子與其結合搭配物之間形成相互作用之能力降低。因此當與其他結合分子相比時，低親和力結合分子將具有較大的K D值，及/或將緩慢地結合抗原且易於解離。
術語「kd」（秒-1或1/秒）係指特定抗體-抗原相互作用之解離速率常數，或抗體、Ig、抗體結合片段或分子相互作用之解離速率常數。此值也稱為k-off值。
術語「ka」（M-1 x 秒-1或1/M）係指特定抗體-抗原相互作用之結合速率常數，或抗體、Ig、抗體結合片段或分子相互作用之結合速率常數。
術語「KD」或「K D」（M）係指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常數，或抗體、Ig、抗體結合片段或分子相互作用之平衡解離常數。平衡解離常數係藉由將ka除以kd而得到。
測量結合親和力之各種方法為本領域中已知的，任何該等方法皆可用於本發明的目的。舉例而言，抗體對抗原之結合親和力可藉由表面電漿共振，例如，BIACORE™或溶液-親和力ELISA來量測。
在一些實施例中，抗體與所關注之跨膜蛋白之結合在表現該跨膜蛋白的細胞中賦予其功能性活性（活體外、離體或活體內），或抗體與所關注之跨膜蛋白之結合在感興趣的跨膜蛋白的內源配體存在或不存在的情況下，調控所關注之跨膜蛋白之正常功能性活性。
在某些實施例中，所關注之跨膜蛋白之抗體為跨膜蛋白功能的拮抗劑。拮抗劑抗體意指直接針對抗原（即，所關注之跨膜蛋白）之活性位點且能抑制跨膜蛋白之活性或跨膜蛋白本身的天然配體之活性的抗體。舉例而言，抗體與抗原之結合將降低或禁止所關注之跨膜蛋白的內源性功能。在一非限制性實例中，拮抗劑抗體可結合至所關注之跨膜蛋白，且藉由以結合至跨膜蛋白、受體活化或類似物的配體進行干擾而調節跨膜蛋白功能。
在又另一個實施例中，所關注之跨膜蛋白的抗體為跨膜蛋白促效劑。促效劑抗體意謂在缺乏天然配體下本身能活化所關注之跨膜蛋白（即，抗原）的抗體，其中該促效劑抗體可誘導所關注之跨膜蛋白的功能性活性。舉例而言，抗體與抗原之結合可誘導或增加所關注之跨膜蛋白之內源性功能。在一非限制性實例中，促效劑抗體可結合至所關注之跨膜蛋白，且可藉由活化蛋白質或受體來調節跨膜蛋白功能，例如，藉由改變蛋白質的構形。
用於量測抗體結合及跨膜蛋白功能之測定為本領域具有通常知識者所熟知的。舉例而言，用於量測跨膜蛋白內化、構形變化、磷酸化、配體結合及類似者之測定為本領域中熟知的。
本發明描述係進一步由以下實例說明，其不應被解釋為以任何方式限制。所有引用的參考文獻(包含本申請中引用的文獻參考資料、已核准的專利和已公開的專利申請)的內容在此明確地經由引用將其全部內容併入本文。 實例 實例 1. 生成和收集抗體生成細胞。
如表1中所示，為了進行比較，在小鼠中啟動了幾個免疫活動以產生免疫反應，且生成製造所關注抗原（抗體生成細胞）之抗體的細胞。隨後根據本發明所述之方法收集抗體生成細胞。
一般而言，小鼠係藉由注射免疫原來免疫接種，諸如，例如編碼所關注之跨膜蛋白或其部分之DNA、所關注之純化跨膜蛋白或其部分、含有所關注之跨膜蛋白或其部分的脂質雙層膜支架蛋白複合物、含有所關注之跨膜蛋白的類病毒顆粒（VLP）、或能表現編碼所關注之跨膜蛋白之DNA、或其組合。在某些實例中，免疫原為人類跨膜蛋白或編碼其之DNA。在其他實例中，小鼠係以所關注之嵌合跨膜蛋白、截短形式之跨膜蛋白、所關注之經修飾跨膜蛋白或編碼其之DNA免疫接種。
用於本發明所述方法的跨膜蛋白如下生成。一般而言，編碼跨膜蛋白之核苷酸序列經修飾以包含FLAG標籤及貼附於該跨膜蛋白之羧基末端的組胺酸標籤（10x-His標籤）。經修飾的核苷酸序列係表現於Sf9或Expi293細胞中(Thermo Fisher Scientific)。然後使用N-十二基-β-D-麥芽糖苷（DDM）洗滌劑將細胞溶解且離心，以獲得含有經修飾的跨膜蛋白的洗滌劑可溶分餾物。接著，藉由用結合經修飾跨膜蛋白之抗FLAG親和性珠粒來進行親合性純化，以將經修飾的蛋白質自洗滌劑可溶分餾物中分離出來。隨後洗滌親和性珠粒及蛋白質，且結合之跨膜蛋白被洗脫並收集。藉由SDS-PAGE凝膠電泳及西方墨點法來驗證純化的跨膜蛋白之分離。
形成含有純化跨膜蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物。純化的跨膜蛋白係包含在由DDM和膽固醇琥珀酸單酯（CHS）所組成的洗滌劑混合物中。此跨膜蛋白及洗滌劑混合物係與1至130個膜支架蛋白及含有經修飾的MSP1E3D1膜支架蛋白之脂質混合物混合，其包含用於生物素化之羧基末端處之Bir-A標籤，與卵磷脂（1-棕櫚醯基-2-油醯基-甘油-3-磷膽鹼）脂質，其已溶解於膽酸鈉洗滌劑緩衝液中，以產生由跨膜蛋白、洗滌劑、膜支架蛋白、脂質及含有1個純化跨膜蛋白對20個膜支架蛋白之比率的緩衝液所組成的最終混合物。隨後使用珠粒將洗滌劑自最終混合物中萃取出來，以促進整合所關注之單一跨膜蛋白的盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物之組合。接著使用10x-his標籤親和力純化及/或粒徑篩析層析法，將包含所關注之跨膜蛋白的盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物自不包含所關注之跨膜蛋白的盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物分離出來，以獲得包含所關注之跨膜蛋白的盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物，以供進一步使用。
免疫接種的小鼠不同。在某些群組中，小鼠係經基因工程改造，使得所關注之跨膜蛋白不從內源性基因表現。在其他群組中，小鼠為野生型小鼠，其表現所關注之跨膜蛋白的小鼠同源物。在一些群組中，小鼠係如在美國專利號第8,502,018、8,642,835、8,697,940、8,791,323、9,226,484及WO2019/113065中所闡述進行基因改造；其全部內容藉由引用併入本文。在一些群組中，經免疫接種之基因改造小鼠為VELOCIMMUNE ®小鼠(雷傑納榮製藥公司，柏油村，紐約)，如例如美國專利號8,502,018及/或8,642,835中所描述，其中每一者全部內容藉由引用併入本文。一般而言，用於免疫接種之VELOCIMMUNE ®小鼠包括編碼人類免疫球蛋白重鏈（IgH）及人類免疫球蛋白輕鏈可變區之DNA，且亦可缺乏編碼所關注之跨膜蛋白的內源性小鼠基因。在特定群組中，對包含有人類化IgH基因座及/或人類化Igκ基因座的VELOCIMMUNE ®小鼠進行免疫接種。在一些群組中，對包括有編碼人類免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈(Igλ)可變區之DNA的經基因工程改造小鼠注射免疫原，該經基因工程改造小鼠缺乏編碼所關注之跨膜蛋白的內源性小鼠基因。
使用經改造以表現所關注之跨膜蛋白或其部分的細胞，藉由細胞結合分析來監測抗體免疫反應。一旦在經免疫接種小鼠中確定所需免疫反應，則收取其脾臟。獲取脾細胞，且藉由溶解移除紅血球。
在形成及使用融合瘤的實例中，收集脾細胞並與小鼠骨髓瘤細胞融合以保持其存活性且形成融合瘤細胞株。然後對融合瘤細胞株進行篩選並選擇，以辨識製造所關注之跨膜蛋白之抗體的細胞株。
也用抗原陽性B細胞分離出抗體生成細胞。一旦小鼠經免疫接種，則收取其脾臟。獲取脾細胞，且藉由溶解移除紅血球。接著用特異於B細胞表面標記物（諸如IgG）之螢光素標記抗體將脾細胞染色以辨識B細胞。
一般而言，隨後藉由將B細胞與已知之分類劑接觸來辨識抗體生成B細胞群，諸如經純化之跨膜蛋白或其部分、所關注之嵌合跨膜蛋白、所關注之截短跨膜蛋白、在VLP或外溶體中的所關注之跨膜蛋白、或含有所關注之跨膜蛋白或其部分之脂質雙層膜支架蛋白複合物，以允許所關注之跨膜蛋白結合至存在於B細胞表面上之抗體。隨後使用FACS收集結合的B細胞，以提供表現所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成B細胞群體。在無複合物（對照組）的樣品中，使用肽或多個類病毒顆粒（VLP）過FACS進行分選，以自異質B細胞群體獲得抗體生成B細胞。在具有複合物的樣品中，使用螢光標記的複合物藉由FACS進行分選，以獲得抗體生成B細胞。在此，B細胞與含有所關注之跨膜蛋白的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育。接著將細胞洗滌以移除未結合複合物。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合。接著將細胞在磷酸鹽緩衝液(PBS)中洗滌，以移除過量的PE-鏈黴親和素。藉由FACS分析B細胞樣品之PE螢光，以辨識表現結合至所關注之跨膜蛋白之抗體的細胞群體。 實例 2. 從抗體生成細胞群生成抗體。
為了進行比較，在具有或不具有脂質雙層膜支架蛋白複合物的情況下，藉由傳統融合瘤技術或細胞分選來分離抗體以用於篩選。將來自抗體生成B細胞群之單個細胞在384孔培養盤上之單獨孔中分離。來自這些經分離之抗體生成B細胞之抗體基因的RT-PCR係根據Wang及Stollar，免疫學方法雜誌( Journal of Immunological Methods) (2000) 244: 217–225所描述之方法進行，其全部內容在此藉由引用併入本文。簡言之，藉由反轉錄酶（RT）反應(Superscript TMIII, Invitrogen)合成每個單一抗體生成B細胞之cDNA。接著將各所得RT製品拆分且轉移至兩個384孔培養盤上之兩個對應孔中。使用特異於人類IgG重鏈可變區前導序列的5'退化引子及特異於小鼠重鏈穩定區之3'引子，首先藉由PCR擴增一組所得RT製品，以形成擴增子。隨後使用特異於人類IgG重鏈可變區序列之構架1的5'退化引子組及特異於人類IgG重鏈可變區序列之構架4的3'退化引子組，藉由PCR再次擴增該擴增子。另一組所得RT製品係先使用特異於人類κ或λ輕鏈可變區前導序列的5'退化引子及特異於小鼠κ或λ輕鏈穩定區的3'引子藉由PCR來擴增，以形成擴增子。隨後，使用特異於人類κ或λ輕鏈可變區序列之構架1的5'退化引子組及特異於人類κ或λ輕鏈可變區序列之構架4的3'退化引子組，藉由PCR再次擴增該擴增子。將重鏈及輕鏈PCR製品各自選殖至含有人類IgG1重鏈穩定區及κ輕鏈穩定區之抗體載體中。重組人類IgG1抗體係藉由CHO細胞之暫態轉染來製造。
對之自抗體生成細胞獲得的初篩抗體進行細胞結合測試。所關注之跨膜蛋白與每種抗體之間結合之解離常數係在Biacore™ T200 (GE Healthcare)上測定。在各種條件下的若干活動之結果表明，使用呈現所關注之跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物進行細胞分選在辨識結合至所關注之跨膜蛋白的抗體方面最為成功。參見表1。 表1
所關注之 跨膜蛋白 （抗原） 平台 抗原呈現 策略 免疫原 小鼠品系 結合抗原的抗體 總數# 結合抗原 的抗體 百分比
GPCR3 細胞分選 含有抗原 的複合物 蛋白質 不含抗原之經基因修飾小鼠 118 20.0
GPCR3 混合瘤 NA 蛋白質 不含抗原之經基因修飾小鼠 156 3.5
GPCR3 細胞分選 含有抗原 的複合物 經修飾 DNA 不含抗原之經基因修飾小鼠 63 20.6
GPCR3 混合瘤 NA 經修飾 DNA 不含抗原之經基因修飾小鼠 252 6.5
GPCR4 細胞分選 含有抗原 的複合物 蛋白質 不含抗原之經基因修飾小鼠 313 80.5
GPCR4 混合瘤 NA 蛋白質 不含抗原之經基因修飾小鼠 89 5.6
GPCR4 細胞分選 含有抗原 的複合物 經修飾 DNA 不含抗原之經基因修飾小鼠 213 48.4
GPCR4 混合瘤 NA 經修飾 DNA 不含抗原之經基因修飾小鼠 2002 36.1
GPCR5 細胞分選 含有抗原 的複合物 DNA 不含抗原之經基因修飾小鼠 57 11.6
GPCR5 混合瘤 NA DNA 不含抗原之經基因修飾小鼠 315 7.0
GPCR5 細胞分選 含有抗原 的複合物 蛋白質 不含抗原之經基因修飾小鼠 124 70.5
GPCR5 混合瘤 NA 蛋白質 不含抗原之經基因修飾小鼠 299 15.4
離子通道2 細胞分選 含有抗原 的複合物 蛋白質 基因修飾小鼠 70 39.8
離子通道2 混合瘤 NA 蛋白質 基因修飾小鼠 308 4.3
離子通道2 細胞分選 含有抗原 的複合物 蛋白質 基因修飾小鼠 92 69.7
離子通道2 混合瘤 NA 蛋白質 基因修飾小鼠 43 2.4
GPCR6 細胞分選 含有抗原 的複合物 蛋白質 不含抗原之經基因修飾小鼠 53 18.9
GPCR6 混合瘤 NA 蛋白質 不含抗原之經基因修飾小鼠 8 1.0
GPCR6 細胞分選 含有抗原 的複合物 經修飾 DNA 不含抗原之經基因修飾小鼠 22 9.6
GPCR6 混合瘤 NA 經修飾 DNA 不含抗原之經基因修飾小鼠 10 0.6
GPCR1 細胞分選 含有抗原 的複合物 DNA 不含抗原之經基因修飾小鼠 42 11.9
GPCR1 混合瘤 NA DNA 不含抗原之經基因修飾小鼠 82 4.4
 離子通道1 細胞分選 含有抗原 的複合物 DNA 不含抗原之經基因修飾小鼠 156 14.8
離子通道1 混合瘤 NA DNA 不含抗原之經基因修飾小鼠 19 0.3
四跨膜蛋白1 細胞分選 含有抗原 的複合物 DNA、蛋白質、 含有抗原的 複合物 不含抗原之經基因修飾小鼠 81 29
四跨膜蛋白1 混合瘤 NA DNA、蛋白質、 含有抗原的 複合物 不含抗原之經基因修飾小鼠 162 8
實施例 3. 偵測由脂質雙層膜支架蛋白複合物所涵蓋的所關注之跨膜蛋白與抗體之間的結合。
在此實例中，對編碼例示性人類跨膜蛋白（GPCR1）之核苷酸序列進行修飾，以將FLAG標籤及His標籤（10x-His標籤）貼附至GPCR1蛋白序列之羧基末端，且該經修飾之核苷酸序列係表現於細胞中且如實例1中所闡述進行純化。隨後，將所關注之例示性GPCR1跨膜蛋白加入至脂質雙層膜支架蛋白複合物中，且如實例1中所述，將涵蓋所關注之GPCR1跨膜蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物純化。
如圖1A和1B所示，已知的抗-GPCR1抗體結合至涵蓋所關注之GPCR1跨膜蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物的能力係藉由八隅體分析來確認。具體而言，將38 µg/mL的盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物(包含GPCR1跨膜蛋白或10µg/mL的對照不含GPCR1之盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物（空複合物）提供至具有固定抗-GPCR1抗體（陽性對照AB）或同型對照抗體（陰性抗AB）的培養盤中。
在陽性對照（抗-GPCR1）抗體與包含GPCR1跨膜蛋白（0.6 nm）的盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物之間偵測到結合，且在抗-GPCR1抗體與空複合物之間(-0.05 nm)、陰性對照抗體與含有GPCR1跨膜蛋白(-0.06 nm)的盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物之間、或陰性對照抗體與空複合物(-0.03 nm)之間未偵測到結合。參見圖1A。確認由該複合物而非該複合物本身所呈現之所關注之跨膜蛋白會與針對所關注之跨膜蛋白的抗體結合。
為了確認可偵測到呈現所關注之跨膜蛋白的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物，並自對照脂質雙層膜支架蛋白複合物、生物素化對照脂質雙層膜支架蛋白複合物（空複合物）、呈現GPCR1跨膜蛋白（含GPCR1的複合物）的脂質雙層膜支架蛋白複合物分離出來，或將對照脂質雙層膜支架蛋白複合物、生物素化對照脂質雙層膜支架蛋白複合物（空複合物）提供給攜有鏈黴親和素的培養盤，以使得鏈黴親和素與貼附在複合物中之膜支架蛋白上的Bir-A標籤結合。隨後將培養盤與50 g/mL之抗-GPCR1抗體（陽性對照AB）或50 g/mL之同型對照抗體（陰性對照AB）一起培育。參見圖1B。
首先，圖1B顯示呈現所關注之GPCR1跨膜蛋白的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物及生物素化對照脂質雙層膜支架蛋白複合物可藉由將鏈黴親和素結合至貼附於複合物中之每一個膜支架蛋白上的Bir-A標籤來偵測及分離出。此係藉由偵測所攜有之鏈黴親和素與包含GPCR1跨膜蛋白（3.0 nm）的生物素化盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物和生物素化空複合物（0.69 nm）之間的結合來展示。
偵測到陽性對照（抗-GPCR1）抗體與包含繫於鏈黴親和素盤（0.69 nm）之GPCR1跨膜蛋白的生物素化盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物之間的結合，但未偵測到抗-GPCR1抗體與生物素化空複合物（-0.04 nm）、陰性對照抗體與包含跨膜蛋白（-0.05 nm）的生物素化盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物之間、或陰性對照抗體與空的生物素化複合物（-0.06 nm）之間的結合。參見圖1B，展示生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物繫至鏈黴親和素盤，其呈現會特異結合抗-GPCR1抗體而非對照抗體之所關注之跨膜蛋白。 實施例 4. 獲得表現特異結合所關注之例示性跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞。
編碼第一、第二及第三例示性人類跨膜蛋白之核苷酸序列係經修飾，以將FLAG標籤及His標籤（10x-His標籤）貼附至跨膜蛋白之羧基末端，且經修飾之核苷酸序列係表現於細胞中並如實例1中所闡述進行純化。使用Bir-A標記之膜支架蛋白來生成涵蓋所關注之第一、第二或第三例示性跨膜蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物，且如實例1及3中所述進行純化。
脾細胞自經基因修飾之VELOCIMMUNE®小鼠收集，該小鼠包含人類化IgH基因座及/或 缺乏編碼所關注之跨膜蛋白之內源性小鼠基因的人類化Igκ基因座。細胞係自未經免疫接種之對照小鼠或經免疫接種之基因修飾小鼠中分離出來，其藉由注射：編碼所關注之第一跨膜蛋白（GPCR1）、所關注之第二跨膜蛋白（GPCR2）或所關注之第三跨膜蛋白（GPCR3）的DNA。在此，每隻小鼠係經基因修飾。用螢光標記將自每隻小鼠收集之脾細胞染色成B細胞標記物（即，抗IgG抗體），且同時與0.2 mg/ml至5.0 mg/mL之含有跨膜蛋白包埋於其中的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育。接著將細胞洗滌以移除未結合複合物。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合。接著將細胞在磷酸鹽緩衝液(PBS)中洗滌，以移除過量的PE-鏈黴親和素。對照小鼠及經免疫接種小鼠之細胞群之PE螢光藉由FACS偵測，以辨識由生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物所呈現之表現結合所關注之跨膜蛋白之抗體的B細胞群體。參見圖2A-2F。
在一百萬個對照細胞中僅兩個B細胞非特異性結合至由生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物所呈現之GPCR1跨膜蛋白（圖2A，矩形），顯示含有所關注之跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物為用於偵測及分離製造針對跨膜蛋白抗原之抗體的細胞的高度特定分選劑。藉由比較，由生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物所呈現之一百萬個中之11個結合至所關注之第一跨膜蛋白之抗體生成B細胞係使用本方法偵測（圖2B，矩形）。
如圖2C中所示，可偵測到自對照小鼠獲得的一百萬個脾細胞中之兩個B細胞作為呈現所關注之第二跨膜蛋白之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物的非特異性結合劑（矩形）。相比之下，使用本方法可偵測到一百萬個表現特異於第二例示性所關注之GPCR跨膜蛋白(GPCR2)之抗體的B細胞中的七十八個（矩形），如圖2D所示。
在又一實例中，從對照小鼠收集之一百萬個脾細胞中僅獲得11個B細胞結合非特異性結合至呈現所關注之第三跨膜蛋白的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物（矩形）。參見圖2E。然而，可偵測到一百萬個表現特異於第三例示性所關注之GPCR跨膜蛋白(GPCR3)之初級抗體的B細胞中的六十五個，且自經免疫接種的基因修飾小鼠收集的脾細胞獲得。 實施例 5. 比較已知細胞分選策略與包含使用脂質雙層膜支架蛋白複合物的分選方法。
為了比較用於獲得本領域已知抗體生成細胞的方法與本發明揭露之創造性方法的效用，根據實例1來純化編碼所關注之例示性人類跨膜蛋白的DNA。對於以編碼所關注之跨膜蛋白之DNA的小鼠群免疫接種，將純化的人類DNA注射至表現或不表現該編碼所關注之跨膜蛋白之內源性小鼠基因的經基因工程改造VELOCIMMUNE®小鼠中。對於以所關注之跨膜蛋白免疫接種之群組，編碼第一例示性人類跨膜蛋白之核苷酸序列係在細胞中表現，如實例1中所闡述進行純化，且藉由注射直接投與至經基因改造VELOCIMMUNE®小鼠，該小鼠表現或不表現編碼所關注之跨膜蛋白之內源性小鼠基因。
在某些群組中，小鼠用多個VLP免疫接種。生成包含編碼所關注之人類跨膜蛋白之DNA的質體並表現在病毒細胞中。脂質顆粒在病毒細胞中自組裝，一旦藉由聚乙二醇化(PEG)沉澱出芽，則自病毒細胞分離且純化，隨後進行同位素離心及分離病毒細胞培養基。使用已知技術將經純化之多個VLP注入小鼠中以進行免疫接種。
為了進行比較，以（VI）或無（VI-KO）編碼所關注之跨膜蛋白之內源性小鼠基因，如表2中所闡述對包括有編碼人類免疫球蛋白重鏈(IgH)及人類免疫球蛋白輕鏈可變區之DNA的經基因改造VELOCIMMUNE ®小鼠藉由注射進行免疫接種。
接下來，使用表2中所述的分選策略，分離出抗體生成B細胞的群體。具體而言，自經免疫接種的經基因修飾小鼠收集脾細胞。如表2中所闡述，所收集之脾細胞用螢光標記染色成B細胞標記物（即，抗IgG抗體），且同時與0.2 mg/ml至5.0 mg/mL之所關注之分選劑之生物素化跨膜蛋白（蛋白質）或0.2 mg/mL至5.0 mg/mL之涵蓋所關注之跨膜蛋白的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物(含有TMB的複合物)或2.0 mg/mL至20 mg/mL之生物素標記的VLP分選劑(VLP)。接著洗滌細胞以移除未結合的分選劑。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與每一生物素（Bir-A）標記的分選劑結合。將細胞在磷酸鹽緩衝液（PBS）中洗滌以移除過量的PE-鏈黴親和素，且B細胞樣品的PE螢光係由FACS分析，以在表現結合至由分選劑所呈現之所關注之跨膜蛋白的抗體的異質細胞群體中辨識B細胞。
隨後在如實例2中所闡述之384孔培養盤上將與所關注之跨膜蛋白結合之單一抗體生成B細胞分離至每個孔。來自這些B細胞之抗體基因的RT-PCR係根據Wang及Stollar Immunous， 免疫學方法期刊（ Journal of Immunological Methods）(2000) 244: 217–225所描述之方法進行。簡言之，經由反轉錄酶（RT）反應(Superscript TMIII, Invitrogen)合成各單個B細胞之cDNA。接著將各所得RT製品拆分且轉移至兩個384孔培養盤上之兩個對應孔中。使用特異於人類IgG重鏈可變區前導序列的5'退化引子及特異於小鼠重鏈穩定區之3'引子，首先藉由PCR擴增一組所得RT製品，以形成擴增子。隨後使用特異於人類IgG重鏈可變區序列之構架1的5'退化引子組及特異於人類IgG重鏈可變區序列之構架4的3'退化引子組，藉由PCR再次擴增該擴增子。另一組所得RT製品係先使用特異於人類κ或λ輕鏈可變區前導序列的5'退化引子及特異於小鼠κ或λ輕鏈穩定區的3'引子藉由PCR來擴增，以形成擴增子。隨後，使用特異於人類κ或λ輕鏈可變區序列之構架1的5'退化引子組及特異於人類κ或λ輕鏈可變區序列之構架4的3'退化引子組，藉由PCR再次擴增該擴增子。將重鏈及輕鏈PCR製品各自選殖至含有人類IgG1重鏈穩定區及κ輕鏈穩定區之抗體載體中。重組人類IgG1抗體係藉由暫態轉染CHO K1細胞來製造，且分析其結合所關注之跨膜蛋白的能力。 表2
跨膜蛋白 （TMB ） 小鼠品系 # 小鼠 免疫原 分選劑 結合TMB 的 抗體總數#
GPCR1 VI 9 VLP與DNA VLP 無
GPCR1 VI 9 蛋白質 蛋白質 176
GPCR1 VI-KO 3 DNA 含TMB的複合物 42
離子通道2 VI-KO 15 蛋白質 蛋白質 1
離子通道2 VI-KO 14 蛋白質 蛋白質 1
離子通道2 VI-KO 4 蛋白質 含TMB的複合物 236
離子通道2 VI-KO 4 蛋白質 含TMB的複合物 167
表2顯示當與其它分選劑、獨立於所使用之免疫原相比時，利用脂質雙層膜支架蛋白複合物用於獲得抗體生成細胞以呈現跨膜蛋白的方法，該方法會偵測到更多表現特異結合至所關注之跨膜的抗體生成細胞。
以純化跨膜蛋白分選劑分選的細胞係自表現編碼所關注之跨膜蛋白之內源性小鼠基因(VI)的經基因修飾小鼠獲得，當與不表現編碼所關注之跨膜蛋白的內源性小鼠基因（VI-KO）且用呈現跨膜蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物來分選的經基因修飾小鼠所獲得的那些細胞相比時，生成了更多結合至所關注之跨膜蛋白的抗體。然而，當分析時，由VI小鼠生成的抗體並非功能性結合劑。顯示使用脂質雙層膜支架蛋白複合物用於獲得抗體生成細胞以呈現跨膜蛋白的方法會獲得結合至跨膜蛋白之功能性相關表位的抗體。 實施例 6. 生成與分離結合至所關注之第二例示性 GPCR 跨膜蛋白 的抗體。
編碼所關注之第二例示性GPCR跨膜蛋白（GPCR2）之核苷酸序列經如實例1中所闡述進行修飾，以包含FLAG標籤及貼附於GPCR2蛋白之羧基末端的10x-His標籤。另外，將以下穩定突變引入該跨膜蛋白中：胺基酸取代： A2a-T4L-delta，如Veli-Pekka Jaakola等人於科學( Science)，2008年11月21日；322(5905)第1211-1217頁中所述，其全部内容在此藉由明確引用方式併入本文。將經修飾之GPCR2核苷酸序列選殖至一表現載體且表現於Sf9細胞中。接著將細胞溶解，且獲得該經修飾之GPCR2跨膜蛋白並如實例1進行純化。
接下來，如實例1及本文中所闡述，生成含有經修飾人類GPCR2跨膜蛋白之盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物。
基因修飾之GPCR2基因剔除小鼠，即，包含人類化IgH基因座及人類化Igκ基因座且亦缺少編碼所關注之跨膜蛋白之內源性小鼠基因的VELOCIMMUNE®小鼠，係藉由注射編碼包含穩定突變(DNA免疫原)之經修飾之人類GPCR2蛋白之外源性DNA，或注射如表3所示的含有穩定突變(蛋白質免疫原)之經修飾之人類GPCR2蛋白來免疫接種。
脾細胞自各小鼠收集且用螢光標記染色成B細胞標記物（即，抗IgG抗體），且同時與0.2 mg/ml至5.0 mg/mL含有其中包埋有跨膜蛋白的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培育。接著將細胞洗滌以移除未結合複合物。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合。接著將細胞在磷酸鹽緩衝液(PBS)中洗滌，以移除過量的PE-鏈黴親和素。藉由FACS偵測來自對照小鼠及經免疫接種小鼠之細胞群的PE螢光，以辨識表現結合至由生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物所呈現之所關注之第二例示性GPCR跨膜蛋白之抗體的B細胞群。
隨後將結合至所關注之跨膜蛋白的單抗體生成B細胞分離至384孔培養盤上的個別孔中，自各細胞分離編碼DNA之抗體，如實例2中所闡述生成抗體以用於進一步分析。
圖3顯示，獨立於所使用的免疫原類型，用於獲得抗體生成細胞之本發明方法會偵測到表現特異結合至所關注之跨膜之抗體的抗體生成細胞。具體而言，根據所公開方法藉由使用呈現所關注之跨膜蛋白的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物，抗體生成細胞係自經基因改造之小鼠獲得，該小鼠以編碼跨膜蛋白的DNA（DNA）或所關注之純化跨膜蛋白（蛋白質）進行免疫接種。抗體係如實施例2中所闡述而生成，以用於篩選。使用標準轉染技術在293細胞中表現所關注抗原之全長跨膜蛋白（TMB過度表現），且將抗原表現293細胞與不以編碼所關注之例示性跨膜蛋白之DNA轉染之對照293細胞（親本細胞）進行比較。接著將細胞與抗體一起培育，以允許細胞表面上之抗原與特異結合至所關注之例示性跨膜蛋白的抗體之間的結合。根據製造商進行MSD(Meso尺度診斷)免疫分析，以辨識從5隻不同經免疫接種小鼠中得到的抗體生成細胞所生成之細胞結合抗體。小鼠1、3、4及5係以純化的人類GPCR2跨膜蛋白免疫接種，而小鼠2以編碼人類GPCR2跨膜蛋白之DNA免疫接種。虛線以上的抗體可結合所關注之跨膜蛋白。相比之下，虛線以下的抗體為弱結合劑或無法結合所關注之跨膜蛋白，如與陽性（方形）及陰性（三角形）對照抗體相比所示。
結果顯示，無論小鼠是否以編碼所關注之跨膜蛋白的DNA或所關注之跨膜蛋白進行免疫接種，使用本發明方法獲得的抗體生成細胞製造出足量的抗體，可結合至所關注之跨膜蛋白（在虛線之上）。
如表3中所示， B細胞係使用呈現跨膜蛋白（含有TMB的複合物）之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物，自各經免疫接種小鼠獲得，抗體係自所收集到的B細胞子群生成，且抗體係藉由免疫測定法來測試其結合至所關注抗原之能力。無論小鼠是否以編碼跨膜蛋白的DNA或純化的跨膜蛋白進行免疫接種，使用本發明方法獲得豐富的表現特異結合至所關注之跨膜蛋白(抗原)之抗體的抗體生成細胞。 表3
小鼠 免疫原 分選劑 # 抗體 生成細胞 # 所測試 的抗體 # 抗原 結合抗體 結合抗原的 抗體百分比
1 蛋白質 含 TMB 的 複合物 723 141 59 42
2 DNA 含 TMB 的 複合物 561 140 88 63
3 蛋白質 含 TMB 的 複合物 880 141 98 70
4 蛋白質 含 TMB 的 複合物 1040 141 99 70
5 蛋白質 含 TMB 的 複合物 640 141 102 72
總計   3844 704 446 63
實施例 7. 獲得會表現結合至所關注之跨膜蛋白特定結構域之抗體的抗體生成細胞。
本發明方法亦用於生成特異結合至位於所關注之跨膜蛋白之特定結構域上之表位的抗體。
在第一實例中，編碼全長人類跨膜蛋白（全長TMB）之核苷酸序列經修飾以將FLAG標籤及His標籤（10x-His標籤）貼附至跨膜蛋白的羧基末端，如實例1中所闡述進行純化及分離。此外，編碼缺失N端之細胞外部分之截短人類跨膜蛋白之核苷酸序列（截短TMB）另經修飾，以將FLAG標籤及His標籤（10xHis標籤）貼附至跨膜蛋白之羧基末端，且該經修飾核苷酸序列係表現於細胞中，並如實例1中所闡述進行純化。使用Bir-A標記的膜支架蛋白生成涵蓋截短TMB的脂質雙層膜支架蛋白複合物，且如實例1及3中所述進行純化。在本文中，該截短TMB蛋白包含細胞外環結構域、跨膜結構域、及野生型人類跨膜蛋白之細胞內C末端結構域之每一者，但不包含細胞外N末端結構域。因此，涵蓋經截短TMB的脂質雙層膜支架蛋白複合物僅將野生型人類跨膜蛋白之細胞外環結構域呈現給細胞。
包含編碼人類免疫球蛋白重鏈（IgH）之DNA及人類免疫球蛋白輕鏈可變區的基因工程改造VELOCIMMUNE®小鼠係用編碼全長TMB之DNA免疫接種。監測免疫反應，且自經免疫接種小鼠收取脾細胞。向各小鼠收集之脾細胞用螢光標記染色成B細胞標記物（即，抗IgG抗體），且同時與0.2 mg/ml至5.0 mg/mL呈現該包埋於其中之截短TMB的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培養，以容許在截短TMB之細胞外域上之表位與B細胞表面上的之間的結合。接著將細胞洗滌以移除未結合複合物。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合。接著將細胞在磷酸鹽緩衝液(PBS)中洗滌，以移除過量的PE-鏈黴親和素。藉由FACS偵測自小鼠收集之細胞群的PE螢光，以辨識表現特異於所關注之跨膜蛋白之細胞外環結構域之抗體的B細胞群。
隨後將結合至所關注之跨膜蛋白的單抗體生成B細胞分離至384孔培養盤上的個別孔中，自各細胞分離編碼DNA之抗體，且如實例2中所闡述生成抗體以用於進一步分析。
如圖4所示，使用本發明方法獲得結合至位於所關注之例示性跨膜蛋白之細胞外環結構域中之表位的抗體（框）。
在另一實例中，編碼全長人類跨膜蛋白（全長TMB）之核苷酸序列經修飾以將FLAG標籤及His標籤（10x-His標籤）貼附至跨膜蛋白之羧基末端，並如實例1中所闡述進行純化及分離。此外，生成編碼一部份人類跨膜蛋白（TMB片段）之核苷酸序列，且該TMB片段核苷酸序列係於細胞中表現，且如實例1中所闡述進行純化。在本文中，TMB片段多肽TMB對應於所關注之全長跨膜蛋白的N末端部分。
使用Bir-A標記膜支架蛋白來生成涵蓋全長TMB之脂質雙層膜支架蛋白複合物，且如實例1及3中所描述進行純化。
包含編碼人類免疫球蛋白重鏈（IgH）與人類免疫球蛋白輕鏈可變區之DNA的經基因修飾VELOCIMMUNE®小鼠，係以編碼全長TMB或純化的全長TMB蛋白之DNA免疫接種。監測免疫反應，且自經免疫接種小鼠收取脾細胞。自各小鼠收集之脾細胞與TMB片段一起培養，以允許該TMB片段與在細胞表面上的抗體之間的結合，該抗體特異於位於全長TMB之N末端的表位。本步驟有效阻斷表現特異於來自結合至由含有包埋的全長TMB的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物所呈現之全長TMB的全長TMB之N末端域中之表位之抗體的所有抗體生成細胞。細胞接著用螢光標記染色成B細胞標記物（即，抗IgG抗體），以辨識脾細胞群體中之抗體生成B細胞，且亦與0.2 mg/ml至5.0 mg/mL之涵蓋該全長TMB的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培養，以容許全長TMB之細胞外環結構域上之表位與抗體生成B細胞表面的抗體之間的結合。接著將細胞洗滌以移除未結合之複合物。將細胞與PE-鏈黴親和素一起培養，以使得該鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記之膜支架蛋白結合。然後將細胞以磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌，以移除過多的PE-鏈黴親和素，且細胞結合至來自該分類之TMB片段。藉由FACS偵測自小鼠收集之細胞群的PE螢光，以辨識表現特異於所關注之跨膜蛋白之細胞外環結構域之抗體的抗體生成B細胞群體。
接著將結合至所關注之跨膜蛋白之單抗體生成B細胞分離至384孔培養盤上之個別孔中，編碼DNA之抗體係自各細胞分離，且如實例2中所闡述生成抗體以用於進一步分析。
在另一實例中，由一部份所關注之人類跨膜蛋白及一部分所關注之跨膜蛋白的小鼠同源物所構成的所關注之嵌合跨膜蛋白係用於生成特異結合至位於所關注之跨膜蛋白之特定結構域上之表位的抗體。
在本文中，該嵌合跨膜蛋白係藉由生成編碼一部份所關注之人類跨膜蛋白之核苷酸序列產生，其可操作地連接至所關注之跨膜蛋白之小鼠同源物之一部分，及另修飾核苷酸序列以將FLAG標籤及His標籤（10x-His標籤）貼附至該嵌合跨膜蛋白之羧基末端。隨後如實施例1中所闡述以純化並分離出核苷酸序列。此外，編碼該嵌合跨膜蛋白之核苷酸序列係在細胞中表現，且如實例1中所闡述進行純化，以生成所關注之經標記嵌合跨膜蛋白（嵌合-TMB）。在此實例中，該所關注之嵌合跨膜蛋白具有對應於跨膜蛋白之小鼠同源物的N末端和細胞外環結構域、跨膜結構域及細胞外C末端結構域，其對應於所關注之人類跨膜蛋白。
此外，編碼野生型人類跨膜蛋白（人類TMB）之核苷酸序列係經修飾以將FLAG標籤及His標籤（10x-His標籤）貼附至跨膜蛋白之羧基末端、純化及分離；然後該編碼人類跨膜蛋白之核苷酸序列係於細胞中表現，且如實例1中所闡述進行純化。
涵蓋人類TMB或嵌合TMB之脂質雙層膜支架蛋白複合物係使用Bir-A標記之膜支架蛋白生成的，且如於實施例1及3中所述純化。
包含有編碼人類免疫球蛋白重鏈(IgH)及人類免疫球蛋白輕鏈可變區之DNA的經基因工程修飾VELOCIMMUNE®小鼠係用編碼人類TMB之DNA或純化的人類TMB蛋白進行免疫接種。監測免疫反應，且自經免疫接種小鼠收取脾細胞。自各小鼠收集之脾細胞用螢光標記染色成B細胞標記物（即，抗IgG抗體），且同時與涵蓋嵌合TMB之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培養，以容許由複合物呈現之嵌合TMB之人類部分上之表位與B細胞表面上的抗體之間的結合。接著將細胞洗滌以移除未結合之複合物。
將細胞與PE-鏈黴親和素一起培養，以使得該鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記之膜支架蛋白結合。然後將細胞以磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌，以移除過多的PE-鏈黴親和素，且細胞結合至來自該分類之TMB片段。藉由FACS偵測自小鼠收集之細胞群的PE螢光，以辨識表現特異於所關注之跨膜蛋白之細胞外環結構域之抗體的抗體生成B細胞群體。
此免疫接種及分選策略有效地移除所有表現特異於位於嵌合TMB之小鼠部分上之人類TMB表位之抗體的抗體生成B細胞。
在另一免疫接種及分選策略中，包含編碼人類免疫球蛋白重鏈（IgH）之DNA及人類免疫球蛋白輕鏈可變區的經基因修飾VELOCIMMUNE®小鼠，係以編碼嵌合TMB或純化的嵌合TMB蛋白之DNA免疫接種。監測免疫反應，且自經免疫接種小鼠收取脾細胞。自各小鼠收集之脾細胞用螢光標記染色成B細胞標記物（即，抗IgG抗體），且同時與涵蓋該人類TMB的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培養，以容許位於由複合物所呈現之人類TMB之細胞外部分上之表位與B細胞表面上的抗體之間的結合。接著將細胞洗滌以移除未結合之複合物。
將細胞與PE-鏈黴親和素一起培養，以使得該鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記之膜支架蛋白結合。然後將細胞以磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌以自分類中移除過量的PE-鏈黴親和素。藉由FACS偵測自小鼠收集之細胞群的PE螢光，以辨識表現特異於所關注之人類跨膜蛋白之細胞外環結構域之抗體的抗體生成B細胞群體。
此特定免疫接種及分選策略亦有效移除表現特異於位於嵌合TMB之小鼠部分上之表位之抗體的全部抗體生成B細胞。
然後可將結合至由該複合物所呈現之所關注之跨膜蛋白的單抗體生成B細胞分離至384孔培養盤上之個別孔中，及編碼DNA的抗體自各細胞中分離，以用於根據實例2生成及分析抗體。 實施例 8. 獲得表現特異於所關注之跨膜蛋白之交叉反應抗體的抗體生成細胞。
本發明方法亦用於生成可辨識小鼠及人類形式的例示性所關注之跨膜蛋白的抗體。
編碼兩個不同例示性人類跨膜蛋白、人類TMB1及人類TMB2之核酸係經修飾以將FLAG標籤及His標籤（10x-His標籤）貼附至各人類跨膜蛋白胺基酸序列之羧基末端，如實例1所闡述進行純化。此外，編碼兩個人類跨膜蛋白、小鼠TMB1及小鼠TMB2中之任一者之小鼠同源物的核酸係經修飾以將FLAG標籤及His標籤（10x-His標籤）貼附至各小鼠跨膜蛋白胺基酸序列之羧基末端，且如實例1所闡述純化該經修飾核苷酸序列。接下來，分別編碼人類TMB1、人類TMB2、小鼠TMB1及小鼠TMB2之核酸各自在細胞中表現，且每個蛋白質係如實施例1中所述分離及純化。使用Bir-A標記膜支架蛋白來生成涵蓋人類TMB1蛋白、人類TMB2蛋白、小鼠TMB1蛋白及小鼠TMB2蛋白中之任一者的脂質雙層膜支架蛋白複合物，且如實例1中所述進行純化。
包含編碼人類免疫球蛋白重鏈（IgH）及人類免疫球蛋白輕鏈可變區之DNA之經基因工程改造VELOCIMMUNE®小鼠(其不表現與所關注之跨膜蛋白（即小鼠TMB1或小鼠TMB2）的內源性小鼠同源物)，係如表4中所闡述，藉由注射編碼小鼠或人類跨膜蛋白之外源性DNA、或編碼人類TMB1蛋白之外源性DNA與小鼠TMB2蛋白之組合免疫接種。
監測免疫反應，且自經免疫接種小鼠收取脾細胞。用螢光標記將自各小鼠收集之脾細胞染色成B細胞標記物（即，抗IgG抗體），且同時與包含特定人類TMB蛋白（含有人類TMB的複合物）或特定小鼠TMB蛋白（含有小鼠TMB的複合物）的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培養，以容許由生物素化脂質雙層膜支架蛋白所呈現之所關注之跨膜蛋白與B細胞表面上的抗體之間的結合。接著將細胞洗滌以移除未結合之複合物，且與PE-鏈黴親和素一起培養，以使得該鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記之膜支架蛋白結合。隨後將細胞在磷酸鹽緩衝液(PBS)中洗滌以自分類中移除過量的PE-鏈黴親和素。藉由FACS偵測自小鼠收集之細胞群體的PE螢光，以辨識表現特異於所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成B細胞群體。
隨後將結合至所關注之跨膜蛋白的單抗體生成B細胞分離至384孔培養盤上的個別孔中，自各細胞分離編碼DNA之抗體，且如實例2中所闡述生成抗體以用於進一步分析。
如表4中所示，以編碼小鼠TMB1的DNA單獨對經基因修飾小鼠免疫接種，及以呈現人類TMB1蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物對抗體生成B細胞進行分選，辨識表現可結合小鼠TMB1與人類TMB1蛋白之交叉反應抗體的抗體生成B細胞。
此外，以編碼小鼠TMB1蛋白之DNA及編碼人類TMB1蛋白之DNA一起對經基因修飾小鼠免疫接種，及以呈現人類TMB1蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物或呈現小鼠TMB1蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物對抗體生成B細胞進行分選，辨識表現可結合小鼠TMB1與人類TMB1蛋白之交叉反應抗體的抗體生成B細胞。
表4亦顯示，以編碼小鼠TMB2的DNA單獨對經基因修飾小鼠免疫接種，及以呈現人類TMB2蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物對抗體生成B細胞進行分選，或以呈現小鼠TMB2蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物對抗體生成B細胞進行分選，辨識表現可結合小鼠TMB2與人類TMB2蛋白之交叉反應抗體的抗體生成B細胞。以編碼人類TMB2的DNA單獨對經基因修飾小鼠免疫接種，及以呈現人類TMB2蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物對抗體生成B細胞進行分選，或以呈現小鼠TMB2蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物對抗體生成B細胞進行分選，亦辨識表現可結合小鼠TMB1與人類TMB1蛋白之交叉反應抗體的抗體生成B細胞。 表4
小鼠 免疫原 抗原呈現 策略 # 抗體生成細胞 # 所測試的抗體 # 抗原結合抗體 結合抗原的抗體百分比
VI-KO DNA小鼠TMB1 帶有人類TMB1 的複合物 240 131 15 11
VI-KO DNA小鼠TMB1及 DNA人類TMB1 帶有小鼠TMB1 的複合物 97 66 3 5
VI-KO DNA小鼠TMB1及 DNA人類TMB1 帶有人類TMB1 的複合物 111 66 3 5
VI-KO DNA小鼠TMB2 帶有人類TMB2 的複合物 257 146 42 29
VI-KO DNA小鼠TMB2 帶有小鼠TMB2 的複合物 624 166 4 2
VI-KO DNA人類TMB2 帶有人類TMB2 的複合物 736 213 77 36
VI-KO DNA人類TMB2 帶有小鼠TMB2 的複合物 309 125 25 20
實施例 9: 從以含有跨膜蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物免疫接種之小鼠獲得表現特異於所關注之跨膜蛋白之抗體之抗體生成細胞。
為了判定涵蓋所關注之跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物是否可以用作免疫原，以獲得表現特異於所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞， 如實例8中所闡述生成並純化編碼例示性人類跨膜蛋白之核苷酸序列、包括有貼附於其羧基末端之FLAG標籤及His標籤（10x-His標籤）的人類TMB2。編碼經修飾的人類TMB2蛋白之核苷酸序列係表現於細胞中，且經修飾的TMB2蛋白係如實例8中所闡述進行分離且純化。涵蓋人類TMB2蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物係使用Bir-A標記膜支架蛋白生成，且如實例8中所述進行純化。
此外，分別生成單獨在細胞中表現編碼His標籤之核苷酸序列及編碼貼附於經修飾人類TMB2蛋白之FLAG標籤的核苷酸序列，且如實例1中所闡述進行純化，以提供FLAG-肽及HIS-肽。接下來，生成單獨在細胞中表現編碼包含在脂質雙層膜支架蛋白複合物 中之膜支架蛋白的核苷酸序列，且如實例1中所闡述進行純化，以提供MSP-肽。
如表5中所展示，包含編碼人類免疫球蛋白重鏈（IgH）及人類免疫球蛋白輕鏈可變區之DNA的基因改造VELOCIMMUNE®小鼠(其不表現對所關注之跨膜蛋白（即，小鼠TMB2）的內源性小鼠同源物)，係藉由注射0.54 mg/mL涵蓋人類TMB2蛋白的脂質雙脂層膜支架蛋白複合物(含有人類TMB2的複合物)來免疫接種。監測免疫反應，且自經免疫接種小鼠收取脾細胞。自各經免疫接種小鼠收集之脾細胞用螢光標記染色成B細胞標記物（即，抗IgG抗體），且同時與MSP-肽、FLAG-肽及HIS-肽一起培養，以容許MSP-肽、FLAG-肽及HIS-肽與特異於分別位於MSP-肽、FLAG-肽及HIS-肽上之表位的B細胞表面之抗體之間的結合。本步驟有效阻斷表現特異於由複合物呈現之人類TMB2蛋白以外之複合物元件之抗體的所有抗體生成B細胞。
隨後，將剩餘B細胞與含有人類TMB2蛋白(含有人類TMB2的複合物)或小鼠TMB 2蛋白(含有小鼠TMB2的複合物)生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物一起培養，以容許由生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物所呈現的所關注之跨膜蛋白與B細胞表面的抗體之間的結合。接著將細胞洗滌以移除未結合之複合物，且與PE-鏈黴親和素一起培育，以使該鏈黴親和素結合至脂質雙層膜支架蛋白複合物中之各生物素（Bir-A）標記膜支架蛋白。隨後將細胞在磷酸鹽緩衝液(PBS)中洗滌以自分類中移除過量的PE-鏈黴親和素。藉由FACS偵測自小鼠收集之細胞群體的PE螢光，以辨識表現特異於所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成B細胞群體。
隨後將結合至所關注之跨膜蛋白的單抗體生成B細胞分離至384孔培養盤上的個別孔中，自各細胞分離編碼DNA之抗體，且如實例2中所闡述生成抗體以用於進一步分析。
如表5中所示，以涵蓋人類TMB2蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物對經基因修飾小鼠免疫接種，及以呈現人類TMB2蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物對抗體生成B細胞進行分選，辨識表現可結合小鼠TMB2與人類TMB2蛋白同源物之交叉反應抗體以及特異於人類TMB2蛋白之抗體的抗體生成B細胞。此外，以涵蓋人類TMB2蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物對經基因修飾小鼠免疫接種，及以呈現小鼠TMB2蛋白之 脂質雙層膜支架蛋白複合物對抗體生成B細胞進行分選，辨識表現可結合小鼠TMB2蛋白與人類TMB2蛋白之交叉反應抗體的抗體生成B細胞。 表5
小鼠 免疫原 抗原呈現 策略 所收集的 抗體生成 細胞總數 # # 所分析 的抗體 生成細胞 # 所測試 的抗體 # 抗原 結合抗體 結合抗原 的抗體 百分比
VI-KO 帶有人類 TMB2的複合物 帶有人類 TMB2的 複合物 1370 666 116 32 28
VI-KO 帶有人類 TMB2的複合物 帶有小鼠 TMB2的 複合物 102 102 78 10 13
實施例 10. 生成表現結合至所關注之例示性 SLC 跨膜蛋白 之抗體的抗體生成細胞，及自細胞獲得特異於 SLC 蛋白的抗體。
編碼所關注之第一例示性SLC跨膜蛋白的核苷酸序列係如實例1中所闡述進行修飾，以包含貼附於例示性SLC蛋白之N末端的FLAG標籤及10x-His標籤。將編碼經修飾SLC跨膜蛋白之核苷酸序列選殖至表現載體，且表現於Sf9細胞中。接著，細胞係溶解，且如在實例1中所述獲得經修飾的SLC跨膜蛋白並純化。
接下來，如實例1及本文中所闡述，生成含有經修飾人類SLC跨膜蛋白之盤狀脂質雙層膜支架蛋白複合物。
經基因修飾之SLC基因剔除小鼠，即，含有人類化IgH基因座及人類化Igκ基因座的VELOCIMMUNE® 小鼠，其亦缺乏編碼所關注之SLC跨膜蛋白之內源性小鼠基因，係藉由注射編碼經修飾人類SLC蛋白的外源性DNA及注射如實例1所述之經修飾人類SLC蛋白免疫接種。
脾細胞自各經免疫接種小鼠收集且用螢光標記染色成B細胞標記物（即，抗IgG抗體），且同時與0.2 mg/ml至5.0 mg/mL含有包埋於其中之SLC跨膜蛋白的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物。接著將細胞洗滌以移除未結合之複合物。隨後，將細胞與PE-鏈黴親和素一起培育，以使鏈黴親和素與脂質雙層膜支架蛋白複合物中之每一生物素（Bir-A）標記的膜支架蛋白結合。然後將細胞以磷酸鹽緩衝液（PBS）洗滌以移除過量的PE-鏈黴親和素。來自對照小鼠及經免疫接種小鼠之細胞群之PE螢光藉由FACS被偵測，以辨識由生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物所呈現之表現結合至所關注之例示性SLC跨膜蛋白之抗體的B細胞群體。
隨後將結合至所關注之SLC跨膜蛋白的單抗體生成B細胞分離至384孔培養盤上的個別孔中，自各細胞分離編碼DNA之抗體，且如實例2中所闡述生成抗體以用於進一步分析。
雖然已描述及描繪本發明的若干態樣，但本領域中具熟練技術者可影響替代態樣以達成相同目標。因此，隨附申請專利範圍意欲涵蓋屬於本發明之真實精神及範疇的所有該等替代態樣。
無
圖 1A-1B顯示藉由脂質雙層膜支架蛋白複合物所呈現之所關注之跨膜蛋白特異結合辨識所關注之跨膜蛋白的抗體，且使用該所揭示之方法在 活體外偵測。將具有至少兩個膜支架蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物（每一者含有可偵測的Bir-A標籤，且含有所關注之第一例示性跨膜蛋白（含有GPCR1的複合物））與對照之不包含所關注之跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物（空複合物）進行比較，以確定其與已知會結合至GPCR1之例示性抗體（陽性對照AB）和不結合GPCR蛋白之同型對照mab（陰性對照AB）的結合能力。（ A）柱狀圖顯示八隅體分析的結果，其顯示由脂質雙層膜支架蛋白複合物呈現之所關注之跨膜蛋白特異性結合至陽性對照抗體（0.6nm），但不結合介於抗GPCR1抗體與空複合物（-0.05 nm）間、介於陰性對照抗體及脂質雙層膜支架蛋白複合物(包含GPCR1跨膜蛋白(-0.06 nm)間、或介於陰性對照抗體及空複合物(-0.03 nm)間。（ B）藉由將具有或不具跨膜蛋白的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物提供給攜有鏈黴親和素的培養盤，然後與已知會結合至GPCR1的抗體(陽性對照AB)或陰性對照抗體一起培育，以分析了檢測和自不含所關注之跨膜蛋白之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物(空複合物)分離出呈現所關注之跨膜蛋白的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物(含有GPCR1的複合物)的能力。柱狀圖顯示藉由脂質雙層膜支架蛋白複合物所呈現之所關注之跨膜蛋白特異結合至陽性對照抗體而非陰性對照抗體。
圖 2A 至 2F顯示藉由流式細胞技術偵測及分離出表現特異於所關注之例示性跨膜蛋白的抗體之抗體生成B細胞。脾細胞係自未經免疫接種之對照小鼠（ A 、 C 、 E）和經基因工程改造之小鼠收集並分離出來，該等小鼠藉由注射編碼所關注之第一跨膜蛋白（GPCR1、 B）、所關注之第二跨膜蛋白（GPCR2、 D）或所關注之第三跨膜蛋白（GPCR3、 F）之DNA免疫接種。使用FACS技術用B細胞標誌物的螢光標籤（即抗IgG）對脾細胞進行染色，並將細胞群與呈現一種例示性之所關注之跨膜蛋白的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物接觸，以偵測並收集表現特異於每個例示性之所關注之跨膜蛋白（抗原結合細胞）的抗體的B細胞群體（表面IgG陽性細胞）。（ A）從對照小鼠獲得的一百萬個脾細胞中僅有兩個B細胞與生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物呈現之所關注之第一跨膜蛋白非特異地結合（矩形）。（ B）使用本方法偵測到100萬個表現特異於第一例示性GPCR跨膜蛋白（GPCR1）之抗體的B細胞中的11個（矩形）。（ C）從對照小鼠獲得的一百萬個脾細胞中僅有兩個B細胞與生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物呈現之所關注之第二跨膜蛋白非特異地結合（矩形）。（ D）使用本方法偵測到100萬個B細胞中有78個表現特異於所關注之第二例示性GPCR跨膜蛋白(GPCR2)的抗體（矩形）。（ E）從對照小鼠獲得的一百萬個脾細胞中僅有11個B細胞與生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物（矩形）呈現之所關注之第三跨膜蛋白非特異地結合（矩形）。（ F）使用本方法（矩形）偵測到100萬個B細胞中有65個表現特異於所關注之第三例示性GPCR跨膜蛋白(GPCR3)的抗體。
圖 3顯示使用生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物從抗體生成細胞分離出抗體，以呈現特異性結合至與所用免疫原的類型無關之所關注之第二例示性GPCR跨膜蛋白的跨膜蛋白抗原。抗體生成細胞係使用呈現所關注之跨膜蛋白的生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物，自用編碼跨膜蛋白的DNA（DNA）或純化的所關注之跨膜蛋白（蛋白質）免疫接種的經基因工程化小鼠中獲得，且生成抗體以用於篩選。所關注抗原之全長跨膜蛋白係在細胞（TMB過度表現）中表現，且將抗原表現細胞與未用編碼TMB之DNA（母代細胞）轉染之對照細胞進行比較。接著將細胞與抗體一起培育以辨識特異結合所關注之例示性跨膜蛋白之抗體。虛線以上的抗體可結合所關注之跨膜蛋白。相比之下，虛線以下的抗體為弱結合劑或無法結合所關注之跨膜蛋白，如與陽性（方形）及陰性（三角形）對照抗體相比所示。
圖 4展示使用所揭示方法自抗體生成細胞分離出之抗體，其表現以用來篩分與細胞表面上表現的所關注抗原之跨膜蛋白的結合。抗體生成細胞係使用呈現所關注抗原之跨膜蛋白之N端截短形式之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物，自經免疫接種之經基因工程改造小鼠獲得，且生成抗體用以篩選。所關注抗原之跨膜蛋白之截短形式係在細胞（過度表現之截短TMB）中表現，或所關注抗原之跨膜蛋白之全長形式係在細胞中表現（過度表現之全長TMB），且當細胞與抗體培育時，將表現抗原之細胞與未轉染編碼截短TMB抗原或全長TMB之DNA的對照細胞（親代細胞）進行比較，以辨識特異性結合位於示例性之所關注之跨膜蛋白的細胞外環結構域中表位的抗體（方框）。
表 1 ：抗體自經免疫接種小鼠所表現之各種跨膜蛋白之細胞表面抗體的細胞分離。使用編碼所關注之跨膜蛋白的DNA（DNA）、編碼跨膜蛋白之經修飾形式的DNA(經修飾DNA)、純化跨膜蛋白(蛋白質)、涵蓋所關注之跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物（含有抗原的複合物）或其組合，對已經由基因工程改造以預防表現來自內源性基因的所關注之跨膜蛋白的小鼠（不含抗原的經基因修飾小鼠）或表現來自內源性基因的所關注之跨膜蛋白之經基因工程改造的小鼠（基因修飾的小鼠）進行免疫接種。使用本文揭示的分選方法（細胞分選及含有抗原的複合物）收集之抗體生成細胞及抗體係自細胞分離，且與使用標準融合瘤技術（融合瘤）獲得之細胞所分離之抗體進行比較。對於所分析之每個跨膜蛋白，與標準融合瘤技術相比，藉由用呈現所關注之的跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物篩選細胞，可獲得較高百分比之與所關注之跨膜蛋白結合的抗體，這些抗體來自抗體生成。
表 2 ：比較細胞分選策略能力，以獲得表現特異結合至所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞。具有（VI）或不具（VI-KO）編碼所分析之所關注之例示性跨膜蛋白(即，GPCR1或離子通道2)的內源性小鼠基因的經基因工程化小鼠係藉由注射以下免疫原之一或多者而進行免疫接種： 編碼所關注之跨膜蛋白的DNA（DNA）、純化之跨膜蛋白（蛋白質）、可表現所關注之跨膜蛋白(VLP)之類病毒顆粒或其組合（VLP及DNA）。隨後使用以下一種分選劑以對從經免疫接種小鼠獲得之B細胞進行分選：生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物，其呈現跨膜蛋白（含有TMB的複合物）、VLP或純化跨膜蛋白（蛋白質）。接著收集製造結合於分選劑之抗體的細胞，且從每個細胞生成抗體以進行比較。
表 3：比較從基因工程化小鼠獲得的抗體生成細胞所產生的抗體，該小鼠用編碼所關注之人類跨膜蛋白的DNA（DNA）或純化的人類跨膜蛋白（蛋白質）進行免疫接種，其中使用呈現所關注之跨膜蛋白之生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物（含有TMB的複合物）對自每隻小鼠獲得的細胞進行分類。該數據提供5個代表性免疫活動的結果。
表 4：抗體生成細胞之分離及生成來自經基因修飾小鼠之不表現所關注之兩種不同例示性跨膜蛋白(VI-KO)之小鼠同源物的抗體，比較不同免疫接種策略以顯示可使用生物素化脂質雙層膜支架蛋白複合物，以獲得結合至所關注之跨膜蛋白之小鼠同源物(小鼠TMB)和所關注之跨膜蛋白之人類同源物(人類TMB)的交叉反應性抗體。所提供的數據為四種針對TMB1的代表性免疫接種活動及四種針對TMB2的代表性免疫接種活動的組合。
表 5：抗體生成細胞之分離及生成來自經基因修飾之小鼠之不表現所關注之例示性跨膜蛋白（VI-KO）之小鼠同源物的抗體，顯示用脂質雙層膜支架蛋白複合物免疫接種經基因修飾之小鼠，其涵蓋有人類TMB2蛋白（人類TMB2），且使用呈現人類TMB2蛋白（含有人類TMB2的複合物）之脂質雙層膜支架蛋白複合物及/或呈交呈人類TMB2蛋白之脂質雙層膜支架蛋白複合物及/或使用呈現小鼠TMB2蛋白（含有小鼠TMB2的複合物）之脂質雙層膜支架蛋白複合物來分選抗體生成B細胞，確定了表現可結合小鼠TMB2及人類TMB2蛋白同源物之交叉反應抗體的抗體生成B細胞，以及特異於人類TMB2蛋白的抗體。所提供的數據是兩種代表性免疫活動的組合。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
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Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
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Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018

Claims (54)

  1. 一種用於獲得表現結合至所關注之跨膜蛋白之抗體的抗體生成細胞的方法，該方法包括： （a）將抗體生成細胞群體與包括有所關注之跨膜蛋白的脂質雙層膜支架蛋白複合物接觸，以允許該所關注之跨膜蛋白與該細胞表面上之抗體結合；以及 （b）收集結合至所關注之跨膜蛋白的該細胞。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該複合物包括複數個脂質，其形成由至少一個膜支架蛋白包圍之盤狀磷脂雙層。
  3. 如請求項1所述之方法，其中該抗體生成細胞群體係自脾臟、淋巴結、周邊血液、骨髓或其組合獲得。
  4. 如請求項1所述之方法，其中該抗體生成細胞群體包括周邊血球、B細胞、漿細胞、漿細胞骨髓瘤或其組合。
  5. 如請求項4所述之方法，其中該抗體生成細胞群體包括B細胞。
  6. 如請求項1所述之方法，其中該抗體生成細胞係自先前已免疫接種至該所關注之跨膜蛋白之哺乳動物獲得。
  7. 如請求項6所述之方法，其中該哺乳動物為已用編碼該所關注之跨膜蛋白之至少一部分的核酸免疫接種或具有該所關注之跨膜蛋白之至少一部分的非人類哺乳動物。
  8. 如請求項7所述之方法，其中該非人類哺乳動物係經基因工程改造。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該經基因工程改造之非人類哺乳動物不表現來自內源性基因之該所關注之跨膜蛋白。
  10. 如請求項8所述之方法，其中該經基因工程改造之非人類哺乳動物包括編碼人類重鏈可變區的核酸序列及編碼人類輕鏈可變區的核酸序列。
  11. 如請求項8所述之方法，其中該經基因工程改造之非人類哺乳動物為小鼠。
  12. 如請求項9所述之方法，其中該所關注之跨膜蛋白為人類跨膜蛋白。
  13. 如請求項12所述之方法，其中該經基因工程改造之非人類哺乳動物已用該跨膜蛋白的非人類同源物或編碼該跨膜蛋白之非人類同源物的核酸免疫接種。
  14. 如請求項13所述之方法，其中在該步驟（b）中收集之該細胞表現結合於該人類跨膜蛋白的抗體及該跨膜蛋白的該非人類同源物。
  15. 如請求項12所述之方法，其中該經基因工程改造之非人類哺乳動物已用該所關注之嵌合跨膜蛋白或編碼該所關注之嵌合跨膜蛋白之核酸免疫接種，且其中該嵌合跨膜蛋白包括該所關注之跨膜蛋白之非人類同源物的一部分及該人類跨膜蛋白的一部分。
  16. 如請求項15所述之方法，其中在該步驟（b）中收集之該細胞表現結合至位於該人類跨膜蛋白上的表位的抗體。
  17. 如請求項8所述之方法，其中該所關注之跨膜蛋白為嵌合跨膜蛋白，其中該嵌合蛋白包括可操作地連接至一部分非人類跨膜蛋白之人類跨膜蛋白的一部分。
  18. 如請求項17所述之方法，其中該經基因工程改造之非人類哺乳動物已用該人類跨膜蛋白或編碼該人類跨膜蛋白之核酸免疫接種。
  19. 如請求項18所述之方法，其中在該步驟（b）中收集之該細胞表現與該嵌合跨膜蛋白之人類部分結合的抗體。
  20. 如請求項8所述之方法，其中該經基因工程改造之非人類哺乳動物已用來自該跨膜蛋白之截短形式免疫接種。
  21. 如請求項20所述之方法，其中該經基因工程改造之非人類哺乳動物已經以全長形式之該跨膜蛋白或編碼其之核酸免疫接種。
  22. 如請求項20所述之方法，其中該跨膜蛋白之截短形式不包含該跨膜蛋白之全長形式的N端結構域或C端結構域。
  23. 如請求項22所述之方法，其中該跨膜蛋白之截短形式包括細胞外環，且其中在該步驟（b）中收集之該細胞表現結合至位於該跨膜蛋白之該截短形式之該細胞外環上的表位的抗體。
  24. 如請求項1所述之方法，其中該步驟（a）更包括將該抗體生成細胞群體與至少一種阻斷劑接觸。
  25. 如請求項24所述之方法，其中該至少一種阻斷劑為結合至該所關注之跨膜蛋白之一部分的多肽。
  26. 如請求項25所述之方法，其中該多肽結合至該所關注之跨膜蛋白之N端結構域或該所關注之跨膜蛋白之C端結構域。
  27. 如請求項26所述之方法，其中，該跨膜蛋白包括細胞外環，且其中在該步驟（b）中收集之該細胞表現結合至位於該所關注之跨膜蛋白之該細胞外環上的表位的抗體。
  28. 如請求項24所述之方法，其中該抗體生成細胞群係自已用該包括有該所關注之跨膜蛋白的該脂質雙層膜支架蛋白複合物免疫接種之哺乳動物獲得，其中該複合物更包括第一可偵測標記，且其中該所關注之跨膜蛋白包括第二可偵測標記。
  29. 如請求項28所述之方法，其中該至少一種阻斷劑包括（i）結合至該第一可偵測標記之第一阻斷劑以及（ii）結合至該第二可偵測標記之第二阻斷劑。
  30. 如請求項29所述之方法，其中該至少一種阻斷劑包括結合至該膜支架蛋白之第三阻斷劑。
  31. 如請求項1所述之方法，其中該所關注之跨膜蛋白係選自由以下所組成之群組：G-蛋白偶聯受體（GPCR）蛋白、四跨膜蛋白及離子通道蛋白。
  32. 如請求項31所述之方法，其中該所關注之跨膜蛋白為GPCR蛋白。
  33. 如請求項31所述之方法，其中該所關注之跨膜蛋白為離子通道蛋白。
  34. 如請求項31所述之方法，其中該所關注之跨膜蛋白為四跨膜蛋白。
  35. 如請求項1所述之方法，其中該複合物更包括與可偵測標記接合之至少一個膜支架蛋白。
  36. 如請求項35所述之方法，其中收集與該所關注之跨膜蛋白結合之該細胞的步驟包括： 偵測該細胞與該所關注之跨膜蛋白的結合； 將結合至該所關注之跨膜蛋白之細胞與未結合至該所關注之跨膜蛋白之細胞分離；以及 收集該結合細胞。
  37. 如請求項36所述之方法，其中該可偵測標記為生物素。
  38. 如請求項37所述之方法，其中該偵測包括： 用鏈黴親和素-藻紅素（PE-鏈黴親和素）培育步驟（b）之該細胞；以及 使用螢光活化細胞分選（FACS）來辨識該結合細胞。
  39. 如請求項36所述之方法，其中該可偵測標記為螢光分子。
  40. 如請求項39所述之方法，其中該偵測包括使用FACS辨識該結合細胞。
  41. 如請求項1所述之方法，其更包括（i）將自步驟（b）中收集之細胞分離出包括有編碼由該細胞表現之該抗體之重鏈可變區的核苷酸序列的核酸，及包括有編碼由該細胞所表現之抗體之輕鏈可變區的核苷酸序列的核酸。
  42. 如請求項41所述之方法，其中該方法在步驟（i）之後更包括： (ii)轉染一宿主細胞，以引入於步驟（i）中分離出之包括有編碼該重鏈可變區之核苷酸序列的該核酸，及包括有編碼該輕鏈可變區之核苷酸序列的該核酸；及 （iii）在表現包括有該重鏈可變區及該輕鏈可變區之抗體的條件下培養來自步驟（ii）之該宿主細胞。
  43. 如請求項42所述之方法，其中步驟（ii）中之該宿主細胞是以包括有編碼該重鏈可變區之核苷酸序列的第一表現載體及包括有編碼該輕鏈可變區之核苷酸序列的第二表現載體轉染。
  44. 如請求項42所述之方法，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞。
  45. 如請求項44所述之方法，其中該哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢（CHO）細胞。
  46. 一種抗體，其係藉由請求項41至45中任一項所述之方法獲得。
  47. 如請求項46所述之抗體，其中該抗體結合至選自由以下所組成之群組的所關注之跨膜蛋白：G-蛋白偶聯受體（GPCR）蛋白、四跨膜蛋白及離子通道蛋白。
  48. 如請求項47所述之抗體，其中該所關注之跨膜蛋白為GPCR蛋白。
  49. 如請求項47所述之抗體，其中該所關注之跨膜蛋白為離子通道蛋白。
  50. 如請求項47所述之抗體，其中該所關注之跨膜蛋白為四跨膜蛋白。
  51. 如請求項46所述之抗體，其中該抗體是調節細胞中該所關注之跨膜蛋白的功能。
  52. 一種藉由如請求項1至45中任一項所述之方法製備之哺乳動物宿主細胞，其中該宿主細胞表現結合至該所關注之跨膜蛋白的抗體或其片段。
  53. 如請求項52所述之哺乳動物宿主細胞，其中該細胞為中國倉鼠卵巢（CHO）細胞。
  54. 如請求項1至45中任一項所述之方法，其中，包括有該所關注之跨膜蛋白的該脂質雙層膜支架蛋白複合物係藉由混合脂質、膜支架蛋白以及在一或多種洗滌劑存在下所提供之該所關注之跨膜蛋白且移除該一或多種洗滌劑而形成，以誘導包括有該所關注之該跨膜蛋白的複合物之形成。
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