KR20220053596A - 치료 항체 발견을 위한 효율적인 하이브리도마 플랫폼의 개발 - Google Patents
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Abstract
본 기술은 항체, 항체 라이브러리, 하이브리도마, 하이브리도마 라이브러리 등을 생산하기 위한 향상된 방법에 전반적으로 관계한다. 예를 들면, 이들 방법은 생산된 항원 특이적 B 세포의 숫자를 증가시키고, 하이브리도마의 숫자를 증가시키고 및/또는 소정의 생산 주기에서 만들어질 수 있는 단일클론 항체의 숫자를 증가시킨다.
Description
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2019년 8월 30일 자 제출된 U.S. 가출원 번호 62/894,660에 우선권을 주장하고, 이것은 본원에서 전체적으로 및 모든 점에서 참조로서 편입된다.
배경
단일클론 항체는 임상적 진단에서 수십 년 동안 핵심 시약으로서 이용되었고, 그리고 이들은 치료적 작용제의 중요한 새로운 부류로서 급부상하고 있다. 하이브리도마 기법은 단일클론 항체를 획득하기 위한 가장 흔히 이용되는 방법이다. 단일클론 항체는 정상 항체 생산 비장 B-세포를 불멸 골수종 세포 또는 다른 불멸 세포와 융합함으로써 창출된 하이브리도마 세포로부터 분비된다.
하이브리도마 생산은 수십 년 전 개시 이후로 거의 변화가 없었다 (Nature 256:495-497 (1975)). 하이브리도마의 산출을 위한 전형적인 프로토콜은 (i) 동물 (예를 들면, 생쥐, 쥐 또는 토끼)을 항원으로 면역화; (ii) 항체 생산 B-세포를 전형적으로 비장으로부터 수확; (iii) B-세포를 비-분비성 골수종 세포주와 융합하여 하이브리도마를 형성; (iv) 하이브리도마 세포를 선별 배지에서 성장; (v) 원하는 항체를 생산하는 세포에 대한 선별검사; 및 (vi) 상기 항체를 분비하는 균질한 세포주를 획득하기 위한 원하는 하이브리도마(들)의 클로닝을 수반한다.
증가된 숫자의 항원 특이적 항체를 산출하고 단일클론 항체 및 항체 라이브러리의 생산을 향상시키는 것이 요구된다.
요약
본 기술은 항체, 항체 라이브러리, 하이브리도마, 하이브리도마 라이브러리 등을 생산하기 위한 향상된 방법뿐만 아니라 다양한 방법 단계로부터 조성물에 전반적으로 관계한다. 예를 들면, 이들 방법은 생산된 항원 특이적 B 세포의 숫자를 증가시키고, 하이브리도마의 숫자를 증가시키고 및/또는 소정의 생산 주기에서 만들어질 수 있는 단일클론 항체의 숫자를 증가시킬 수 있다. 본원에서 설명된 방법은 다양한 질환을 치료하는 데 이용을 위한 항체, 항체 라이브러리, 하이브리도마, 하이브리도마 라이브러리 등뿐만 아니라 다양한 방법 단계로부터 조성물의 생산을 유의미하게 증가시키는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 본원에서 설명된 방법은 암, 면역 장애, 염증성 질환, 그리고 항체 요법에 의해 치료 가능한 임의의 다른 질환의 치료를 위한 항체 및/또는 하이브리도마 산출에 적용될 수 있다. 본원에서 설명된 방법은 도전적인 표적을 향해 지향된 항체 및/또는 하이브리도마 산출에 적용될 수 있다. 도전적인 표적은 예를 들면 표적화가능 영역의 크기가 작고, 단백질 입체형태가 중요하고 및/또는 항원이 변형되기 (예를 들면, 번역후 변형 예컨대 글리코실화, 인산화, 아세틸화 및 메틸화에 의해) 때문에, 항체를 산출하기 어려운 항원이다. 구체예에서, 표적 항원은 다중통과 막경유 단백질이다. 구체예에서, 다중통과 막경유 단백질은 G 단백질-연계된 수용체 (GPCR)이다. 구체예에서, 다중통과 막경유 단백질은 이온 펌프, 이온 통로, 또는 전달체이다.
한 양상에서, 항체, 항체 라이브러리, 하이브리도마, 또는 하이브리도마 라이브러리를 생산하기 위한 방법이 제공된다. 구체예에서, 상기 방법은 다음 단계 중에서 1가지 또는 그 이상을 포함할 수 있다:
(a) 복수의 동물에게 항원을 주사하는 단계;
(b) B 세포를 각 동물로부터 수확하는 단계;
(c) B 세포 및 융합 파트너 사이의 하이브리도마를 형성하는 단계; 및
(d) 하이브리도마를 항원에 대한 결합 특이성에 대해 선별검사하는 단계.
구체예에서, 하기의 조건 중에서 적어도 1가지, 그리고 바람직하게는 2가지 또는 그 이상이 적용될 수 있다:
(i) 동물이 이계번식 동물임;
(ii) 동물이 복수 부위에서 주사됨;
(iii) 동물이 적어도 매주, 적어도 10 일마다, 적어도 2 주마다, 또는 주사 중간에 더 큰 지속 기간의 일부 다른 빈도의 빈도로 주사됨;
(iv) 동물이 6 주에서 15 주 사이 동안 주사됨;
(v) 각 동물에게 단일 어쥬번트가 주사되고 적어도 일부 동물에게 상이한 어쥬번트가 주사되도록, 복수의 어쥬번트가 이용됨;
(vi) B 세포가 (c) 단계에 앞서 농축됨; 및/또는
(vii) 표면 및 분비된 IgG 둘 모두를 발현하도록 조작된 융합 파트너의 이용.
한 양상에서, 항체, 항체 라이브러리, 하이브리도마, 또는 하이브리도마 라이브러리를 생산하기 위한 방법이 제공된다. 구체예에서, 상기 방법은 다음 단계 중에서 1가지 또는 그 이상을 포함할 수 있다:
(a) 1마리 또는 그 이상의 동물에게 항원을 주사하는 단계;
(b) B 세포를 각 동물로부터 수확하는 단계;
(c) B 세포 및 융합 파트너 사이의 하이브리도마를 형성하는 단계; 및
(d) 하이브리도마를 항원에 대한 결합 특이성에 대해 선별검사하는 단계.
구체예에서, 하기의 조건 중에서 적어도 1가지, 그리고 바람직하게는 2가지 또는 그 이상이 적용될 수 있다:
(i) 동물이 이계번식 동물임;
(ii) 동물이 복수 부위에서 주사됨;
(iii) 동물이 적어도 매주, 적어도 10 일마다, 적어도 2 주마다, 또는 주사 중간에 더 큰 지속 기간의 일부 다른 빈도의 빈도로 주사됨;
(iv) 동물이 6 주에서 15 주 사이 동안 주사됨;
(v) 각 동물에게 단일 어쥬번트가 주사되고 상이한 동물에게 상이한 어쥬번트가 주사되도록, 복수의 어쥬번트가 이용됨;
(vi) B 세포가 (c) 단계에 앞서 농축됨; 및/또는
(vii) 표면 및 분비된 IgG 둘 모두를 발현하도록 조작된 융합 파트너의 이용.
구체예에서, 하기의 조건 중에서 적어도 1가지, 그리고 바람직하게는 2가지 또는 그 이상이 적용될 수 있다:
(i) 동물이 이계번식 동물임;
(ii) 동물이 복수 부위에서 주사됨;
(iii) 동물이 적어도 매주, 적어도 10 일마다, 적어도 2 주마다, 또는 주사 중간에 더 큰 지속 기간의 일부 다른 빈도의 빈도로 주사됨;
(iv) 동물이 6 주에서 15 주 사이 동안 주사됨;
(v) 각 동물에게 단일 어쥬번트가 주사되고 상이한 동물에게 상이한 어쥬번트가 주사되도록, 복수의 어쥬번트가 이용됨; 및/또는
(vi) B 세포가 (c) 단계에 앞서 농축됨.
구체예에서, B 세포는 배수 림프절로부터 수확될 수 있다.
구체예에서, 상기 방법은 2마리 또는 그 이상의 동물에게 항원을 주사하는 단계를 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 3마리 또는 그 이상의 동물에게 항원을 주사하는 단계를 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 4마리 또는 그 이상의 동물에게 항원을 주사하는 단계를 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 5마리 또는 그 이상의 동물에게 항원을 주사하는 단계를 포함할 수 있다.
구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 2가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 3가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 4가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 5가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 6가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 7가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vi) 조건 중에서 2가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vi) 조건 중에서 3가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vi) 조건 중에서 4가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vi) 조건 중에서 5가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vi) 조건 중에서 6가지가 적용될 수 있다.
구체예에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(a) 항원을 복수의 이계번식 쥐 각각의 복수 부위에 주사하는 단계;
(b) 주사를 적어도 6 주 동안 2 주마다 반복하는 단계;
(c) 면역 세포를 각 쥐의 하나 또는 그 이상의 배수 림프절로부터 수확하는 단계;
(d) 비-B 세포를 음성 선택에 의해 면역 세포로부터 고갈시켜, 농축된 B 세포 표본을 형성하는 단계;
(e) 농축된 B 세포 표본을 복수의 융합 파트너와 접촉시켜, B 세포 및 융합 파트너 사이의 하이브리도마를 형성하는 단계; 및
(f) 하이브리도마를 항원에 대한 특이성에 대해 선별검사하는 단계.
구체예에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(a) 항원을 1마리 또는 그 이상의 이계번식 쥐 각각의 복수 부위에 주사하는 단계;
(b) 주사를 적어도 6 주 동안 2 주마다 반복하는 단계;
(c) 면역 세포를 각 쥐의 하나 또는 그 이상의 배수 림프절로부터 수확하는 단계;
(d) 비-B 세포를 음성 선택에 의해 면역 세포로부터 고갈시켜, 농축된 B 세포 표본을 형성하는 단계;
(e) 농축된 B 세포 표본을 복수의 융합 파트너와 접촉시켜, B 세포 및 융합 파트너 사이의 하이브리도마를 형성하는 단계; 및
(f) 하이브리도마를 항원에 대한 특이성에 대해 선별검사하는 단계.
구체예에서, 동물은 쥐일 수 있다. 구체예에서, 동물은 이계번식 쥐일 수 있다. 이계번식 쥐의 실례는 제한 없이, Sprague Dawley, Long-Evans, Sentinel, Wistar, Wistar Han, 그리고 Holtzman 쥐를 포함한다. 구체예에서, 동물은 유전자도입 동물일 수 있다. 구체예에서, 동물은 유전자도입 쥐일 수 있다.
구체예에서, 동물은 복수 부위에 주사될 수 있다. 구체예에서, 복수 부위는 배수 림프절에 근접한 부위일 수 있다. 구체예에서, 복수 부위는 등, 어깨, 복막내, 꼬리 밑부분 및 비절 중에서 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.1 μg 및 300 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.5 μg 및 200 μg 사이일 수 있다.
구체예에서, 상기 방법은 2마리 또는 그 이상의 이계번식 쥐에게 항원을 주사하는 단계를 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 3마리 또는 그 이상의 이계번식 쥐에게 항원을 주사하는 단계를 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 4마리 또는 그 이상의 이계번식 쥐에게 항원을 주사하는 단계를 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 5마리 또는 그 이상의 이계번식 쥐에게 항원을 주사하는 단계를 포함할 수 있다.
구체예에서, 동물은 2 주마다 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 주 1회보다 많지 않게 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 2 주마다 1회보다 많지 않게 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 6 주에서 20 주 사이 동안 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 일 또는 그 이상마다 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 6 주에서 15 주 사이 동안 주사될 수 있다. 주사 횟수는 종결점을 포함한, 언급된 범위에 의해 포괄된 모든 값 및 부분범위를 포함한다.
구체예에서, 복수의 어쥬번트가 이용될 수 있고, 그리고 각 동물 (또는 동물의 부분집합)은 상이한 어쥬번트가 주사될 수 있다. 예를 들면, 동물은 복수의 군으로 분할될 수 있는데, 여기서 상기 군의 각 구성원은 단일 어쥬번트 또는 어쥬번트의 조합을 받아들이고, 그리고 각 어쥬번트 또는 조합은 다른 군 중에서 적어도 일부에 의해 받아들여지는 것과 상이하다. 구체예에서, 복수의 어쥬번트는 제한 없이, 완전 프로인드 어쥬번트 (CFR), Ribi 및/또는 TLR 효현제 칵테일을 포함할 수 있다. 구체예에서, CFR은 기계-혼합될 수 있다.
구체예에서, B 세포는 하이브리도마를 형성하기 전에 농축될 수 있다. 구체예에서, 농축은 배수 림프절로부터 수확된 세포를 결합 작용제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 구체예에서, B 세포는 음성 선택에 의해 농축될 수 있다. 구체예에서, 결합 작용제는 B 세포가 아닌 세포와 연관된 분자에 대해 특이적일 수 있다. 구체예에서, 결합 작용제는 B 세포가 아닌 세포의 표면 상에서 발현된 분자에 대해 특이적일 수 있다. 구체예에서, B 세포는 양성 선택에 의해 농축될 수 있다. 구체예에서, 결합 작용제는 B 세포와 연관된 분자에 대해 특이적일 수 있다. 구체예에서, 결합 작용제는 B 세포의 표면 상에서 발현된 분자에 대해 특이적일 수 있다. 구체예에서, 결합 작용제는 항체일 수 있다. 구체예에서, 자성 분리가 이용될 수 있다.
구체예에서, 융합 파트너는 표면 및 분비된 IgG 둘 모두를 발현하도록 조작된 세포일 수 있다. 구체예에서, 융합 파트너는 Sp2ab 융합 파트너일 수 있다. 구체예에서, 하이브리도마를 선별검사하는 단계는 항원에 특이적인 항체를 발현하는 하이브리도마를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 구체예에서, 하이브리도마를 선별검사하는 단계는 항원에 특이적인 IgG 항체의 발현에 대한 FACS 분류를 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1a는 항원 A (표적 A)에 대한 항체 생산에 대해 Balb/c 생쥐와 대비하여 Sprague Dawley 쥐 (SD 쥐)를 이용할 때 IgG 혈청 역가에서 차이를 보여준다. 생쥐 대 쥐에서 표적 A 사이의 상동성은 98%이다. 생쥐와 대비하여 *p < 0.05.
도 1b는 항원 B (표적 B)에 대한 항체 생산에 대해 C57 백 6 (C57/Bl6) 생쥐와 대비하여 Sprague Dawley 쥐 (SD 쥐)를 이용할 때 IgG 혈청 역가에서 차이를 보여준다. 생쥐와 대비하여 *p < 0.05.
도 2a는 면역화를 위한 항원 주사 부위의 실례를 보여주는, 쥐의 표현이다.
도 2b는 각 동물의 단일 부위 주사 또는 복수 부위 주사를 이용한, 항원 C (표적 C) 및 D (표적 D)에 대한 항원 특이적 항체 역가를 보여준다. 단일 주사와 대비하여 *p < 0.05.
도 3a는 항원을 이용한 동물의 주사를 위한 실례 프로토콜, 그리고 상기 프로토콜에 기초된 예상된 항원 특이적 Ig (IgM 및 IgG) 반응을 보여준다. 배경 혈청 역가가 첫 번째 주사에 앞서 수행된다 ("역가 검사 채혈"). 동물에게 0주 차에 어쥬번트에서 항원이 주사되고 ("일차 접종"), 이후 6주 차 때까지 2 주마다 1회 PBS에서 항원이 주사된다 ("추가 접종"). 혈청 역가가 최종 주사 후 다시 한 번 계측된다.
도 3b 및 3c는 표준 항원 주사 프로토콜 (9 주 동안 주 2회 주사) 및 도 3a에서 도시된 향상된 프로토콜을 비교한다. 향상된 프로토콜은 Ribi 어쥬번트 (도 3b) 또는 TLR 어쥬번트 (도 3c)에서 투여될 때, 항원 E (표적 E)에 대한 항체 역가를 증가시킨다.
도 4a는 주사 부위에 근접한 배수 림프절의 실례를 보여주는, 쥐의 표현이다.
도 4b는 세포가 비장과 비교하여 림프절로부터 수확될 때, 항원 (표적 D)-특이적 하이브리도마 클론의 숫자에서 차이를 보여준다. LNs로부터 IgG+ 하이브리도마에서 증가는 쥐 (생쥐와는 대조적으로)에 적용 가능하다.
도 5a는 항원 J에 대한 항원 특이적 IgG 혈청 역가를 보여준다. CFA 어쥬번트가 이용되었고, 그리고 기계에 의해 또는 손 ("주입기 혼합")에 의해 혼합되었다. 주입기 혼합과 대비하여 *p < 0.01.
도 5b 및 5c는 CFA, Ribi, 또는 TLR이 어쥬번트로서 이용될 때, 항원 F ("표적 F," 도 5b) 또는 항원 G ("표적 G," 도 5c)에 대한 항원 특이적 IgG 혈청 역가를 보여준다. 다른 조건과 대비하여 *p < 0.05.
도 6은 전체 림프절로부터 파생된 IgG-양성 하이브리도마 클론 ("분리되지 않음"), 림프-수확된 세포의 비-B 세포의 고갈 후 남아있는 세포 ("B 세포"), 또는 농축된 B 세포로부터 IgM-양성 B 세포의 고갈 후 남아있는 세포의 숫자를 보여준다.
도 7a는 P3X63AgU.1 ("PU.1"; ATCC) 또는 Sp2ab (Enzo Abeome DiSH) 중 어느 한 가지를 융합 파트너로서 이용하여 산출된 항원 H ("표적 H")-특이적 하이브리도마의 숫자를 보여준다.
도 7b는 SP2ab 하이브리도마의 FACS 분류 프로필을 보여준다.
도 7c 및 7d는 PU.1 또는 Sp2ab 융합 파트너를 이용하여 산출된 항원 특이적 하이브리도마의 백분율을 보여준다.
도 1a는 항원 A (표적 A)에 대한 항체 생산에 대해 Balb/c 생쥐와 대비하여 Sprague Dawley 쥐 (SD 쥐)를 이용할 때 IgG 혈청 역가에서 차이를 보여준다. 생쥐 대 쥐에서 표적 A 사이의 상동성은 98%이다. 생쥐와 대비하여 *p < 0.05.
도 1b는 항원 B (표적 B)에 대한 항체 생산에 대해 C57 백 6 (C57/Bl6) 생쥐와 대비하여 Sprague Dawley 쥐 (SD 쥐)를 이용할 때 IgG 혈청 역가에서 차이를 보여준다. 생쥐와 대비하여 *p < 0.05.
도 2a는 면역화를 위한 항원 주사 부위의 실례를 보여주는, 쥐의 표현이다.
도 2b는 각 동물의 단일 부위 주사 또는 복수 부위 주사를 이용한, 항원 C (표적 C) 및 D (표적 D)에 대한 항원 특이적 항체 역가를 보여준다. 단일 주사와 대비하여 *p < 0.05.
도 3a는 항원을 이용한 동물의 주사를 위한 실례 프로토콜, 그리고 상기 프로토콜에 기초된 예상된 항원 특이적 Ig (IgM 및 IgG) 반응을 보여준다. 배경 혈청 역가가 첫 번째 주사에 앞서 수행된다 ("역가 검사 채혈"). 동물에게 0주 차에 어쥬번트에서 항원이 주사되고 ("일차 접종"), 이후 6주 차 때까지 2 주마다 1회 PBS에서 항원이 주사된다 ("추가 접종"). 혈청 역가가 최종 주사 후 다시 한 번 계측된다.
도 3b 및 3c는 표준 항원 주사 프로토콜 (9 주 동안 주 2회 주사) 및 도 3a에서 도시된 향상된 프로토콜을 비교한다. 향상된 프로토콜은 Ribi 어쥬번트 (도 3b) 또는 TLR 어쥬번트 (도 3c)에서 투여될 때, 항원 E (표적 E)에 대한 항체 역가를 증가시킨다.
도 4a는 주사 부위에 근접한 배수 림프절의 실례를 보여주는, 쥐의 표현이다.
도 4b는 세포가 비장과 비교하여 림프절로부터 수확될 때, 항원 (표적 D)-특이적 하이브리도마 클론의 숫자에서 차이를 보여준다. LNs로부터 IgG+ 하이브리도마에서 증가는 쥐 (생쥐와는 대조적으로)에 적용 가능하다.
도 5a는 항원 J에 대한 항원 특이적 IgG 혈청 역가를 보여준다. CFA 어쥬번트가 이용되었고, 그리고 기계에 의해 또는 손 ("주입기 혼합")에 의해 혼합되었다. 주입기 혼합과 대비하여 *p < 0.01.
도 5b 및 5c는 CFA, Ribi, 또는 TLR이 어쥬번트로서 이용될 때, 항원 F ("표적 F," 도 5b) 또는 항원 G ("표적 G," 도 5c)에 대한 항원 특이적 IgG 혈청 역가를 보여준다. 다른 조건과 대비하여 *p < 0.05.
도 6은 전체 림프절로부터 파생된 IgG-양성 하이브리도마 클론 ("분리되지 않음"), 림프-수확된 세포의 비-B 세포의 고갈 후 남아있는 세포 ("B 세포"), 또는 농축된 B 세포로부터 IgM-양성 B 세포의 고갈 후 남아있는 세포의 숫자를 보여준다.
도 7a는 P3X63AgU.1 ("PU.1"; ATCC) 또는 Sp2ab (Enzo Abeome DiSH) 중 어느 한 가지를 융합 파트너로서 이용하여 산출된 항원 H ("표적 H")-특이적 하이브리도마의 숫자를 보여준다.
도 7b는 SP2ab 하이브리도마의 FACS 분류 프로필을 보여준다.
도 7c 및 7d는 PU.1 또는 Sp2ab 융합 파트너를 이용하여 산출된 항원 특이적 하이브리도마의 백분율을 보여준다.
상세한 설명
이러한 설명을 읽어본 후, 다양한 대안적 구체예 및 대안적 적용에서 본원 발명을 어떻게 실행할 지는 당업자에게 명백해질 것이다. 하지만, 본 기술의 모든 다양한 구체예가 본원에서 설명되지는 않을 것이다. 여기에서 제시된 구체예는 단지 실례로서 제시되고, 그리고 제한하지 않는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 다양한 대안적 구체예에 관한 이러한 상세한 설명은 본원에서 진술된 바와 같은 발명의 범위 또는 폭을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 기술을 개시하고 설명하기에 앞서, 아래에 설명된 양상은 특정 조성물, 이런 조성물을 제조하는 방법, 또는 이들의 용도에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 하는데, 그 이유는 이들이 당연히, 변할 수 있기 때문이다. 또한, 본원에서 이용된 용어는 단지 특정한 양상을 설명하기 위한 것이고, 그리고 한정하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해된다.
단지 독자의 편의를 위해 다양한 섹션으로 분할된 상세한 설명 및 임의의 섹션에서 발견된 개시는 다른 섹션에서 것들과 조합될 수 있다. 표제 또는 부제가 독자의 편의를 위해 본 명세서에서 이용될 수 있는데, 이들은 본원 발명의 범위에 영향을 주는 것으로 의도되지 않는다.
정의
별도로 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본원 발명이 속하는 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 및 뒤이은 청구항에서, 하기 의미를 갖는 것으로 규정될 다수의 용어가 언급될 것이다:
본원에서 이용된 용어는 특정한 구체예를 단지 설명하기 위한 것이고, 그리고 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 별도로 지시되지 않으면, 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
"임의적" 또는 "임의적으로"는 차후에 설명된 사건 또는 상황이 발생하거나 또는 발생하지 않을 수 있고, 그리고 상기 설명이 상기 사건 또는 상황이 발생하는 사례 및 발생하지 않는 사례를 포함한다는 것을 의미한다.
수명칭, 예를 들면, 온도, 시간, 양, 농도, 그리고 범위를 비롯한 다른 것 앞에서 이용될 때 용어 "약"은 ( + ) 또는 ( - ) 10%, 5%, 1%, 또는 이들 사이에 임의의 부분범위 또는 하위값에 의해 변할 수 있는 근사치를 표시한다. 바람직하게는, 복용량과 관련하여 이용될 때 용어 "약"은 용량이 +/- 10% 변할 수 있다는 것을 의미한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "근접"은 공간 내에 대상 또는 포인트의 짧은 물리적 거리 내에 위치되거나, 또는 짧은 거리 내에 배치된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 구체예에서, 근접은 약 0 mm 내지 약 50 mm 일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 0 mm 내지 약 40 mm 사이일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 0 mm 내지 약 30 mm 사이일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 0 mm 내지 약 20 mm 사이일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 0 mm 내지 약 10 mm 사이일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 1 mm 이하일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 5 mm 이하일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 1 cm 이하일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 2 cm 이하일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 5 cm 이하일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 1 mm일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 2 mm일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 3 mm일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 4 mm일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 5 mm일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 1 cm일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 2 cm일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 3 cm일 수 있다. 구체예에서, 근접은 약 4 cm일 수 있다. 거리는 종결점을 포함한, 언급된 범위 내에 임의의 값 또는 부분범위일 수 있다.
"포함하는" 또는 "포함한다"는 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만, 다른 것들을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물과 방법을 규정하는 데 이용될 때 "본질적으로 구성되는"은 언급된 목적을 위한 조합에 대한 임의의 본질적인 유의성을 갖는 다른 요소를 배제한다는 것을 의미할 것이다. 따라서, 본원에서 규정된 바와 같은 요소로 본질적으로 구성되는 조성물은 청구된 기술의 기본 및 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 다른 물질 또는 단계를 배제하지 않을 것이다. "구성되는"은 다른 성분 및 실제적인 방법 단계의 미량 이상의 원소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 이들 이행 용어 각각에 의해 규정된 구체예는 본원 발명의 범위 안에 있다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체) 및 항체 단편 (이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
본원에서 이용된 바와 같이 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 개체군을 구성하는 개별 항체는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 균질한 개체군으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "융합 파트너"는 B 세포와 조합 (융합)되어 하이브리도마를 형성할 수 있는 세포를 지칭한다. 일반적으로, 융합 파트너는 골수종 세포이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "이계번식"은 동일한 종의 다른 동물로부터 유전적으로 다양한 동물을 지칭한다. 대조적으로, "근친교계"는 동족번식으로 인해, 계통 내에 다른 것들과 유전적으로 동일하거나 (또는 거의 동일한) 동물을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "융합 파트너"는 하이브리도마의 창출을 위한 융합 파트너를 지칭한다. 다양한 종으로부터 하이브리도마의 창출을 위한 방법 및 세포는 당해 분야에서 널리 알려져 있다. 일반적으로, 융합 파트너는 골수종 세포이다. 융합 파트너는 하이브리도마의 창출을 위한 임의의 적합한 세포 또는 세포주, 예를 들면 골수종일 수 있다. 융합 파트너는 포유류 공급원으로부터 유래될 수 있다. 포유류 공급원은 영장류, 인간, 쥐, 생쥐, 설치류, 또는 임의의 다른 종일 수 있다.
방법
한 양상에서, 항체를 생산하기 위한 방법이 제공된다. 한 양상에서, 항체 라이브러리를 생산하기 위한 방법이 제공된다. 한 양상에서, 하이브리도마를 생산하기 위한 방법이 제공된다. 한 양상에서, 하이브리도마 라이브러리를 생산하기 위한 방법이 제공된다.
구체예에서, 상기 방법은 다음 단계 중에서 1가지 또는 그 이상을 포함할 수 있다:
(a) 1마리 또는 그 이상의 동물에게 항원을 주사하는 단계;
(b) B 세포를 예를 들면, 각 동물로부터 B 세포를 내포하는 배수 림프절로부터 수확하는 단계;
(c) 하나 또는 그 이상의, 또는 각각의 B 세포(들) 및 융합 파트너(들) 사이의 하이브리도마를 형성하는 단계; 및
(d) 하나 또는 그 이상의 하이브리도마를 항원에 대한 결합 특이성에 대해 선별검사하는 단계.
구체예에서, 하기의 조건 중에서 적어도 1가지, 또는 바람직하게는 적어도 2가지가 적용될 수 있다:
(i) 동물이 이계번식 동물임;
(ii) 동물이 복수 부위에서 주사됨;
(iii) 동물이 본원에서 설명된 빈도로, 예를 들면, 적어도 2 주마다 1회보다 많지 않게 주사됨;
(iv) 동물이 약 6 주에서 약 15 주 사이의 기간에 걸쳐 또는 상기 기간 동안 본원에서 설명된 바와 같은 빈도로 주사됨;
(v) 서로 다른 동물 또는 동물의 다른 군과 비교하여 상이한 어쥬번트가 상이한 동물 또는 동물의 군에게 주사되도록, 복수의 어쥬번트가 이용됨;
(vi) B 세포가 (c) 단계에 앞서 농축됨; 및/또는
(vii) 표면 및 분비된 IgG 둘 모두를 발현하도록 조작된 융합 파트너의 이용.
구체예에서, (a) - (d) 조건 중에서 적어도 2가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (a) - (d) 조건 중에서 적어도 3가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (a) - (d) 조건 중에서 4가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (a) - (d) 조건 중에서 1가지 또는 그 이상이 명시적으로 배제될 수 있다.
구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 적어도 3가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 적어도 4가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 적어도 5가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 적어도 6가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 2가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 3가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 4가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 5가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 6가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 7가지가 적용될 수 있다. 구체예에서, (i)-(vii) 조건 중에서 1가지 또는 그 이상이 명시적으로 배제될 수 있다. 구체예에서, (i) 조건이 명시적으로 배제된다. 구체예에서, (ii) 조건이 명시적으로 배제된다. 구체예에서, (iii) 조건이 명시적으로 배제된다. 구체예에서, (iv) 조건이 명시적으로 배제된다. 구체예에서, (v) 조건이 명시적으로 배제된다. 구체예에서, (vi) 조건이 명시적으로 배제된다. 구체예에서, (vii) 조건이 명시적으로 배제된다.
구체예에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(a) 항원을 1마리 또는 그 이상의 이계번식 쥐 각각의 복수 부위에 주사하는 단계;
(b) 주사를 적어도 6 주 동안 2 주마다 반복하는 단계;
(c) 면역 세포를 각 쥐의 하나 또는 그 이상의 배수 림프절로부터 수확하는 단계;
(d) 비-B 세포를 음성 선택에 의해 면역 세포로부터 고갈시켜, 농축된 B 세포 표본을 형성하는 단계;
(e) 농축된 B 세포 표본을 복수의 융합 파트너와 접촉시켜, 각 B 세포 및 융합 파트너 사이의 하이브리도마를 형성하는 단계; 및
(f) 하이브리도마를 항원에 대한 특이성에 대해 선별검사하는 단계.
구체예에서, 동물은 이계번식 동물일 수 있다. 구체예에서, 동물은 포유동물일 수 있다. 구체예에서, 동물은 설치류일 수 있다. 구체예에서, 설치류는 토끼, 기니 피그, 쥐, 햄스터, 생쥐 등일 수 있다. 구체예에서, 동물은 쥐일 수 있다. 구체예에서, 동물은 이계번식 쥐일 수 있다. 이계번식 쥐의 실례는 제한 없이, Sprague Dawley, Long-Evans, Sentinel, CD® IGS (Charles River), CD® Hairless, Wistar, Wistar Han, 그리고 Holtzman 쥐를 포함한다.
구체예에서, 동물은 생쥐일 수 있다. 구체예에서, 동물은 이계번식 생쥐일 수 있다. 이계번식 생쥐의 실례는 제한 없이, Black Swiss, CD-1® IGS (예를 들면, Charles River로부터), CF-1, CFW, ORL Sencar, SKH1-Elite, Sentinel, 그리고 Diversity Outbred (Jackson Laboratory)를 포함한다.
구체예에서, 상기 방법은 항원을 2마리 또는 그 이상의 이계번식 쥐 각각의 복수 부위에 주사하는 단계를 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 항원을 3마리 또는 그 이상의 이계번식 쥐 각각의 복수 부위에 주사하는 단계를 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 항원을 4마리 또는 그 이상의 이계번식 쥐 각각의 복수 부위에 주사하는 단계를 포함할 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 항원을 5마리 또는 그 이상의 이계번식 쥐 각각의 복수 부위에 주사하는 단계를 포함할 수 있다.
구체예에서, 동물은 하나 또는 그 이상의 부위에 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 복수 부위에 주사된다. 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 부위는 배수 림프절에 근접한 부위일 수 있다. 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 부위는 등, 어깨, 복막내, 꼬리 밑부분, 비절 및 정맥내 중에서 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 약 0.1 μg 및 약 300 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.1 μg 및 200 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.1 μg 및 100 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.1 μg 및 50 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.1 μg 및 25 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.1 μg 및 10 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.5 μg 및 200 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.5 μg 및 100 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.5 μg 및 50 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.5 μg 및 25 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.5 μg 및 10 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 1 μg 및 300 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 1 μg 및 200 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 1 μg 및 100 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 1 μg 및 50 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 1 μg 및 25 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 1 μg 및 10 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 5 μg 및 300 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 5 μg 및 200 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 5 μg 및 100 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 5 μg 및 50 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 5 μg 및 25 μg 사이일 수 있다. 구체예에서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 5 μg 및 10 μg 사이일 수 있다. 양은 종결점을 포함한, 언급된 범위 내에 임의의 값 또는 부분범위일 수 있다.
구체예에서, 동물은 하루에, 또는 적어도 1 주 내지 4 주마다, 바람직하게는 적어도 1 주마다, 10 일마다, 2 주마다, 3 주마다, 4 주마다, 기타 등등 발생하는 기간에 한 부위에 또는 복수 부위에 주사될 수 있다. 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 부위는 상이한 시점에 주사될 수 있지만, 각 부위는 1 주마다 내지 4 주마다보다 빈번하지 않게, 바람직하게는 2 주마다 등보다 빈번하지 않게 주사된다. 일부 구체예에서, 동물은 주 1회보다 많지 않게 주사된다. 일부 구체예에서, 동물은 2 주마다 1회보다 많지 않게 주사된다.
구체예에서, 동물은 6 주에서 15 주 사이 동안 본원에서 설명된 빈도로 주사를 제공받을 수 있다. 구체예에서, 동물은 7 주에서 15 주 사이 동안 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 8 주에서 15 주 사이 동안 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 9 주에서 15 주 사이 동안 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 10 주에서 15 주 사이 동안 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 11 주에서 15 주 사이 동안 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 12 주에서 15 주 사이 동안 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 13 주에서 15 주 사이 동안 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 14 주에서 15 주 사이 동안 주사될 수 있다.
구체예에서, 동물은 항원 및 어쥬번트를 포함하는 첫 번째 조성물이 초기에 적어도 하나의 부위에 주사되고, 이후 항원을 포함하는 두 번째 조성물이 2 주마다 1회 동일하거나 또는 상이한 부위에 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 2 주마다 1회보다 많지 않게 주사될 수 있다. 구체예에서, 동물은 2 주마다 1회보다 많지 않게 동일한 부위에 주사될 수 있다. 일부 구체예에서, 두 번째 조성물은 어쥬번트를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 두 번째 조성물은 어쥬번트를 포함한다. 구체예에서, 림프절은 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 또는 여섯 번째 주사 후 동물로부터 수확될 수 있다. 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 또는 여섯 번째 주사는 동물에서 동일한 부위 또는 부위들 내로 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 또는 여섯 번째 주사, 또는 상이한 부위 내로 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 또는 여섯 번째 주사를 의미할 수 있다.
구체예에서, 림프절은 초기 주사 후 예를 들면, 6 주 및 10 주 사이에 동물로부터 수확될 수 있다. 구체예에서, 림프절은 초기 주사 후 6 주 및 8 주 사이에 동물로부터 수확될 수 있다. 구체예에서, 림프절은 초기 주사 후 약 6 주째에 동물로부터 수확될 수 있다. 구체예에서, 림프절은 초기 주사 후 약 7 주째에 동물로부터 수확될 수 있다. 구체예에서, 림프절은 초기 주사 후 약 8 주째에 동물로부터 수확될 수 있다. 구체예에서, 림프절은 초기 주사 후 약 9 주째에 동물로부터 수확될 수 있다. 구체예에서, 림프절은 초기 주사 후 약 10 주째에 동물로부터 수확될 수 있다.
구체예에서, 복수의 어쥬번트가 이용될 수 있고, 그리고 각 동물 (또는 동물의 부분집합)은 상이한 어쥬번트가 주사될 수 있다. 구체예에서, 복수의 어쥬번트는 예를 들면, 완전 프로인드 어쥬번트 (CFR), Ribi 및/또는 TLR (톨 유사 수용체) 효현제 칵테일을 포함할 수 있다. 구체예에서, 어쥬번트는 프로인드 불완전 어쥬번트일 수 있다. 구체예에서, 어쥬번트는 TiterMax® (블록 공중합체 CRL-8941, 스쿠알렌 및 미세미립자 안정제를 내포하는 유중수 유제)일 수 있다.
일부 어쥬번트는 유제를 형성하기 위해 혼합된다. 이론에 한정됨 없이, 어쥬번트의 기계-혼합은 손-혼합 (예를 들면, 주입기 이용)과 비교하여 더 일관된 유화 및 향상된 결과를 야기하는 것으로 생각된다. 구체예에서, 어쥬번트는 기계-혼합될 수 있다. 구체예에서, 기계-혼합된 어쥬번트는 CFR일 수 있다.
구체예에서, B 세포는 하이브리도마를 형성하기 전에 농축될 수 있다. 구체예에서, 농축은 배수 림프절로부터 수확된 세포를 결합 작용제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 구체예에서, B 세포는 음성 선택에 의해 농축될 수 있다. 구체예에서, 결합 작용제는 B 세포가 아닌 세포와 연관된 분자에 대해 특이적일 수 있다. 구체예에서, 결합 작용제는 B 세포가 아닌 세포의 표면 상에서 발현된 분자에 대해 특이적일 수 있다. 구체예에서, B 세포는 양성 선택에 의해 농축될 수 있다. 구체예에서, 결합 작용제는 B 세포와 연관된 분자에 대해 특이적일 수 있다. 구체예에서, 결합 작용제는 B 세포의 표면 상에서 발현된 분자 (예를 들면, B 세포 특이적 세포 표면 수용체)에 대해 특이적일 수 있다.
결합 작용제는 관심되는 분자에 결합하는 임의의 작용제일 수 있다. 구체예에서, 결합 작용제는 항체 또는 이의 부분일 수 있다. 구체예에서, 결합 작용제는 융합 단백질, 앱타머, 리간드, 또는 수용체일 수 있다.
구체예에서, 자성 분리가 이용될 수 있다. 구체예에서, 자성 비드가 이용될 수 있다. 자성 비드는 결합 작용제에 결합될 수 있거나 또는 만약 그렇지 않으면 이것과 연관될 수 있다.
구체예에서, 표면 및 분비된 IgG 둘 모두를 발현하도록 조작된 융합 파트너. 참조: 예를 들면, 이의 물질, 방법 및 교시 모두에 대하여 본원에서 전체적으로 참조로서 편입되는 U.S. 특허 번호 7,148,040. 구체예에서, 융합 파트너는 Sp2ab 융합 파트너이다. Sp2ab 골수종 융합 파트너는 Abeome Corporation 또는 Enzo Life Sciences로부터 구입 가능하다.
구체예에서, 하이브리도마를 선별검사하는 단계는 항원에 특이적인 항체를 발현하는 하이브리도마를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 구체예에서, 하이브리도마를 선별검사하는 단계는 항원에 특이적인 IgG 항체의 발현에 대한 FACS 분류를 포함할 수 있다.
구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 50% 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 2배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 3배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 4배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 5배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 6배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 7배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 8배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 9배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 10배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 20배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 30배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 40배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 50배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 60배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 70배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 80배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 적어도 90배 증가시킬 수 있다. 구체예에서, 상기 방법은 (i)-(vii)에서 선택되는 적어도 2가지 조건이 없는 경우에 생산과 비교하여 항체 및/또는 하이브리도마의 생산을 100배 이상 증가시킬 수 있다.
구체예에서, 본원에서 설명된 방법에 따라서 하이브리도마 클론을 예를 들면 림프절로부터 파생시키는 단계는 예를 들면, 다른 모든 면에서 유사하거나 또는 동일한 방법에서 하이브리도마 클론을 비장 조직으로부터 파생시킬 때보다 약 15배까지 많은 하이브리도마 클론을 생산한다. 예를 들면, 실시예 4에서 비교된 방법을 참조한다. 구체예에서, 본원에서 설명된 방법에 따라서 하이브리도마 클론을 예를 들면 림프절로부터 파생시키는 단계는 예를 들면, 다른 모든 면에서 유사하거나 또는 동일한 방법에서 하이브리도마 클론을 비장 조직으로부터 파생시킬 때보다 약 2배 내지 약 15배 많은 하이브리도마 클론을 생산한다. 구체예에서, 본원에서 설명된 방법에 따라서 하이브리도마 클론을 예를 들면 림프절로부터 파생시키는 단계는 예를 들면, 다른 모든 면에서 유사하거나 또는 동일한 방법에서 하이브리도마 클론을 비장 조직으로부터 파생시킬 때보다 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 또는 약 15배 많은 하이브리도마 클론을 생산한다. 양은 종결점을 포함한, 언급된 범위 내에 임의의 값 또는 부분범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 림프절은 쥐, 예를 들면, 야생형 쥐 또는 유전자도입 쥐로부터 유래된다.
구체예에서, 어쥬번트의 기계 혼합은 어쥬번트의 주입기 혼합보다 2배 내지 4배의 항원 특이적 혈청 IgG 역가를 유발할 수 있다. 구체예에서, 어쥬번트의 기계 혼합은 어쥬번트의 주입기 혼합보다 2배의 항원 특이적 혈청 IgG 역가를 유발할 수 있다. 구체예에서, 어쥬번트의 기계 혼합은 어쥬번트의 주입기 혼합보다 3배의 항원 특이적 혈청 IgG 역가를 유발할 수 있다. 구체예에서, 어쥬번트의 기계 혼합은 어쥬번트의 주입기 혼합보다 4배의 항원 특이적 혈청 IgG 역가를 유발할 수 있다.
구체예에서, 완전 프로인드 어쥬번트 (CFA)가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 상이한 어쥬번트, 예컨대 Ribi 어쥬번트 또는 TLR 효현제 칵테일 어쥬번트가 이용될 때와 비교하여 10배 또는 그 이상일 수 있다. 구체예에서, CFA가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 50배 높을 수 있다. 구체예에서, CFA가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 25배 높을 수 있다. 구체예에서, CFA가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 20배 높을 수 있다. 구체예에서, CFA가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 15배 높을 수 있다. 구체예에서, CFA가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 10배 높을 수 있다. 구체예에서, CFA가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 10배 내지 50배 높을 수 있다. 구체예에서, CFA가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 10배 내지 25배 높을 수 있다. 구체예에서, CFA가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 10배 내지 20배 높을 수 있다. 양은 종결점을 포함한, 언급된 범위 내에 임의의 값 또는 부분범위일 수 있다.
구체예에서, Ribi 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 상이한 어쥬번트, 예를 들면 TLR 효현제 칵테일 어쥬번트가 이용될 때와 비교하여 10배 또는 그 이상 높을 수 있다. 구체예에서, Ribi 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 50배 높을 수 있다. 구체예에서, Ribi 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 25배 높을 수 있다. 구체예에서, Ribi 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 20배 높을 수 있다. 구체예에서, Ribi 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 15배 높을 수 있다. 구체예에서, Ribi 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 10배 높을 수 있다. 구체예에서, Ribi 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 10배 내지 50배 높을 수 있다. 구체예에서, Ribi 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 10배 내지 25배 높을 수 있다. 구체예에서, Ribi 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 10배 내지 20배 높을 수 있다. 양은 종결점을 포함한, 언급된 범위 내에 임의의 값 또는 부분범위일 수 있다.
구체예에서, TLR 효현제 칵테일 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 상이한 어쥬번트, 예를 들면 Ribi 어쥬번트 또는 CFA가 이용될 때와 비교하여 10배 또는 그 이상 높을 수 있다. 구체예에서, TLR 효현제 칵테일 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 50배 높을 수 있다. 구체예에서, TLR 효현제 칵테일 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 25배 높을 수 있다. 구체예에서, TLR 효현제 칵테일 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 20배 높을 수 있다. 구체예에서, TLR 효현제 칵테일 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 15배 높을 수 있다. 구체예에서, TLR 효현제 칵테일 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 2배 내지 10배 높을 수 있다. 구체예에서, TLR 효현제 칵테일 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 10배 내지 50배 높을 수 있다. 구체예에서, TLR 효현제 칵테일 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 10배 내지 25배 높을 수 있다. 구체예에서, TLR 효현제 칵테일 어쥬번트가 이용될 때 항원 특이적 IgG 역가 값은 10배 내지 20배 높을 수 있다. 양은 종결점을 포함한, 언급된 범위 내에 임의의 값 또는 부분범위일 수 있다.
구체예에서, IgM-고갈된 농축된 LN B-세포의 이용은 농축된 LN B-세포가 이용될 때보다 약 10배 내지 약 100배 많은 IgG-발현 하이브리도마 클론을 생산할 수 있다. 구체예에서, IgM-고갈된 농축된 LN B-세포의 이용은 농축된 LN B-세포가 이용될 때보다 약 10배 내지 약 75배 많은 IgG-발현 하이브리도마 클론을 생산한다. 양은 종결점을 포함한, 언급된 범위 내에 임의의 값 또는 부분범위일 수 있다. 구체예에서, IgM-고갈된 농축된 LN B-세포의 이용은 약 10배 내지 약 50배 많은 IgG-발현 하이브리도마 클론을 생산한다. 구체예에서, IgM-고갈된 농축된 LN B-세포의 이용은 약 10배 내지 약 25배 많은 IgG-발현 하이브리도마 클론을 생산한다. 구체예에서, IgM-고갈된 농축된 LN B-세포의 이용은 약 25배 내지 약 100배 많은 IgG-발현 하이브리도마 클론을 생산한다. 구체예에서, IgM-고갈된 농축된 LN B-세포의 이용은 약 50배 내지 약 100배 많은 IgG-발현 하이브리도마 클론을 생산한다. 구체예에서, IgM-고갈된 농축된 LN B-세포의 이용은 약 10배 내지 약 75배 많은 IgG-발현 하이브리도마 클론을 생산한다. 양은 종결점을 포함한, 언급된 범위 내에 임의의 값 또는 부분범위일 수 있다.
한 양상에서, 항체 라이브러리가 본원에서 제공된다. 구체예에서, 항체 라이브러리는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 이용하여 제조된다.
한 양상에서, 항체가 본원에서 제공된다. 구체예에서, 항체는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 이용하여 제조된다.
한 양상에서, 하이브리도마 라이브러리가 본원에서 제공된다. 구체예에서, 하이브리도마 라이브러리는 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 이용하여 제조된다.
한 양상에서, 본원에서 설명된 바와 같은 하이브리도마 라이브러리 또는 항체 라이브러리의 제조를 위한 키트가 본원에서 제공된다. 구체예에서, 키트는 적어도 1가지 어쥬번트를 포함한다. 구체예에서, 키트는 적어도 2가지의 상이한 어쥬번트를 포함한다. 구체예에서, 키트는 B 세포 (예를 들면, 림프절에서 다른 세포로부터)를 단리하거나, 분리하거나, 또는 농축하기 위한 시약을 포함한다. 구체예에서, 키트는 적어도 1가지 시약과 상호작용하는 비드 (마이크로비드)를 포함한다. 구체예에서, 키트는 적어도 1가지의 시약과 상호작용하는 칼럼을 포함한다. 구체예에서, 키트는 하이브리도마의 창출을 위한 융합 파트너를 포함한다.
구체예에서, 어쥬번트는 CFR, Ribi 및/또는 TLR 효현제 칵테일이다. 구체예에서, B 세포를 단리하거나, 분리하거나, 또는 농축하기 위한 적어도 1가지 시약은 B 세포 (예를 들면, 뮤린 또는 쥐 B 세포)에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 구체예에서, B 세포를 단리하기 위한 적어도 1가지 시약은 B 세포 이외의 세포를 인식하는 항체를 포함한다. 구체예에서, 항체는 표지화된다. 구체예에서, 표지는 두 번째 분자에 결합한다. 구체예에서, 두 번째 분자는 비드 또는 칼럼에 부착된다. 구체예에서, 표지는 비오틴이고, 그리고 두 번째 분자는 스트렙타비딘이다. 구체예에서, 비드는 자성 비드이다. 구체예에서, 칼럼은 자성 칼럼이다. 구체예에서, 융합 파트너는 표면 및 분비된 IgG 둘 모두를 발현하도록 조작된다.
일부 구체예는 이용되거나, 생산되거나, 또는 본원에서 설명된 임의의 방법 또는 방법 중에서 일부의 실행을 유발하는 장치, 기구, 조성물, 제제, 세포, 항체, 어쥬번트, 하이브리도마, 이들의 개체군 또는 복수, 그리고 이들의 조합에 관계한다.
본원에서 설명된 실시예와 구체예가 단지 예시를 목적으로 하고, 그리고 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시되고 본원의 기술적 사상과 이해범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
실시예
당업자는 본원에서 설명된 입자를 만들고 이용하는 것에 관한 설명이 오로지 예시를 목적으로 하고, 그리고 본원 발명이 이러한 예시에 의해 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
실시예 1. 동족번식 대 이계번식 동물
Sprague Dawley 쥐 또는 Balb/c 생쥐 (Charles River)가 완전 프로인드 어쥬번트 (BD Biosciences) 또는 Ribi 어쥬번트 (Sigma-Aldrich)와 혼합된 100 μg 표적 A 단백질 (Genentech)로 꼬리 밑부분에서 피하 면역화되고, 그 이후에 불완전 프로인드 어쥬번트 (BD Biosciences) 또는 무균 PBS와 혼합된 50 μg 단백질이 2 주마다 순환 부위 (i.p., 양쪽 비절 또는 꼬리 밑부분)에서 추가 접종되었다. 혈청이 5회 투약 이후에 채취되고, 그리고 면역화 단백질에 대한 ELISA에 의해 검사되었다.
도 1a는 Balb/c 생쥐에서보다 SD 쥐에서 IgG-발현 역가가 더 높다는 것을 보여준다. 항원 특이적 IgG 역가 값은 최대 신호의 절반의 신호를 유발하는 희석 인자이다. 역가 차이가 아마도 항원 관용에서 차이에 기반되지 않는다는 것을 보여주기 위해, 표적 상동성이 포함된다.
Sprague Dawley 쥐 (Charles River) 또는 C57BL/6 녹아웃 생쥐 (Genentech)가 완전 프로인드 어쥬번트 (BD Biosciences), Ribi 어쥬번트 (Sigma-Aldrich), 또는 TLR 효현제 칵테일 (도 3c에서 설명된 바와 같음)과 혼합된 50 μg 표적 B 단백질 (Genentech)로 꼬리 밑부분에서 피하 면역화되고, 그 이후에 불완전 프로인드 어쥬번트 (Sigma-Aldrich) 또는 무균 PBS와 혼합된 25 μg 단백질이 2 주마다 순환 부위 (i.p., 양쪽 비절 또는 꼬리 밑부분)에서 추가 접종되었다. 혈청이 6회 투약 이후에 채취되고, 그리고 면역화 단백질에 대한 ELISA에 의해 검사되었다.
도 1b는 C57BL/6 생쥐에서보다 SD 쥐에서 IgG-발현 역가가 더 높다는 것을 보여준다. 항원 특이적 IgG 역가 값은 최대 신호의 절반에 도달하는 신호를 유발하는 희석 인자이다. 역가 차이가 아마도 항원 관용에서 차이에 기반되지 않는다는 것을 보여주기 위해, 표적 상동성이 포함된다.
실시예 2. 단일 대 복수 주사 부위
도 2a는 면역화를 위한 복수 주사 부위의 위치를 보여준다. 꼬리 밑부분, 어깨 및 비절 주사가 피하 (s.c.) 투여되는데, 항원 특이적 B-세포는 각각, 서혜부와 장골, 액와와 상완, 그리고 슬와 림프절로 배수될 가능성이 높다. 복막내 (i.p.) 주사가 복강 내로 투여되는데, 항원 특이적 B-세포는 장간막 림프절뿐만 아니라 비장으로 배수될 가능성이 높다.
유전자도입 쥐 (Open Monoclonal Technology)가 단지 i.p.에서만 주 1회, 또는 2 주마다 순환하는, 도 2a에서 도시된 바와 같은 복수 부위 사이에서 분할된, Ribi 어쥬번트 (Sigma-Aldrich)와 혼합된 20 μg 표적 C 단백질 또는 표적 D 단백질 (Genentech)로 면역화되었다. 혈청이 5 주의 주사 이후에 채취되고, 그리고 면역화 단백질에 대한 ELISA에 의해 검사되었다.
도 2b는 단일-부위 면역화 후 항원 특이적 역가가 복수-부위 면역화 후 항원 특이적 역가보다 낮다는 것을 보여준다. 항원 특이적 IgG 역가 값은 최대 신호의 절반에 도달하는 신호를 유발하는 희석 인자이다.
실시예 3. 주 2회 대 2 주마다 1회 투약
도 3a는 2 주마다 1회 투약의 전략을 보여준다. 항원으로 면역화 시에 항원 특이적 면역 반응에서 예상된 변화의 포괄적 도해; 실제 데이터는 도시되지 않는다. 어쥬번트 (프로인드, Ribi, 또는 실시예 3에서 설명된 바와 같은 TLR 효현제 칵테일)와 조합된 단백질이 0주 차에 동물의 복수 부위에 주사되는데, 이것은 혈청 IgM 수준에서 증가에 의해 표시된 바와 같은 일차 면역 반응을 자극한다. 동물은 이후, 전형적으로 어쥬번트가 없는 무균 PBS에서 희석된 더 적은 양의 항원이 2 주마다 1회 추가 접종된다. 이것은 이차 면역 반응을 자극하여, 혈청 IgG 수준에서 증가, 그리고 B-세포 선택 및 표적에 대한 친화성 성숙을 위한 배 중심의 발달을 야기한다. 항원 특이적 면역 반응의 진행을 평가하기 위해, 복수의 시점에서 혈청이 채취된다.
C57BL/6 녹아웃 생쥐 (Genentech)가 Ribi 어쥬번트 (Sigma-Aldrich)와 혼합된 2 μg 표적 E 단백질 (Genentech)로 주 2회 (3-4 일마다) i.p. 면역화되거나 또는 Ribi 어쥬번트와 혼합된 100 μg 표적 E 단백질로 i.p. 면역화되고, 그 이후에 Ribi 어쥬번트와 혼합되거나 또는 무균 PBS에서 희석된 50 μg 표적 E 단백질이 2 주마다 i.p. 추가 접종되었다. 혈청이 8 또는 9 주의 투약 이후에 채취되고, 그리고 면역화 단백질에 대한 ELISA에 의해 검사되었다.
도 3b는 놀랍게도, 주 2회 투약된 쥐로부터 항원 특이적 역가가 Ribi 어쥬번트를 이용하여 2 주마다 1회 투약된 것들보다 낮았다는 것을 보여준다. 항원 특이적 IgG 역가 값은 최대 신호의 절반에 도달하는 신호를 유발하는 희석 인자이다.
C57BL/6 녹아웃 생쥐 (Genentech)가 TLR 효현제의 조합: 50 μg MPL (Sigma-Aldrich), 20 μg R848 (Invivogen), 10 μg PolyI:C (Invivogen) 및 10 μg CpG (Invivogen)와 혼합된 2 μg 표적 E 단백질 (Genentech)로 주 2회 (3-4 일마다) i.p. 면역화되거나 또는 TLR 효현제 칵테일 어쥬번트와 혼합된 100 μg 표적 E 단백질로 i.p. 면역화되고, 그 이후에 Ribi 어쥬번트 (Sigma-Aldrich)와 혼합되거나 또는 무균 PBS에서 희석된 50 μg 표적 E 단백질이 2 주마다 i.p. 추가 접종되었다. 혈청이 8 또는 9 주의 투약 이후에 채취되고, 그리고 면역화 단백질에 대한 ELISA에 의해 검사되었다.
도 3c는 주 2회 투약된 쥐로부터 항원 특이적 역가가 TLR 효현제 어쥬번트 칵테일을 이용하여 2 주마다 1회 투약된 것들보다 낮았다는 것을 보여준다. 항원 특이적 IgG 역가 값은 최대 신호의 절반에 도달하는 신호를 유발하는 희석 인자이다.
실시예 4. B-세포 공급원으로서 림프절 대 비장
도 4a는 복수 부위 주사 위치에 근접한 배수 림프절의 위치를 보여준다. 서혜부, 장골, 액와, 상완, 장간막 및 슬와 림프절을 비롯한, 복수의 림프절이 수확되고, 그리고 도 2a에서 설명된 바와 같은 복수 부위에서 항원이 주사된 동물로부터 잠재적인 항원 특이적 B-세포 공급원으로서 한 데 모아진다.
유전자도입 쥐 (Open Monoclonal Technology)가 완전 프로인드 어쥬번트 (BD Biosciences)와 혼합된 200 μg 표적 D 단백질 (Genentech)로 꼬리 밑부분에서 s.c. 면역화되고, 그 이후에 2 주마다 순환하는, 도 2a에서 도시된 바와 같은 복수 부위 사이에서 분할된, 불완전 프로인드 어쥬번트 (BD Biosciences)와 혼합된 100 μg 표적 D 단백질, 또는 Ribi 어쥬번트 (Sigma-Aldrich) 또는 TLR 효현제 칵테일 (실시예 3에서 설명된 바와 같음)과 혼합된 10 μg 표적 D 단백질이 주 2회 (3-4 일마다) 추가 접종되었다. 비장 또는 복수의 림프절이 면역화의 시작 후 대략 7 주째에, 최후 면역화 후 3 일째에 수확되었다. 이들 쥐로부터 B-세포가 실시예 6에서 설명된 바와 같이 자성 분리 (Miltenyi Biotec)를 이용하여 림프구로부터 정제되었고, 그리고 결과의 B-세포 개체군으로부터 45 백만 개의 세포가 전기세포융합 (Harvard Apparatus)을 통해 P3X63-Ag8U.1 생쥐 골수종 세포 (American Type Culture Collection)와 융합되었다. 융합된 세포가 반고체 배지 D (StemCell Technologies)에서 항-쥐 IgG-FITC (Sigma-Aldrich)로 재현탁 및 Omniwell 트레이 (Thermo Fisher Scientific) 내로 도말 전, 배지 C (StemCell Technologies)에서 37℃, 7% CO2에서 하룻밤 동안 배양되었다. 도말 후 7 일째에, 형광 집락이 선택되고, 그리고 Clonepix FL (Molecular Devices)을 이용하여 배지 E (StemCell Technologies)를 내포하는 96 웰 배양 평판 (BD Biosciences) 내로 이전되었다. 상층액이 집락 선발 후 7 일째에 표적 D 단백질에 대한 ELISA에 의해 선별검사되었다.
도 4b는 림프절로부터 파생된 항원 특이적 하이브리도마 클론의 숫자가 비장으로부터 파생된 것보다 훨씬 높다는 것을 보여준다. 도 4b에서 도시된 바와 같이, 하이브리도마 클론을 비장으로부터 파생시키는 것은 하이브리도마 클론을 림프절로부터 파생시킬 때보다 약 10배까지 적은 하이브리도마 클론을 생산한다. 놀랍게도, 본원에서 설명된 방법을 이용하여, 비장보다는 림프절로부터 파생될 때 많게는 10배 또는 그 이상의 숫자의 항원 특이적 IgG+ 클론을 획득하는 것이 가능하다.
실시예 5. 복수 어쥬번트의 병렬적 이용
CFR의 기계 혼합이 결과의 역가에 영향을 주는 지를 결정하기 위해, 기계 (Omni 혼합기, Omni Inc.)를 이용하여, 또는 주입기를 이용하여 손에 의해 CFR이 항원과 혼합되었다. 어쥬번트 조성물이 쥐에게 주사되었고, 그리고 항원 특이적 항체 역가가 본원에서 설명된 바와 같이 결정되었다. 결과는 도 5a에서 도시된다. 도 5a에서 알 수 있는 바와 같이, 기계 혼합은 주입기 혼합보다 훨씬 높은 항원 특이적 혈청 IgG 역가를 생산한다. 기계 혼합된 표본은 주입기 혼합된 표본보다 대략 2배의 항원 특이적 혈청 IgG 역가를 보여주었다.
유전자도입 쥐 (Open Monoclonal Technology)가 꼬리 밑부분에 주사된, 도 2a에서 도시된 바와 같은 복수 부위 사이에서 분할된, Ribi 어쥬번트 (Sigma-Aldrich)와 혼합되거나 또는 실시예 3에서 설명된 바와 같은 TLR 효현제 칵테일 어쥬번트와 혼합된 20 μg 표적 F 단백질 (Genentech)로, 또는 완전 프로인드 어쥬번트 (BD Biosciences)와 혼합된 150 μg 표적 F 단백질로 주 2회 면역화되고, 그 이후에 도 2a에서 도시된 바와 같은 복수 부위 사이에서 분할된, 불완전 프로인드 어쥬번트 (BD Biosciences) 또는 10 μg CpG (Invivogen)와 혼합된 50 μg 표적 F 단백질이 2 주마다 추가 접종되었다. 혈청이 10 주의 투약 이후에 채취되고, 그리고 면역화 단백질에 대한 ELISA에 의해 검사되었다.
도 5b는 상이한 어쥬번트로 면역화된 동물로부터 항원 특이적 역가를 보여준다. 항원 특이적 IgG 역가 값은 최대 신호의 절반의 신호를 유발하는 희석 인자이다. 도 5b에서 도시된 바와 같이, 완전 프로인드 어쥬번트 (CFA)는 이러한 항원에 대해 10의 거듭제곱 (power) 이상으로, Ribi 어쥬번트 또는 TLR 효현제 칵테일 어쥬번트보다 훨씬 높은 항원 특이적 IgG 역가 값을 갖는다.
유전자도입 쥐 (Open Monoclonal Technology)가 도 2a에서 도시된 바와 같은 복수 부위 사이에서 분할된, Ribi 어쥬번트 (Sigma-Aldrich)와 혼합되거나 또는 실시예 3에서 설명된 바와 같은 TLR 효현제 칵테일 어쥬번트와 혼합된 20 μg 표적 G 단백질 (Genentech)로 주 1회 면역화되었다. 혈청이 6 주의 투약 이후에 채취되고, 그리고 면역화 단백질에 대한 ELISA에 의해 검사되었다.
도 5c는 상이한 어쥬번트로 면역화된 동물로부터 항원 특이적 역가를 보여준다. 항원 특이적 IgG 역가 값은 최대 신호의 절반의 신호를 유발하는 희석 인자이다. 도 5c에서 도시된 바와 같이, Ribi 어쥬번트는 이러한 항원에 대해 대략 10의 거듭제곱으로, TLR 효현제 칵테일 어쥬번트보다 높은 항원 특이적 IgG 역가 값을 갖는다.
실시예 6. 음성 선택을 통한 B-세포 농축 및 IgM 고갈
유전자도입 쥐 (Open Monoclonal Technology)가 Ribi 어쥬번트 (Sigma-Aldrich)와 혼합된 10 μg 표적 D 단백질 (Genentech)로 꼬리 밑부분에서 s.c. 면역화되고, 그 이후에 도 2a에서 도시된 바와 같은 복수 부위 사이에서 분할된, Ribi 어쥬번트 (Sigma-Aldrich)와 혼합된 10 μg 표적 D 단백질이 주 2회 (3-4 일마다) 추가 접종되었다. 복수의 림프절이 면역화의 시작 후 대략 7 주째에, 최후 면역화 후 3 일째에 수확되었다. 림프구가 항-쥐 CD4 (BD Biosciences), 항-쥐 CD8a (BD Biosciences), 항-쥐 CD11b/c (BD Biosciences), 항-쥐 CD161a (BD Biosciences), 그리고 항-쥐 과립구 (eBioscience) 비오틴-접합된 항체와 함께 배양되고, 세척되고, 이후 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드 (Miltenyi Biotec)와 함께 배양되고, 그리고 표지화되지 않은 개체군을 포획하기 위해 자성 칼럼 (Miltenyi Biotec) 위에서 이동되었다. 결과의 농축된 B-세포 개체군은 이후, 융합을 위해 채취되거나 또는 추가 고갈 단계가 진행되었다. 세포가 항-쥐 IgM-비오틴 (BD Biosciences)으로 표지화되고, 세척되고, 이후 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드 (Miltenyi Biotec)와 함께 배양되고, 그리고 표지화되지 않은 개체군을 포획하기 위해 자성 칼럼 (Miltenyi Biotec) 위에서 이동되었다. 각 군으로부터 세포가 전기세포융합 (Harvard Apparatus)을 통해 P3X63-Ag8U.1 생쥐 골수종 세포 (American Type Culture Collection)와 융합되었다. 융합된 세포가 반고체 배지 D (StemCell Technologies)에서 항-쥐 IgG-FITC (Sigma-Aldrich)로 재현탁 및 Omniwell 트레이 (Thermo Fisher Scientific) 내로 도말 전, 배지 C (StemCell Technologies)에서 37℃, 7% CO2에서 하룻밤 동안 배양되었다. 도말 후 7 일째에, 형광 집락이 선택되고, 그리고 Clonepix FL (Molecular Devices)을 이용하여 배지 E (StemCell Technologies)를 내포하는 96 웰 배양 평판 (BD Biosciences) 내로 이전되었다. 상층액이 집락 선발 후 7 일째에 표적 D 단백질에 대한 ELISA에 의해 선별검사되었다. 도시된 IgG-양성 클론 숫자는 45 백만 개 B-세포의 융합에 대해 정규화된다.
도 6은 전체 림프절, 농축된 LN B-세포, 그리고 IgM-고갈된 농축된 LN B-세포로부터 파생된 IgG-발현 하이브리도마 클론의 숫자를 보여준다. 도 6에서 도시된 바와 같이, IgM-고갈된 농축된 LN B-세포는 최고 숫자의 IgG-발현 하이브리도마 클론을 생산하고, 농축된 LN B-세포 및 분리되지 않은 전체 림프절이 그 뒤를 이었다. 놀랍게도, 여기에서 설명된 방법을 이용하여, IgM-고갈된 농축된 LN B-세포는 농축된 LN B-세포보다 약 10배 내지 약 100배 많은 IgG-발현 하이브리도마 클론을 생산할 수 있다.
실시예 7. SP2ab 대 PU1 항원 특이적 하이브리도마 산출
도 7a: 대조 하이브리도마 (왼쪽)가 APC GAM Ig로 표지화 후 Igα 및 Igβ로 형질전환된 라인 (오른쪽)과 유세포분석법을 이용하여 비교된다. 히스토그램은 살아있는-세포 개체군을 표시한다. 하이브리도마는 Harlow and Lane (1988)에서 설명된 바와 같이 생산되고, 그리고 HAT로 보충된 배양 배지 (Sigma-Aldrich)에서 성장되었다. 분류된 세포가 히포크산틴 및 티미딘 (Sigma-Aldrich)으로 보충된 배양 배지에서 성장되었다. 세포가 세척되고, 그리고 이후 알로피코시아닌-접합된 염소 항생쥐 Ig H+L (Invitrogen)로 염색되었다. 세포가 다시 한 번 세척되고, 그리고 20% FBS를 내포하는 IMDM (Atlanta Biological Laboratories)으로 재현탁되었다. 생존 불가능한 세포가 프로피디움 요오드화물 또는 7-아미노 악티노마이신 D (둘 모두 Invitrogen)를 이용하여 생존 세포와 구별되었다. Price, et al. J. Immunol Methods. 2009 March 31; 343(1): 28-41로부터 수정됨.
도 7b는 SP2ab 하이브리도마의 FACS 분류 프로필을 보여준다. 면역화된 쥐로부터 획득된 IgM 음성 B-세포가 실시예 6에서 설명된 바와 같이 자성 분리 (Miltenyi Biotec)를 이용하여 림프구로부터 정제되고, 그리고 전기세포융합 (Harvard Apparatus)을 통해 SP2ab 생쥐 골수종 세포 (Enzo Life Sciences)와 융합되었다. 융합된 세포가 1X HAT (Sigma-Aldrich)로 보충된 배지 E (StemCell Technologies)를 내포하는 6-웰 평판 내로 도말 전, 배지 C (StemCell Technologies)에서 37℃, 7% CO2에서 하룻밤 동안 배양되고, 그리고 37℃, 7% CO2에서 3일 동안 배양되었다. 세포가 수집되고, 그리고 알로피코시아닌-표지화 항-쥐 IgG (Jackson Immunoresearch) 및 피코에리트린-표지화 표적 단백질 (Genentech)로 염색되었다. 하이브리도마 세포 개체군은 IgG을 발현하고 (왼쪽 히스토그램), 그리고 IgG+Ag+ 세포가 확인되고 FACSAria 융합 분류기 (BD Biosciences)를 이용하여 분류되었다 (오른쪽 반점 플롯).
유전자도입 쥐 (Open Monoclonal Technology)가 완전 프로인드 어쥬번트 (BD Biosciences)와 혼합된 100 μg 표적 H 단백질 (Biosearch Technologies)로 꼬리 밑부분에서 면역화되고, 그 이후에 불완전 프로인드 어쥬번트 (BD Biosciences)와 혼합된 50 μg 표적 H 단백질이 2 주마다 i.p 추가 접종되었다. C57BL/6 녹아웃 생쥐 (Genentech)가 TLR 효현제 칵테일 (실시예 3에서 설명된 바와 같음)과 혼합된 2 μg 표적 I 단백질 (Genentech)로 복수 부위 (i.p. 및 양쪽 비절)에서 주 2회 (3-4 일마다) 면역화되었다. 면역화된 동물로부터 IgM 음성 B-세포가 자성 분리 (Miltenyi Biotec)를 이용하여 림프구로부터 정제되고 (생쥐의 경우에 키트를 이용하여, 또는 쥐의 경우에 실시예 6에서 설명된 바와 같이), 그리고 전기세포융합 (Harvard Apparatus)을 통해 P3X63-Ag8U.1 생쥐 골수종 세포 (American Type Culture Collection)와 융합되었다. 융합된 세포가 반고체 배지 D (StemCell Technologies)에서 항-종 IgG-FITC (Jackson Immunoresearch)로 재현탁 및 Omniwell 트레이 (Thermo Fisher Scientific) 내로 도말 전, 배지 C (StemCell Technologies)에서 37℃, 7% CO2에서 하룻밤 동안 배양되었다. 도말 후 7 일째에, 형광 집락이 선택되고, 그리고 Clonepix FL (Molecular Devices)을 이용하여 배지 E (StemCell Technologies)를 내포하는 96 웰 평판 내로 이전되었다. 상층액이 선발 후 7 일째에 면역화 단백질에 대한 ELISA에 의해 선별검사되었다.
도 7c는 PU1 융합 파트너를 이용한 IgG-기반 분류로부터 항원 특이적 하이브리도마의 백분율을 보여준다. 항원 양성 백분율은 IgG-발현 웰의 함수로서 도시된다.
전술된 동일한 세포 개체군이 전기세포융합 (Harvard Apparatus)을 통해 SP2ab 생쥐 골수종 세포 (Enzo Life Sciences)와 융합되었다. 융합된 세포는 1X HAT (Sigma-Aldrich)로 보충된 배지 E (StemCell Technologies)를 내포하는 6-웰 평판 내로 도말 전, 배지 C (StemCell Technologies)에서 37℃, 7% CO2에서 하룻밤 동안 배양되고, 그리고 37℃, 7% CO2에서 3일 동안 배양되었다. 세포가 수집되고, 그리고 알로피코시아닌-표지화 항-쥐 IgG (Jackson Immunoresearch) 및 타당하면, 피코에리트린-표지화 표적 H 또는 I 단백질 (Genentech)로 염색되었다. IgG+Ag+ 세포가 FACSAria 융합 분류기 (BD Biosciences)를 이용하여 96 웰 평판 내로 분류되었다. 도말 후 7 일째에, 상층액이 면역화 단백질에 대한 ELISA에 의해 선별검사되었다.
도 7d는 Sp2ab 융합 파트너를 이용한 항원-기반 분류로부터 항원 특이적 하이브리도마의 백분율을 보여준다. 항원 양성 백분율은 IgG-발현 웰의 함수로서 도시된다.
참고문헌
Price, et al. Engineered cell surface expression of membrane immunoglobulin as a means to identify monoclonal antibody-secreting hybridomas. J. Immunol Methods. 2009 March 31; 343(1): 28-41.
Harlow, E.; Lane, DP. Antibodies: A Laboratory Manual. CSH Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY: 1988.
Claims (39)
- 항체 라이브러리를 생산하기 위한 방법이며,
(a) 1마리 이상의 동물에게 항원을 주사하는 단계,
(b) B 세포를 포함하는 배수 림프절을 각 동물로부터 수확하는 단계,
(c) 각 B 세포 및 융합 파트너 사이의 하이브리도마를 형성하는 단계, 및
(d) 하이브리도마를 항원에 대한 결합 특이성에 대해 선별검사하는 단계
를 포함하고,
하기 조건:
(i) 상기 동물이 이계번식 동물임,
(ii) 상기 동물이 복수 부위에서 주사됨,
(iii) 상기 동물이 2 주마다 주사됨,
(iv) 상기 동물이 6 주에서 15 주 사이 동안 주사됨,
(v) 상이한 동물에게 상이한 어쥬번트가 주사되도록 복수의 어쥬번트가 이용됨,
(vi) B 세포가 (c) 단계에 앞서 농축됨, 및/또는
(vii) 표면 및 분비된 IgG 둘 모두를 발현하도록 조작된 융합 파트너의 이용
중 적어도 2가지가 적용되는 것인 방법. - 청구항 제1항에 있어서, (i)-(vii) 조건 중 2가지가 적용되는 것인 방법.
- 청구항 제1항에 있어서, (i)-(vii) 조건 중 3가지가 적용되는 것인 방법.
- 청구항 제1항에 있어서, (i)-(vii) 조건 중 4가지가 적용되는 것인 방법.
- 청구항 제1항에 있어서, (i)-(vii) 조건 중 5가지가 적용되는 것인 방법.
- 청구항 제1항에 있어서, (i)-(vii) 조건 중 6가지가 적용되는 것인 방법.
- 청구항 제1항에 있어서, (i)-(vii) 조건 중 7가지가 적용되는 것인 방법.
- 청구항 제1항에 있어서, (i)-(vi) 조건 중 적어도 2가지가 적용되는 것인 방법.
- 청구항 제1항에 있어서, (a) 단계는 2마리 이상의 동물에게 항원을 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 제1항에 있어서, (a) 단계는 3마리 이상의 동물에게 항원을 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 제1항에 있어서, (a) 단계는 4마리 이상의 동물에게 항원을 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 제1항에 있어서, (a) 단계는 5마리 이상의 동물에게 항원을 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 동물은 쥐인 방법.
- 청구항 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 복수 부위는 배수 림프절에 근접한 부위인 방법.
- 청구항 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 복수 부위는 등, 어깨, 복막내, 꼬리 밑부분 및 비절 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
동물은 복수 부위에 주사되고,
각 부위에 주사된 항원의 양은 0.1 μg 및 300 μg 사이인 방법. - 청구항 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
동물은 복수 부위에 주사되고,
각 부위에 주사된 항원의 양은 0.5 μg 및 200 μg 사이인 방법. - 청구항 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 동물은 주 1회보다 많지 않게 주사되는 것인 방법.
- 청구항 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 동물은 2 주마다 1회보다 많지 않게 주사되는 것인 방법.
- 청구항 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 동물은 6 주에서 15 주 사이 동안 주사되는 것인 방법.
- 청구항 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 어쥬번트는 완전 프로인드 어쥬번트, Ribi 및/또는 TLR 효현제 칵테일을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, B 세포는 음성 선택에 의해 농축되는 것인 방법.
- 청구항 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 파트너는 Sp2ab 융합 파트너인 방법.
- 청구항 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리도마를 선별검사하는 단계는 항원에 특이적인 IgG 항체의 발현에 대한 FACS 분류를 포함하는 것인 방법.
- 항체 라이브러리를 생산하는 방법이며,
(a) 항원을 1마리 이상의 이계번식 쥐 각각의 복수 부위에 주사하는 단계,
(b) 주사를 적어도 6 주 동안 2 주마다 반복하는 단계,
(c) 면역 세포를 각 쥐의 하나 이상의 배수 림프절로부터 수확하는 단계,
(d) 비-B 세포를 음성 선택에 의해 면역 세포로부터 고갈시켜, 농축된 B 세포 표본을 형성하는 단계,
(e) 농축된 B 세포 표본을 복수의 융합 파트너와 접촉시켜, 각 B 세포 및 융합 파트너 사이의 하이브리도마를 형성하는 단계, 및
(f) 하이브리도마를 항원에 대한 특이성에 대해 선별검사하는 단계
를 포함하는 방법. - 청구항 제25항에 있어서, 복수 부위는 배수 림프절에 근접한 부위인 방법.
- 청구항 제25항 또는 제26항에 있어서, 복수 부위는 등, 어깨, 복막내, 꼬리 밑부분 및 비절 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.1 μg 및 300 μg 사이인 방법.
- 청구항 제28항에 있어서, 각 부위에 주사된 항원의 양은 0.5 μg 및 200 μg 사이인 방법.
- 청구항 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 동물은 2 주마다 1회보다 많지 않게 주사되는 것인 방법.
- 청구항 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 동물은 6 주에서 10 주 사이 동안 주사되는 것인 방법.
- 청구항 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 파트너는 Sp2ab 융합 파트너인 방법.
- 청구항 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 하이브리도마를 선별검사하는 단계는 항원에 특이적인 IgG 항체의 발현에 대한 FACS 분류를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 단계는 2마리 이상의 동물에게 항원을 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 단계는 3마리 이상의 동물에게 항원을 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 단계는 4마리 이상의 동물에게 항원을 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 단계는 5마리 이상의 동물에게 항원을 주사하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 제조된 항체 라이브러리.
- 청구항 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 제조된 하이브리도마 라이브러리.
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