KR20100118091A - 인간화된 ｎｓｇ 마우스 및 그 제조 및 이용 방법 - Google Patents
인간화된 ｎｓｇ 마우스 및 그 제조 및 이용 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20100118091A KR20100118091A KR1020100039173A KR20100039173A KR20100118091A KR 20100118091 A KR20100118091 A KR 20100118091A KR 1020100039173 A KR1020100039173 A KR 1020100039173A KR 20100039173 A KR20100039173 A KR 20100039173A KR 20100118091 A KR20100118091 A KR 20100118091A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- human
- cells
- stem cells
- mouse
- human fetal
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 53
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims abstract description 47
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 101
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 81
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 42
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 38
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 24
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 20
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 20
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 15
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 14
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 11
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 11
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 claims description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 abstract description 14
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract 4
- 241000257176 Hypoderma <fly> Species 0.000 abstract 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 17
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 14
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 14
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 12
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 11
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 7
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 4
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 4
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 4
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 4
- 208000031873 Animal Disease Models Diseases 0.000 description 3
- 238000011558 animal model by disease Methods 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 3
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 101100220044 Homo sapiens CD34 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/30—Animals modified by surgical methods
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Instructional Devices (AREA)
Abstract
하나 이상의 구체 예, NSG 마우스에 인간 태아 흉선 및 태아 골편이 이식된 인간화 마우스 모델 및 그 제조 및 이용 방법을 제공한다.
Description
하나 이상의 구체 예는, NSG 마우스에 인간 태아 흉선 및 태아 골편이 이식된 인간화 마우스 모델 및 그 제조 및 이용 방법에 관한 것이다.
인간을 대상으로 한 질병의 연구는 기술적이고 윤리적 문제로 인하여 한계가 있으므로, 인간과 유전적으로 매우 유사하다고 알려진 동물을 이용한 질병 모델이 유용하게 이용되고 있다. 대상이 되는 질병을 모델 동물에 발병시키고, 다양한 치료제를 적용하여 치료 방법을 탐색한다. 그러나, 동물 질병 모델에서 치료 효과가 있다고 알려진 치료제가 인간에게 적용 시에도 동일한 효과를 갖는지 여부를 알 수 없으므로, 동물 질병 모델에서 확인된 치료제를 직접 인간에 적용할 수 없으므로 임상 적용까지 여러 단계를 거쳐야 한다.
보다 효과적으로 동물 질병 모델을 확립하기 위하여, 최근, 인간의 면역 체계와 유사한 면역 체계를 갖는 인간화 동물 모델을 구축하기 위한 노력이 활발하게 진행되고 있다. 인간화 동물 모델 가운데 특히, 인간화 마우스를 확립하기 위하여 면역기능이 결핍된 마우스에 조혈모세포를 이식하는 방법이 이용되었다. SCID (severe combined immune deficiency) 마우스에 인간의 CD34+ 세포를 이식한 결과 마우스의 모든 조직에서 인간 조혈모세포-유래 인간세포가 소량 검출되었고 조직내에 재형성되었음이 확인되었다 (Greiner DL, Hesselton RA and Shultz LD, Stem Cells 1998; 16: 166-77). 또한, NK 세포의 기능도 저하된 NOD/SCID (non-obese diabetics/SCID) 마우스에 인간 CD34+인 조혈모세포를 이식했을 때, SCID 마우스에 비해 훨씬 더 많은 인간 세포가 조직 내에 재형성되었으나, 인간세포가 주로 골수에서 검출되었고, 이식 후 초기에는 여전히 인간의 T 세포는 발달하지 않았다 (Bente DA, Melkus MW, Gracia JV and Rico-Hesse R, J Virol 2005; 79:13797-9).
또한, NOD/SCID 마우스는 T 세포와 B 세포 등은 결핍되어 있으나, NK 세포 기능이 남아있고, 자연적으로 림프종을 형성하여 그 수명이 짧은 단점이 있었다. 이를 개선하기 위해, T 세포 및 B 세포 외에 NK 세포 기능도 결핍된 NSG 마우스 (NOD/SCID/IL2 receptor γ null)가 개발되었고(Shultz LD, et al., J. Immunol. 2005; 169: 204-209), NSG 마우스는 NOD/SCID에 비해 수명이 2배 이상 길기 때문에 인간세포를 이식 후 장기간 모니터링하기에 적합하다. NSG 마우스에 인간 태아 흉선이나 인간 태아 간 등의 인간의 조혈 조직의 동시 이식 없이, 조혈모세포의 단독 이식에 의하여 인간의 B 세포, T 세포 및 NK 세포가 재형성될 수 있음이 확인되었다 (Blood. 2002; 100: 3175-3182). NSG 마우스에 조혈모세포만 이식한 경우, 인간 세포의 생착 및 분화가 성공적으로 이루어져 30 내지 90%의 인간 세포가 관찰되었으나, 대부분의 B 세포와 T 세포가 정상적인 비율로 분화하지 못하고 정상적인 인간의 말초 혈액 내 면역세포의 분포와는 달리 B 세포가 우세하게 분포하였다.
따라서, NSG 마우스에 비하여, 성숙한 인간 B 세포 및 인간 T 세포를 인간의 생체에서와 더욱 유사한 비율로 가지고 있는 인간화 마우스는 여전히 요구된다.
일 구체예는, 인간 세포의 이식에 유용한 인간화 마우스를 제공하는 것이다.
다른 구체예는, 상기 인간화 마우스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 구체예는, 상기 인간화 마우스를 이용하여 인간 항체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 구체예는, 상기 인간화 마우스를 이용하여 인간 줄기세포의 증식 및 분화를 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
일 구체예는, NSG 마우스에 인간 태아 흉선 및 인간 태아 골편이 이식된 마우스를 제공한다.
상기 NSG 마우스는 중증 복합 면역결핍 (severe combined immunodeficiency: SCID) 돌연변이 및 인터루킨-2Rγ(IL-2Rγ) 대립인자 돌연변이 (γ null)에 대하여 이중 동형접합 (double homozygous)인 비비만 당뇨병 (nonobese diabetic: NOD) 마우스를 말한다. SCID 돌연변이는 기능적 B 세포 및 T 세포의 결손을 야기시키는 돌연변이를 말한다. 예를 들면, SCID 마우스 (C.B.-17-Prkdcscid)는 B 세포 수용체 (B cell receptor: BCR) 및 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR)의 재배열에 결함이 있어, 기능적 B 세포 및 T 세포의 결손이 야기된다. 상기 NSG (NOD scid gamma) 마우스는 NOD/SCID γnull 마우스 또는 NOD/SCID IL-2RγKO 마우스라고도 한다. NSG 마우스는 잭슨 라보라토리 (The Jackson Laboratory)의 레오나르드 슐츠 박사 (Dr. Leonard Shultz)의 실험실에 개발되었다. 상기 NSG 마우스는 잭슨 라보라토리로부터 상업적으로 구입하거나, 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다 (Shultz LD, et al., J. Immunol. 2005; 169: 204-209). 예를 들면, NSG 마우스는 C57BL/6J-γ null 마우스와 NOD/SCID 마우스를 9회 역교배 (backcross mating)하여 얻어질 수 있다. NSG 마우스는 기능적 T 세포 및 기능적 B 세포가 결여되어 있고, 대식구 기능이 감소되어 있고, NK 세포 또는 NK 활성이 제거되어 있고, 수지상 세포 기능이 감소되어 있는 것으로 알려져 있다. NSG 마우스는 NOD/SCID 마우스 또는 β2-마이크로글로불린-결여 NOD/LtSz-SCID (NOD/SCID/β2m null)에 비하여 이종조직 (xenograft)의 생착율(engraftment level)이 높은 것으로 알려져 있다.
상기 마우스에 있어서, 상기 인간 태아 흉선은 신장 캡슐에 이식되고, 상기 인간 태아 골편은 피하에 이식된 것일 수 있다.
상기 마우스는, 인간 줄기세포가 더 이식된 것일 수 있다. 상기 인간 줄기세포는 예를 들면, 조혈모세포(hematopoietic stem cell)인 것일 수 있다. 상기 조혈모세포는 성인의 골수, 제대혈, 태아간 및 가동화된 말초혈액 유래의 조혈모세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 조혈모세포는 인간 제대혈 유래 CD34+ 조혈모세포인 것일 수 있다. 상기 인간 줄기세포는 정맥을 통하여 투여함으로써 이식된 것일 수 있다.
상기 마우스는, NOD/SCID 마우스 또는 NOD/SCID/β2m null 마우스에 비하여, 더 인간화된 면역체계를 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 마우스는, NOD/SCID 마우스 또는 NOD/SCID/β2m null 마우스에 비하여, 예를 들면, 림프절, 비장 및/또는 골수에서, 인간의 생체 내에서와 더 유사한 비율의 성숙한 인간 T 세포 또는 인간 B 세포를 갖는 것일 수 있다. 상기 성숙한 인간 B 세포는 CD19+IgM-IgD+ 세포일 수 있다. 상기 성숙한 인간 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 세포일 수 있다.
상기 마우스에 있어서, 상기 인간 태아 흉선 및 인간 태아 골편은 각각 동일한 개체로부터 유래된 것일 수 있다. 또한, 상기 인간 줄기세포는 상기 인간 태아 흉선 및 인간 태아 골편의 유래와는 동일 개체 또는 다른 개체로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 인간 줄기세포는 태아간 또는 제대혈 유래일 수 있다.
다른 구체예는, NSG 마우스에 인간 태아 흉선, 인간 태아 골편 및 인간 줄기세포가 이식된 마우스에 항원을 면역접종하는 단계; 및
상기 면역접종된 마우스의 혈청으로부터 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 항원에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 NSG 마우스에 인간 태아 흉선, 인간 태아 골편 및 인간 줄기세포가 이식된 마우스에 항원을 면역접종하는 단계를 포함한다.
NSG 마우스에 인간 태아 흉선, 인간 태아 골편 및 인간 줄기세포가 이식된 마우스에 대하여는 상기한 바와 같다. 면역접종은 당업자에게 알려져 있으며, 알려진 면역접종 방법이 사용될 수 있다. 당업자라면, 선택되는 항원에 따라, 알려진 면역접종 방법으로서 적절한 투여 계획을 선택하여 접종함으로써, 투여되는 마우스에서 높은 면역반응을 유도할 수 있다. 상기 항원은 상기 마우스에서 면역반응을 유도할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 특별히 한정되지 않는다. 상기 항원은 예를 들면, 단백질, 당, 및 지질이 될 수 있다.
상기 방법은 상기 면역접종된 마우스의 혈청으로부터 항체를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 단계는 알려진 항체 분리 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 면역접종된 마우스에서 혈액을 분리하고, 분리된 혈액으로부터 원심분리 등을 통하여, 혈청을 얻고, 상기 혈청으로부터 항체를 분리할 수 있다.
다른 구체예는, NSG 마우스에 인간 태아 흉선, 인간 태아 골편 및 인간 줄기세포가 이식된 마우스에 항원을 면역접종하는 단계; 및
상기 면역접종된 마우스로부터 상기 항원에 결합하는 항체를 생산하는 B 세포를 분리하는 단계;를 포함하는, 항원에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은, NSG 마우스에 인간 태아 흉선, 인간 태아 골편 및 인간 줄기세포가 이식된 마우스에 항원을 면역접종하는 단계를 포함하여, 이 단계에 대하여는, 상기한 바와 같다.
상기 방법은, 상기 면역접종된 마우스로부터 상기 항원에 결합하는 항체를 생산하는 B 세포를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 B 세포의 분리는 B 세포의 순수 분리 뿐만 아니라 B 세포의 비율을 높이는 것을 포함한다. 상기 B 세포는 그를 포함하는 림프 세포 (lymphoid cell) 또는 비장세포 (splenocyte)의 형태로 분리될 수 있다. 분리된 B 세포는 배양되어, 항체를 생산하는데 사용될 수 있다.
상기 방법은, 상기 분리된 B 세포를 불멸화하는 단계를 더 포함할 수 있다. B 세포를 불멸화하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 상기 불멸화 단계는, 예를 들면, 상기 분리된 B 세포를 미엘로마 세포주와 융합하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 불멸화된 세포 중에서 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 세포를 선발하는 단계를 더 포함할 수 있다. 선발된 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 세포는 배양되어, 상기 항체를 생산하고, 분리하는데 사용될 수 있다.
다른 구체예는, NSG 마우스에 인간 태아 흉선 및 인간 태아 골편을 이식하는 단계를 포함하는, 인간화된 마우스를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 인간 태아 흉선은 신장 캡슐에 이식하고, 상기 인간 태아 골편은 피하에 이식하는 것일 수 있다.
상기 방법은, 인간 줄기세포를 이식하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 인간 줄기세포의 이식은, 정맥을 통하여 투여함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 인간 줄기세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)인 것일 수 있다. 상기 조혈모세포는 성인의 골수, 제대혈, 태아간 및 가동화된 말초혈액 유래의 조혈모세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
다른 구체예는, NSG 마우스에 인간 태아 흉선 및 인간 태아 골편이 이식된 마우스에 인간 줄기세포를 이식하는 단계; 및
상기 인간 줄기세포로부터 복제되고 분화된 세포를 분석하는 단계를 포함하는, 인간 줄기세포로부터 복제되고 분화된 세포를 분석하는 방법을 제공한다.
상기 방법은, NSG 마우스에 인간 태아 흉선 및 인간 태아 골편이 이식된 마우스에 인간 줄기세포를 이식하는 단계를 포함한다. 상기 인간 줄기세포의 이식은, 정맥, 예를 들면 미정맥을 통하여 투여함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 인간 줄기세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)인 것일 수 있다. 상기 조혈모세포는 성인의 골수, 제대혈, 태아간 및 가동화된 말초혈액 유래의 조혈모세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 방법은, 상기 인간 줄기세포로부터 복제되고 분화된 세포를 분석하는 단계를 포함한다. 상기 분석은, 알려진 세포 분석 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 복제되고 분화된 세포는 상기 마우스로부터 수확되어 세포 수준에서 또는 조직 수준에서 분석될 수 있다. 예를 들면, 인간 세포에 특이적인 항체에 인간 세포를 결합시키고 얻어진 복합체로부터 상기 특정 인간 세포를 용출시킴으로써 분석될 수 있다. 상기 분석은, 특정한 세포를 특이적으로 염색하고, 염색된 세포를 가시화 또는 이미지 분석함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 분석은 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)를 사용하여 이루어질 수 있다. 상기 분석은, 특정한 세포 타입의 확인, 세포의 분화 정도의 확인 및 세포의 분포 비율의 확인이 포함된다.
일 구체예에 따른 NSG 마우스에 인간 태아 흉선 및 태아 골편이 이식된 마우스는, NSG 마우스에 비하여, 인간화된 세포 분포를 갖는 마우스를 생산하는데 사용될 수 있다.
다른 구체예에 따른 항원에 특이적인 항체를 생산하는 방법에 의하면, 인간 항체를 NSG 마우스에 비하여, 높은 효율로 생산할 수 있다.
다른 구체예에 따른 인간 줄기세포로부터 복제되고 분화된 세포를 분석하는 방법에 의하면, NSG 마우스에 비하여, 인간 줄기세포의 복제와 분화를 효율적으로 관찰할 수 있다.
도 1a는 인간 태아 흉선, 인간 태아 골편 및 태아간 또는 제대혈 유래 CD34+ 세포가 이식된 NSG 마우스 및 조혈모세포만을 이식받은 마우스에 1차 및 2차 근육주사를 통하여 면역접종하고, 비장 내로 DNP-KLH로 면역접종한 후 3-4주 후, 비장세포 (splenocyte)를 FACS를 이용하여 관찰한 도면을 나타낸다.
도 1b는 인간 태아 흉선, 인간 태아 골편 및 태아간 또는 제대혈 유래 CD34+ 세포가 이식된 NSG 마우스의 비장 내로 DNP-KLH로 면역접종한 후 14주 후, 태아간 또는 제대혈 유래 CD34+를 이식한 후 21주 후에 비장세포를 FACS를 이용하여 관찰한 도면을 나타낸다.
도 1c는 비장세포를 항-인간 CD45-PECy7, 항-인간 CD20-APC 및 항-인간 CD38-PE로 염색한 결과를 나타내고,
도 1d는 마우스의 골수세포를 항-인간 CD45-PE Cy7, 항-인간 CD19-PE 및 항-인간 CD3-FITC로 염색하고 관찰한 결과를 나타낸다.
도 2의 a는 인간 태아 흉선, 태아 골편 및 조혈모세포가 이식된 NSG 마우스에 DNP-KLH로 면역접종한 후 얻어진 비장을 면역조직화학염색한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2의 b는 조혈모세포만이 이식된 NSG 마우스에 DNP-KLH로 면역접종한 후 얻어진 비장을 면역조직화학염색한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 인간 태아 흉선, 태아 골편 및 조혈모세포가 이식되고 DNP-KLH로 면역접종된 상기 NSG 마우스의 혈청에 존재하는 항원특이적 IgG 및 IgM을 ELISA 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 1b는 인간 태아 흉선, 인간 태아 골편 및 태아간 또는 제대혈 유래 CD34+ 세포가 이식된 NSG 마우스의 비장 내로 DNP-KLH로 면역접종한 후 14주 후, 태아간 또는 제대혈 유래 CD34+를 이식한 후 21주 후에 비장세포를 FACS를 이용하여 관찰한 도면을 나타낸다.
도 1c는 비장세포를 항-인간 CD45-PECy7, 항-인간 CD20-APC 및 항-인간 CD38-PE로 염색한 결과를 나타내고,
도 1d는 마우스의 골수세포를 항-인간 CD45-PE Cy7, 항-인간 CD19-PE 및 항-인간 CD3-FITC로 염색하고 관찰한 결과를 나타낸다.
도 2의 a는 인간 태아 흉선, 태아 골편 및 조혈모세포가 이식된 NSG 마우스에 DNP-KLH로 면역접종한 후 얻어진 비장을 면역조직화학염색한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2의 b는 조혈모세포만이 이식된 NSG 마우스에 DNP-KLH로 면역접종한 후 얻어진 비장을 면역조직화학염색한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 인간 태아 흉선, 태아 골편 및 조혈모세포가 이식되고 DNP-KLH로 면역접종된 상기 NSG 마우스의 혈청에 존재하는 항원특이적 IgG 및 IgM을 ELISA 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: NSG 마우스에 인간 태아 흉선, 태아 골편 및 인간 태아간 또는 제대혈 유래 조혈모세포가 이식된 마우스의 제조
NSG 마우스에 인간 태아 흉선, 태아 골편을 이식하여 생산된 마우스에 인간 태아간 또는 제대혈 유래 조혈모세포를 이식하였다.
(1) NSG 마우스에 인간 태아 흉선, 태아 골편 및 인간 태아간 또는 제대혈 유래 조혈모세포의 이식
이식 당일 동결보관된 인간 태아의 흉선 (1 mm3) 및 태아 골편(3 mm3) 조직 (Advanced Bioscience Resource, INC., USA) 또는 IRB 승인을 거친 사산태아 (삼성의료원)를 잘라서 인간 태아의흉선 (1 mm3) 및 태아 골편(3 mm3) 조직을 준비하였다. 8주령인 NSG 마우스 (Jackson Laboratory, USA)를 수면 마취시킨 후 상기 잘라서 준비된 흉선 조직을 한 조각씩 마취된 마우스의 좌측 신장의 캡슐 내에 이식하고, 지혈기로 잘라진 막을 봉합하였다. 또한, 상기 잘라서 준비된 태아의 골편은 마취된 마우스의 좌측 상지와 액와 인접 부위의 피하에 1 조각씩 이식하고 봉합하여 실험군을 준비하였다.
또한, NSG 마우스에 인간 태아 흉선 및 태아의 골편 이식 없이 상기 실험군 마우스에 대해 수행된 동일한 수술 및 조혈모세포 이식 절차를 수행하여 대조군을 준비하였다.
(2) 조혈모세포의 이식
상기 (1)에서 조직을 이식받은 실험군 및 대조군 마우스 모두 수술 후 3 주 동안 회복시켰다. 수술 3 주 후, 부술판 (busulfan, 20mg/kg)을 실험군과 대조군 마우스의 복강 내 주사로 전-조건화 (pre-conditioning )한 후 24 시간 내에 인간 제대혈 유래 조혈모세포를 이식하였다. 태아간 또는 제대혈에서 유래된 조혈모세포는 비오틴화 항-CD34 항체 (biotinylated anti-CD34 antibody)로 표지한 후 MACS 장비 (Miltenyi Biotech, 독일)를 이용하여 소팅하여 99% 이상이 CD34+ 세포를 분리하였다.
CD34+ 조혈모세포를 31 게이지의 1cc 인슐린 주사기 (insulin syringe, BD Bioscience)를 사용하여 꼬리 정맥에 1 x 105 세포수/0.1 ml/마우스로 주사하였다.
(3) 유세포형광분석법(FACS)에 의한 인간세포의 생착 및 분화 확인
상기 (2)와 같이 구축된 실험군과 대조군 NSG 마우스에서 조혈모세포 이식 후 8 주부터 마우스의 꼬리에서 채혈하여 4 주 간격으로 유세포 형광분석을 통해 인간 면역세포를 관찰하였다. 면역세포의 관찰을 위해, 각 마우스에서 200㎕의 혈액을 미정맥에서 채취하고, 상온에서 적혈구를 용해시켜서 수확한 백혈구에 인간 CD 마커를 표지하기 위해 하기와 같이 염색시켰다. 백혈구 세포 105개를 우태아혈청(FBS) 2%가 함유된 1X PBS (phosphate buffered saline)에서 항-인간 CD45-PECy7, 항-인간 CD19-PE, 항-인간 CD3-FITC (eBioscience, Inc., USA)와 함께 암조건으로 4℃에서 30 분간 반응시키고, 2% FBS가 포함된 1xPBS로 1회 세척하였다. 상기와 같이 수확된 백혈구 시료를 유세포 형광분석장치인 FACS Aria (BD BioScience, USA)를 사용하여 측정하고, 그 결과를 FACX Diva 프로그램으로 분석하였다 (BD Biosciences, USA). 그 결과, 마우스에서 CD45+인 인간 세포가 높은 비율로 생착되었음을 알 수 있었다.
다음으로, 상기 마우스로부터 비장 조직과 골수 조직을 분리하였다. 마우스의 비장을 적출하여 70μM 메쉬 (mesh) (strainer, BD Bioscience, USA)에 통과시켜 단일 세포를 분리하였고, 골수세포를 분리하기 위하여 대퇴골 (femur)와 정강뼈(tibia)를 적출하여 각각 상단과 하단에 구멍을 내고 18G 또는 21G 주사침이 장착된 3ml 주사기를 이용하여 1xPBS 2% FBS를 플러쉬 (flush)하여 사용 중인 주사기를 3 또는 4회 통과시켜서 단일세포 상태로 준비한 후 70μM 메쉬 (mesh)를 통과시켜서 세포 이외의 골파편을 제거하였다. 상기와 같이 수확한 백혈구에 분화된 인간 세포 마커를 표지하기 위해 하기와 같이 염색시켰다. 백혈구 세포 105개를 우태아혈청(FBS) 2%가 함유된 1X PBS (phosphate buffered saline)에서 항-인간 CD45-PECy7 (Phycoerythrin-Cy7); 항-인간 CD19-PECy7 및 항-인간 IgM-PE 및 항-인간 IgD-FITC (fluorescein isothiocyanate) (eBioscience, Inc., USA)와 함께 암조건으로 4℃에서 30 분간 반응시키고, 2% FBS가 포함된 1xPBS로 1회 세척하였다. 상기와 같이 수확된 백혈구 시료를 유세포 형광분석장치인 FACS Aria (BD BioScience, USA)을 사용하여 측정하고, 그 결과를 FACS Diva 프로그램으로 분석하였다 (BD Biosciences, USA). 그 결과는, 도 1a 내지 1d에 나타내었다.
도 1a 내지 1d에 나타낸 바와 같이, 이식된 인간 조혈모세포가 골수에 생착되어 마우스 체내에서 분화됨을 확인하였다. 또한, 생착된 상기 조혈모세포는 자가 복제 및 분화되어 성숙한 B 및 T 세포를 포함하는 인간 혈구 세포로 분화하였다.
도 1a는 인간 태아 흉선, 인간 태아 골편 및 인간 태아간 유래-CD34+ 세포가 이식된지 14주 후, NSG 마우스에 불완전 어주반트 (incomplete adjuvant)와 혼합된 DNP-KLH를 근육주사로 투여하여 면역접종하고, 2 주 후 완전 어주반트 (complete adjuvant)와 혼합된 DNP-KLH를 근육주사로 투여한 2주 후 즉, 조혈모세포를 이식한지 18주에 비장 (spleen) 내로 DNP-KLH로 면역접종한 후 3-4주 후에 비장세포 (splenocyte)를 FACS를 이용하여 관찰한 도면을 나타낸다. 도 1a는 항-인간 CD45-PECy7, 항-인간 CD19-PE 및 항-인간 CD3-FITC로 염색한 결과를 나타내고, 도 1b는 항-인간 CD19-PECy7, 항-인간 IgM-PE 및 항-인간 IgD-FITC로 염색한 결과를 나타내고, 도 1c는 항-인간 CD45-PECy7, 항-인간 CD20-APC 및 항-인간 CD36-PE로 염색한 결과를 나타내고, 도 1d는 마우스의 골수세포를 항-인간 CD45-PECy7, 항-인간 CD19-PE 및 항-인간 CD3-FITC로 염색하고 관찰한 결과를 나타낸다.
도 1a에서, A는 인간 CD45+ 세포 중에서 분석한 FACS 프로필이며, B와 C는 분석한 결과에 대한 막대 그래프이다. 태아흉선과 골편과 조혈모세포가 이식된 마우스는 대조군에 비하여 비장 내 인간세포인 CD45+ 세포가 더 높게 포함되어 있었다. 또한, 비장내의 T 세포와 B 세포도 높게 존재하였다.
도 1b는 인간의 B 세포가 미성숙 단계로부터 성숙 단계인 T1 B 세포 (CD19+IgM+IgD-), T2 B 세포 (CD19+IgM+IgD+), 성숙된 B 세포 (CD19+IgM-IgD+)를 나타낸다 (Immunological Reviews 2004. 197: 179-191). 태아 흉선과 골편이 조혈모세포와 함께 이식된 경우 조혈모세포만을 이식받은 마우스에 비하여 T1, T2, 성숙 B 세포가 비장 내에서 높게 존재함을 알 수 있었다.
또한 도 1c에서는 CD45+ 세포 가운데 CD38+++CD20- 세포 (형질세포: plasma cell)를 조사한 결과 형질세포가 실험군에서 조혈모세포만을 이식한 대조군에 비하여 매우 높게 존재하였다.
도 1d는 인간 태아 흉선 및 인간 태아 골편 및 태아간-CD34+ 세포가 이식된 NSG 마우스에서 비장 (spleen) 내로 DNP-KLH로 면역접종한 3주 후 즉, 태아간-CD34+ 조혈모세포를 이식한 후 21주 후에 골수세포를 FACS를 이용하여 관찰한 도면을 나타낸다. 도 1d는 각각, 항-인간 CD45-PECy7; 항-인간 CD19-PE 및 항-인간 CD3-FITC로 염색한 결과를 나타낸다. 도 1d의 결과는 골수에서의 인간 조혈모세포가 생착하여 면역세포인 T 및 B 세포의 분화정도를 보여주는 결과이다.
신장 캡슐에 이식된 인간 태아 흉선조직은 조혈모세포로부터 T 세포가 발생 및 분화될 수 있는 환경을 제공하고, 피하에 이식된 태아 골편은 정상적인 성체 혈구세포의 형성과정을 특히 B 세포가 정상적으로 성숙 분화할 수 있도록 미세환경을 제공하여 NSG 마우스 내에서 인간의 성숙한 B 세포로의 분화를 유도하는 것으로 보인다. 그 결과, 도 1a-1d에 나타낸 바와 같이 부족한 성숙한 B 세포로의 발생 및 분화가 촉진되는 것으로 여겨진다. 그러나, 본 발명의 범위가 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다.
NSG 마우스에 CD34+ 조혈모세포만을 이식하는 경우, NSG 마우스 자체의 흉선, 골조직 (long bone endosteal region) 등 만으로는 T 세포로의 발달 및 성숙한 B 세포로의 발생 및 분화를 유도하는데 한계가 있다. 그러나, 상기한 바와 같은 본 발명의 실시예에 의하면, 이식해 준 인간 태아 흉선 조직에서는 인간 T 세포의 분화를, 이식해준 인간 태아 골편이 인간 태아간 또는 제대혈 유래 CD34+ 조혈모세포로부터 더욱 인간에 가까운 성숙한 B 세포로의 분화 및 발생을 유도할 수 있어, 성숙한 면역체계를 갖는 인간화 마우스 모델을 얻을 수 있다.
(4) 인간의 성숙 B 세포가 분화된 인간화 마우스 모델에서 항원특이적 단일클론항체의 생산 확인
(4.1) 항원으로 면역 접종
상기와 같이 구축된 실험군과 대조군 NSG 마우스에 인간 태아 흉선, 태아 골편 및 조혈모세포 이식으로 생산된 마우스 모델에 항원을 면역 접종하는 단계는 다음과 같다. 인간 태아흉선과 인간 태아골편을 이식 3주 후 CD34+ 인간 조혈모세포를 이식한지 14 주가 될 때 마우스에 DNP-KLH (100㎍/0.1 ml/mouse, Chemicon, USA)를 불완전 어주반트와 혼합하고, 근육 주사하여 1차 면역 접종하였다. 면역 접종 2 주 후 DNP-KLH (100㎍/0.1 ml/mouse, Chemicon, USA)를 완전 어주반트와 혼합하여 근육 주사하여 2차 면역접종하였다. 2차 면역접종 2주 후에 마우스를 수면마취 후 DNP-KLH (100㎍/0.1 ml/mouse, Chemicon, USA)를 비장 내 주사로 면역 접종하였다. 그 후 3-4주 되는 시점에 상기 마우스의 비장을 적출하여 일부는 포르말린 고정하여 면역화학염색을 하였다.
도 2a (실험군) 및 2b (대조군)는 인간 태아 흉선, 태아 골편 및 조혈모세포가 이식된 NSG 마우스에 DNP-KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)로 면역접종한 후 얻어진 비장을 면역조직화학 염색한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 태아 흉선/태아골편/조혈모세포가 이식된 마우스의 비장에는 CD3+ T 세포 영역 (T cell zone)과 CD20+ B 세포 영역이 잘 구분되어 발달되어 있었다. FDC+인 수지상세포가 잘 발달하였고 CD138+ 형질세포도 높게 분포하였다. 반면에 조혈모세포만을 이식받은 마우스의 비장은 CD3+ T 세포와 CD20+ B 세포의 경계가 뚜렷하지 않았고, FDC+ 세포인 수지상세포가 잘 발달하지 못하였고 특히 CD138+ 형질세포가 매우 저조하게 분화되어 있음을 알 수 있었다.
또한, 인간 태아 흉선, 태아 골편 및 조혈모세포가 이식되고 DNP-KLH로 면역접종된 상기 NSG 마우스로부터 미정맥으로부터 혈액을 수확하여 혈청내 항원 특이적 IgG 와 IgM 을 조사하였다. 도 3은 인간 태아 흉선, 태아 골편 및 조혈모세포가 이식되고 DNP-KLH로 면역접종된 상기 NSG 마우스의 혈청에 존재하는 항원특이적 IgG 및 IgM을 ELISA 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 태아 흉선 및 태아 골편과 함께 조혈모세포가 이식된 마우스의 혈청 내에 DNP-KLH에 특이적인 IgG (검은 막대)와 IgM (희색 막대)가 검출되었다. 그러나, 조혈모세포만을 이식받은 마우스의 혈청에서는 DNP-KLH에 특이적인 IgM은 존재하였으나 항원 특이적인 IgG는 검출되지 않았다.
(4.2) 항원 특이적 항체를 생산하는 세포의 불멸화
(4.1)에서 적출되고 남은, 나머지 일부 비장으로부터 비장세포를 준비하였다. 준비된 비장세포와 생쥐-인간 키메라 (mouse-human chimeric) 세포인, 골수암 세포주 (myeolma cell line)를 세포융합하여, 불멸화된 DNP 특이적 단일클론 인간 항체를 생산하는 세포를 선발하였다. 그 결과, 1.7x107 세포와 미엘로마 세포를 융합하여, 불멸화된 180개의 세포 클론들을 선발하였다. 이들 중 약 70개 클론에서 인간 항체가 검출되었으며, 상기 클론의 대부분은 IgM을 생산하였고, 2개 클론에서 IgG를 생산하는 것으로 확인되었다 (OD: 0.3 내지 1.5). 이들 중 DNP-KLH 특이적 IgM을 생산하는 하나의 세포를 클론 No. 3으로 명명하였고, DNP-KLH 특이적 IgG를 생산하는 하나의 세포를 클론 No. 56으로 명명하였다. 얻어진 클론 No.3과 56을 RPMI 1640+10%FBS 배지에서 37℃ 및 5% CO2 농도에서 96 웰 플레이트에서 배양하였다. 배양물로부터 얻어진 배양 상층액을, ELISA를 수행하였다. ELISA 과정은 다음과 같다. 먼저, 96웰 플레이트의 각 웰에 DNP-KLH를 코팅하였다. 세척 후 차단(blocking)하고 세척한 후, 다음으로, 상기 상층액 시료를 부가한 후, 표지된 항-인간 IgM (Bethyl Laboratory, USA) 및 항-인간 IgG 항체 (Bethyl Laboratory, USA)를 반응시키고, A450에서 흡광도를 측정하였다. 표 1은 A450의 측정 결과를 나타내는 것으로, 2반복 실험 값의 평균 값으로 나타내었다.
| 배지 | 클론 56의 배양 상층액(IgG) | 클론 3의 배양 상층액(IgM) |
| 0.059 | 0.289 | 1.4285 |
대조군으로서, DNP-KLH 대신 BSA가 코팅된 것을 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실험하였으며, 그 결과를 표 2에 나타낸 바와 같다.
| 배지 | 클론 56의 배양 상층액 | 클론 3의 배양 상층액 |
| 0.046 | 0.047 | 0.059 |
표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 하이브리도마 클론 56 및 클론 3으로부터 각각 IgG와 IgM을 높은 생산성으로 생산할 수 있다.
Claims (15)
- NSG 마우스에 인간 태아 흉선 및 인간 태아 골편이 이식된 마우스.
- 제1항에 있어서, 인간 줄기세포가 더 이식된 마우스.
- 제2항에 있어서, 상기 인간 태아 흉선은 신장 캡슐에 이식되고, 상기 인간 태아 골편은 피하에 이식되고, 상기 인간 줄기세포는 정맥을 통하여 이식된 것인 마우스.
- 제2항에 있어서, 상기 인간 줄기세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)인 것인 마우스.
- 제4항에 있어서, 상기 조혈모세포는 인간 태아간 또는 제대혈 유래 CD34+ 조혈모세포인 것인 마우스.
- 제4항에 있어서, NSG 마우스에 비하여, 성숙된 T 세포 및 B 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이상의 세포가 더 높은 비율로 존재하는 것인 마우스.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 마우스에 항원을 면역접종하는 단계; 및
상기 면역접종된 마우스의 혈청으로부터 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체를 생산하는 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 마우스에 항원을 면역접종하는 단계; 및
상기 면역접종된 마우스로부터 상기 항원에 결합하는 항체를 생산하는 B 세포를 분리하는 단계;를 포함하는, 항원에 결합하는 항체를 생산하는 방법. - 제8항에 있어서, 상기 분리된 B 세포를 불멸화하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 불멸화 단계는, 상기 분리된 B 세포를 미엘로마 세포주와 융합하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- NSG 마우스에 인간 태아 흉선, 인간 태아 골편 및 인간 줄기세포를 이식하는 단계를 포함하는, 인간화된 마우스를 생산하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 인간 태아 흉선은 신장 캡슐에 이식하고, 상기 인간 태아 골편은 피하에 이식하고, 상기 인간 줄기세포는 정맥을 통하여 투여함으로써 이식하는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 인간 줄기세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)인 것인 방법.
- NSG 마우스에 인간 태아 흉선 및 인간 태아 골편이 이식된 마우스에 인간 줄기세포를 이식하는 단계; 및
상기 인간 줄기세포로부터 증식되고 분화된 세포를 분석하는 단계를 포함하는, 인간 줄기세포로부터 증식되고 분화된 세포를 분석하는 방법. - 제14항에 있어서, 상기 줄기세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)인 것인 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020090036730 | 2009-04-27 | ||
| KR20090036730 | 2009-04-27 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130088968A Division KR20130100246A (ko) | 2013-07-26 | 2013-07-26 | 인간화된 ｎｓｇ 마우스 및 그 제조 및 이용 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20100118091A true KR20100118091A (ko) | 2010-11-04 |
Family
ID=43032677
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020100039173A KR20100118091A (ko) | 2009-04-27 | 2010-04-27 | 인간화된 ｎｓｇ 마우스 및 그 제조 및 이용 방법 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8604271B2 (ko) |
| KR (1) | KR20100118091A (ko) |
| WO (1) | WO2010126278A2 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102613264B1 (ko) * | 2023-03-28 | 2023-12-13 | (주)씨앤에스알 | 인간 줄기세포 이식 및 면역 부스팅에 기반한 인간면역화 마우스 및 그의 제조방법 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2822117A1 (en) * | 2010-12-31 | 2012-07-05 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of autologous t-cells in mice |
| WO2016210130A1 (en) | 2015-06-23 | 2016-12-29 | Cytodyn Inc. | Inhibition of ccl5 ligand binding to ccr5 receptor and alteration of ccr5/ccl5 axis signaling in inflammation, cancer, autoimmune, and other conditions |
| WO2018209299A1 (en) * | 2017-05-11 | 2018-11-15 | Cytodyn Inc. | Humanized mouse model |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5057598A (en) * | 1983-05-06 | 1991-10-15 | Centocor, Inc. | Monoclonal antibodies reactive with endotoxin core |
| CA2402459A1 (en) * | 2000-12-01 | 2002-06-06 | Central Institute For Experimental Animals | Method of producing a mouse suitable for engraftment, differentiation and proliferation of heterologous cells, mouse produced by this method and use of the mouse |
| WO2006049439A1 (en) * | 2004-11-03 | 2006-05-11 | Dinona Inc. | Method of producing xenogenic cd4 t-cell and animal model producing xenogenic cd4 t-cell |
-
2010
- 2010-04-27 WO PCT/KR2010/002638 patent/WO2010126278A2/en active Application Filing
- 2010-04-27 KR KR1020100039173A patent/KR20100118091A/ko active Application Filing
-
2011
- 2011-09-07 US US13/227,233 patent/US8604271B2/en active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102613264B1 (ko) * | 2023-03-28 | 2023-12-13 | (주)씨앤에스알 | 인간 줄기세포 이식 및 면역 부스팅에 기반한 인간면역화 마우스 및 그의 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20120066780A1 (en) | 2012-03-15 |
| WO2010126278A3 (en) | 2011-03-31 |
| WO2010126278A2 (en) | 2010-11-04 |
| US8604271B2 (en) | 2013-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0481058B1 (en) | Human lymphoid tissue in an immunocompromised host | |
| DK1648507T3 (en) | PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR INCREASING THE EFFECTIVENESS OF THERAPEUTIC ANTIBODIES USING COMPOUNDS THAT POTENTATE NK CELLS | |
| JP2801228B2 (ja) | キメラ性非ヒト動物及びそれらの使用 | |
| JP3523245B1 (ja) | ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物 | |
| TW201729840A (zh) | 抗ｖｉｓｔａ抗體及片段、其用途及鑑定其之方法 | |
| CN103547597A (zh) | 新型调节剂及使用方法 | |
| JPS6362518B2 (ko) | ||
| JP6654001B2 (ja) | ヒトｉｌ−１５分泌免疫不全マウス | |
| CN1551783B (zh) | 类K121抗体在制备用于治疗κ类型多发性骨髓瘤的药物中的应用 | |
| CA2103693A1 (en) | Animal model of the human immune system | |
| KR20100118091A (ko) | 인간화된 ｎｓｇ 마우스 및 그 제조 및 이용 방법 | |
| JP4609855B2 (ja) | ヒト由来免疫担当細胞の製造方法 | |
| JP2020054328A (ja) | 免疫不全マウス | |
| US20220177551A1 (en) | Developing an efficient hybridoma platform for therapeutic antibody discovery | |
| JPH09502167A (ja) | 新規な幹細胞マーカー | |
| US20020128449A1 (en) | Monoclonal antibodies to antigens expressed by hematopoietic facilitatory cells | |
| Zhu et al. | Rabbit hybridoma | |
| Xiao et al. | A non-leaky Artemis-deficient mouse that accurately models the human severe combined immune deficiency phenotype, including resistance to hematopoietic stem cell transplantation | |
| KR20130100246A (ko) | 인간화된 ｎｓｇ 마우스 및 그 제조 및 이용 방법 | |
| Ito et al. | Antigen-specific antibody production of human B cells in NOG mice reconstituted with the human immune system | |
| CN107375923A (zh) | 抗s100a4抗体在抗cd137抗体介导抗肿瘤免疫损伤中的应用 | |
| JPH08500009A (ja) | 造血促進細胞及びその使用 | |
| JP5890017B2 (ja) | 抗原特異的ｔ細胞寛容を誘導する抗体およびその使用 | |
| Perico et al. | Bi-specific autoantigen-T cell engagers as targeted immunotherapy for autoreactive B cell depletion in autoimmune diseases | |
| JP2647292B2 (ja) | 非ヒトキメラ哺乳動物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| A107 | Divisional application of patent | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20130726 Effective date: 20141231 |