KR102613264B1 - 인간 줄기세포 이식 및 면역 부스팅에 기반한 인간면역화 마우스 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 줄기세포 이식 및 면역 부스팅에 기반한 인간면역화 마우스 및 그의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 인간 줄기세포가 이식된 마우스에 세팔로스포린계 항생제 및 플루오로퀴놀론계 항생제를 투입하여 제조된, 인간 줄기세포 이식 및 면역 부스팅에 기반한 인간면역화 마우스 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인간 줄기세포 이식 및 면역 부스팅에 기반한 인간면역화 마우스 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
인간을 대상으로 한 질병의 연구는 기술적 및 윤리적인 문제로 연구 임상시험의 한계가 존재하며 인간과 해부학적/생리적으로 유사하다고 알려진 동물을 이용한 대체법이 유용하게 이용되고 있다. 이를 위해 인간의 질병을 실험동물에게 유도하고 다양한 치료법을 탐색한다. 특히 최근 첨단 바이오 의약품의 개발이 성장에 따른 각 분야의 전임상 연구가 실제 임상으로 연계에 주요 쟁점이 되고 있다. 즉, '보다 적절한 모델'을 활용함으로써 세포 수준의 연구 결과를 인체에 적용하기 위함과 동시에 유효성과 안전성 확보를 위해 필수적인 평가 항목으로 변화해 가고 있기 때문이다.
특정 질환 재현성 모델을 통한 첨단 바이오 의약품의 적합성, 독성 평가 및 신규 의료 기술 적용 기술은 다양한 의학적 접근 평가에서 매우 중요한 역할을 한다. 그러나 일반적인 동물 모델을 적용하여 접근하는 경우 환자의 질환과 상태를 면밀히 대변하지 못하여 한계가 지적되고 있다. 최근, 보다 적절한 연구자원 개발의 일환으로 실험동물의 고도화를 위한 기술 개발이 활발하게 이루어 지고 있으며 바이오첨단의약품(신물질) 또는 신약개발에 직접 활용되고 있는 추세다.
실험동물의 고도화라 함은 설치류나, 미니돼지, 영장류 등을 이용한 유전자변형 동물이나 PDX(patient-derived xenograft)/CDX(cell-derived xenograft) 마우스(사람의 조직 또는 세포를 이식한 이종이식마우스)가 대표적인 예시며 '보다 적절한 실험동물 질환모델' 개발을 통해 인간과 인간의 질병에 더욱 근접하게 활용될 수 있다. 특히, 인간면역화 마우스(humanized mouse)는 숙주 내에 인간의 T세포, B세포, NK세포 등 인간의 면역체계가 도입된 실험동물로 바이오 의약품에 대한 사람의 면역반응을 연구하는데 활용가치가 매우 높다.
하지만, 이종이식마우스의 경우 사람에 특이적인 약물 반응 평가에 한계가 있고 인간면역화 마우스의 경우엔 인간의 혈구세포(human-specific CD45 positive cells)의 비율이 40% 미만의 수준만을 보증한 성능을 갖고 있다. 또한 안정성과 유효성 검증을 위한 생존기간이 비교적 짧기 때문에(25주 후 급격히 생존율 감소) 생존율 극복이라는 장벽이 존재하고 매우 고가의 비용이라는 점도 고려해야 한다.
지금까지 신약개발에 사용된 마우스는 인간의 면역체계와 달라 치료제 개발 검증 단계에서 한계를 나타내었다. 기승인된 표적항암치료제인 Pembrolizumab (MSD社 KEYTRUDA®)나 Nivolumab(BMS社 Opdivo®)과 같은 항암제의 경우 기존 전임상결과에서 낮은 반응성을 나타내나, 인간 면역화마우스를 활용한 종양모델(CDX 또는 PDX)에서는 높은 반응성을 나타낸 신약들이 다수 존재하는 것으로 보고되었다. 이는 필수적으로 수반되는 전임상시험 단계에서 인간과 다른 면역체계를 가진 실험동물을 활용한 결과가 실제 임상과 상이한 결과를 나타내기 때문이다. 이러한 측면에서, 인간면역화 마우스는 전임상 단계의 바이오소재로서 질환 특이적 아바타 모델로 적용되어 임상 전단계에서 안정성 높은 데이터를 검증 및 평가할 수 있는 첨단 기술 기반 소재(high-end technology-based material)로 제공될 수 있다.
최근 들어 항암치료의 한계를 극복하기 위한 자가, 동종, 이종 세포치료제의 시장이 활발한 실정이다. 특히 “생물학적 제제 등의 품목허가, 심사 규정”등이 강화되면서 인간의 질병을 적용한 질환 재현성 환경의 정교한 검증 결과를 입증해야 한다. 즉, T세포 치료제, NK세포치료제, 조혈줄기세포, 유도만능줄기세포 등의 약력학, 약동학 및 임상적 유효성 등 정밀하게 확인된 작용기전과 안정성 및 유효성을 입증할 수 있어야 한다.
항암제 개발 분야의 최근 연구 논문들은 다양한 발암 모델(유방암, 대장암, 폐암 등) 유발 후 기표적항암제 단독 요법 또는 세포치료제 병행요법 등에 대한 전임상 효능 규명 연구에서 활용되고 있다(① Richard B Bankert et al. Humanized mouse model of ovarian cancer recapitulates patient solid tumor progression, ascites formation, and metastasis, PLoS One. 2011;6(9):e24420. ② J. Jason Morton et al. Humanized xenograft models: narrow the tumor-microenvironment gap. Cancer Res 2016, Nov 1; 76(21): 6153-6158. ③ Nina B. Horowitz et al. Humanized mouse model for advanced of innate lymphoid cell-based cancer immunotherapies. Frontiers in immunology, ④ Ling Yin et al. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. Am J Cancer Res. 2020; 10(12): 4568-4584. ⑤ Morgane M. Cogels et al. Humanized Mice as a Valuable Pre-Clinical Model for Cancer Immunotherapy Research. Front Oncol. 2021; 11: 784947.). 또한, 종래기술로서, 공개특허 제2005-0120863호는 Ｈ-라스 과발현 마우스를 이용한 항암제의 항암활성검정방법을 개시하고 있다.
현재까지 개발된 인간 면역화 마우스의 경우 숙주의 혈중 인간의 혈구세포(human CD45 surface marker)의 비율은 40%의 수준으로서 세계적으로 종양학 분야의 심도있는 연구 결과 제시를 위해 활용되어 왔으나, 최근 첨단 바이오 의약품(세포치료제 시장)의 성장에 따라 자가면역질환, 감염성질환(예: SARS-CoV2) 등의 전반적인 질환 분야에 적용되어 인간 특이적 질병을 재현하고 효능검증 및 평가 소재로서 전임상 단계의 예방과 평가 도구로 기대되고 있다.
그러나, 종래의 인간 면역화 마우스의 경우, 마우스 내의 인간의 혈구세포 비율 및 숙주 내 인간의 면역세포비율이 낮고 생존 유지기간이 길지 않기 때문에 이를 개선할 필요가 있으며, 동일한 성능을 확보한 인간 면역화 마우스의 실험 개체의 제조 및 인간 면역화 마우스의 제조 단계에서의 안정성 확립이 요청되고 있다.
본 발명은 이러한 종래 기술의 문제를 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 마우스 내의 인간의 혈구세포 비율, 숙주 내 인간의 면역세포비율 및 생존 유지력을 높인 인간 줄기세포가 이식된 고도화 인간면역화 마우스를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 숙주에게 공여되는 인간의 세포와 대사 교란 억제를 위한 화합물을 마우스에게 적용함으로써 숙주의 이식 거부 반응을 최소화하고 동시에 줄기세포 이식량의 적절성을 고려하여 최적화함으로써 고도화된 인간면역화 마우스를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 마우스 내의 공여된 인간의 면역세포에 대한 부스팅 기술을 적용함으로써 숙주 내의 인간의 혈구세포 비율, 활성된 인간의 다양한 면역세포비율 및 생존 유지력을 높인 고도화된 인간면역화 마우스의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 줄기세포가 이식된 인간면역화 마우스를 이용하여 인간 항체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 줄기세포가 이식된 마우스에 세팔로스포린계 항생제 및 플루오로퀴놀론계 항생제를 투입하여 제조된, 인간 줄기세포 이식 및 면역 부스팅에 기반한 인간면역화 마우스를 제공한다.
종래의 경우 고선량방사선 노출을 통해 숙주의 골수 세포를 억제하는 방식으로 접근하였으나, 골수 뿐만 아니라 전신에 노출되는 방사선으로 인해 조직 및 모든 세포에 손상이 가해져 대사 교란 유발로 인한 생존율이 매우 낮아지는 문제가 있다. 또한 이종 이식되는 인간의 세포에 대한 숙주의 면역 거부 반응으로 고성능의 인간면역화 마우스 제조와 장기적인 모델 구축에 한계가 있다. 이에 최종 검증 단계인 혈액분석 과정 역시 숙주의 면역이 비교적 높아 고도화된 인간의 면역시스템을 재현할 수 없고, 재현 가능하더라도 대표적인 혈구세포(human CD45) 위주의 성능만 측정 가능할 뿐이다.
본 발명은 인간 줄기세포가 이식된 마우스에 세팔로스포린계 항생제 및 플루오로퀴놀론계 항생제를 투입하여 면역세포를 부스팅함으로써 이식된 인간의 세포 특이적 활성을 유도하고 숙주의 면역을 최대한 억제하여 안정적이며 장기적인 인간의 면역시스템을 유지 및 보존할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 인간 줄기세포가 이식된 마우스는 면역부전 마우스에 인간 줄기세포가 이식된 것일 수 있다.
상기 면역부전 마우스는 중증 복합 면역결핍 (severe combined immunodeficiency: SCID) 돌연변이 및 인터루킨-2Rγ(IL-2Rγ) 대립인자 돌연변이 (γ null)에 대하여 이중 동형접합 (double homozygous)인 비-비만 당뇨병 (non-obese diabetic: NOD) 마우스를 말한다. SCID 돌연변이는 기능적 B 세포 및 T 세포의 결손을 야기시키는 돌연변이를 말한다. 예를 들면, SCID 마우스 (C.B.-17-Prkdcscid)는 B 세포 수용체 (B cell receptor: BCR) 및 T세포 수용체(T cell receptor: TCR)의 재배열에 결함이 있어, 기능적 B 세포 및 T 세포의 결손이 야기된다. 상기 면역부전 마우스는 NSG(NOD scid gamma), NOD/SCID γnull 마우스 또는 NOD/SCID IL-2RγKO 마우스라고도 한다. NSG마우스는 잭슨 라보라토리 (The Jackson Laboratory)의 레오나르드 슐츠 박사 (Dr. Leonard Shultz)의 실험실에 개발되었다. 상기 NSG 마우스는 잭슨 라보라토리로부터 상업적으로 구입하거나, 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다 (Shultz LD, et al., J. Immunol. 2005; 169: 204-209). 예를 들면, NSG 마우스는 C57BL/6J-γ null 마우스와 NOD/SCID 마우스를 9회 역교배 (backcross mating)하여 얻어질 수 있다. NSG 마우스는 기능적 T 세포 및 기능적 B 세포가 결여되어 있고, 대식구 기능이 감소되어 있고, NK 세포 또는 NK 활성이 제거되어 있고, 수지상 세포 기능이 감소되어 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 인간 줄기세포가 이식된 마우스는 prkdc scid(DNA-PKcs Severe Combine Immuno Deficiency) 기반의 IL2수용체 공통 감마체인( IL2 receptor common gamma chain)이 결손 또는 돌연변이된 마우스, RAG2(Recombination activating gene2) 유전자가 결손 또는 돌연변이된 마우스, 또는 B2m(Beta-2-microglobulin)이 결손 또는 돌연변이된 마우스에 인간 줄기세포가 이식될 수 있다.
여기서, 상기 인간 줄기세포는 인간 태아간 또는 제대혈 유래 CD34+ 조혈모세포(hematopoietic stem cell)인 것이 바람직하다.
본 발명은 인간 줄기세포가 이식된 마우스에 세팔로스포린계 항생제 및 플루오로퀴놀론계 항생제를 투입함으로써 면역세포를 부스팅하여 면역활성이 장기간 유지될 수 있도록 한 점에 특징이 있다.
즉, 본 발명의 세팔로스포린계 항생제 및 플루오로퀴놀론계 항생제의 2중 조합에 의한 면역세포 부스팅을 통해 숙주의 면역은 최대한 억제하고 동시에 이식된 인간의 세포는 활성을 유지하도록 함으로써 인간의 면역시스템 및 면역활성이 장기간 유지될 수 있다. 이때, 면역세포 부스팅 과정은 이식 후 4주간 유지하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기서, 세팔로스포린계 항생제는 0.1mg/ml~10mg/ml, 플루오로퀴놀론계 항생제는 0.3mg/ml~5mg/ml인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 인간 줄기세포가 이식된 마우스는, 부설판(Busulfan) 및 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)를 포함하는 숙주와 공여세포 간의 대사 교란 억제를 위한 화합물이 투입된 마우스에 인간 줄기세포를 이식한 마우스인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 종래의 고선량방사선 노출로 인해 조직 및 세포에 손상이 가해져 대사 교란 유발로 인한 생존율이 낮아지는 문제점을 해소하기 위하여 항암제와 면역억제제(busulfan + cyclophosphamide)를 사용하여 항암제의 효능은 역이용하고 숙주의 면역억제를 최소화하는 방식을 채택하였다. 즉, 종래의 방식은 방사선 기반 골수 억제 및 줄기세포 이식을 통해 혈액분석을 진행하는 방식인 반면, 본 발명은 화합물을 활용한 골수억제, 줄기세포 이식 및 면역 부스팅을 통해 혈액분석을 진행하는 방식이다. 본 발명의 화합물을 통한 방식으로 인해 숙주의 실제 골수세포만 억제하는 방식으로 장기적이고 안정적인 모델 획득에 매우 용이한 단계로 사용된다. 이로 인해 줄기세포 이식과정 역시 기존 방식에 비하여 1/10~1/100 수준의 세포를 사용함으로써 소량의 사용만으로 고효율이 가능하다는 장점이 있다.
이와 같이, 본 발명은 인간의 면역시스템을 이종 동물에게 이식 및 유지하기 위하여 숙주에게 위험 요소가 되는 다양한 요인을 최소화한 결과 최종 혈액 분석과정 역시 다양한 면역세포 특이적 마커로 확인 가능하다는 장점이 있다.
한편, 본 발명은 마우스에 대사 교란 억제를 위한 화합물을 투입하는 단계(S10); 상기 대사 교란 억제를 위한 화합물이 투입된 마우스에 인간 줄기세포를 이식하는 단계(S20); 및 상기 인간 줄기세포가 이식된 마우스에 세팔로스포린계 항생제 및 플루오로퀴놀론계 항생제를 투입하여 면역부스팅을 하는 단계(S30); 를 포함하는, 인간 줄기세포 이식 및 면역 부스팅에 기반한 인간면역화 마우스의 제조 방법을 제공한다.
상기 S10단계에서, 상기 대사 교란 억제를 위한 화합물은 부설판(Busulfan) 및 시클로포스파미드(Cyclophosphamide)를 포함할 수 있다.
상기 S20단계는, 상기 대사 교란 억제를 위한 화합물이 투입된 마우스에 인간 줄기세포의 수를 조절하여 이식함으로써 상기 마우스 내 인간 특이적 면역화 비율을 제어하는 단계(S22);를 포함할 수 있다.
이때, 상기 인간 줄기세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)이고, 상기 인간 줄기세포는 상기 마우스의 정맥을 통하여 투여함으로써 이식될 수 있다.
본 발명은 상기 마우스에 항원을 면역접종하는 단계; 및 상기 면역접종된 마우스의 혈청으로부터 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 마우스에 항원을 면역접종하는 단계; 및 상기 면역접종된 마우스로부터 상기 항원에 결합하는 항체를 생산하는 B 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 항원에 결합하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 면역부전마우스를 대상으로 인간면역화 마우스 제조를 수행하여 제조 전과 후를 비교한 결과, 숙주의 혈중 human-specific CD45 marker(인간 특이적 혈구세포 표면 표지자)의 비율이 80% 이상을 나타내었다. 또한, 종래의 인간면역화 마우스 대비 본 발명의 마우스를 대상으로 혈중 인간 특이적 혈구세포 표면 표지자의 비율을 확인한 결과 월등히 높은 비율을 보유하고 있음을 확인하였다. 또한, 숙주 내의 인간의 림프계 면역세포를 특정하여 하위 정밀한 면역세포의 분포를 확인한 결과, 적응 면역 T세포, 보조 T세포, 세포독성 T세포, NK세포, NKT세포, B세포 등이 확인되었다.
따라서, 본 발명을 통해 정량적 성능 측면에서 향상되었으며 제조 단계의 안정성과 가공법이 확립되었다. 또한 본 발명을 통해 배치별 동일한 성능을 확보한 실험 개체를 생산 및 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 인간면역화 마우스 및 그 제조 방법에 따르면, 마우스 내의 인간의 혈구세포 비율, 숙주 내 인간의 면역세포비율 및 생존 유지력을 높인 인간 줄기세포가 이식된 고도화 인간면역화 마우스를 제공할 수 있다.
또한, 숙주에게 공여되는 인간 세포와 대사 교란 억제를 위한 화합물을 마우스에게 적용하여 이식 거부 반응을 최소화하고 최적의 줄기세포 이식(최소 및 최적의 이식량)을 통한 고도화된 인간면역화 마우스를 제공할 수 있다.
본 발명은 의약품의 보다 적합한 개발 전략을 위해 인간의 면역체계를 고도로 보유한 인간면역화 마우스 제조 기술에 적용할 수 있다. 본 발명의 인간의 면역시스템이 고도화로 탑재된 인간면역화 마우스는 다양한 인간의 질환을 특이적으로 대변하고 바이오 의약품에 대한 인간의 면역세포의 활성/비활성 추적 등 동태, 약효능 및 안정성 평가에 대해 면밀히 검증할 수 있는 바이오 소재로 활용될 수 있다.
도 1a 내지 도1c는 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주의 면역 억제에 따른 면역결핍(부전) 영향을 설명하는 도면이다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간의 줄기세포의 (CD34-positive HSCs) 정보 및 해당 세포의 활성도를 나타내는 도면이다.
도 3a 내지 도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간의 줄기세포(CD34-positive HSCs) 이식 및 면역부스팅을 설명하는 도면이다.
도 4a 내지 도 4e는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간면역화 제조기술에 따른 개체의 성능(혈구세포의 활성)을 설명하는 도면이다.
도 51a 내지 도 54f는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간면역화 제조기술에 따른 개체의 성능(B, T, NK & NKT의 활성)을 설명하는 도면이다.
도 6a 내지 도 6d는 본 발명의 비교예에 따른 이중조합처리 vs. 단독처리 기반 제조기술에 따른 개체의 성능(백혈구공동항원, B, T, NK & NKT의 활성)을 설명하는 도면이다.
도 7a 내지 도 7f는 본 발명의 비교예에 따른 이중조합처리 vs. 단독처리 기반 제조기술에 따른 개체의 성능(백혈구 공동항원, B, T, NK & NKT의 활성)을 설명하는 도면이다.
도 8a 내지 도 8b는 본 발명의 비교예에 따른 이중조합 부스터 농도에 따른 개체의 성능 및 생존율을 설명하는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주와 공여세포 간의 대사 교란 억제를 위한 화합물이 투입된 마우스의 면역억제 효과를 나타내는 도면이다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간의 줄기세포의 (CD34-positive HSCs) 정보 및 해당 세포의 활성도를 나타내는 도면이다.
도 3a 내지 도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간의 줄기세포(CD34-positive HSCs) 이식 및 면역부스팅을 설명하는 도면이다.
도 4a 내지 도 4e는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간면역화 제조기술에 따른 개체의 성능(혈구세포의 활성)을 설명하는 도면이다.
도 51a 내지 도 54f는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간면역화 제조기술에 따른 개체의 성능(B, T, NK & NKT의 활성)을 설명하는 도면이다.
도 6a 내지 도 6d는 본 발명의 비교예에 따른 이중조합처리 vs. 단독처리 기반 제조기술에 따른 개체의 성능(백혈구공동항원, B, T, NK & NKT의 활성)을 설명하는 도면이다.
도 7a 내지 도 7f는 본 발명의 비교예에 따른 이중조합처리 vs. 단독처리 기반 제조기술에 따른 개체의 성능(백혈구 공동항원, B, T, NK & NKT의 활성)을 설명하는 도면이다.
도 8a 내지 도 8b는 본 발명의 비교예에 따른 이중조합 부스터 농도에 따른 개체의 성능 및 생존율을 설명하는 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주와 공여세포 간의 대사 교란 억제를 위한 화합물이 투입된 마우스의 면역억제 효과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 바람직한 실시예를 상세하게 설명하고자 한다. 본 발명은 본 발명의 정신 및 필수적 특징을 벗어나지 않는 범위에서 다른 특정한 형태로 구체화될 수 있음은 당업자에게 자명하다. 별도로 정의 되지 않는 한 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 화학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
<실시예>
실시예 1: 숙주의 면역 억제에 따른 면역결핍(부전) 영향
인간면역화 마우스 제조를 위하여 숙주 개체의 효율성을 극대화하기 위해 공여 개체(숙주: 실험동물)의 면역억제를 유도함으로써 인간 세포의 면역거부반응 억제를 극대화하는 과정이 필수적이다. 본 시험을 위하여 생후 4주차(4주령)의 비면역부전마우스인 Balb/C 마우스(정상대조군)와 면역부전마우스(NOD-scid IL2Rgammanull/mutation/KO/KD, NOD-scid IL2Rgnull, NOD.Cg-Prkdc scid IL2rg tm1wijl /SzJ, NOD-scid IL2;면역부전마우스마우스) 그리고 인간면역화 기술을 도입한 실험동물을 대상으로 본 시험을 수행하였다. 본 검증 연구에 사용된 개체 수는 그룹당 10수의 마우스로 구성되어 평가되었다.
도 1a를 참조하면, 호스트의 면역억제 기술력 검증과 관련하여, 면역 제어 전/후에 따른 혈중 백혈구 공통항원의 변화를 추적하기 위하여 1) 정상대조군(비면역부전마우스인 Balb/C), 2) 면역부전마우스(NOD-scid IL2Rgammanull/mutation/KO/KD, NOD-scid IL2Rgnull, NOD scid gamma, 3) 면역부전마우스 기반 추가 면역억제 그룹(면역부전마우스에 세팔로스포린계 항생제 및 플루오로퀴놀론계 항생제를 투입)을 대상으로 혈중 마우스 특이적 CD45 항원의 변화를 관찰하였다. CD45는 백혈구공통항원으로 인간을 포함한 모든 동물에서 존재하는 항원으로 종 특이성을 지니는 항원이다. 인간의 백혈구 공통항원은 human-specific CD45이고, 마우스의 경우 mouse-specific CD45라 한다.
도 1b를 참조하면, 검증 결과 정상대조군과 면역부전마우스 그룹에서 마우스 특이적 백혈구공통항원의 발현이 우세하게 확인된 반면, 추가면역억제를 시행한 그룹에서 마우스 특이적 백혈구공통항원의 발현이 현저하게 감소되고 있음을 확인하였다. 면역억제를 유도하지 않은 대조군 그룹에서 혈중 마우스백혈구공통항원(mCD45)이 높게 유지되고 있는 반면, 면역억제를 유도한 그룹에서는 마우스의 백혈구공동항원의 발현이 현저히 감소하는 경향을 보였다.
도 1c를 참조하면, 사용된 항체의 불특정 결합 여부를 확인하기 위하여 표적마커의 특이도 및 정확도를 인간의 혈액과 마우스 개체의 혈액으로 분석하였다. 분석한 결과 마우스-백혈구공통항원은 인간의 혈액세포에서 음성으로, 마우스의 혈액세포에서는 100% 양성발현을 하였다. 이는, 본 시험에 사용된 항체가 개체 마우스 혈구 세포 특이적 결합도가 매우 우수한 항체로 평가되었음을 의미하며, 제시된 결과는 정확한 결과임을 의미한다.
실시예 2: 인간의 줄기세포의 (CD34-positive HSCs) 정보 및 해당 세포의 활성도
인간의 세포를 마우스 개체에 이식하기 전단계에서, 이식에 사용되는 세포주의 활성도 및 오염 여부를 확인하였다. 도 2a를 참조하면, 본 평가을 위해 사용한 줄기세포 시료는 총 3개로, human CD34-positive Hematopoetic Stem Cells(제대혈 유래 조혈모줄기세포)이다. 3개의 세포주 내 HIV(후천성면역결핍증;AIDS), HBV(B형간염), HCV(C형간염) 감염 여부는 음성이었고, 해당세포의 활성도는 93~95% 이상 이었다. 도 2B를 참조하면, 줄기세포 이식 직전 본 연구에 사용된 세포주의 실제 순도와 활성도를 유세포분석법(Flowcyto Metry)과 생존세포계수법(live cell counting)으로 확인한 결과, 인간의 CD34 양성인 조혈모세포는 99.4%, 99.3%, 99.6%로 고순도의 줄기세포임을 확인하였다. 또한, 이들의 세포의 활성도 역시 95% 이상인 것으로 검증되었으며, 인간 외 이종의 세포는 오염되지 않은 순수한 HSC임을 확인하였다.
실시예 3: 인간의 줄기세포(CD34-positive HSCs) 이식 및 면역부스팅
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 인간면역화 제조 방식에 대한 모식도이다. 도 3a를 참조하면, 본 발명의 인간면역화 마우스 제조 기술은 총 4단계의 과정을 통해 재구성된다. 즉, 1단계는 숙주의 면역억제 단계이고, 2단계는 줄기세포 이식 단계이며, 3단계는 공여세포의 부스팅 단계이고, 4단계는 혈중 분석을 통한 성능 검증단계이다.
도 3b를 참조하면, 줄기세포 이식을 위하여 HSC 1x103 ~ 1x105 (1,000개~50,000개의 세포를 꼬리미정맥으로 주입하여 체순환 (정맥→심실→동맥→모세혈관)을 유도한다.
도 3c를 참조하면, 공여세포 이식 24시간 이후 세팔로스포린계(cephalosporin) 0.3mg/ml와 플루오로퀴놀론계(fluoroquinolone) 0.1mg/ml을 혼합하여 주 2회 4주간 투여하여 인간의 면역세포의 활성을 유도한다(총 8회 투여: 생후 8주차까지 수행).
도 3d를 참조하면, 줄기세포 이식 과정에서 마우스 1개체 기준으로 공여된 세포의 양을 조혈하여 인간면역화 마우스 제조 기술의 성능 제어력 검증을 수행하였다. 각각의 숙주에게 1,000개, 10,000개, 50,000개의 세포를 이식 후 8주 후(생후 12주차)에 인간의 면역시스템 재현성 여부를 평가하였다. 이를 위해 인간의 백혈구공통항원(human-specific CD45)으로 정량화하여 수치화하였다. 인간의 조혈모줄기세포를 1,000개 이식하였을 때 숙주 내에 인간 특이적 백혈구공통항원의 비율은 31.6%이고, 마우스 특이적 백혈구공통항원은 65.2%였다. 10,000개의 조혈모줄기세포가 이식되었을 경우 인간 특이적 백혈구공통항원 발현율은 63.3%이고, 마우스 특이적 백혈구공통항원5의 발현율은 35.7%이다. 또한 50,000개의 조혈모줄기세포가 이식되었을 경우 인간 특이적 백혈구공통항원의 비율은 98%이고, 1.3%의 마우스 특이적 백혈구공통항원은 1.3%인 것으로 평가되었다. 즉, 인간 면역화 제조 기술을 통해 1,000개 내지 50,000 개의 이식을 통해 숙주내 인간의 면역시스템 재현성은 약 30%, 60%, 90% 이상으로 구성 및 제조 할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 대사 교란 억제를 위한 화합물이 투입된 마우스에 인간 줄기세포의 수를 조절하여 이식함으로써 상기 마우스 내 인간 특이적 면역화 비율을 제어할 수 있는 장점이 있다.
실시예 4: 인간면역화 제조기술에 따른 개체의 성능(혈구세포의 활성)
인간 줄기세포가 이식된 마우스에 세팔로스포린계 항생제 및 플루오로퀴놀론계 항생제를 투입(이중조합 부스팅)하여 제조된 인간면역화 제조 기술에 따른 인간의 면역시스템의 재현적 성능을 검증하기 위하여 비인간면역화 그룹(정상대조군)과 인간면역화 마우스 그룹(생후 12주차 시점)에 대하여 인간/마우스 특이적 백혈구공동항원(mouse/human-specific CD45)으로 평가되었다.
도 4a를 참조하면, 정상대조군(비인간면역화 그룹)에서는 마우스 특이적 혈구세포의 발현만 관찰될 뿐 인간의 세포는 발견되지 않았다. 반면 인간면역화 마우스 그룹에서는 인간 특이적 CD45가 평균 87.9% 로 검출되었고, 마우스 특이적 CD45의 발현율은 평균 10% 이하로 한 개체 내에 2종의 세포가 관찰되는 것이 특징이다.
도 4b 및 도 4c를 참조하면, 인간면역화 제조 기술 전후에 따른 동일 개체의 성능을 추적한 검증 데이터로서, 제조 기술 적용 전단계에서는 숙주의 백혈구공동항원의 발현(98.5%)만 관찰된다. 하지만 인간화 8주차부터는 숙주와 인간의 혈액이 함께 검출되며, 인간의 백혈구공통항원의 발현이 지속적으로 증가하고 유지된다. 즉, 8주차 시점에 인간의 백혈구공통항원 특이적 발현양은 78%, 12주차에 91%, 20주차에 92.7%, 30주차에 89.1%, 40주차에 88%으로 수준이고, 반대로 숙주의 백혈구공통항원의 발현은 8주차에 13.7%, 12주차에 8.7%, 20주차에 7.6%, 30주차에 10.8%, 40주차에 11.9%로 평가 되었다.
도 4d를 참조하면, 도 4d는 인간화 전후 단계에 따른 모든 개체에 대하여 인간 특이적 백혈구공통항원의 발현양과 유지 기간에 대한 분산형 및 막대형 모식도이다. 도 4e는 본 실시예에 사용된 모든 개체의 인간의 백혈구공통항원 특이적 발현율을 정량화하여 수치화한 결과이다.
실시예 5: 인간면역화 제조기술에 따른 개체의 성능(B, T, NK & NKT의 활성)
인간면역시스템이 재현성 높게 탑재된 실험동물 개체 내에서 인간 특이적 주요한 림프계열의 면역 세포의 구성 또는 활성 여부를 평가하기 위하여 특정 면역세포들의 표면항원을 활용하여 B세포, T세포, T세포 하위인자(세포독성T세포, 도움T세포), NK세포, NKT세포를 평가하였다.
도 51a를 참조하면, 숙주 내의 혈중 전체B림프구(CD45+/CD19+/CD3-)의 세포를 유세포분석법으로 확인한 결과 대조군에서는 인간 특이적 세포의 발현은 감지되지 않았다. 반면 인간면역화마우스 그룹은 8주차에 평균 0.4%를 시작으로 12주차에 61.6%, 20주차에 51%, 30주차에 53.4%, 40주차에 52.8%로 강한 증가세와 유지력을 나타내었다. 도 52a는 모든 개체의 B세포 특이적 발현양에 정량적인 수치 결과로 생후 8주차부터 40주차까지 추적한 결과이다. 도 53a 및 도 54a는 모든 그룹의 평균 전체B세포의 발현 수치를 정량적으로 기술하였고 대조군과 시험군의 막대차트로 성능을 제시하였다.
도 51b는 혈중 전체T림프구(CD45+/CD3+) 특이적 세포의 발현을 유세포분석법을 통하여 확인한 결과로서, B세포와는 다르게 8주차부터 활성이 관찰되었다. T세포의 활성은 8주차 기준 27.4%에서 12주차에 35.6%로 강하게 증가세를 나타내었다. 30주차에 52.5%로 가장 높은 활성을 유지하다 30주차와 40주차에 걸쳐 각각 48.1%, 44.7%의 수치를 기록하였다.
도 52b는 모든 개체의 T세포 특이적 발현양에 정량적인 수치 결과로서, 생후 8주차부터 40주차까지 추적한 결과이다.
도 53b 및 도 54b는 각 그룹의 평균 전체 T세포의 발현 수치를 정량적으로 기술하였고 대조군과 시험군의 막대차트로 성능을 제시하였다.
도 51c를 참조하면, T림프계열 세포 중 도움T세포(CD45+/CD3+/CD4+) 특이적 세포의 발현을 유세포분석법을 통하여 확인한 결과, 8~12주까지 체내 극소량 존재하다 20주부터 강하게 증가세를 나타내었다. T림프계열의 세포는 능동면역에 속하는 세포로서, 특정 도움T세포로 성숙 및 분화되는데 소요시간이 필요하다. 도 52c는 그룹 내의 모든 개체의 발현율과 지속 흐름을 기술하였고, 도 53c 및 도 53c는 평균 도움T세포의 발현양이 8주차에 0.5%, 12주차에 3.2%로 소폭 증가하고 20주차에 32.1%, 30주차에 30.3%, 40주차에 26.9%를 나타내었으며, 대조군과 시험군의 막대차트로 성능을 제시하였다.
도 51d를 참조하면, T림프계열 세포 중 세포독성T세포(CD45+/CD3+/CD8+) 특이적 세포의 발현을 유세포분석법을 통하여 확인한 결과, 8주부터 40주까지 증가 및 유지되는 양상을 확인하였다. 세포독성T세포는 바이러스나 체세포 및 종양세포를 파괴하는 세포로 도움T세포의 활성을 자극하는 세포로 알려져 있다. 도 52d는대조군을 포함한 모든 개체의 발현율의 결과를 나타내며, 도 53d 및 도 54d를 참조하면, 인간면역화마우스의 혈중 세포독성T세포의 발현율은 평균값으로 8주차에 6.0%, 12주차에 7%, 20주차에 14.3.%, 30주차에 17.7%, 40주차에 15.2%를 나타내었고, 상기 결과는 막대차트로 나타내었다.
도 51e를 참조하면, T림프계열 세포 중 자연살상세포(CD45+/CD3-/CD56+) 특이적 세포의 발현을 유세포분석법을 통하여 숙주 내의 구성 정도 및 활성 정도를 확인하였다. NK세포는 선천면역을 담당하는 주요한 세포로 세포독성T세포의 역할과 유사하고, 감염 후 3일째 작용되며 감염된 세포의 반응을 빠르게 영향을 주어 세포자멸사를 유도한다. 도 52e는 모든 개체의 T세포 특이적 발현양에 정량적인 수치 결과로 생후 8주차부터 40주차까지 추적한 결과이다. 혈중 자연살상세포의 발현율은 평균 8주차 1.4%, 12주차 5.2%, 20주차 5.5.%, 30주차 5.4%, 40주차 5.0%를 기록하였다. 도 52e를 참조하면, 8주 평균1.4%, 12주 평균 5.2% 사이에서 발현이 3.8% 증가하였고, 전반적으로 12주에서 40주 사이에 큰 변화 없이 5%의 수준으로 유지되고 있음이 관찰되었다.
도 53e 및 도 54e는 각 그룹의 평균 전체 자연살해세포(NK세포)의 발현 수치를 정량적으로 기술하였고, 대조군과 시험군의 막대차트로 성능을 제시하였다.
도 51f를 참조하면, T림프계열 세포 중 자연살해T세포(CD45+/CD3+/CD56+) 특이적 세포의 발현을 유세포분석법을 통하여 숙주 내의 구성 정도 및 활성 정도를 확인하였다. NKT세포는 T세포와 자연살해세포의 특성을 공유하는 T세포 그룹이다. 그 결과, 8주차(평균 17.6%)부터 12주(평균 22.4%) 사이에 강한 발현을 보이나, 20주 시점부터 빠른 감소세를 보이며, 40주차에서 대조군과 비슷한 양상을 보인다. 대조군을 포함한 모든 개체의 NKT마커의 발현율은 도 52f와 같으며, 8주차에 17.6%, 12주차에 22.4%, 20주차에 9.4.%, 30주차에 2.5%, 40주차에 0.9%를 나타내었고, 해당의 결과는 막대차트로 제시하였다.
비교예 1: 이중조합처리 vs. 단독처리 기반 제조기술에 따른 개체의 성능(백혈구공동항원, B, T, NK & NKT의 활성)
공여 세포의 활성을 이중조합(세팔로스포린계+플루오로퀴놀론계 기반) 또는 단독(세팔로스포린 또는 플로오로퀴놀론계)으로 부스팅하였고, 각 투여법에 따른 인간의 면역시스템의 성능을 검증하였다. 공여세포의 활성부스팅(생후 4주차에 인간의 공여세포 이식, 이식 다음날 부스팅 시행)은 4주간 주 2회 시행하였고, 생후 12주차 시점에 인간 특이적 백혈구공통세포항원(human CD45)으로 성능을 비교 및 분석하였다.
도 6a는 유세포분석법을 통하여 인간/마우스 특이적 백혈구공통항원(human/mouse-specific CD45)을 표적하여 분석한 결과로서, 대조군과 이중조합 부스팅 또는 단독 부스팅그룹을 대상으로 전면 평가하였다. 대조군(비인간면역화그룹)에서는 마우스 특이적 CD45의 발현만 관찰되는 반면, 이중조합 또는 단독 부스팅 그룹에서 모두 인간과 마우스의 세포 발현이 확인되었다.
도 6b는 본 발명의 실시예에 따른 이중조합 부스팅을 시행한 경우로서, 백혈구 공통세포항원이 8주차에 평균 87.9%, 12주차에 90.5%, 20주차에 81.7%, 30주차에 89.1%, 40주차에 87.9%로 가장 높은 수치를 나타내었다. 반면, 단독투여그룹 중 세팔로스포린계열을 4주간 투여한 경우, 8주차에 평균 71.6%, 12주차에 74.6%, 20주차에 78.6%, 30주차에 72.2%, 40주차에 61.0%를 기록하였다. 또한 단독 투여그룹인 플루오로퀴놀론계를 4주간 투여한 그룹은 8주차에 평균 70.6%, 12주차에 77.2%, 20주차에 78.2%, 30주차에 74.8%, 40주차에 74.9%로 나타났다. 도 6c 및 도 6d는 각 그룹의 성능을 비교/분석하기 위하여 모든 그룹의 정량적 발현값을 막대차트 또는 꺽은선형 그래프로 분석한 결과로서, 세팔로스포린계 또는 플루오로퀴놀론계 단독으로 면역세포의 부스팅 하였을 때보다 이중조합 부스팅으로 인한 인간의 면역계 재현성이 강하게 유도될 수 있음을 확인하였다.
비교예 2: 이중조합처리 vs. 단독처리 기반 제조기술에 따른 개체의 성능(백혈구 공동항원, B, T, NK & NKT의 활성)
도 7a를 참조하면, (세팔로스포린계+플루오로퀴놀론계 기반) 이중조합 부스팅 또는 단독(세팔로스포린 또는 플로오로퀴놀론계) 부스팅에 따른 다양한 면역 세포들의 활성 여부를 평가하기 위해 림프계의 주요세포인 B세포, T세포, NK세포, NKT세포를 정밀 분석하였다. 분석법은 유세포분석법으로 분석을 시행하였고, 평가를 위한 시점은 모든 면역세포의 활성이 가능한 12주차와 검증 종료 시점인 40주차를 기준하였다. 앞서 시행한 분석과 동일하게 유세포분석법을 통하여 전체B세포(CD45+/CD3), 전체T림프구(CD45+/CD3+) 그리고 T세포의 기능적 하위 유닛인 도움T림프구(CD45+/CD+3/CD4+), 세포독성T림프구(CD45+/CD+3/CD8+), 자연살해세포(CD45+/CD3-/CD56+) 및 자연살해T세포(CD45+/CD3+/CD56+)의 발현을 검정하였다. 그 결과 대조군에서는 인간 특이적 세포의 발현이 관찰되지 않았으며, 이중조합 또는 단독 부스팅에 따른 인간의 면역세포의 발현이 관찰되었다. 그러나 이들 중 단독부스팅에 비하여 이중조합 부스팅을 유도한 그룹에서 보다 높은 림프계의 세포 발현이 확인되었다.
도 7b는 이중조합 부스팅 및 단독 처리에 따른 주차 별 혈중 다양한 면역세포의 평균 정량적 수치 결과를 제시한 결과로서, 추적 기간은 12주차, 20주차, 30주차, 40주에 거쳐 모두 검증되었으며, 모든 혈액에서 공통적으로 발현하는 백혈구공통항원(CD45)를 포함한 림프계열 세포들의 발현 양을 정량적으로 평가하였다. 도 7c는 도 7b의 정량적 수치를 막대차트로 나타낸 것으로, 전체B세포, T세포, NK세포, NKT세포 모두 단독부스팅 방법에 비하여 높은 수준으로 활성을 유도 및 유지하고 있음을 나타내고 있다.
도 7d는 이중부스팅(Cephalosporin/Flueoroquinolone) 기반 모든 인간면역화 마우스 개체의 정량적 면역세포 분석표이고, 도 7e는 단독부스팅(cephalosporin) 기반 모든 인간면역화 마우스 개체의 정량적 면역세포 분석표이며, 도 7f는 이중부스팅(Fluoroquinolone) 기반 모든 인간면역화 마우스 개체의 정량적 면역세포 분석표이다.
비교예 3: 이중조합 부스터 농도에 따른 개체의 성능 및 생존율
본 발명의 바람직한 이중조합 부스터 농도는 플루오로퀴놀론계(fluorquinolone) 0.3mg/ml~5mg/ml 및 세팔로스포린계(Cephalosporin) 0.1~10mg/ml 이다.
모든 그룹에서 생후 4주차 이중조합 또는 단독 부스팅에 따른 생존율은 도 8b와 같으며, 대조군(비인간화마우스 그룹) 대비 이중조합 부스팅을 처리한 그룹의 생존율은 가장 안정적이고 장기적이었다.
저용량의 농도(플루오로퀴놀론계: 0.09mg/ml 또는 세팔로스포린계 0.04mg/ml)로 처리하였을 때 체내로 유입된 공여세포와 숙주의 세포간의 면역거부반응으로 인하여 실험개체의 이식편대숙주병이 유발되어 개체의 수가 급격하게 감소하였다. 즉, 최저 용량치의 세팔로스포린계 0.05mg/kg, 플루오퀴놀론계의 0.1mg/kg 이하로 적용되는 경우, 체내로 전달되는 약물 효능 부족으로 공여 세포에 충분한 면역신장이 유도되지 않아 숙주의 면역과 면역거부반응(이식편대 숙주병 유발)이 유발될 수 있다.
반면 고용량으로 해당 약물을 단독 처리 하였을 경우((플루오로퀴놀론계: 5.5mg/ml 또는 세팔로스포린계 10.5mg/ml), 두드러기 설사, 아낙필락시스 등으로 인한 약물 오남용성 부작용이 증가하여 일정 시간이 경과됨에 따라 생존율이 감소하는 경향을 보였다. 숙주(실험동물)에게 최대 용량치의 세팔로스 포린계 10mg/kg, 플루오퀴놀론계의 5mg/kg 이상으로 적용되는 경우, 체내로 전달되는 약물 효능의 오남용으로 내성유전자의 수평전달 및 내재적 돌연변이가 유발될 수 있고 부작용(피부염증, 두드러기, 설사 등)이 발생될 수 있어 이식된 미분화된 조혈모세포에 손상 또는 충분한 면역신장이 곤란하게 될 수 있다.
비교예 4: 대사 교란 억제를 위한 화합물이 투입된 마우스의 면역억제(병용억제) 효과
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 숙주와 공여세포 간의 대사 교란 억제를 위한 화합물이 투입된 마우스의 면역억제 효과를 나타내는 도면으로서, 실시예 1에 대한 비교예들이 대비되었다. 이때, 면역억제용 화합물인 부설판busulfan)은 40mg/kg, 시클로포스파미드(cyclophosphamide)는 100mg/kg을 투입하여 실험하였다.
도 9를 참조하면, 정상개체군(Balb/c 마우스로써 숙주 본래의 면역을 보유한 normal control) 및 면역부전마우스(NSG마우스로써 숙주 본래의 면역이 억제되어 있어 질환 재현성 실험 동물로 많이 사용하는 시험군의 대조군)에 비하여, 면역부전마우스에 면역억제화합물인 부설판(Busulfan)이 투입된 마우스가 더 효과적으로 면역억제가 되어 면역부전이 유도됨을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 면역부전마우스에 부설판 대신 시클로포스파미드(cyclophosphamide)가 단독으로 투입된 마우스의 경우, 부설판이 단독으로 투입된 마우스와 대등할 정도로 면역부전이 유도됨을 확인하였다.
한편, 도 9의 병용억제는 본 발명의 일 실시예로서, 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 면역부전마우스에 부설판 및 시클로포스파미드(cyclophosphamide)가 병용 투입된 마우스는 부설판 또는 시클로포스파미드(cyclophosphamide)가 단독 투입된 마우스에 비하여 현저하게 면역이 억제되어 면역부전이 유도됨을 확인하였다.
한편, 이상의 상세한 설명은 모든 면에서 제한적으로 해석되어서는 아니되고 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구항의 합리적 해석에 의해 결정되어야 하고, 본 발명의 등가적 범위 내에서의 모든 변경은 본 발명의 범위에 포함된다.
Claims (11)
- 마우스에 대사 교란 억제를 위한 화합물을 투입하는 단계(S10);
상기 대사 교란 억제를 위한 화합물이 투입된 마우스에 인간 줄기세포를 이식하는 단계(S20); 및
상기 인간 줄기세포가 이식된 마우스에 세팔로스포린계 항생제 및 플루오로퀴놀론계 항생제를 투입하여 면역부스팅을 하는 단계(S30);를 포함하고,
상기 인간 줄기세포를 이식하는 단계(S20)는, 상기 대사 교란 억제를 위한 화합물이 투입된 마우스에 인간 줄기세포의 수를 조절하여 이식함으로써 상기 마우스 내 인간 특이적 면역화 비율을 제어하는 단계(S22);를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 줄기세포 이식 및 면역 부스팅에 기반한 인간면역화 마우스의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 인간 줄기세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell)이고,
상기 인간 줄기세포는 상기 마우스의 정맥을 통하여 투여함으로써 이식되는 것을 특징으로 하는 인간 줄기세포 이식 및 면역 부스팅에 기반한 인간면역화 마우스의 제조 방법.
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|---|---|---|---|---|
| KR20050120863A (ko) | 2004-06-21 | 2005-12-26 | 한국생명공학연구원 | Ｈ-라스 과발현 마우스를 이용한 항암제의 항암활성검정방법 |
| KR20100118091A (ko) * | 2009-04-27 | 2010-11-04 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 인간화된 ｎｓｇ 마우스 및 그 제조 및 이용 방법 |
| KR20220061508A (ko) * | 2020-11-06 | 2022-05-13 | 의료법인 성광의료재단 | 골수억제를 이용한 인간화 동물모델의 제조 방법 |
-
2023
- 2023-03-28 KR KR1020230040671A patent/KR102613264B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050120863A (ko) | 2004-06-21 | 2005-12-26 | 한국생명공학연구원 | Ｈ-라스 과발현 마우스를 이용한 항암제의 항암활성검정방법 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
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