KR20210104681A - 그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 부재 하에 면역요법의 항암 유효성을 연구하기 위해 종양 세포로 그래프트된 알의 용도 - Google Patents

그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 부재 하에 면역요법의 항암 유효성을 연구하기 위해 종양 세포로 그래프트된 알의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 부재 하에, 항암 유효성을 조사하거나 면역치료 분자를 스크리닝하기 위해 종양 세포로 그래프팅된 발육란 모델의 용도에 관한 것이다.

Description

그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 부재 하에 면역요법의 항암 유효성을 연구하기 위해 종양 세포로 그래프트된 알의 용도
본 발명은 면역-종양학 분야, 특히 암 환자에게 유효성(effectiveness) 면에서 가장 유망한 면역요법(immunotherapy)을 처방하기 위한 개인 맞춤형(personalised) 의약에 관한 것이다.
암 치료에 이미 존재하는 치료 해결법 (수술, 방사선조사, 화학요법, 및 표적화 요법)에도 불구하고, 일부 악성 종양은 면역 체계가 종양에 작용할 수 있는 메커니즘이 발견될 때까지 치유 불가능한 상태로 남아 있었다.
상기 분야의 이들 발전으로 인해 면역요법으로 칭해지는 신규 치료 접근법이 개발되었으며, 이 면역요법은 면역 체계를 재활성화시키거나 자극하여 종양 세포를 특이적으로 공격한다.
면역요법의 관심사 중 하나는 주어진 유형의 암에 의존하는 것이 아니라, 종양에서의 유전적 프로파일과 특이적 바이오마커 (PDL-1 유형)의 존재에 의존하는 치료법을 개발하는 것이다. 따라서 이들 치료는 개인 맞춤형 의학을 향한 제1 단계인, 환자의 프로필과 그의 종양을 고려한다.
2010년 이후 다양한 작용 과정이 고려되고 있으며 유망한 결과를 산출하였다:
- 세포독성 분자와 연관이 있는지 여부에 관계 없이, 모노클로날 항체의 사용,
- CTLA-4 억제제 (이필리무맙)의 사용과 같이, 개발 중인 면역 체계와 관련된 일부 메커니즘을 활성화시키거나 억제하기 위한 면역 체크포인트 억제제 (암 메커니즘에서 특이적으로 활성화되거나 억제된 경로의 체크포인트)의 사용,
- 특별히 비표적 면역요법, 예방적 또는 치유적 암 백신으로 종양 세포와 더 효과적으로 싸우기 위한 면역 체계의 자극,
- CAR-T 세포 (키메라 항원 수용체 T 림프구)와 같은 입양 세포 요법(adoptive cell therapy)의 사용이며, 이는 시험관내에서 환자의 세포를 수정한 다음에, 이를 환자에게 재주입하여 유망한 결과로, 종양과 싸우는 것을 목표로 한다.
대부분의 면역요법은 효과적인 면역 세포의 존재를 필요로 하며, 이는 이러한 분자의 시험관내 시험 가능성을 제한한다. 따라서 개발 단계는, 주로 마우스에서, 동물 모델로 빠르게 이동하고 있다.
자발적으로 종양이 발달하는 마우스 모델은 환자 종양에 존재하는 유전적 복잡성을 갖지 않아, 이는 임의의 치료 효과를 억제하거나 반대로 증폭할 수 있다. 그에 따라, 이는 결과를 인간에 외삽하는 것을 곤란하게 한다.
이종이식에 사용된 최초의 생체내 모델은 숙주 면역 체계에 의해 공격받지 않는 종양의 발달을 촉진하는 면역 결핍(immunodeficient) 마우스였다. 이어서 이들 마우스 모델은 인간 유전자의 발현 (녹-인(knock-in)을 통해 트랜스제닉(transgenic) 모델을 만들거나, 인간 조혈세포를 면역결핍 마우스에 그래프트(grafting)함으로써 '인간화'되었다. 그러나, 이들 모델은 몇 가지 단점, 예컨대 모델을 개발하는 데 필요한 시간 (임의의 결과를 얻기까지 수개월이 소요되는 시간), 또는 인간에서보다 더 빠른 종양 발달(tumour development) 속도 등을 가지며, 이 발달은 그것이 인간에서와 같이 종양 환경에서 만성 염증을 동반하지 않는다.
이러한 곤란함, 인간화 마우스 모델에서 조사를 수행하는 데 필요한 연관 비용 및 시간을 고려해서, 신규 면역요법의 유효성을 개발하고 검증하기 위해 다른 더 간단하고, 빠르며 더 신뢰할 수 있는 모델을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하기 위해 종양 세포와 함께, 특히 융모 요막 (chorioallantoic membrane; CAM)의 수준에서 그래프트된 조류 발육란(embryonated bird egg) 모델의 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 모델은 그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 존재를 배제한다.
바람직하게는, 면역치료 분자는 입양 세포 요법, 예컨대 CAR-T, 백신, 이중-특이적 항체, 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD1, 또는 항-PDL1, 또는 항 CTLA-4 항체로부터 선택된다.
특히, 그리고 암 환자 샘플로부터 종양 세포를 단리하는 경우, 여러 면역치료 분자의 시험은 그 환자에서 암 치료 유효성 면에서 가장 유망할 분자를 결정할 수 있게 한다.
이 발육란(embryonated egg)의 사용 범위 내에서, 그래프트된 종양 세포으로부터 발달한 종양 및 배아 전체 둘 다에서 시험된 면역치료 분자(들)의 독성을 결정하거나, 또는 심지어 정량화하는 것이 또한 가능하다.
본 발명은 또한
- 융모 요막 (CAM) 형성에 상응하고 닭 배아에서 적어도 8일의 발달에 상당하는 발달 단계 까지 이전에 인큐베이션된(incubated) 조류 발육란의 CAM의 수준에서 종양 세포를 그래프트하는 단계,
- 그래프트한 후 적어도 12시간에 면역치료 분자(들)를 발육란에 투여하는 단계,
- 그래프트된 배아에서 발달한 종양의 종양형성(tumourigenesis)에 대한 그렇게 투여된 면역치료 분자(들)의 효과를 조사하는 단계
를 포함하는 것,
그리고 그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 효과기 면역 세포의 부재 하에 그리고 상기 세포를 첨가하지 않고 구현하는 것
을 특징으로 하는, 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
- 융모 요막 (CAM) 형성에 상응하고 닭 배아에서 적어도 8일의 발달에 상당하는 발달 단계 까지 이전에 인큐베이션된 조류 발육란의 CAM의 수준에서 종양 세포를 그래프트하는 단계,
- 그래프트한 후 적어도 12시간에 후보 면역치료 분자(들)를 발육란에 투여하는 단계,
- 그래프트된 발육란에서 발달한 종양의 종양형성에 대한, 그렇게 투여된 면역치료 분자(들)의 효과를 조사하는 단계
를 포함하는,
항암 활성을 갖는 면역치료 분자의 스크리닝 방법에 관한 것이며,
그리고 상기 방법은 그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 효과기 면역 세포의 부재 하에 그리고 상기 세포를 첨가하지 않고 구현된다.
본 발명은 마지막으로, 암 환자 또는 동물을 모니터링(monitoring)하는 방법에 관한 것이며,
- T1 시점에 상기 환자 또는 동물로부터의 종양 세포를 사용하여, 상기 기재된 바와 같은 제1 조류 발육란을 제조하고, 이 제1 조류 발육란에서 발달하는 종양의 종양형성을 조사하는 단계,
- T2 시점에 동일한 환자 또는 동물의 샘플로부터의 종양 세포를 사용하여, 상기 기재된 바와 같은 제2 조류 발육란을 제조하고, 이 제2 조류 발육란에서 발달하는 종양의 종양형성을 조사하는 단계,
- 제1 및 제2 조류 발육란에서 발달한 종양의 종양형성을 비교하는 단계
를 포함하며,
상기 방법은 그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 부재 하에 그리고 상기 세포를 첨가하지 않고 구현된다.
본 발명은 종양 세포가 그래프트된 조류 발육란의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 존재를 배제한다.
본 발명에 따른 용도 및 방법은 종양 세포가 그래프트된 발육란의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 존재 또는 첨가를 결코 포함할 수 없다.
도 1은 종양 세포 침착 구역(deposition zone)과 주요 조직이 존재하는 발육란의 모델을 나타낸다.
도 2는 세포 그래프팅으로부터 샘플 수집까지 조사 타임라인의 예를 나타낸다.
도 3은 MDA-MB-231 세포로부터 시작된 종양에 대한 아테졸리주맙 (항-PD-L1 티쎈트릭(Tecentriq)) 처리 효과를 나타낸다.
도 4는 (A) MDA-MB-231 세포 또는 (B) SU-DHL-4 세포로부터 시작된 종양에 대한 펨브롤리주맙 (항-PD1 키트루다(Keytruda)) 처리 효과를 나타낸다.
도 5는 SU-DHL-4 세포로부터 시작된 종양에 대한 RMP1-14 (항-PD1) 처리 효과를 나타낸다.
도 6은 MDA-MB-231 세포로부터 시작된 종양에 대한 니볼루맙 (항-PD1 옵디보(Opdivo)) 처리 효과를 나타낸다.
도 7은 MDA-MB-231 세포를 그래프트한 후 하부 CAM에서의 전이에 대한 펨브롤리주맙 (항-PD1 키트루다) 처리의 효과를 나타낸다.
도 8은 아테졸리주맙 (항-PD-L1 티쎈트릭)으로 처리하거나 처리하지 않고 SU-DHL-4 세포로부터 수득된 종양에서 CD3 (A) 및 CD4 (B) 발현의 상대적인 양 (음성 대조군과 비교하여)을 나타낸다.
도 9는 펨브롤리주맙 (항-PD-1 키트루다)으로 처리하거나 처리하지 않고 SU-DHL-4 세포로부터 수득된 종양에서 CD3 (A), CD45 (B), CD56 (C) 및 CD8 (D) 발현의 상대적인 양 (음성 대조군과 비교하여)을 나타낸다.
도 10은 니볼루맙 (항-PD1 옵디보)으로 처리하거나 처리하지 않고 MDA-MB-231 세포로부터 수득된 종양에서 CD3 발현의 상대적인 양 (음성 대조군과 비교하여)을 나타낸다.
도 11은 E16에서 닭 배아의 말초 혈액 단핵 세포에서 유세포 분석에 의해 검출된 상이한 면역 세포 집단 (CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구 및 단핵구)을 나타낸다.
도 12는 펨브롤리주맙 (항-PD-1 키트루다®)으로 T 림프구를 처리한 후 인간 종양 세포 H460에 대한 닭 T 림프구의 세포독성 효과의 증가를 나타낸다.
본 발명은 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하기 위해, 종양 세포와 함께 특히 CAM의 수준에서, 그래프트된 조류 발육란의 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 모델은 그래프트된 난자의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포를 배제한다. 바람직하게는, 면역치료 분자는 입양 세포 요법, 예컨대 CAR-T, 백신, 이중-특이적 항체, 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD1, 또는 항-PDL1, 또는 항 CTLA-4 항체로부터, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 입양 세포 요법, 예컨대 CAR-T, 이중-특이적 항체, 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD1, 또는 항-PDL1, 또는 항 CTLA-4 항체로부터 선택된다. 유리하게는, 면역치료 분자는 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD1, 또는 항-PDL1, 또는 항 CTLA-4 항체로부터 선택된다.
융모 요막 (CAM) 수준에서 종양이 그래프트된 발육란, 특히 닭 모델은 이미 화학 요법, 펩티드 또는 나노입자와 같은 여러 유형의 항암 치료제의 유효성 및 독성 시험에 널리 사용되고 있다. 그러나, 이것은 암 환자 자신의 면역 체계의 활성화. 또는 보다 정확하게 재활성화에 의존하는 면역치료 항암 분자의 유효성을 시험하는 데 사용된 적이 없다.
본 발명자들은 놀랍게도 이 모델이 인간과는 매우 상이하고 많은 저자들이 닭 면역 체계가 미성숙하여 어떤 면역 반응을 야기하는 것이 불가능할 수 있는 것을 고려했을지라도, 그래프트된 알 면역 체계만을 사용하여 면역치료 분자의 유효성을 시험하는 데 동일한 방식으로 사용될 수 있음을 입증하였다. 따라서 본 발명에 따른 이 모델의 사용은 그래프트된 배아의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 부재 하에 및 추가 없이 구현된다. 따라서 이 구현은 그래프트된 난자의 면역 체계에만 의존한다. 이 모델의 이러한 구현은 기존 모델에 비해 다음과 같은 몇몇 이점을 갖는다:
- 비용 (마우스와 비교한 알의 비용 및 동물 하우스에서 몇 주 또는 몇 달 동안 그의 유지 관리);
- 발육된 그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 효과기 면역 세포의 존재 또는 추가를 필요로 하지 않는, 완전한 면역 체계의 존재.
더욱이, 이것은 배아 모델이기 때문에, 면역 체계가 여전히 발달하고 있다. 그럼에도 불구하고, 이 면역 체계의 성숙은 그래프트한 후 몇 시간 동안 치료용 면역 화합물에 의해 활성화되어 그의 유효성을 검증하기에 충분하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 발육란은 갈리포르메스(Galliformes) 또는 스트루티오니포르메스(Struthioniformes) 목의 조류의 알이다. 특히, 알은 순계류의 알, 특히 닭, 메추라기, 칠면조, 꿩, 공작, 뿔닭 또는 기타 농장 조류의 알인 것이 특히 바람직하다. 이는 또한 타조 알일 수 있다. 유리하게는, 본 발명에 따른 발육란은 계란 (갈루스 갈루스(Gallus gallus))이다.
본 발명의 범위 내에서, 용어 "발육란"은 적절한 조건, 특히 37℃ 내지 38℃ 온도의 인큐베이터에서, 배아가 발달할 수 있는 수정된 조류의 알을 지칭한다. 이들 조건 하에, 계란이 부화하는 데 필요한 인큐베이션 시간은 닭의 경우 21일이다.
여기에 보고된 발달 단계는 알의 수정 후 인큐베이션 시간, 특히 상기에 정의한 바와 같은은 적절한 조건 하에 인큐베이션 시간의 함수로서 정의된다.
"CAM의 수준에서 그래프트하는 것"은 상위 CAM이든 하위 CAM이든, CAM 상에 부가 또는 주사에 의해 투여를 지정하는 것을 의도한다.
본 발명에 따른 발육란 모델은 2개의 상이한 유기체 또는 이종이식으로부터 유래된 세포: "숙주" 또는 "수령자(recipient)" 조류로부터의 세포 및 "수령자" 조류의 것과 상이한 종의 인간 또는 동물 유기체로부터의 알에 그래프트된 종양 세포를 갖는다. 특히 바람직하게는, 조류 발육란에 그래프트된 종양 세포는는 인간 세포이다. 이어서 이들 그래프트된 세포는 하나 이상의 고형 종양을 형성함으로써 및/또는 알에서 이동함으로써 배아에서 발달할 것이다.
본 발명에 따르면, 종양 세포를 그래프트하는 것은 발육란의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행되며, 일단 그래프트된 상기 알의 사용은 그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 존재 및 추가를 배제한다.
정의에 의하면, "CAM의 수준에서 그래프트하는 것"은 일단 CAM이 형성되면, 정상 및 표준 성장 조건 하에, 닭에서 적어도 8일에 발달에 상당하는 단계에서 실시된다. 사용된 조류가 닭인 경우, 이 단계는 적어도 8일의 발달에 상응한다. 발달 일 수는 종마다 다를 수 있으며, 그래프트하는 것은 다양한 발달 기간 후에 발달할 수 있다. 예를 들어, 닭에서 적어도 8일의 발달 단계는 메추라기에서 적어도 6.5일의 발달 단계에 상응한다.
본 발명에 따라 사용된 그래프트된 배아는 부화하려는 의도가 아니므로 성체 유기체를 생성하도록 의도되지 않는 것으로 이해된다. 이는 면역치료 분자(들)의 효과를 조사하는 기간 동안에 동물 모델로서 단지 사용되며, 닭에서 21일의 발달에 상응하는 부화까지는 사용되지 않는다. 어떤 경우든, 본 발명에 따른 조류 배아는 부화 전과 그래프트된 종양 세포가 알에서 하나 이상의 종양을 발달시킨 후 시행중인 윤리 규칙에 따라 희생될 것이다.
그래프트된 종양 세포는 상이한 유형의 암의 종양 세포 주일 수 있지만, 암 환자의 종양 샘플, 예를 들어 환자의 종양 생검으로부터 또는 환자로부터의 종양 세포를 함유하는 임의의 다른 생물학적 샘플로부터 유래할 수도 있되, 단, 효과기 면역 세포가 제거된 것이며, 즉 생물학적 샘플로부터 종양 세포만 단리된 것이다.
본 발명의 범위 내에서, 효과기 면역 세포가 제거된 종양 세포주 또는 암 환자로부터의 생물학적 샘플을 그래프트할 때이든, 발육란 모델을 사용할 때 또는 본 발명에 따른 방법을 구현할 때 효과기 면역 세포를 첨가하지는 않을 것이다.
본 발명의 한 실시양태에 따르면, 암을 앓고 있는 환자 또는 동물의 샘플로부터 수득된 종양 세포는 발육란에 그래프트하기 전에 정제된 순환 종양 세포 (CTC)이다. 이러한 정제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 특히 Zheyu Shen et al., 2017에 의해 다양한 방법이 설명되었다. 비표적 림프구를 포획하고 CTC를 용출하는 것이 목적 일 때 소위 "음성"농축을 달성할 수 있다. 문헌 [Zheyu Shen et al., 2017]에 의해 다수의 상이한 방법이 특히 기재되어 있다. 이들은 목적이 비표적 림프구를 포획하고 CTC를 용리하는 것일 때 소위 "음성" 보강, 또는 목적이 CTC를 포획하고 샘플로부터의 비표적 세포를 용리하는 것일 때 소위 "양성" 보강을 달성하는 것을 가능하게 한다. 특히, 2013년 Han Wei Hou 등에 의해 기재된 것들, 또는 다시 2017년 Laget S et al에 의해 기재된 것들 (이들이 순환 종양 세포 (CTC)일 때), 2013년 Petit Vincent et al.에 의해 기재된 것들 (이들이 환자의 세포로부터 유래된 이종이식편 (환자 유래 이종이식편 또는 PDX)으로부터 단리된 종양 세포일 때), 마지막으로 DeBord Logan C et al.에 의해 2018년에 기재된 것들을 언급할 수 있다.
바람직하게는, 상기 환자는 인간 개체이다. 이 경우에, 샘플은 상기 환자의 종양으로부터 유래된 이종이식편 또는 PDX (환자-유래 이종이식편)이다.
발육란에 그래프트된 종양 세포는 특히 폐암, 전립선암, 유방암, 흑색종, 신장암 및 면역요법 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 다른 암으로부터일 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따라 사용된 발육란 모델은 종양, 바람직하게는 인간 세포가 CAM의 수준에서 그래프트된 계란이다. 바람직하게는, 그래프트된 계란 모델의 사용은 인간 면역 효과기 세포의 존재를 배제한다.
"면역 효과기 세포"란, 림프구, 특히 T, B 및 NK 림프구, 대식세포 및 수지상 세포를 의미한다.
본 발명의 범위 내에서, 용어 종양 및 암은 악성 세포의 증식을 정의하기 위해, 동일한 의미로 그리고 상호교환적으로 사용된다. 용어 항종양 및 항암의 사용에도 동일하게 적용된다.
"면역치료 분자"란, 면역 반응을 활성화시키거나 환자의 종양에 대해 환자의 면역 체계에 의해 개발된 작용을 회복할 수 있는 임의의 화합물 또는 생성물을 지정하는 것을 의도한다. 이들 면역치료 분자는 종양에 의해 차단된 면역 체계를 제어하는 기능을 표적으로 한다. 이러한 화합물은 항체, 특별히 모노클로날 항체, 아주반트, 화학 분자 등일 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 발육란에서, 면역치료 분자는 이 경우에 그래프트된 종양 세포로부터 발달하는 암에 대한 "숙주" 또는 "수령자" 조류의 면역 반응을 자극할 수 있다. 면역치료 분자 중에서, 특히 입양 세포 요법, 예컨대 CAR-T, 백신, 이중-특이적 항체, 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 항-PD1, 또는 항-PDL1, 또는 항 CTLA-4 항체가 언급될 수 있다.
특히, 그리고 종양 세포가 암 환자 샘플에서 유래된 경우, 여러 면역치료 분자를 시험하면 이 환자의 종양 치료에 가장 유망한 면역치료 분자를 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 바람직한 실시양태에 따르면, 종양 세포로 그래프트된 조류 발육란을 사용하여 시험된 상이한 면역치료 분자 중에서 어느 것이 최고의 항암 활성을 갖는지 결정한다.
종양 세포로 그래프트된 조류 발육란은 또한 본 발명에 따라 독립적으로 시험된 분자 각각으로 수득된 효과와 비교하여 면역치료 분자 조합의 항암 유효성을 시험하기 위해 사용될 수 있다.
이 발육란의 사용 범위 내에서, 그래프트된 종양 세포로부터 발달된 종양과 배아 전체 둘 다에서 시험된 면역치료(들)의 독성을 결정하거나, 또는 심지어 정량화하는 것도 가능하다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 종양에 대한 및/또는 배아 전체에 대한 면역치료 분자(들)의 독성을 정량화하기 위해 종양 세포로 그래프트된 조류 발육란의 용도에 관한 것이다.
한 바람직한 실시양태에서, 상기 기재된 본 발명에 따른 용도는 CAM 형성에 상응하고 닭의 적어도 9일 또는 훨씬 더 바람직하게는 9.5일의 발달에 상당하는 발달 단계까지 이전에 인큐베이션된, 그래프트된 조류 발육란으로 수행된다.
본 발명은 또한
- 융모 요막 (CAM) 형성에 상응하고 그래프트시에 닭에서 적어도 8일에 상당하는 발달 단계 까지 이전에 인큐베이션된 조류 발육란의 CAM의 수준에서 종양 세포를 그래프트하는 단계,
- 그래프트한 후 적어도 12시간에 면역치료 분자(들)를 발육란에 투여하는 단계,
- 그래프트된 배아에서 발달한 종양의 종양형성에 대한, 그렇게 투여된 면역치료 분자(들)의 효과를 조사하는 단계
를 포함하는 것,
그리고 그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 효과기 면역 세포의 부재 하에 그리고 상기 세포를 첨가하지 않고 구현하는 것
을 특징으로 하는, 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하는 방법에 관한 것이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 사용된 조류의 종에 따라 종양 세포를 그래프트하는 시간, 즉 CAM의 형성에 도달하고 닭에서 적어도 8일의 발달에 상당하는 발달 단계에 도달하는 발육란의 인큐베이션 또는 발달의 최소 일 수를 결정하는 방법을 알 것이다. 예를 들어 닭에서는, 발달 8일부터, 그리고 메추라기에서는 발달 6.5일로부터 그래프트를 실시할 수 있다.
한 바람직한 실시양태에 따르면, 발육란은 그래프트 전에, CAM의 형성에 상응하고 닭에서 적어도 9일 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 9.5일에 상당하는 발달 단계까지 인큐베이션되었다.
인큐베이션은 적절한 조건, 즉 발육란의 정상적인 발달을 가능하게 하는 조건, 특히 37℃ 내지 39℃, 바람직하게는 38℃, 또는 심지어 38.5℃의 온도에서 수행된다.
종양 세포를 그래프트하는 것은 CAM의 상부 또는 하부, 바람직하게는 상부 CAM의 수준에서 임의의 위치에서 수행될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 임의의 방법이 이 그래프핑에 사용될 수 있으며, 특히 문헌 [Crespo P. & Casar B, 2016]에 의해 참조된 그래프팅 기술을 사용하는 것이 가능하다.
한 특정 실시양태에 따르면, 그래프트된 종양 세포의 양은 약 10개 세포 내지 약 5.106개 세포 범위이다.
하나의 바람직한 실시양태에 따르면, 사용된 종양 세포는 세포주 또는 암 환자 또는 동물 샘플로부터 단리된 종양 세포에 대해, 발육란에 그래프트하기 전에 동결되었다.
특히, 그래프트된 종양 세포가 암에 걸린 환자 또는 동물의 샘플에서 유래된 경우, 여러 면역치료 분자를 시험하면 이 환자 또는 동물의 종양 치료에 가장 유망한 것을 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 실시양태에 따르면, 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하는 방법은 시험된 상이한 분자 중에서 최고의 항암 활성을 나타내는 면역치료 분자의 결정을 허용한다.
본 발명에 따른 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하는 방법은 또한 독립적으로 시험된 면역치료 분자(들)의 각각의 효과와 관련하여 면역치료 분자(들)의 조합의 항암 유효성을 시험할 수 있게 한다.
면역치료 분자(들)를 발육란에 투여하는 단계는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술에 의해 상이한 방식으로 수행될 수 있다. 투여는 특히 CAM의 수준에서 부가 또는 주사에 의해, 종양내 주사에 의해, 알의 배아(embryonic) 또는 배외(extra-embryonic) 구조로의 주사에 의해 수행될 수 있다.
면역치료 분자(들)의 투여는 종양 세포를 그래프트한 후 적어도 12시간, 바람직하게는 그래프트한 후 적어도 24시간 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 48시간, 즉 그래프트한 후 1 내지 2일 후에 수행된다. 면역치료 분자(들)는 기간의 면에서 상이한 패턴에 따라 투여될 수 있지만, 또한 2일마다, 또는 매일, 또는 1일 2회, 또는 단일 주사와 같은 투여 횟수의 면에서, 알의 인큐베이션의 마지막 날까지 투여될 수 있다. 이들 선택은 투여되는 면역치료 분자에 따라 결정될 것이다.
하나의 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하는 방법은, 종양형성에 대한 효과를 연구하기 전에, 그래프트된 발육란에 면역치료 분자(들)를 투여한 후, 적어도 1시간 동안 일단 그래프트된 발육란의 인큐베이션을 추가로 포함한다. 유리하게는, 인큐베이션은 많아야 21일의 배아 발단 단계, 그리고 유리하게는 18일의 발달에 상응하도록, 적어도 4일 및 많아야 12일 동안 수행된다.
하나의 특정한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하는 방법은, 투여된 면역치료 분자(들)의 투여 후, 그리고 특히 미세해부에 의한 상기 발육란의 인큐베이션 말기에 그래프트된 종양 세포로부터 발달하는 종양을 수집하는 것을 추가로 포함한다.
그에 따라 종양형성에 대한 면역치료 분자(들)의 효과에 대한 조사는 특히 그래프트된 발육란에서 발달된 종양을 수집한 후에 여러 보완적인 접근법을 취할 수 있다. 이는 특히 종양 성장, 전이성 침습(metastatic invasion), 혈관신생(angiogenesis), 신혈관신생(neo-angiogenesis), 염증 및/또는 종양 면역 침윤, 및 독성과 같은 파라미터를 분석하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 종양은 종양 성장을 조사하기 위한 종양 중량 및/또는 부피, 인간 전이에 대한 정량적 PCR에 의한 Alu 서열의 증폭과 같은 전이성 침습을 조사하기 위한 상이한 특이적 마커의 발현, 혈관신생 및 신혈관신생을 위한 종양에서의 혈관 수, 종양 면역 침윤을 평가하기 위한 염증에 대한 인터루킨의 정량화 및/또는 CD3, CD8, CD4, CD45 및 CD56과 같은 마커의 특히 rtQPCR에 의한 정량화, 체중, 및 종양에 대한 독성을 평가하기 위한 조직학적 분석과 같은 이들 상이한 파라미터를 측정 및/또는 분석하기 위한 분석을 받을 수 있다.
전이성 침습에 대한 조사는 쉽게 접근할 수 있는, 하부 CAM에서 수행될 수 있지만, 이는 또한 특히 암의 유형 및 연관 전이 현상에 대한 공지된 데이터에 따라 배아 내의 임의의 표적 기관에서 수행될 수도 있다.
염증 및/또는 종양 면역 침윤은 CD3 (T 림프구에 대한 막 마커), CD4 (조절 T 림프구, 단핵구 및 대식세포에 대한 막 마커), CD8 (세포독성 T 림프구에 대한 마커), CD45 (백혈구에 대한 막 마커), CD56 (NK 세포에 대한 마커) 등과 같은 다양한 마커의 발현을 분석함으로써 특히 조사될 수 있다. 이들 마커에 특이적인 올리고뉴클레오티드 쌍은, 종 간의 교차 번식을 피하기 위해 개발될 수 있다.
확장에 의해, 전이 부위에서 면역 체계 세포의 염증 및 침윤을 모니터링하는 것이 또한 가능하다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 이들 모든 인자의 조합 분석은 배아에서 투여된 면역치료 분자(들)의 항암 유효성을 결정할 수 있게 한다. 이들 파라미터는 특히 암 환자에서 채택할 치료 관리를 결정하기 위해 임상의에 의해 사용되는 결정 트리(decision tree)의 필수 부분이다.
종양형성에 대한 면역치료 분자(들)의 효과를 조사하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 모든 방법의 범위 내에서, 항암 활성은 일단 그래프트된 발육란에서 면역치료 분자(들)의 투여 후 수집된 종양의 종양형성을 동일한 종양 세포로 동일한 방법에 따라 사전에 그래프트되었으며 면역치료 분자가 투여되지 않은 동일한 조류의 또 다른 발육란으로부터 수집된 종양의 것들과 비교하여 바람직하게 평가된다. 유사하게, 여러 면역치료 분자의 효과가 조사될 때, 항암 활성은 일단 그래프트된 발육란에서 면역치료 분자의 투여 후 수집된 종양의 종양형성을 동일한 종양 세포로 동일한 방법에 따라 사전에 그래프트되었으나 각각의 면역치료 분자가 개별적으로 투여된 동일한 조류의 하나 이상의 다른 발육란(들)로부터 수집된 종양들의 것들과 비교함으로써 우선적으로 평가될 것이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 항암 활성을 평가하는 방법의 범위 내에서 평가되는 것은 1종 이상의 면역 체크포인트 억제제의 항암 활성이고, 바람직하게는 항-PD1 항체 또는 항-PDL1 항체의 항암 활성이다.
본 발명은 또한 생체내 암 치료를 위한 면역치료 분자를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은
- 융모 요막 (CAM) 형성에 상응하고 닭에서 적어도 8일의 발달에 상당하는 발달 단계 까지 이전에 인큐베이션된 조류 발육란의 CAM의 수준에서 종양 세포를 그래프트하는 단계,
- 그래프트한 후 적어도 12시간에 후보 면역치료 분자(들)를 발육란에 투여하는 단계,
- 그래프트된 발육란에서 발달한 종양의 종양형성에 대한, 그렇게 투여된 면역치료 분자(들)의 효과를 조사하는 단계
를 포함하는, 항암 활성을 갖는 면역치료 분자를 스크리닝하는 방법에 관한 것이며,
상기 방법은 그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 효과기 면역 세포의 부재 하에 그리고 상기 세포를 첨가하지 않고 구현된다.
"후보 면역치료 분자"는 상기 정의된 바와 같고 항종양/항암 활성을 가질 수 있고, 특히 발육란에 그래프트된 종양 세포로부터 발달한 암의 유형을 치료하는 데 잠재적으로 효과적인, 화학적 또는 생물학적 면역치료 분자를 의미한다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법은 후보 치료제가 항암 활성을 갖는지 여부, 및 항전이(anti-metastasis) 활성을 갖는지를 결정할 수 있게 한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 암 환자 또는 동물을 모니터링하는 방법에 관한 것이며,
- T1 시점에 상기 환자 또는 동물로부터의 종양 세포를 사용하여, 상기 기재된 바와 같은 제1 조류 발육란을 제조하고, 이 제1 조류 발육란에서 발달하는 종양의 종양형성을 조사하는 단계,
- T2 시점에 동일한 환자 또는 동물의 샘플로부터의 종양 세포를 사용하여, 상기 기재된 바와 같은 제2 조류 발육란을 제조하고, 이 제2 조류 발육란에서 발달하는 종양의 종양형성을 조사하는 단계,
- 제1 및 제2 조류 발육란에서 발달한 종양의 종양형성을 비교하는 단계
를 포함하며,
상기 방법은 그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 부재 하에 그리고 상기 세포를 첨가하지 않고 구현된다.
면역치료 분자의 항암 활성을 평가하는 방법에 대한 상기 언급된 모든 선호도 및 세부사항은 본 발명에 따른 모니터링 및 스크리닝 방법에 준용된다.
실시예
본 발명은 이하에 종양학에서 상이한 면역치료 분자, 특히 면역 쳬계와 종양: PD-1 및 PDL-1의 상호 작용에 중요한 역할을 하는 두 막 단백질에 대한 항체의 유효성을 검증하기 위해 융모 요막 (CAM) 상에서 발달된 인간 기원의 종양으로 발육된 암탉의 사용에 의해 예시된다.
PD-1 (또는 프로그램된 세포 사멸 1의 경우 PDC1)은 활성화된 T 림프구의 표면 상에서 발현되는 막 단백질이다. 종양 세포 표면 상에 존재하는, 그의 리간드 인 PDL-1 (프로그램된 세포 사멸-리간드 1)에 대한 그의 결합은, 종양 세포와 관련하여 T 림프구의 불활성화 (증식 및 시토카인 분비의 억제)를 야기한다.
면역 체크포인트 억제제는 림프구를 차단하고 림프구가 종양을 공격하는 것을 방지하기 위해 장애물을 제거하는 것을 목표로 개발되었다. 따라서 항-PD1 또는 항-PD-L1 항체는 종양에 대한 면역 체계의 공격을 재활성화시켜야 한다.
재료 및 방법
배아, 인큐베이션 조건 및 그래프트
융모 요막 (CAM) 상에 부가하여 발육란을 개방하고 종양 세포를 그래프트하는 것은 이미 공지되어 있으며 수년 동안 널리 문서화되었다 (Crespo P. & Casar B., 2016). 상부 CAM 상에 종양 세포의 그래프팅 부위를 가진 발육란의 개략도가 도 1에 표시되어 있다.
여기에는 검증 연구에 사용된 특정 조건만 기재되어 있다:
- 수정된 암탉 알을 37℃ 및 40% 습도에서 9.5일 동안 앙와위 자세에서 인큐베이션하였다.
- E9.5의 발달에서, 상기 알은 CAM의 무결성을 유지하면서 개방되었다. 세로를 CAM 상으로 그래프트한 다음에 알을 37.5℃ 및 40% 습도에서 24시간 동안 다시 인큐베이션하였다.
- 각각의 군 (대조군 및 처리 군)에 대해, 적어도 9개의 알 (E18에서 생존하는 알)에 대한 결과가 제공되었다.
세포주
표준 림프종 (SU-DHL-4), 유방 선암종 (MDA-MB-231), 또는 교모세포종 (U87) 세포주를 표 1에 기재된 양과 조건으로 그래프트하였다.
Figure pct00001
면역치료 분자
그래프트한 후 난 내(in ovo) 종양을 항-인간 PD1 또는 항-PDL1 항체로 네 가지 경우 (E10.5; E12.5; E14.5; E16.5)로 처리하였으며 100 μl의 항체 (항-PD1 또는 항- PDL1)를 상이한 농도에서 (하기 도면에 상세히 설명됨) 사용하였다.
시험된 항-PD1 및 항-PDL-1 항체는 표 2에 제시하였다.
Figure pct00002
아테졸리주맙 (항-PD-L1 티쎈트릭) 및 펨브롤리주맙 (항-PD-1 키트루다)은 인간에서 이미 처방된 2종의 모노클로날 항체이다.
아테졸리주맙 (항-PD-L1 티쎈트릭)는 인간 (FDA)에서 승인된 최초의 항-PDL-1이다. 이는 전이성 비소세포성 폐암에 대해 사용된다. 이는 또한 요로 상피암에도 사용된다. 펨브롤리주맙 (항 PD-1 키트루다)은, 항-PD-1이지만 PD-1 막 단백질의 또 다른 부위에 결합하는, 니볼루맙 (옵디보)의 상업적 경쟁자인 많은 암 (흑색 종, 폐, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 전립선, 방광, 유방,..)에 대해 처방되는 항 PD-1이다 (Fessas, P.; Semin Oncol. 2017).
종양 수집 및 분석
E18에, 알을 개봉하고, 종양을 수집하고, 인산염 완충 식염수 (PBS)에 있는 4% 파라포름알데히드에 고정하고 세정하여 종양 주변의 CAM 조각을 제거하고, 정밀 저울로 중량을 측정하였다. 전이 분석을 위해, 하부 CAM (그래프트 부위 반대편)의 조각을 수집하고 동결시킬 수 있다. 이것은 전체 게놈 DNA 추출에 사용될 것이다. 이들 샘플에서 인간 세포의 검출은 인간 Alu 서열에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR에 의해 수행하였다 (인간에서 널리 보존된 다중 카피 서열)(Zijlstra, A. et al., 2012).
도 2는 세포 그래프트로부터 샘플 수집까지의 조사 타임라인을 나타낸다.
결과는 다양한 암 모델에서 수득되었으며, 이는 많은 모델에서 이러한 유형의 치료의 잠재력을 입증하였다.
결과
1. 종양 성장에 대한 4 가지 면역요법의 유효성
MDA-MB-231 세포에 대한 아테졸리주맙 (항-PDL-1 티쎈트릭)의 유효성
세포를 그래프트한 후, 종양을 알당 4 μg/kg 용량으로 100 μl의 아테졸리주맙 (항-PDL-1 티쎈트릭)으로 4회 (E10.5; E12.5; E14.5; E16.5) 처리하였다.
아테졸리주맙 투여 후 MDA-MB-231 세포에서 시작된 종양 중량 분석의 결과는 표 3 (SD: 표준 편차; SEM: 평균의 표준 오차)에 풀링(pooling)되고 도 3에 첨부되었다.
Figure pct00003
MDA-MB-231 세포 및 SU-DHL-4 세포에 대한 펨브롤리주맙 (항-PD-1 키트루다)의 유효성
세포를 그래프트한 후, 종양을 100 μl의 펨브롤리주맙 (항-PD-1 키트루다)으로 4회 (E10.5; E12.5; E14.5; E16.5) 처리하였다.
펨브롤리주맙 투여 후 MDA-MB-231 세포 또는 SU-DHL-4 세포에서 시작된 종양 중량 분석의 결과는 표 4 및 5 (SD: 표준 편차; SEM: 평균의 표준 오차)에 풀링되고 도 4에 첨부되었다.
Figure pct00004
Figure pct00005
SU-DHL-4 세포에 대한 뮤린(murine) 항-PD-1 RMP1-14의 유효성
세포를 그래프트한 후, 종양을 알당 166 μg/kg 용량으로 100 μl의 RMP1-14 (뮤린 항-PDL-1)로 4회 (E10.5; E12.5; E14.5; E16.5) 처리하였다.
RMP1-14 투여 후 SU-DHL-4 세포에서 시작된 종양 중량 분석의 결과는 표 6 (SD: 표준 편차; SEM: 평균의 표준 오차) 및 첨부된 도 5에 나타냈다.
Figure pct00006
MDA-MB-231 세포에 대한 니볼루맙 (항-PD-1 옵디보)의 유효성
세포를 그래프트한 후, 종양을 100μl의 니볼루맙 (항-PD-1 옵디보)으로 4회 (E10.5; E12.5; E14.5; E16.5) 처리하였다.
니볼루맙 투여 후 MDA-MB-231 세포에서 시작된 종양 중량 분석의 결과는 표 7 (SD: 표준 편차; SEM: 평균의 표준 오차)에 뿐만 아니라 첨부된 도 6에 풀링되었다.
Figure pct00007
2. 전이성 침습의 모니터링
종양 중량에 더하여, 면역요법을 시행한 후 발육란 내부의 전이성 침습을 모니터링할 수 있다.
이 분석은 통상적으로 인간 Alu 서열 (인간 게놈의 다중카피 서열)에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 qPCR (바이오-래드; SsoAdvanced Univ SYBR Green Supermix Ref. 1725274)에 의해 배아의 임의의 조직으로부터 추출된 게놈 DNA (MagJET Genomic DNA kit; 써모사이언티픽(ThermoScientific); Ref. K2721) 상에서 수행하였다 (Zijlstra, A. et al., 2012).
MDA-MB-231 세포를 그래프트 한 다음에, 상기에 기재된 바와 같이 펨브롤리주맙 (항 PD-1 키트루다)을 투여한 후, 쉽게 이용 가능한 조직인 하부 CAM의 조각으로부터 추출된 게놈 DNA에 대해 분석을 수행하였다.
결과는 첨부된 도 7에 풀링되어 있다.
3. 면역 체계 세포에 의한 종양 침윤의 분석
종양 중양에 대한 관찰된 유효성에 추가하여, 면역요법의 존재 또는 부재 하에 배아에서 종양 조직으로의 면역 세포의 침윤을 측정함으로써 면역요법의 작용을 분석할 수 있다.
조류 형태의 CD3 (T 림프구에 대한 막 마커), CD4 (조절 T 림프구, 단핵구 및 대식세포에 대한 막 마커), CD45 (백혈구에 대한 막 마커), CD8 (세포독성 T 림프구 마커) 및 CD56 (NK 세포 마커) 마커는 상기 기재된 바와 같이, 항 PD-1 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙, 또는 항-PD-L1 아테졸리주맙 투여 후 또는 투여 여부에 관계 없이, SU-DHL-4 세포로부터 시작된 종양에서 qPCR에 의해 분석되었다.
조직을 수집하고 총 RNA를 추출하였다 (MagJET RNA 키트; 써모사이언티픽; 참고 K2731). 전체 RNA로부터, cDNA를 원하는 각각의 바이오 마커 (PrimePCR, Pre-Amp Assay, Probe Chicken; 바이오-래드; Ref. 10041596)에 대한 특이적 사전0증폭으로 합성하였다 (iScript Explore RT 및 PreAmp Kit; 바이오-래드; Ref. 12004856). 이어서 각각의 바이오마커에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 정량적 PCR을 수행한다 (PrimePCR Assay FAM, Chicken; 바이오-래드; Ref. 12001961).
결과는 도 8 (항-PDL-1 아테졸리주맙), 도 9 (항-PD-1 펨브롤리주맙) 및 도 10 (항-PD-1 니볼루맙)에 풀링되어 있고, 아테졸리주맙 (항-PDL-1), 펨브롤리주맙 (anti PD-1) 또는 니볼루맙 (항-PD-1)을 사용한 면역요법 치료를 받은 여부와 관계 없이 CD3, CD4, CD45, CD8 및 CD56을 보유하는 닭의 면역 세포의 침윤을 나타낸다.
4. 닭 배아 면역 세포의 특성화 및 면역요법에 대한 그의 반응
유세포 분석에 의한 말초 혈액으로부터의 면역 세포의 특성화
닭 말초 혈액을 E16에서 수집하였다. 피콜-파크(Ficoll-Paque)® 밀도 구배 원심분리 (시그마(Sigma)-GE17-1440-02)에 의해 정제한 후, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 항-닭-CD45-FITC (써모피셔-MA5-28679), 항-닭-CD3-퍼시픽 블루(Pacific Blue)® (클리니사이언시즈(CliniSciences) 8200-26), 항-닭-CD8 알파-PE (써모피셔-MA5-28726), 항-닭-CD4-PE (써모피셔-MA5-28686), 항-닭 KUL01-PE (써모피셔-MA5-28828) (이는 닭 단핵구 및 매식 세포를 식별한다)로 표지하였다. 상이한 면역 세포 집단은 유세포 분석 (BD FACSCanto ™ II)에 의해 검출하였다.
결과는 도 11에 풀링되어 있으며 닭 배아 말초 혈액에서 다양한 면역 세포 집단 (CD8+ T 세포, CD4+ T 세포 및 단핵구)이 검출되었으며, 이는 닭 배아 면역 체계가 기능적이라는 것을 나타내는 것이다.
시험관내 펨브롤리주맙 (키트루다)의 존재 하에 인간 H460 종양 세포에 대한 닭 림프구의 세포독성 검증
상기에 기재된 바와 같이 E16에서 수집된 혈액으로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 72시간 동안 피토헤마글루티닌 (PHA, 시그마-11249738001, 5 μg/ml)에 의해 활성화되었다. 이어서, 종양 세포에 의해 발현되는 PD-L1과의 상호작용을 방지하기 위해 펨브롤리주맙 (키트루다®, 5 μg/ml)을 12시간 동안 배양에 유지된 T 림프구에 첨가하여 PD-1 분자를 차단하였다. 이어서 펨브롤리주맙-처리 및 미처리 T 림프구를 T 림프구 (효과기 세포 = E) 대 종양 세포 (표적 림프구 = C)의 상이한 비율: E/C = 10:1; E/C = 20:1 및 E/C = 40:1로 인간 H460 (폐) 종양 세포와 공동-배양하였다 (도 12). 펨브롤리주맙에 의한 닭 T 림프구 상의 PD-1차단은 시험관내 MTT 세포독성 검정 (시그마-CGD1-1KT)에 의해 밝혀진 바와 같이 종양 세포에 대한 T 림프구의 세포독성을 측정함으로써 확인되었다.
결과는 도 12에 풀링되어 있으며, 펨브롤리주맙으로 T 림프구를 처리한 후 인간 H460 종양 세포에 대한 닭 T 림프구의 세포독성 효과의 증가를 입증한다.
종양 세포가 펨브롤리주맙으로 처리되지 않은 종양 세포와 함께 인큐베이션된 T 림프구와 비교하여 종양 세포가 펨브롤리주맙-처리된 T 림프구와 함께 인큐베이션될 때 더 큰 종양 세포 생존력이 검출되었다. 이 차이는 T 림프구 세포독성의 증가를 나타내며, 이는 펨브롤리주맙에 의한 닭 T 림프구에 대한 PD-1의 효과적인 차단을 나타내는 것이다.
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Claims (14)

  1. 입양 세포 요법(adoptive cell therapy), 예컨대 CAR-T, 백신, 이중-특이적 항체, 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor), 예컨대 항-PD1, 또는 항-PDL1, 또는 항 CTLA-4 항체로부터 선택된 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하기 위해 종양 세포와 함께, 특히 융모 요막 (chorioallantoic membrane; CAM)의 수준에서, 그래프트된(grafted) 조류 발육란 모델(embryonated bird egg model)의 용도로서, 여기서 상기 모델은 그래프트된 알의 면역 효과기 세포(immune effector cell) 이외의 면역 효과기 세포의 존재를 배제하는 것인 용도.
  2. 제1항에 있어서, 시험된 상이한 면역치료 분자로부터 발육란에 그래프트된 종양 세포로부터 발달된 종양의 치료를 위해 가장 유망한 항암 활성을 가진 면역치료 분자를 선택하기 위한 용도.
  3. 그래프트된 종양 세포로부터 발달된 종양에 대한 및/또는 배아 전체에 대한 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 독성을 결정하거나, 또는 심지어 정량화하기 위해 종양 세포와 함께, 특히 융모 요막 (CAM)의 수준에서, 그래프트된 조류 발육란 모델의 용도로서, 여기서 상기 모델은 그래프트된 알의 임의의 면역 효과기 세포 이외의 임의의 면역 효과기 세포의 존재를 배제하는 것인 용도.
  4. - 융모 요막 (CAM) 형성에 상응하고 닭 배아에서 적어도 8일의 발달에 상당하는 발달 단계 까지 이전에 인큐베이션된(incubated) 조류 발육란의 CAM의 수준에서 종양 세포를 그래프트하는 단계,
    - 그래프트한 후 적어도 12시간에 면역치료 분자(들)를 발육란에 투여하는 단계,
    - 그래프트된 배아에서 발달한 종양의 종양형성(tumourigenesis)에 대한, 그렇게 투여된 면역치료 분자(들)의 효과를 조사하는 단계
    를 포함하는 것,
    그리고 그래프트된 알의 효과기 면역 세포 이외의 효과기 면역 세포의 부재 하에 및 상기 세포를 첨가하지 않고 구현하는 것
    을 특징으로 하는, 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 면역치료 분자(들)를 종양형성에 대한 효과를 조사하기 전에 그래프트된 발육란 내로 투여한 후, 적어도 1시간 동안 일단 그래프트된 발육란을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 면역치료 분자(들)의 투여 후 상기 발육란의 인큐베이션 말기에 그래프트된 종양 세포로부터 발달하는 종양을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하는 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 종양형성을 조사하는 것이 다양한 파라미터, 예컨대 종양 성장, 전이성 침습(metastatic invasion), 혈관형성(angiogenesis), 신혈관형성(neo-angiogenesis), 염증 및/또는 종양 면역 침윤(tumour immune infiltration), 및 종양에 대한 독성을 측정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하는 방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항암 활성이 일단 그래프트된 발육란의 면역치료 분자(들)를 투여한 후 수집된 종양의 종양형성을 동일한 종양 세포로 동일한 방법에 따라 사전에 그래프트되었으며 면역치료 분자가 투여되지 않은 동일한 조류의 발육란에서 수집된 종양의 것과 비교함으로써 평가되는 것을 특징으로 하는, 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하는 방법.
  9. - 융모 요막 (CAM) 형성에 상응하고 닭에서 적어도 8일의 발달에 상당하는 발달 단계 까지 이전에 인큐베이션된 조류 발육란의 CAM의 수준에서 종양 세포를 그래프트하는 단계,
    - 그래프트한 후 적어도 12시간에 후보 면역치료 분자(들)를 발육란에 투여하는 단계,
    - 그래프트된 발육란에서 발달한 종양의 종양형성에 대한, 그렇게 투여된 면역치료 분자(들)의 효과를 조사하는 단계
    를 포함하는, 항암 활성을 갖는 면역치료 분자를 스크리닝(screening)하는 방법으로서,
    상기 방법은 그래프트된 알의 효가기 면역 세포 이외의 효과기 면역 세포의 부재 하에 및 상기 세포를 첨가하지 않고 구현되는 것인, 항암 활성을 갖는 면역치료 분자를 스크리닝하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 면역치료 분자(들)를 종양형성에 대한 효과를 조사하기 전에 그래프트된 발육란 내로 투여한 후, 적어도 1시간 동안 일단 그래프트된 발육란을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 항암 활성을 갖는 면역치료 분자를 스크리닝하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 면역치료 분자(들)의 투여 후 상기 발육란의 인큐베이션 말기에 그래프트된 종양 세포로부터 발달하는 종양을 수집하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 항암 활성을 갖는 면역치료 분자를 스크리닝하는 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 후보 면역치료 분자(들)의 항암 활성이 일단 그래프트된 발육란의 면역치료 분자(들)를 투여한 후 수집된 종양의 종양형성을 동일한 종양 세포로 동일한 방법에 따라 사전에 그래프트되었으며 면역치료 분자가 투여되지 않은 동일한 조류의 발육란에서 수집된 종양의 것과 비교함으로써 평가되는 것을 특징으로 하는, 항암 활성을 갖는 면역치료 분자를 스크리닝하는 방법.
  13. 조류 발육란에 그래프트된 상기 종양 세포가 암에 걸린 환자 또는 동물의 샘플로부터 유래된 것임을 특징으로 하는, 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 1종 이상의 면역치료 분자(들)의 항암 활성을 평가하는 방법 또는 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항암 활성을 갖는 면역치료 분자를 스크리닝하는 방법.
  14. 암에 걸린 환자 또는 동물을 모니터링하는 방법으로서,
    - 융막 요막 (CAM) 형성에 상응하고 닭에서 적어도 8일의 발달에 상당하는 발달 단계 까지 이전에 인큐베이션된, T1 시점에 상기 환자 또는 동물로부터 유래된 CAM 종양 세포의 수준에서 그래프팅함으로써 제1 조류 발육란을 제조하고, 이 제1 조류 발육란에서 발달하는 종양의 종양형성을 조사하는 단계,
    - 융막 요막 (CAM) 형성에 상응하고 닭에서 적어도 8일의 발달에 상당하는 발달 단계까지 이전에 인큐베이션된, T2 시점에 상기 환자 또는 동물의 샘플로부터의 CAM 종양 세포의 수준에서 그래프팅함으로써 제2 조류 발육란을 제조하고, 이 제2 조류 발육란에서 발달하는 종양의 종양형성을 조사하는 단계,
    - 제1 및 제2 조류 발육란에서 발달한 종양의 종양형성을 비교하는 단계
    를 포함하며,
    상기 방법은 그래프트된 알의 면역 효과기 세포 이외의 면역 효과기 세포의 부재 하에 및 상기 세포를 첨가하지 않고 구현되는 것인,
    암에 걸린 환자 또는 동물을 모니터링하는 방법.
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