CN101073578A - 用于制备抗血管生成、抗肿瘤侵袭和转移药物的土贝母苷乙 - Google Patents

Abstract

本发明涉及土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷用于制备抗血管生成、抗肿瘤侵袭和转移的药物。土贝母苷乙是从土贝母中提取出来的一种化学成分，是土贝母苷甲的天然衍生物；这里所谓含土贝母苷乙的土贝母皂苷是指含土贝母苷乙和土贝母苷甲、但不含土贝母苷丙的土贝母中的皂苷组分。土贝母甘乙明显抑制人脐静脉内皮细胞ECV－304的增殖，促进其凋亡；土贝母苷乙明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜的和肿瘤细胞在鸡胚绒毛尿囊膜诱导的血管生成；土贝母苷乙明显抑制肿瘤组织微血管的生成；土贝母苷乙明显抑制肿瘤组织血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞因子(bFGF)的表达；土贝母苷乙明显抑制小鼠B16黑色素瘤细胞的实验转移和Lewis肺癌细胞的自发转移；土贝母苷乙诱导Lewis肺癌组织中促转移基因CD44v6和ErBb－2的表达下调，抑转移基因nm23－H1的表达上调。土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷可用于制备抗血管生成、抗肿瘤侵袭和转移的药物。

Description

用于制备抗血管生成、抗肿瘤侵袭和转移药物的土贝母苷乙

发明背景

抗肿瘤药物有没有新靶点，是判断该药物有没有开发前景的一个很重要的标志。原发肿瘤的生长和转移有赖于新生血管生成。肿瘤既可通过肿瘤血管从宿主获取营养和氧气，又可通过肿瘤血管源源不断地向宿主输送转移瘤细胞，并在机体其他部位继续生长和诱导血管生成，导致肿瘤转移。异常活跃的血管发育是恶性肿瘤生长的一个重要条件。成年人的血管内皮细胞基本上是静止的，而肿瘤的血管系统都在迅速增殖，肿瘤组织中内皮细胞的周转率是成人脉管系统内皮细胞的50倍，处于高度生长状态的肿瘤血管内皮细胞遂成为突出目标；肿瘤血管细胞是从正常组织进入肿瘤的正常细胞，基因组稳定，不象基因组极不稳定的癌细胞那样容易产生多种抗药性；尽管各种肿瘤细胞差异极大，其血管细胞因为是正常细胞，差异较小，同一药物如果针对肿瘤血管则可能对不同肿瘤均有疗效。鉴于上述3点理由，肿瘤的血管系统已经成为一个崭新的、有希望的抗肿瘤治疗靶点，抗血管生成疗法(antiangiogeneasis therapy)业已成为重要的肿瘤治疗策略(therapy strategies)之一。能破坏或抑制血管生成，有效阻止肿瘤生长和转移的肿瘤新生血管生成(tumor angiogenesis)抑制剂，是当今新型抗肿瘤药物研究开发最活跃的领域之一。肿瘤新生血管生成抑制剂治疗具有下述优势：(1)肿瘤发生时，血管形成已被启动，故具有良好的特异性；(2)血管内皮细胞暴露于血流中，药物能直接发挥作用，故剂量小、疗效高、副作用少；(3)内皮细胞基因表达相对稳定、不易产生耐药性。在肿瘤血管新生过程中，血管生成的开关通路与血管生成中正负调控因子的平衡有关。在正调控因子中，血管内皮生长因子(VEGF)等起着重要的促进作用，而血小板反应蛋白(TBS)、血管抑制素(angiostatin)和内皮抑制素(endostatin)等则属血管生成的负调控因子。另外，一氧化氮(NO)在VEGF诱导的血管生成和血管高通透性中起着关键作用。

目前已有30多种肿瘤新生血管生成抑制剂分别在进行临床前和临床研究。抑制内皮细胞增殖/转移的有：TNP-470，血管抑制素，内皮抑制素，linomide，金雀异黄素IFN，苏拉明，抗血管生成生长因子或其受体的抗体，血小板刺激素，血管抑制素类固醇等；抑制蛋白水解酶的有：TIMPS，金属蛋白酶抑制剂，源于软骨的抑制剂，纤维蛋白溶酶原，激活子抑制剂，美满霉素，四环素等；抑制血管形成及诱导凋亡的αvβ3整联蛋白抑制剂：vataxin，17E6，环状多肽及其类似物，IFN，血管抑制素，内皮抑制素等。

进入I-III期临床实验的肿瘤新生血管生成抑制剂大致可分为五大类：a、抑制基底膜降解的肿瘤新生血管生成抑制剂，如金属蛋白酶抑制剂AG3340、Marimastat(BB-2561)、Bay12-9566、Neovastat等；b、直接抑制内皮细胞增殖的肿瘤新生血管生成抑制剂，如TNP-470、Angio-statin、Endostatin和PF4等；c、抑制血管生长因子活化的肿瘤新生血管生成抑制剂，如VEGF单抗、VEGF-毒素偶合物、VEGFR单抗、SU-5416、Ribozyme等；d、抑制内皮细胞特异性整合素/生存信号的肿瘤新生血管生成抑制剂，如整合素αvβ3、单抗(Vi-taxin)和αvβ3小分子拮抗剂(EDM121974)等；以上四类药物是特异性抑制剂，能特异性地抑制肿瘤血管内皮细胞；e、非特异性抑制剂，即对内皮细胞和肿瘤细胞都有抑制作用的肿瘤新生血管生成抑制剂、如碳氧氨咪唑(Carboxyaminoinidazole，CAI)、Suramin、IL-12和IFNα-2a等。

近年来，我国的科技工作者也开始进行肿瘤新生血管生成抑制剂的寻找和研究工作，取得了一些进展，如中国科学院上海药物研究所发现来源于天然产物的新化合物PAA、DYB、ZH-1等具有抑制新生血管形成作用，中山大学正在研制的内皮抑素已进入I期临床。

美国基因技术研究所的科学家在1989年成功克隆血管内皮生长因子(VEGF)，1993年又制造出VEGF的抗体Avastin。Avastin是一种抗血管生成的新型抗癌药，其作用机制是抑制新生血管生成，从而阻断肿瘤生长的血液供应，抑制肿瘤生长与转移。与传统化疗药物结合使用，可延长结肠癌患者的生存期，这种“饿死肿瘤”的疗法被美国《科学》杂志评为2003年十大科学突破。

肿瘤侵袭、转移是一个多步骤的生物学过程，大体上可分为三基本步骤：原发灶侵袭、转移细胞通过与基底膜表面整合素、非整合素受体等结合而粘附其上；释放多种基质蛋白酶，降解由细胞间质与基底膜组成的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的成分，打破ECM的动态平衡；穿越ECM破损处，侵入局部血管、淋巴管，在远端位突破毛细形成“种子”，长出新生血管，供给瘤体营养，最终形成新侵袭、转移灶。此三个基本步骤可循环反复、不断演进。因此，抗粘附、抗运动和抑制基质蛋白酶活性的化合物均可抑制恶性细胞的侵袭和转移。侵袭和转移是恶性肿瘤最重要的恶性行为和治疗的主要障碍，控制恶性肿瘤的侵袭和转移成为恶性肿瘤患者预后的关键因素。然而，迄今为止还没有一种理想的抗恶性肿瘤侵袭和转移的药物可资临床应用。

肿瘤的发生发展是多基因改变的结果。包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活。肿瘤的转移与肿瘤的发生发展是两个既相关又各自独立的生物学过程，肿瘤的转移受自身具有正向作用的转移基因和具有负向作用的转移抑制基因调控，前者的激活和后者的失活均可诱发肿瘤的转移。肿瘤相关基因表达的变化在肿瘤转移中的作用已引起广泛的重视。

土贝母苷乙是从中药土贝母中分离出来的一种单体有效成分，分子式为C₆₃H₉₈O₃₀，分子量为1334，化学结构见图1。它与土贝母苷甲的区别是：土贝母苷甲苷元16位碳上是氢，而土贝母苷乙苷元16位碳上是羟基。土贝母苷乙与苷甲一样，水溶性好、稳定性强，唯得率较苷甲低(土贝母苷乙为0.5％，土贝母苷乙为1.8％)。这里所谓含土贝母苷乙的土贝母皂苷是指含土贝母苷乙和土贝母苷甲、但不含土贝母苷丙的土贝母中的皂苷组分，它的制备工艺简单易行，得率也较高，约2.2％。土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷的提取方法参见文献(王永清、于立坚等：陕西新医药，10：55，1981；Kaisai R，Miyakoshi M，Nie RL，et al.Saponins from Bolbostemma：cyclicbisdesmosides，tubeimosides II and III.Phytochem，1998，27：1439.)。

发明概要

本发明涉及土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷用于制备抗血管生成、抗肿瘤侵袭和转移的药物的用途。

本发明涉及土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷作为制备抗血管生成、抗肿瘤侵袭和转移的药物，该药物包括土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷及可药用的载体。

本发明涉及如权利要求1所定义的药物的制备方法，该药物包括土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷和/或可药用的载体。

土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷可与任何可药用的载体混合或溶解，如经皮肤、粘膜、胃肠内和胃肠外给药的可药用载体。该药物以常规药用制剂的形式使用，如固体形式的片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、扁囊剂、拴剂等，或半固体形式的油膏、软膏等，或液体形式的针剂、悬浮剂、糖浆剂、乳剂、搽剂等。该药物中使用可药用的赋形剂和添加剂，这些可药用的赋形剂和添加剂包括无毒的可相容的填料、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、矫味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂、稳定剂等。如乳糖、柠檬酸、硬脂酸、硬脂酸镁石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、可可脂、乙二醇、葡萄糖、盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因、抗坏血酸等。该药物可按各种制剂的常规工艺制备。

本发明涉及土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷作为制备抗血管生成，抗肿瘤生长、侵袭和转移的药物，可作为食品添加剂、化妆品添加剂加入到食品或化妆品中。

本发明涉及土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷作为制备抗血管生成，抗肿瘤生长、侵袭和转移的药物，可用于各种实体形肿瘤，如食道癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻烟癌、口腔癌、唇癌、皮肤癌、膀胱癌、绒毛膜上皮癌、腮腺瘤、淋巴瘤、骨瘤、黑色素瘤和各种颅内肿瘤等。所制成的各种口服药物中土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷的含量为每日每kg体重大约0.001-100mg，优选约0.01-50mg，更优约0.05-30mg，最佳约0.1-10mg。每日分2-4次服用，10-30天为一疗程，一般用药3-6个疗程，每个疗程间隔10-30天。所制成的注射用药物，可供肌肉注射或静脉点滴，其中土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷的含量为每日每kg体重0.001-50mg，优选约0.01-25mg/kg，更优约0.05-15mg，最佳约0.1-3mg。每日分1-3次使用，10-30天为一疗程，一般用药3-6个疗程，每个疗程间隔10-30天。然而，精确的剂量应由医生确定，主要取决于病人的年龄、体重、病情、反应等。

下面列举的实验研究结果，作为土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷可用于制备抗血管生成、抗肿瘤侵袭和转移的药物的证据。

1.土贝母甘乙对人脐静脉内皮细胞ECV-304增殖及凋亡的影响

1.1材料和方法

1.1.1土贝母苷乙：准确称取土贝母苷乙，用灭菌去离子水溶解后过滤除菌，-20℃低温保存备用。

1.1.2细胞株和细胞培养：人脐静脉内皮细胞株ECV-304，以含10％灭活新生小牛血清、100kU/ml青霉素、100ug/ml链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养。以0.25％胰酶-0.02％EDTA消化细胞，2～3天传代一次，取对数生长期细胞进行实验。

1.1.3细胞毒实验：采用MTT法。细胞消化后制成细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔90μl(含1.0×10⁴细胞)，加入不同浓度的土贝母苷乙液10μl，对照组加入相同体积溶剂。每组设4个平行孔，充分混匀后，于CO₂培养箱中培养24、48、72h。每孔加入MTT20μl(5mg/ml)，继续培养5h后每孔加入三联液100μl。37℃放置过夜后，用酶标仪在570nm波长处测量各孔OD值。调零孔则用RPMI-1640培养液。Bliss法计算半数抑制浓度IC₅₀。细胞生长抑制率按下列公式计算：

1.1.4形态学观察

1.1.4.1倒置显微镜：加入土贝母苷乙液(20μmol/L)，细胞培养24h，倒置显微镜下观察，照相并记录实验结果。

1.1.4.2荧光显微镜：Hoechst-PI双染色：细胞接种于6孔板(4×10⁵/ml)，加入土贝母苷乙液(15μmol/L)，作用72h后常规方法收集细胞。用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，加入Hoechst-33342染色液，使其终浓度为50μmol/L。混匀后于37℃水浴染色15min，离心去上清，用PBS洗一次。加PBS悬浮细胞，取细胞悬液100μl，加入PI染液，使其终浓度为10μg/L。混匀，冰上染色15min。离心去上清。制片，荧光显微镜观察，拍照。

1.1.4.3吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色：细胞接种于6孔板(4×10⁵/孔)，加入土贝母苷乙液(15μmol/L)，作用72h后常规方法收集细胞。用预冷的PBS洗涤两次，离心，去上清。加PBS悬浮细胞，取细胞悬液100μl，加入AO/EB染料8μl，混匀。取一滴于载玻片，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并拍照。

1.2结果

1.2.1土贝母苷乙对ECV-304细胞生长的影响

土贝母苷乙明显抑制ECV-304细胞的生长，其作用与剂量和时间相关；土贝母苷乙对ECV-304细胞作用24、48、72h的IC₅₀分别为22.2、19.3、15.7μmol/L(表1)。

表1  土贝母苷乙对ECV-304细胞生长的抑制作用( x±s，n＝4)

组别	浓度(μmol/L)	时间(h)
								24		48		72
		OD570	IR(％)	OD570	IR(％)	OD570	IR(％)
								对照	-	0.139±0.002	-	0.156±0.001	-	0.163±0.003	-
土贝母苷乙	10	0.136±0.001	2.3	0.148±0.002	5.2	0.150±0.003*	8.0
								土贝母苷乙	15	0.134±0.003	3.8	0.101±0.001**	39.9	0.078±0.001***	52.2
土贝母苷乙	20	0.092±0.003***	33.5	0.064±0.003***	58.6	0.017±0.006***	89.3
								土贝母苷乙	25	0.028±0.006***	79.5	0.018±0.001***	88.7	0.000±0.000***	100.0

与对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

1.2.2土贝母苷乙对ECV-304细胞凋亡的影响

1.2.2.1倒置显微镜观察：对照组细胞多角形，贴壁良好，伸展充分，有较多的分裂期细胞，呈典型的单层卵石状紧密排列；20μmol/L土贝母苷乙液作用后，细胞形态发生显著变化，细胞间连接开始消失，细胞变圆变亮，并可见均匀分布的染色质，随着作用时间的延长，染色质逐渐边聚，细胞表面出现芽状突起，细胞轮廓模糊，空泡化明显(图2)。

1.2.2.2荧光显微镜观察：Hoechst-PI双染色：对照组ECV-304细胞核大小较均一，呈圆形或椭圆形，染色质分布均匀，紫外光下呈蓝色荧光(图3A)。15μmol/L土贝母苷乙处理的细胞则皱缩，变形，染色质浓缩，部分核染色体碎裂，呈红色荧光(图3B)。

1.2.2.3吖啶橙-溴乙锭(AO/EB)染色：在荧光显微镜下观察AO/EB染色后各组培养细胞，可见对照组细胞形态大小正常，细胞核大小均匀，呈圆形或椭圆形，核染色质分布均匀，着绿色荧光(图4A)；细胞经15μmol/L土贝母苷乙作用后，部分细胞膜破损，胞浆浓缩，细胞核呈固缩状、圆珠状或新月状，染色质着绿色或橘红色荧光(图4B)。

2.土贝母苷乙对血管生成的影响

2.1材料和方法

2.1.1鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)的血管生成：种蛋(受精率＞90％)，平均重44.56g。鸡胚卵用0.1％的新洁尔液灭菌，拭干后将鸡蛋气室向上，长轴与蛋托呈45°放入37.0±0.5℃、60％湿度的隔水式恒温孵育箱内孵育，胚头朝上。转蛋角度以水平位置前俯后仰各45°为宜，每4小时翻动一次。鸡胚孵化的第6天，在气室处划定开窗位置。无菌条件下钻孔，暴露绒毛尿囊膜。放入灭菌的滤纸，于滤纸处给药，用无菌透明胶带封孔。每天每组鸡胚给不同浓度土贝母苷乙液100μl(对照组给相同体积的PBS溶液)，一共给药3天。第4天取出鸡胚，局部采用丙酮-无水乙醇(V∶V＝1∶1)固定。剪下盖有滤纸的CAM，小心弃去滤纸。将CAM小心转移至干净的载玻片上，滴甘油，加盖玻片，石蜡密封。在解剖显微镜下(4×10)于滤纸区域内随机选取5个视野计数可见血管的分支点数目。按下式计算血管生成抑制率。

2.1.2肿瘤细胞诱导的血管生成：鸡胚孵化的第6天，在绒毛尿囊膜气室体表处划定开窗位置。无菌条件下开一个直径1cm小孔，暴露绒毛尿囊膜，接种1×10⁷/ml人鼻咽癌细胞(CNE-2Z)悬液100μl，用无菌透明胶带封孔。鸡胚在37.0±0.5℃、60％湿度的隔水式恒温孵育箱内继续培养3天后，在接种细胞处轻轻铺上无菌滤纸环(正中打孔，外径0.50cm，内径0.15cm)使接种的细胞处于环内。于滤纸环区域内给药。给药组每天加入50μl药液，对照组加入相同体积的PBS溶液。给药4天后取出鸡胚，处理同2.1.1。血管生成诱导率和血管生成抑制率按下式计算：

2.2结果

2.2.1土贝母苷乙对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响：与对照组相比，土贝母苷乙明显抑制CAM血管生成，其效果与剂量相关(表2，图5)。值得注意的是，40μmol/L土贝母苷乙剂量组出现溶血(图5C)。

表2土贝母苷乙对CAM血管生成的影响

组别	种蛋数(只)	用药量(μmol×days)	血管分支点数(个)	抑制率(％)
					对照组	7	-	101.68±4.94	-
土贝母苷乙	6	0.5×10-3×3	87.55±9.89	13.9
					土贝母苷乙	6	1.0×10-3×3	64.46±3.98*	36.6
土贝母苷乙	6	2.0×10-3×3	42.60±3.91**	58.1
					土贝母苷乙	6	4.0×10-3×3	31.72±3.80***	68.8

与对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

2.2.2土贝母苷乙对肿瘤细胞诱导的CAM血管生成的影响：CAM结果显示，人鼻咽癌细胞明显诱导血管生成。CAM血管的自然生长状态成叶脉样。接种癌细胞的CAM，以接种区为中心形成呈放射状生长的血管网，新生毛细血管直接向肿瘤接种区爬行生长，出现“血管辐辏现象”。接种区周围血管分支数目明显增多(P＜0.05)。土贝母苷乙显著抑制人鼻咽癌细胞诱导的CAM血管的生成，其抑制效果与剂量相关(表3)。与对照组相比，给药组血管密度、分支数目明显减少，管径较细。

表3土贝母苷乙对肿瘤诱导的CAM血管生成的抑制作用

组别	种蛋数(只)	用药量(μmol×days)	血管分支点数(个)	诱导率(％)	抑制率(％)
						对照组	6	-	139.1±9.5		-
CNE-2Z	6	-	193.2±7.8	38.9
						土贝母苷乙+CNE-2Z	6	0.25×10-3×4	216.5±8.8		2.9
土贝母苷乙+CNE-2Z	6	0.50×10-3×4	129.5±7.2**		40.7
						土贝母苷乙+CNE-2Z	6	1.00×10-3×4	116.5±5.3**		46.6
土贝母苷乙+CNE-2Z	6	2.00×10-3×4	90.3±8.7***		58.8

与对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

3.土贝母苷乙对瘤组织微血管密度(microvessel density，MVD)的影响

3.1材料和方法

3.1.1石蜡切片的制作：新鲜瘤组织剥离后，在10％中性福尔马林液中固定24h；75％、85％、95％、95％、95％、100％、100％、100％的乙醇脱水30～40min，二甲苯透明3次，各30min；62的石蜡浸蜡3次，各6h，石蜡包埋。

3.1.2D31标记：(1)抗原修复：将石蜡包埋组织块4μm连续切片，用免疫组化法检测微血管密度。先将切片放于盛有pH6.0的柠檬酸盐缓冲液的容器中，置电炉上加热至沸腾，并持续10min，然后将该容器置入装有冷水的盆中使切片快速冷却；取出切片，以蒸馏水浸洗后平放于温盒内；每张切片上滴加50μl 0.05％胰蛋白酶液，37℃，8min，取出切片，蒸馏水冲洗。(2)3％H₂O₂阻断组织内源性过氧化物酶，室温下10min；以5％正常血清作切片背景保护，37℃，30min。(3)加第一抗体，兔抗鼠CD31抗体。工作浓度1∶50，37℃，30min；第二抗体，山羊抗兔IgG和第三抗体；SP试剂，工作浓度分别为1∶200和1∶500，37℃下各孵育20min。(4)DAB显色，镜下控制呈色反应，自来水冲洗，苏木素复染，常规脱水至封片，光镜下观察。

3.1.3微血管密度的计数：按照Weidner的方法，即在低倍视野(40倍)下扫视整个肿瘤组织切片，寻找新生血管最密集区即“热点”(hotspot)，然后在高倍镜(200倍)视野下计数热点区被CD31染色的微血管数目。对所标记的微血管选取的原则是：血管内皮细胞被染成棕色，与邻近的微血管、肿瘤细胞及其他结缔组织成分不相连的，标记清晰的内皮细胞或细胞串均作为一个可计数的微血管，而血管腔的有无不作为判断血管的标准。有较厚肌壁的大血管应排除在计数范围之外。此外，肿瘤的坏死区、硬化区、肿瘤细胞稀少区微血管不进行计数。每个象限任选CD31单抗标记阳性的血管数最多的5个视野计数，取平均值作为瘤灶内MVD。

3.2结果

经CD31免疫组化染色，Lewis肺癌瘤组织中的血管内皮细胞被染成棕色。不同处理组瘤组织中的微血管密度值分别为：对照组19.6±3.2；土贝母苷乙组7.3±1.3。土贝母苷乙组明显低于对照组(P＜0.05)。对照组毛细血管大量增生，肿瘤组织内微血管分布不均，形态不规则，数量相差悬殊，呈异质性，毛细血管增生富集在肿瘤边缘处(图6A)。土贝母苷乙组仅癌巢间质有极少量新生毛细血管(图6B)。

4.土贝母苷乙对促血管生成因子表达的影响

4.1材料和方法

石蜡包埋组织块，4μm连续切片，免疫组化法检测土贝母苷乙对促血管生成因子表达的影响(免疫超敏S-P实验按试剂盒说明操作)。血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞因子(bFGF)定位于细胞膜和细胞浆，以细胞膜或细胞浆内出现明确的棕黄色颗粒为阳性细胞。着淡黄色为弱阳性(+)，棕黄色为阳性(++)，棕褐色为强阳性(+++)，无着色为阴性(-)。

4.2结果

Lewis肺癌瘤组织中VEGF表达产物定位于肿瘤细胞及部分间质细胞的胞浆和胞膜，对照组瘤细胞胞浆和胞膜VEGF表达强阳性，呈深棕黄色颗粒状或弥漫性分布，土贝母苷乙组瘤组织中VEGF阳性表达细胞数明显减少，大多数癌细胞染色呈蓝色(阴性)。bFGF阳性表达产物定位于肿瘤细胞及部分间质细胞的胞浆和胞膜，呈弥漫或局灶性分布。对照组bFGF瘤细胞胞浆染色呈明显深棕黄色(强阳性)，实验组瘤细胞染色呈蓝色(阴性)(表4)。

表4土贝母苷乙对肿瘤组织VEGF、bFGF表达的影响( x±s)

组别	阳性细胞百分率(％)
			VEGF	bFGF
	对照组	58.3±7.5			59.9±5.6
土贝母苷乙			7.8±2.3**	5.0±1.2**

与对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

5.土贝母苷乙对小鼠移植性肿瘤转移的影响

5.1材料和方法

5.1.1实验动物：BALB/c裸小鼠，6-8周龄，雌雄兼有，饲养于SPF级动物实验室。饲料、饮水、笼具和操作器材及其他用品均灭菌处理后使用，实验时按无菌原则操作。

5.1.2细胞株：B16黑色素瘤细胞培养于含10％小牛血清，100kU/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中。Lewis肺癌细胞株(LLC)为自发性肺未分化上皮样癌，LLC细胞培养于含5％小牛血清，10％胎牛血清，100kU/L青霉素和100mg/L链霉素的DMEM培养液中。37℃、5％CO²饱和湿度细胞培养箱培养，取对数生长期细胞用于实验。

5.1.3B16实验转移模型：取对数生长期B16黑色素瘤细胞，调整浓度至1×10⁶细胞/ml，按每只0.2ml(2×10⁵细胞)接种于裸鼠尾静脉。随机分为阴性对照组、阳性对照组和实验组，每组8只小鼠，雌雄各半。接种当日即开始给药。实验组每日每只裸鼠腹腔注射不同剂量土贝母苷乙(1.5，3mg/kg·/d)，连续14天；阴性对照组同时腹腔注射同量溶剂；阳性对照组每周每只裸鼠腹腔注射环磷酰胺50mg/kg/·w，共注射2次。接种后第15天，称体重，摘除眼球放血、颈椎脱位法牺牲动物。取出肺，称重并计转移结节数。按下列公式分别计算肿瘤转移抑制率，相对肺重。

相对肺重＝肺重/体重

5.1.4LLC自发转移模型：取对数生长期Lewis肺癌细胞，调整浓度至2×10⁷细胞/ml，按每只0.2ml(4×10⁶细胞)接种于裸鼠右侧背部皮下(移植瘤增殖后开始侵袭周围正常组织和血管，继之癌细胞进入血液循环形成血行播散，粘附于靶器官并穿出血管，癌细胞增殖成为克隆，最终形成转移瘤。上述过程基本类似于人类肿瘤从生长到转移瘤形成所经历的一系列步骤)。接种后第7天开始给药。分组方式和给药方式同B16实验转移模型。用药14次后，称体重，摘除眼球放血、颈椎脱位法牺牲动物，剥离肿瘤衡重。将瘤标本中生长良好的瘤组织用10％中性福尔马林固定，用于检测土贝母苷乙对微血管密度、促血管生成因子、肿瘤转移因子表达的影响。取出肝，称重并计转移结节数。按下列公式计算土贝母苷乙肿瘤生长抑制率，肿瘤转移抑制率及相对肝重。

相对肝重＝肝重/体重

5.1.5免疫组化法检测肿瘤转移因子的表达

石蜡包埋组织块，4μm连续切片，免疫组化法检测土贝母苷乙肿瘤转移因子表达的影响(免疫超敏S-P实验按试剂盒说明操作)。以细胞膜或细胞浆内出现明确的棕黄色颗粒为阳性细胞。促肿瘤转移因子(CD44v6)以胞膜着色为主，少量胞浆着色，阳性显色为棕黄色；促肿瘤转移因子(ErBb-2)以胞膜或胞浆着色为主，阳性显色为棕黄色，；抑肿瘤转移因子(nm23-H1)主要位于胞浆，以胞膜或胞浆淡黄至褐黄色细颗粒状着色为阳性细胞。着淡黄色为弱阳性(+)，棕黄色为阳性(++)，棕褐色为强阳性(+++)，无着色为阴性(-)。

5.2结果

5.2.1土贝母苷乙对接种B16、LLC细胞裸小鼠生长的影响：实验前后与对照组相比，裸鼠的体重无明显改变(表5)。

表5土贝母苷乙对接种B16、LLC细胞裸小鼠生长的影响

组别	用药量	B16		LLC
						体重(g， x±s)		体重(g， x±s)
		实验前	实验后	实验前	实验后
						对照	-	21.3±2.6	21.5±2.2	21.2±2.4	21.8±2.87
土贝母苷乙	2mg/kg·d×14	20.0±1.6	20.3±1.2	20.8±1.9	20.6±2.80
						土贝母苷乙	3m/kg·d×14	20.1±2.3	19.8±2.1	21.0±2.3	20.8±2.53
环磷酰胺	50mg/kg·w×2	21.0±2.1	20.6±2.2	19.9±1.7	19.3±2.6

与对照组比较，^*p＜0.05；^**p＜0.01。

5.2.2土贝母苷乙对接种B16裸小鼠肺重、相对肺重的影响：与对照组相比，土贝母苷乙组裸小鼠的肺重，相对肺重低(表6)。

表6土贝母苷乙对肺重及相对肺重的影响

组别	用药量	肺重(g， x±s)	相对肺重(％)
				对照土贝母苷乙土贝母苷乙环磷酰胺	1.5mg/kg·d×143.0mg/kg·d×1450mg/kg·w×2	0.28±0.030.23±0.020.20±0.02*0.25±0.03	1.30±0.221.13±0.151.01±0.131.21±0.16

与对照组比较，^*p＜0.05；^**p＜0.01。

5.2.3土贝母苷乙对B16细胞实验性肺转移的影响：BALB/c裸小鼠尾静脉接种B16细胞发生肺转移。土贝母苷乙(1.5，3mg/kg·d×14)对B16细胞肺转移的抑制率分别为68.8％和82.8％(表7)。

表7土贝母苷乙对B16细胞实验性肺转移的影响

组别	用药量	转移发生率(％)	转移结节数(个， x±s)	转移抑制率(％)	P值
						对照土贝母苷乙土贝母苷乙环磷酰胺	1.5mg/kg·d×143.0mg/kg·d×1450mg/kg·w×2	8/85/84/84/8	17.80±6.897.16±3.211.99±1.058.76±1.90	59.888.850.8	＜0.05＜0.01＜0.01

5.2.4土贝母苷乙对接种LLC裸小鼠原发瘤生长，肝重、相对肝重的影响：BALB/c裸小鼠接种LLC细胞7天后，可见皮下长出原发瘤。土贝母苷乙可明显抑制原发瘤的生长(图7)，并呈一定的剂量依赖关系(表8)。HE染色病理检查显示，对照组瘤组织边界不清，细胞密集排列，异型性明显，而苷乙组瘤组织中心及边缘见大片状或灶性坏死(图8)。裸鼠连续14天分别腹腔注射土贝母苷乙(1.5，3mg/kg·d)，对原发瘤的生长抑制率分别为49.9％和58.4％。同时，土贝母苷乙(1.5，3mg/kg.d)可明显降低裸鼠的肝重与相对肝重(表8)。

表8土贝母苷乙对接种LLC裸小鼠原发瘤生长、肝重，相对肝重的影响

组别	用药量	瘤重(g， x±s)	抑瘤率(％)	肝重(g， x±s)	相对肝重(％)
						对照土贝母苷乙土贝母苷乙环磷酰胺	-1.5mg/kg·d×143.0mg/kg·d×1450mg/kg·w×2	1.28±0.390.73±0.21*0.45±0.22*0.61±0.18*	-43.064.852.3	1.68±0.211.45±0.191.22±0.16*1.43±0.17	7.89±0.786.97±0.535.81±0.39*7.19±0.69

与对照组比较，^*p＜0.05；^**p＜0.01。

5.2.5土贝母苷乙对LLC自发性肝转移的影响：BALB/c裸鼠背部皮下接种LLC细胞，自发性发生肝转移。在肝表面可见清晰的转移灶。土贝母苷乙可明显抑制LLC细胞的肝转移(表9，图9)。

表9土贝母苷乙对LLC细胞自发性转移的抑制作用

组别	用药量	转移发生率	转移结节数( x±s)	转移抑制率(％)	P值
						对照土贝母苷乙土贝母苷乙环磷酰胺	2mg/kg·d×143mg/kg·d×1450mg/kg·w×2	6/64/63/75/6	99.16±68.1252.18±4.09a39.98±31.9041.90±19.72	47.359.757.7	＜0.05＜0.05＜0.05

5.2.6土贝母苷乙对肿瘤转移因子表达的影响：免疫组化检测的结果显示，在Lewis肺癌细胞中，CD44v6和ErBb-2表达于细胞膜与细胞浆，nm23主要表达于细胞浆；给小鼠注射土贝母苷乙后，Lewis肺癌细胞中促转移基因CD44v6和ErBb-2的表达下调，抑转移基因nm23-H1的表达上调(表10)。

表10土贝母苷乙对肿瘤转移因子表达的影响

组别	CD44vv6	ErBb-2	Nm-23-H1
				对照土贝母苷乙	+++-	++-	-++

实施例

下面的配方举例说明了本发明的剂型。

                    实施例1：片剂，

NO       组分                                   用量

                                         mg/片          mg/片

1        土贝母苷乙

         (或含土贝母苷乙的土贝母皂苷)    100            100

2        乳糖USP                         122            123

3        玉米淀粉，食品级，呈            30             40

         10％的纯水浆状物

4        玉米淀粉，食品级                95             130

5        硬脂酸镁                        3              7

                            合计         350            400

制造方法

在适当的混合机中混合第1项和第2项组分15分钟，第3组分与混合物粒化。如果需要，通过一个初筛研磨潮湿的颗粒，并使之干燥。如果需要，将干燥的颗粒过筛，并与第4项混合10-15分钟。加入第5项混合1-3分钟。在适当的压片机中将混合物压成适当的尺寸和重量。

                    实施例2：胶囊剂

NO    组分                                  用量

                                     mg/粒        mg/粒

1     土贝母苷乙                     50           100

      (或含土贝母苷乙的土贝母皂苷)

2     乳糖USP                        106          120

3     玉米淀粉，食品级               40           73

4     硬脂酸镁NF                     4            7

                    合计             200          300

制造方法

将第1、2和第3项在适当的混合机中混合10-15分钟，加入第4项混合1-3分钟。在适当的包囊机上将该混合物装入适当的胶囊中。

                    实施例3：注射液

土贝母苷乙(或含土贝母苷乙的土贝母皂苷)    10g或50g

葡萄糖                                    490g或450g

注射用水                                  加至10000ml

                    实施例4：栓剂

以生产发明产品10000粒为例所用的原料及其配比为：

土贝母苷乙(或含土贝母苷乙的土贝母皂苷)    300g或600g

吐温80                                    800g或800g

可可豆酯(或半合成脂肪酸甘油)              加至10000g

制造方法

混合：按本实施例的配比称取土贝母苷乙(或含土贝母苷乙的土贝母皂苷)、吐温80和可可豆酯(或半合成脂肪酸甘油)，将可可豆酯(或半合成脂肪酸甘油)放入不锈钢锅水浴加热至大部分溶化，停止加热，然后分别加入吐温80和土贝母苷乙(或含土贝母苷乙的土贝母皂苷)，用不锈钢搅拌机搅拌至混合均匀，便得到本发明的混合药物。润滑剂的配制：用软肥皂和甘油各一份与5倍的80％医用酒精充分混合搅拌均匀，制成润滑剂。

成型：在栓模上涂上已配制的润滑剂。将本发明的混合药物倒入栓模中至溢出模口，让其自然冷却。待完全凝固后，用刀切去溢出部分。然后开启模具，将栓剂从模具中取出。

无菌包装：将所制备的拴剂进行质量检查，每粒重量应为1g，含土贝母苷乙(或含土贝母苷乙的土贝母皂苷)30mg或60mg。检查合格后包装，钴60灭菌。

附图说明

图1.土贝母苷乙的化学结构式

图2.倒置显微镜观察土贝母苷乙作用下ECV-304细胞形态学变化

A：对照，×200；B：30μmol/L  土贝母苷乙，24h，×200。

图3.荧光显微镜下观察土贝母苷乙诱导的ECV-304细胞凋亡形态学变化(Hoechst-PI染色，×400)

A：对照；B：20μmol/L土贝母苷乙，72h。

图4.荧光显微镜下观察土贝母苷乙诱导的ECV-304细胞形态学变化(AO/EB染色，×400)

A：对照；B：20μmol/L土贝母苷乙，72h，

图5.土贝母苷乙对CAM血管生成的抑制作用

A：对照组；B：20μmol/L土贝母苷乙；E：40μmol/L土贝母苷乙。

图6.土贝母苷乙对微血管密度的影响

A：对照；B：土贝母苷乙组。

图7.土贝母苷乙对Lewis肺癌原发瘤生长的影响

A：对照；B：土贝母苷乙。

图8：土贝母苷乙诱导的Lewis肺癌瘤组织的病理变化(HE染色，×200)

A：对照；B：土贝母苷乙。

图9.土贝母苷乙对LLC自发性肝转移的抑制作用

A：对照；B：土贝母苷乙(图中灰白点为转移灶)。

Claims (1)

1.土贝母苷乙或含土贝母苷乙的土贝母皂苷用于制备抗血管生成、抗肿瘤侵袭和转移的药物的用途。

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