CN1329376C - 一种n（1）－烃基－3′－肟基靛玉红衍生物（i）的制备方法及其医学应用 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I，JN-2528)的制备新方法并阐明了其抗肿瘤作用。新的合成方法以靛玉红为起始原料，在碱性化合物的促进下，直接与卤代烃等卤化物反应，得到N(1)-烃基靛玉红，然后，再与羟胺反应得到N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)。采用MTT和SRB法及移植性C57小鼠Lewis肺癌模型，证实了N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红的抗肿瘤活性。该化合物在体外对激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞和激素非依赖性前列腺癌PC-3和DU-145细胞的生长有明显的抑制作用。在体内，JN-2528亦能明显抑制小鼠Lewis肺癌生长。
Description
技术领域
本发明涉及以靛玉红为起始原料制备N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红(结构式I，JN-2528)的新方法，以及其抗肿瘤，治疗老年痴呆症和抗病毒感染等疾病的医药应用。
背景技术
N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)是已知的细胞周期激酶(CDKs)[1-4]，Stat3信息传导系统[5]和糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)[6-8]抑制剂，由于大多数恶性肿瘤细胞中存在着CDKs过度表达或/和相应的基因扩增的情况，所以，抑制CDKs是一个合理的治疗癌症及细胞增殖异常疾病的靶标[4，9]；神经退化和紊乱疾病与神经系统中的GSK-3β过多有关，故N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)是治疗神经系统疾病，诸如老年痴呆症等[10]潜在的有效药物；对于病毒如艾滋病毒(HIV)[11]和巨细胞病毒[12]等，这类靛玉红衍生物都具有杀灭作用。因此，研究合成这类靛玉红衍生物的新方法及其化合物的医药应用倍受到人们的关注。
现有制备N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)的方法主要有以下两种：
绝大多数文献报道的制备N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)的方法，是以靛红(Isatin，或称吲哚满二酮)为起始原料，经烃化得N(1)-烃基靛红，再与3-吲哚醇(3-Indolol，或称3-Indoxyl)经缩合而得N(1)-烃基靛玉红衍生物(II)[13-16][Eisenbrand.EP 98109845.2,1998-5-29；WO 99/62503，1999-12-9；Eisenbrand.EP 99706207.6，1999-4-12；WO 00/61555，2000-10-19]，最后，再与羟胺反应，制得化合物I(见图-2)。
该法反应步骤较多，为三步，在第二步制备N(1)-烃基靛玉红衍生物(II)时，常产生双吲哚衍生物异构体，如靛兰等，以及其它杂质，给分离纯化带来困难，影响了II的产率，这是该法的缺陷所在。
用相转移催化法制备N(1)-烃基靛玉红衍生物(II)，该法直接以靛玉红为原料，在多相介质25％NaOH-THF中，经相转移催化剂TEBA(三乙基苄基氯化铵)作用，与RX反应制得中间体II[17，18]，然后，与图-2相似，II和羟胺反应，制得化合物I，见图-3。
该法反应步骤减少，但由于在强碱水溶液中与THF中反应，破坏了2-羰基与N(1′)-氢原子间的氢键，使烃化反应失去选择性，部分N(1′)-位也被烃化，较难分离，影响化合物I的收率与纯度。
另一方面，决定化合物是否有医药应用价值至少有如下先决条件：1)药物分子具有与靶分子，靶细胞或靶器官相互作用而纠正其病理病变的能力；2)药物分子具有通过生物膜而到达靶标的能力；3)药物分子应具有较好的选择性进而有较小的毒副作用。
靛玉红是双吲哚杂环平面结构的化合物，其分子大小恰巧与细胞周期激酶(CDK)中的ATP结合位点相当，进而与细胞内ATP竟争与CDK相结合而抑制CDK活性。但由于靛玉红不能与CDK蛋白形成H键，使得靛玉红与CDK间的结合亲和力小，对酶活性抑制作用较弱。在本发明化合物中，我们在靛玉红3′-位上引进了肟基，能与CDK分子中ATP结合中心形成稳定的氢键，进而增强了该化合物与CDK亲和力而具有较强的酶抑制作用。但由于靛玉红的双吲哚杂环平面结构，有较大的极性，该理化性质决定了其水溶性和油溶性都很差，不易通过生物膜而到达药物作用部位，生物利用度差。例如欧洲发明专利中的化合物Indirubin-3′-monoxime-5 Sulphonic acid(IMSA)[EP1079826B1]，虽然在无细胞实验系统中，有很强的CDK抑制作用，但该化合物极性极大，无法通过细胞膜，故在细胞系统中我们已证明无任何生物学功能，见实验例二。
发明内容
本发明目的在于：提供以靛玉红为原料制备N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)的简便的合成方法。
本发明目的还在于：使反应在无水状态下进行，避免在制各中间体II的过程中产生异构体或其它副产物，便于中间体II的纯化，有利于最终产物的合成与纯化。
本发明的目的还在于寻求N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物在治疗和预防癌症中的应用。通过在靛玉红分子中引进二个重要化学功能基团：3-′肟基和N-烃基，使得所得到的新衍生物具有更大的CDK亲和力和更大的脂溶性，进而增强了生物学活性和生物利用度而具有医药应有价值。
本发明的技术方案是：N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)制备方法，包括如下两步反应：
步骤1、将靛玉红溶于无水的有机极性溶剂中，冷却后，加入碱性促进剂，接着分批加入卤代烃RX，这里R为C1～5烷基、C2～5烯烃和芳基等；X为Br或I。经反应，选择性地制得单一的N(1)-烃基靛玉红衍生物(II)；
步骤2、将中间体II加入含水的醇R′OH中，溶解后，加入羟胺盐酸盐，加入少许碱性物质，以中和盐酸，然后加热至回流，数小时后，反应结束，制得N
(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)。
上述制备N(1)-烃基-3′肟基靛玉红衍生物(I)的过程可用下述方程式表示：
上述技术方案中，“步骤1”中使用的无水极性溶剂是四氢呋喃(THF)、或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、或N，N-二甲基乙酰胺(DMA)等，尤以后两种溶剂为佳；冷却温度在-10-5℃之间；所加的碱性促进剂包括无机碱性物质，如Na2CO3、K2CO3、NaOH、KOH和NaH等，以及强有机碱性物质，如DBU等，它们和起始原料靛玉红的摩尔比为1.0～1.8；较优选的碱性促进剂是NaH和DBU，它们与原料靛玉红的摩尔比选为1.3～1.6，加料与反应温度为-2～5℃ 。
上述技术方案中，“步骤1”中使用的卤代烃RX，R为C1～5烷基、C2～5烯烃和芳基等；R为烷基时，可为直链的、带支链的和相应环状烷基；R为烯烃时，一般为单烯烃，可为直链或带支链烯烃；R为芳基时，常选用苄基、带有单个或多个吸电基团的苯基。X为Br或I(碘)。RX和起始原料靛玉红的摩尔比为1.0～1.8，较优选1.3～1.6。
上述技术方案中，“步骤1”中反应结束以TLC测定为依据，结束后，可将溶剂在低温真空条件下除去，或者直接将反应液搅拌下倒入冰水中，析出中间体II，经过滤，水洗数次，得粗品II，经重结晶或硅胶柱层析纯化等方法，得纯度高的N(1)-烃基靛玉红衍生物(II)。经上述技术条件制得的II为单一的N(1)-烃基靛玉红，其结构确证见实施例中N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)晶体X-衍射结构鉴定结果。
上述技术方案中，“步骤2”中由中间体II和羟胺反应制得N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)，其制备是以醇R’OH为溶剂，这里的R’为甲基、乙基、丙基、异丙基等，以选用前两种醇为优；醇中含水量在5～35％之间，以15～25％为佳；加入中间体II后，添加的碱性物质为NaOH、或KOH、或醇钠和醇钾等，其用量达到使反应液的pH值＞6为标准，然后，加热回流，直至TLC检测显示反应完成。回流时间与加入的碱量呈反比。
上述技术方案中，“步骤2”中反应结束后，将溶剂真空浓缩除去，加入水；或直接将反应液倒入大量水中；用酸中和后，析出N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)粗品固体，过滤洗涤后，干燥，经重结晶得化合物I纯品。重结晶在极性溶剂中进行，以丙酮或乙腈，或它们的混合液为佳。
本发明的有益效果是：以靛玉红为原料，以其它易得的原辅材料进行较大规模生产N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)，其方法经济、简捷。
本发明中，第一步反应所产生的中间体II单一，所选用的反应条件避免了异构体或其它副产物产生和积累，易于中间体II纯化，从而形成一种制备高纯度N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)的新方法。
上述N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)制备方法是，将靛玉红溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、或N，N-二甲基乙酰胺(DMA)中，在-2～5℃条件下，加NaH或DBU，它们与原料靛玉红的摩尔比选为1.3～1.6；然后，加入卤代烃RX，RX和起始原料靛玉红的摩尔比为1.3～1.6。反应结束以TLC测定为依据，结束后，将反应液搅拌下倒入冰水中，析出中间体II，经过滤，水洗数次，得粗品II，经重结晶或硅胶柱层析纯化等方法，得纯度高的N(1)-烃基靛玉红衍生物(II)。中间体II和羟胺在含水量为15～25％甲醇或乙醇中回流，制得化合物I粗品，经丙酮或乙腈重结晶，得N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)。
较优的N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)制备方法是，将靛玉红溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在-2～5℃条件下，加NaH，它与原料靛玉红的摩尔比选为1.3～1.5；然后，加入卤代烃RX，RX和起始原料靛玉红的摩尔比为1.3～1.5。反应结束以TLC测定为依据，结束后，将反应液搅拌下倒入冰水中，析出中间体II，经过滤，水洗数次，得粗品II，经硅胶柱层析纯化，得纯度高的N(1)-烃基靛玉红衍生物(II)。中间体II和羟胺在含水量为25％乙醇中回流，制得化合物I粗品，经丙酮重结晶，得N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)。
N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)是CDK抑制剂，可用于肿瘤的治疗和预防。其结构式如下：
所指的肿瘤包括各种白血病和各种实体瘤。
在使用时，可以是单药治疗，亦可以是联合治疗。联合治疗可以是与其它化疗联用，亦可以与中草药联用，或是与手术，放疗，免疫治疗，激素治疗，基因治疗等联用。联合治疗可以是同时治疗，亦可以是不同先后次序治疗。
JN-2528系列化合物作为药用，可以采用任何给药途经，任何给药方式。即可以口服，注射，吸入，透皮吸收，植入，腔道，黏膜，以及静脉滴注等。
JN-2528系列化合物作为药用，可以制成片剂，丸剂，胶囊剂，膏剂，霜剂，贴剂，粉剂，针剂，喷雾剂，植入剂，拴剂，滴剂等多种剂型。
本发明通过MTT和SRB法，对抗癌活性研究表明，NJ-2528对乳腺癌，肝癌，肺癌，胃癌，结肠癌，宫颈癌，黑色素瘤，激素依赖型和激素非依赖型前列腺癌以及神经母细胞瘤都具有较好的抗癌作用。尤为重要的是JN-2528对临床上束手无策的激素非依赖型前列腺癌亦具有与激素依赖型前列腺癌相同的抑制作用。
应该指出，JN-2528在肿瘤治疗过程中，可以是单药治疗，亦可以是与2种，3种或更多药物联合治疗，同时给药，或不同先后次序给药。这里所说的联合治疗，可以是与其它西药，中草药合并使用，或与激素治疗，放射治疗，免疫治疗，化疗，冷冻治疗以及基因治疗合并治疗。
该项发明提供的药物产品治疗肿瘤，这些产品含有有效剂量的JN-2528和其它制药工业所采用的一切适宜添加剂，以及各种适宜的给药途经。娴熟的药物生产工艺包括使用无毒的制药工业所接受的药物前体为原料，采用多种方法从天然材料中提取或人工合成JN-2528。娴熟的药物生产工艺还包括使用制药工业所接受的溶剂作为JN-2528的溶媒，例如水，矿物油，食用油，二甲基亚砜，等。
JN-2528可制成口服给药，局部用药，吸入给药，肛门给药等剂型。使用无毒的制药工业所接受的材料作为载体，附加剂，赋型剂。再次指出的是给药方式可以是联合用药。口服给药剂型包括：片剂，胶囊，酊剂，锭剂，口服糖浆或其它一切适用剂型。
JN-2528可制成系统给药剂型，包括：皮下注射，皮内注射，肌肉注射，静脉注射，脊椎注射，鞘内注射，或其它任何注射给药和滴注。除此之外，JN-2528制剂除含有有效剂量的JN-2528外，尚可含有其它药学上一切可用的无毒物质。包括一种或多种载体，稀释剂，附加剂，以及如果需要的话，其它药用成份。
JN-2528可制成任何形式的口服剂型，包括：片剂，锭剂，软硬胶囊，可服水剂，酊剂，口服混悬液，粉剂，乳化剂等。口服剂型可含有一种或多种甜味剂，矫味剂，颜色剂及防腐剂，以保证色彩完美和便于服用。
用于JN-2528片剂的赋型剂可以是惰性的稀释剂，如碳酸钙，碳酸钠，乳酸钙，磷酸钙，磷酸钠；制颗粒剂：玉米淀粉，藻朊酸；粘合剂：淀粉，明胶或是阿拉伯胶；滑润剂：硬脂酸，硬脂酸镁或滑石粉。采用一切已知技术，制成包衣或无衣片剂。包衣剂型包括肠溶衣和缓释剂型。用于缓释剂型的材料可以是甘油单脂或甘油二脂盐。
JN-2528胶囊可以是硬胶囊，亦可以是软胶囊。用于硬胶囊的辅料可以是碳酸钙，磷酸钙或高岭土。用于软胶囊的辅料如水，油类包括花生油，橄榄油或液态石蜡。
JN-2528口服水型混悬液可将有效剂量的JN-2528与合适的稀释剂配制而成。其稀释混悬剂可以是羟甲基纤维素钠或甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，藻酸钠盐，聚乙烯吡咯烷酮，西黄耆胶，阿拉伯胶。分散剂或湿润剂包括：天然磷脂，如卵磷脂，或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合物，如17烷基乙烯氧化烷醇，或是乙烯与脂肪酸部分酯化缩合物，或是己糖醇如聚氧乙烯山梨醇单油酸盐，或是氧化乙烯和脂肪酸部分脂肪缩合产物，以及乙醇酐，如聚乙烯山梨醇甲酯酸盐。
JN-2528口服水型混悬液也可能含有一种或多种防腐剂，如乙基对或邻羟基苯安息香盐；含一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
JN-2528油型混悬液可将有效剂量的JN-2528混悬于植物油中，如大豆油，花生油，玉米油，橄榄油，芝麻油，可可油。或是矿物油，如液态石蜡。该制剂亦可含有稀释剂，如蜂蜡，蜡，或十六烷醇，上文所述的甜味剂，以及矫味剂和稳定剂，如抗氧化剂维生素C(抗坏血酸)。
采用如上所述的分散剂，湿润剂，混悬剂，防腐剂，矫味剂，甜味剂，以及着色剂，JN-2528亦可制成水包油型制剂。JN-2528制成水包油型乳化剂。其油相可以是如上所述的植物油，如大豆油，橄榄油，花生油等。亦可以是液态石蜡，矿物油，或是二类的混合物。乳化剂可以是天然的乳化剂，如金合欢胶，或是西黄耆胶，天然磷脂如大豆磷脂，卵磷脂，脂肪酸，己糖醇或酐的脂或半脂化物，如山梨糖单脂。亦可是人造化工材料，如氧化乙烯半脂缩合物，聚乙烯山梨醇单脂盐。JN-2528的水包油型乳化制剂亦可含有甜味剂和矫味剂等。
JN-2528的糖浆剂和酊剂可采用甜味剂，如丙醇，丙二醇，山梨醇或蔗糖。该制剂亦可含有湿润剂，防腐剂，矫味剂，颜色添加剂。
JN-2528的注射剂可采用无菌注射液或是油状混悬液。其可运用药剂学上一切适用的分散剂，湿润剂或混悬剂。该制剂可以是无菌透明液，使用药剂学上一切适用的稀释剂，如1，3-丁二醇，水，林格氏溶液，或生理盐水。此外，无菌油脂类亦可作为溶剂或混悬剂。其可以是合成的甘油单脂或二脂，脂肪酸，如油酸等。
JN-2528亦可制成栓剂，如肛门栓剂等。栓剂可由一定量的JN-2528与相应的无刺激赋型剂组合而成。赋型剂在常温下为固体，但在肛门体温下液化而释放药物。适用的赋型剂包括可可脂和聚乙烯二醇类。
JN-2528的系统给药剂型，根据所用载体浓度，可以是混悬型，亦可是溶解型。为了使用便利或减轻病人痛苦，可添加防腐剂，缓冲剂和局部麻醉剂。
JN-2528亦可作为兽医用药。为便于动物服用，含有JN-2528的制剂可加入动物饲料中或饮水中。亦可制成方便的剂型作为动物的食品或饮品。
对于人，在治疗上述疾病时，JN-2528的剂量范围初步定为每公斤体重0.01mg至20mg，或按人均体重60公斤计大约每天0.6mg至1200mg。根据给药方式，JN-2528可制成单一剂量剂型或多剂量剂型。剂量单位初步定为含有效成份1mg至500mg。
每日给药次数依病种而定。多数情况下，每日不多于四次。应指出的是，给药剂量可能取决于多种因素，如年龄，体重，健康状况，性别，饮食，以及给药时间，途径，病情，和药物的联合使用等。于是，最终给药方案应由医生根据具体情况而决定。
该专利所提及的优先化合物，有理想的药理学性如：优越的口服生物利用度，低毒性，低血浆蛋白结合率和理想的体内外半衰期。这类化合物能通过血脑屏障，这对治疗中枢神经系统疾病是优点。
本发明在3′-肟基靛玉红分子的N(1)-位引进了乙基，得到N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红(JN-2528)。我们的实验表明，本专利化合物N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红与同类化合物相比具有如下特点：
1、在无细胞实验系统中，JN-2528与Indirubin-3’-monoxime-5 Sulphonic acid(IMSA)相似，具有较强的CDK抑制作用(IC50为0.78μM)。但IMSA因无法通过细胞生物膜，进而本专利已证明该化合物对所试细胞无任何生长抑制作用。与此相反，JN-2528，无论是体外，还是体内都具有较强的生物学活性。
2、与靛玉红相比，在无细胞实验系统中，JN-2528对CDK的抑制作用较靛玉红强大约20倍，同时由于JN-2528的脂溶性增加，体内生物活性亦明显强于靛玉红。
3、传统肿瘤化疗药物，对正常细胞缺乏选择性，故毒性大。JN-2528选择性地抑制癌细胞中的异常CDK，故对正常细胞无影响，毒性作用极低。在有效抗癌剂量下，无任何毒副作用。
附图说明
附图1为N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)的结构。
附图2为制备化合物I最常用的方法。
附图3为相转移催化法制备化合物I。
附图4为本发明专利方法制备化合物I。
附图5为1-乙基-3-肟-靛玉红晶体结构X-衍射测定结果。
具体实施方式
实验例一，N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红的制备：
步骤a、1-乙基-靛玉红
[步骤a]：在由2.62克靛玉红(10mmol)和40mL无水DMF所组成的溶液中加入0.6克NaH(15mmol)，在N2环境下搅拌，并将混合物冷却到0℃，缓慢滴加由1.15mL碘乙烷(15mmol)和DMF(5mL)组成溶液，加完后缓慢返回室温，搅拌3小时，TLC检测(展开剂同上)。反应完成后，搅拌下小心倒入300mL冰水中，用氯仿萃取3次(150mL×3)，合并有机相，用无水Na2SO4干燥后真空浓缩至干，残留物用硅胶柱层析纯化(洗脱液为：氯仿/石油醚，5/1(v/v))，得1.5克紫色粉末固体1-乙基-靛玉红，收率52％；熔点大于200℃(分解)。1HNMR(CDCl3)δ：1.33(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，3.89(q，J＝7.2Hz，2H，CH2)，6.89(m，1H，H-Ph)，6.96(m，1H，H-Ph)，7.00(m，1H，H-Ph)，7.13(m，1H，H-Ph)，7.28(m，1H，H-Ph)，7.52(d，J＝7.6Hz，1H，H-Ph)，7.74(d，J＝7.6Hz，1H，H-Ph)，8.90(d，J＝7.6Hz，1H，H-Ph)，10.56(bs，1H，NH-1)；Anal.Calcd for C18H14N2O2(Mr＝290.32)：C74.47，H4.86，N9.65；foundC74.33，H4.85，N9.21.
[步骤b]：投料与反应过程与上一致，反应结束后，倒入300mL冰水中，搅拌后有大量紫红色固体析出(注：这里不用氯仿萃取，此处区别于法A)，过滤，水洗至中性，干燥后，按法A进行柱层析纯化。
步骤b、1-乙基-3-肟-靛玉红
[步骤a]：1.2克1-乙基-靛玉红(2.9mmol)加到50mL75％的乙醇中，接着加盐酸羟胺2.0克(29mmol)，分批加KOH，使反应液pH调至5～6，回流15小时，TLC检测(展开剂同上)。反应完成后，倒入酸性(少许HCl)水中，析得深橙红色粉末固体，经过滤，水洗至中性，干燥和重结晶，可得1-乙基-3-肟-靛玉红0.65克，收率75％。1HNMR(CD3COCD3)δ：1.28(t，J＝7.2Hz，3H，CH3)，3.94(q，J＝7.2Hz，2H，CH2)，6.98(m，1H，H-Ph)，7.07(m，2H，H-Ph)，7.10(m，1H，H-Ph)，7.20(m，1H，H-Ph)，7.35(m，1H，H-Ph)，7.45(m，1H，H-Ph)，8.38(d，J＝7.8Hz，1H，H-Ph)，8.71(d，J＝7.8Hz，1H，H-Ph)，10.56(bs，1H，NH-1)；ESI-MS(70V)m/z：304.1(M-H)-，C18H15N3O2(Mr＝305.3)。
[步骤b]：1.2克1-乙基-靛玉红(2.9mmol)悬浮于45mL 95％的乙醇中，依次加入2.0克盐酸羟胺和8克KOH，回流2h后，冷至室温，再倒入300mL水中，不溶物滤去，滤液中加乙酸中和，产生的红色固体沉淀，过滤，水洗，干燥，得粗产品(收率高于步骤a)。可用丙酮重结晶纯化。
1-乙基-3-肟-靛玉红晶体结构X-衍射测定结果见图-5。
实验例二，N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红的体外抗肿瘤作用：
N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红和N(1)-乙酰基-靛玉红激素对依赖型和非依赖型前列腺癌的抑制作用。
下文例举的是JN-2528(N(1))-烃基-3′-肟基靛玉红)化合物对肿瘤治疗的一些实例。在此我们再次重申，虽然我们仅仅以治疗肿瘤为例，但这并不意味着这些化合物仅仅用于治疗肿瘤。
(一)材料与方法
试剂：JN-2528化合物，由我们实验室合成并纯化，以质谱，核磁，红外，以及X-衍射确认结构(见实例一)。纯度为＞98.0％。JN-2528为红色及暗红色结晶粉末。实验时，以DMSO配成溶液，于-20℃保存。欧洲专利类似化合物Indirubin-3’-monoxime-5 Sulphonic acid(IMSA)[EP1079826B1]，维甲酸，柔红霉素，紫杉醇购于美国Sigma化学试剂公司。实验用的其它化学试剂，除特别说明外，均购于美国Sigma化学试剂公司。
细胞培养：人癌细胞系，乳腺癌，MCF-7；结肠癌，LOVO：前列腺癌，雄激素依赖型LNCAP和雄激素非依赖型PC-3，DU145；神经母细胞瘤：N2A细胞购于American Type Culture Collection。细胞置于37℃，5％CO2温箱中，以含10％胎牛血清和青霉素和链霉素的RPMI1640培养基培养。
MTT和SRB：MTT和SRB实验方法如文献所述[19]，简述如下：取对数生长期的癌细胞，接种于96-孔板中，细胞密度为每孔5000细胞/200L。24小时后加入等系列稀释的药物。细胞在药物作用下，继续培养72小时。每孔取出100μL的培养液后，加入501MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide]溶液继续培养4小时。以200L盐酸-异丙醇溶液溶解紫黑色的甲潜沉淀物，于540nm波长处测定光吸收值。若采用SRB法，则在72小时后，除去所有的培养液，细胞以10％三氯醋酸固定1小时后，置空气中自然干燥24小时，加入50 ISRB(sulforhodamine B)染色20-30分钟，以1％冰醋酸洗涤5次，置空气中自然干燥后，加入200l的10mM Tris-HCl(pH10.0)溶液溶解紫红色蛋白-SRB复合物，于600nm波长处测定光吸收值。求得各组试验数据的平均值，以实验组对对照组计算得细胞生成抑制率。以Sigma Plot绘图软件绘得细胞生长率-药物浓度半对数曲线，并求得药物的半数有效浓度(IC50)。
(二)结果：
采用MTT及SRB二种分析方法，我们对JN-2528的抗癌活性进行了研究。表1～3列出的是JN-2528及其它化疗药物对各种癌细胞的半数有效抑制浓度。由表1～3可以看出，不管是乳腺癌(MCF-7，表1)，结肠癌(LOVO，表2)，激素依赖型(LNCAP)和激素非依赖型前列腺癌(PC-3，DU-145，表3)，对JN-2528有一定的敏感性，其半数有效抑制浓度IC50在4～14M之间(见表1-3)，与临床常见的化疗药物相似。这一结果说明JN-2528具有抗癌活性。
表1：JN2528对乳腺癌细胞半数有效抑制浓度(IC50，μM)及与其它化疗药物的比较(MTT法)。
| 药物 | 细胞系MCF-7 |
| JN-2528 | 6.72±0.54 |
| 柔红霉素 | 0.054±0.011 |
| 维甲酸 | 21.45±3.78 |
| NS389 | ＞200 |
表2：JN-2528对结肠癌细胞的半数抑制有效浓度(IC50，M)及与其它化疗药物的比较(MTT法)。
| 药物 | 细胞系LOVO |
| JN-2528 | 8.49±0.733 |
| 柔红霉素 | 0.035±0.04 |
| 维甲酸 | 75.34±12.49 |
| 紫杉醇 | 0.0037±0.0005 |
| NS389 | ＞200 |
表3：JN-2528对前列腺癌细胞的半数抑制有效浓度(IC50，M)及与其它化疗药物的比较(MTT法，3天)。
| 药物 | 细胞系 | ||
| LNCAP | PC-3 | DU145 | |
| JN-2528 | 10.34±0.42 | 13.38±0.59 | 7.44±0.76 |
| 柔红霉素 | N/A | 0.24±0.02 | 0.11±0.01 |
| 维甲酸 | 15.95±3.19 | ＞50 | ＞50 |
| NS389 | 65.54±9.46 | ＞200 | ＞200 |
| Proscar | 40.60±7.12 | 133.68±12.94 | N/A |
| Casodex | 57.40±7.21 | 120.11±17.31 | N/A |
| 紫杉醇 | 0.00035±0.0001 | 0.00296±0.001 | 0.00577±0.001 |
(三)讨论
通过MTT和SRB实验，不难看出JN-2528具有较强的抗癌活性，其对癌细胞抑制作用比细胞诱导分化剂维甲酸(Retinoid acid，IC50：21.5-＞50M)及新型环氧化物酶II抑制剂NS389(IC50＞200M)强得多。值得注意的是，与欧洲发明专利中的同类化合物Indirubin-3’-monoxime-5 Sulphonic acid(IMSA)相比较[EP1079826B1]，虽然IMSA在无细胞实验体系中对细胞周期激酶(CDK)具有极强的抑制作用，但我们实验证明IMSA对癌细胞的生长无抑制作用。这是因为IMSA极性太大，无法通过生物膜。本发明的重要理论依据之一就是改善化合物的理化性质，增强脂溶性，以便于其通过细胞生物膜发挥药物活性。
JN-2528对激素依赖型前列癌细胞LNCAP的抑制作用亦强于临床所常用的Casodex(IC50：57.4M)和Proscar(IC50：40.6M)。更为重要的是，对于临床上束手无策的激素非依赖型前列腺癌细胞(PC-3，DU-145)，JN-2528亦具有很好的抑制作用。相比之下，PC-3和DU-145细胞对紫杉醇敏感性则下降了近10倍。
虽然与柔红霉素或紫杉醇相比，JN-2528抗癌作用略微逊色，但前者在有效的药物浓度下即已产生较强的毒副作用，如紫杉醇在血浆药物浓度0.05M时即产生严重的骨髓抑制。而JN-25288毒性很低，初步实验表明该化合物的小鼠LD50大约为3.5g/kg。
值得指出的是，虽然LNCAP细胞对紫杉醇很为敏感，但实验很难测得其IC90，因为不管紫杉醇浓度多大，总有约15-20％左右的细胞不敏感。究其原因极有可能是这些细胞在紫杉醇作用下，进入G0期而躲避药物的进一步作用。与之相反，JN-2528有很好的疗效-浓度曲线。这一结果也表明，JN-2528若与紫杉醇不同先后顺序给药，则可能产生显着的协同作用。
此外，JN-2528对所试不同种类肿瘤细胞的IC50无显著差异，这与其它化疗药物不同，如结肠癌和乳腺癌细胞对柔红霉素较前列腺癌细胞敏感，这说明JN-2528作用于细胞生成的公共靶点。
实验例三，N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红的体内抗肿瘤作用
(一)材料与方法：
材料：C57BL/6小鼠，全雄，25±2g。南京大学模式动物中心提供。Lewis肺癌细胞株，南京中医药大学提供。JN-2528冻干粉，批号：050418-1。每瓶1mg，加1ml生理盐水，配成1mg/ml，由无锡杰西医药公司提供。环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号04081921。
仪器：赛多利斯BP-310电子天平。超净工作台。玻璃匀浆器。手术器械若干套。
方法：无菌操作下取Lewis肺癌瘤块，除去坏死组织，将数个瘤块混合，剪成小块，加入PBS用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入离心管，1000rpm离心5分钟，去上清，加生理盐水适量稀释成1∶3-1∶4的瘤细胞悬液。用1ml一次性注射器抽吸，每次抽吸前将细胞混匀。小鼠右腋皮下接种0.2mL瘤细胞悬液。整个操作尽快在30min内完成。
次日将荷瘤小鼠随机分成四组，每组10只，并开始腹腔给药，连续10天。末次给药的次日处死小鼠，先称体重，后解剖皮下瘤块，剔除正常组织，称瘤净重。按如下公式计算抑制率：
其中阳性对照组，每日腹腔注一次环磷酰胺，剂量为100mg/kg体重，连续10天。JN2528治疗组，剂量为：15mg/kg和30mg/kg，隔日腹腔注射一次。非治疗组(模型对照组)，每日腹腔注射0.2ml的生理盐水。
(二)结果与讨论：由实验结果(表4)可以看出，虽然仅仅以15mg/kg和30mg/kg剂量给药5次，JN-2528就已显示了明显的抗Lewis肺癌作用，抑制率分别为30.75％和44.36％。与阳性药环磷酰胺相比，似乎JN-2528作用较环磷酰胺为弱，但应该指出的是，环磷酰胺剂量为100mg/kg，并且是每日给药，即实际剂量大约是JN-2528的7倍。另一重要事实是，环磷酰胺是细胞毒药物，与其它细胞毒类药物一样，具有作用快，作用强的特点，但缺乏选择性。从我们的实验亦可以看出，在所用剂量下，环磷酰胺已出现严重的毒性作用。其表现在与对照组相比，环磷酰胺组动物体重下降了22％，超过最大耐受剂量(MTD)所允许的体重下降范围(10％)。与此相反，JN-2528具有很好的选择性，在有效药物剂量下，明显抑制Lewis肺癌的生成，但动物没有出现明显的毒性反应。用药后动物体重与对照组相比，无任何差别。这与药物最初的设计目标相一致。其抗癌作用亦可通过增加药物剂量而提高。因此，有理由相信JN-2528具有很好的应用前景。结果显示，JN-2528组实体瘤瘤重较模型组有明显下降。
表4：药物对C57/B6鼠接种Lewis肺癌的影响
| 组别 | 动物数(只) | 剂量(mg/kg) | 瘤重(g) | 体重(g) | 抑瘤率(％) | |
| 治疗前 | 治疗后 | |||||
| 模型组 | 10 | 0 | 2.04±0.84 | 29.5+4.5 | 37.8+1.7 | - |
| 阳性药 | 11 | 100a | 0.025±0.008** | 28.40+3.7 | 21.8+2.3** | 98.79 |
| JN-2528 | 12 | 15b | 1.31±0.52* | 25.5+2.54 | 38.38+2.3 | 35.76 |
| JN-2528 | 9 | 30b | 0.91±0.57** | 26.7+1.4 | 44.38+3.1 | 55.50 |
a：每日给药；b：隔日给药；*与模型对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
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Claims (12)
1、一种N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)的制备方法，包括如下两步反应：步骤(1)、靛玉红溶于无水的有机极性溶剂中，在冷却和碱性促进剂条件下，与卤代烃RX反应，这里R为C1～5烷基、C2～5烯烃和芳基；X为Br或I；选择性地制得单一的N(1)-烃基靛玉红衍生物(II)；步骤(2)、中间体II在含水的醇R’OH中和羟胺盐酸盐，在碱性条件下加热至回流，制得N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)。
2、权利要求1所述的以靛玉红为原料制备N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)的反应方程式为：
3、N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)和N(1)-烃基靛玉红衍生物(II)在制备细胞周期激酶抑制剂中的应用。
4、细胞周期激酶抑制剂N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)和N(1)-烃基靛玉红衍生物(II)在制备用于治疗恶性肿瘤，心血管疾病，肾小管化而导致的肾炎，神经系统紊乱疾病，牛皮癣，及爱滋病的药物中的应用。
5、如权利要求4所述的化合物在制备治疗疾病中药物中的应用，其中所述化合物可制成如下剂型：小针注射剂或中针注射剂或大针注射剂或粉针注射剂或注射用乳剂或片剂或丸剂或胶囊剂或膏剂或霜剂或贴剂或搽剂或粉剂或喷雾剂或植入剂或滴剂或栓剂或软膏剂或糖果剂。
6、如权利要求5所述的化合物在制备治疗疾病的药物中的应用，其中所述化合物采用各种途径给药：口服给药，注射给药，植入给药，腔内给药，舌下给药，肛门给药，透皮给药，内外敷。
7、如权利要求6所述的应用，其中所述的注射给药是：静脉注射，肌肉注射，皮下注射，腔内注射；所述化合物是单药治疗，或与放射治疗联合使用或与中草药联合使用或与外科手术联合使用或与生物调节剂联合使用或与基因治疗联合使用。
8、如权利要求1所述的制备N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)的方法，其中步骤(1)中使用的无水极性溶剂为四氢呋喃、或N，N-二甲基甲酰胺、或N，N-二甲基乙酰胺；所述冷却温度在-10～5℃之间；所加的碱性促进剂为选自Na2CO3、K2CO3、NaOH、KOH和NaH的无机碱性物质和包括DBU的强有机碱性物质，其与原料靛玉红的摩尔比为1.0～1.8。
9、如权利要求8所述的制备方法，其中所述无水极性溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、或N，N-二甲基乙酰胺；所述的碱性促进剂为NaH和DBU，其与原料靛玉红的摩尔比为1.3～1.6，加料与反应温度为-2～5℃。
10、如权利要求1所述的制备N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)方法，其中步骤(1)中使用的卤代烃RX，所述的R基团选自C1～5烷基、C2～5烯烃和芳基，所述的X基团为Br或I，RX和起始原料靛玉红的摩尔比为1.0～1.8。
11、如权利要求10所述的制备方法，其中当R为烷基时，为直链的、带支链的和相应环状烷基；当R为烯烃时，为直链或带支链烯烃的单烯烃；当R为芳基时，为苄基、带有单个或多个吸电基团的苯基；RX和起始原料靛玉红的摩尔比为1.3～1.6。
12、如权利要求1所述的N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)制备方法，其中将靛玉红溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在-2～5℃条件下，加NaH，使其与原料靛玉红的摩尔比为1.3～1.5；然后，加入卤代烃RX，RX和起始原料靛玉红的摩尔比为1.3～1.5；反应结束以TLC测定为依据，结束后，将反应液搅拌下倒入冰水中，析出中间体II，经过滤，水洗数次，得粗品II，经硅胶柱层析纯化，得纯度高的N(1)-烃基靛玉红衍生物(II)；中间体II和羟胺在含水量为25％乙醇中回流，制得化合物I粗品，经丙酮重结晶，得N(1)-烃基-3′-肟基靛玉红衍生物(I)。
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