CN109276572B

CN109276572B - 马钱苷元和5氟尿嘧啶联用在胃癌治疗中的应用

Info

Publication number: CN109276572B
Application number: CN201811368230.8A
Authority: CN
Inventors: 杨柳; 黄东胜; 周怀香; 胡晓歌
Original assignee: Zhejiang Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Zhejiang Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2038-11-16
Also published as: CN109276572A

Abstract

本发明公开了一种中药单体——马钱苷元与5氟尿嘧啶联用在胃癌治疗中的重要作用及相应的生物学功能、机制。所述方法包括马钱苷元与5氟尿嘧啶联用对抑制HGC27和MGC803细胞的增殖，侵袭和转移的协同作用，以及所述马钱苷元与5氟尿嘧啶协同治疗胃癌患者的分子机制。本发明为设计协同抗胃癌药物提供了新的思路，并为治疗胃癌药物的开发提供了理论基础。

Description

马钱苷元和5氟尿嘧啶联用在胃癌治疗中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤生物治疗领域，涉及中药单体——马钱苷元和5氟尿嘧啶联用在胃癌治疗中的应用。

背景技术

胃癌是世界上第四大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。晚期胃癌是一种侵袭性疾病，预后仍然很差。虽然已经开发了各种治疗方式，并且近几十年来胃癌的死亡率逐渐下降，但目前为止仍然没有合适的药物能够有效地消除胃癌细胞。因此，临床上急迫的需要一种新的治疗策略。

山茱萸是山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc的成熟干燥果肉，是我国传统珍稀药材和常用名贵中药，研究表明，山茱萸具有增强免疫力、抗肿瘤等功效。山茱萸主要有效成分为马钱苷。马钱苷为环烯醚萜苷类成分，中国药典从2005版起，将马钱苷作为中药材山茱萸的质量控制指标之一，规定其含量不得低于0.6％，其具有对非特异性免疫功能有增强作用，能促进巨噬细胞吞噬功能，延缓衰老。有良好的防癌防辐射功效，作为新型抗癌类药物广泛应用在临床药物。马钱苷元(Loganetin)是马钱苷的水解产物，目前还未见任何关于马钱苷元在抗胃癌方面的研究与应用。

发明内容

为了克服现有的治疗胃癌药物的副作用较大，治疗效果欠佳的技术不足，本发明提供一种治疗胃癌的药物组合物，其由5氟尿嘧啶和马钱苷元组合。两种药物活性成分在抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和转移方面具有显著的协同作用，说明其对胃癌的治疗能够起到很好的治疗作用。

为了实现上述目的，本发明人在这方面进行了大量的有益探索，并取得了一些预料之外的结果。以下对本发明进行进一步阐述：

本发明提供了一种药物组合物，包括5氟尿嘧啶和马钱苷元。所述药物组合物用于抗癌治疗，特别是胃癌，胃癌转移。

本发明还提供了包含马钱苷元和5氟尿嘧啶药物组合物用于制备抑制胃癌细胞增殖、侵袭和转移的药物的用途。优选地，所述马钱苷元和5氟尿嘧啶在所述药物中分开包装。优选地，所述胃癌细胞为HGC27和MGC803细胞系。

本发明提供了马钱苷元与5氟尿嘧啶用于制备治疗胃癌的药物的用途。优选地，所述马钱苷元和5氟尿嘧啶在所述药物中分开包装。

本发明还提供了一种抑制胃癌细胞增殖、侵袭和转移的方法，所述方法包括将包含马钱苷元和5氟尿嘧啶药物组合物给予受试者。

本发明还提供了一种治疗胃癌的方法，所述方法包括将包含马钱苷元和5氟尿嘧啶药物组合物给予受试者。优选地，所述胃癌为胃癌转移。

本发明还提供了一种治疗胃癌的方法，所述方法包括将马钱苷元和5氟尿嘧啶分别给予受试者，先给予马钱苷元，后给5氟尿嘧啶。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：本发明首次发现马钱苷元分子和5氟尿嘧啶在胃癌治疗上具有显著的协同性，并能够较大程度地抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和转移，这不仅具有科学意义的创新，更具有开发新的抗肿瘤药物的巨大临床应用价值。

附图说明

通过以下附图对本发明进行说明。

图1为马钱苷元和5氟尿嘧啶对HGC27和MGC803两株胃癌细胞系的毒性研究，通过MTT实验分别记录马钱苷元和5氟尿嘧啶的单用组和联用组HGC27和MGC803细胞的存活率。结果表明，马钱苷元和5氟尿嘧啶均能有效地杀死胃癌细胞，且两者具有一定的协同性。

图2为HGC27和MGC803细胞的克隆形成实验，马钱苷元和5氟尿嘧啶均能够有效地抑制HGC27和MGC803细胞的生长。

图3为马钱苷元与5氟尿嘧啶联用对HGC27和MGC803细胞成球能力的影响。

图4为钱苷元与5氟尿嘧啶联用对HGC27和MGC803细胞迁移能力的影响。

图5为钱苷元与5氟尿嘧啶联用对HGC27和MGC803细胞侵袭能力的影响。

图6为马钱苷元与5氟尿嘧啶联用影响HGC27和MGC803细胞的分子机制研究。

图7为马钱苷元与5氟尿嘧啶联用对胃癌转移情况的影响。

具体实施方式

马钱苷元是一种从中药山茱萸中提取分离的药用单体，其化学结构式如下：

本发明人发现了马钱苷元与5氟尿嘧啶联用在胃癌治疗中的重要作用及相应的生物学功能、机制。

本发明人发现，马钱苷元与5氟尿嘧啶在胃癌治疗中具有协同作用。

本发明人发现，马钱苷元与5氟尿嘧啶联用可以抑制HGC27和MGC803细胞系的增殖、侵袭和转移。

本发明人发现，马钱苷元与5氟尿嘧啶在胃癌治疗中具有协同作用。有望克服现有的治疗胃癌药物的副作用较大，治疗效果欠佳等不足。

本发明人发现，所述马钱苷元与5氟尿嘧啶处理过的HGC27和MGC803细胞中，激活wnt/β-catenin信号通路的几个关键蛋白c-Myc、Met和CD44均下调。因此，上述马钱苷元与5氟尿嘧啶分子可能通过抑制wnt/β-catenin信号通路，从而抑制HGC27和MGC803细胞的增殖、侵袭和转移。

在本发明中，马钱苷元与5氟尿嘧啶联用，可增强5氟尿嘧啶的抗肿瘤效果，两者的成分配比没有特别的限制，可以根据实际情况进行调整，马钱苷元与5氟尿嘧啶联用对胃癌细胞增殖的抑制情况，参考表1。

表1马钱苷元与5氟尿嘧啶联用对胃癌细胞增殖的抑制情况

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例

实施例1.通过MTT实验检测马钱苷元与5氟尿嘧啶联用对HGC27和MGC803细胞生长增殖的影响。

噻唑蓝(MTT)是一种黄色染料，利用其只与活细胞的脱氢酶反应生成蓝紫色结晶物(甲瓒)并沉积于细胞中，而不与死细胞反应的特点，将甲瓒溶于DMSO，用酶联免疫检测仪在特定波长处测定其吸光值即可反映出活细胞的比例。本发明人将HGC27和MGC803细胞制成4×10⁴个细胞/mL，以每孔100μL加入96孔板培养液。分为4组(对照组、5氟尿嘧啶组、马钱苷元组和联用组)分别给药，加入MTT显色72h后，终止干预，弃培养液，将MTT浓度调整为0.5mg/mL每孔加入100μL。在培养箱中染色4h。弃MTT染色液(避免触碰到孔底部)，加入二甲基亚砜(DMSO)，每孔100μL。避光，脱色摇床上振荡5min，置于酶标仪570nm波长处，测定吸光值。

HGC27和MGC803细胞从ATCC细胞库获得。将HGC27和MGC803细胞培养于RPMI1640(HyClone公司)培养基，含10％胎牛血清(BI公司)，100U/ml青霉素及100μg/ml的链霉素。

结果表明，马钱苷元与5氟尿嘧啶在一定浓度范围内，对胃癌HGC27和MGC803细胞均有增殖抑制作用，且呈现显著的浓度依赖性，参见图1。马钱苷元与5氟尿嘧啶在HGC27和MGC803细胞中的协同作用，参见表2

表2马钱苷元与5氟尿嘧啶在HGC27和MGC803细胞中的协同作用

注：协同:(CI＝0.3-0.7),中度协同:(CI＝0.7-0.85).

实施例2.通过克隆形成实验检测马钱苷元与5氟尿嘧啶联用对HGC27和MGC803细胞生长增殖的影响。

细胞克隆形成率，就是通常所说的细胞接种存活率。它指的是贴壁细胞在贴壁生长的过程中，能成活并发展成克隆的细胞的多少。需要指出的是，并非所有能成功贴壁的细胞都能增殖生长，从而最终形成克隆。也就是说不仅要成功贴壁而且要具备较强增殖活力的细胞才能形成克隆。因此，检测克隆形成率是考察细胞群体依赖性和增殖能力的指标之一。本发明人按照500个细胞/孔，将HGC27和MGC803细胞接种于6孔板，分为4组(对照组、5氟尿嘧啶组、马钱苷元组和联用组)分别给药干预，克隆生长到合适大小(药物处理14天)，吸去上清，用PBS轻轻洗涤两次；室温下，加入4％多聚甲醛溶液，处理15min，使细胞充分固定；倒弃4％多聚甲醛溶液后，加入结晶紫染色液处理15min；再加入少量PBS溶液，洗去未结合的多余染液，自然干燥。拍照记录。

结果显示，相比对照组和单用1.25μM 5氟尿嘧啶组，40μM马钱苷元组处理HGC27细胞后以及单用1.11μM 5氟尿嘧啶组，40μM马钱苷元组处理MGC803细胞后，细胞克隆形成率均明显下降，相对于单用药组，HGC27和MGC803细胞的联用药组，细胞克隆形成率也明显降低，参见图2。上述结果提示，马钱苷元与5氟尿嘧啶联合用药能协同抑制胃癌HGC27和MGC803细胞的体外增殖。

实施例3.马钱苷元与5氟尿嘧啶联用对HGC27和MGC803细胞成球能力的影响

本发明人将贴壁的HGC27和MGC803细胞经胰酶消化和离心后，倒掉上清液，用枪头将剩余的液体尽可能吸干净。加入约2ml的无菌PBS重悬细胞，800rpm，离心2分钟，倒掉PBS，并重复上述过程一次，洗去细胞中残留的含血清的培养液。用干细胞培养液重悬细胞至合适的浓度，并用细胞计数仪计数后，将相同数量(10000个)的对照组以及实验组细胞接种入预先已添加干细胞培养液的低粘附性的培养皿中培养。分为4组(对照组、5氟尿嘧啶组、马钱苷元组和联用组)分别给药。中间每间隔2天添加1ml(含对应药物)的培养液。培养10天后，采集照片。

从图3可以看出，在HGC27和MGC803细胞中，当添加马钱苷元与5氟尿嘧啶干预后，成球的直径明显减小。5氟尿嘧啶和马钱苷元药物浓度与实施例2中一致。

实施例4.马钱苷元与5氟尿嘧啶联用对HGC27和MGC803细胞迁移能力的影响

用于检测细胞迁移运动与修复能力的细胞划痕法是指：在培养贴壁细胞的培养皿或培养板上，用硬物划线，洗去划痕区域的细胞，拍照记录，然后继续培养，取特定时间点如24h，观察并拍照记录划痕区域的面积，与初始划痕面积比较的实验方法。细胞划痕法主要用于判断细胞迁移能力。本发明人取对数生长期的HGC27和MGC803细胞，胰酶常规消化，HGC27和MGC803细胞分别以7.0×10⁵和5.0×10⁵每孔的密度接种于6孔板中，置于培养箱内培养24h后，弃旧培养基，用10μL枪头于每孔中央划一道直线，造成细胞划痕，宽约0.5mm。然后，拍照记录划痕后的细胞间隔区域宽度。分为4组(对照组、5氟尿嘧啶组、马钱苷元组和联用组)分别给药干预。24h后，继续观察并拍照记录划痕后的细胞间隔区域宽度。观察细胞迁移状况。计算细胞迁移率，每次实验每组设置复孔3个，每个实验重复3次；以“药物组细胞迁移距离/对照组细胞迁移距离数×100％”表示药物组的相对迁移率。

结果显示，对照组的MGC803细胞在划痕后24h能迅速迁移，划痕区一半被填满。划痕后24h单用3.33μM 5氟尿嘧啶组迁移率与对照组相差无几，单用70μM的马钱苷元组划痕区域的愈合明显受到抑制而减慢，而马钱苷元与5氟尿嘧啶联用组的划痕区域的愈合则表现出更为明显的抑制。对照组的HGC27细胞在划痕后24h能迅速迁移，划痕区域的一半被填满。划痕后24h单用2.5μM 5氟尿嘧啶组和单用70μM的马钱苷元组划痕区域的愈合受到了部分抑制，而马钱苷元与5氟尿嘧啶联用组的划痕区域的愈合则表现出更为明显的抑制而减慢迁移。参见图4。

实施例5.马钱苷元与5氟尿嘧啶联用对HGC27和MGC803细胞侵袭能力的影响

Transwell细胞侵袭实验指在上室接种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会趋向营养成分高的下室生长。底膜聚碳酸酯膜材料上还加铺上了一层基质胶，模拟体内细胞外基质，细胞首先通过分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将该基质胶降解，才能进入底膜的下室面。通过检测进入下室面的细胞多少就可获知待测肿瘤细胞的侵袭能力大小。本发明人将BD Matrigel基质胶低温溶解，吸取适量基质胶，按照1:7的比例，用无血清RPMI-1640培养基稀释混匀。每孔的Transwell底膜上加入50μL稀释后的基质胶，使基质胶均匀铺于小室上层膜上，尽量避免气泡。再将小室放在37℃培养箱2h，使基底膜水化凝固。取对数生长期的HGC27和MGC803细胞，胰酶常规消化，离心，弃上清液后，用无血清培养基重悬细胞，HGC27和MGC803分别制成密度为5.0×10⁴和4.0×10⁴个细胞每200μL的细胞悬液。将600μL含10％FBS的RPMI-1640培养液加入Transwell小室下层的24孔板内，而Transwell小室上层加入细胞悬液200μL。分为4组(对照组、5氟尿嘧啶组、马钱苷元组和联用组)分别给药干预。24h后，将小室从培养板内取出，弃上室内的培养液，底膜上室面的残留细胞用棉签拭去，PBS洗涤后，自然干燥；再将小室移入已加入500μL 0.1％结晶紫染液的培养板内，静置15min，PBS洗去未结合的染液。用棉签擦去基质胶和上室内的细胞。Transwell小室上室放入干净24孔板中，用倒置显微镜观察底膜下室面并拍照记录。

结果显示，5氟尿嘧啶和的马钱苷元都抑制了HGC27和MGC803细胞的侵袭，且马钱苷元与5氟尿嘧啶HGC27和MGC803细胞的侵袭表现出显著的协同抑制作用。参见图5。5氟尿嘧啶和马钱苷元的加药浓度与实施例4中一致。

实施例6.马钱苷元与5氟尿嘧啶联用影响HGC27和MGC803细胞的分子机制研究

(1)加药处理的贴壁细胞总蛋白提取

取对数生长期的细胞，胰酶常规消化，以2.0×10⁵密度接种于6孔板，使细胞充分摇匀后，置于培养箱培养24h。分为4组(对照组、5氟尿嘧啶组、马钱苷元组和联用组)分别给药干预。加药处理24h后，取出HGC27和MGC803细胞。加入含蛋白酶抑制剂(100×)的细胞裂解液(碧云天公司)，置于冰上裂解30min后，4℃，高速离心。

(2)蛋白浓度测定

根据样品数量，按照溶液A和溶液B(50:1)，配制BCA工作液。将蛋白标准品(5mg/mL)按照0、1、2、4、8、12、16、20μL的体积分别加入96孔板，以PBS为标准品稀释液，将以上标准品体积内都补足至20μL，这样就得到了不同浓度的蛋白标准品，可用于绘制标准曲线。加样品96孔板上取样品数量的空白孔，每孔先加18μL PBS，再一次加入各个待测样品2μL，记录好不同样品的位置。加入200μL的BCA工作液，37℃孵育箱中孵育30min后，测定吸光值、计算样品蛋白浓度。

(3)Western blotting实验

a制样：加入蛋白上样5×buffer；吹打混匀；100℃金属浴10min后；冷却至室温；离心5min；取上清上样。

b电泳：首先在80V，电泳30min后；然后换120V，电泳90min。

c转膜：电泳结束后将蛋白转到PVDF膜上(转膜条件：100V，100min)；1×TBST洗膜3次，10min/次。

d封闭：用5％脱脂奶粉的封闭液室温在摇床上孵育2h；1×TBST洗膜3次，10min/次。

e孵育一抗：分别加入β-actin、c-Myc、Met和CD44抗体(稀释比：1:1000)4℃孵育过夜；1×TBST洗膜3次，15min/次。

f孵育二抗：(稀释比：1:10000)室温孵育45min；1×TBST洗膜4次，15min/次。

g ECL显色液显色；超灵敏化学发光仪进行显影扫描。

结果显示，马钱苷元与5氟尿嘧啶处理过的HGC27和MGC803细胞中，激活wnt/β-catenin信号通路的几个关键蛋白c-Myc、Met和CD44均下调。因此，上述马钱苷元与5氟尿嘧啶分子可能通过抑制wnt/β-catenin信号通路，从而抑制HGC27和MGC803细胞的增殖，转移和侵袭，参见图6。

实施例7.马钱苷元与5氟尿嘧啶联用对胃癌转移情况的影响分组：取6周龄BALB/c雌性裸鼠共40只，适应性喂养7天后将裸鼠随机分为4组(对照组、5氟尿嘧啶治疗组、马钱苷元治疗组和联用治疗组)，10只/组。

建模和给药：制备HGC27-luc细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁷个/mL。取200μL细胞尾静脉注射入裸鼠体内。5氟尿嘧啶的给药浓度为100mg/kg，每周一次。马钱苷元的给药浓度为20mg/kg，每周五次。联用治疗组先给马钱苷元，后给5氟尿嘧啶，两药给药间隔48h。对照组给予等量生理盐水(给药方式均为腹腔注射)，每天记录小鼠体重变化。

观察：利用小动物活体成像系统观察肿瘤的生长及转移情况。实验开始前，每只裸鼠体内注射150mg/kg的荧光素酶(用不含有Mg2+、Ca2+的DPBS稀释)，约10分钟后用异氟醚将裸鼠麻醉并进行活体成像观察，采集生物荧光图片，参见图7。

动物实验结果显示，马钱苷元与5氟尿嘧啶联用能够显著地抑制胃癌的转移情况。

本发明实施例中的结果表明，马钱苷元与5氟尿嘧啶联用可以抑制HGC27和MGC803细胞系的增殖，侵袭和转移，且具有显著的协同作用。此外，本发明发现了马钱苷元与5氟尿嘧啶联用在胃癌治疗中的重要生物学功能与机制。因此，本发明为设计协同抗胃癌药物提供了新的思路，并为治疗胃癌药物的开发提供了理论基础。

Claims

1.一种药物组合物，包括5氟尿嘧啶和马钱苷元。

2.马钱苷元与5氟尿嘧啶用于制备抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和转移的药物的用途。

3.根据权利要求2的用途，所述马钱苷元和5氟尿嘧啶在所述药物中分开包装。

4.根据权利要求2的用途，将包含马钱苷元和5氟尿嘧啶的组合物给予受试者。

5.根据权利要求2的用途，将马钱苷元和5氟尿嘧啶分别给予受试者，先给予马钱苷元，后给予5氟尿嘧啶。

6.根据权利要求2的用途，所述胃癌为胃癌转移。

7.根据权利要求2的用途，所述胃癌细胞为HGC27和MGC803细胞系。

8.马钱苷元与5氟尿嘧啶用于制备治疗胃癌药物的用途。

9.根据权利要求8的用途，所述马钱苷元和5氟尿嘧啶在所述药物中分开包装。

10.根据权利要求8的用途，所述胃癌为胃癌转移。

11.根据权利要求8的用途，将包含马钱苷元和5氟尿嘧啶药物组合物给予受试者。

12.根据权利要求8的用途，将马钱苷元和5氟尿嘧啶分别给予受试者，先给予马钱苷元，后给予5氟尿嘧啶。