CN107715103A

CN107715103A - Clusterin在制备杀伤肿瘤干细胞的癌症治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN107715103A
Application number: CN201711160445.6A
Authority: CN
Inventors: 熊继先
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2018-02-23
Anticipated expiration: 2037-11-20
Also published as: CN107715103B

Abstract

本发明公开了Clusterin在制备杀伤肿瘤干细胞的癌症治疗药物中的应用。本发明还公开了一种Clusterin抑制剂和一种癌症治疗药物。进一步本发明公开了一种癌症联合治疗药物，所述癌症联合治疗药物包括Clusterin蛋白与HSP90蛋白，所述癌症联合治疗药物能够杀伤肿瘤干细胞。本发明首次公开了Clusterin可以作为制备肿瘤干细胞分子靶向治疗药物的靶点，且可以与HSP90联合制备肿瘤干细胞分子治疗药物，有助于开发针对肿瘤干细胞的靶向药物，改善恶性肿瘤治疗现状和治愈肿瘤，在肿瘤治疗领域具有潜在，良好的应用前景。

Description

Clusterin在制备杀伤肿瘤干细胞的癌症治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及Clusterin在制备杀伤肿瘤干细胞的癌症治疗药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的高发病率和高致死率疾病。例如，胃癌(GastricCancer,GC)是最常见的消化系统恶性肿瘤，发病率在全球范围内位列所有恶性肿瘤的第五位，死亡率位居恶性肿瘤死因第三位，且还具有高复发率和低治疗率。

肿瘤中的肿瘤细胞可分为两类：一类为普通的肿瘤细胞，一类为肿瘤干细胞。普通肿瘤细胞具有快速分裂，对抗癌药敏感，无自我更新能力等特点。而肿瘤干细胞(Cancerstem cell,CSC)是肿瘤中少数具有干细胞特性即自我更新能力并能产生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞亚群，被认为是肿瘤发生、转移和复发，及放化疗耐受的根源。其具有以下特点：通常情况下处于静息状态，对抗癌药不敏感，具有自我更新能力，即具有无限增殖的能力。在肿瘤化疗中，大量的肿瘤细胞被杀死(对化疗药敏感)，然而肿瘤干细胞会生存下来(对化疗药不敏感)。目前，很多治疗手段都能使肿瘤在短时间内得到控制和缩小，但大多数患者会出现复发和转移，从而导致治疗失败。因此，肿瘤的复发是由于肿瘤化疗药对肿瘤干细胞无效，换言之，目前的肿瘤化疗药主要是针对肿瘤细胞，而不是肿瘤干细胞。事实上，大多数肿瘤化疗药只对肿瘤细胞有效，而对肿瘤干细胞无效。因此，要达到治愈癌症的目的，不仅要消灭普通的肿瘤细胞，更重要的是通过特异性治疗杀死引起肿瘤增殖的肿瘤干细胞。寻找和发现能有效治疗肿瘤干细胞的特异性靶点，继而研发相关靶向药物也成为肿瘤治疗的关键和当前药物研发的方向。但目前针对肿瘤干细胞的特异性治疗靶点缺乏，对调控肿瘤干细胞干性和生存的关键分子知之甚少。

Clusterin(丛生蛋白)是一种普遍存在，高度保守的异源二聚体硫酸化糖蛋白，其广泛表达于人体各组织及体液中，以分泌型异源二聚体硫酸化糖蛋白为主要形式，其在细胞聚集、细胞粘附、细胞增殖、细胞生存和凋亡、组织重建、免疫调节、神经系统调节、肿瘤发生发展等重要的生理、病理过程中发挥着重要作用。但目前Clusterin在肿瘤中的作用机制不明，Clusterin在肿瘤干细胞中的表达及功能是本领域技术人员所未知的，至今Clusterin作为肿瘤干细胞治疗靶点及在制备治疗肿瘤干细胞药物中的应用都未见文献报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种肿瘤干细胞治疗的分子靶点Clusterin，所述Clusterin在制备杀伤肿瘤干细胞的癌症治疗药物中的应用。

基于此，发明人考察了Clusterin在人胃癌干细胞中的表达与功能，结果发现，Clusterin在人胃癌干细胞中表达，且随着胃癌干细胞的成球生长其表达逐渐增高，同时，临床胃癌样本研究表明，Clusterin在更大的胃癌细胞，深层侵入的胃癌细胞，及胃癌干细胞富集存在的胃粘膜腺体基底胃上皮细胞中高表达；通过RNA干扰抑制Clusterin表达，胃癌干细胞无法生长成球，细胞凋亡无法生存；裸鼠成瘤实验结果表明，诱导Clusterin沉默导致胃癌成瘤生长抑制。结果证明，Clusterin在调控胃癌干细胞干性和生存中起着重要作用，是调控胃癌干细胞生存和生长的关键分子和重要靶点，可以用于制备抗胃癌干细胞及其抗胃癌治疗药物。

首先地，本发明提供了Clusterin在制备杀伤肿瘤干细胞的癌症治疗药物中的应用。

Clusterin作为肿瘤干细胞治疗靶点，优选的，所述Clusterin蛋白在人肿瘤干细胞中持续表达并分泌，且随着肿瘤干细胞的成球生长其表达逐渐增高。

优选的，所述Clusterin与肿瘤恶性程度、肿瘤发生、发展、转移和预后密切相关。更优选的，所述Clusterin与胃癌恶性程度、胃癌发生、发展、转移和预后密切相关。

进一步地，本发明提供一种Clusterin抑制剂，所述抑制剂包括：Clusterin核酸的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA以及Clusterin蛋白的抑制剂。

优选的，所述Clusterin蛋白的抑制剂包括Verteporfin(维替泊芬)。

优选的，所述抑制剂为抑制Clusterin基因表达的shRNA，所述shRNA序列包括SEQID NO:1(shRNA1)或SEQ ID NO:2(shRNA2)；所述shRNA序列为：

shRNA1:

CTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACTGAAACAGACCTGCATGAAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTTCATGCAGGTCTGTTTCAGGTGCCTACTGCCTCGCAATTG；

shRNA2：

CTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGGGAAGTAAGTACGTCAATATAGTGAAGCCACAGATGTATATTGACGTACTTACTTCCCTGTGCCTACTGCCTCGCAATTG。

优选的，所述抑制剂还包括其他分子，所述其他分子为Verteporfin；所述抑制剂抑制Clusterin表达，使肿瘤干细胞无法生长成球，细胞凋亡无法生存。

进一步地，本发明还提供一种癌症治疗药物，所述癌症治疗药物能够杀伤肿瘤干细胞；所述药物包括Clusterin抑制剂，所述Clusterin抑制剂为Clusterin核酸的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA以及Clusterin蛋白的抑制剂；所述药物还包括药学上可接受的载体或其他抗癌药物。

优选的，所述Clusterin蛋白的抑制剂包括Verteporfin(维替泊芬)。

本发明所述的载体为药学上可以接受的载体，其指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质。它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组分能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

优选的，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

优选的，所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

优选的，所述药物可用于治疗肿瘤干细胞的癌症。

优选的，所述药物具有减少肿瘤体积，抑制肿瘤干细胞成球生长，促进肿瘤干细胞凋亡的作用。

更进一步地，本发明提供了一种癌症联合治疗药物，所述癌症联合治疗药物包括Clusterin蛋白与HSP90蛋白，所述癌症联合治疗药物能够杀伤肿瘤干细胞；所述Clusterin是调控肿瘤干细胞生存和生长的关键分子和重要靶点；所述Clusterin调控HSP90功能来调控肿瘤干细胞的干性和生存，

具体为：

首先，通过Clusterin敲低和HSP90抑制剂处理肿瘤干细胞能减少细胞内HSP90客户蛋白，增加Cleaved PARP凋亡标志物。

进一步，通过增加Clusterin的表达能部分恢复HSP90抑制剂从而导致客户蛋白的减少；敲低Clustein加剧了HSP90抑制剂导致胃癌干细胞的凋亡，而增加Clusterin的表达能部分恢复HSP90抑制剂导致的胃癌干细胞的凋亡；敲低Clustein导致胃癌干细胞的凋亡也可以通过增加HSP90的表达得到部分恢复。

其中，HSP90抑制剂为17-AAG(Tanespimycin)、SNX-2112(PF-04928473)；HSP90客户蛋白为Akt(蛋白激酶B，Protein kinase B)，CDK4(周期蛋白依赖性激酶4，Cyclin-dependent kinase 4)，Her2人表皮生长因子受体-2，human epidermal growth factorreceptor-2)，c-Raf(c-Raf激酶，proto-oncogene serine/threonine-protein kinase)，EGFR(表皮生长因子受体，epidermal growth factor receptor)，IGF1R(胰岛素样生长因子1受体，insulin-like growth factor 1 receptor)。

本发明提到的肿瘤干细胞癌症包括胃癌以及其他癌症。

胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤，具有高复发率和低治愈率，且死亡率很高。因此，对其生存调控机制及分子靶向治疗进行的研究可作为其他肿瘤的实验依据和理论参考。同时，不同实体瘤的肿瘤干细胞具有共同的特点：均具有自我更新、增殖和自我分化的能力，都能导致体内成瘤性等，不同实体瘤干细胞具有相同或相似的分子调控通路。因此，根据本发明的记载和本领域的公知常识，可以推测Clusterin同样对除胃癌干细胞以外的其他肿瘤干细胞的干性及生存具有重要作用，是调控其生存和生长的关键分子，是分子靶向治疗的重要靶点，用于制备肿瘤干细胞靶向治疗药物。

所述肿瘤干细胞癌症还包括胰腺癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤。

本发明的有益效果在于：本发明首次公开了Clusterin可以作为制备肿瘤干细胞分子靶向治疗药物的靶点，且可以与HSP90联合制备肿瘤干细胞分子治疗药物；有助于开发针对肿瘤干细胞的靶向药物，改善恶性肿瘤治疗现状和治愈肿瘤，在肿瘤治疗领域具有潜在，良好的应用前景。

附图说明

图1为iTRAQ多重化学标记串联质谱技术鉴定和定量分析不同时间(第0，1，2，3，4，5天)人胃癌干细胞(GCSC)成球生长培养基上清中蛋白，结果显示为鉴定的部分蛋白表达变化；

图2为iTRAQ多重化学标记串联质谱技术鉴定和定量分析不同时间(第0，1，2，3，4，5天)人胃癌干细胞(GCSC)成球生长培养基上清中蛋白，结果显示为鉴定的所有蛋白表达变化；

图3为Western blot检测不同时间(第0，1，2，3，4，5天)人胃癌干细胞(GCSC)成球生长培养基上清中Clusterin的表达变化；

图4A为Western blot检测不同时间(第0，1，2，3，4，5天)人胃癌干细胞(GCSC)中Clusterin和干细胞标志物Sox2的表达情况；B为定量分析图A中Clusterin和Sox2的表达变化；

图5为Westernblot检测强力霉素(Doxycycline，Dox)诱导慢病毒感染的人胃癌干细胞(GCSC)后Clusterin蛋白表达情况，其中β-actin为内参蛋白；

图6A为Dox诱导慢病毒感染的人胃癌干细胞(shClu1和shClu2)6天后细胞形态图；B为Dox诱导慢病毒感染的人胃癌干细胞(shClu1和shClu2)6天后细胞大小统计结果；C为CCK8检测Dox处理慢病毒感染的人胃癌干细胞(GCSC)6天后细胞增殖及活性情况；

图7A为慢病毒感染的人胃癌干细胞(GCSC)6天生长成球后Dox诱导6天细胞形态图；B为慢病毒感染的人胃癌干细胞(GCSC)6天生长成球后Dox诱导6天细胞大小统计结果；C为CCK8检测慢病毒感染的人胃癌干细胞(GCSC)6天生长成球后Dox处理6天细胞增殖及活性情况；D为TUNEL检测慢病毒感染的人胃癌干细胞(GCSC)6天生长成球后Dox处理6天细胞凋亡情况；E为TUNEL检测慢病毒感染的人胃癌干细胞(GCSC)6天生长成球后Dox处理6天细胞凋亡统计分析；F为Western blot检测慢病毒感染的人胃癌干细胞(GCSC)6天生长成球后Dox处理6天细胞蛋白表达情况，其中Sox2为干细胞标志物，P-RB(phosphorylated RB)为细胞周期调控蛋白，Cleaved PARP为细胞凋亡标志物，β-actin为内参蛋白；

图8为慢病毒感染的人胃癌干细胞(GCSC)皮下接种裸鼠成瘤后Dox诱导处理结束时(第26天)移植瘤图；

图9为慢病毒感染的人胃癌干细胞(GCSC)皮下接种裸鼠成瘤后Dox诱导处理结束时(第26天)移植瘤瘤重情况，****表示有极为显著差异(p<0.0001)，ns表示无差异；

图10为慢病毒感染的人胃癌干细胞(GCSC)皮下接种裸鼠成瘤后Dox诱导处理移植瘤生长体积情况，其中左图为Dox处理组(Dox+)，右图为对照组(Dox-)，****表示有极为显著差异(p<0.0001)，ns表示无差异；

图11A为免疫组化检测胃癌组织中Clusterin的表达与肿瘤大小情况；B为免疫组化检测胃癌组织中Clusterin的表达与肿瘤深度情况；C为免疫组化检测正常胃粘膜腺体中Clusterin的表达情况，表示隐窝基底部；

图12A为免疫共沉淀结合质谱分析鉴定Heat shock protein 90(HSP90，热休克蛋白90)为胃癌干细胞内与Clusterin相互作用蛋白；B为免疫共沉淀结合质谱分析鉴定到的所有胃癌干细胞内与Clusterin存在相互作用蛋白；

图13为免疫共沉淀结合Western blot检测证实胃癌干细胞内HSP90和Clusterin存在相互作用；

图14为免疫荧光染色观察胃癌干细胞中HSP90和Clusterin的共表达情况；

图15为Westernblot检测Dox及HSP90抑制剂(17-AAG和SNX-2112)分别处理慢病毒感染的胃癌干细胞的相关蛋白表达情况，其中AKT，CDK4，HER2，c-Raf，EGFR，IGF-1R为HSP90客户蛋白(clientproteins)，Cleaved PARP为细胞凋亡标志物，β-actin为内参蛋白；

图16为Western blot检测Dox或/和HSP90抑制剂(17-AAG)处理过表达Clusterin慢病毒感染的胃癌干细胞(Clu+)的相关蛋白表达情况，其中β-actin为内参蛋白；

图17为CCK8检测改变胃癌干细胞中Clusterin表达对HSP90功能的影响，其中GCSC为未转染胃癌干细胞，shClu1为诱导性Clusterin shRNA慢病毒感染胃癌干细胞，Clu+为过表达Clusterin慢病毒感染的胃癌干细胞，其中*表示有统计学差异(p<0.05)，**表示有显著差异(p<0.01)；

图18为CCK8检测改变胃癌干细胞中HSP90表达在Clusterin对胃癌干细胞影响的恢复作用，其中shCtrl为对照细胞，shClu1为诱导性Clusterin shRNA慢病毒感染胃癌干细胞，shCtrl_HSP90+为过表达HSP90的shCtrl细胞，shClu1_HSP90+为过表达HSP90的shClu1细胞，其中****表示有极为显著差异(p<0.0001)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

本发明提到的“Clusterin”包括Clusterin基因(CLU)及Clusterin蛋白，所述Clusterin基因在NCBI中GeneID:1191；所述Clusterin蛋白在NCBI:NP_001822.3。

本发明所用的主要实验材料如下：

测序级胰酶(Trypsin，Sequencing Grade)购自Promega公司；RNA抽提试剂盒(RNeasy Mini Kit)购自QIAGEN公司；逆转录试剂盒、Tag DNA聚合酶购自Life Technology公司；逆转录酶M-MLV、PCR试剂盒购自TIANGEN公司；限制性内切酶EcoRI、MluI购自NEB公司；HSP90抑制剂17-AAG、SNX2112购自Selleck Chemicals公司；DMSO、嘌呤霉素(puromycin)、强力霉素(Doxycycline，Dox)、一抗Anti-β-actin购自Sigma公司；一抗Anti-Clusterin-α、二抗Anti-goat购自Santa Cruz Biotechnologies公司；一抗Anti-HSP90购自Abcam公司；一抗Anti-Sox2、anti-Cleaved PARP、anti-pSer807/Ser811-Rb、anti-AKT、anti-CDK4、anti-HER2、anti-c-Raf、anti-EGFR、anti-IGF-1R、二抗Anti-mouse、二抗Anti-rabbit购自Cell SignalingTechnology公司；CCK-8试剂盒购自同仁化学研究所。

所述细胞及其培养：人胃癌干细胞(GCSC)来自莫显明教授，细胞培养按照其文献报道方法(Cell Research,2012,22(1):248-258)进行。

本发明涉及到的统计分析方法是采用SPSS12.0统计学软件，实验结果以均值±标准差(x±s)表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，P<0.05被认为有显著性差异。

实施例1分析Clusterin在胃癌干细胞生长成球过程中表达

1.iTRAQ多重化学标记串联质谱技术鉴定和定量分析GCSC成球培养基上清蛋白

收集培养1-5天的GCSC培养基(分别记为D1-D5)及未培养的培养基(记为D0)，离心取上清，超滤浓缩蛋白后胰蛋白酶(Trypsin)酶解，酶解肽段经iTRAQ试剂(AppliedBiosystems)标记混合后经液相串联质谱(LC/MS/MS)分析，蛋白鉴定和定量分析通过ProteinPilot软件平台(Applied Biosystems)进行。

2.Western blot

上清中蛋白经BCA法测定蛋白浓度，等量蛋白样品经10％SDS-PAGE电泳后转膜印迹，封闭，一抗4℃过夜孵育，洗膜加二抗，室温孵育1h，洗膜后用ECL(SuperSignal Westchemiluminescent substrates，Thermo Fisher Scientific)显色。

3.结果

经过iTRAQ多重化学标记串联质谱技术在胃癌干细胞成球培养基上清中鉴定和定量分析了不同时间(第0，1，2，3，4，5天)分泌型Clusterin的表达变化，其表达随着胃癌干细胞的生长成球(D0-D5)表达逐渐增加(图1和图2)，也通过Western blot证实上述结果(图3)。其中第1天的培养基中表达的蛋白设为1。

通过对成球生长过程中胃癌干细胞的Clusterin表达分析发现其表达同样逐渐增加，且与干细胞标志物Sox2表达方式一致(图4A和图4B)。

上述结果表明，胃癌干细胞持续表达并分泌Clusterin蛋白，随着胃癌干细胞的生长成球，其表达量不断增加，且与干细胞标志物Sox2表达方式一致。提示Clusterin可能在胃癌干细胞的生存和生长中起着重要作用，对胃癌干细胞的干性和生存至关重要。

实施例2Clusterin是调控胃癌干细胞干性和生存的关键分子

1.稳定表达可诱导型过表达Clusterin、HSP90的GCSC细胞，及稳定表达可诱导型Clusterin shRNA的GCSC细胞的建立与鉴定

限制性内切酶EcoRI、MluI双酶切PCR扩增Clusterin、HSP90(来自GCSC细胞)基因产物纯化回收后，分别连接到经相应内切酶酶切的诱导型真核表达载体pLVX-TetOne-Puro(Clontech公司)上，构建重组表达载体pLVX-TetOne-Puro-Clusterin，pLVX-TetOne-Puro-HSP90。空对照载体为pLVX-TetOne-Puro。

Clusterin、HSP90过表达病毒由pLVX-TetOne-Puro-Clusterin，pLVX-TetOne-Puro-HSP90和对照pLVX-TetOne-Puro过表达质粒，分别加包装质粒Lenti-X PackagingSingle Shots(Clontech公司)，转染Lenti-X 293T细胞(Clontech)，包装病毒并浓缩得到。

携带靶向Clusterin基因干扰质粒(GV307-Clusterin-shRNA1，GV307-Clusterin-shRNA2)和无义干扰序列对照质粒(GV307-negative control)的慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司(GeneChem)包装构建。

所述shRNA1和shRNA2序列分别为SEQ ID NO:1(shClu1)和SEQ ID NO:2(shClu2)序列。

Clusterin干扰慢病毒和Clusterin、HSP90过表达慢病毒感染GCSC细胞，嘌呤霉素(puromycin)筛选出成功感染的稳定表达细胞株，记为shClu1、shClu2和Clu+、HSP90+ GCSC细胞。其中GV307-negative control干扰慢病毒和pLVX-TetOne-Puro过表达慢病毒成功感染的GCSC细胞为相应对照。

强力霉素(Doxycycline，Dox，2.5μg/ml)诱导处理相关细胞48hr后，Western blot检测目的蛋白的表达情况。

2.Dox诱导Clusterin敲低的shClu GCSC细胞的成球生长培养

将转染并筛选的shClu1、shClu2和对照shCtrl单细胞接种于不含或含有Dox培养基中培养6天，期间间隔48hr补充Dox。6天后显微镜观察细胞并拍照，记录细胞(或细胞球)大小，CCK8检测细胞增殖和活性情况。

将转染并筛选的shClu1、shClu2和对照shCtrl细胞于培养基中培养6天待其成球后，加入或不加Dox再培养6天，期间间隔48hr补充Dox。12天后显微镜观察细胞并拍照，记录细胞(或细胞球)大小，CCK8检测细胞增殖和活性情况，TUNEL检测细胞凋亡情况，Westernblot检测相关蛋白表达情况。

所述Western blot检测方法：

RIPA细胞裂解液提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，等量蛋白样品经10％SDS-PAGE电泳后转膜印迹，封闭，一抗4℃过夜孵育，洗膜加二抗，室温孵育1h，洗膜后用ECL(SuperSignal West chemiluminescent substrates，Thermo Fisher Scientific)显色。

所述CCK8检测细胞增殖和活性方法：

取各组细胞(1×10⁵cells/mL，100μl)接种于96孔板，每组6个复孔，培养24hr后，17-AAG(0.2μM)和/或Dox(2.5μg/ml)处理24hr，DMSO作为对照。分别加入CCK-8测定波长450nm的吸光值(A450)，绘制各组细胞生长曲线。

所述TUNEL检测GCSC细胞凋亡方法：

采用罗氏公司(Roche Molecular Biochemicals)生产的原位末端标记试剂盒(Insitu Cell Death Detection Kit，Cat.No.11684817910)，参照试剂盒说明书进行：⑴4％多聚甲醛固定1h，PBS缓冲液漂洗；⑵3％H₂O₂阻断液室温10min，PBS漂洗；⑶0.1％TritonX-100渗透液冰上作用2min，PBS漂洗；⑷加50μl TUNEL反应混合液，湿盒中37℃作用1h，PBS漂洗；⑸含DAPI抗猝灭剂封片，显微镜观察记录，所有细胞核呈蓝色，凋亡细胞呈绿色荧光，在光镜下任选一定数目的视野进行凋亡细胞计数，统计凋亡细胞(FITC绿色荧光细胞)占所有细胞(DAPI染色的蓝色细胞)的百分率。

3.结果

我们筛选了两条靶向敲低Clusterin表达的shRNA，构建了稳定表达可诱导型Clusterin shRNA的胃癌干细胞GCSC细胞系(shClu1和shClu2，图5)。

Dox诱导胃癌干细胞Clusterin敲低导致胃癌干细胞呈单细胞，无法生长成球，生存率显著降低，而对照细胞和未Dox处理细胞都逐渐生长成球(图6A、6B、6C)。

胃癌干细胞成球后Dox诱导处理敲低Clusterin表达导致细胞球解散，呈分散状，胃癌干细胞死亡(图7A)，与对照细胞和未Dox处理细胞相比，Clusterin敲低的胃癌干细胞球逐渐减小(图7B)，生存率降低(图7C)，胃癌干细胞凋亡，TUNEL检测结果显示，Dox诱导(Dox+)转染Clusterin shRNA(shClu1,shClu2)表达沉默的胃癌干细胞凋亡细胞大幅增加，而对照和未Dox诱导(Dox-)的shClu1,shClu2的胃癌干细胞凋亡细胞很少，证实Clusterin敲低能极为显著诱导胃癌干细胞凋亡(图7D、7E)，Westernblot也发现Clusterin敲低的胃癌干细胞中凋亡标志物Cleaved PARP明显增加，干细胞标志物Sox2、细胞周期调控蛋白P-RB(phosphorylated RB)明显降低(图7F)。

上述结果表明，本发明构建的两条干扰质粒能有效地抑制Clusterin表达；且发现Clusterin对胃癌干细胞的干性和生存具有至关重要的作用，是调控胃癌干细胞干性和生存的关键分子。

实施例3Clusterin敲低能显著抑制裸鼠中胃癌干细胞移植瘤生长

雌性Balb/C裸鼠(6周龄，体重18.0±2.0g)，培养于无菌环境。小鼠分为2组，Dox处理组(Dox+)、对照组(Dox-)，每组5只，分别于两侧肋皮下分别注射接种100μl含4x10⁵shClu2 GCSC细胞(记为shClu)和shCtrl细胞(记为shCtrl)悬液，建立皮下移植瘤模型。14天后待荷瘤裸鼠肿瘤体积达0.6cm³左右后，开始相关处理，其中Dox处理组(Dox+)为饮水中加入Dox(1mg/ml，0.5％glucose)；对照组(Dox-)饮水中不加Dox(0.5％glucose)，每3天换一次饮水，共12天。密切观察皮下肿瘤生长情况，每2天或3天用游标卡尺测量肿瘤大小，按公式：V＝1/2长径×短径2，计算肿瘤体积，并绘制皮下移植瘤生长曲线。26天处死老鼠取瘤体拍照并称重。

体内成瘤实验发现，较对照细胞及未Dox处理相比，Dox处理的shClu胃癌干细胞形成的移植瘤明显缩小(图8)，瘤重显著减轻(图9)，肿瘤生长曲线也表明Dox处理的shClu胃癌干细胞形成的移植瘤生长明显减缓(图10)。

上述结果表明，Clusterin敲除显著降低胃癌干细胞体内成瘤能力。

实施例4免疫组织化学检测Clusterin表达与胃癌患者临床病理参数的关系

90例胃癌及90例癌旁组织芯片(HStm-Ade180Sur-05)购自上海芯超生物科技有限公司，羊多克隆抗体anti-human Clusterin购自Santa Cruz公司(sc6419，1:5000)。采用Dako公司EnVision+ detection system试剂盒参照试剂盒说明书进行。免疫组化染色的结果由两名未知病理数据的病理学专家独立在光镜下完成。每人均选择10个具有代表性的高倍视野(×40倍)，判定标准参照文献(J.Clin.Pathol.，1995，48：876-878)，应用SPSS12.0统计软件进行统计学分析。分析Clusterin表达与胃癌患者临床病理学参数(包括性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤分化、肿瘤分型、肿瘤侵润深度、淋巴结转移状态、远处转移状态、TNM分期等)之间的关系。

通过免疫组化法对90例胃癌组织、90例胃癌癌旁组织分析表明，Clusterin在更大的胃癌细胞(图11A)，深层侵入肌层的胃癌细胞(图11B)，及胃癌干细胞富集存在的胃粘膜腺体基底胃上皮细胞(图11C)中高表达。

大的胃癌组织和更深的侵入深度，更多的淋巴结转移和不良预后相关，提示Clusterin可能赋予胃癌干细胞侵润和转移的能力导致病人的死亡，相关侵入肌层胃癌细胞中Clusterin高表达也对上述结果予以证实。同时，Clusterin在胃癌干细胞可能来源的胃粘膜腺体基底部高表达进一步提示其在胃癌干细胞干性调控中的作用。

上述结果说明，Clusterin可能与胃癌恶性程度，胃癌发生、发展、转移和预后密切相关，有望成为胃癌治疗的靶点和临床诊断应用。

实施例5Clusterin通过调控HSP90功能对胃癌干细胞干性和生存的作用1.免疫共沉淀筛选GCSC细胞Clusterin、HSP90相互作用蛋白

收集GCSC细胞，IP裂解液提取细胞全蛋白，加入anti-Clusterin或anti-HSP90抗体，并加入proteinG珠子，孵育，缓冲液冲洗，洗脱互作蛋白进行后续的质谱分析鉴定，或进行Westernblot分析。

2.免疫荧光染色验证GCSC细胞Clusterin和HSP90共定位情况

细胞接种至载玻片上，PBS清洗，4％多聚甲醛固定，0.5％Triton X-100通透细胞，封闭，加入anti-Clusterin，anti-HSP90一抗，PBS清洗，加入分别标记Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594的二抗(Thermo Fisher Scientific)，含DAPI的抗淬灭剂(ThermoFisher Scientific)封片置荧光显微镜下观察拍照。

3.结果

经过免疫共沉淀结合质谱分析鉴定Heat shock protein90(HSP90，热休克蛋白90)为胃癌干细胞内与Clusterin存在相互作用蛋白(图12A、12B)，并通过免疫共沉淀和Westerinblot分析(图13)及免疫荧光检测证实Clusterin与HSP90细胞内共定位情况(图14)证实两者存在相互作用。

Clusterin敲低和HSP90抑制剂(17-AAG、SNX-2112)处理都能减少HSP90客户蛋白(Akt,CDK4,Her2,c-Raf,EGFR,IGF1R)，增加CleavedPARP(图15)，提示Clusterin是通过调控HSP90功能实现。进一步，增加Clusterin表达能部分恢复HSP90抑制剂(17-AAG)导致客户蛋白的减少(图16)；敲低Clustein加剧HSP90抑制剂(17-AAG)导致胃癌干细胞的凋亡，而增加Clusterin表达能部分恢复HSP90抑制剂(17-AAG)导致胃癌干细胞的凋亡(图17)；敲低Clustein导致胃癌干细胞的凋亡也可以通过增加HSP90的表达得到部分恢复(图18)。

上述结果表明，Clusterin通过调控Heat shock protein90(HSP90，热休克蛋白90)功能来调控胃癌干细胞的干性和生存。因此，Clusterin蛋白有望单独或与HSP90蛋白联合作为制备肿瘤干细胞分子治疗药物靶点，用于相关药物的开发。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 深圳大学

<120> Clusterin在制备杀伤肿瘤干细胞的癌症治疗药物中的应用

<130> p17145

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 116

<212> DNA

<213> shRNA1

<400> 1

ctcgagaagg tatattgctg ttgacagtga gcgactgaaa cagacctgca tgaagtagtg 60

aagccacaga tgtacttcat gcaggtctgt ttcaggtgcc tactgcctcg caattg 116

<210> 2

<211> 115

<212> DNA

<213> shRNA2

<400> 2

ctcgagaagg tatattgctg ttgacagtga gcgagggaag taagtacgtc aatatagtga 60

agccacagat gtatattgac gtacttactt ccctgtgcct actgcctcgc aattg 115

Claims

1.Clusterin在制备杀伤肿瘤干细胞的癌症治疗药物中的应用。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述Clusterin蛋白在人肿瘤干细胞中持续表达并分泌，且随着肿瘤干细胞的成球生长其表达逐渐增高。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述Clusterin与肿瘤恶性程度、肿瘤发生、发展、转移和预后密切相关。

4.如权利要求1～3任一项所述应用，其特征在于，所述肿瘤干细胞癌症包括胃癌、胰腺癌、食管癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤。

5.一种Clusterin抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括：Clusterin核酸的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA以及Clusterin蛋白的抑制剂。

6.如权利要求5所述Clusterin抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为抑制Clusterin基因表达的shRNA，所述shRNA序列包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

7.如权利要求6所述Clusterin抑制剂，其特征在于，所述抑制剂还包括其他分子，所述其他分子为Verteporfin。

8.一种癌症治疗药物，其特征在于，所述癌症治疗药物能够杀伤肿瘤干细胞；所述药物包括Clusterin抑制剂，所述Clusterin抑制剂为Clusterin核酸的反义寡核苷酸、siRNA、shRNA以及Clusterin蛋白的抑制剂；所述药物还包括药学上可接受的载体或其他抗癌药物。

9.一种癌症联合治疗药物，其特征在于，所述癌症联合治疗药物包括Clusterin蛋白与HSP90蛋白，所述癌症联合治疗药物能够杀伤肿瘤干细胞；所述Clusterin是调控肿瘤干细胞生存和生长的关键分子和重要靶点；所述Clusterin调控HSP90功能来调控肿瘤干细胞的干性和生存。

10.如权利9所述药物，其特征在于，通过敲低Clusterin和HSP90抑制剂处理肿瘤干细胞能减少细胞内HSP90客户蛋白，增加Cleaved PARP凋亡标志物。