CN104480111A - 一种逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA及其应用 - Google Patents

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姚登福
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吴玮
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Abstract

本发明公开了一种干预丛生蛋白基因转录来逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA,其创新点在于:包括以下四条shRNA模板序列中的任一条或一条以上任意组合:CLU-shRNA1:5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’;CLU-shRNA2:5’-GGGAATCAGAGACAAAGCT-3’;CLU-shRNA3:5’-CAGTGGAAGATGCTCAACA-3’;CLU-shRNA4:5’-GCGAAGACCAGTACTATCT-3’;将本发明的四条寡核苷酸链退火形成双链的shRNA模板,能够高效抑制人HepG2/ADM细胞株CLU基因转录及CLU蛋白表达。能够明显降低化疗药物IC50值,对靶向或抗癌药物治疗具有增敏作用。通过促凋亡机制使得阿霉素诱导的肝癌细胞发生的凋亡数明显高于对照组及阴性组。

Description

一种逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA及其应用
技术领域
本发明涉及一种逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA,尤其是涉及一种干预丛生蛋白基因转录来逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA,属于分子生物学与生物医药领域。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,每年有超过60万的新增肝癌患者,位列肿瘤相关死因的第三位。HCC的发生发展是多病因、多基因、多步骤及多因子协同的复杂过程,涉及到癌基因激活,抑癌基因失活及(或)胚胎期某些癌基因重新复活等多信号通路和基因调控。
目前,多药耐药(multiple drug resistance, MDR)产生是肝癌化疗失败主要原因,已发现肝癌细胞耐受的抗肿瘤药物有多柔比星、顺铂、紫杉醇和依托泊苷等,因此寻找特异有效分子靶点逆转肝癌多药耐药,已是肝癌治疗的研究重点。
丛生蛋白(Clusterin,CLU)又名高尔基体硫酸化糖蛋白-2、丛生蛋白或载脂蛋白J。CLU具有多种生物学功能,如脂转运、膜循环、细胞粘附、细胞凋亡和补体级联等。其基因位于染色体8p21~p12,由8个内含子和9个外显子组成。它广泛存在于哺乳动物组织,种属间高度保守。经选择性剪切最终形成两种蛋白:核型丛生蛋白(nCLU)和分泌型丛生蛋白(sCLU)。研究发现,sCLU可阻止细胞凋亡,而nCLU则促进细胞凋亡。
通常在60kDa处可发现分泌前丛生蛋白(psCLU),由mRNA直接翻译而成;经选择性剪切,psCLU在Arg227和Ser228间裂解为反相平行的α链和β链,构成成熟的异二聚体糖蛋白sCLU,分子量为75–80kDa;nCLU分子量大小为45-55kDa,无靶向内质网引导肽,不裂解为双链,通过核内信号区(nuclear localization signals, NLSs)介导,在特定条件下由胞质进入胞核。
研究发现,由于晚期高侵袭肿瘤组织中促凋亡蛋白nCLU转化为抗凋亡蛋白sCLU,两亚型相互转变对肿瘤进展具重要调节作用。提高nCLU/sCLU比值可增加对肿瘤细胞的化疗敏感性,间接反映nCLU和sCLU相互拮抗凋亡相关的生物特性。肝细胞恶性转变和癌变过程中CLU异常活化,过表达的CLU既可作为肝癌早期诊断的标志,又可作为肝癌靶向治疗的新靶点,具有开发与应用前景。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足,提供一种干预丛生蛋白基因转录来逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA,干预CLU基因转录逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA能高效抑制CLU基因的表达,对靶向或抗癌药物治疗具有优秀的增敏作用。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:一种干预丛生蛋白基因转录来逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA,其创新点在于:包括以下四条shRNA模板序列中的任一条或一条以上的任意组合:
CLU-shRNA1:5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’;
CLU-shRNA2:5’-GGGAATCAGAGACAAAGCT-3’;
CLU-shRNA3:5’-CAGTGGAAGATGCTCAACA-3’;
CLU-shRNA4:5’-GCGAAGACCAGTACTATCT-3’。
进一步,包括以下三条shRNA模板序列中的任一条或一条以上的任意组合:
CLU-shRNA1:5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’;
CLU-shRNA2:5’-GGGAATCAGAGACAAAGCT-3’;
CLU-shRNA3:5’-CAGTGGAAGATGCTCAACA-3’。
进一步,包括以下两条shRNA模板序列中的任一条或两条组合物:
CLU-shRNA1:5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’;
CLU-shRNA2:5’-GGGAATCAGAGACAAAGCT-3’。
进一步,所述shRNA模板序列为:
CLU-shRNA1:5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’。
本发明的另一个目的是提供一种干预丛生蛋白基因转录来逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA的应用,具体为用于制备抗肝癌的药物。
本发明的有益效果如下:
(1) 将本发明的四条寡核苷酸链退火形成双链的shRNA模板,能够高效抑制人HepG2/ADM细胞株CLU基因转录,及CLU蛋白表达。
(2) 用MTT法分析得出双链的shRNA能够明显降低化疗药物IC50值,对靶向或抗癌药物治疗具有增敏作用。
(3) 通过荧光显微镜检测得出双链的shRNA干扰人肝癌HepG2/ADM细胞CLU表达后,通过促凋亡机制使得阿霉素诱导的肝癌细胞发生的凋亡数明显高于对照组及阴性组。
(4) 通过流式细胞仪分析,双链的shRNA能干扰HepG2/ADM细胞株P-gp介导的药物外排机制;
(5) 通过蛋白及基因分析,双链的shRNA使肝癌耐药细胞多药耐药基因MDR1及P-糖蛋白受到明显抑制,并且下调β-catenin及其下游基因CyclinD1表达水平。
    (6)本发明的干预CLU基因转录逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA能高效抑制CLU基因的表达,对靶向或抗癌药物治疗具有优秀的增敏作用。
    (7)本发明的shRNA序列对于开发新的抗肝癌药物,逆转肝癌细胞多药耐药和提高肝癌的治疗效果有重要的意义,其具有很大的开发与应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式作进一步的说明。
图1为本发明实施例中Western blotting测HCC细胞的CLU蛋白表达。
图2为柱状图显示图1中CLU与GAPDH灰度值比值。
图3为Western blotting测HepG2耐药株HepG2/ADM与亲本株中CLU蛋白表达。
图4为柱状图显示图3中CLU与GAPDH灰度值比值。
图5为转染细胞普通光(×100)。
图6为转染细胞绿色荧光(×100)。
图7为Western blotting测shRNA抑制CLU蛋白效率。
图8为RT-PCR测各组细胞CLU-mRNA。
图9为伊立替康处理后细胞生存曲线。
图10为吉西他滨处理后细胞生存曲线。
图11为顺铂处理后细胞生存曲线。
图12为 阿霉素处理后细胞生存曲线。
图13 为图9-12中四种药IC50。
图14 为阴性对照组NC-shRNA 蓝色荧光(×100)。
图15为阴性对照组NC-shRNA红色荧光(×100)。
图16为图9、10合并图(×100)。
图17为CLU干扰组shRNA-1蓝色荧光(×100)。
图18为CLU干扰组shRNA-1红色荧光(×100)。
图19为图12、13合并图(×100)。
图20为空白对照组Control流式峰值图。
图21为阴性对照组NC-shRNA流式峰值图。
图22为 CLU干扰组shRNA-1流式峰值图。
图23 各组细胞Rh123滞留相对值。
图24为各组细胞中P-gp蛋白表达。
图25为各组细胞 MDR1基因表达
图26为各组细胞β-catenin、GSK-3β和Cyclin D1蛋白表达。
图27为图26中各组基因表达。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作详细说明。
本实施例为本发明的干预CLU基因转录逆转肝癌多药耐药的shRNA的设计及验证步骤。
1、细胞培养:人肝癌细胞株Hep3B、PLC、HepG2及耐药株HepG2/ADM在10%FCS DMEM培养基(含1%双抗)中培养。BEL7404、SUN739、97H、SMMC7721和LO2细胞在10%FCS RPMI-1640培养基(含1%双抗)中培养。各细胞株培养在5%CO2,37℃培养箱中,常规培养。
2、转染shRNA:根据人Clusterin序列(NCBI:NM_001831.3)设计四条干扰序列及阴性对照序列NC-shRNA(如表1所示)并构建质粒载体pRNAT-U6.1/Neo-shRNA。将HepG2/ADM细胞接种于六孔板中,常规培养。当细胞密度长至全孔80%,依照转染试剂GenJetTM (VerⅡfor HepG2)说明书,分别将干扰组shRNA和阴性对照NC-shRNA转入HepG2/ADM细胞,并设空白对照孔。12h后换原培液继续培养,24h后荧光显微镜观察转染效率。
具体如图5-6所示:图5为人肝癌HepG2/ADM细胞普通光学显微镜图;图6为同一视野荧光显微镜细胞图,带荧光的细胞即为转染成功的HepG2/ADM细胞。
四条寡核苷酸链及阴性对照shRNA(Negative-shRNA)的序列见表1:
表1
    名称 寡核苷酸序列(5’→3’)
CLU-shRNA1 GTAAGTACGTCAATAAGGA
CLU-shRNA2 GGGAATCAGAGACAAAGCT
CLU-shRNA3 CAGTGGAAGATGCTCAACA
CLU-shRNA4 GCGAAGACCAGTACTATCT
Negative-shRNA TTCTCCGAACG TGTCACGT
3、Western blotting:首先,将各组细胞接种于六孔板,培养24小时后,弃培养基,PBS洗涤3次,胰酶消化取细胞悬液,细胞计数。冰上操作细胞悬液加入含PMSF细胞裂解液 (稀释浓度为1:1000),静置30min,13000r/min离心15min,吸取上清液,-70℃保存。
其次,使用BCA试剂盒测定蛋白浓度,使用上样用缓冲液按比例稀释蛋白,然后SDS-PAGE凝胶电泳1.5h,300mA 2h转至PVDF膜,随后5%脱脂奶粉封闭3h,最后各组分别加入一抗稀释液(稀释浓度比例为:Clusterin抗体1:500;GAPDH、Cyclin D1、P-gp、β-catenin及GSK-3β抗体均为1:1000),4℃孵育过夜。TBST洗膜后对应加入二抗羊抗或兔抗(稀释浓度为1:1000),室温孵育2.5h,洗膜后使用ECL液显色,并用Bio-Rad凝胶成像采集系统成像。
具体如图1~4所示:Western blotting结果显示在Hep3B、SMMC7721、PLC及HepG2中CLU高表达,而正常肝细胞LO2中低表达(图1,图2);检测HepG2阿霉素耐药株HepG2/ADM与亲本株CLU表达,显示在HepG2/ADM中CLU明显过表达(图3, 图4)。
4、RT-PCR:胰酶消化后分别收集空白对照,阴性对照及干扰组HepG2/ADM细胞,使用Trizol提取总RNA,紫外分光光度计测定RNA含量及吸光度比值A260/A280。
根据cDNA合成试剂盒说明合成第一链,目的基因及内参引物序列见表2。使用SYBPremixEx TaqTMⅡ试剂进行RT-PCR,以GAPDH 作为内参。RT-PCR反应条件如下,95℃30s,60℃45s,40个循环。结果使用2-ΔΔCt 法进行分析。mRNA相对变化计算公式:Ratio=2-ΔΔCt (ΔCt=CtCLU-CtGAPDH), ΔΔCt=ΔCt样本-ΔCt空白,相对表达量=2-ΔΔCt
具体如图8所示:显示四种干扰质粒对人耐药细胞HepG2/ADM中CLU-mRNA表达影响,其中以CLU-shRNA1抑制效果最佳。
以上相关基因及内参对照基因扩增引物核苷酸序列如表2所示:
表2
5、MTT法:转染shRNA-1和NC-shRNA,收集细胞并稀释成密度为1×104/ml的细胞悬液,种板于96孔板,设置未转染细胞为空白对照组,并设复孔。12小时贴壁完全后,各96孔板分别加入不同化疗药物(伊立替康、吉西他滨、顺铂和阿霉素)使终浓度分别为0、0.01、0.1、1、10、20、40、60μM。培养24小时后每孔加入20μL 5mg/ml MTT溶液,继续孵育4h。吸取孔内培液,每孔加入150μL DMSO,使结晶充分溶解。使用酶标仪测各组490nm吸光值。细胞生存率=(OD实验组/OD对照组)×100%。IC50值用Probit法分析得出。
如图9~13所示:shRNA1转染HepG2/ADM细胞后各组组间细胞生存曲线差异明显(图9~12),且下调CLU使细胞对各组化疗药IC50改变:下调CLU使细胞对伊立替康、阿霉素和顺铂IC50显著降低,而吉西他滨处理后组间未见明显差异(图13)。shRNA1组IC50值与NC-shRNA相比,**代表P<0.01(差异非常显著);*代表0.01<P<0.05(差异具有统计学意义) 。
6、凋亡荧光检测:将HepG2/ADM细胞接种于六孔板,分别转染shRNA-1和NC-shRNA作为干扰组和阴性对照组。成功转染后除去原培液,加入终浓度为2μM阿霉素培液,继续培养24h。胰酶消化收集细胞,每个样品分别加入5μLPI和Hoechst33342染色液,4℃避光孵育30min,PBS洗涤3次。涂片并用荧光显微镜观察红色和蓝色荧光。
如图14~19所示:荧光显微镜分析显示shRNA-1干扰组细胞(图17~19)Hoechst致密浓染比例升高,且PI红色荧光增强,凋亡细胞明显增多。
7、Rh123蓄积实验:HepG2/ADM细胞按1×105/ml密度每孔接种于六孔板,成功转染shRNA-1和NC-shRNA,并设空白对照Control。24h后每孔加入Rh123溶液,终浓度为5μM。37℃孵育30min后,消化收集细胞,预冷PBS洗涤3次。400μLPBS重悬细胞,流式细胞仪在激发波长488nm、发射波长520nm条件下检测样品。
结果如图20~23所示:显示相比空白对照组(图20)与阴性对照组(图21),干扰组(图22)吸收峰右移,HepG2/ADM细胞Rh123蓄积量增加。柱状图显示shRNA-1干扰后细胞Rh123蓄积量明显增加(图23)
8、对MDR1/P-gp, β-catenin, CyclinD1表达的明显抑制作用试验:如图24~27所示:Western blotting和RT-PCR检测各组细胞P-gp和Wnt通路关键信号分子表达。其中,CLU-shRNA1干扰组中多药耐药基因MDR1-mRNA明显下降,且P-gp蛋白表达水平也受到明显抑制(图24, 25)。同时发现抑制CLU后Wnt通路关键基因β-catenin及其下游基因Cyclin D1受到明显抑制,且与蛋白水平下降一致(图26, 27)。而GSK-3β表达水平未见明显变化。
序列表
<110>南通大学附属医院
<120>一种逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA及其应用
<160>4
<210>1
    <211>19
    <212>RNA
    <213>人工序列
<400>gtaagtacgt  caataagga
<210>2
    <211>19
    <212>RNA
    <213>人工序列
<400>gggaatcaga  gacaaagct
<210>3
    <211>19
    <212>RNA
    <213>人工序列
<400>cagtggaaga  tgctcaaca
<210>4
    <211>19
    <212>RNA
    <213>人工序列
<400>gcgaagacca  gtactatct。

Claims (5)

1.一种逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA,其特征在于:包括以下四条shRNA模板序列中的任一条或一条以上的任意组合:
CLU-shRNA1:5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’;
CLU-shRNA2:5’-GGGAATCAGAGACAAAGCT-3’;
CLU-shRNA3:5’-CAGTGGAAGATGCTCAACA-3’;
CLU-shRNA4:5’-GCGAAGACCAGTACTATCT-3’。
2.根据权利要求1所述的逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA,其特征在于:包括以下三条shRNA模板序列中的任一条或一条以上的任意组合:
CLU-shRNA1:5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’;
CLU-shRNA2:5’-GGGAATCAGAGACAAAGCT-3’;
CLU-shRNA3:5’-CAGTGGAAGATGCTCAACA-3’。
3.根据权利要求1或2所述的逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA,其特征在于:包括以下两条shRNA模板序列中的任一条或两条组合:
CLU-shRNA1:5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’;
CLU-shRNA2:5’-GGGAATCAGAGACAAAGCT-3’。
4.根据权利要求1、2或3所述的逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA,其特征在于:所述shRNA模板序列为CLU-shRNA1:5’-GTAAGTACGTCAATAAGGA-3’。
5.一种权利要求1所述的逆转肝癌细胞多药耐药的shRNA应用于制备抗肝癌的药物领域。
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