发明内容
本发明的目的在于提出一种预防及治疗酒精致癌的组合物及其制备方法,将红曲霉和纳豆芽孢杆菌发酵产物,包括纳豆激酶、红曲色素等,以及将益生菌、益生菌发酵产物、益生元、玉米低聚肽和牛磺酸等一同组合,得到的组合物具有极好的生理代谢调节功能和营养价值,能够增强白细胞、巨噬细胞活性,产生大量的抗菌素,刺激淋巴细胞不断分裂繁殖,提高机体免疫力,起到很好的抗炎、抗氧化效果,从而达到很好的预防和治疗酒精致癌的效果。
本发明的技术方案是这样实现的:
本发明提供一种预防及治疗酒精致癌的组合物的制备方法,将大豆经过脱毒粉碎处理后,与牛樟芝粉混合,经过酶解、第一次发酵后,与益生元混合,进一步进行第二次发酵后,再加入玉米低聚肽、牛磺酸混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
作为本发明的进一步改进,包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将脱毒混合液装入容器中,加盖并安装冷凝管,加热,蒸汽处理,洗净,干燥,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,干燥,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将步骤S1制得的脱毒大豆粉和步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入去离子水中,加入复合酶酶解,灭酶,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将碳源、氮源、维生素和无机盐用水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为6.5-7.2,灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,第一次培养,培养成菌种种子液,分别接种于步骤S4制得的培养基中,第二次培养,将两个培养基等体积混合并稀释得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,恒温发酵,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.益生元的制备:将低聚异麦芽糖、L-阿拉伯糖、菊粉和变性淀粉混合均匀,研细,过筛,得到益生元;
S8.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,第一次培养,培养成菌种种子液,分别接种于步骤S4制得的培养基中,第二次培养,将两个培养基等体积混合并稀释得到第二复合发酵菌液;
S9.第二次发酵:将步骤S7制得的益生元、步骤S6中的滤渣加入步骤S8中的第二复合发酵菌液中,恒温发酵,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S10.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将步骤S3制得的酶解产物、步骤S6制得的第一次发酵产物和步骤S9制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入玉米低聚肽、牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
作为本发明的进一步改进,步骤S1中所述脱毒混合液为乙醇、乙酸和氨水的混合液,其中,乙醇、乙酸和NH3·H2O的质量分数为5-12wt%、2-7wt%和3-5wt%;所述加热至温度为70-90℃,蒸汽处理0.5-2h。
作为本发明的进一步改进,步骤S3中所述复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为(3-5):4;所述脱毒大豆粉、牛樟芝粉和复合酶的质量比为(20-40):(15-22):(1-2);所述酶解温度为35-45℃,反应时间为2-4h;所述灭酶方法为在300-500W微波下灭酶处理1-3min。
作为本发明的进一步改进,步骤S4中所述碳源、氮源、维生素、无机盐和水的质量比为(12-20):(5-12):(2-4):(2-5):200;所述碳源选自糖蜜、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、水溶性淀粉中的一种或几种混合;所述氮源选自氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、氨基酸、蛋白胨、鱼粉;所述氨基酸选自苯丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲氨酸、异亮氨酸中的一种或几种混合;所述维生素选自维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素A、维生素K、维生素B12、维生素D、维生素E中的一种或几种混合;所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化锌、氯化铜、氯化锰中的一种或几种混合。
作为本发明的进一步改进,步骤S5中所述纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为(5-10):7;所述第一次培养条件为35-40℃,培养12-18h;所述第二次培养条件为35-40℃,培养24-48h;所述菌种种子液的含菌量为107-108cfu/mL;所述纳豆芽孢杆菌、红曲霉的接种量分别为1-3%和2-4%;所述稀释倍数为100-200倍;步骤S6中所述滤渣和第一复合发酵菌液的固液比为1:(5-10)g/mL;所述恒温发酵条件为36-38℃,发酵48-72h。
作为本发明的进一步改进,步骤S7中所述低聚异麦芽糖、L-阿拉伯糖、菊粉和变性淀粉的质量比为(2-7):(1-3):(2-5):10;所述过筛的筛网目数为100-200目;步骤S8中所述植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为(3-7):5;所述第一次培养条件为35-40℃,培养16-24h;所述第二次培养条件为35-40℃,培养24-48h;所述菌种种子液的含菌量为107-108cfu/mL;所述植物乳杆菌、青春双歧杆菌的接种量分别为3-5%和2-6%;所述稀释倍数为100-200倍;步骤S9中所述益生元、滤渣、第二复合发酵菌液的质量比为(2-3):10:(20-50);所述恒温发酵条件为36-38℃,发酵48-72h。
作为本发明的进一步改进,步骤S10中所述酶解产物、第一次发酵产物、第二次发酵产物、玉米低聚肽、牛磺酸的质量比为(5-10):(12-20):50:(3-5):(1-2)。
作为本发明的进一步改进,具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,乙醇、乙酸和NH3·H2O的质量分数为5-12wt%、2-7wt%和3-5wt%,加盖并安装冷凝管,加热至70-90℃,蒸汽处理0.5-2h,洗净,干燥,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,干燥,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将20-40重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉和15-22重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1-2重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为(3-5):4,在300-500W微波下灭酶处理1-3min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将12-20重量份碳源、5-12重量份氮源、2-4重量份维生素和2-5重量份无机盐用100重量份水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为6.5-7.2,灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为(5-10):7,35-40℃温度下培养12-18h,培养成菌种种子液,含菌量为107-108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为1-3%和2-4%,35-40℃温度下培养24-48h,将两个培养基等体积混合并稀释100-200倍得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:(5-10)g/mL,36-38℃温度下恒温发酵48-72h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.益生元的制备:将2-7重量份低聚异麦芽糖、1-3重量份L-阿拉伯糖、2-5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过100-200目筛,得到益生元;
S8.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为(3-7):5,35-40℃温度下培养16-24h,培养成菌种种子液,含菌量为107-108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为3-5%和2-6%,35-40℃温度下培养24-48h,将两个培养基等体积混合并稀释100-200倍得到第二复合发酵菌液;
S9.第二次发酵:将2-3重量份步骤S7制得的益生元、10重量份步骤S6中的滤渣加入20-50重量份步骤S8中的第二复合发酵菌液中,36-38℃温度下恒温发酵48-72h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S10.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将5-10重量份步骤S3制得的酶解产物、12-20重量份步骤S6制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S9制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入3-5重量份玉米低聚肽、1-2重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
本发明进一步保护一种上述制备方法制得的预防及治疗酒精致癌的组合物。
本发明具有如下有益效果:大豆中的抗营养因子,比如胰蛋白酶抑制素主要包括2类,分别为库尼兹胰蛋白酶抑制素(KTI)和鲍曼-贝尔克抑制素(BBI),本发明中采用了化学溶剂+物理蒸汽结合法对大豆进行脱毒和蒸煮处理,在高温下将胰蛋白酶抑制素以及其它抗营养因子通过溶于带有化学溶剂(包括醇、酸和胺)的高温蒸汽中,部分高温分解,产生可挥发性物质而随蒸气散失,部分与有机物质发生反应,如胺可以与硫键反应,从而起到有效脱毒、改善口感的效果;后续的酶解、发酵能进一步对大豆进行脱毒,最终使得组合物中不含有抗营养因子;
乙醇体内代谢过程中发生氧化应激反应会诱导线粒体功能障碍,肝脏脂肪变性,炎症和纤维化。牛樟芝是一种食用真菌,具有很好的抗癌、抗炎等多种活性,是一种很好的保肝护肝的物质,将其与脱毒大豆粉混合后进行复合酶酶解,包括菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,能使得蛋白质物质降解为小分子蛋白、短肽,同时,使得植物细胞壁破裂,从而大量营养物质溶出,还能提取产生一种马来酸琥珀酸衍生物,能显著抑制丙型肝炎病毒(HCV)的活性,其中Antrodin A抑制作用最为明显;Antroquinonols能提高肝脏抗氧化能力,保护肝细胞免受酒精诱导的氧化应激伤,从而保护肝脏等器官避免酒精致癌;
本发明第一次发酵中,以脱毒大豆粉、牛樟芝粉的酶解后渣滓采用红曲、纳豆芽孢杆菌进行发酵,其中,经过红曲霉发酵后,产生大量的红曲色素、不饱和脂肪酸、氨基酸、微量元素、异黄酮、麦角甾醇等活性物质,具有抗癌、降胆固醇、降血脂、降血压、提高人体免疫力等效果,其中,红曲色素包括红曲玉红胺、红斑红曲胺、红曲玉红素、红斑红曲素、红曲素、安卡红曲黄素等,以及Monacolin K等活性物质的抗癌效果明显;另外,脱毒蒸煮后的大豆粉以及牛樟芝粉在纳豆芽孢杆菌的作用下,能产生大量的抗癌、抗氧化、抗炎、降血脂等活性物质,包括纳豆激酶、超氧化物歧化酶、γ-多聚谷氨酸、异黄酮、2,6-吡啶二羧酸、皂苷素、生育酚、维生素K2等,两者协同,具有抗癌、降血脂、溶栓、抗心脑血管疾病、抗菌等显著功效,还具有协同增效的作用;同时,双菌种的混合发酵培养,也能有效抑制红曲霉对桔霉素的产生,从而降低生物毒性;
益生元是一种不被消化或难以被消化的食物成分,这些成分通过选择性的剌激结肠内细菌的增殖和/或活性,从而对宿主的健康有益。本发明将益生元与第一次发酵的滤渣混合后,加入益生菌复合菌液中,水溶性糖类益生元的加入使得益生菌,包括植物乳杆菌、青春双歧杆菌,能够快速的进入稳定期,并有效延长稳定期时间,发酵产生大量的有益物质,同时益生元也可以补充益生菌的碳源,促进益生菌增殖,制得的最终组合物中含有大量的益生菌,具有免疫刺激作用,增强巨噬细胞活性使其产生抗菌素,进而刺激淋巴细胞不断分裂繁殖,有助于体内抗氧化、抗炎反应,从而起到抑制肿瘤的效果。
玉米低聚肽是玉米中提取的蛋白质,再经过定向酶切及特定小肽分离技术获得的小分子多肽物质,不仅具有分子量小,好吸收,无毒性,生物相容性好等优点,玉米低聚肽中氨基酸的分布主要以丙氨酸、亮氨酸和谷氨酸为主,使得其还具有一个重要的、而又不同于其它食物性低聚肽的功能特性——醒酒作用,从而保护肝脏,还能够降低血脂、降血脂、提升人体免疫力;另外,牛磺酸又称β-氨基乙磺酸,是一种含硫的非蛋白氨基酸,能够与胆汁酸结合形成牛黄胆酸,从而促进脂类吸收,还能能促进垂体激素分泌,活化胰腺功能,从而改善机体内分泌系统的状态,促进机体免疫调节和抗疲劳的等作用,本发明在组合物中还添加这两种组分,能进一步提高机体免疫力,从而有效抑制酒精致癌的发生,具有协同增效的作用。
本发明将红曲霉和纳豆芽孢杆菌发酵产物,包括纳豆激酶、红曲色素等,以及将益生菌、益生菌发酵产物、益生元、玉米低聚肽和牛磺酸等一同组合,得到的组合物具有极好的生理代谢调节功能和营养价值,能够增强白细胞、巨噬细胞活性,产生大量的抗菌素,刺激淋巴细胞不断分裂繁殖,提高机体免疫力,起到很好的抗炎、抗氧化效果,从而达到很好的预防和治疗酒精致癌的效果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
牛樟芝为牛樟芝A camphorata S-29来源于上海食品生物技术研究所,菌种保存于中国普通微生物菌种保藏中心,保藏编号为CGMCC NO.9590。
菠萝蛋白酶,酶活力100000U/g,由夏盛(北京)生物科技开发有限公司提供。中性纤维素酶,酶活力5000U/g,由夏盛(北京)生物科技开发有限公司提供。红曲霉为ACCC30342红曲霉,由上海复祥生物科技有限公司提供。纳豆芽孢杆菌,有效物质含量>99%,活菌含量大于1010cfu/g,由济南金华峰辉生物科技有限公司提供。植物乳杆菌,活菌含量大于1010cfu/g,由潍坊瑞辰生物科技有限公司提供。青春双歧杆菌,活菌含量大于1010cfu/g,由陕西康洲生物科技有限公司提供。
低聚异麦芽糖,CAS号:499-40-1,有效物质含量>99%,由上海陵溪生物科技有限公司提供。L-阿拉伯糖,CAS号:5328-37-0,有效物质含量>99%,由西安欣禄生物科技有限公司提供。菊粉,CAS号:9005-90-5,有效物质含量>90%,由上海源叶生物科技有限公司提供。变性淀粉,CAS号:9049-76-7,有效物质含量大于99%,由济南圣和化工有限公司提供。玉米低聚肽,CAS号:6025-53-2,由成都万象宏润生物科技有限公司提供牛磺酸,CAS号:107-35-7,有效物质含量>99.5%,由江苏远洋药业股份有限公司提供。
实施例1
本实施例提供一种预防及治疗酒精致癌的组合物的制备方法,具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为5wt%、2wt%和3wt%,加盖并安装冷凝管,加热至70℃,蒸汽处理2h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将20重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉和15重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为3:4,在300W微波下灭酶处理1min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将10重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、4重量份蛋白胨、1重量份尿素、1重量份维生素C、1重量份维生素A和1重量份氯化钠、0.5重量份硫酸锌、0.5重量份硫酸铜用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为6.5,紫外线灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为5:7,35℃温度下培养12h,培养成菌种种子液,含菌量为107cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为1%和2%,35℃温度下培养24h,将两个培养基等体积混合并稀释100倍得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:5g/mL,36℃温度下恒温发酵48h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.益生元的制备:将2重量份低聚异麦芽糖、1重量份L-阿拉伯糖、2重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过100目筛,得到益生元;
S8.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为3:5,35℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为107cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为3%和2%,35℃温度下培养24h,将两个培养基等体积混合并稀释100倍得到第二复合发酵菌液;
S9.第二次发酵:将2重量份步骤S7制得的益生元、10重量份步骤S6中的滤渣加入20重量份步骤S8中的第二复合发酵菌液中,36℃温度下恒温发酵48h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S10.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将5重量份步骤S3制得的酶解产物、12重量份步骤S6制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S9制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入3重量份玉米低聚肽、1重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
实施例2
本实施例提供一种预防及治疗酒精致癌的组合物的制备方法,具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为12wt%、7wt%和5wt%,加盖并安装冷凝管,加热至90℃,蒸汽处理0.5h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将40重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉和22重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入2重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为5:4,在500W微波下灭酶处理3min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将10重量份麦芽糖、8重量份葡萄糖、2重量份果糖、1重量份赖氨酸、1重量份苏氨酸、10重量份蛋白胨、1重量份维生素C、1重量份维生素B1、1重量份维生素B2、1重量份维生素B6和4重量份氯化钾、0.2重量份氯化锌、0.3重量份氯化铜、0.5重量份氯化锰用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7.2,紫外线灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为10:7,40℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为3%和4%,40℃温度下培养48h,将两个培养基等体积混合并稀释200倍得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:10g/mL,38℃温度下恒温发酵72h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.益生元的制备:将7重量份低聚异麦芽糖、3重量份L-阿拉伯糖、5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过200目筛,得到益生元;
S8.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为7:5,40℃温度下培养24h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为5%和6%,40℃温度下培养48h,将两个培养基等体积混合并稀释200倍得到第二复合发酵菌液;
S9.第二次发酵:将3重量份步骤S7制得的益生元、10重量份步骤S6中的滤渣加入50重量份步骤S8中的第二复合发酵菌液中,38℃温度下恒温发酵72h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S10.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将10重量份步骤S3制得的酶解产物、20重量份步骤S6制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S9制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入5重量份玉米低聚肽、2重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
实施例3
本实施例提供一种预防及治疗酒精致癌的组合物的制备方法,具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为7wt%、5wt%和4wt%,加盖并安装冷凝管,加热至80℃,蒸汽处理1h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将30重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉和18重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1.5重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为4:4,在400W微波下灭酶处理2min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为7:7,37℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为2%和3%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:7g/mL,37℃温度下恒温发酵56h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.益生元的制备:将5重量份低聚异麦芽糖、2重量份L-阿拉伯糖、3.5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过150目筛,得到益生元;
S8.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为5:5,37℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为4%和4%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第二复合发酵菌液;
S9.第二次发酵:将2.5重量份步骤S7制得的益生元、10重量份步骤S6中的滤渣加入35重量份步骤S8中的第二复合发酵菌液中,37℃温度下恒温发酵56h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S10.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将7重量份步骤S3制得的酶解产物、15重量份步骤S6制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S9制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入4重量份玉米低聚肽、1.5重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
实施例4
与实施例3相比,复合酶为单一的菠萝蛋白酶,其他条件均不改变。
实施例5
与实施例3相比,复合酶为单一的中性纤维素酶,其他条件均不改变。
对比例1
与实施例3相比,未进行步骤S1,直接将大豆洗净、干燥后煮熟,干燥,粉碎,得到大豆粉。
具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后煮熟,干燥,粉碎,得到大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将30重量份步骤S1制得的大豆粉和18重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1.5重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为4:4,在400W微波下灭酶处理2min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为7:7,37℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为2%和3%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:7g/mL,37℃温度下恒温发酵56h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.益生元的制备:将5重量份低聚异麦芽糖、2重量份L-阿拉伯糖、3.5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过150目筛,得到益生元;
S8.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为5:5,37℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为4%和4%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第二复合发酵菌液;
S9.第二次发酵:将2.5重量份步骤S7制得的益生元、10重量份步骤S6中的滤渣加入35重量份步骤S8中的第二复合发酵菌液中,37℃温度下恒温发酵56h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S10.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将7重量份步骤S3制得的酶解产物、15重量份步骤S6制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S9制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入4重量份玉米低聚肽、1.5重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
对比例2
与实施例3相比,未进行步骤S3酶解,其他条件均不改变。
具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为7wt%、5wt%和4wt%,加盖并安装冷凝管,加热至80℃,蒸汽处理1h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S4.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为7:7,37℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S3制得的培养基中,接种量分别为2%和3%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第一复合发酵菌液;
S5.第一次发酵:将30重量份步骤S1制得的大豆粉和18重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入步骤S4中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:7g/mL,37℃温度下恒温发酵56h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S6.益生元的制备:将5重量份低聚异麦芽糖、2重量份L-阿拉伯糖、3.5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过150目筛,得到益生元;
S7.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为5:5,37℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S3制得的培养基中,接种量分别为4%和4%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第二复合发酵菌液;
S8.第二次发酵:将2.5重量份步骤S6制得的益生元、10重量份步骤S5中的滤渣加入35重量份步骤S7中的第二复合发酵菌液中,37℃温度下恒温发酵56h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S9.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将15重量份步骤S5制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S8制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入4重量份玉米低聚肽、1.5重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
对比例3
与实施例3相比,第一复合发酵菌液中未添加纳豆芽孢杆菌,其他条件均不改变。
具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为7wt%、5wt%和4wt%,加盖并安装冷凝管,加热至80℃,蒸汽处理1h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将30重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉和18重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1.5重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为4:4,在400W微波下灭酶处理2min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将红曲霉接种到高氏培养基中,37℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,接种于步骤S4制得的培养基中,接种量为5%,37℃温度下培养36h,稀释150倍得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:7g/mL,37℃温度下恒温发酵56h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.益生元的制备:将5重量份低聚异麦芽糖、2重量份L-阿拉伯糖、3.5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过150目筛,得到益生元;
S8.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为5:5,37℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为4%和4%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第二复合发酵菌液;
S9.第二次发酵:将2.5重量份步骤S7制得的益生元、10重量份步骤S6中的滤渣加入35重量份步骤S8中的第二复合发酵菌液中,37℃温度下恒温发酵56h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S10.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将7重量份步骤S3制得的酶解产物、15重量份步骤S6制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S9制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入4重量份玉米低聚肽、1.5重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
对比例4
与实施例3相比,第一复合发酵菌液中未添加红曲霉,其他条件均不改变。
具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为7wt%、5wt%和4wt%,加盖并安装冷凝管,加热至80℃,蒸汽处理1h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将30重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉和18重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1.5重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为4:4,在400W微波下灭酶处理2min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌接种到高氏培养基中,37℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,接种于步骤S4制得的培养基中,接种量为5%,37℃温度下培养36h,稀释150倍得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:7g/mL,37℃温度下恒温发酵56h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.益生元的制备:将5重量份低聚异麦芽糖、2重量份L-阿拉伯糖、3.5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过150目筛,得到益生元;
S8.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为5:5,37℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为4%和4%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第二复合发酵菌液;
S9.第二次发酵:将2.5重量份步骤S7制得的益生元、10重量份步骤S6中的滤渣加入35重量份步骤S8中的第二复合发酵菌液中,37℃温度下恒温发酵56h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S10.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将7重量份步骤S3制得的酶解产物、15重量份步骤S6制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S9制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入4重量份玉米低聚肽、1.5重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
对比例5
与实施例3相比,未进行步骤S5、S6,其他条件均不改变。
具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为7wt%、5wt%和4wt%,加盖并安装冷凝管,加热至80℃,蒸汽处理1h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将30重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉和18重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1.5重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为4:4,在400W微波下灭酶处理2min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S5.益生元的制备:将5重量份低聚异麦芽糖、2重量份L-阿拉伯糖、3.5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过150目筛,得到益生元;
S6.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为5:5,37℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为4%和4%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第二复合发酵菌液;
S7.第二次发酵:将2.5重量份步骤S5制得的益生元、10重量份步骤S3中的滤渣加入35重量份步骤S6中的第二复合发酵菌液中,37℃温度下恒温发酵56h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S8.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将7重量份步骤S3制得的酶解产物、65重量份步骤S7制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入4重量份玉米低聚肽、1.5重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
对比例6
与实施例3相比,第二复合发酵菌液中未添加植物乳杆菌,其他条件均不改变。
具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为7wt%、5wt%和4wt%,加盖并安装冷凝管,加热至80℃,蒸汽处理1h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将30重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉和18重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1.5重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为4:4,在400W微波下灭酶处理2min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为7:7,37℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为2%和3%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:7g/mL,37℃温度下恒温发酵56h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.益生元的制备:将5重量份低聚异麦芽糖、2重量份L-阿拉伯糖、3.5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过150目筛,得到益生元;
S8.第二复合发酵菌液的制备:将青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,37℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,接种于步骤S4制得的培养基中,接种量为8%,37℃温度下培养36h,稀释150倍得到第二复合发酵菌液;
S9.第二次发酵:将2.5重量份步骤S7制得的益生元、10重量份步骤S6中的滤渣加入35重量份步骤S8中的第二复合发酵菌液中,37℃温度下恒温发酵56h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S10.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将7重量份步骤S3制得的酶解产物、15重量份步骤S6制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S9制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入4重量份玉米低聚肽、1.5重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
对比例7
与实施例3相比,第二复合发酵菌液中未添加青春双歧杆菌,其他条件均不改变。
具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为7wt%、5wt%和4wt%,加盖并安装冷凝管,加热至80℃,蒸汽处理1h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将30重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉和18重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1.5重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为4:4,在400W微波下灭酶处理2min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为7:7,37℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为2%和3%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:7g/mL,37℃温度下恒温发酵56h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.益生元的制备:将5重量份低聚异麦芽糖、2重量份L-阿拉伯糖、3.5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过150目筛,得到益生元;
S8.第二复合发酵菌液的制备:将青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,37℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,接种于步骤S4制得的培养基中,接种量为8%,37℃温度下培养36h,稀释150倍得到第二复合发酵菌液;
S9.第二次发酵:将2.5重量份步骤S7制得的益生元、10重量份步骤S6中的滤渣加入35重量份步骤S8中的第二复合发酵菌液中,37℃温度下恒温发酵56h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S10.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将7重量份步骤S3制得的酶解产物、15重量份步骤S6制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S9制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入4重量份玉米低聚肽、1.5重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
对比例8
与实施例3相比,未进行步骤S7、S8、S9,其他条件均不改变。
具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为7wt%、5wt%和4wt%,加盖并安装冷凝管,加热至80℃,蒸汽处理1h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将30重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉和18重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1.5重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为4:4,在400W微波下灭酶处理2min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为7:7,37℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为2%和3%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:7g/mL,37℃温度下恒温发酵56h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将7重量份步骤S3制得的酶解产物、65重量份步骤S6制得的第一次发酵产物混合均匀后,加入4重量份玉米低聚肽、1.5重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
对比例9
与实施例3相比,步骤S10中未添加玉米低聚肽,其他条件均不改变。
具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为7wt%、5wt%和4wt%,加盖并安装冷凝管,加热至80℃,蒸汽处理1h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将30重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉和18重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1.5重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为4:4,在400W微波下灭酶处理2min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为7:7,37℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为2%和3%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:7g/mL,37℃温度下恒温发酵56h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.益生元的制备:将5重量份低聚异麦芽糖、2重量份L-阿拉伯糖、3.5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过150目筛,得到益生元;
S8.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为5:5,37℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为4%和4%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第二复合发酵菌液;
S9.第二次发酵:将2.5重量份步骤S7制得的益生元、10重量份步骤S6中的滤渣加入35重量份步骤S8中的第二复合发酵菌液中,37℃温度下恒温发酵56h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S10.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将7重量份步骤S3制得的酶解产物、15重量份步骤S6制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S9制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入5.5重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
对比例10
与实施例3相比,步骤S10中未添加牛磺酸,其他条件均不改变。
具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为7wt%、5wt%和4wt%,加盖并安装冷凝管,加热至80℃,蒸汽处理1h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S3.酶解:将30重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉和18重量份步骤S2制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1.5重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为4:4,在400W微波下灭酶处理2min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S4.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S5.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为7:7,37℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为2%和3%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第一复合发酵菌液;
S6.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S5中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:7g/mL,37℃温度下恒温发酵56h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S7.益生元的制备:将5重量份低聚异麦芽糖、2重量份L-阿拉伯糖、3.5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过150目筛,得到益生元;
S8.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为5:5,37℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S4制得的培养基中,接种量分别为4%和4%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第二复合发酵菌液;
S9.第二次发酵:将2.5重量份步骤S7制得的益生元、10重量份步骤S6中的滤渣加入35重量份步骤S8中的第二复合发酵菌液中,37℃温度下恒温发酵56h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S10.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将7重量份步骤S3制得的酶解产物、15重量份步骤S6制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S9制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入5.5重量份玉米低聚肽,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
对比例11
与实施例3相比,未添加大豆,其他条件均不改变。
具体包括以下步骤:
S1.牛樟芝的处理:将牛樟芝洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到牛樟芝粉;
S2.酶解:将48重量份步骤S1制得的牛樟芝粉混合均匀后,加入100重量份去离子水中,加入1.5重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为4:4,在400W微波下灭酶处理2min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S3.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S4.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为7:7,37℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S3制得的培养基中,接种量分别为2%和3%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第一复合发酵菌液;
S5.第一次发酵:将步骤S3中的滤渣加入步骤S4中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:7g/mL,37℃温度下恒温发酵56h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S6.益生元的制备:将5重量份低聚异麦芽糖、2重量份L-阿拉伯糖、3.5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过150目筛,得到益生元;
S7.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为5:5,37℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S3制得的培养基中,接种量分别为4%和4%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第二复合发酵菌液;
S8.第二次发酵:将2.5重量份步骤S6制得的益生元、10重量份步骤S5中的滤渣加入35重量份步骤S7中的第二复合发酵菌液中,37℃温度下恒温发酵56h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S9.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将7重量份步骤S2制得的酶解产物、15重量份步骤S5制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S8制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入4重量份玉米低聚肽、1.5重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
对比例12
与实施例3相比,未添加牛樟芝,其他条件均不改变。
具体包括以下步骤:
S1.大豆的脱毒预处理:将大豆洗净、干燥后,放置于上层筛网,将乙醇、乙酸和氨水的混合液装入容器中,其中,C2H5OH、CH3COOH和NH3·H2O的质量分数为7wt%、5wt%和4wt%,加盖并安装冷凝管,加热至80℃,蒸汽处理1h,去离子水洗净,50℃干燥2h,粉碎,得到脱毒大豆粉;
S2.酶解:将48重量份步骤S1制得的脱毒大豆粉加入100重量份去离子水中,加入1.5重量份复合酶酶解,复合酶为菠萝蛋白酶和中性纤维素酶,质量比为4:4,在400W微波下灭酶处理2min,过滤,滤液冷冻干燥,得到酶解产物,滤渣留用;
S3.培养基的制备:将12重量份葡萄糖、3重量份果糖、2重量份水溶性淀粉、2重量份尿素、7重量份蛋白胨、0.5重量份苏氨酸、0.5重量份甘氨酸、1重量份维生素B12、2重量份维生素D和2重量份氯化钠、0.5重量份氯化钙、0.5重量份硫酸镁、0.5重量份氯化铁用100重量份无菌水溶解,混合均匀后,用PBS溶液调节培养基pH值为7,紫外线灭菌,分成4份备用;
S4.第一复合发酵菌液的制备:将纳豆芽孢杆菌、红曲霉接种到高氏培养基中,纳豆芽孢杆菌、红曲霉的质量比为7:7,37℃温度下培养16h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S3制得的培养基中,接种量分别为2%和3%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第一复合发酵菌液;
S5.第一次发酵:将步骤S2中的滤渣加入步骤S4中的第一复合发酵菌液中,固液比为1:7g/mL,37℃温度下恒温发酵56h,过滤,滤液冷冻干燥,得到第一次发酵产物,滤渣留用;
S6.益生元的制备:将5重量份低聚异麦芽糖、2重量份L-阿拉伯糖、3.5重量份菊粉和10重量份变性淀粉混合均匀,研细,过150目筛,得到益生元;
S7.第二复合发酵菌液的制备:将植物乳杆菌、青春双歧杆菌接种到高氏培养基中,植物乳杆菌、青春双歧杆菌的质量比为5:5,37℃温度下培养18h,培养成菌种种子液,含菌量为108cfu/mL,分别接种于步骤S3制得的培养基中,接种量分别为4%和4%,37℃温度下培养36h,将两个培养基等体积混合并稀释150倍得到第二复合发酵菌液;
S8.第二次发酵:将2.5重量份步骤S6制得的益生元、10重量份步骤S5中的滤渣加入35重量份步骤S7中的第二复合发酵菌液中,37℃温度下恒温发酵56h,冷冻干燥,得到第二次发酵产物;
S9.预防及治疗酒精致癌的组合物的制备:将7重量份步骤S2制得的酶解产物、15重量份步骤S5制得的第一次发酵产物和50重量份步骤S8制得的第二次发酵产物混合均匀后,加入4重量份玉米低聚肽、1.5重量份牛磺酸,混合均匀,得到预防及治疗酒精致癌的组合物。
测试例1
将本发明实施例1-5和对比例1-12制得的预防及治疗酒精致癌的组合物进行成分测定,结果见表1。
表1
由上表可知,本发明实施例1-3制得的预防及治疗酒精致癌的组合物的胰蛋白酶抑制剂含量下降至<0.1mg/g,富含有机酸类物质,并含有丰富的抗癌、抗氧化、抗炎的营养物资。
测试例2对相关肿瘤细胞的影响
细胞株:肝癌HepG2、口腔癌HN6、舌癌TCA8113。
MTT法:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板中培养,每孔体积200uL,设置对照组、实施例1-5组和对比例1-12组。每组6个复孔,实施例1-5组和对比例1-12组加入实施例1-5和对比例1-12制得的预防及治疗酒精致癌的组合物,对照组加入阿霉素,置于细胞培养箱内分别培养2-4天,培养结束后,每孔加入已配制好的MTT溶液(5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)200μL,细胞培养箱内孵育4h。吸去旧液,每孔加入150μL DMSO,置于振荡器上振荡15min,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
并根据细胞抑制率计算出各组对不同肿瘤细胞株的半抑制浓度(IC50值)。
结果见表2。
表2
由上表可知,本发明实施例1-3制得的预防及治疗酒精致癌的组合物能明显抑制肿瘤细胞的生长。
测试例3对酒精性肝损伤小鼠的影响
实验小鼠适应性喂养一周后,将190只小鼠随机分成19组,包括空白对照组、模型组、实施例1-5组、对比例1-12组。其中除了空白对照组,其他组分别腹腔注射相同剂量的52%vol食用酒精,另外,实施例1-5组和对比例1-12组分别每天灌胃2g/kg制得的预防及治疗酒精致癌的组合物,培养30d后,最后一次灌胃后禁食不禁水,8h后,眼球取血液,测定血清中TG以及血清中丙氨酸转氨酶ALT、门冬氨酸氨基转移酶AST以及γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的活性,然后处死小鼠,取肝脏组织,加入3倍体积的甲醇,电动匀浆,再加入6倍体积的氯仿,漩涡混合器混匀,制备10%的组织匀浆,静置抽提24h后,小心抽取有机层,测定肝脏中TG含量。
结果见表3和表4。
表3
组别 |
血清TG(mmol/L) |
肝脏TG(mmol/L) |
空白对照组 |
1.45±0.42 |
19.43±7.45 |
模型组 |
3.56±1.04<sup>#</sup> |
44.36±14.23<sup>#</sup> |
实施例1组 |
2.42±0.56<sup>*</sup> |
24.25±7.24<sup>*</sup> |
实施例2组 |
2.40±0.47<sup>*</sup> |
23.42±8.22<sup>*</sup> |
实施例3组 |
2.37±0.52<sup>*</sup> |
22.10±6.37<sup>*</sup> |
实施例4组 |
2.56±0.45 |
27.53±6.54 |
实施例5组 |
2.59±0.51 |
27.59±7.12 |
对比例1组 |
2.48±0.48 |
25.63±7.53 |
对比例2组 |
2.67±0.37 |
29.6±5.78 |
对比例3组 |
2.72±0.42 |
30.62±8.34 |
对比例4组 |
2.69±0.47 |
31.25±7.98 |
对比例5组 |
2.87±0.50 |
34.57±6.85 |
对比例6组 |
2.82±0.46 |
32.15±7.34 |
对比例7组 |
2.87±0.53 |
31.56±6.89 |
对比例8组 |
3.10±0.42 |
35.26±5.78 |
对比例9组 |
2.78±0.56 |
27.8±7.62 |
对比例10组 |
2.85±0.47 |
28.5±6.98 |
对比例11组 |
3.10±0.68 |
35.5±6.73 |
对比例12组 |
2.97±0.74 |
33.5±5.89 |
注释:与空白对照组相比,#表示P<0.05;与模型组比,*表示P<0.05。
表4
组别 |
ALT(ukat/l) |
AST(ukat/l) |
GGT(ukat/l) |
空白对照组 |
0.72±0.09 |
4.52±0.34 |
0.11±0.04 |
模型组 |
1.85±0.11<sup>#</sup> |
8.15±0.24<sup>#</sup> |
0.32±0.01<sup>#</sup> |
实施例1组 |
0.79±0.10<sup>*</sup> |
4.85±0.22<sup>*</sup> |
0.18±0.01<sup>*</sup> |
实施例2组 |
0.77±0.06<sup>*</sup> |
4.80±0.18<sup>*</sup> |
0.16±0.02* |
实施例3组 |
0.75±0.08<sup>*</sup> |
4.72±0.19* |
0.14±0.01* |
实施例4组 |
0.90±0.07 |
5.21±0.17 |
0.22±0.01 |
实施例5组 |
0.92±0.06 |
5.25±0.15 |
0.23±0.02 |
对比例1组 |
0.84±0.04 |
4.94±0.14 |
0.20±0.01 |
对比例2组 |
1.03±0.10 |
5.52±0.16 |
0.24±0.02 |
对比例3组 |
1.17±0.07 |
5.85±0.13 |
0.25±0.01 |
对比例4组 |
1.21±0.06 |
5.79±0.17 |
0.26±0.02 |
对比例5组 |
1.42±0.09 |
6.02±0.15 |
0.29±0.02 |
对比例6组 |
1.37±0.07 |
5.92±0.12 |
0.27±0.01 |
对比例7组 |
1.40±0.05 |
6.01±0.15 |
0.26±0.03 |
对比例8组 |
1.57±0.04 |
6.35±0.14 |
0.30±0.03 |
对比例9组 |
1.46±0.05 |
5.77±0.16 |
0.25±0.02 |
对比例10组 |
1.51±0.04 |
5.47±0.12 |
0.23±0.02 |
对比例11组 |
1.56±0.06 |
6.78±0.15 |
0.27±0.03 |
对比例12组 |
1.62±0.05 |
6.98±0.17 |
0.29±0.02 |
注释:与空白对照组相比,#表示P<0.05;与模型组比,*表示P<0.05。
由上表可知,本发明实施例1-3制得的预防及治疗酒精致癌的组合物具有很好的保护酒精性肝损伤的功能,具有良好的抗氧化、抗炎等功效,进一步能很好的起到抗癌的效果。
实施例4、实施例5与实施例3相比,复合酶为单一的菠萝蛋白酶或中性纤维素酶,总酸、琥珀酸等物质含量下降,对酒精性肝损伤的保护作用下降;对比例2与实施例3相比,未进行步骤S3酶解,总酸、琥珀酸等物质含量明显下降,对酒精性肝损伤的保护作用明显下降;本发明酶解复合酶包括菠萝蛋白酶和纤维素酶,能使得蛋白质物质降解为小分子蛋白、短肽,同时,使得植物细胞壁破裂,从而大量营养物质溶出,还能提取产生一种马来酸、琥珀酸衍生物,能显著抑制丙型肝炎病毒(HCV)的活性,两种酶具有协同增效的作用。
对比例1与实施例3相比,大豆未进行步骤S1脱毒蒸煮处理,使得最后制得的组合物中胰蛋白酶抑制剂显著升高,可见,经过脱毒处理后,组合物中抗营养因子含量会大大降低。本发明中采用了化学溶剂+物理蒸汽结合法对大豆进行脱毒和蒸煮处理,在高温下将胰蛋白酶抑制素以及其它抗营养因子通过溶于带有化学溶剂(包括醇、酸和胺)的高温蒸汽中,部分高温分解,产生可挥发性物质而随蒸气散失,部分与有机物质发生反应,如胺可以与硫键反应,从而起到有效脱毒、改善口感的效果;后续的酶解、发酵能进一步对大豆进行脱毒,最终使得组合物中不含有抗营养因子。
对比例3、对比例4与实施例3相比,第一复合发酵菌液中未添加纳豆芽孢杆菌、红曲霉,使得异黄酮、红曲色素和Monacolin K含量以及细胞抗癌活性下降,对酒精性肝损伤的保护作用下降;对比例5与实施例3相比,未进行步骤S5、S6,未进行第一次发酵工艺,使得异黄酮、红曲色素和Monacolin K含量以及细胞抗癌活性明显下降,对酒精性肝损伤的保护作用明显下降;本发明第一次发酵中,以脱毒大豆粉、牛樟芝粉的酶解后渣滓采用红曲、纳豆杆菌进行发酵,其中,经过红曲霉发酵后,产生大量的红曲色素、不饱和脂肪酸、氨基酸、微量元素、异黄酮、麦角甾醇等活性物质,具有抗癌、降胆固醇、降血脂、降血压、提高人体免疫力等效果,其中,红曲色素包括红曲玉红胺、红斑红曲胺、红曲玉红素、红斑红曲素、红曲素、安卡红曲黄素等,以及Monacolin K等活性物质的抗癌效果明显;另外,脱毒蒸煮后的大豆粉以及牛樟芝粉在纳豆杆菌的作用下,能产生大量的抗癌、抗氧化、抗炎、降血脂等活性物质,包括纳豆激酶、超氧化物歧化酶、γ-多聚谷氨酸、异黄酮、2,6-吡啶二羧酸、皂苷素、生育酚、维生素K2等,两者协同,具有抗癌、降血脂、溶栓、抗心脑血管疾病、抗菌等显著功效,还具有协同增效的作用;同时,双菌种的混合发酵培养,也能有效抑制红曲霉对桔霉素的产生,从而降低生物毒性,两种菌株具有协同增效的作用。
对比例6、对比例7与实施例3相比,第二复合发酵菌液中未添加植物乳杆菌或者青春双歧杆菌,细胞抗癌活性下降,对酒精性肝损伤的保护作用下降;对比例8与实施例3相比,未进行步骤S7、S8、S9,未进行第二次发酵工艺,细胞抗癌活性明显下降,对酒精性肝损伤的保护作用明显下降;益生元是一种不被消化或难以被消化的食物成分,这些成分通过选择性的剌激结肠内细菌的增殖和/或活性,从而对宿主的健康有益。本发明将益生元与第一次发酵的滤渣混合后,加入益生菌复合菌液中,水溶性糖类益生元的加入使得益生菌,包括植物乳杆菌、青春双歧杆菌,能够快速的进入稳定期,并有效延长稳定期时间,发酵产生大量的有益物质,同时益生元也可以补充益生菌的碳源,促进益生菌增殖,制得的最终组合物中含有大量的益生菌,具有免疫刺激作用,增强巨噬细胞活性使其产生抗菌素,进而刺激淋巴细胞不断分裂繁殖,有助于体内抗氧化、抗炎反应,从而起到抑制肿瘤的效果,两种菌株具有协同增效的作用。
对比例9、对比例10与实施例3相比,步骤S10中未添加玉米低聚肽或者牛磺酸,对酒精性肝损伤的保护作用明显下降。玉米低聚肽是玉米中提取的蛋白质,再经过定向酶切及特定小肽分离技术获得的小分子多肽物质,不仅具有分子量小,好吸收,无毒性,生物相容性好等优点,玉米低聚肽中氨基酸的分布主要以丙氨酸、亮氨酸和谷氨酸为主,使得其还具有醒酒作用,从而保护肝脏,还能够降低血脂、降血脂、提升人体免疫力;另外,牛磺酸又称β-氨基乙磺酸,是一种含硫的非蛋白氨基酸,能够与胆汁酸结合形成牛黄胆酸,从而促进脂类吸收,还能能促进垂体激素分泌,活化胰腺功能,从而改善机体内分泌系统的状态,促进机体免疫调节和抗疲劳的等作用,本发明在组合物中还添加这两种组分,能进一步提高机体免疫力,从而有效抑制酒精致癌的发生,具有协同增效的作用。
对比例11、对比例12与实施例3相比,未添加大豆或者牛樟芝,对比例11中异黄酮、胰蛋白酶抑制剂明显下降,对比例12中琥珀酸、总酸含量明显下降,两者细胞抗癌活性明显下降,对酒精性肝损伤的保护作用明显下降。乙醇体内代谢过程中发生氧化应激反应会诱导线粒体功能障碍,肝脏脂肪变性,炎症和纤维化。牛樟芝是一种食用真菌,具有很好的抗癌、抗炎等多种活性,是一种很好的保肝护肝的物质,大豆中的纳豆激酶也能起到很好的抗癌、保护肝脏的效果具有协同增效的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。