CN101824455A - 一种大豆蛋白低聚肽及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆蛋白低聚肽，以大豆蛋白低聚肽总重量计，粗蛋白含量90％-95％，灰分2％-3％，水分3％-5％，糖及脂肪含量2％-3％，其氮溶指数NSI为98.5％-99.9％，酸溶性蛋白含量99.5％-99.9％。本发明还公开了这种大豆蛋白低聚肽的制备方法及其用途。

Description

一种大豆蛋白低聚肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，尤其涉及一种大豆蛋白低聚肽及其制备方法和用途。

背景技术

大豆蛋白在食品工业、饲料工业中有着广泛的应用。大豆分离蛋白可应用于鱼类制品、肉类制品、乳制品和营养食品等，大豆浓缩蛋白分为粉状、粒状两种，粉状用于食品增加蛋白质含量；粒状基本上是用来增强食品的组织结构，两种产品都能增强食品的保水性。在肉制品中，大豆蛋白可用于容留肉汁、吸收脂肪，改善口感。大豆蛋白氨基酸组成平衡，必须氨基酸含量丰富，作为高营养价值的饲料，也广泛应用于养殖业。

迄今为止，大豆蛋白产品自身功能的一些缺陷使得它们的应用受到了很大的影响。如大豆蛋白的敏感性特别强，在热、酸、碱等条件下极易发生物理、化学变化，形成絮片或沉淀，也就是所谓的速溶性问题，这也就局限了大豆蛋白的应用面；大豆蛋白溶解度低，无法作为功能性成分在乳制品、饮料和糖果等食品体系中加以利用；大豆蛋白具有一定的抗原性，而且其消化率和生物效价远不及牛奶，鸡蛋等动物性蛋白等。我国大豆分离蛋白的开发较国外落后，吸收消化后还有一定差距，国产较好的分离蛋白虽然蛋白含量可以达到85％以上，但NSI值仍只有65％左右。

为了改善大豆蛋白的功能特性，拓宽其应用领域，因此提出了大豆蛋白水解，即大豆多肽的研究开发。大豆肽是由大豆蛋白降解而生成的一种复合物，主要成分为分子链不等的各级肽类，还包括一些游离氨基酸、少量糖类、水分、灰分等。大豆肽具有易消化吸收、分子量小、无豆腥味，在热、酸、碱条件下不发生变性，NSI值在90％以上，速溶性好，这一产品开发的成功将使大豆蛋白的功能特性与应用面更上一层楼。

现阶段大豆肽的研究已较为普遍，但在应用上还存在不少问题：①大豆肽在风味上需要达到的目标是无味、无臭。但蛋白质水解过程中产生的苦味、臭味无法完全抑制，尤其是大规模生产中。蛋白质水解生产蛋白水解肽之所以会有苦味，主要是由于常规的蛋白酶水解时，会使蛋白质中的疏水性氨基酸残基大量暴露，并且这些蛋白酶本身就有较浓的臭味，从而使得到的大豆肽产品带有苦味和臭味，因此需要用化学修饰、活性炭吸附和离子交换等工艺进行脱苦及除臭，这些工艺繁琐复杂，而且过程中大豆肽的损失也很大，使得生产成本大大增加。②大豆多肽与氨基酸混合物和蛋白质相比价格高是不可避免的，这也是多肽进入市场困难的主要原因。目前大豆肽产品的限制性因素主要有两个：一是生产工艺复杂，效率低，收率低，成本高；二是产品品质差，质量不稳定。③目前，采用的大豆蛋白质水解用的酶制剂无法彻底消除水解过程中产生的苦味和臭味。能有效克服水解过程中的苦味的蛋白酶，任务仍然非常艰巨。另外，水解度控制要求特别高，仍然是人工操作，自动化程度低，误差较大，工艺复杂，产品收率低、成本较高、质量不够稳定等。

因此，本领域迫切需要提供一种水解大豆蛋白的新方法，它可以高效、快速、彻底地水解大豆蛋白获得大豆蛋白肽，其工艺简单，产率高，产品质量稳定、性能好，并且能够从根本上解决大豆蛋白肽的苦味和臭味问题。

发明内容

本发明旨在提供一种大豆蛋白低聚肽。

本发明的另一个目的是提供所述大豆蛋白低聚肽的制备方法。

本发明的再一个目的是提供所述大豆蛋白低聚肽的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种大豆蛋白低聚肽，以大豆蛋白低聚肽总重量计，粗蛋白含量90％-95％，灰分2％-3％，水分3％-5％，糖及脂肪含量2％-3％，其氮溶指数NSI为98.5％-99.9％，酸溶性蛋白含量99.5％-99.9％。

在另一优选例中，以大豆蛋白低聚肽总重量计，分子量在6000Da±100Da的组分占47％-54w/w％，分子量在300-1000Da的组分占35％-42w/w％。

在另一优选例中，所述大豆蛋白低聚肽在所有pH下都能溶液水，溶液澄清，呈淡黄褐色-淡红褐色，显弱酸性；所述大豆蛋白低聚肽无异味，无苦味；对热很稳定，100℃煮沸无沉淀析出；室温下保存6个月含量无明显变化。

在另一优选例中，所述的大豆蛋白低聚肽通过下述步骤制备得到：

(1)将原材料和复合酶A在pH8-9，55-65℃混合8-12小时，得到大豆蛋白低聚肽；以固形物的总重量计，复合酶A的量为1-3w/w％；所述的原材料选自：大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、大豆蛋白粉、大豆粉、或大豆饼粉；所述的复合酶A由下述成份构成：以复合酶A的干物的总重量计，角蛋白酶60-70w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，中性蛋白酶5-10w/w％，枯草杆菌蛋白酶1-5w/w％，地衣芽孢杆菌蛋白酶1-5w/w％，菠萝蛋白酶0.5-5w/w％。

在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的大豆蛋白低聚肽的制备方法，所述的方法包括步骤：

(1)将原材料和复合酶A在pH8-9，55-65℃混合8-12小时，得到大豆蛋白低聚肽；以固形物的总重量计，复合酶A的量为1-3w/w％；所述的原材料选自：大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、大豆蛋白粉、大豆粉、或大豆饼粉；所述的复合酶A由下述成份构成：以复合酶A的干物的总重量计，角蛋白酶60-70w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，中性蛋白酶5-10w/w％，枯草杆菌蛋白酶1-5w/w％，地衣芽孢杆菌蛋白酶1-5w/w％，菠萝蛋白酶0.5-5w/w％。

在另一优选例中，所述步骤(1)为：将原材料和复合酶A在pH8-9，55-65℃混合8-12小时后，在75-85℃保温30分钟。

在另一优选例中，在步骤(1)前，所述原材料经过以下步骤处理：

(a)将原材料和水按固液比1∶3-1∶9混合、研磨成乳状液。

在另一优选例中，所述原材料经过以下步骤处理：

(a′)将大豆浓缩蛋白或大豆蛋白粉和水按固液比1∶3-1∶9混合、研磨成乳状液；和

(b′)将步骤(a′)得到的乳状液和复合酶B在45-55℃混合、过滤，得到经过处理的大豆浓缩蛋白或大豆蛋白粉；以固形物的总重量计，复合酶B的量为0.3-0.5w/w％；所述的复合酶B由下述成份构成：以复合酶B的干物的总重量计，木聚糖酶20-35w/w％，葡聚糖酶25-35w/w％，α-淀粉酶10-25w/w％，果胶酶10-20w/w％，甘露聚糖酶1-5w/w％，纤维素酶0.01-1.0w/w％，酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％。

在另一优选例中，所述原材料经过以下步骤处理：

(a″)将大豆粉或大豆饼粉和水按固液比1∶3-1∶9混合、研磨成乳状液；和

(b″)将步骤(a″)得到的乳状液和复合酶C在45-55℃混合、过滤，得到经过处理的大豆粉或大豆饼粉；以固形物的总重量计，复合酶C的量为0.5-1.0w/w％；所述的复合酶C由下述成份构成：以复合酶C的干物的总重量计，木聚糖酶15-30w/w％，葡聚糖酶20-30w/w％，α-淀粉酶20-35w/w％，果胶酶10-20w/w％，甘露聚糖酶1-5w/w％，纤维素酶0.01-1.0w/w％，酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％，脂肪酶1-5w/w％。

在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的大豆蛋白低聚肽的用途，所述的大豆蛋白低聚肽用于制备清除自由基、抗氧化的组合物；或用于制备血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂；或用于制备抑制血栓形成的组合物；或用于制备预防或抑制癌细胞生长的组合物。

据此，本发明提供了一种水解大豆蛋白的新方法，它可以高效、快速、彻底地水解大豆蛋白获得大豆蛋白肽，其工艺简单，产率高，产品质量稳定、性能好，并且能够从根本上解决大豆蛋白肽的苦味和臭味问题。

附图说明

图1显示了复合酶A中不同浓度的角蛋白酶对大豆蛋白的水解能力。

图2显示了不同用量的复合酶A对大豆蛋白的水解能力。

图3是大豆蛋白低聚肽制备工艺流程示意图。

图4是大豆蛋白低聚肽的凝胶色谱图。

图5显示了本发明大豆蛋白低聚肽对羟自由基的清除效果。

图6显示了本发明大豆蛋白低聚肽对超氧阴离子自由基的清除效果。

图7显示了本发明大豆蛋白低聚肽对DPPH自由基的清除效果。

图8是大豆蛋白低聚肽对ACE活性的抑制测定谱图；其中

A是ACE抑制活性测定标样图谱；B是大豆肽ACE抑制活性样品图谱。

图9显示了本发明大豆蛋白低聚肽对ACE活性的抑制效果。

图10显示了本发明大豆蛋白低聚肽对血小板聚集的抑制效果。

图11显示了本发明大豆蛋白低聚肽对癌细胞的抑制效果；其中

A是未加本发明大豆蛋白低聚肽的人胚肾上皮细胞变种293FT生长情况；B是加本发明大豆蛋白低聚肽后人胚肾上皮细胞变种293FT生长情况；C是未加本发明大豆蛋白低聚肽的人肝癌细胞HepG2生长情况；D是加本发明大豆蛋白低聚肽后人肝癌细胞HepG2生长情况。

图12是本发明大豆蛋白低聚肽经胃、胰蛋白酶消化前后的凝胶色谱图；其中A是消化前的凝胶色谱图；B是经胃蛋白酶消化后的凝胶色谱图；C是经胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后的凝胶色谱图。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现使用复合酶A可以有效地水解大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、大豆粉、或大豆饼粉得到大豆蛋白低聚肽，所得到的大豆蛋白低聚肽无苦味、异味，水解程度高，其几乎所有组分的分子量在6000Da以下，含有少量游离氨基酸。本发明得到的大豆蛋白低聚肽可以清除自由基、抗氧化；可以抑制癌细胞生长；可以抑制ACE的活性；还具有抗凝血的作用。

本发明所采用的以角蛋白酶为主的复合酶，能够高效、快速地水解大豆蛋白获得大豆蛋白多肽，并且所得产品无苦味、臭味，产品质量稳定，工艺简单，成本低，从而可有效地解决本领域所存在的问题。

定义

如本文所用，“大豆分离蛋白”是指利用脱皮脱脂冷榨豆饼或低温脱溶豆粕为原料，经稀碱萃取、酸沉淀、离心分离、喷雾干燥等工序加工而成的食用大豆蛋白产品，其蛋白质含量(干基)在90％以上，质量标准可参照食品工业用大豆蛋白的国家标准GB/T 20371-2006。

如本文所用，“大豆浓缩蛋白”是指以去杂脱脂后的冷榨大豆饼或低温脱溶豆粕为原料，除去其中的非蛋白质成分后，制得的蛋白质含量(干基)在65％以上的大豆蛋白产品，质量标准可参照食品工业用大豆蛋白的国家标准GB/T 20371-2006。

如本文所用，“大豆蛋白粉”是指采用脱皮大豆、脱脂豆饼豆粕、冷榨豆饼或低温脱溶豆粕为原料，经粉碎、灭酶脱腥等工艺生产所得的大豆蛋白产品，其蛋白质含量(干基)在50％以上，质量标准可参照食品工业用大豆蛋白的国家标准GB/T20371-2006。

如本文所用，“大豆粉”是指大豆进行了加热脱腥及干燥后，进行粉碎加工所得的大豆蛋白产品，其蛋白质含量(干基)在40％以上，质量要求如下：浅黄色，颗粒均匀，不结块，无任何异味；水≤20％，蛋白质≥40％。

如本文所用，“大豆饼粉”是指大豆经过压榨脱油后所得的残饼，再进行干燥粉碎后所得的大豆蛋白产品，其蛋白质含量(干基)在40％以上，质量要求如下：浅黄色至深黄色粉末，无虫蛀，无霉变；水≤15％，蛋白质≥40％。

如本文所用，“复合酶A”是指由下述成份构成的组合物，以复合酶A的干物的总重量计，其中角蛋白酶60-70w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，中性蛋白酶5-10w/w％，枯草杆菌蛋白酶1-5w/w％，地衣芽孢杆菌蛋白酶1-5w/w％，和菠萝蛋白酶0.5-5w/w％。

复合酶A中所用的角蛋白酶是地衣形芽孢杆菌L-25角蛋白酶及编码该角蛋白酶的DNA，对多种动物蛋白和植物蛋白均有很强的水解能力和很高的水解效率，在公开号为CN1361279A的中国专利申请中有详尽的描述，该专利中的有关内容并入本申请中。其余蛋白酶都可以从市售渠道获得。

如本文所用，“复合酶B”是指由下述成份构成的组合物，以复合酶B的干物的总重量计，其中木聚糖酶20-35w/w％，葡聚糖酶25-35w/w％，α-淀粉酶10-25w/w％，果胶酶10-20w/w％，甘露聚糖酶1-5w/w％，纤维素酶0.01-1.0w/w％，和酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％。

如本文所用，“复合酶C”是指由下述成份构成的组合物，以复合酶C的干物的总重量计，其中木聚糖酶15-30w/w％，葡聚糖酶20-30w/w％，α-淀粉酶20-35w/w％，果胶酶10-20w/w％，甘露聚糖酶1-5w/w％，纤维素酶0.01-1.0w/w％，酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％，和脂肪酶1-5w/w％。

如本文所用，术语“药学上可接受的”或“食品学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

大豆蛋白低聚肽

本发明提供一种大豆蛋白低聚肽，是大豆蛋白水解产物，以固体物质的总重量计，其中分子量在6000Da±100Da的组分占47％-54w/w％，分子量在300-1000Da的组分占35％-42w/w％。

本发明提供的大豆蛋白低聚肽还具有如下特征：

1)是一种乳白色-白色粉末，粗蛋白含量90-95w/w％，灰分2-3w/w％，水分3-5w/w％，糖及脂肪含量2-3w/w％，其氮溶指数NSI为98.5-99.9％，酸溶性蛋白含量99.5-99.9w/w％；

2)是一种多肽组合物，组合物中各组分的分子量均在6000Da以下，其中分子量在6000Da左右的占47％-54％，分子量在300-1000Da之间的占35％-42％，含有少量的游离氨基酸；

3)无异味，无苦味；

4)在所有pH下都能溶液水，溶液澄清，呈淡黄褐色-淡红褐色，显弱酸性；

5)对热很稳定，100℃煮沸无沉淀析出；

6)在室温下保存6个月含量无明显变化。

本发明提供的大豆蛋白低聚肽还具有以下功能：

1)具有强的抗氧化活性，对羟自由基和DPPH自由基的清除能力均显著高于维生素C；对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除率分别可达96％、32％和100％；

2)具有强的ACE抑制活性，活性抑制率可达87％，有降低血压的功效；

3)能够抗血小板聚集，抑制率可达63％，能有效防止血栓的形成；

4)能够显著的抑制癌细胞的生长，对肝癌细胞的抑制率可达56％，而对正常体细胞并无明显的影响；

5)有强的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性，在体内消化吸收后仍有很强的活性。

本发明提供的大豆蛋白低聚肽可以是液体或液体浓缩物。

制备方法

本发明提供一种大豆蛋白低聚肽的制备方法，它包括步骤：将原材料经过处理后加入复合酶A水解，水解产物经过微滤后，过D315和335树脂除盐、脱色，最终制成大豆蛋白低聚肽。

在本发明的一个优选实施方案中，以固形物的总重量计，复合酶A的加量按固形物含量的1-3w/w％加入。

在本发明的一个优选实施方案中，所采用的水解是在55℃-65℃，pH8-9条件下水解8-12小时；更佳地，然后在75-85℃保温30分钟。

本发明的另一优选实施例中，所述的制备大豆蛋白低聚肽的方法的原材料是大豆分离蛋白，包括以下步骤：

1)原材料预处理：按固液比1∶3-1∶9将大豆分离蛋白与水混合，然后将混合液磨碎成乳状液；

2)酶水解：将乳状液和复合酶A在pH8-9，55℃-65℃下混合8-12小时，按照固形物总量计，复合酶A的量为1％-3％(m/m)；更佳地，在水解8-12小时后，迅速升温至75℃-85℃，并保温30分钟；

3)分离：降低反应液的温度至15℃-20℃，调节pH至3.5-4.5，进行膜滤，除去不溶的固形物残渣，收集大豆蛋白低聚肽溶液。

本发明的另一优选实施例中，所述的制备大豆蛋白低聚肽的方法的原材料是大豆浓缩蛋白或大豆蛋白粉，包括以下步骤：

1)原材料预处理：按固液比1∶3-1∶9将大豆浓缩蛋白或大豆蛋白粉与水混合，然后将混合液磨碎成乳状液；

2)第一次酶水解：将乳状液和复合酶B在45℃-55℃下混合2-3小时，以去除淀粉、纤维素、以及葡聚糖等半纤维素多糖杂质；按照固形物总量计，复合酶B的量的0.3％-0.5％(m/m)；

3)过滤：降低反应液温度至20℃-25℃，压入板框过滤机进行过滤，并压水进板框洗涤滤渣1-2次；

4)第二次酶水解：将滤渣与水按固液比1∶2-1∶4混合，充分搅拌均匀后，调节pH至8-9之间，升温至55℃-65℃，按照固形物含量的1％-3％(m/m)加入复合蛋白酶，混合均匀后于此条件下水解8-12小时，然后迅速升温至75℃-85℃，并保温30分钟；

5)分离：降低反应液的温度至15℃-20℃，调节pH至3.5-4.5，进行膜滤，除去不溶的固形物残渣，收集大豆蛋白低聚肽溶液。

本发明的另一优选实施例中，所述的制备大豆蛋白低聚肽的方法的原材料是大豆粉或大豆饼粉，包括以下步骤：

1)原材料预处理：按固液比1∶3-1∶9将大豆粉或大豆饼粉和水混合，然后将混合液磨碎成乳状液；

2)第一次酶水解：将乳状液和复合酶C在45℃-55℃下混合2-3小时，以去除淀粉、纤维素、以及葡聚糖等半纤维素多糖杂质和油脂；按照固形物总量计，复合酶C的量的0.5％-1.0％(m/m)；

3)除脂：降低反应液温度至15℃-20℃，静置30-45分钟后，放出下层的混合液，去除浮于表面的油脂层；

4)过滤：将混合液压入板框过滤机进行过滤，并压水进板框洗涤滤渣1-2次；

5)第二次酶水解：将滤渣与水按固液比1∶2-1∶4混合，充分搅拌均匀后，调节pH至8-9之间，升温至55℃-65℃，按照固形物含量的1％-3％加入复合蛋白酶，混合均匀后于此条件下水解8-12小时，然后迅速升温至75℃-85℃，并保温30分钟；

6)分离：降低反应液的温度至15℃-20℃，调节pH至3.5-4.5，进行膜滤，除去不溶的固形物残渣，收集大豆蛋白低聚肽溶液。

更佳地，在上述各优选例的分离步骤得到大豆蛋白低聚肽溶液后还可以包括以下的一个或多个步骤：

纯化：用D315和335树脂除盐并脱色；

浓缩：用薄膜蒸发或真空浓缩对大豆蛋白低聚肽溶液进行浓缩，使固形物含量达到15％-20％；

干燥：浓缩液经冷冻干燥、喷雾干燥或真空烘干制成大豆蛋白低聚肽粉。

用途

本发明提供的大豆蛋白低聚肽可以用于清除自由基、抗氧化；用于食品保鲜；用于保湿；可以用于抗血小板聚集及预防和治疗血栓形成；还可以用于预防癌细胞形成或用于抑制癌细胞生长。

本发明提供的大豆蛋白低聚肽可以和食品学上或药学上可接受的载体混合得到保健食品、饮料、化妆品或药品。

所述的化妆品可以是发乳剂或面霜。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明从原料组成入手，开辟了大豆蛋白低聚肽制备的新工艺，实现了产品概念的内在本质和技术创新。

2、独特的复合蛋白酶有着特殊的酶切位点，水解产物均一、稳定、基本无疏水性末端暴露，从而在根本上消除了大豆蛋白低聚肽的苦味和臭味，避免了繁琐复杂的脱苦、除臭工艺，大大提高了产品的收率，降低了生产成本。

3、本发明以角蛋白酶为主的复合酶水解大豆蛋白生产大豆肽的方法，效率高、速度快，能够在短时间内彻底地水解大豆蛋白，工艺简单，并且有很高的原料利用率和多肽产出率。

4、所制备的大豆蛋白低聚肽其溶解性和粘度不受pH和温度的影响，乳化性、保湿性、发泡性好，分子量在均300-6000Da之间，基本无游离氨基酸产生，吸收速度快，效率高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

苦味和臭味的检测可以直观地通过味觉和嗅觉进行评判，苦味也可以用不同浓度的喹啉做标准，进行简单的分级评判。一般情况下，取一种带有苦味或臭味的标准样品，将其按照不同浓度依次划分为不同的苦味或臭味级别，然后再用样品与之比较，从而对样品进行分级评判。比如将喹啉配置成不同的浓度，然后通过味觉将其划分为不苦、微苦、稍苦、苦、很苦等，然后再去感觉样品的苦味程度，并与标准对照，从而确定其苦味的程度。

实验条件：

1.材料

大豆分离蛋白、大豆浓度蛋白、大豆蛋白粉、大豆粉和大豆饼粉均由福建福兴医药有限公司提供；胃蛋白酶(1∶3000)，胰蛋白酶(1∶250)，购自上海生工；实验细胞株293FT购自Invitrogen公司，HepG2购自ATCC公司；DMEM培养基，Glutamine，细胞培养用非必需氨基酸均购自Invitrogen公司；细胞培养用胎牛血清购自HyClone公司。

2.试剂

实验所用试剂均为市售的分析纯试剂。

3.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：程瑾瑞等，中国食品工业标准汇编(第二版)；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验[M]；D.L斯佩克特等，细胞实验指南(上、下)。

在本专利的以下实施例中，所提及的大豆蛋白低聚肽、大豆肽或大豆多肽均是指按照本专利的方法所制备的同一种大豆蛋白水解产物。

在本专利的以下实施例中，所提及的IC₅₀均是指抑制率为50％时，反应液中抑制物的浓度。

实施例1

复合酶A对大豆蛋白的水解

在45-85w/w％范围内，逐渐依次调整复合酶A中角蛋白酶的百分比浓度，然后按照实施例2(1)中所述的步骤1)至步骤2)，或实施例2(2)中所述的步骤1)至步骤4)，或实施例2(3)中所述的步骤1)至步骤5)实施复合酶A对大豆蛋白的水解(复合酶A的量按照原料量的2w/w％加入)，水解结束后，取酶解液5ml12000rpm离心5分钟，取上清液用Folin-酚法测定可溶性蛋白含量，并按照下式计算水解度DH：

$\mathrm{DH}(\%)=\frac{(N_2-N_1)\×V}{N_0}\×100$

式中：N₂——酶解反应后酶解液的可溶性蛋白含量，mg/mL；

N₁——酶解反应前溶液的可溶性蛋白含量，mg/mL；

N₀——参加酶解反应的大豆蛋白的总蛋白量(原料的粗蛋白含量×原料的加入量，原料的粗蛋白含量按照凯氏定氮法进行测定)，mg；

V——酶解反应液体积，mL。

再取2ml以上所得酶解液离心后上清，与2ml20％TCA混合，振荡均匀，静置5分钟后，10000rpm离心10min，取上清液，用Folin-酚法测定可溶性蛋白含量，即为酶解液中酸溶性蛋白含量，酸溶性蛋白的百分比含量按照下式计算：

酸溶性蛋白百分比含量％＝Ns/N×100

式中：Ns——酶解液中酸溶性蛋白含量，mg/ml；

N——酶解液中可溶性蛋白含量，mg/ml。

在1-3w/w％(复合酶A的量相对于原料量的百分比数)的范围内，逐渐依次改变复合酶A的添加量，然后按照实施例2(1)中所述的步骤1)至步骤2)，或实施例2(2)中所述的步骤1)至步骤4)，或实施例2(3)中所述的步骤1)至步骤5)实施复合酶A对大豆蛋白的水解(复合酶A中角蛋白酶的含量为65％)，水解结束后，按照以上同样的方法分别测定酶解液的水解度和酸溶性蛋白的百分比含量。

以上所得结果如图1和图2所示。从图1中可以看出，角蛋白酶对大豆蛋白有很强的水解能力，复合酶A中角蛋白酶含量在60-70％范围内时，酶解液的水解度及酸溶性蛋白的百分比含量均可达到100％。当复合酶A中角蛋白酶的含量低于60％后，酶解液中酸溶性蛋白的含量迅速减少，角蛋白酶含量为45％时，酸溶性蛋白含量降低至60％左右，这说明角蛋白酶对大豆蛋白多肽的产生有至关重要的作用。从图2中可以看出，在1-3％复合酶A添加量的范围内，均能够快速、有效、彻底的水解大豆蛋白产生大豆蛋白低聚肽。

实施例2

大豆蛋白低聚肽的制备

(1)以大豆分离蛋白为原料

以大豆分离蛋白为原料，制备大豆蛋白低聚肽按照以下步骤进行，工艺流程如图3所示。

1)原材料预处理：按固液比1∶3-1∶9将大豆分离蛋白与水混合(m/v)，调节pH至5-6之间，升温至30℃-40℃，并在此条件下保温30分钟，然后将混合液通过胶体磨磨碎成乳状液；

2)酶水解：将乳状液加入到反应罐中，调节pH至8-9，升温至55℃-65℃，按照固形物含量的1％-3％加入复合酶A(m/m)，混合均匀后于此条件下水解8-12小时，然后迅速升温至75℃-85℃，并保温30分钟；

3)分离：降低反应液的温度至15℃-20℃，调节pH至3.5-4.5，并静置30分钟，然后进行膜滤，除去不溶的固形物残渣，收集大豆低聚肽溶液；

4)纯化：用D315和335树脂对大豆低聚肽进行纯化，除盐并脱色；

5)浓缩：用薄膜蒸发或真空浓缩对大豆低聚肽溶液进行浓缩，使固形物含量达到15％-20％；

6)干燥：浓缩液经冷冻干燥、喷雾干燥或真空烘干制成大豆蛋白低聚肽粉。

(2)以大豆浓缩蛋白或大豆蛋白粉为原料制备大豆蛋白低聚肽

以大豆浓缩蛋白或大豆蛋白粉为原料，制备大豆蛋白低聚肽按照以下步骤进行，工艺流程如图3所示。

1)原材料预处理：按固液比1∶3-1∶9将大豆浓缩蛋白或大豆蛋白粉与水混合(m/v)，调节pH至4-6之间，升温至30℃-40℃，并在此条件下保温30min，然后将混合液通过胶体磨磨碎成乳状液；

2)第一次酶水解：将乳状液加入到反应罐中，升温至45℃-55℃，按照固形物含量的0.3％-0.5％加入复合酶B(m/m)，混合均匀后于此条件下水解2-3小时；

3)过滤：降低反应液温度至20℃-25℃，压入板框过滤机进行过滤，并压水进板框洗涤滤渣1-2次；

4)第二次酶水解：将滤渣与水按固液比1∶2-1∶4混合(m/v)，充分搅拌均匀后，调节pH至8-9之间，升温至55℃-65℃，按照固形物含量的1％-3％加入复合酶A(m/m)，混合均匀后于此条件下水解8-12小时，然后迅速升温至75℃-85℃，并保温30分钟；

5)分离：降低反应液的温度至15℃-20℃，调节pH至3.5-4.5，并静置30分钟，然后进行膜滤，除去不溶的固形物残渣，收集大豆低聚肽溶液；

6)纯化：用D315和335树脂对大豆低聚肽进行纯化，除盐并脱色；

7)浓缩：用薄膜蒸发或真空浓缩对大豆低聚肽溶液进行浓缩，使固形物含量达到15％-20％；

8)干燥：浓缩液经冷冻干燥、喷雾干燥或真空烘干制成大豆蛋白低聚肽粉。

(3)以大豆粉或大豆饼粉为原料制备大豆蛋白低聚肽

以大豆粉或大豆饼粉为原料，制备大豆蛋白低聚肽按照以下步骤进行，工艺流程如图3所示。

1)原材料预处理：按固液比1∶3-1∶9将大豆粉或大豆饼粉与水混合(m/v)，调节pH至5-6之间，升温至30℃-40℃，并在此条件下保温30min，然后将混合液通过胶体磨磨碎成乳状液；

2)第一次酶水解：将乳状液加入到反应罐中，升温至45℃-55℃，按照固形物含量的0.5％-1.0％加入复合酶C(m/m)，混合均匀后于此条件下水解2-3小时；

3)除脂：降低反应液温度至15℃-20℃，静置30-45分钟后，放出下层的混合液，去除浮于表面的油脂层；

4)过滤：将混合液压入板框过滤机进行过滤，并压水进板框洗涤滤渣1-2次；

5)第二次酶水解：将滤渣与水按固液比1∶2-1∶4混合(m/v)，充分搅拌均匀后，调节pH至8-9之间，升温至55℃-65℃，按照固形物含量的1％-3％加入复合酶A(m/m)，混合均匀后于此条件下水解8-12小时，然后迅速升温至75℃-85℃，并保温30分钟；

6)分离：降低反应液的温度至15℃-20℃，调节pH至3.5-4.5，并静置30分钟，然后进行膜滤，除去不溶的固形物残渣，收集大豆低聚肽溶液；

7)纯化：用D315和335树脂对大豆低聚肽进行纯化，除盐并脱色；

8)浓缩：用薄膜蒸发或真空浓缩对大豆低聚肽溶液进行浓缩，使固形物含量达到15％-20％；

9)干燥：浓缩液经冷冻干燥、喷雾干燥或真空烘干制成大豆蛋白低聚肽粉。

通过以上方法获得的产品，经苦味和臭味检测，无苦味、无臭味。

用反相高压液相色谱法分析所制备大豆蛋白肽的氨基酸组成，结果如表1所示。

表1氨基酸组成分析结果

编号	氨基酸	含量(％)	编号	氨基酸	含量(％)
						1	Asp	11.388	10	Cys	1.164
2	Ser	4.532	11	Tyr	3.464
						3	Glu	19.368	12	Val	4.084
4	Gly	3.828	13	Met	0.866
						5	His	2.056	14	Lys	5.824

编号	氨基酸	含量(％)	编号	氨基酸	含量(％)
						6	Arg	6.032	15	Ile	4.362
7	Thr	3.392	16	Leu	6.802
						8	Ala	4.528	17	Phe	5.136
9	Pro	5.142

通过对大豆肽粉的氨基酸组成分析(表1)，可以看出，大豆肽各氨基酸组成平衡，除蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸含量较少外，其余的均在3％以上。天冬氨酸和谷氨酸含量较高，分别为11.3％和19.4％。大豆肽含有人体必需的8种氨基酸齐全，含量也较高，是一种较为理想的人体蛋白质补充源，特别是亮氨酸和精氨酸含量达到6％。由此可见，大豆肽营养成分均衡，具有开发成为保健食品的独特优势。

对所制备的大豆蛋白低聚肽粉的各项指标进行测定，结果如表2所示，从表2可以看出，大豆肽蛋白质含量在90％以上，酸溶性蛋白含量占总蛋白含量的99％以上，游离氨基酸含量小于5％，分子量多在6000Da以下，灰分低于3％，很适合开发成为保健食品。

表2大豆蛋白低聚肽分析表

项目名称	指标
		蛋白质含量(干基，％)	90.9-95.4％
酸溶性蛋白含量(干基，％)	99.6-99.9％
		游离氨基酸含量	2.48-2.97
分子量大小	＜6kDa
		灰分(％)	2-3％

实施例3

大豆蛋白低聚肽分子量分布的测定

采用凝胶过滤色谱法分析大豆蛋白低聚肽的分子量分布。凝胶过滤色谱根据分子量大小对混合物组分进行分离，根据各组分的保留体积，对照标准谱图，可计算出被测样品中各组分的分子量大小。

以标准谱图中各标准蛋白的保留体积为横坐标，以各标准蛋白分子量的对数为纵坐标，绘制标准曲线，求得解析式1gY＝-0.1877X+6.0231，式中Y为组分的分子量(Da)，X为组分的保留体积。

取2ml大豆蛋白低聚肽溶液(实施例2所制备)25℃，10000rpm离心10min，上清液用0.2um的微滤膜过滤后，取100ul进行HPLC分析。色谱条件为：0.05M磷酸盐缓冲液，0.15M NaCl，pH7.0；0.5ml/min，25℃；紫外检测器，220nm；上样100ul；Superdex^TMPeptide 10/300GL色谱柱。

所得色谱图如图4所示，根据谱图中各组分的保留体积计算出各组分的分子量，根据谱图中各组分的峰面积计算出各组分的百分比含量，结果如表3所示。

表3大豆肽中各组分的分子量及百分比含量

分子量(Da)	百分比含量(％)
		6000	53.19
1000	24.72
		300-1000	12.70
≤300	5.40

从图4和表3可以看出在大豆蛋白水解产物中多肽和氨基酸的比例占绝大部分，多肽分子量大多数在6.0kDa以下，其中8号峰为氨基酸，其峰面积占总峰面积的3.374％；2号至7号峰为多肽，多肽的峰面积占总峰面积的95.75％.多肽与氨基酸占到总峰面积的95％以上，这说明大豆蛋白经过角蛋白酶的酶解成为多种可溶的多肽与氨基酸，大分子量的蛋白已不存在。

实施例4

大豆蛋白低聚肽的抗氧化活性

1)大豆蛋白低聚肽对羟基自由基(·OH)的清除作用

参考Fenton反应体系模型，利用H₂O₂与Fe²⁺混合产生·OH，但由于·OH具有很高的反应活性，存活时间短，若在体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉·OH，并产生有色产物。该产物在波长510nm处有强吸收，若在反应体系中加入具有清除·OH功能的被测物，便会与水杨酸竞争·OH，而使有色产物生成量减少。采用固定反应时间法，因此，可以用来评价样品对·OH的清除效果(Sabu MC，Smitha K，et al.Anti-diabetic activity of green tea polyphenols and their role in reduceing oxidative stress in experimental diabetes[J].J.Ethnopharmacol，2002，83：109-116.)。

在试管中依次加0.5ml 9mM水杨酸-乙醇溶液，0.5ml的不同浓度的大豆肽样品溶液(在1-18mg/ml浓度范围内，所用大豆蛋白肽为实施例2所制备)，0.5ml 9mMFe²⁺溶液(现配)，3.5ml蒸馏水，最后加入5ml 8.8mM H₂O₂启动Fenton反应，摇匀后于510nm处测定吸光度A₁；取0.5ml的蒸馏水代替9mM Fe²⁺溶液所测得的吸光度为A₂；取0.5ml蒸馏水代替样品所测得的吸光度为A₃。羟基自由基的清除率P(％)可按照式(1)进行计算，所得结果如图5所示。

$P(\%)=\frac{A_3-(A_1-A_2)}{A_3}\×100$ 式(1)

式中：P—清除率，％；

A₁——样品溶液反应后的吸光值；

A₂——取0.5ml的蒸馏水代替9mM Fe²⁺溶液后的吸光值；

A₃——取0.5ml蒸馏水代替样品的吸光值。

从图5可以看出，大豆肽对羟基自由基有很好清除效果，当大豆肽浓度为11mg/mL时，其对羟基自由基的清除率可达到96％。在0-10mg/mL浓度范围内，大豆肽对·OH自由基的清除率随着浓度的升高而迅速增大，大豆肽对羟基自由基的IC₅₀为4mg/mL。

文献对大豆肽清除羟基自由基作用的报道很多，研究表明，大豆分离蛋白经中性蛋白酶Asl.398酶解，得到的酶解物具有较强的抗氧化活性，在浓度0.1-250mg/mL范围内对羟自由基都有明显的清除作用，且在上述浓度下无促氧化作用(荣建华，李小定，谢笔钧.大豆肽抗氧化效果的研究[J].食品科学，2002，23(11)：118-120.)。本专利所制备的大豆肽，在0.1-10mg/ml的浓度范围内对羟基自由基就有很好的清除效果，比其他同类的大豆肽产品具有更强的活性。

2)大豆蛋白低聚肽对超氧阴离子自由基(O₂ ^-·)的清除作用

邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基加速自氧化，同时生成有色中间产物。中间产物的积累在滞后40s到45s时与时间成良好线性关系，有色产物在420nm处有强烈光吸收，从而可用于评价受试物清除超氧阴离子自由基的能力(邹国林等.一种SOD的测活方法——邻苯三酚自氧化法的改进[J].生物化学与生物物理进展，1986，4：71-73)。

取4.5ml pH 8.3的10mM PBS缓冲液与100μl不同浓度的大豆肽样品溶液(在2-20mg/ml浓度范围内，所用大豆蛋白肽为实施例2所制备)混合，于25℃恒温15min，取混合液3ml加入45mM的邻苯三酚(用10mM HCl溶液配制)100μl，摇匀，反应3min，在波长420nm测定吸光值A₁。超氧阴离子自由基的清除率P(％)可按照式(2)进行计算，所得结果如图6所示。

$P(\%)=\frac{A_3-(A_1-A_2)}{A_3}\×100$ 式(2)

式中：P—清除率，％；

A₁——样品溶液反应后的吸光值；

A₂——4.5ml PBS溶液+100μl HCl(10mM)+100μl蒸馏水的吸光值；

A₃——4.5ml PBS溶液+100μl邻苯三酚溶液+100μl蒸馏水的吸光值。

从图6可以看出，大豆肽对超氧阴离子自由基也具有较好的清除效果，当大豆肽浓度为6mg/mL时，其对超氧阴离子自由基的清除率可达到29％，在0-6.0mg/mL浓度范围内，大豆肽对超氧阴离子自由基的清除率随着浓度的升高而迅速增大，其对超氧阴离子自由基的最大清除率可达到32％。1999年，张学忠等发现在反应体系中添加40mg/mL大豆多肽，邻苯三酚自氧化速率被抑制27％(张学忠，王寰宇，陈松明，等.大豆功能短肽的制备及其生理活性研究「A 」.李荣和.大豆新加工技术原理与应用「M 」.北京：科学技术文献出版社，1999.181-227.)，而本专利所制备的大豆肽其对邻苯三酚的自养化速率最大抑制率达到32％，在低浓度下就能起作用，并且在2-8mg/ml的浓度范围内对超氧阴离子自由基就有很好的清除效果，因此具有更好的抗氧化性。

3)大豆蛋白低聚肽对DPPH自由基的清除作用

DPPH(1，1-二苯-2-苦肼基)是一种稳定的自由基。其乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为517nm。当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此，可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力。其能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化能力越强(陆冬莲等.太白山区23种中药抗氧化活性的研究[J].天然产物研究与开发，2001，13：20-22.)。

配制浓度为1×10^-4mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。称取适量的大豆蛋白肽样品(所用大豆蛋白低聚肽为实施例2所制备)，并用95％乙醇配置成不同浓度的溶液(在1-11mg/ml的浓度范围内)。在517nm处，按照如下计算公式(3)中的方法加样测定，室温下反应30min，每样重复3次，取平均值，并计算自由基清除率P，所得结果如图7所示。

$P(\%)=\frac{A_3-(A_1-A_2)}{A_3}\×100$ 式(3)

式中：P—清除率，％；

A₁——2ml DPPH溶液+2ml样品溶液的吸光值；

A₂——2ml待测溶液+2ml乙醇的吸光值；

A₃——2ml DPPH溶液+2ml乙醇的吸光值。

图7反映了大豆蛋白低聚肽清除DPPH自由基效果，可以看出，大豆蛋白低聚肽对DPPH自由基有着较强的清除效果，在1-5mg/mL浓度范围内，其对DPPH自由基清除率随着含量的增大而迅速增大，清除率最高可达到100％，大豆蛋白低聚肽对清除DPPH自由基的IC₅₀为3mg/mL。

很多研究报道了其他具有抗氧化活性物质对DPPH自由基的清除作用，但是关于大豆肽对DPPH自由基的清除作用的报道较少，本专利所制备的大豆肽对DPPH自由基亦有很强的清除作用，进一步说明本专利的大豆肽较其他同类产品有更好的功能和更强的活性。

在相同的浓度和条件下，分别比较本专利所制备的大豆蛋白低聚肽与Vc清除DPPH、·OH和O₂ ^-三种自由基的能力，结果见表4所示。

表4大豆肽与Vc抗氧化活性的比较

注：大豆肽浓度及Vc浓度均为10mg/mL，Vc对三种自由基清除能力的测定均按照本实施例所描述的方法进行。

由表4可以看出，在相同的条件下大豆肽对三种自由基的清除能力均显著高于Vc，这说明本专利的大豆肽具有很好的抗氧化活性。

实施例5

大豆蛋白低聚肽的AGE抑制活性

三肽马尿酰-组氨酰-亮氨酸(N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate，简称HHL)在血管紧张素转化酶(ACE)的催化下快速地分解产生马尿酸和二肽His-Leu(简称HL)。当加入对ACE有抑制作用的样品时，ACE的活性受到抑制，马尿酸和二肽的生成量减少，因此可通过HPLC测定马尿酸的生成量来评价ACEI对ACE活性的抑制率(张蓉真等.福建老酒中血管紧张素转换酶抑制物质的分离鉴定.福州大学学报(自然科学版).1996，24(6))。

ACE活性测定根据经Raoetal改进过的Cushman法。先将2.5μL的ACE酶加人5μL待测大豆肽样品中(用5μL 0.2mol/L的NaCl代替样品作为空白对照，所用大豆肽样品为实施例2所制备)，在37℃下保温3min后，加人25μL三肽(Hip-His-Leu)反应液(2.5mmol/LHip-His-Leu)，在37℃下保温1h后，加人42.5μL的0.1N的HCl溶液终止反应。

取上述终止反应后的反应混合液10uL，上样高效液相凝胶过滤色谱，对反应产物马尿酸(Hip)进行定量，结果如图8所示，图中，峰1为ACE酶，峰2为三肽HHL，峰3为组分马尿酸，峰4为二肽HL。

ACE抑制率直接从加人待测大豆肽样品的混合反应液的马尿酸的峰高或面积B与以分离用的洗脱缓冲液为对照的混合反应液的马尿酸的峰高或面积A按下式计算出，即：

抑制率％＝(A-B)/A×100

色谱条件为：0.05M磷酸盐缓冲液，0.15M NaCl，pH7.0；0.4ml/min，25℃；紫外检测器，280nm；上样10ul；Toyopearl HW40S色谱柱。

分别测定不同浓度的大豆蛋白低聚肽对ACE活性的抑制作用，结果如图9所示。从图中可以看出，大豆肽对ACE活性具有很强的抑制作用，抑制率随着浓度的增大而增大，当大豆肽浓度为18mg/mL时，抑制率可达到86.7％。

实施例6

大豆蛋白低聚肽的抗血小板聚集活性

在二磷酸腺苷(ADP)诱导剂作用下，血小板膜上糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)、纤维蛋白原、钙离子。在未被激活的血小板，其GPⅡb和GPⅢa彼此分开分布于血小板膜表面，诱导剂作用后，两种糖蛋白相互作用形成复合物成为纤维蛋白原的受体，纤维蛋白原结合在活化血小板上，在Ca²⁺参与下实现聚集反应。因此，可以通过检测加入样品对ADP诱导的血小板聚集反应的结果与未加入样品的空白作对照，测定样品对血小板聚集的抑制活性。

取新鲜兔血9ml，与1ml 3.8％柠檬酸钠混合(m/v)，室温下500rpm离心10min，血浆约占总血1/4，取上层血浆，即为富血小板血浆(PRP)，下层红细胞3000r/min离心10min，上清液为贫血小板血浆(PPP)。血小板聚集实验在LBY-NJ的血小板聚集仪上进行。以PPP调PRP使透光度在30左右(血小板数在2×10⁹ml)。分别取200μl调过的PRP与40μl不同浓度的大豆蛋白低聚肽(10mg/ml-50mg/ml，所用大豆蛋白低聚肽为实施例2所制备)或生理盐水于比浊管中37℃下孵育至少5min，在电磁搅拌下分别加入致聚剂ADP 10μl(300μmol/L)诱导血小板聚集，观察样品对血小板聚集的影响，比较空白PRP与样品PRP在3min内最大聚集程度，计算聚集百分率和试样抑制聚集百分率，计算公式如下：

分别测定不同大豆肽浓度对ADP诱导的血小板聚集抑制率，结果如图10所示，

从图中可以看出，大豆蛋白低聚肽对ADP诱导的血小板聚集反应有很强的抑制作用，随着肽浓度的升高，其对ADP诱导的血小板聚集抑制率逐渐提高，当浓度达到50mg/mL时，其对ADP诱导的血小板聚集反应抑制率可达到63.4％。其IC₅₀为27mg/mL。Kyung-Ae Lee，Seung-Ho Kim 2005年从大豆蛋白水解物中分离得到两个具有抑制ADP诱导的血小板聚集反应作用的活性肽SSGE和DEE，其IC₅₀分别为480μM和460μM，对ADP诱导的血小板聚集反应的最大抑制率为70％(Kyung-Ae Lee，Seung-Ho Kim.SSGEand DEE，new pep“des isolated from a soy proteinhydrolysate that inhibit platelet aggregation.Food Chemistry.2005(90)：389-393.)。由此可知，本专利所制备的大豆肽具有相当高的血小板聚集反应抑制率水平，对于预防和治疗心血管疾病具有重要意义。

实施例7

大豆蛋白低聚肽的抑制癌细胞生长活性

HepG2细胞来自Invitrogen，培养条件为10％FBS(Hyclone)DMEM，100ug/ml青霉素，100ug/ml链霉素，37℃5％CO2培养箱培养。

293FT细胞来自ATCC，培养条件为10％FBS(Hyclone)DMEM，100ug/ml青霉素，100ug/ml链霉素，2mM L-谷胺酰氨，1％(V/V)非必需氨基酸，37℃5％CO2培养箱培养。

100ml细胞培养瓶中的细胞生长达到95％汇合率后，胰酶消化细胞，细胞悬浮液中取5ul与等体积台盼兰混合染色计数，适当稀释后铺96孔板，2.0×10⁴个/孔，培养12h后换液，并添加大豆蛋白低聚肽(所用大豆蛋白低聚肽为实施例2所制备)。培养24h后拍照，消化细胞，台盼兰染色计数。

图11显示了大豆蛋白低聚肽对正常细胞(人胚胎肾上皮细胞变种293FT)及肝癌细胞(HepG2)生长的影响：从图11a、11b的比较可以看出，大豆蛋白低聚肽对正常细胞293FT无明显的影响，添加大豆肽与不添加大豆肽的细胞培养后，细胞数未发生明显变化，细胞形态也无变化。从图11c、11d的比较可以看出，大豆蛋白低聚肽对肝癌细胞生长有明显的抑制作用，加入大豆肽细胞培养后，不仅细胞数大量减少，细胞形态也发生较大变化。可见大豆肽在体外细胞实验中，显示了良好的抑制肝癌细胞活性。

表5显示了添加不同大豆蛋白低聚肽浓度对正常细胞(人胚胎肾上皮细胞变种293FT)及肝癌细胞(HepG2)生长的影响。由表可知，大豆肽对人肾上皮细胞变种生长无明显的影响，而对人肝癌细胞(HepG2)显示了良好的抑制活性，当大豆肽浓度达到10μg/mL时，其对肝癌细胞的抑制率为15％，当大豆肽浓度达到10mg/mL时，其对肝癌细胞的抑制率可高达56.30％。

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤，源于细胞生长、分化与凋亡之间的调控失衡，以及环境与机体的相互作用。目前肝癌的治疗多采用化疗药物通过不同机制作用于肝癌细胞，但其疗效不佳，相互之间可产生交叉耐药性，毒副作用大。复合角蛋白酶水解大豆蛋白所产生的大豆肽具有良好的癌细胞抑制效果，且随着浓度的增大而抑制逐渐增大，而对正常细胞并无明显影响，有望从中分离出具有抗癌效果的药物，应用于临床治疗恶性肿瘤。

表5大豆蛋白低聚肽体外细胞实验结果

可溶性蛋白含量(mg/mL)	对人肾上皮细胞生长促进率(％)	对肝癌细胞生长抑制率(％)
			10-4	-0.09	0.00
10-3	-0.08	0.83
			10-2	0.00	15.00
10-1	0.02	35.00
			100	-0.04	35.83
101	0.02	56.30

实施例8

大豆蛋白低聚肽对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性

本实验采用体外模拟消化来考察大豆蛋白低聚肽对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性。

(1)胃蛋白酶体外消化

于25ml具塞试管中，加入50mg大豆蛋白低聚肽(所用大豆肽为实施例2所制备)，5ml蒸馏水，溶解后用盐酸调pH至2.5，然后按照2000U/g大豆肽的比例加入胃蛋白酶，置于37℃水浴中3小时，反应结束后加入2ml 20％TCA终止反应，将反应液于10000rpm，25℃下离心5min，取上清100ul进行HPLC分析(按实施例3中所叙的方法进行，采用Toyopearl HW-40s凝胶柱)。

(2)胰蛋白酶体外消化

于25ml具塞试管中，加入50mg大豆蛋白低聚肽(所用大豆肽为实施例2所制备)，5ml蒸馏水，溶解后用盐酸调pH至8.0，然后按照2000U/g大豆肽的比例加入胰蛋白酶，置于37℃水浴中3小时，反应结束后加入2ml 20％TCA终止反应，将反应液于10000rpm，25℃下离心5min，取上清100ul进行HPLC分析(按实施例3中所叙的方法进行，采用Toyopearl HW-40s凝胶柱)。

以未经胃蛋白酶、胰蛋白酶消化的大豆肽为对照，比较消化前、后大豆肽分子量分布的变化，结果如图12所示。从图中可以看出，大豆肽体外消化前、后峰型没有大的变化，保留时间在20min前的峰为大分子蛋白，这些小峰消化后几乎都被降解，40min后的峰为氨基酸，峰面积大大提高，保留时间为20-40min的多肽峰基本没有变化，但峰面积略有提高。这说明大豆肽经胃蛋白酶、胰蛋白酶作用后，剩余的大分子蛋白继续分解为多肽与氨基酸。多肽部分的峰型不变说明其主要组分没有降解。

将所得胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后的大豆肽样品，按照实施例4中所叙述的方法分析其对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的去除率，并与消化前的样品进行比较，结果如表6所示。

表6大豆肽体外消化前后抗氧化活性的比较

注：大豆肽样品浓度为10mg/ml

由表6可以看出，大豆肽经胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后，其对DPPH、·OH及超氧阴离子三种自由基的清除能力不但没有降低，反而略有提高，结合大豆肽体外消化的分子量分布(图12)可知，大豆肽经过胃蛋白酶、胰蛋白酶体外消化后不仅原有的抗氧化活性肽不会被降解，还会有少量的抗氧化活性肽产生。由此可知，本专利所制备的大豆肽经生物体吸收利用后，其抗氧化活性不会丧失，而且还有所提高，是一种很好的生物保健肽。

将所得胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后的大豆肽样品，按照实施例5中所叙述的方法分析其对ACE活性的抑制率，并与消化前的样品进行比较，结果如表7所示。

表7大豆肽体外消化前后ACE抑制活性的比较

	未消化	胃蛋白酶消化	胰蛋白酶消化
				ACE活性抑制率(％)	86.1	85.9	84.7

注：大豆肽样品浓度为18mg/ml

由表7可以看出，大豆肽分别经过胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，其对ACE活性的抑制效果无明显的变化，这进一步说明本专利的大豆肽在体内消化吸收后，仍保持很高的生物活性，具有很强的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (10)

1.一种大豆蛋白低聚肽，其特征在于，以大豆蛋白低聚肽总重量计，粗蛋白含量90％-95％，灰分2％-3％，水分3％-5％，糖及脂肪含量2％-3％，其氮溶指数NSI为98.5％-99.9％，酸溶性蛋白含量99.5％-99.9％。

2.如权利要求1所述的大豆蛋白低聚肽，其特征在于，以大豆蛋白低聚肽总重量计，分子量在6000Da±100Da的组分占47％-54w/w％，分子量在300-1000Da的组分占35％-42w/w％。

3.如权利要求1所述的大豆蛋白低聚肽，其特征在于，所述大豆蛋白低聚肽在所有pH下都能溶液水，溶液澄清，呈淡黄褐色-淡红褐色，显弱酸性；所述大豆蛋白低聚肽无异味，无苦味；对热很稳定，100℃煮沸无沉淀析出；室温下保存6个月含量无明显变化。

4.如权利要求1所述的大豆蛋白低聚肽，其特征在于，所述的大豆蛋白低聚肽通过下述步骤制备得到：

(1)将原材料和复合酶A在pH8-9，55-65℃混合8-12小时，得到大豆蛋白低聚肽；以固形物的总重量计，复合酶A的量为1-3w/w％；所述的原材料选自：大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、大豆蛋白粉、大豆粉、或大豆饼粉；所述的复合酶A由下述成份构成：以复合酶A的干物的总重量计，角蛋白酶60-70w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，中性蛋白酶5-10w/w％，枯草杆菌蛋白酶1-5w/w％，地衣芽孢杆菌蛋白酶1-5w/w％，菠萝蛋白酶0.5-5w/w％。

5.一种如权利要求1-4任一所述的大豆蛋白低聚肽的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)将原材料和复合酶A在pH8-9，55-65℃混合8-12小时，得到大豆蛋白低聚肽；以固形物的总重量计，复合酶A的量为1-3w/w％；所述的原材料选自：大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、大豆蛋白粉、大豆粉、或大豆饼粉；所述的复合酶A由下述成份构成：以复合酶A的干物的总重量计，角蛋白酶60-70w/w％，木瓜蛋白酶10-15w/w％，胰蛋白酶5-10w/w％，中性蛋白酶5-10w/w％，枯草杆菌蛋白酶1-5w/w％，地衣芽孢杆菌蛋白酶1-5w/w％，菠萝蛋白酶0.5-5w/w％。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)为：将原材料和复合酶A在pH8-9，55-65℃混合8-12小时后，在75-85℃保温30分钟。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)前，所述原材料经过以下步骤处理：

(a)将原材料和水按固液比1∶3-1∶9混合、研磨成乳状液。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述原材料经过以下步骤处理：

(a′)将大豆浓缩蛋白或大豆蛋白粉和水按固液比1∶3-1∶9混合、研磨成乳状液；和

(b′)将步骤(a′)得到的乳状液和复合酶B在45-55℃混合、过滤，得到经过处理的大豆浓缩蛋白或大豆蛋白粉；以固形物的总重量计，复合酶B的量为0.3-0.5w/w％；所述的复合酶B由下述成份构成：以复合酶B的干物的总重量计，木聚糖酶20-35w/w％，葡聚糖酶25-35w/w％，α-淀粉酶10-25w/w％，果胶酶10-20w/w％，甘露聚糖酶1-5w/w％，纤维素酶0.01-1.0w/w％，酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％。

9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述原材料经过以下步骤处理：

(a″)将大豆粉或大豆饼粉和水按固液比1∶3-1∶9混合、研磨成乳状液；和

(b″)将步骤(a″)得到的乳状液和复合酶C在45-55℃混合、过滤，得到经过处理的大豆粉或大豆饼粉；以固形物的总重量计，复合酶C的量为0.5-1.0w/w％；所述的复合酶C由下述成份构成：以复合酶C的干物的总重量计，木聚糖酶15-30w/w％，葡聚糖酶20-30w/w％，α-淀粉酶20-35w/w％，果胶酶10-20w/w％，甘露聚糖酶1-5w/w％，纤维素酶0.01-1.0w/w％，酸性蛋白酶0.02-0.05w/w％，脂肪酶1-5w/w％。

10.一种如权利要求1-4任一所述的大豆蛋白低聚肽的用途，其特征在于，所述的大豆蛋白低聚肽用于制备清除自由基、抗氧化的组合物；或用于制备血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂；或用于制备抑制血栓形成的组合物；或用于制备预防或抑制癌细胞生长的组合物。

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