CN104987429A - 一种牛樟芝化合物组分分离提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛樟芝化合物组分分离提取方法,以牛樟芝子实体粉或菌丝体为原料,采用酶解、超临界CO2萃取、离子交换色谱、膜分离超滤和层析法纯化相结合的技术实现牛樟芝化合物组分的分离提取。本发明具有有效活性组分分离效果好,纯化纯度高,成分不易被分解破坏、无有害化学试剂和重金属残留、提取效率高等优点,可以同时脱除多糖液中的盐分和水,实现对多糖和三萜类化合物稀溶液的纯化和分离,作为新原料、中间体应用于功能食品、保健食品、药品、化妆品等产业的研究开发。本发明具有很高的工业应用价值,是一项既环保、经济又可工业化生产的现代生物医药活性物质的制备技术。
Description
技术领域
本发明属于食(药)用菌活性组分分离提取技术领域,具体涉及一种牛樟芝化合物组分分离提取方法。
背景技术
牛樟芝又名牛樟菇,属于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌属、多年生蕈菌类,拉丁名为Antrodia camphorata,是1990年才被生化界发表的新种。其生长区域为台湾山区海拔 450-2000米山林间,只生长在台湾特有百年以上的牛樟树树干腐朽之心材内壁,或枯死倒伏之牛樟树木材潮湿表面,野生樟芝生长期在每年六至十月,采集极为不易。牛樟芝额的子实体形态多变化,有板状、钟状、马蹄状或塔状;初生时鲜红色,渐长变为白色、淡红褐色、淡褐色或淡黄褐色。牛樟芝气芳香味辛苦、平。有祛风行气、化淤活血、温中消结、解毒消肿、镇静止痛、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、提升机体免疫力之效;对于治疗胃肠疼痛、腹泻呕吐、食物中毒、毒蕈中毒、糖尿病、酒精肝、脂肪肝、肝硬化、肝癌等更是有独特功能。牛樟芝是有许多的生理活性成分,如多糖体、三萜类化合物、超氧歧化酶、腺苷、蛋白质(含免疫蛋白)、维生素、微量元素、核酸、凝集素、氨基酸、纤维素、血压稳定物质等。牛樟芝的有效成分中以三萜类化合物为最特别,是其他菇菌无法相比的,三萜类化合物使牛樟芝具有抗癌、保肝等功效。由于樟芝在台湾被视为独特而珍贵的药用真菌,因此具有极高的研究和商业价值,也是目前台湾最昂贵的野生真菌,在港澳被称为"神芝",台湾誉为"森林中的红宝石"。
研究表明,牛樟芝成分有多糖、萜类、甾体类化合物、马来酸及琥珀酸衍生物等主要活性化合物,具有护肝、抗癌、调节免疫、去过敏、解毒和抗炎等功效。其中多醣 (Polysaccharides),牛樟芝在子实体含有多醣体,具有免疫生理活性、预防及控制肿瘤等生理活性,主要含β-D-glucan(β-D-葡聚糖))其作用是透过激发巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及自然杀手细胞等来增强免疫功能,进而达到抗肿瘤的效果。樟芝多醣体中有强心、降血压、降血糖等功效。三萜类化合物(Terpenoids),三萜类化合物是目前樟芝子实体发现最多的萜类化学成分,一般被认为牛樟芝萃取物中苦味成份的主要来源。其中多达10多种新发现三萜类为樟芝所独有,实验证实:这些三萜类化合物能抑制肝癌细胞的增殖、毒杀老鼠血癌(P-388 murine leukemia)细胞活性、抗副交感神经作用、抗血清素活性、活化神经细胞生长能力等功能;比多醣体扮演着更重要的抗肿瘤活性调节角色。高血压患者往往因为血压高,导致脑血管破裂而中风,三萜类化合物能有效的抑制Angiotensin Converting Enzyme(ACE)的活性,进而降低血糖。β-D-葡聚醣具有预防肿瘤的免疫生理活性,增强人体免疫功能,具有抗过敏的作用,帮助调解高血糖。近年来牛樟芝的药理作用得到医学界的广泛重视,提取分离牛樟芝化合物组分,研制开发新技术新产品前景十分广阔。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛樟芝化合物组分分离提取方法,具有有效活性组分分离效果好,纯化纯度高,成分不易被分解破坏、无有害化学试剂和重金属残留、提取效率高等优点。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种牛樟芝化合物组分分离提取方法:以牛樟芝子实体粉或菌丝体为原料,采用酶解、超临界CO2萃取、离子交换色谱、膜分离超滤和层析法纯化相结合的技术实现牛樟芝化合物组分的分离提取。
具体步骤如下:
(1)将合格牛樟芝干燥至水分含量≤8%,粉碎,过20-30目筛;
(2)将牛樟芝粉用纯化水浸泡,料液比为1:10-12,调节pH=4.5-5.5,温度50-60℃,时间6h;加入淀粉酶和木聚糖酶,搅拌均匀,超声辅助酶解2-3h;将料液升温至100℃,灭酶2-3min,然后将料液采用100目膜过滤,得酶解提取液(1);
(3)在步骤(2)的滤渣中加入其重量10倍的纯化水,搅拌均匀,再加入纤维素酶,酶解2-3h,将料液升温至100℃,灭酶2-3min,然后将料液采用100目膜过滤,得酶解提取液(2);
(4)将酶解提取液(1)和酶解提取液(2)合并,混合均匀,0.09MPa减压浓缩至可溶性固形物含量为10-12%,浓缩液的浓度Brix=16.0-18.0%;
(5)将浓缩液采用超临界CO2萃取,条件为:萃取釜压力25-30MPa,萃取温度50-55℃,分离温度40℃,I级分离釜压力8-10MPa,Ⅱ级分离釜压力6MPa,CO2流速2-2.5L/min,萃取时间4-5h,分离釜收集得到牛樟芝化合物组分的综合萃取物;
(6)采用离子交换色谱和凝胶层析进行分离,吸附部分得α-葡聚糖苷酶,未吸附部分得β-葡聚糖苷酶;
(7)采用膜分离超滤技术分离提取纯多糖部分;
(8)采用硅胶薄层层析分离,经脱水分馏,得三萜类化合物。
步骤(2)中所述的淀粉酶的酶活力为20万U/g,木聚糖酶的酶活力为12万U/g,用量分别为牛樟芝粉重量的0.1-0.2%;超声波频率为25-30kHz。
步骤(3)中所述的纤维素酶的酶活力为20万U/g,用量为滤渣重量的0.2-0.3%。
步骤(6)的具体步骤如下:(1)将葡聚糖凝胶在7-10倍量的蒸馏水中充分溶胀1-2小时;(2)将凝胶装填入垂直的层析柱中,柱长100cm,直径5cm;(3)萃取物浓缩液体积为凝胶总床体积的15%-20%,萃取物浓缩液与洗脱液的相对粘度为1.5-2。
步骤(7)的工艺参数如下:超滤膜为中空纤维式纳米膜,中空纤维外径0.4-2.0mm,内径0.3-1.4mm,过滤精度0.005-0.01μm;超滤温度为25℃,pH值接近浸提介质的pH,超滤压力为0.15-0.18MPa。
步骤(8)的具体步骤如下:(1)用95wt.%乙醇溶液浸渍2h,温度40-45℃,回流2次,将体积比为10:3:1的甲苯-乙酸乙酯-乙酸作为展开剂;(2)采用梯度洗脱,收集的规格:上液量200g,200-300目的硅胶50g,50ml收一馏分。
本发明的显著优点在于:本发明具有有效活性组分分离效果好,纯化纯度高,成分不易被分解破坏、无有害化学试剂和重金属残留、提取效率高等优点,可以同时脱除多糖液中的盐分和水,实现对多糖和三萜类化合物稀溶液的纯化和分离,作为新原料、中间体应用于功能食品、保健食品、药品、化妆品等产业的研究开发。本发明具有很高的工业应用价值,是一项既环保、经济又可工业化生产的现代生物医药活性物质的制备技术。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1:牛樟芝组分分离
原料:牛樟树椴木为培养基材栽培的牛樟芝。培养时间为二年。
步骤:
(1)将牛樟芝子实体净选除杂,干燥至水分≤8%,粉碎20-30目,称量牛樟芝子实体粉碎粉1000g。
(2)将步骤(1)的牛樟芝粉粹粉,按料液比为1:10-12,调节pH4.5-5.5,温度50-60℃,用纯化水浸泡6h后,再加入淀粉酶1.5g和木聚糖酶1.5g,搅均,酶反应2-3h。所述的淀粉酶酶活力为20万U/g,木聚糖酶酶活力为12万U/g,用量分别为粉粹粉重量的0.15%;上述酶解过程在超声辅助条件下进行,超声波频率25-30kHz。酶解反应后将料液升温至100℃,灭酶2-3min,然后将料液采用100目膜过滤,得酶解提取液(Ⅰ)备用。
(3)将步骤(2)的滤渣加纯化水10倍,加入纤维素酶2.5g,反应2-3h,所述的纤维素酶,酶活力为20万U/g,用量为滤渣重量的0.25% 。酶解反应后将料液升温至100℃,灭酶2-3min,然后将料液采用100目膜过滤,得酶解提取液(Ⅱ)备用。
(4)将步骤(2)的酶解提取液(Ⅰ)和步骤(2)的酶解提取液(Ⅱ)合并,进行混合均匀浓缩,压力0.09MPa,减压浓缩至可溶性固形物含量为10-12%,浓缩液的浓度Brix=16.0-18.0%。
(5)将浓缩液采用超临界CO2萃取,条件为:萃取釜压力25-30MPa,萃取温度50-55℃;分离温度40℃,I级分离釜压力8-10MPa,Ⅱ级分离釜压力6MPa,CO2流速2-2.5L/min(食品级,纯度≥99.5%),萃取4-5h,分离釜收集得牛樟芝组分综合萃取物。
(6)采用离子交换色谱,凝胶层析(分子筛过滤)亲和色谱进行分离,吸附部分得α-葡聚糖苷酶,未吸附部分得β-葡聚糖苷酶。
制备步骤:①离子交换色谱使用水缓冲溶液,凝胶选用葡聚糖凝胶,采用100cm长的层析柱分级分离,直径在5cm,将干胶颗粒悬浮于7-10倍量的蒸馏水中充分溶胀,即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸,胀溶时间1-2小时。②凝胶装填入垂直的层析柱,柱顶安放容器,柱内充满洗脱液,将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中,然后在搅拌下使凝胶下沉于柱内,放置30分钟,再开始流动平衡。③凝胶床经过平衡后,在床顶部留洗脱液使凝胶床饱和,再用滴管加入萃取物浓缩液。萃取物浓缩液体积为凝胶总床体积的15%-20%。萃取物浓缩液与洗脱液的相对粘度为1.5-2。加入萃取物浓缩液,打开流出口,使萃取物浓缩液渗入凝胶床内,将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连,自然流速,吸附部分得α-葡聚糖苷酶干物质12.2g,未吸附部分得β-葡聚糖苷酶干物质14.6g。并对每一馏份做定性、定量测定。
(7)采用膜分离超滤技术将物质进行分离和净化,是以超滤膜的两侧压力为推力达到溶液分离提取纯多糖部分。
制备步骤:①超滤膜按结构型式为中空纤维式纳米膜表超滤膜结构。中空纤维外径0.4-2.0mm,内径0.3-1.4mm,中空纤维管壁上布满微孔,孔径以能截留物质的分子量表达,过滤精度在0.005-0.01μm范围内,可有效去除水中的微粒、胶体、细菌垫层及高分子有机物质。②浓缩液在中空纤维外侧或内腔加压流动,分别构成外压式与内压式中空超滤膜。超滤是动态过滤过程。③超滤温度为25℃,pH值接近浸提介质的pH,超滤压力为0.15-0.18MPa,制得牛樟芝多糖干物质37.5g。
(8)采用硅胶薄层层析分离,经脱水分馏,得三萜类化合物(牛樟芝三萜)。
制备方法:①用95%乙醇2000g,温度40-45℃,浸渍2h,回流2次,将甲苯-乙酸乙酯-乙酸作为展开剂(10:3:1)。② 称量。干硅胶的视密度在0.4, 薄层层析硅胶规格:5-10um。搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌搅匀。③装柱。将柱底用棉花塞紧,加入约1/3体积石油醚(氯仿),装上蓄液球,打开柱下活塞,将匀浆一次倾入蓄液球内。④.压实。沉降完成后,用双联球或气泵加压,直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。使分离度提高,避免过柱时由于柱床收缩产生开裂。⑤上液。采用湿法。上液后,加入一些洗脱剂,再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后加入大量洗脱剂。⑥过柱和收集。柱层析在扩散和分离之间的工作。采用洗脱剂多次洗脱,使萃取物浓缩液全部过柱。收集的规格:上液量200g,硅胶50g(200-300目),50ml收一馏分,收集三萜类化合物(牛樟芝三萜)干物质56.6g。
实施例2:牛樟芝化合物组分分离结果:制得牛樟芝多糖38.7;三萜类化合物(牛樟芝三萜)56.7g;α-葡聚糖苷酶12.6g;β-葡聚糖苷酶14.9g。
实施例3:牛樟芝化合物组分分离结果:制得牛樟芝多糖37.9;三萜类化合物(牛樟芝三萜)57.2g;α-葡聚糖苷酶12.8g;β-葡聚糖苷酶14.6g。
实施例各组分进行检测分析,其化合物质量、纯度、萃取率见下表:
表1 牛樟芝(1000g)化合物组分分离提取质量、纯度、萃取率平均测定值
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种牛樟芝化合物组分分离提取方法,其特征在于:以牛樟芝子实体粉或菌丝体为原料,采用酶解、超临界CO2萃取、离子交换色谱、膜分离超滤和层析法纯化相结合的技术实现牛樟芝化合物组分的分离提取。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:具体步骤如下:
(1)将合格牛樟芝干燥至水分含量≤8%,粉碎,过20-30目筛;
(2)将牛樟芝粉用纯化水浸泡,料液比为1:10-12,调节pH=4.5-5.5,温度50-60℃,时间6h;加入淀粉酶和木聚糖酶,搅拌均匀,超声辅助酶解2-3h;将料液升温至100℃,灭酶2-3min,然后将料液采用100目膜过滤,得酶解提取液(1);
(3)在步骤(2)的滤渣中加入其重量10倍的纯化水,搅拌均匀,再加入纤维素酶,酶解2-3h,将料液升温至100℃,灭酶2-3min,然后将料液采用100目膜过滤,得酶解提取液(2);
(4)将酶解提取液(1)和酶解提取液(2)合并,混合均匀,0.09MPa减压浓缩至可溶性固形物含量为10-12%,浓缩液的浓度Brix=16.0-18.0%;
(5)将浓缩液采用超临界CO2萃取,条件为:萃取釜压力25-30MPa,萃取温度50-55℃,分离温度40℃,I级分离釜压力8-10MPa,Ⅱ级分离釜压力6MPa,CO2流速2-2.5L/min,萃取时间4-5h,分离釜收集得到牛樟芝化合物组分的综合萃取物;
(6)采用离子交换色谱和凝胶层析进行分离,吸附部分得α-葡聚糖苷酶,未吸附部分得β-葡聚糖苷酶;
(7)采用膜分离超滤技术分离提取纯多糖部分;
(8)采用硅胶薄层层析分离,经脱水分馏,得三萜类化合物。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(2)中所述的淀粉酶的酶活力为20万U/g,木聚糖酶的酶活力为12万U/g,用量分别为牛樟芝粉重量的0.1-0.2%;超声波频率为25-30kHz。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(3)中所述的纤维素酶的酶活力为20万U/g,用量为滤渣重量的0.2-0.3%。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(6)的具体步骤如下:
(1)将葡聚糖凝胶在7-10倍量的蒸馏水中充分溶胀1-2小时;
(2)将凝胶装填入垂直的层析柱中,柱长100cm,直径5cm;
(3)萃取物浓缩液体积为凝胶总床体积的15%-20%,萃取物浓缩液与洗脱液的相对粘度为1.5-2。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(7)的工艺参数如下:超滤膜为中空纤维式纳米膜,中空纤维外径0.4-2.0mm,内径0.3-1.4mm,过滤精度0.005-0.01μm;超滤温度为25℃,pH值接近浸提介质的pH,超滤压力为0.15-0.18MPa。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(8)的具体步骤如下:
(1)用95wt.%乙醇溶液浸渍2h,温度40-45℃,回流2次,将体积比为10:3:1的甲苯-乙酸乙酯-乙酸作为展开剂;
(2)采用多次洗脱,收集的规格:上液量200g,200-300目的硅胶50g,50ml收一馏分。
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |