CN103923925B

CN103923925B - 抑制ER81基因表达的siRNA及其在乳腺癌细胞中的应用

Info

Publication number: CN103923925B
Application number: CN201410189953.7A
Authority: CN
Inventors: 杨举伦; 冯强; 黎贵芸
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-05-07
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2034-05-07
Also published as: CN103923925A

Abstract

本发明公开了一种特异性抑制人ER81基因表达的siRNA及其制备和筛选方法。本发明以ER81基因为靶点序列，针对该基因的7个转录突变体编码区的同源序列，分别在上、中、下游各选择一个干扰靶点，构建出三个重组siRNA表达载体。将siRNA重组表达载体转入乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，利用DNA介导的RNA干扰技术，最终筛选出一个能够明显抑制ER81基因表达的siRNA片段。实验结果表明，本发明所筛选出的siRNA可以特异、高效的抑制ER81基因的表达，从而抑制乳腺癌细胞的增殖，促进细胞凋亡。本发明所筛选出的siRNA为制备靶向治疗乳腺癌相关药物提供了一个新的途径，展示出了良好的应用前景。

Description

抑制ER81基因表达的siRNA及其在乳腺癌细胞中的应用

技术领域

本发明属于医学分子生物学领域，具体地涉及靶向人ER81基因siRNA表达载体的构建、筛选及其在抑制乳腺癌细胞中ER81基因表达水平中的应用。尤其涉及利用siRNA通过RNA干扰途径特异性抑制ER81基因表达及其在杀伤乳腺癌细胞，诱导细胞凋亡方面的用途。

背景技术

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有130万妇女发生乳腺癌，有50万妇女死于乳腺癌。其发病率始终处于上升状态，尤以近20年来最为显著。乳腺癌的发生涉及细胞凋亡与增殖失衡、细胞的分化紊乱、癌基因与抑癌基因的功能失调以及相关信号传导系统等多种生命活动的异常。随着现代分子生物学、分子免疫学、肿瘤免疫学、生物工程学研究的迅速进展，人们对乳腺癌的研究已进入了一个活跃阶段。

目前乳腺癌的治疗主要是采取手术为主，辅以化疗、放疗及内分泌治疗等综合方式。近年来，随着肿瘤分子生物学研究的日趋深入，肿瘤的基因治疗以其治疗的高特异性和相对较低的毒副作用为乳腺癌的治疗开辟了一个新天地。因此，寻找可用于诊断和预后判断的生物标志物，并由此引出新的治疗靶点，是当今肿瘤学研究的重要内容。

基因治疗（gene therapy）是将正常的外源基因导入人体靶细胞或组织以取代有缺陷的基因，通过其正常表达，达到治疗基因病的目的。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。目前基因治疗主要涉及恶性肿瘤、心脑血管疾病、遗传病和某些传染病，其中又以恶性肿瘤为主要治疗对象，它为肿瘤治疗开辟了一条新的道路，而且随着研究的深入，基因治疗可能成为从根本上解决肿瘤问题的金钥匙。肿瘤的基因治疗属于一种生物治疗手段，是一大类治疗策略的总称。根据治疗机理不同，目前至少可以分为以下六类：1、免疫基因治疗，治疗基因包括肿瘤相关抗原基因、细胞因子（如 IL -2、TNF等）基因或者 MHC基因等。2、抑癌基因治疗，体内导入野生型抑癌基因，替代缺失或异常的抑癌基因表达，可以达到抑制肿瘤细胞增殖的效果，目前研究较为深入的抑癌基因治疗主要运用 p53、p16、RB基因等。3、抗血管生成基因治疗，通过基因导入并表达的手段，在体内长期维持一定水平的血管生成抑制因子，抑制肿瘤血管的生成，从而达到抑制肿瘤的增殖、复发和转移。4、调节毒素表达的转基因系统，利用植物或细菌的免疫毒素，如白喉毒素、假单孢内毒素等，将编码正常或变异的毒素基因与单克隆抗体细胞因子或生长因子等连接，将毒素基因导入肿瘤细胞，引起肿瘤细胞的死亡；5、反义癌基因治疗：通过人工合成的寡核苷酸与癌基因编码的mRNA互补结合，可以抑制mRNA的转录，达到封闭癌基因的目的。6、RNA干扰（RNAi）：是指细胞中导入与内源性mRNA某段序列同源的双链RNA（dsRNA），可致该mRNA发生特异性降解从而导致基因表达沉默的现象，通过RNA干扰，使与肿瘤细胞生长、转移的相关因子沉默，从而达到抗肿瘤作用。

在正常生物体内，细胞内的双链RNA（dsRNA，38个碱基以上）在依赖ATP的情况下，被核糖核酸酶Dicer切割成双链小干扰RNA（siRNA， 21～25个碱基）。siRNA这个结构对基因沉默效应十分关键。（1）siRNA中有两条链，一条为正义链，一条为反义链，其中反义链可和多种核酸酶结合形成沉默复合物（RISC），同时由于反义链与某一种mRNA的编码区是同源的，因此可与此编码区互补结合，随之引导RISC结合mRNA，然后通过依赖于ATP的解螺旋酶解开siRNA的双链，并将其正义链与靶mRNA置换，即mRNA取代正义链与反义链互补，继而核酸酶将mRNA切割成21～23 nt的小片段，切断部位大约在与siRNA反义链配对序列的中部，于是mRNA发生降解，从而导致基因表达的沉默，干扰了靶基因的表达。（2）RISC中的RdRP（RNA依赖性RNA聚合酶）以siRNA反义链作为引物，以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，然后由Dicer切割产生新的siRNA，新siRNA再去识别新一组mRNA，又产生新的siRNA。经过若干次合成-切割循环，沉默信号就会不断放大，甚至穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持。

RNAi具有许多传统方法无法比拟的特点和优势。RNAi具有以下特征: （1）抗干扰性：RNAi是 dsRNA介导的 PTGS机制，翻译抑制剂对RNAi不产生影响;（2）特异性：RNAi具有很高的特异性，RNAi只能特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，而其它mRNA的表达则不受影响；（3）催化性：RNAi抑制基因表达具有很高的效率，是以催化放大的方式进行的，相对少量的 dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达；（4）传递性：RNAi抑制基因表达的效应可以跨越细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子代；（5）长度限制性：引发有效 RNAi的 dsRNA不得短于 21 bp，而大于30 bp的dsRNA诱导的不是特异的 RNAi，而是引起细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡，一般来说，引发有效RNAi的 dsRNA要求在 21～23 bp；（6）浓度、时间双重依赖性：dsRNA诱发的 RNAi效应的强度随着其浓度的增高而增强；（7）ATP依赖性：在去除 ATP的样品中，RNAi现象降低或消失，显示 RNAi是一个 ATP依赖的过程，可能 Dicer和 RISC的酶切反应必须由 ATP提供能量所致。基于以上的特点，siRNA作用远远优于反义寡核苷酸、核酶等，RNAi可有效的弥补反义寡核苷酸技术与基因敲除技术的不足。

RNA干扰作为一种转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing ，PTGS）机制，与传统的基因敲除等基因沉默技术相比，RNAi技术具有投入少，操作简便等优势。因此，人们把注意力从反义 RNA技术如核酶、寡聚脱氧核苷酸等转移至 RNAi上，使其在基因功能研究以及基因治疗中发挥了重要的作用。从 1998年 Fire首次报道双链RNA可以特异性地沉默基因表达以来，RNAi已经在各个领域广泛应用，尤其在肿瘤的治疗领域中，已显示巨大的潜力。近年来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi技术将成为研究基因功能及进行基因治疗不可缺少的方法。RNAi技术的不断成熟使其在医学领域得到快速的发展，尤其在癌症治疗方面，RNAi作为一种基因治疗手段已显示出远大的前景，并有望在肿瘤基因治疗、遗传性疾病以及病毒性感染治疗等方面发挥重要作用。

1992年Thomas A.Brown等在鼠的基因组DNA中发现了ER81基因，该基因位于鼠第12号染色体上，人ER81基因于1995年被Monte D等发现，命名为ETV1，位于人类第7号染色体上。ER81基因属于ETS家族，Ets基因最早发现于美国Frederick的国家癌症研究所分子肿瘤学实验室。他们在E26鸟骨髓成红细胞增多症病毒所表达的融合蛋白中发现了癌基因Ets。E26为禽类的白血病病毒，是一个复制缺陷的逆转录病毒，转录一个5.7 kb RNA，并编码一个135 kD的三联核内磷酸蛋白，即一个Ets的序列结合了滤过性病毒的gag基因和癌基因myb。此后，一系列细胞Ets基因被发现，它们的序列与E26都拥有高度保守的同源序列。因此，根据E26（E-twenty six）的缩写而将该基因命名为Ets。又因为Ets家族是细胞内最大的信号依赖转录调控因子家族之一，故也有作者认为Ets来自英文“E26”（transformationspecific）的缩写。ER81为ETS related 81的缩写。

ER81作为基因转录因子，除DNA结合区域外，还有调控区域，调控基因的转录。ER81可以促进细胞的分化、促进器官的形成，在乳腺肿瘤的形成过程中，ER81起着促进肿瘤的生成与转移的作用。

ER81作为一个广泛表达的转录因子，在人体组织中，ER81 mRNA在脑组织表达非常高，在睾丸、肺和心脏高表达，在脾、小肠、胰腺和结肠中度表达，在肝、前列腺和胸腺弱表达，在骨骼、肌肉、肾和卵巢表达非常弱，在胎盘和外周血粒细胞不表达。而在乳腺癌、Ewing’s肉瘤、前列腺癌、黑色素瘤和胃癌等几种肿瘤中都有ER81的异常表达。对正常乳腺细胞系和乳腺癌细胞系的分析发现，ER81不仅存在于正常乳腺细胞系，在乳腺癌细胞系中，ER81基因在 MDA-MB-436、MDA-MB-330和MDA-MB-231细胞系以相对高水平表达，其中以MDA-MB-231细胞系表达最高。并且发现ER81 mRNA和ER和/或PR mRNA之间存在负相关性趋势（P＜0.05），表明在乳腺肿瘤的发生过程中，ER81起着促进肿瘤生成与转移的作用。这些结果说明ER81对于体外和体内乳腺癌细胞生长和恶性表现型的维持是一个关键的调节因素。ER81转录因子的激活可能发生在乳腺恶变过程的早期，该转录因子的激活对乳腺癌的产生和发展至关重要，而乳腺癌的发生可能是HER2基因通过激活ER81而促进肿瘤的恶性转化。因此，ER81对于乳腺癌的治疗从而降低肿瘤恶性转化可能是一个潜在的分子靶点。

虽然人们对ER81基因、ER81转录因子的结构和功能、ER81转录因子的活化机制、以及ER81转录因子与肿瘤的关系的研究已达到一定的程度。但是，人体是一个有机的、复杂的相互联系的网络系统；而且人类肿瘤的发生是一个多步骤、多阶段、多基因参与的系统过程；肿瘤细胞的增生、凋亡、浸润和转移牵涉到一系列复杂的分子事件，在这些过程中关于激活 ER81表达的信号通路、受ER81调控的靶基因以及与其它基因间的相互作用等了解得还不够充分。

ER81蛋白可由乳腺癌细胞的ER81 mRNA编码合成，如果运用RNA干扰技术，将携带特异性小干扰RNA（siRNA）的质粒转染乳腺癌细胞，将可能使肿瘤细胞的ER81 mRNA特异性降解，减少ER81蛋白的合成，使ER81的表达下调，从而抑制肿瘤的生长。基于上述原理，本发明利用基因工程技术，设计、选择3段人ER81基因的RNA干扰片段，将设计的人ER81 siDNA序列插入siRNA表达载体pGenesil-1中，构建出重组质粒pGenesil-ETV1A/ETV1B/ETV1C，研究靶向ER81 mRNA的siRNA对人乳腺癌细胞ER81 mRNA和ER81蛋白表达的影响及对人乳腺癌细胞生物学特性的影响。有助于阐明ER81基因及其靶基因的作用，进一步研究新的ER81反应性基因，将为深入研究其在多种生理和病理过程中的作用提供理论依据，有助于阐明ER81转录因子在恶性肿瘤中的发展规律，为从分子水平研究疾病的发病机制，以及临床的诊断治疗提供新的思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性抑制人ER81基因的siRNA序列，其特征在于，其碱基序列为：GUUGGUACAUAGGACGUCC。针对的ER81基因靶序列是ETV1A：GGACGTCCTATGTACCAAC。

本发明的另一目的是提供一种特异性抑制人ER81基因表达的siRNA的制备方法。

本发明是基于ER81基因7个转录突变体的共同序列设计siRNA序列。并利用RNAi在线设计软件查找共同序列中得分较高的RNA干扰靶点序列。再经过BLAST比对，去除可能与其他非相关基因杂交的靶点序列，最终在序列的上、中、下游各选择一个得分较高、特异性好的靶点序列。最后用筛选出的靶点序列构建重组siRNA表达载体，并稳定转染乳腺癌细胞，最终在细胞内表达出具有干扰活性的siRNA。本发明所设计的siRNA不仅特异性高，而且能够同时抑制人ER81基因7个不同转录突变体的表达。

本发明还提供了编码该siRNA前体的DNA序列，以及包含该编码序列的重组siRNA表达载体pGenesil-ETV1A。利用该重组siRNA表达载体可以直接在细胞内表达siRNA，从而抑制ER81基因表达，达到抑制癌细胞增殖，促进细胞凋亡的目的。

本发明所用siRNA表达载体pGenesil-1含有一个可用于稳定表达siRNA的具有固定转录起始位点（G）和终止位点（TTTTTT）的U6启动子。该表达载体上的U6启动子可以转录出具有特异序列的siRNA前体—shRNA（短发卡RNA），该mRNA并不编码氨基酸，而是在细胞内自动形成一个带有茎环的shRNA。该shRNA在细胞内被核酸酶Dicer识别并剪切为长度约有21-25nt并在3’末端带有两个核苷酸突出的siRNA。用这个成熟的siRNA作为引导序列，引导RISC（RNA诱导沉默复合物）去识别与siRNA互补的靶基因mRNA序列。然后siRNA与mRNA在复合物中换位，核酸酶Dicer将mRNA切割成21-23nt的片段，特异性的抑制靶基因的表达。新产生的siRNA片段可再次引导RISC与靶基因mRNA形成复合物，继续降解靶基因的mRNA，从而产生级联放大效应，使得靶基因的表达几乎完全被特异性抑制。

本发明的另一目的是提供一种特异性抑制人ER81基因表达的方法。本发明所提供的抑制人乳腺癌细胞中ER81基因表达水平的方法，是利用DNA介导的RNA干扰技术，将抑制该基因表达的siRNA编码基因克隆到siRNA表达载体，然后导入乳腺癌细胞。重组siRNA表达载体在细胞中表达出能够抑制ER81基因mRNA的siRNA，使得乳腺癌细胞中的ER81基因在转录水平得到抑制。

本发明还提供了所述siRNA在制备抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡方面抗肿瘤药物中的应用。

本发明的上述目的通过如下技术方案实现：

（1）在GenBank数据库中搜索人ER81基因的mRNA，通过序列比对确定该基因7个转录突变体的同源序列。用Genscript网站中的RNAi在线设计软件查找同源序列中得分最高的RNA干扰靶点序列。经过BLAST比对，去除可能与其他非相关基因杂交的靶点序列，最终在序列的上、中、下游各选择一个得分较高、特异性好的靶点序列；

（2）将确定的靶点序列按BamHⅠ+Sense+Loop+AntiSense+终止信号+SalⅠ+Hind Ⅲ酶切位点的形式设计编码能够自发形成茎环RNA的siDNA序列。并将化学合成的siDNA片段连接到siRNA表达载体pGenesil-1中，构建出重组siRNA表达载体pGenesil-ETV1A/ETV1B/ETV1C；

（3）将重组siRNA表达载体pGenesil-ETV1A/ETV1B/ETV1C转染乳腺癌细胞MDA-MB-231，用G418筛选出能够稳定表达绿色荧光蛋白的稳转细胞株MDA-MB-231/ETV1A/ETV1B/ETV1C；

（4）提取稳转细胞株MDA-MB-231/ETV1A /ETV1B/ETV1C的总RNA和总蛋白，分别进行荧光定量PCR和Western Blot，从mRNA水平和蛋白质水平确定ER81基因的表达量变化。通过MTT法绘制细胞生长曲线和平板克隆实验检测细胞增殖能力的变化。最后利用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况，确定稳转细胞株MDA-MB-231/ETV1A/ETV1B/ETV1C的凋亡率变化。

本发明最终筛选出了一个能够明显抑制人ER81基因表达，从而抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡的siRNA。本发明的实验结果表明，所筛选出的重组表达载体pGenesil-ETV1A稳定转染乳腺癌细胞后，经过荧光定量PCR和Western Blot检测ER81基因的表达量显著降低；利用MTT和平板克隆实验发现细胞增殖被显著抑制；最后通过流式细胞术检测细胞凋亡，发现细胞凋亡明显增加。说明pGenesil-ETV1A在抑制了乳腺癌细胞ER81基因的表达后，会抑制癌细胞的增殖，引起癌细胞的凋亡，最终起到抑制、杀伤癌细胞的作用。

本发明的有益成果：本发明利用DNA介导的RNA干扰技术，以在乳腺癌细胞中高表达的ER81基因为靶点，针对其基因编码序列设计了小干扰RNA（siRNA）。将能够编码该siRNA的重组siRNA表达载体导入细胞中，通过外源导入的siRNA来介导内源ER81 mRNA的降解，从而导致细胞内ER81基因的沉默。本发明通过实验筛选出了一个能够明显抑制ER81基因表达的siRNA。该siRNA可用于观察细胞内ER81基因被特异性抑制的情况下表达及信号通路的变化，为从分子和细胞水平研究ER81基因的功能提供了有效的工具。同时也为乳腺癌的基因治疗提供了新的途径，在靶向治疗与ER81基因相关的肿瘤领域展现了良好的应用前景。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明所选用的siRNA表达载体，控制siRNA转录的是RNA聚合酶Ⅲ家族中的U6启动子，其有确定的转录起始位点和转录终止位点，便于设计编码siRNA的siDNA序列。并且能够高水平表达小RNA，使得siRNA在细胞内的积累较多，抑制效果更明显；

（2）本发明所选用的siRNA表达载体，携带有新霉素抗性基因和增强型绿色荧光蛋白的编码基因。新霉素抗性基因可用于G418筛选，便于稳转细胞系的建立。绿色荧光蛋白可以直接在荧光显微镜下观察，能够快速、准确的追踪转染效率；

（3）本发明在构建重组siRNA表达载体的过程中，利用两条引物相互退火延伸，得到的退火产物不需要进行酶切及纯化，就可以直接与处理好的载体进行连接。并且本发明在设计编码干扰序列的siDNA序列时引入了一个SalⅠ酶切位点，可用于连接后的酶切鉴定，解决了因插入片段过短PCR难以鉴定阳性克隆的问题。以上实验设计极大的简化了实验工序，提高了实验效率，降低了实验成本；

（4）本发明所筛选出的针对人ER81基因的siRNA抑制效果更为显著。本发明针对人ER81基因的上、中、下游分别设计了干扰靶点，并从实验中筛选出了对ER81基因抑制效率较高的siRNA；

（5）本发明所筛选出的siRNA序列具有更高的特异性。小干扰RNA在识别靶序列过程中只降解与之相对应的单个基因的mRNA，针对同源基因共同序列的RNAi则能导致同源基因共同失活，而单个碱基的改变就能导致RNAi的失效。本发明针对ER81基因7个转录突变体的共同序列设计siRNA序列，经过BLAST比对去除了与其他非相关基因配对程度高的siRNA序列，选择了只能够特异性靶向ER81基因mRNA的siRNA序列；

（6）本发明构建的抑制ER81基因的重组siRNA表达载体，能够显著抑制肿瘤细胞的增殖、促进细胞的凋亡。可用于进一步研究ER81基因的功能及其在关于激活 ER81表达的信号通路、受ER81调控的靶基因以及与其它基因间的相互作用；

（7）本发明使用DNA介导的RNA干扰技术，利用脂质体法稳定转染重组siRNA表达载体。安全性高、无插入突变的危险，并且没有免疫毒性反应。为肿瘤治疗提供了新的靶向治疗方案和相关药物的开发制备；

（8）本发明使用RNA干扰技术，直接从转录水平上降低ER81基因mRNA的表达，并直接导致ER81蛋白的积累减少进而抑制ER81信号通路。本发明相对于反义寡核苷酸、基因敲除以及受体中和抗体等传统抑制蛋白信号转导通路治疗肿瘤的技术和方法，具有操作简便、特异性高、针对性强、级联放大、效果更加持续的特点。

附图说明

图1为本发明siRNA表达载体pGenesil-1的BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切电泳图，M：Trans2K^TM Plus DNA Marker，泳道1为BamHⅠ单酶切条带，泳道2为Hind Ⅲ单酶切条带，泳道3为BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切条带；

图2为本发明重组siRNA表达载体的SalⅠ酶切鉴定电泳图，M：Trans2K^TM Plus DNAMarker，泳道1-4分别为重组质粒pGenesil-ETV1A/ ETV1B/ ETV1C/NC的SalⅠ酶切条带；

图3为本发明重组siRNA表达载体转染乳腺癌细胞MDA-MB-231 24小时后的共聚焦扫描图，×200，1为表达绿色荧光的转染细胞，2为全光下细胞共聚焦扫描图，3为绿色荧光与全光通道的叠加图；

图4为本发明提取五组稳转细胞及正常乳腺癌细胞的总RNA电泳图，泳道1-6分别为转染A、B、C、NC、BC组以及未转染的空白组细胞总RNA电泳图；

图5为本发明转染A、B、C、NC、BC组以及未转染的空白组细胞中ER81基因mRNA的相对定量结果图；

图6为本发明转染A、B、C、NC、BC组以及未转染的空白组细胞中ER81蛋白的WesternBlot结果图，泳道1-6分别为转染A、B、C、NC、BC组以及未转染的空白组细胞ER81和内参GAPDH蛋白的定量表达结果；

图7为本发明MTT法绘制转染A、B、C、NC、BC组以及未转染的空白组的细胞生长曲线图；

图8为本发明转染A、B、C、NC、BC组以及未转染的空白组细胞的克隆形成率结果图；

图9为本发明转染A、B、C、NC、BC组以及未转染的空白组细胞的细胞周期分布图；

图10为本发明转染A、B、C、NC、BC组以及未转染的空白组细胞的细胞增殖指数示意图；

图11为本发明转染A、B、C、NC、BC组以及未转染的空白组细胞的细胞凋亡示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：靶向人ER81基因的重组siRNA表达载体的构建

1、靶向人ER81基因的siDNA基因片段的合成

在NCBI网站上的基因数据库GenBank中搜索人ER81 mRNA序列，ER81基因共有7个转录突变体，基因登录号分别为：NM_004956，NM_001163147，NM_001163148，NM_001163149，NM_001163150，NM_001163151，NM_001163152。通过序列比对找出7个转录突变体的共同序列并利用它们的共同序列在Genscript公司的RNAi在线设计工具GenScript siRNA TargetFinder（https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai）中查找得分最高的几个siRNA靶点序列。最后将设计出的siRNA靶点序列在GenBank中进行BLAST比对，剔除可能与其他非相关基因杂交的序列。最终选择mRNA上、中、下游三个位置的靶点序列，得到如下序列：ETV1A:GGACGTCCTATGTACCAAC；ETV1B: CGGCGAGGATCACTTCAGC；ETV1C: GACAGACATGGAACGTCAC。同时设置乱序siRNA靶点序列为阴性对照组，其中乱序siRNA靶点序列为：GACTTCATAAGGCGCATGC。

由于siRNA必须由双链RNA（dsRNA）在宿主细胞内通过核酸内切酶RNaseIII家族中的核酸Dicer切割为具有活性的双链小干扰RNA（siRNA），所以必须设计出一个在转录为RNA后能够形成带茎环结构的双链RNA。本发明所设计的编码siRNA的siDNA基本结构为酶切位点BamHⅠ+Sense+Loop+AntiSense+终止信号+SalⅠ+Hind Ⅲ酶切位点。其中Sense为编码siRNA的siDNA序列，Loop环的序列为5’- TTCAAGAGA-3’，AntiSense为编码siRNA的siDNA反向互补序列，终止信号序列为5’-TTTTTT-3’。

最终确定合成的siDNA序列及互补序列分别为：ETV1A-1:GATCCCGGACGTCCTATGTACCAACTTCAAGAGAGTTGGTACATAGGACGTCCTTTTTTGTCGACA；

ETV1A-2: AGCTTGTCGACAAAAAAGGACGTCCTATGTACCAACTCTCTTGAAGTTGGT

ACATAGGACGTCCGG；

ETV1B-1:GATCCCGCGGCGAGGATCACTTCAGCTTCAAGAGAGCTGAAGTGATCCTCG

CCGTTTTTTGTCGACA；

ETV1B-2: AGCTTGTCGACAAAAAACGGCGAGGATCACTTCAGCTCTCTTGAAGCTGAA

GTGATCCTCGCCGCGG；

ETV1C-1: GATCCCGACAGACATGGAACGTCACTTCAAGAGAGTGACGTTCCATGTCTG

TCTTTTTTGTCGACA；

ETV1C-2: AGCTTGTCGACAAAAAAGACAGACATGGAACGTCACTCTCTTGAAGTGAC

GTTCCATGTCTGTCGG；

乱序-1: GATCCCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGAGAGCATGCGCCTTA

TGAAGTCTTTTTTGTCGACA；

乱序-2: AGCTTGTCGACAAAAAAGACTTCATAAGGCGCATGCTCTCTTGAAG

CATGCGCCTTATGAAGTCGG。

将以上序列送出以引物形式合成。

2、靶向人ER81基因的siRNA重组表达载体的构建

2.1 siDNA寡核苷酸片段退火形成双链结构：将合成回来的寡核苷酸片段按说明书要求加相应量的无菌超纯水稀释至10μM/L。取已经稀释好的两条互补的siRNA靶点序列片段各 2μl，10×T4 buffer 2μl，加水至总体积20μl，放于200μl的PCR管中，置于PCR仪中，设置反应程序如下：95度5min，80度、70度、60度、50度、40度、30度、20度、10度、4度各2min。使两条互补的寡核苷酸退火互补后形成一条完整的带有相应酶切位点粘性末端的双链siRNA靶点序列片段，最终能够连接到siRNA表达载体上。

2.2 siRNA表达载体pGenesil-1的双酶切：用Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切siRNA表达载体pGenesil-1(购自武汉晶赛生物工程有限公司)。在200μl PCR反应管内加入siRNA表达载体pGenesil-1 30μl；Hind Ⅲ酶（10U/μl） 2μl；BamHⅠ酶（10U/μl） 2μl；10×Buffer K 5μl，ddH₂O 11μl，上述体系配置好后37℃反应4小时。酶切产物全部加样进行1％琼脂糖凝胶电泳，电压110V，20分钟，pGenesil-1表达载体双酶切后在4850bp左右的位置出现目的条带，结果见附图1。目的条带进行切胶纯化，步骤按天根离心柱型DNA纯化试剂盒说明书进行。

2.3 siRNA重组表达载体的构建：将寡核苷酸经过退火后形成的双链siDNA片段连入pGenesil-1载体，构建出相应的pGenesil-ETV1A（含有靶点序列ETV1A）、pGenesil-ETV1B（含有含有靶点序列ETV1B）、pGenesil-ETV1C（含有靶点序列ETV1C）、pGenesil-NC（含有乱序序列的阴性对照）重组siRNA表达载体。在200μl PCR管中配制如下连接体系：pGenesil-1/ Hind Ⅲ/ BamHⅠ载体大片段1μl；双链siDNA片段DNA 5ul；T4 DNA ligase 1ul；10×T4DNA ligase buffer 1ul；ddH₂O 2μl。以上体系配制好后放入金属浴，16℃反应4小时。将连接产物全部加入到100μl DH5α感受态中，冰浴30分钟。42℃热激90秒后立即冰浴90秒。加入900μl LB液体培养基，37℃，80rpm，振荡培养1小时。取200μl培养物涂布于LB/Kan平板上37℃倒置培养10小时。

2.4 阳性克隆的鉴定：挑取LB/Kan平板上的单菌落，接于5ml的液体LB/Kan培养基中，放入37℃恒温摇床150prm振荡培养8-10小时，至菌液OD₆₀₀≈0.8左右时停止培养。取全部菌液用于提取质粒，提取步骤按天根质粒小提试剂盒说明书操作。将提取出的pGenesil-ETV1A、pGenesil-ETV1B、pGenesil-ETV1C、pGenesil-NC四个重组siRNA表达载体分别用SalⅠ酶切。pGenesil-1载体上有一个SalⅠ的单酶切位点，本发明设计的靶点序列也引入了一个SalⅠ酶切位点。如果目的siDNA片段正确连入pGenesil-1表达载体，在用SalⅠ酶切重组质粒时，则会出现4500bp和400bp的两条带。而如果siDNA片段没有连入pGenesil-1表达载体，在用SalⅠ酶切重组质粒时，只会出现一条4850bp的条带，酶切结果见附图2。对酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序，选择没有突变的含有目的siDNA片段的重组siRNA表达载体进行细胞转染实验。

实施例2：重组siRNA表达载体对乳腺癌细胞系MDA-MB-231中ER81基因的抑制作用及对细胞生物学特性的影响

1、重组siRNA表达载体稳定转染MDA-MB-231细胞

用300μl的OPTI-MEM低血清培养基（购自Thermo Fisher Scientific Inc.旗下的Gibco®品牌）稀释0.8μg 上一步提取纯化的各重组siRNA表达载体（pGenesil-ETV1A、pGenesil-ETV1B、pGenesil-ETV1C、pGenesil-NC）和原始siRNA表达载体pGenesil-1，轻轻混匀。再用298μl的OPTI-MEM低血清培养基稀释2μl的Lipofectamine^TM2000（购自Invitrogen公司），室温孵育5分钟。将稀释的表达载体DNA和稀释的Lipofectamine^TM2000等体积混合，混匀后室温孵育20分钟。取出铺好的24孔培养板，弃原培养液，然后向每孔滴加600µl的转染混合物，混匀后将培养板放回培养箱内。培养6小时后，吸除旧培养液，每孔更换为500µl不含抗生素的1640完全培养液。转染后24小时，激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光，结果见附图3。当确定转染细胞有绿色荧光后，将细胞传代至6孔板。转染48小时后，弃原培养液，加入G418终浓度为400μg/ml的1640培养液。每天更换新鲜培养液，转染30天后将阳性细胞集落稀释为单细胞悬液，挑取阳性单细胞最终培养形成能够稳定表达GFP的阳性克隆。

本次转染分为五个组，其中实验组有三组，分别为A组：转染含有靶点序列ETV1A的pGenesil-ETV1A重组表达载体；B组：转染含有靶点序列ETV1B的pGenesil-ETV1B重组表达载体；C组：转染含有靶点序列ETV1C的pGenesil-ETV1C重组表达载体；阴性对照组为NC组：转染含有乱序序列的pGenesil-NC重组表达载体；转染空白对照组为BC组：转染空的siRNA表达载体pGenesil-1。

2、荧光定量PCR检测ER81基因mRNA表达

将上一步的A、B、C、NC、BC五个稳转细胞组和未做转染的MDA-MB-231细胞（为空白组）分别接种6孔板，当细胞长至对数生长期时，弃培养液离心收集细胞，用D-Hanks液重悬细胞沉淀。使用Trizol法提取细胞总RNA，提取的具体步骤参照分子克隆指南（第三版）。细胞总RNA提取电泳图见附图4。使用购自Fermentas公司的反转录试剂盒进行反转录，具体步骤参见说明书操作。用反转录产物进行荧光定量PCR，从而确定不同转染组中ER81基因的表达情况。引物ER81RTf：AACTGATTGAGCCTGAAG；ER81RTr：ATAGTAATAGCGGAGTGAAC；选择GAPDH作为内参基因，引物GAPDHRTf：TGACAACAGCCTCAAGAT；GAPDHRTr：GAGTCCTTCCACGATACC。反应体系和条件参见购自TAKARA公司的SYBRPremix Ex Taq^TM试剂盒说明书。

按以上六个组进行实验，每组设三个重复。荧光定量PCR结果显示引物扩增效率大致相同，可使用2^－△△Ct法对ER81基因和内参基因GAPDH的mRNA表达水平进行相对定量分析。其中△Ct=目的基因Ct值－GAPDH Ct值，△△Ct=实验组△Ct－空白组△Ct，实验组目的基因/空白组目的基因=2^－△△Ct。荧光定量PCR的结果表明与未转染的空白组相比，转染的空白对照组BC组和阴性对照NC组的ER81基因的mRNA表达无明显变化；转染的A组ER81基因的mRNA表达水平下降了80.1％（P＜0.05）；转染的B组和C组ER81基因的mRNA表达水平分别下降了31.0％和53.5％，但统计学分析无差异（P＞0.05）。结果表明靶点序列为ETV1A的转染A组能够明显抑制乳腺癌细胞ER81基因mRNA的表达，结果见图5。

3、Western Blot检测细胞ER81蛋白表达

在100ml培养瓶中分别培养正常MDA-MB-231细胞和A、B、C、NC、BC五个稳转细胞组。待细胞汇合率达到80-90％时，分别提取收集各组细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒（购自Thermo Scientific公司）测定蛋白含量。各组取50μg的总蛋白经12％的SDS-PAGE胶电泳分离后，用半干式电转的方法将蛋白质转移至硝酸纤维膜上，接着用含5％脱脂奶粉的封闭液室温封闭2小时。以抗ER81抗体（购自Santa Cruz公司）为一抗室温孵育2小时，再以Horseradish Peroxidase（HRP）标记的羊抗兔IgG（购自Santa Cruz公司）为二抗室温孵育2小时。最后化学增强发光法(ECL)显带，以GAPDH为内参对照，结果见图6。

由Western Blot结果可以看出，转染的空白对照组BC组和阴性对照NC组的ER81蛋白均有表达，且表达量与转染的空白组相比无明显变化；转染A组基本无条带，表明ER81蛋白几乎没有表达；转染的B组和C组与BC组和NC组相比较条带较弱，表明蛋白表达有所下降但未被完全抑制。结果表明靶点序列为ETV1A的转染A组，几乎能够完全抑制ER81蛋白的表达，相对于转染B组和C组抑制效果显著。

4、MTT法绘制细胞生长曲线

将以上A、B、C、NC、BC五个稳转细胞组和正常MDA-MB-231细胞制成单细胞悬液，以每孔2×10³个细胞接种于96孔板，每孔体积200μl。同时设置未加细胞只加培养液的调零孔，每组每个检测时间点设3个复孔。每天更换一次培养液，连续培养7天。每孔加入20μlMTT（5mg/ml）溶液继续孵育4小时，终止培养，弃上清，每孔加入150μl的DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶标仪于490nm处检测吸光值，每24小时检测一次。以培养时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制各组细胞的生长曲线，结果见图7。

由绘制的生长曲线可以看出转染A组接种3天后，吸光度较未转染的空白组显著降低（P＜0.01）；B组在接种5天以后，吸光度较未转染的空白组降低（P＜0.05）；C组在接种4天后吸光度较未转染的空白组降低（P＜0.05）；而NC组、BC组较未转染的空白组之间吸光度无显著性差异（P＞0.05），说明转染入细胞的重组质粒对乳腺癌细胞的生长无明显影响。结果表明转染后的A、B、C组对乳腺癌细胞MDA-MB-231均有生长抑制作用，其中A组的抑制细胞作用更为明显，B组、C组的抑制作用相对较弱，而NC组和BC组基本没有生长抑制现象。

5、细胞增殖能力的检测

克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续分裂增殖 6 次以上，其后代所组成的细胞群体，称为克隆或集落。一般情况下，每个克隆可含有 50 个以上的细胞，大小在 0.3～1.0mm²之间。通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖能力做定量分析。本次实验细胞包括正常MDA-MB-231细胞及A、B、C、NC、BC五个稳转细胞组。使用0.25％的胰蛋白酶消化6孔板中处于对数生长期的贴壁生长细胞，用含20%胎牛血清（购自Gibco公司）的RPMI 1640（购自Hyclone公司）培养液悬浮细胞制成单细胞悬液，分别以250、500个细胞的密度梯度接种于6孔板，每个样品设3个重复，培养2周，当出现肉眼可见的克隆时终止培养。用PBS缓冲液漂洗细胞，甲醇固定，吉姆萨染液染色后，显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，计算克隆形成率。分析比较转染不同重组siRNA表达载体后表达的siRNA对细胞增殖能力的影响。

将6组细胞分别接种至6孔板培养2周后均有克隆形成，其中转染A组的克隆形成率为5.93％，转染B组和C组的克隆形成率分别为20.5％和13.8％，均小于对照组（P＜0.01）。转染的NC组、BC组以及未转染的空白组的克隆形成率分别为32.8％、30.9％和31.2％。结果表明转染A组、B组和C组均降低了乳腺癌细胞MDA-MB-231的克隆形成能力，细胞增殖活性受到抑制，但A组相较于B组和C组抑制作用更加明显，结果见附图8。

克隆形成率（％）=克隆数/接种数×100％

6、流式细胞术对细胞周期的检测

通过流式细胞术碘化丙啶PI（购自Beckman公司）染色法检测细胞内DNA含量，将不同细胞周期时相区分为G1/G0期，S期，G2/M期，通过专业软件计算各时相的百分率。取以上A、B、C、NC、BC五个稳转细胞组和正常MDA-MB-231细胞。培养48h后使用0.25％胰蛋白酶消化细胞，并吹打成单细胞悬液。每个实验组取1×10⁶个细胞，经4℃预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，用预冷的75%乙醇4℃固定细胞过夜，再次使用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，离心弃上清。用0.5ml预冷的PBS重悬细胞，加入3000U的RNaseA，37℃水浴30分钟。冰浴终止RNaseA作用后，加入PI染液0.5ml对细胞进行避光染色30 min。使用流式细胞仪检测细胞PI荧光信号，其中激发光波长为488 nm，发射光波长为620 nm，每个样品收集多于10000个荧光信号。使用MultiCycle DNA软件分析细胞荧光强度、细胞周期分布，并计算细胞增殖指数。分析比较转染不同重组siRNA表达载体后表达的siRNA对细胞周期分布的影响。

经过流式细胞仪检测转染A组的细胞，G0/G1期细胞比例增高，另一方面S期和G2/M期细胞比例降低，细胞的增殖指数明显降低，增殖指数较转染的NC组、BC组和未转染的空白组低（P＜0.01）。转染B组和C组的细胞，G0/G1期细胞比例也有所增高，S期和G2/M期细胞比例略有降低，细胞的增殖指数也有所降低，增殖指数较转染的NC组、BC组和未转染的空白组低，但无统计学差异（P＞0.05）。结果表明相比对照组，A组细胞出现G0/G1期部分阻滞，细胞增殖指数明显下降（P＜0.01）。细胞周期分布结果见附图9，细胞增殖指数结果见附图10。

增殖指数（Proliferation Index）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100％

7、流式细胞术对细胞凋亡的检测

本实验采用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)双染的方法对凋亡细胞进行检测。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。Hoechst 33342可以穿透细胞膜，染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。碘化丙啶（PI）不能穿透细胞膜，对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，碘化丙啶(PI)可以染色坏死细胞。根据这些特性，上述两种染料双染后，使用流式细胞仪就能将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡细胞为高蓝色/低红色（Hoechst33342++/PI+），坏死细胞为低蓝色/高红色（Hoechst 33342+/PI++）。

本次实验使用Invitrogen公司的Chromatin Condensation/Dead CellApoptosis Kit with Hoechst 33342 and PI for Flow Cytometry试剂盒。培养以上A、B、C、NC、BC五个稳转细胞组和正常MDA-MB-231细胞。每组收集1×10⁶个细胞于1.5ml离心管，1ml预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，离心弃上清，最后用1ml的PBS缓冲液重悬细胞沉淀。加入1μl的Hoechst染色液，再加入1μl PI染色液。轻轻避光混匀，冰上孵育30分钟。流式细胞仪分析：Heochst 33342 的激发光波长为352nm，发射波长为400 ~ 500nm，产生蓝色荧光；PI 用的激发光波波长为488nm，发射光波长大于630nm，产生红色荧光。通过分析蓝色荧光对红色荧光的散点图，分析比较转染不同重组siRNA表达载体后表达的siRNA对细胞凋亡的促进作用。

通过流式细胞术检测转染A组、B组、C组、NC组、BC组和未转染的空白组MDA-MB-231细胞凋亡情况，结果进行组间比较细胞凋亡率有统计学意义（P＜0.05）。经两两比较显示转染A组细胞凋亡率均高于其他五组（P＜0.05），转染B组和C组细胞凋亡率均高于转染NC组、BC组和未转染的空白组（P＜0.05）。结果表明转染A组表达的siRNA能够明显促进细胞凋亡，促进细胞凋亡的能力强于转染B组和C组，结果见附图11。

SEQUENCE LISTING

<110> 杨举伦

<120> 抑制ER81基因表达的siRNA及其在乳腺癌细胞中的应用

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

guugguacau aggacgucc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggacgtccta tgtaccaac 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggcgaggat cacttcagc 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacagacatg gaacgtcac 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacttcataa ggcgcatgc 19

<210> 6

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttcaagaga 9

<210> 7

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tttttt 6

<210> 8

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatcccggac gtcctatgta ccaacttcaa gagagttggt acataggacg tccttttttg 60

tcgaca 66

<210> 9

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agcttgtcga caaaaaagga cgtcctatgt accaactctc ttgaagttgg tacataggac 60

gtccgg 66

<210> 10

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gatcccgcgg cgaggatcac ttcagcttca agagagctga agtgatcctc gccgtttttt 60

gtcgaca 67

<210> 11

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agcttgtcga caaaaaacgg cgaggatcac ttcagctctc ttgaagctga agtgatcctc 60

gccgcgg 67

<210> 12

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gatcccgaca gacatggaac gtcacttcaa gagagtgacg ttccatgtct gtcttttttg 60

tcgaca 66

<210> 13

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

agcttgtcga caaaaaagac agacatggaa cgtcactctc ttgaagtgac gttccatgtc 60

tgtcgg 66

<210> 14

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gatcccgact tcataaggcg catgcttcaa gagagcatgc gccttatgaa gtcttttttg 60

tcgaca 66

<210> 15

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agcttgtcga caaaaaagac ttcataaggc gcatgctctc ttgaagcatg cgccttatga 60

agtcgg 66

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aactgattga gcctgaag 18

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atagtaatag cggagtgaac 20

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tgacaacagc ctcaagat 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gagtccttcc acgatacc 18

Claims

1.一种抑制ER81基因表达的siRNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于该siRNA是通过如SEQ ID NO：8所示的DNA寡核苷酸链转录并在细胞内由核酸酶Dicer剪切而成。

3.权利要求1所述的siRNA在制备抑制癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡相关药物中的应用。

4.根据权利要求3所述siRNA在制备抑制癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡相关药物中的应用，其特征在于：所述癌细胞为乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞株。