CN101569750A - PDK1-siRNA融合表达载体的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了PDK1－siRNA融合表达载体的用途，属于生物制药领域。本发明经实验证明PDK1－siRNA融合表达载体转染人乳腺癌细胞系后，能特异地降解与其互补的PDK1 mRNA，降低人乳腺癌细胞中PDK1的表达，而且可以有效地抑制人乳腺癌细胞的趋化运动和黏附能力，具有抑制人乳腺癌细胞转移扩散的作用，提供了在制备抑制人乳腺癌细胞转移药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体是用于抑制肿瘤细胞的转移扩散的PDK1-siRNA融合表达载体的用途。
背景技术
内源性或外源性双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的序列特异的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)，这是生物体内抵御转座子和病毒感染的重要保护机制，也是生长发育过程中调节内源基因表达的重要途径。RNAi被发现不到10年的时间，由于其高效性和高度特异性，成为颇为理想的细胞水平基因敲除工具，并迅速成为后基因组时代功能基因组学研究中不可或缺的重要手段。新近的RNAi技术，是利用DNA载体直接在体内表达短发夹状RNA(shRNA)，特异性封闭相应的靶基因mRNA，抑制mRNA的翻译。与早期的RNA干扰技术相比，该方法的特异性和干扰效率均有较大提高，已广泛应用于多种研究领域。利用RNAi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这些基因保持在沉默或休眠状态，从而使肿瘤细胞增殖速度减慢，凋亡加快，显示了RNAi技术用于肿瘤基因治疗的可行性和有效性。RNAi过程中，由双链RNA分子加工而成的19-23个核苷酸的RNAs就称为siRNA，是诱导基因沉默的第一步，它与RNAi特异性酶结合，形成沉默复合物，特异降解与siRNA同源的靶mRNA。
扩散转移是恶性肿瘤的一个重要特征，也是导致恶性肿瘤患者低治愈率、高死亡率的重要原因，它的发生取决于肿瘤细胞的生物学特征、宿主微环境及两者相互作用的时空关系。趋化因子及其受体能够直接或间接的影响着肿瘤细胞的运动、增殖、凋亡、侵袭，细胞间相互粘连，瘤细胞与基质的相互作用，肿瘤血管形成等，在肿瘤的扩散转移过程中发挥着重要作用。因此，阻断肿瘤细胞的趋化运动可以有效地控制肿瘤转移。
3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(Phosphoinositide-dependent kinase1，PDK1)是1997年被发现的一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是EGFR下游的重要信号分子，它可以通过磷化某个苏氨酸位点激活很多下游的信号分子，如Akt、PKC(Protein kinase C)zeta、PKA(Protein kinase A)、S6K(p70ribosomal S6 kinase)、SGK(serum-and glucocorticoid-stimulatedprotein kinase)、RSK(p90 ribosomal S6 kinase)等。PDK1和这些下游底物均属于AGC超家族中的成员。PDK1下游的这些激酶参与了很多细胞生理过程，使得PDK1在细胞生长和增殖、细胞迁移、细胞周期、蛋白合成、糖原合成、细胞分化、细胞存活及细胞骨架重排中发挥着不可磨灭的作用。另有研究表明，在乳腺癌细胞特别是高转移性的乳腺癌细胞中PDK1的表达水平都有所升高。由此可见，PDK1生物学特性在肿瘤增值和转移过程中起到重要作用。
发明内容
本发明就是为了解决乳腺癌病人癌细胞转移扩散问题，而提供一种PDK1-siRNA融合表达载体在制备抑制人乳腺癌细胞转移药物中的应用。
本发明针对PDK1这一靶点设计出能降低其蛋白表达的siRNA序列，构建并制备其融合表达载体，进而从体外细胞培养、动物实验两个层次表明：降低PDK1的表达可以有效地抑制EGF诱导的乳腺癌细胞的趋化运动，抑制肿瘤细胞转移扩散。
通过siRNA基因敲除技术可以靶向抑制PDK1的表达，并对PDK1所参与的细胞迁移功能产生抑制作用，为肿瘤的基因治疗提供了一种可行的技术手段。
本发明采用的技术方案是：设计针对PDK1的siRNA片段，制备PDK1-siRNA融合表达载体，将其转染到乳腺癌细胞株MDA-MB-231中，用免疫印迹等方法检测到细胞中PDK1的表达水平降低；转染后的细胞株进行一系列细胞功能实验，确定PDK1-siRNA融合载体能够降低瘤细胞的迁移能力和EGF诱导的黏附能力、抑制趋化运动所需的PDK1的活化；将转染后的去基因细胞株与作为对照的野生型癌细胞株植入实验小鼠体内，直接比较肿瘤的生长和扩散率，检测癌细胞的体内转移情况，进一步证实PDK1-siRNA融合表达载体能够抑制肿瘤转移扩散。
应用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒提取纯化PDK1-siRNA融合表达载体质粒，确保无内毒素污染，用无RNA酶水溶解载体，终浓度为10μg/μl，-80℃冻存，备用。
从而实现PDK1-siRNA融合表达载体在制备抑制人乳腺癌细胞转移药物中的应用。
本发明的有益效果：
1、PDK1-siRNA融合表达载体能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外粘附能力，并抑制该细胞的体外转移与扩散。
2、PDK1-siRNA融合表达载体能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞在小鼠体内的转移与扩散。
3、综合上述结果，本发明提供了PDK1-siRNA融合表达载体在抑制人乳腺癌细胞移动侵袭方面的药物用途，可用于治疗肿瘤病人，抑制肿瘤转移扩散。
附图说明
图1是用免疫印迹的方法检测细胞中PDK1蛋白表达水平；
图2是不同浓度的化诱因子EGF对各组细胞的趋化指数统计图；
图3是对照细胞和PDK1降表达细胞在EGF刺激后的细胞黏附数目图；
图4a是注射对照细胞的荧光显微镜下小鼠肺部瘤组织图片；
图4b是注射PDK1降表达细胞的荧光显微镜下小鼠肺部瘤组织图片；
图5a是注射对照细胞组小鼠肺内GFP抗体免疫组化结果图；
图5b是注射PDK1降表达细胞组小鼠肺内GFP抗体免疫组化结果图；
图6是各组小鼠肺叶的人HPRT基因的RT-PCR结果。
具体实施方式
一.实验材料来源：
人乳腺癌MDA-231细胞由美国国家癌症研究所Dr.Joost J.Oppenheim赠送；趋化小室购自Neuro Probe公司；EGF购自Peprotech公司；0.01％Fibronectin来自Sigma公司；PDK1抗体购自BDTransduction(San Jose，CA)。
二.Akt2-siRNA的设计与合成
依据Ambion公司在网上提供的设计软件(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)选择siRNA序列，合成以下PDK1特异的siRNA：
1、5’-GGATCCCAAGAAGGATACGGACCTCTTAAATTCAAGAGA TTTAAGAGG TCCGTATCCTTCTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’，
其作用位点：AF017995(1071-1091)；
2、5’-GGATCCCAACACGCCTAACAGGACGTATTATTCAAGAGATAATACGTCCTGTTAGGCGTGTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’，
其作用位点：AF017995(1631-1651)。
三.PDK1-siRNA融合表达载体的制备
表达载体pRNAT-U6.1/Hygro其结构为线性，两端分别为BamHI和HindIII酶切位点的粘性末端。将合成的PDK1-siRNA模板退火，连接酶作用下连入pRNAT-U6.1/Hygro质粒载体中，转染感受态大肠杆菌DH5α，铺平板过夜培养。挑取转化菌扩增培养提取质粒，酶切测序验证插入序列。应用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒提取纯化PDK1-siRNA融合表达载体质粒，确保无内毒素污染，用无RNA酶水溶解载体，终浓度为10μg/μl，-80℃冻存。
阴性对照Control-siRNA载体由试剂盒提供，含有一段与人类已知基因均不同源的siRNA。
四.融合表达载体转染乳腺癌细胞
用800μl低渗液将20μg融合表达载体与1×106细胞混合，采用1000v电压电转100μs，静置5min，传入96孔板，5％CO2温箱孵育24h。添加0.8mg/ml Hygromycin B压力筛选至非转染对照组细胞完全死亡，约20d，将表达GFP的单克隆挑出扩大培养。
结果表明得到5个稳定克隆，其编号分别为52、60、63、97、99。
五.检测转染后细胞中PDK1的表达水平
定量PCR检测PDK1的表达水平：将对照细胞和PDK1-siRNA转染的细胞(52、60、63、97、99)，用Trizol试剂提取细胞的总RNA，电泳检测质量，紫外分光定量。以相同量RNA作为起始模板，逆转录反应合成cDNA。用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒在定量PCR仪GeneAmp 5700上进行实时定量PCR，反应体系为95℃预变性15min，94℃变性15s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次。用SDS Software及琼脂糖凝胶电泳分析结果。
免疫印迹的方法检测PDK1的表达水平：将对照细胞和PDK1-siRNA转染的细胞(52、60、63、97、99)预留足够数量至离心管中，离心后裂解细胞，煮样，超声，再离心。制得样品后，使用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。根据样品的浓度，取相同的蛋白总量进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将胶上蛋白电转到PVDF膜上，室温牛奶封闭2小时。简单洗涤后，一抗(鼠抗人PDK1单克隆抗体)室温孵育2小时。然后用抗鼠的二抗室温孵育1小时。最后用化学发光试剂盒检测。根据曝光后条带的宽窄和深浅判断蛋白的表达量。每个克隆至少通过3次免疫印迹进行检测。
通过定量PCR和免疫印迹的方法证明：与对照细胞相比，克隆52、60、63、97、99中的PDK1的mRNA和蛋白表达量均有明显降低(参见图1)。
六.检测转染细胞趋化运动能力
将不同浓度的化诱因子EGF(0，1，10，100ng/ml)加到趋化小室下层板的孔中，上层小室分别加克隆52、60、63、97、99细胞(浓度5×105cells/ml)及对照细胞，滤膜浸于含有浓度为10μg/ml纤连蛋白的无血清培养基中，4℃过夜，室温风干，用滤膜分隔上下小室。孵育后去除膜上层非特异趋化的细胞后，将膜固定、Diff-Quick染色后显微镜下计数趋化细胞数(400×视野)。样品孔与对照孔的趋化细胞数的比率即为趋化指数。统计分析采用方差分析，每孔取随机3个视野的总和作为该孔的趋化细胞数。结果用3个孔的平均趋化指数±标准差(Mean±SD)表示，每个实验至少重复3次。
如图2所示，表皮生长因子EGF能够以剂量依赖方式诱导MDA-MB-231细胞即Scramble细胞的趋化运动，趋化指数均在10以上，但跑得快降表达的细胞受EGF诱导的趋化运动指数都在4左右。表明PDK1-siRNA融合表达载体能够使乳腺癌细胞对EGF诱导的趋化运动能力减弱。
七.检测转染细胞的黏附能力
将对照细胞和PDK1降表达的乳腺癌细胞(浓度为2.7×105cells/ml)重悬于完全培养基中，37℃、5％CO2孵育20min。每种细胞分为两组，第一组细胞悬液直接滴到预先包被了fibronectin的盖玻片中央，37℃分别孵育5min、15min，然后用冷的PBS终止，并简单洗涤两次，用4％PFA固定；另一组细胞悬液在滴到玻片之前加入终浓度为10ng/ml的EGF，随后的操作步骤与第一组相同。在显微镜下计数黏附细胞数(200×视野)，作抑制分析时，先对MDA-MB-231细胞做了预处理，将其置于适当浓度的抑制因子中37℃孵育60min。每个玻片随机计数5个视野，结果用5个视野的平均数±标准差(Mean±SD)表示。每个实验至少重复3次。
结果：图3所示对照细胞在EGF刺激后的细胞黏附数目约为未受刺激时的4倍左右，但PDK1降表达的细胞在EGF刺激前后黏附细胞的数目增加不多。用此SiRNA序列干扰PDK1的表达使肿瘤细胞的黏附能力下降。
八.检测转染细胞的转移扩散能力
将对照细胞和PDK1降表达的乳腺癌细胞分别通过尾静脉注射到严重免疫缺陷(SCID)小鼠体内，每只小鼠注射1×106细胞。28天后，取出小鼠的肺，制成组织切片，在荧光显微镜下直接观察瘤块。另留一部分肺组织用于RNA提取、RT-PCR实验(用HPRT引物)。依据经验确定循环扩增的次数，尽量放大PDK1-siRNA细胞和对照组细胞之间的差别，一般为25次。35天后处死接种癌细胞的SCID小鼠，取其肺组织做免疫组化分析，用石蜡包埋切片，标记兔抗人GFP多克隆抗体，二抗用Alex546标记的抗兔血清，在荧光显微镜下观察图象，每五只小鼠为一组数据。
荧光显微镜观察结果显示(图4a、图4b)：注射了对照细胞的小鼠肺部的瘤块数目明显多于注射PDK1-siRNA融合表达载体转染过细胞的小鼠。免疫组化结果(图5a、图5b)显示：注射对照细胞组小鼠肺内GFP抗体染色明显。肺叶的RT-PCR的结果(图6)显示：注射了对照细胞的小鼠可以逆转录扩增出人的基因HPRT，且条带清晰；但注射了PDK1-siRNA融合表达载体转染过细胞的小鼠却没有扩增出明显条带。荧光显微镜观察结果和RT-PCR的结果都充分说明对照乳腺癌细胞可以通过尾静脉注射的方法向趋化细胞数。结果用3个孔的平均趋化指数±标准差(Mean±SD)表示，每个实验至少重复3次。
如图2所示，表皮生长因子EGF能够以剂量依赖方式诱导MDA-MB-231细胞即Scramble细胞的趋化运动，趋化指数均在10以上，但跑得快降表达的细胞受EGF诱导的趋化运动指数都在4左右。表明PDK1-siRNA融合表达载体能够使乳腺癌细胞对EGF诱导的趋化运动能力减弱。
七.检测转染细胞的黏附能力
将对照细胞和PDK1降表达的乳腺癌细胞(浓度为2.7×105cells/ml)重悬于完全培养基中，37℃、5％CO2孵育20min。每种细胞分为两组，第一组细胞悬液直接滴到预先包被了fibronectin的盖玻片中央，37℃分别孵育5min、15min，然后用冷的PBS终止，并简单洗涤两次，用4％PFA固定；另一组细胞悬液在滴到玻片之前加入终浓度为10ng/ml的EGF，随后的操作步骤与第一组相同。在显微镜下计数黏附细胞数(200×视野)，作抑制分析时，先对MDA-MB-231细胞做了预处理，将其置于适当浓度的抑制因子中37℃孵育60min。每个玻片随机计数5个视野，结果用5个视野的平均数±标准差(Mean±SD)表示。每个实验至少重复3次。
结果：图3所示对照细胞在EGF刺激后的细胞黏附数目约为未受刺激时的4倍左右，但PDK1降表达的细胞在EGF刺激前后黏附细胞的数目增加不多。用此SiRNA序列干扰PDK1的表达使肿瘤细胞的黏附能力下降。
八.检测转染细胞的转移扩散能力
将对照细胞和PDK1降表达的乳腺癌细胞分别通过尾静脉注射到严重免疫缺陷(SCID)小鼠体内，每只小鼠注射1×106细胞。28天后，取出小鼠的肺，制成组织切片，在荧光显微镜下直接观察瘤块。另留一部分肺组织用于RNA提取、RT-PCR实验(用HPRT引物)。依据经验确定循环扩增的次数，尽量放大PDK1-siRNA细胞和对照组细胞之间的差别，一般为25次。35天后处死接种癌细胞的SCID小鼠，取其肺组织做免疫组化分析，用石蜡包埋切片，标记兔抗人GFP多克隆抗体，二抗用Alex546标记的抗兔血清，在荧光显微镜下观察图象，每五只小鼠为一组数据。
荧光显微镜观察结果显示(图4a、图4b)：注射了对照细胞的小鼠肺部的瘤块数目明显多于注射PDK1-siRNA融合表达载体转染过细胞的小鼠。免疫组化结果(图5a、图5b)显示：注射对照细胞组小鼠肺内GFP抗体染色明显。肺叶的RT-PCR的结果(图6)显示：注射了对照细胞的小鼠可以逆转录扩增出人的基因HPRT，且条带清晰；但注射了PDK1-siRNA融合表达载体转染过细胞的小鼠却没有扩增出明显条带。荧光显微镜观察结果和RT-PCR的结果都充分说明对照乳腺癌细胞可以通过尾静脉注射的方法向肺部发生转移和扩散，但PDK1-siRNA融合表达载体转染过的PDK1降表达的乳腺癌细胞，其转移扩散能力明显减弱。
SEQUENCE LISTING
<110>天津医科大学附属肿瘤医院
<120>PDK1-siRNA融合表达载体的用途
<130>DNA
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
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Claims (1)
1.PDK1-siRNA融合表达载体在制备抑制人乳腺癌细胞转移药物中的应用。
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| CNA2008100529645A CN101569750A (zh) | 2008-04-30 | 2008-04-30 | PDK1-siRNA融合表达载体的用途 |
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|---|---|
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ID=41229318
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|---|---|
| CN (1) | CN101569750A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103923925A (zh) * | 2014-05-07 | 2014-07-16 | 杨举伦 | 抑制ER81基因表达的siRNA及其在乳腺癌细胞中的应用 |
| CN105899662A (zh) * | 2013-10-22 | 2016-08-24 | 西伦蒂斯私人股份公司 | siRNA及其在用于抑制PDK1基因表达的方法和组合物中的应用 |
-
2008
- 2008-04-30 CN CNA2008100529645A patent/CN101569750A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105899662A (zh) * | 2013-10-22 | 2016-08-24 | 西伦蒂斯私人股份公司 | siRNA及其在用于抑制PDK1基因表达的方法和组合物中的应用 |
| CN103923925A (zh) * | 2014-05-07 | 2014-07-16 | 杨举伦 | 抑制ER81基因表达的siRNA及其在乳腺癌细胞中的应用 |
| CN103923925B (zh) * | 2014-05-07 | 2016-06-08 | 杨举伦 | 抑制ER81基因表达的siRNA及其在乳腺癌细胞中的应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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Open date: 20091104 |