CN101570751A - PDK1-siRNA序列及其融合表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了PDK1-siRNA序列及其融合表达载体,属于生物技术领域。该序列与PDK1 mRNA互补;具有降低PKD1蛋白表达的功能。其核酸序列为:GAAGGATACGGACCTCTTAAA和CACGCCTAACAGGACGTATTA。PDK1-siRNA融合表达载体是由合成的抑制PDK1基因表达的siRNA序列模板与pRNAT-U6.1/Hygro载体相连接而成,将其转染MDA-MB-231细胞后能够特异降解与siRNA同源的PDK1的mRNA,抑制PDK1蛋白表达,为进一步研究PKD1基因在肿瘤中的生物学功能提供了可行的手段。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体是两段能抑制人PDK1基因表达的PDK1-siRNA序列及其融合表达载体。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是多数真核细胞本身固有的一种自我保护现象,既能对抗如病毒基因或人工转基因所表达的mRNA等外源基因的侵害,又能降解自身异常基因产生的mRNA。以基因转录后沉默的方式或诱导DNA甲基化的方式对含有其同源序列的基因表达进行干涉。
近年来,人们利用这一现象针对要研究的基因表达进行阻断,从而产生相应的功能缺失表型,形成RNAi技术。新近的RNAi技术,是利用DNA表达载体直接在体内表达短发夹状RNA(shRNA),特异性封闭相应的靶基因mRNA,抑制mRNA的翻译。这与早期的RNA干扰技术相比,该方法的特异性和干扰效率均有较大提高,已广泛应用于多种研究领域。
3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(Phosphoinositide-dependent kinase1,PDK1)是1997年被发现的一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,是EGFR下游的重要信号分子,它可以通过磷化某个苏氨酸位点激活很多下游的信号分子,如Akt、PKC(Protein kinase C)zeta、PKA(Protein kinase A)、S6K(p70 ribosomal S6 kinase)、SGK(serum-andglucocorticoid-stimulated protein kinase)、RSK(p90 ribosomal S6kinase)等。PDK1和这些下游底物均属于AGC超家族中的成员。PDK1下游的这些激酶参与了很多细胞生理过程,使得PDK1在细胞生长和增殖、细胞迁移、细胞周期、蛋白合成、糖原合成、细胞分化、细胞存活及细胞骨架重排中发挥着不可磨灭的作用。此外,在乳腺癌细胞特别是高转移性的乳腺癌细胞中PDK1的表达水平都有所升高。由此可见,PDK1生物学特性在肿瘤增值和转移过程中起到重要作用。
发明内容
本发明是为进一步研究PDK1在肿瘤发生发展中的作用,以及为PDK1为靶点的肿瘤的基因治疗提供了一个新的技术手段,而提供了两段抑制人PDK1基因表达的PDK1-siRNA序列及其融合表达载体。
本发明通过基因敲除技术,即siRNA方法抑制PDK1的表达。利用RNAi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达,使这些基因保持在沉默或休眠状态,从而使肿瘤细胞增殖速度减慢,凋亡加快,显示了RNAi技术用于肿瘤基因治疗的可行性和有效性。RNAi过程中,由双链RNA分子加工而成的19-23个核苷酸的RNAs就称为siRNA,是诱导基因沉默的第一步,它与RNAi特异性酶结合,形成沉默复合物,特异降解与siRNA同源的靶mRNA。
PDK1-siRNA序列,该序列与PDK1 mRNA互补;具有抑制人PKD1蛋白表达的功能,
其核酸序列如下:
5’-GAAGGATACGGACCTCTTAAA-3’,
其作用位点AF017995(1071-1091);
5’-CACGCCTAACAGGACGTATTA-3’,
其作用位点AF017995(1631-1651)。
一种PDK1-siRNA融合表达载体,该融合表达载体是由合成的抑制人PDK1基因表达的siRNA序列模板与pRNAT-U6.1/Hygro载体相连接而成,将其转染MDA-MB-231细胞后能够特异降解与siRNA同源的PDK1的mRNA,抑制PDK1蛋白表达,
其中合成人PDK1基因表达的siRNA序列模板的核酸序列模板为:两端带有酶切位点,3’端为HindIII,5’端为BamH I,合成抑制人PDK1基因表达的siRNA序列模板的核酸序列如下:
5’-GGATCCCAAGAAGGATACGGACCTCTTAAATTCAAGAGA
TTTAAGAGGTCCGTATCCTTCTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’;
5’-GGATCCCAACACGCCTAACAGGACGTATTATTCAAGAGA
TAATACGTCCTGTTAGGCGTGTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’。
本发明通过脂质体将融合载体转入MDA-MB-231人乳腺癌细胞系中,以control-siRNA作为对照,通过潮霉素压力筛选得到稳定细胞株,用RT-PCR、Western Blot方法检测细胞的PDK1表达水平。
结果表明:表达PDK1-siRNA作用的细胞其PDK1的合成明显降低,与对照组相比具有显著差异(P<0.05)。
本发明设计的PDK1-siRNA序列及融合表达载体能够在人乳腺癌细胞中表达特定的siRNA,并能够有效地抑制人PDK1的基因表达,为进一步研究PDK1基因在肿瘤中的生物学功能提供了可行的手段。
这样设计的本发明为进一步研究PDK1在肿瘤发生发展中的作用以及为以PDK1为靶点的肿瘤基因治疗提供了一个新的技术手段。
附图说明
附图是转染PDK1-siRNA融合载体后细胞PDK1蛋白和mRN A表达量。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
一.实验材料来源:
人乳腺癌MDA-231细胞由美国国家癌症研究所Dr.Joost J.Oppenheim赠送;pRNAT-U6.1/Hygro质粒购自GenScript公司;Hygromysin来自Invitrogen。PDK1抗体购自BD Transduction(SanJose,CA)。
二.实施方法:
1.PDK1-siRNA的设计
依据Ambion公司在网上提供的设计软件
(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)选择siRNA序列,合成以下PDK1特异的siRNA:
5’-GGATCCCAAGAAGGATACGGACCTCTTAAATTCAAGAGA
TTTAAGAGG TCCGTATCCTTCTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’,
其作用位点:AF017995(1071-1091);
5’-GGATCCCAACACGCCTAACAGGACGTATTATTCAAGAGA
TAATACGTCCTGTTAGGCGTGTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’,
其作用位点:AF017995(1631-1651)。
2.PDK1-siRNA融合表达载体构建
表达载体pRNAT-U6.1/Hygro其结构为线性,两端分别为BamHI和HindIII酶切位点的粘性末端。将合成的PDK1-siRNA模板退火,连入pRNAT-U6.1/Hygro质粒载体中,转染感受态大肠杆菌DH5α,铺平板过夜培养。挑取转化菌扩增培养提取质粒,酶切测序验证插入序列。
阴性对照Control-siRNA载体由试剂盒提供,含有一段与人类已知基因均不同源的siRNA。
3.融合表达载体转染乳腺癌细胞株
应用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒提取纯化质粒,用800μl低渗液将20μg重组质粒与1×106细胞混合,采用1000v电压电转100μs,静置5min,传入96孔板,5%CO2温箱孵育24h。添加0.8mg/ml HygromycinB压力筛选至非转染对照组细胞完全死亡,约20d,将表达GFP的单克隆挑出扩大培养。
结果表明得到5个稳定克隆,其编号分别为52、60、63、97、99.
4.检测转染后细胞中PDK1的表达水平
定量PCR检测Akt2的表达水平:将对照细胞和Akt2-siRNA转染的细胞(52、60、63、97、99),用Trizol试剂提取细胞的总RNA,电泳检测质量,紫外分光定量。以相同量RNA作为起始模板,逆转录反应合成cDNA。用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒在定量PCR仪GeneAmp 5700上进行实时定量PCR,反应体系为95℃预变性15min,94℃变性15s,50℃退火30s,72℃延伸30s,循环40次。用SDS Software及琼脂糖凝胶电泳分析结果。
免疫印迹的方法检测PDK1的表达水平:将对照细胞和PDK1-siRNA转染的细胞(52、60、63、97、99)预留足够数量至离心管中,离心后裂解细胞,煮样,超声,再离心。制得样品后,使用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。根据样品的浓度,取相同的蛋白总量进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后,将胶上蛋白电转到PVDF膜上,室温牛奶封闭2小时。简单洗涤后,一抗(鼠抗人PDK1单克隆抗体)室温孵育2小时。然后用抗鼠的二抗室温孵育1小时。最后用化学发光试剂盒检测。根据曝光后条带的宽窄和深浅判断蛋白的表达量。每个克隆至少通过3次免疫印迹进行检测。
如图1所示,PDK1-siRNA融合表达载体转染入乳腺癌细胞,通过定量PCR和免疫印迹的方法证明:与对照细胞相比,克隆52、60、63、97、99中的PDK1表达量均有所降低。
SEQUENCE LISTING
<110>天津医科大学附属肿瘤医院
<120>PDK1-siRNA序列及其融合表达载体
<130>DNA
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>1
gaaggatacg gacctcttaa a 21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<220>
<221>2
<222>(1)..(21)
<223>
<400>1
cacgcctaac aggacgtatt a 21
<210>3
<211>78
<212>DNA
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<220>
<221>3
<222>(1)..(78)
<223>
<400>1
ggatcccaag aaggatacgg acctcttaaa ttcaagagat ttaagaggtc cgtatccttc 60
ttttttttcc aaaagctt 78
<210>4
<211>78
<212>DNA
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<220>
<221>4
<222>(1)..(78)
<223>
<400>1
ggatcccaac acgcctaaca ggacgtatta ttcaagagat aatacgtcct gttaggcgtg 60
ttttttttcc aaaagctt 78
Claims (2)
1.PDK1-siRNA序列,其特征是:该序列与PDK1 mRNA互补;具有抑制人PKD1蛋白表达的功能,其核酸序列分别如下:
5’-GAAGGATACGGACCTCTTAAA-3’,其作用位点:AF017995(1071-1091);
5’-CACGCCTAACAGGACGTATTA-3’,其作用位点:AF017995(1631-1651)。
2.一种PDK1-siRNA融合表达载体,其特征在于:该融合表达载体是由合成的抑制人PDK1基因表达的siRNA序列模板与pRNAT-U6.1/Hygro载体相连接而成,将其转染MDA-MB-231细胞后能够特异降解与siRNA同源的PDK1的mRNA,抑制PDK1蛋白表达,
其中合成人PDK1基因表达的siRNA序列模板的核酸序列模板为:两端带有酶切位点,3’端为HindIII,5’端为BamH I,合成抑制人PDK1基因表达的siRNA序列模板的核酸序列如下:
5’-GGATCCCAAGAAGGATACGGACCTCTTAAATTCAAGAGA
TTTAAGAGG TCCGTATCCTTCTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’;
5’-GGATCCCAACACGCCTAACAGGACGTATTATTCAAGAGA
TAATACGTCCTGTTAGGCGTGTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’。
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---|---|---|---|---|
CN105899662A (zh) * | 2013-10-22 | 2016-08-24 | 西伦蒂斯私人股份公司 | siRNA及其在用于抑制PDK1基因表达的方法和组合物中的应用 |
CN116908457A (zh) * | 2023-09-01 | 2023-10-20 | 潍坊医学院 | Tns2在制备上皮性卵巢癌早期诊断及治疗试剂盒和药物中的应用 |
CN117431246A (zh) * | 2023-11-16 | 2024-01-23 | 江苏省家禽科学研究所 | 一种抑制鸡丙酮酸脱氢酶激酶1基因PDK1表达的siRNA及其应用 |
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2008
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20091104 |