CN106215189A - 人微RNA miR‑185在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人微RNA（microRNAs）miR‑185在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用。所述miR‑185可以直接作用于人端粒蛋白POT1的信使RNA（mRNA）的3’‑非翻译区（3’UTR），抑制POT1的mRNA和蛋白表达，引起端粒损伤和端粒长度紊乱，从而加速细胞衰老和抑制细胞生长速度。因此，miR‑185在细胞生长和衰老过程中有着重要的调控功能，可以针对miR‑185开发有效的细胞生长和衰老的调控剂，如开发抗衰老药物用于延缓细胞衰老过程，以及开发肿瘤生长抑制剂用于抑制肿瘤细胞的生长，用于抗癌治疗，都具有重要的意义。

Description

人微RNA miR-185在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，涉及人微RNA（microRNAs）miR-185在制备细胞生长和衰老调控剂中的应用。

背景技术

端粒是真核生物染色体末端由包括双链TTAGGG重复序列和单链3’悬突构成的DNA序列及其相互作用蛋白组成的高度有序的特殊结构。它能够保护染色体末端、维持基因组稳定性及参与细胞衰老调控等生物学过程。正常人细胞每分裂一次，由于末端复制问题，端粒长度将逐渐缩短。当端粒缩短到一定界限时，细胞将无法继续分裂，进入衰老和死亡过程。端粒结合蛋白是特异结合在端粒上的特殊蛋白复合体，具有保护端粒，稳定端粒结构，防止端粒间融合，抑制DNA损伤发生等功能。人类端粒蛋白复合体由6个蛋白组成，分别是TRF1、POT1、TIN2、RAP1、TPP1和POT1。在这六个蛋白中，端粒保护蛋白1（protections oftelomere 1 protein，POT1）是在进化中最为保守的一个蛋白。POT1能够结合端粒3’悬突单链DNA（ssDNA），从而保护3’悬突不被降解和不被DNA损伤修复通路识别，促进端粒T环结构的形成。POT1对于端粒长度有着重要影响，对细胞周期的进程也有影响，同时还可避免ATR介导的DNA损伤修复反应，但这些功能在不同物种中具有巨大的差别。人的POT1蛋白与TPP1结合，共同调控端粒酶的持续延伸能力。POT1的异常表达伴随着一些重大疾病的发生，全基因组测序结果表明一些影响POT1正确剪接或者ssDNA结合的POT1的点突变在家族遗传性的黑色素瘤病人中被发现，并且引起了端粒的异常延伸；在某些心脏血管肉瘤的病人中也存在POT1的点突变，引起了POT1的表达降低和端粒的异常延伸和结构紊乱；在某些慢性淋巴细胞白血病人中，POT1的点突变引起了端粒的紊乱；在端粒异常缩短的再生障碍性贫血病人中，POT1呈现低表达；这些结果说明了POT1蛋白的正确表达对于正常细胞的端粒调控和基因组稳定性的维持具有重要意义。

在人的正常细胞内敲除POT1，将引发端粒紊乱，细胞衰老和生长停滞。细胞衰老是一个复杂有序的生物学过程。体外培养的正常细胞经过有限次数分裂，端粒逐渐缩短，DNA损伤积累，细胞形态和生理代谢活动发生改变，表现出细胞生长减慢、β半乳糖苷酶活性升高和炎症因子分泌增多等。衰老可引起组织代谢减缓，器官机能衰退，诱发各种衰老相关的退行性疾病如阿尔茨海默病亨廷顿病等，以及显著增加恶性肿瘤的发病率。我国目前已全面进入人口老龄化，也面临着恶性肿瘤越来越高发和医疗资源的紧张，社会保障不足的各种危机。因此，研发抗衰老或延缓衰老药物，以及抗恶性肿瘤的药物，不仅能治疗衰老相关疾病，解决人口老龄化问题，还能极大满足全球范围抗肿瘤治疗的需求。

基于以上POT1在衰老和恶性肿瘤中发挥的重要功能，寻找调控POT1表达的因子将为我们研究细胞生长衰老过程，研发抗衰老药物和抗肿瘤药物具有重要的指导意义。

microRNAs（以下简称miRNAs）是一类长约20-24 nt的单链小分子非编码RNA，由一段具有茎环结构的、长度为70-80 nt的单链RNA前体(pre-miRNA)经剪切而生成。miRNAs通过与mRNA分子的3'非编码区域(3'-untranslated region,3'UTR)互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到影响或被降解。miRNA的形成始于细胞核内由RNA聚合酶II或III转录得到片段较长的初级miRNA（pri-miRNA），然后在核内由dsRNA特异性核酸酶Drosha剪切为约70nt，具有茎环结构的miRNA前体（pre-miRNA）。pre-miRNA在Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin 5的作用下，从核内运输到胞质中，再由Dicer酶（双链RNA专一性RNA内切酶）进一步加工成为约22 nt的成熟双链miRNA（miRNA:miRNA*双螺旋），随即双链中的一条链被整合到RNA沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）中，形成非对称RISC复合物(asymmetric RISC assembly，miRISC)。当miRISC识别互补或部分互补的目标mRNA分子的3'UTR后，就会阻止蛋白质的翻译或者降解mRNA，从而抑制基因的表达。microRNAs通过调控靶基因的表达，参与调控许多生物学过程，如细胞周期、肿瘤发生发展、肿瘤转移和干细胞多能性等。目前未见有miRNAs在细胞生长和衰老调控方面，尤其是调控POT1表达的研究和报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术中细胞生长和抗衰老药物的缺陷和不足，提供人微RNA（microRNAs）miR-185在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用。本发明研究表明，miR-185直接作用于人端粒蛋白POT1的信使RNA（mRNA）的3’-非翻译区（3’UTR），抑制POT1的mRNA和蛋白表达，进而抑制肿瘤细胞生长和加速肿瘤细胞衰老，在调控细胞生长和衰老过程中有重要作用。

本发明的目的是提供miR-185在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用。

本发明的另一目的是提供miR-185表达调控剂在制备细胞生长和衰老调控剂中的应用。

本发明的再一目的是提供一种调控细胞生长和衰老的药物制剂，所述制剂含有miR-185。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明公开了miR-185在调控细胞生长和衰老过程中的功能，提供了miR-185在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用。所述miR-185的序列为：AGGGGGCGAGGGAUUGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGAUGGUCCCCUCCCCAGGGGCUGGCUUUCCUCUGGUCCUUCCCUCCCA（下划线部分为种子序列）。

本发明研究表明，miR-185通过直接作用于POT1的3’UTR，抑制POT1的表达，进而抑制肿瘤细胞生长和加速细胞衰老。

具体地，miR-185通过其第2-10位种子序列（seed region）与POT1的3’UTR的第2873-2889位碱基互补配对，降低POT1的mRNA和蛋白水平，导致肿瘤细胞生长速度减缓，加速细胞衰老。

本发明发现，miR-185与端粒蛋白POT1的表达呈负相关，且端粒蛋白POT1及其机制在人体细胞中普遍存在。

因此，miR-185在调控细胞生长和衰老过程中有着重要功能，可以针对其调控机制制备有效的衰老调控剂或抗衰老药物，以及抗肿瘤细胞生长药物。

优选地，上述应用是指miR-185在制备肿瘤细胞生长延缓剂或加速肿瘤细胞衰老制剂中的应用。

另外，以下所述的应用均应在本发明的保护范围之内：

miR-185表达调控剂在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用。

miR-185表达促进剂或激活剂在制备细胞生长延缓剂或加速细胞衰老制剂中的应用。

优选地，所述细胞为肿瘤细胞。

优选地，所述肿瘤细胞为人纤维肉瘤细胞。

更优选地，所述人纤维肉瘤细胞为人纤维肉瘤细胞HTC75。

miR-185表达抑制剂在制备抗衰老剂中的应用。

miR-185表达抑制剂在制备皮肤抗衰老剂中的应用。

另外，一种包含有效量的miR-185的细胞生长和衰老调控的药物制剂，也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述药物制剂还包含药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。

优选地，所述注射制剂为冻干粉针剂。

优选地，所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗粒剂。

本发明为了验证人微RNA（microRNAs）miR-185对细胞生长和衰老的调控功能，具体实验设计如下：

S1. 双荧光素酶报告系统实验，筛选作用于POT1的3’UTR的候选miRNAs；进一步研究miR-185与POT1的3’UTR相互作用情况。

S2. 构建miR-185过表达细胞，POT1敲低和POT1挽救（rescue）细胞系；并用免疫印迹实验，检测细胞內源POT1和外源POT1、GAPDH的表达水平。

S3. 实时荧光定量PCR实验，检测细胞POT1和miR-185水平；

S4. 端粒异常诱发的损伤灶（telomere dysfunction-induced foci），免疫荧光-原位杂交（IF-FISH）检测端粒和DNA损伤标志-H2AX的共定位并统计。

S4. 端粒长度，即端粒末端限制性片段分析（Telomeric Terminal RestrictionFragment，TRF）实验，研究miR-185表达和POT1敲低对端粒长度的调控。

S5. 细胞生长曲线实验，研究miR-185表达和POT1挽救对细胞生长的影响。

通过以上大量的研究和探索发现，在人成纤维肉瘤HTC75细胞中过表达miR-185能够抑制端粒蛋白POT1表达，促进肿瘤细胞端粒紊乱和衰老，以及抑制肿瘤细胞生长。表明了miR-185可以直接作用于人端粒蛋白POT1的信使RNA（mRNA）的3’-非翻译区（3’UTR），抑制POT1的mRNA和蛋白表达，进而抑制肿瘤细胞生长和加速肿瘤细胞衰老，在调控细胞生长和衰老过程中有重要作用。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了人微RNA miR-185在制备细胞生长和衰老调控剂上的应用。本发明发现miR-185能够抑制端粒蛋白POT1表达，促进肿瘤细胞端粒紊乱和衰老，以及抑制肿瘤细胞生长。因此，根据miR-185的这种功能，开发应用抗衰老药物用于延缓衰老，或者肿瘤生长抑制剂用于抗癌治疗，都具有举足轻重的意义。

附图说明

图1为荧光素酶报告基因系统筛选调控POT1-3’UTR稳定性的候选miRNAs,鉴定得到miR-185。

图2 为miR-185通过特异性结合POT1的3’UTR来调控其稳定性的验证结果。A为miR-185在POT1的3’UTR作用碱基互补示意图；B为荧光素酶报告系统结果。wPOT1为野生型POT1 3’UTR，mPOT1位作用位点突变型POT1 3’UTR。

图3为miR-185通过调控POT1的表达引发肿瘤细胞的端粒损伤。A为荧光定量PCR检测POT1 mRNA的敲低情况或挽救情况；B为免疫荧光-原位杂交（IF-FISH）共染端粒TTAGGG探针（代表端粒定位）和DNA损伤标志-H2AX的代表图；C为统计端粒异常诱发的损伤灶（TIF）。

图4为miR-185过表达和POT1的缺失都能引起肿瘤细胞端粒长度的紊乱。A为过表达miR-185后的肿瘤细胞进行端粒末端限制性片段分析TRF实验；B为TRF统计结果。

图5为miR-185通过调控POT1抑制肿瘤细胞的生长。A为过表达miR-185后荧光定量PCR检测miR-185表达情况；B为过表达miR-185和补回POT1后免疫印迹检测检测POT1蛋白表达情况；C为敲低POT1，过表达miR-185和补回POT1后，细胞生长曲线结果。

图6为miR-185调控POT1机制图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1构建miR-185过表达细胞和挽救（rescue）实验

1、实验方法

合成含有shPOT1正反序列的oligo引物，通过梯度降温的方式将2条引物退火，将退火好的含有shPOT1正反序列的双链RNA连接于pLKO载体中。将表达miRNA或shPOT1的质粒转染HEK293T细胞，制备病毒。用病毒感染人纤维肉瘤细胞HTC75，构建稳定转染细胞系。挽救（rescue）实验：全长的GFP或POT1克隆到pBabe-CMV-DEST-SFB中，转染HEK293T细胞，制备病毒。用病毒感染miR-185过表达细胞系，构建挽救（rescue）细胞系。对细胞系进行免疫印迹实验检测蛋白表达。

2、实验结果

附图5B中，各组的POT1表达情况说明细胞系构建成功。

实施例2 免疫印迹实验

1、实验材料

试剂：本实验所用POT1內源抗体（购于Novus Biologicals公司，产品货号NB500-176），使用时用3%牛血清蛋白（BSA）按1:1000稀释；GAPDH 抗体（购于Abmart公司，产品货号3B3），使用时用3% BSA按 1:5000稀释；二抗（羊抗鼠，购于LI-COR公司，产品货号926-68050，羊抗兔，购于LI-COR公司，产品货号926-32211），使用时用3% BSA按 1:10000稀释。

人纤维肉瘤细胞HTC75，由中山大学生命科学学院松阳洲课题组保存。

2、实验方法

S1.细胞裂解液准备：按照常规人肿瘤细胞培养方法进行培养，收集细胞，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗一次；用PBS悬浮，加5X SDS上样缓冲液裂解煮沸。

所述培养基的组成为：DMEM培养基、10%FBS。

S2. SDS聚丙烯酰胺电泳：将样品加入凝胶孔，设程序80V 30分钟，120 1小时，样品跑至凝胶底部。

S3. 湿转膜：将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，设程序200mA 2小时。

S4. 封闭：用质量体积比5%的脱脂奶粉（用TBS配制）做封闭液，封闭一小时。

S5. 一抗结合：孵一抗 4℃过夜（12小时），用TBST洗膜3遍，每次5分钟。

S6. 二抗结合（该步骤需避光）：孵二抗，置于室温1小时后TBST洗三次，每次5分钟。

S7. 检测：使用licor odyssey双色红外激光成像系统进行显色拍照。

3、实验结果

实验结果如附图5B所示。

内源POT1在miR-185过表达的细胞中表达比Neg对照组低，说明miR-185可抑制内源POT1的蛋白表达。在挽救（rescue）细胞（miR-185+POT1，POT1带有SFB标签，分子量加大约10KD）中，POT1的表达除了内源的条带，出现了更大的条带（外源条带），说明POT1的挽救（rescue）实验成功。其中，shPOT1组作为正对照，miR-185+GFP组作为挽救（rescue）实验的负对照。

实施例3 实时荧光定量PCR实验

1、实验方法

使用TRIzol（Invitrogen, 货号15596-026）法提取细胞总RNA，用DNase I（Invitrogen, 货号18068015）处理样品，去除残余DNA，再用TAKARA PrimeScript™ II1st Strand cDNA Synthesis Kit 反转录成cDNA。以SYBR Green（ABI, 货号4309155）为染料，进行实时荧光定量PCR实验。设置PCR程序：第一步，95℃ 10分钟；第二步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环。溶解曲线程序：第一步，95℃ 10分钟；第二步：95℃ 10秒，55℃ 10秒，每循环将55℃提升0.5℃，升至95℃后结束。

2、实验结果

实验结果如附图3A和图5A所示。附图3A显示miR-185过表达细胞中，POT1的mRNA水平比对照组的低，说明了miR-185可降解POT1的mRNA。ShPOT1为实验的正对照。miR-185+GFP组作为挽救（rescue）实验的负对照。MiR-185+POT1组中POT1的mRNA显著上升，说明POT1挽救（rescue）细胞株成功构建。

实施例4 双荧光素酶报告系统实验

1、实验方法

全长或miR-185结合位点突变的POT1 3’UTR克隆到psiCHECK-2双荧光素酶载体中。将miRNAs表达空载体或miR-185表达载体和POT1 3’UTR载体共转染到HEK293T细胞，48小时后，裂解细胞，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System Kit（Promega公司，货号E1910）和Perkin Elmer victor X5分光光度计测定和计算荧光素酶活性。

2、实验结果

附图1筛选了一系列经生物信息学预测的候选miRNAs，经荧光素酶报告基因活性分析，共转miR-185对于抑制POT1的3’UTR活性影响显著。图2显示miR-185在POT1 3’UTR上的结合位点及荧光素酶活性结果。miR-185抑制野生型POT1 3’UTR约50%的荧光素酶活性，将POT13’UTR上的结合位点突变后，miR-185无法结合POT1 3’UTR，荧光素酶活性回复到对照组的水平，说明了miR-185抑制POT1的表达是通过直接作用于3’UTR上第2873-2889位。

实施例5衰老相关端粒末端限制性片段分析TRF实验

1、实验方法

将包病毒筛选后得到存活稳定细胞株的天数记为0，并冻存。每传代一天后天数加1。将细胞种在10cm培养皿，以0.05%胰酶37℃消化细胞，细胞沉淀用Qiagen基因组DNA抽提试剂盒（Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit，货号69504）消化，按试剂盒指南进行蛋白酶K处理以及37℃ RNA酶处理20分钟。按指南上柱，纯化DNA，洗脱，并测260/280吸光光度值，以1.8左右为合格，测DNA浓度。取4μg DNA用HinfI，RSAI（Thermo Scientific）各1μl于37℃酶切过夜。样品和DNA 标准品Marker 用0.7% Agarose（Biowest）在1XTAE中跑胶过夜，Gel-red（碧云天，1:10000）染色，拍照。将胶标记好左右顺序后用干胶仪干胶。以下操作转移至同位素室：将胶转移至杂交管，42度变性30分钟，清水洗两次后42度中和30分钟。同时按下列体系配制同位素端粒探针，C-rich strand (CCCTAA)3CCC (180ng/ul assayed byNanodrop) 2ul，T4 polymerase kinase (PNK) 2ul，0x Buffer 2ul，-[³²P]ATP 5ul，ddH2O9ul。探针标记反应在37度孵育30分钟，用试剂盒（Roche mini Quick Spin Oligo Column）按指南纯化探针。中和后的胶在42度杂交炉用预杂交液（10x Denharts’, 0.5% SDS, 5xSSC）预杂交30分钟，在1:2000探针稀释后的杂交液（同预杂交液）中杂交过夜。回收探针。用Wash 1溶液（2xSSC, 0.5% SDS）洗两次，每次15分钟，用Wash 2溶液（1xSSC, 0.5% SDS）洗两次，每次15分钟。擦干胶表面，用保鲜膜包裹，磷屏曝光，多功能激光扫描成像系统（GEhealthcare，Typhoon）显影摄像。

2、实验结果

附图4显示，过表达miR-185的三个不同克隆的细胞株随着细胞传代，伴随着端粒末端限制性片段长度的增加。ShPOT1为实验的正对照，和报道一致，也伴随着端粒末端限制性片段长度的增加，而负对照miR-Neg几乎不影响端粒长度。显示过表达miR-185引发肿瘤细胞端粒长度的紊乱。

实施例6衰老相关端粒异常诱发的损伤灶TIF实验

1、实验方法

将细胞接种到带有圆形玻片的12孔板中，24小时后，吸去培养基，使用4%多聚甲醛进行冰上固定30分钟。PBS洗三次，每次1分钟。使用含0.2% TritonX-100的PBS溶液在室温透化15分钟。PBS洗三次，每次1分钟。用含3% 牛血清白蛋白BSA的PBS溶液在室温孵育一小时。将H2AX抗体1:500稀释于含3% 牛血清白蛋白BSA的PBS溶液，在4度湿盒孵育过夜；第二天，吸去抗体，PBS洗三次，每次5分钟。将荧光二抗1:1000稀释于含3% 牛血清白蛋白BSA的PBS溶液，室温孵育1小时。PBS洗三次，每次5分钟。用4%的多聚甲醛室温重新固定30分钟，用PBS洗2次，每次5分钟。乙醇脱水三次，分别是70% 乙醇5分钟，95%乙醇5分钟，100%乙醇15分钟。把玻片挑出，正面朝上放在kimwipe上，晾干。将含有端粒序列荧光探针（FITC-OO-CCCTAACCCTAACCCTAA，Panagene）的杂交液滴在载玻片上（大玻片用10uL 杂交液），把盖玻片倒扣在杂交液上，尽量避免气泡。在热板上变性：85℃，5分钟，然后湿盒中37℃杂交过夜。用wash 1 溶液（70% formamide，10mM Tris-HCl pH 7.4）洗2次，每次15分钟。用wash 2 溶液（0.1M tris-HCl pH 7.4，0.15M NaCl，0.08% Tween）洗2次，每次15分钟。乙醇再次脱水：70% 乙醇5分钟，95%乙醇5分钟，100%乙醇15分钟，空气干燥玻片。用含有DAPI的封片剂封片，晾干。在显微镜下观察，拍照，对端粒和DNA损伤标志-H2AX的共定位进行统计。

2、实验结果

附图3B，C显示，过表达miR-185的细胞中端粒探针和H2AX的共定位变多，且这种效应可被过表达POT1逆转（miR-185+POT1组），而过表达GFP（miR-185+GFP组）则无法逆转。这说明了miR-185抑制POT1表达，促进端粒异常诱发的损伤灶TIF，引发衰老。ShPOT1诱发TIF为实验的阳性对照组。

实施例7细胞生长曲线实验

1、实验方法

将1000个细胞接种到6孔板中，种9个孔，在接下来的48小时（day 2），96小时（day 4）和144小时（day 6）分别消化3个孔的细胞，用血球计数板计数，取平均值，计算标准偏差和t检验。

2、实验结果

附图5C显示，miR-185过表达细胞生长速度比Neg对照组慢，且这种效应可被过表达POT1逆转（miR-185+POT1组），而过表达GFP（miR-185+GFP组）则无法逆转。shPOT1组作为正对照。这说明了miR-185抑制POT1表达，延缓细胞生长。

综上所述结果表明，如附图6所示，miR-185可以直接作用于人端粒蛋白POT1的信使RNA（mRNA）的3’-非翻译区（3’UTR），抑制POT1的mRNA和蛋白表达，进而抑制肿瘤细胞生长和加速肿瘤细胞衰老，在调控细胞生长和衰老过程中有重要作用。

Claims (10)

1.miR-185在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用。

2.miR-185在制备肿瘤细胞生长延缓剂或加速肿瘤细胞衰老制剂中的应用。

3.miR-185表达调控剂在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用。

4.miR-185表达促进剂或激活剂在制备细胞生长延缓剂或加速细胞衰老制剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞为肿瘤细胞。

6.miR-185表达抑制剂在制备抗衰老剂中的应用。

7.miR-185表达抑制剂在制备皮肤抗衰老剂中的应用。

8.一种细胞生长和/或衰老调控的药物制剂，其特征在于，包含有效量的miR-185。

9.根据权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，还包含药学上可接受的辅料。

10.根据权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。