CN113262304B

CN113262304B - miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用

Info

Publication number: CN113262304B
Application number: CN202110453449.3A
Authority: CN
Inventors: 李扬秋; 陈存特; 余锡宝; 曾成武
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2021-04-26
Filing date: 2021-04-26
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2041-04-26
Also published as: CN113262304A

Abstract

本发明公开了miR‑4435‑2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用，属于生物医学领域。本发明首次发现下调miR‑4435‑2HG和/或GDAP1的表达，能显著抑制AML肿瘤细胞的增殖，并有效促进AML肿瘤细胞凋亡。具体以RNA干扰技术为基础，通过人工合成上述基因靶向的siRNA，实现降低miR‑4435‑2HG和/或GDAP1的表达。本发明对于开发新的治疗AML的基因药物和提高AML的治疗效果有重要的意义，其具有很大的应用前景和经济价值。

Description

miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用。

背景技术

急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是威胁人类健康的血液恶性肿瘤，是成人中最常见的急性白血病，每100,000人中发病率3.7。并且该疾病进展迅速，除急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)(M3型AML)等低危组患者外，AML患者的长期生存率不足50％，总体预后不容乐观，现有传统的阿糖胞苷联合蒽环类药物的诱导方案治疗方案下，三十余年诸多改进的尝试并未显著提高非APL的AML病人的完全缓解(complete remission，CR)率。因此，急需寻找有效针对AML新的治疗策略。

近年来，利用RNA干扰技术，将化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转导至特定的细胞，沉默相关基因的表达，是研究基因功能最有效的手段之一，也是靶向基因治疗最有吸引力的方法之一。选择特异性的靶基因合成有效的siRNA，并且选择合适转染方式，使其在宿主细胞中高效作用，是实施这一靶向治疗措施的重点。而高通量测序技术的飞速发展，为AML患者的诊断和预后提供了越来越精确的预测，从而可以为患者提供更有效的精准治疗。

发明内容

本发明的首要目的在于提供miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用；

本发明的另一目的在于提供一种能抑制miR-4435-2HG的siRNA和一种能抑制GDAP1表达的siRNA。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用。

所述抑制剂为以miR-4435-2HG和/或GDAP1作为靶点制备或筛选得到的对其具有抑制作用的分子或制剂，可为siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽或抗体中的至少一种。

优选的，所述抑制剂为siRNA，其中，抑制miR-4435-2HG表达的siRNA正义链序列为如下之一：

si-miR-4435-2HG-1，5’-GCACAGAGCUUUCCCUUUAUC-3’；

si-miR-4435-2HG-2，5’-GCAUGGAACUCGACAGUUA-3’；

抑制GDAP1表达的siRNA正义链序列为如下之一：

si-GDAP1-1，5’-GGCCACUCAGAUCAUUGAUUAUCUU-3’；

si-GDAP1-2，5’-CACUCGCUGUCACAUUGCAUCGACU-3’。

一种能抑制miR-4435-2HG表达的siRNA，正义链序列为如下之一：

si-miR-4435-2HG-1，5’-GCACAGAGCUUUCCCUUUAUC-3’；

si-miR-4435-2HG-2，5’-GCAUGGAACUCGACAGUUA-3’。

一种能抑制GDAP1表达的siRNA，正义链序列为如下之一：

si-GDAP1-1，5’-GGCCACUCAGAUCAUUGAUUAUCUU-3’；

si-GDAP1-2，5’-CACUCGCUGUCACAUUGCAUCGACU-3’。

一种治疗AML药物，包含上述能抑制miR-4435-2HG表达的siRNA和/或能抑制GDAP1表达的siRNA。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明首次提出，miR-4435-2HG和/或GDAP1作为靶点在制备治疗AML药物中的应用，提供了一种针对AML新的有效治疗策略。

2、本发明的抑制miR-4435-2HG和GDAP1表达的siRNA能高效抑制抑制miR-4435-2HG和GDAP1基因的表达，其中能高效抑制miR-4435-2HG的siRNA的mRNA的下调程度达到40％～60％，能高效抑制GDAP1的siRNA的mRNA的下调程度达到80％～90％。

3、本发明的抑制miR-4435-2HG和GDAP1表达的siRNA能显著抑制AML肿瘤细胞的增殖，并有效促进AML肿瘤细胞凋亡。

4、本发明的siRNA序列对于开发新的治疗AML的基因药物和提高AML的治疗效果有重要的意义，能显著降低传统治疗药物的耐药问题，其具有很大的应用前景和经济价值。

附图说明

图1是实施例1的部分实验结果图；其中，图A是实施例中敲低miR-4435-2HG或GDAP1后，使用定量实时RT-PCR(qRT-PCR)检测miR-4435-2HG或GDAP1在THP-1细胞中的表达水平结果图；图B是实施例中通过流式细胞术检测到的THP-1细胞凋亡的代表性图；图C是在三个重复实验中分析了siRNA转染THP-1细胞后的凋亡率统计结果图；图D是在三个重复实验中分析了siRNA转染THP-1细胞后使用CCK8试剂盒细胞活力的统计结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)5-10×10⁶个人单核细胞白血病细胞(细胞株THP-1，ATCC)中加入1毫升TRIZOL试剂。

(2)总RNA提取

2.1将处理过的样本置于冰上，反应5分钟后，加入氯仿0.2毫升，充分混匀(15秒)后置冰上2-3分钟，低温高速(2-8℃，12000g)离心15-30分钟；

2.2小心吸取上层液体(约占总体积50％)转移至1.5毫升新管中，加入0.5毫升异丙醇并混匀，冰上放置10分钟后低温高速离心10-20分钟；

2.3去上清并用1毫升75％乙醇(-20℃)洗涤两次(2-8℃，10000g)，每次均混匀30秒后，离心5-10分钟；

2.4去上清，再离心一次，去除剩余的乙醇；

2.5将洗涤后的样品于低温真空离心机中干燥5-10分钟；

2.6加入超净水(Biotecx BL-5700)50微升(视情况可适当增加或减少)混匀。

2.7取2微升RNA溶液稀释至400微升，于紫外线分光光度仪中检测样品在A260nm波长的光密度估计样品的纯度和含量(1ODA260nm＝40微克/毫升)，RNA总量＝OD数×400微克；

2.8 RNA样品加入0.1容积(5微升)的3M NaAC(醋酸钠)和2倍容积的乙醇(100微升)后，保存于-70℃备用。

(3)RT-PCR

3.1将500ng RNA，0.5μl oligo(dT)(0.5μg/反应)，0.5μl随机引物(0.5μg/反应)和无RNase的双蒸馏水(ddH2O)(最多5μl)按比例混匀，并在70℃下孵育5分钟后，迅速于冰上冷却5分钟；

3.2加入4.0微升GoScriptTM 5×反应缓冲液，1.7微升MgCl2(最终浓度2.0mM)，1.0微升0.5mM dNTP，0.3微升核糖核酸酶抑制剂(20U)，1.0微升逆转录酶和ddH2O，总体系为15微升；

3.3混匀后，将20微升样品在42℃孵育60分钟，然后在70℃灭活15分钟；

3.4最后加入80微升ddH2O稀释，-20℃保存。

(4)qRT-PCR

4.1 qRT-PCR的20微升体系配制为：2×Mix 10微升，0.5微升正向引物(10μM)，0.5微升反向引物(10μM)，1微升cDNA和8微升无RNase ddH2O；

所用引物的序列如下：

miR-4435-2HG-F:5'-ATGTCGGGAGAGGAAGTGGT-3'

miR-4435-2HG-R:5'-CTTCCCAGGAACTGTGCTGT-3'

GDAP1-F:5'-ATGCGTTTGAACTCAACTGGA-3'

GDAP1-R:5'-TCAGGCATTAACCTGGGTGTT-3'

18SrRNA-F:5'-CCTGCTGCCTTCCTTGGATGTG-3'

18SrRNA-R:5'-CGGCGGCTTTGGTGACTCTAGA-3'

4.2 qRT-PCR的程序设置如下：95℃处理15分钟后，在95℃10s到60℃20s进行45个循环。

(5)siRNA转染

5.1设计和合成siRNA

在GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)里查找miR-4435-2HG和GDAP1基因序列(ACCESSION NR_015395.2，NM_018972.4)，然后根据Invitrogen公司(www.invitrogen.com)提供的StealthTMRNAi设计法则，在线设计针对miR-4435-2HG和GDAP1的siRNA。本发明所涉及的siRNA具体正义链序列分别为：

si-miR-4435-2HG-1，5’-GCACAGAGCUUUCCCUUUAUC-3’；

si-miR-4435-2HG-2，5’-GCAUGGAACUCGACAGUUA-3’；

si-GDAP1-1，5’-GGCCACUCAGAUCAUUGAUUAUCUU-3’；

si-GDAP1-2，5’-CACUCGCUGUCACAUUGCAUCGACU-3’；

上述siRNA及siNC(siN0000001)均由广州锐博公司化学合成。

5.2准备处于对数生长期的THP-1细胞

将THP-1细胞接种于含体积分数10％新生牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在含体积百分数5％CO₂的培养箱37℃连续培养，2～3天传代一次，得到处于对数生长期的THP-1细胞。

5.3 Neon电转染siRNA

A、收集2×10⁵个步骤(2)制备的处于对数生长期的THP-1细胞，200g离心10min，完全去除上清；

B、用10微升Buffer R和1微升100μM对应的siRNA(miR-4435-2HG siRNA或GDAP1siRNA)重悬THP-1细胞；

C、启动THP-1电转程序(1400V，10ms，3pulse)；

D、程序完成后将转染后的细胞液接种于6孔板中，培养24h后加入AraC使终浓度为1μM，补充培养至终体积为3毫升；

E、置于培养箱培养24小时后利用流式细胞仪检测细胞凋亡，使用FlowJo对结果进行分析。

(6)检测miR-4435-2HG或GDAP1在THP-1细胞中的表达水平

参考步骤(1)。

(7)检测细胞凋亡

7.1用预冷PBS离心洗涤，收集电转染后的细胞。

7.2用双蒸水稀释5×Binding Buffer为1×工作液，取500微升1×BindingBuffer重悬细胞。

7.3每管加入5微升Annexin V-APC和10微升PI。

7.4轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5分钟。

7.5上机进行分析。

(8)检测细胞活力

8.1收集转染后的细胞，用PBS重悬，分别计数。

8.2将转染miR-4435-2HG或GDAP1后的细胞以每孔100微升/1×10⁴个细胞接种于96孔板中。置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养48h。

8.3 48h后每孔加10微升CCK8试剂。

8.4培养4小时后使用多功能酶标仪进行检测，结果用Excel进行分析。

结果如图1所示。其中，图A是miR-4435-2HG或GDAP1在THP-1细胞中的表达水平结果图，与正常细胞相比，si-miR-4435-2HG-1、si-miR-4435-2HG-2的mRNA的下调程度分别达到63.00％、41.18％，si-GDAP1-1、si-GDAP1-2的mRNA的下调程度分别达到17.60％、11.25％；图B是THP-1细胞凋亡的代表性图，可以看出所述的siRNA能够促进AML肿瘤细胞凋亡；图C是在三个重复实验中分析了siRNA转染THP-1细胞后的凋亡率统计结果图，可以看出所述的siRNA能够稳定有效地促进AML肿瘤细胞凋亡；图D细胞活力的统计结果图，可以看出所述的siRNA都能显著抑制AML肿瘤细胞的增殖。

上述实验结果说明了本发明提供的抑制miR-4435-2HG和GDAP1表达的siRNA能高效抑制miR-4435-2HG和GDAP1基因的表达，抑制miR-4435-2HG和GDAP1基因的表达具有明显的抑制AML细胞增殖、诱导细胞凋亡的功能。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> miR-4435-2HG和/或GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miR-4435-2HG-F

<400> 1

atgtcgggag aggaagtggt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> miR-4435-2HG-R

<400> 2

cttcccagga actgtgctgt 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GDAP1-F

<400> 3

atgcgtttga actcaactgg a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GDAP1-R

<400> 4

tcaggcatta acctgggtgt t 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18SrRNA-F

<400> 5

cctgctgcct tccttggatg tg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 18SrRNA-R

<400> 6

cggcggcttt ggtgactcta ga 22

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> si-miR-4435-2HG-1

<400> 7

gcacagagcu uucccuuuau c 21

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> si-miR-4435-2HG-2

<400> 8

gcauggaacu cgacaguua 19

<210> 9

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> si-GDAP1-1

<400> 9

ggccacucag aucauugauu aucuu 25

<210> 10

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> si-GDAP1-2

<400> 10

cacucgcugu cacauugcau cgacu 25

Claims

1.miR-4435-2HG基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用，其特征在于：

所述基因抑制剂为siRNA，抑制miR-4435-2HG表达的siRNA正义链序列为如下之一：

si-miR-4435-2HG-1，5’- GCACAGAGCUUUCCCUUUAUC -3’；

si-miR-4435-2HG-2，5’- GCAUGGAACUCGACAGUUA -3’。

2.miR-4435-2HG和GDAP1基因抑制剂在制备治疗AML药物中的应用，其特征在于：

所述基因抑制剂为siRNA，其中，抑制miR-4435-2HG表达的siRNA正义链序列为如下之一：

si-miR-4435-2HG-1，5’- GCACAGAGCUUUCCCUUUAUC -3’；

si-miR-4435-2HG-2，5’- GCAUGGAACUCGACAGUUA -3’；

抑制GDAP1表达的siRNA正义链序列为如下之一：

si-GDAP1-1，5’- GGCCACUCAGAUCAUUGAUUAUCUU -3’；

si-GDAP1-2，5’- CACUCGCUGUCACAUUGCAUCGACU -3’。