CN113862273B - 一种HK2低表达的乳腺癌细胞系及其使用的siRNA - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种HK2低表达的乳腺癌细胞系及其使用的siRNA。siRNA为寡聚核酸siRNA1；寡聚核酸siRNA1由SEQ ID NO：1所示的单链RNA分子和SEQ ID NO：2所示的单链RNA分子组成；寡聚核酸siRNA1的3’端为2个dT修饰。实验证明，寡聚核酸siRNA1可抑制乳腺癌肿瘤的生长、抑制乳腺癌细胞的增殖、降低乳腺癌细胞侵袭能力、降低乳腺癌细胞糖酵解能力和构建HK2低表达的乳腺癌细胞模型。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种HK2低表达的乳腺癌细胞系及其使用的siRNA
技术领域
本发明属于医学分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种HK2低表达的乳腺癌细胞系及其使用的siRNA。
背景技术
乳腺癌是女性病人中最常见的原发性恶性肿瘤之一。乳腺癌在细胞起源、组织学形态、疾病分级、临床表现、治疗反应以及转移潜能等方面都表现出极大的复杂性与异质性，限制了现有乳腺癌治疗方法的有效性和广泛性。目前临床上仍然缺乏乳腺癌治疗的靶点。因此，从分子层面研究乳腺癌的发生发展机制，确定癌症病程关键节点的肿瘤标记物和涉及到的信号通路，为乳腺癌的预防、筛查和治疗指出方向，也为对其实现精确的靶向治疗夯实基础。
小干扰RNA（Small interferingRNA，siRNA）又称短干扰RNA或沉默RNA，是一个长20-25个核苷酸的双链RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参与RNA干扰（RNAi），通过人为引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA，诱导内源靶基因mRNA降解，从而达到减弱基因表达的目的。siRNA可经多种不同转染技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的敲低效果。目前siRNA导入体内的方法主要有两种，一是直接注射裸露的siRNA或经化学修饰的siRNA，二是使用病毒载体（如慢病毒、腺病毒或腺相关病毒）表达siRNA。siRNA具有高度的特异性、干扰效率高且操作简单，因此可利用经过适当剪裁的siRNA的互补性，来对已知序列的基因进行标定，这种现象使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。
己糖激酶（hexokinase，HK）2是肿瘤糖代谢研究领域的热点问题。HK2是别构酶，受葡萄糖-6-磷酸和ADP的抑制，亲和性强，可以针对多种六碳糖进行作用。在糖酵解第一步中，葡萄糖在己糖激酶催化下和ATP发生磷酸化反应，生成葡萄糖-6-磷酸和ADP。HK2是糖酵解第一个限速酶，在正常组织中很少表达，除了骨骼肌、心肌和脂肪组织；然而，它在肿瘤细胞中经常表达上调，促进Warburg效应。研究表明，HK2在乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、胆囊癌等肿瘤组织中过高表达，且肿瘤患者HK2高表达预示预后不良。HK2高表达会促进肿瘤细胞生长和转移。因此，HK2在肿瘤糖代谢和肿瘤发生发展中发挥着重要作用。
发明内容
本发明的目的是抑制乳腺癌肿瘤的生长。
本发明首先保护抑制HK2蛋白活性和/或表达量的物质，可为z1）或z2）：
z1）寡聚核酸siRNA1；所述寡聚核酸siRNA1由SEQ ID NO：1所示的单链RNA分子和SEQ ID NO：2所示的单链RNA分子组成；所述寡聚核酸siRNA1的3’端为2个dT修饰；
z2）以所述寡聚核酸siRNA1为靶点，由shRNA表达系统合成的shRNA。
所述由shRNA表达系统合成的shRNA具体可由SEQ ID NO：13所示的单链RNA分子和SEQ ID NO：14所示的单链RNA分子组成。
在本发明的实施例中，寡聚核酸siRNA1具体可为HK2 siRNA1。
在本发明的实施例中，z2）具体可为HK2 shRNA。
本发明还保护一种重组慢病毒载体，其制备方法可如下：
（1）将SEQ ID NO：13所示的单链RNA分子和SEQ ID NO：14所示的单链RNA分子进行退火，得到DNA双链；
（2）将慢病毒表达载体pSIH1-H1-Puro的限制性内酶切BamHⅠ和EcoRⅠ之间的DNA小分子替换为步骤（1）得到的DNA双链，得到重组慢病毒载体。
在本发明的实施例中，重组慢病毒载体具体可为HK2 shRNA重组慢病毒载体。
本发明还保护一种HK2低表达的乳腺癌细胞模型，其制备方法可如下：
（1）将上述任一所述重组慢病毒载体转染细胞，获得病毒液；
（2）用步骤（1）获得的病毒液感染乳腺癌细胞系，筛选获得HK2低表达的乳腺癌细胞系，即HK2低表达的乳腺癌细胞模型。
上述方法中，所述细胞可为HEK293T细胞。
上述方法中，所述乳腺癌细胞系可为人乳腺癌细胞ZR-75-1。
在本发明的实施例中，HK2低表达的乳腺癌细胞模型可为实施例4中构建的HK2敲低的人乳腺癌细胞ZR-75-1稳定细胞系。
本发明还保护上述任一所述抑制HK2蛋白活性和/或表达量的物质的应用，可为A1）-A10）中的至少一种；
A1）制备用于抑制乳腺癌肿瘤的生长的产品；
A2）制备用于抑制乳腺癌细胞的增殖的产品；
A3）制备用于降低乳腺癌细胞侵袭能力的产品；
A4）制备用于降低乳腺癌细胞糖酵解能力的产品；
A5）制备用于构建HK2低表达的乳腺癌细胞模型的产品；
A6）抑制乳腺癌肿瘤的生长；
A7）抑制乳腺癌细胞的增殖；
A8）降低乳腺癌细胞侵袭能力；
A9）降低乳腺癌细胞糖酵解能力；
A10）构建HK2低表达的乳腺癌细胞模型。
本发明还保护上述任一所述重组慢病毒载体的应用，可为A1）-A10）中的至少一种；
A1）制备用于抑制乳腺癌肿瘤的生长的产品；
A2）制备用于抑制乳腺癌细胞的增殖的产品；
A3）制备用于降低乳腺癌细胞侵袭能力的产品；
A4）制备用于降低乳腺癌细胞糖酵解能力的产品；
A5）制备用于构建HK2低表达的乳腺癌细胞模型的产品；
A6）抑制乳腺癌肿瘤的生长；
A7）抑制乳腺癌细胞的增殖；
A8）降低乳腺癌细胞侵袭能力；
A9）降低乳腺癌细胞糖酵解能力；
A10）构建HK2低表达的乳腺癌细胞模型。
本发明还保护上述任一所述HK2低表达的乳腺癌细胞模型的应用，可为A1）、A2）、A3）、A4）、A6）、A7）、A8）和A9）中的至少一种；
A1）制备用于抑制乳腺癌肿瘤的生长的产品；
A2）制备用于抑制乳腺癌细胞的增殖的产品；
A3）制备用于降低乳腺癌细胞侵袭能力的产品；
A4）制备用于降低乳腺癌细胞糖酵解能力的产品；
A6）抑制乳腺癌肿瘤的生长；
A7）抑制乳腺癌细胞的增殖；
A8）降低乳腺癌细胞侵袭能力；
A9）降低乳腺癌细胞糖酵解能力。
上述任一所述的应用中，所述降低乳腺癌细胞糖酵解能力具体可为降低乳腺癌细胞乳酸含量。
实验证明，HK2 siRNA1和HK2 shRNA能抑制人乳腺癌细胞ZR-75-1的增殖，HK2shRNA干扰了HK2后，细胞的侵袭能力减弱，人乳腺癌细胞ZR-75-1糖酵解能力降低，乳腺癌肿瘤生长受到抑制。应用RNAi技术抑制癌细胞中HK2基因的表达，构建HK2低表达的乳腺癌细胞模型，研究HK2在乳腺癌细胞发生发展中的作用，这有助于从分子水平阐明HK2在乳腺癌细胞表达的机制，从而为揭开癌症的发病机制及治疗提供有用的线索。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为3个HK2 siRNA对人乳腺癌细胞ZR-75-1 HK2 mRNA和HK2蛋白表达的影响。**p<0.01，与NC组相比较。
图2为HK2 siRNA对人乳腺癌细胞ZR-75-1增殖的影响。**p<0.01，与NC组相比较。
图3为HK2 shRNA对人乳腺癌细胞ZR-75-1 mRNA和蛋白表达的影响。**p<0.01，与NCshRNA组相比较。
图4为HK2 shRNA对人乳腺癌细胞ZR-75-1增殖的影响。**p<0.01，与NC shRNA组相比较。
图5为HK2 shRNA对人乳腺癌细胞ZR-75-1侵袭的影响。**p<0.01，与NC shRNA组相比较。
图6为HK2 shRNA对人乳腺癌细胞ZR-75-1糖酵解乳酸水平的影响。**p<0.01，与NCshRNA组相比较。
图7为HK2 shRNA对裸鼠肿瘤生长的影响。**p<0.01，与NC shRNA组相比较。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、靶向HK2基因mRNA的siRNA（简称HK2 siRNA）的设计和合成
本发明人的发明人的根据GenBank中的人HK2序列设计HK2 siRNA，设计基本原则如下：（1）从人HK2的转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点；（2）设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果；（3）一般21个核苷酸中的GC含量在30%-70%的范围内，当GC含量较低的片段中更容易找到有效片段；（4）要避免siRNA靶序列形成二级结构和相同碱基的连续重复，这些结构会影响siRNA的退火配对和靶点特异性；（5）将所选序列和相应的基因组数据库（人、小鼠或大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列，例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）；（6）还需参考Sfold推荐的RNA空间构像；同时一般在正义链的3’末端加两个dTdT的尾，指导siRNA形成RNAi沉默复合物，也避免受核酸酶的降解。本发明的发明人根据以上原则，设计HK2 siRNA的正义链和反义链并由上海吉玛公司合成了3个HK2 siRNA，分别命名为HK2siRNA1、HK2 siRNA2和HK2 siRNA3。3个HK2 siRNA均为siRNA双链。
NC siRNA作为阴性对照由上海吉玛公司赠送。
HK2 siRNA1、HK2 siRNA2、HK2 siRNA3和NC siRNA的纯度均大于99%，用DEPC处理过的双蒸水溶解，可直接用于细胞转染。
3个HK2 siRNA和NC siRNA的正义链和反义链的核苷酸序列见表1。
表1
Figure 937047DEST_PATH_IMAGE001
实施例2、3个HK2 siRNA在人乳腺癌细胞ZR-75-1中对HK2干扰效果的检测
人乳腺癌细胞ZR-75-1为美国ATCC细胞库的产品。
1、转染
（1）将人乳腺癌细胞ZR-75-1接种于装有含10%（v/v）新生牛血清的DMEM培养基的培养皿（直径为6cm）（接种细胞密度以转染时细胞密度达70-80%为宜），常规培养24h。
（2）完成步骤（1）后，利用Lipofectamine 3000（美国Invitrogen公司）转染试剂将siRNA（NC siRNA、HK2 siRNA1、HK2 siRNA2或HK2 siRNA3）进行转染（转染方法参照Lipofectamine 3000转染试剂的说明书），转染后48h收集细胞，获得siRNA转染的人乳腺癌细胞ZR-75-1。
2、cDNA的获得
用Trizol（美国Invitrogen公司）提取siRNA转染的人乳腺癌细胞ZR-75-1的总RNA，之后反转录，得到siRNA转染的人乳腺癌细胞ZR-75-1的cDNA。
反转录的步骤如下：
（1）制备体系。体系为15.9μl，由2μg siRNA转染的人乳腺癌细胞ZR-75-1的总RNA、1μl浓度为1μg/μl的随机引物溶液和DEPC水组成。
（2）取体系，70℃温育5min，冰上冷却。
（3）完成步骤（2）后，加入5μl M-MLV 5×buffer、2.5μl 10mM dNTP和1.0μl M-MLV反转录酶（浓度为200U/μl），混合，42℃温育60min，95℃ 5min终止反应，得到siRNA转染的人乳腺癌细胞ZR-75-1的cDNA。
随机引物为北京赛百盛公司合成。M-MLV 5×buffer和M-MLV反转录酶购自美国Promega公司。
3、qRT-PCR鉴定HK2 siRNA对HK2基因的干扰效果
分别以步骤2获得的siRNA转染的人乳腺癌细胞ZR-75-1的cDNA为模板，qRT-PCR检测siRNA转染的人乳腺癌细胞ZR-75-1中HK2基因的相对表达量（以β-actin基因作为内参基因）。采用2-ΔΔCT法计算HK2的mRNA表达量。
鉴定HK2基因的引物为：5’-GCCATCCTGCAACACTTAGGGCTTGAG-3’（SEQ ID NO：9）和5’-GTGAGGATGTAGCTTGTAGAGGGTCCC-3’（SEQ ID NO：10）。
鉴定β-actin的引物为5’-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’（SEQ ID NO：11）和5’-ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3’（SEQ ID NO：12）。
检测结果如图1中A所示。结果表明，HK2 siRNA1、HK2 siRNA2和HK2 siRNA3分别转染人乳腺癌细胞ZR-75-1后，HK2 mRNA的表达量均显著下降，其中HK2 siRNA1的干扰效果最明显。
4、Western blot鉴定HK2 siRNA对HK2蛋白的抑制效果
（1）SDS-PAGE电泳
分别提取步骤1获得的siRNA转染的人乳腺癌细胞ZR-75-1的总蛋白，变性后进行SDS-PAGE电泳；电压120V，约1.5h。
（2）转膜
完成步骤（1）后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上；电压16V，转移约1.5h。
（3）封闭
完成步骤（2）后，用5%脱脂奶粉（用TBST溶液配制，TBST溶液为每1L水中含TriS2.42g、NaCl 8g、Tween-20 10ml，pH7.6）室温封闭硝酸纤维素膜1h，4℃封闭过夜。
（4）一抗结合
完成步骤（3）后，在硝酸纤维素膜上，加入用5%脱脂奶粉按一定比例稀释的一抗，室温轻摇1h，TBST溶液洗膜3次，每次5min。
一抗为兔抗人HK2抗体（美国ProteinTech公司）或辣根过氧化物酶偶联的β-actin抗体（美国ProteinTech公司）。
（5）二抗结合
完成步骤（4）后，在硝酸纤维素膜上，加入用5%脱脂奶粉按一定比例稀释的辣根过氧化物酶偶联的IgG（羊抗兔IgG抗体，美国Santacruz Biotech公司），室温轻摇1h，TBST溶液洗膜3次，每次5min。
（6）显影
完成步骤（5）后，用化学发光法显色8min，压片显影。
检测结果见图1中B（#1为HK2 siRNA1，#2为HK2 siRNA2，#3为HK2 siRNA3，NC为NCsiRNA）。结果表明，与阴性对照相比，转染HK2 siRNA1、HK2 siRNA2或HK2 siRNA3的人乳腺癌细胞ZR-75-1中HK2蛋白表达量显著下降，且HK2 siRNA1与HK2 siRNA2的下降效果更明显。
上述结果表明，在人乳腺癌细胞ZR-75-1中，HK2 siRNA1和HK2 siRNA2对HK2的表达具有最好的干扰效果。
实施例3、HK2 siRNA对人乳腺癌细胞ZR-75-1增殖的影响
将实施例2中步骤1获得的siRNA转染的人乳腺癌细胞ZR-75-1接种至96孔板，每孔接种约3000个，常规培养至贴壁；之后用Cell Counting Kit-8（日本Dojindo公司）于450nm检测OD值。连续检测5天，绘制生长曲线。
生长曲线见图2。结果表明，与NC siRNA相比，HK2 siRNA1、HK2 siRNA2和HK2siRNA3均能抑制人乳腺癌细胞ZR-75-1的增殖，且HK2 siRNA1对人乳腺癌细胞ZR-75-1增殖的抑制效果最明显。
综合上述实验结果，选择HK2 siRNA1作为后续研究的siRNA。
实施例4、靶向HK2基因的慢病毒载体构建及其对HK2基因干扰效果的鉴定
1、HK2 shRNA重组慢病毒载体和NC重组慢病毒载体的构建
（1）鉴于HK2 siRNA1对HK2抑制效果最好，因此基于HK2 siRNA1序列设计短发夹RNA（shRNA）序列，其上游引物为5’-GATCCATAAGCTACAAATCAAAGACTTCCTGTCAGATCTTTGATTT GTAGCTTATTTTTTG-3’（SEQ ID NO：13），下游引物为：5’-AATTCAAAAAATAAGCTACAAATCAAAGATCTGACAGGAAGTCTTTGATTTGTAGCTTATG-3’（SEQ ID NO：14）。将合成的上游引物和下游引物退火，得到DNA双链。
（2）用限制性内酶切BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切慢病毒表达载体pSIH1-H1-Puro（美国System Biosciences公司），回收载体骨架。
（3）将步骤（1）得到的DNA双链和步骤（2）回收的载体骨架进行连接，得到HK2shRNA重组慢病毒载体。
（4）基于NC siRNA序列设计短发夹RNA（shRNA）序列，其上游引物为5’-GATCCTTCT CCGAACGTGTCACGTCTTCCTGTCAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3’（SEQ ID NO：15），下游引物为：5’-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTGACAGGAAGACGTGACACGTTCGGAGAAG-3’（SEQID NO：16）。将合成的上游引物和下游引物退火，得到DNA双链。
（5）用限制性内酶切BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切慢病毒表达载体pSIH1-H1-Puro，回收载体骨架。
（6）将步骤（4）得到的DNA双链和步骤（5）回收的载体骨架进行连接，得到NC shRNA重组慢病毒载体。
2、病毒浓缩液的制备
（1）将HEK293T细胞（美国ATCC细胞库）接种于2个6cm培养皿，细胞密度为50-70%为宜，24h后进行转染。
（2）利用LipofeCtamine 3000转染试剂（美国Invitrogen公司）将1μg HK2 shRNA重组慢病毒载体与3μg pPack Packaging Plasmid Mix（美国System Biosciences公司）共同转染步骤（1）的HEK293T细胞，48h后4℃、4000g离心15min，收集上清液；将上清液用0.45μm过滤器过滤，之后滤液4℃、4000g离心15min，收集，即获得HK2 shRNA病毒浓缩液。
按照上述步骤，将HK2 shRNA重组慢病毒载体替换为NC shRNA重组慢病毒载体，其它步骤均不变，得到NC shRNA病毒浓缩液。
病毒浓缩液分装后-80℃冻存。
3、细胞感染
将步骤3制备的病毒浓缩液（HK2 shRNA病毒浓缩液或NC shRNA病毒浓缩液）感染人乳腺癌细胞ZR-75-1（美国ATCC细胞库）。具体步骤如下：
（1）将人乳腺癌细胞ZR-75-1接种于装有细胞培养基的培养皿（直径为6cm），常规培养24h。
（2）完成步骤（1）后，将培养基替换为含8pg/ml Polybrene的细胞培养基，再加入病毒浓缩液（HK2 shRNA病毒浓缩液或NC shRNA病毒浓缩液）；10h后换为细胞培养基；后期使用嘌呤霉素进行阳性筛选并扩增培养，得到病毒感染筛选后的人乳腺癌细胞ZR-75-1。
4、cDNA的获得及qRT-PCR鉴定HK2 shRNA对HK2基因的干扰效果
用Trizol（美国Invitrogen公司）提取病毒感染筛选后的人乳腺癌细胞ZR-75-1的总RNA，之后反转录，得到病毒感染筛选后的人乳腺癌细胞ZR-75-1的cDNA。以获得的病毒感染后的人乳腺癌细胞ZR-75-1的cDNA为模板，qRT-PCR检测病毒感染后的人乳腺癌细胞ZR-75-1中HK2基因的相对表达量（以β-actin基因作为内参基因）。
鉴定HK2基因的引物为：5’-GCCATCCTGCAACACTTAGGGCTTGAG-3’（SEQ ID NO：9）和5’-GTGAGGATGTAGCTTGTAGAGGGTCCC-3’（SEQ ID NO：10）。
鉴定β-actin的引物为5’-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’（SEQ ID NO：11）和5’-ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3’（SEQ ID NO：12）。
结果如图3中A所示。结果表明，与NC shRNA相比，HK2 shRNA显著抑制HK2的mRNA水平。
5、Western blot鉴定HK2 shRNA对HK2蛋白的干扰效果
提取步骤3获得的病毒感染筛选后的人乳腺癌细胞ZR-75-1的总蛋白，变性后SDS-PAGE电泳。
结果如图3中B所示。结果表明，与NC shRNA相比，HK2 shRNA显著抑制HK2蛋白的表达量。
qRT-PCR和Western blot的结果表明，步骤3获得的病毒（HK2 shRNA病毒浓缩液）感染筛选后的人乳腺癌细胞ZR-75-1为HK2敲低的人乳腺癌细胞ZR-75-1稳定细胞系，步骤3获得的病毒（NC shRNA病毒浓缩液）感染筛选后的人乳腺癌细胞ZR-75-1为对照细胞系。
实施例5、HK2敲低对人乳腺癌细胞ZR-75-1增殖的影响
将实施例4构建的HK2敲低的人乳腺癌细胞ZR-75-1稳定细胞系或对照细胞系接种至96孔板，每孔接种约3000个，常规培养至贴壁；之后用Cell Counting Kit-8（日本Dojindo公司）于450nm检测OD值。连续检测5天，绘制生长曲线。
生长曲线见图4（HK2 shRNA为HK2敲低的人乳腺癌细胞ZR-75-1稳定细胞系，NCshRNA为对照细胞系）。结果表明，与NC shRNA相比，HK2 shRNA能显著抑制人乳腺癌细胞ZR-75-1的增殖。
实施例6、HK2敲低对人乳腺癌细胞ZR-75-1侵袭的影响
通过Transwell侵袭实验，研究HK2敲低对细胞侵袭能力的影响。将实施例4构建的HK2敲低的人乳腺癌细胞ZR-75-1稳定细胞系和对照细胞系分别接种2×104个细胞到Transwell小室中，24h后进行吉姆萨染色，白光倒置显微镜下观察并拍照，进行统计。
实验结果见图5（A为白光倒置显微镜下的细胞状态，B为细胞数量的统计结果）。结果表明，与NC shRNA相比，HK2 shRNA视野下的细胞数量明显减少。由此可见，HK2 shRNA干扰了HK2后，细胞的侵袭能力减弱。
实施例7、HK2敲低对人乳腺癌细胞ZR-75-1糖酵解乳酸水平的影响
为了研究HK2对于人乳腺癌细胞ZR-75-1的糖酵解状况有无影响，采用乳酸检测试剂盒（美国Biovision公司）分别检测实施例4中构建的HK2敲低的人乳腺癌细胞ZR-75-1稳定细胞系和对照细胞系的乳酸含量。
实验结果见图6。结果表明，与NC shRNA相比，HK2 shRNA的乳酸含量较低。
由此可见，HK2表达被干扰后会降低人乳腺癌细胞ZR-75-1糖酵解能力。
实施例8、HK2敲低对裸鼠乳腺癌肿瘤生长的影响
为了探究HK2敲低对裸鼠肿瘤生长的影响，将实施例4构建的HK2敲低的人乳腺癌细胞ZR-75-1稳定细胞系和对照细胞系分别制成细胞悬液，进行裸鼠脂肪垫种植。每组6只小鼠，每只小鼠接种100μl细胞悬液（含5×106个细胞）。45天后，检测肿瘤大小和体积，进行统计学分析。
分析结果见图7。结果表明，与NC shRNA对照组相比，HK2 shRNA乳腺癌肿瘤体积显著降低（P<0.01）。由此可见，降低HK2基因的表达能够显著抑制乳腺癌肿瘤生长。
本发明构建的HK2敲低的人乳腺癌细胞ZR-75-1稳定细胞系为HK2低表达细胞株，为深入研究乳腺癌的作用分子机制奠定基础。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种HK2低表达的乳腺癌细胞系及其使用的siRNA
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial sequence
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<212> RNA
<213> Artificial sequence
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ucuuugauuu guagcuuauc c 21
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<212> RNA
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ucuugucuuu gauuuguagc u 21
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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cuuugauuug uagcuuaucc a 21
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<212> DNA
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g 61
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g 61

Claims (10)

1.抑制HK2蛋白活性和/或表达量的物质，为z1）或z2）：
z1）寡聚核酸siRNA1；所述寡聚核酸siRNA1由单链核酸分子1和单链核酸分子2组成；所述单链核酸分子1由SEQ ID NO：1所示的单链RNA分子和2个dT组成，2个dT位于3’端；所述单链核酸分子2由SEQ ID NO：2所示的单链RNA分子组成；
z2）以z1）中所述寡聚核酸siRNA1为靶点，由shRNA表达系统合成的shRNA。
2.如权利要求1所述的物质，其特征在于：所述由shRNA表达系统合成的shRNA由SEQ IDNO：13所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：14所示的单链DNA分子表达。
3.一种重组慢病毒载体，其制备方法如下：
（1）将SEQ ID NO：13所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：14所示的单链DNA分子进行退火，得到DNA双链；
（2）将慢病毒表达载体pSIH1-H1-Puro的限制性内酶切BamHⅠ和EcoRⅠ之间的DNA小分子替换为步骤（1）得到的DNA双链，得到重组慢病毒载体。
4.一种HK2低表达的乳腺癌细胞模型，其制备方法如下：
（1）将权利要求3所述重组慢病毒载体转染细胞，获得病毒液；
（2）用步骤（1）获得的病毒液感染乳腺癌细胞系，筛选获得HK2低表达的乳腺癌细胞系，即HK2低表达的乳腺癌细胞模型。
5.如权利要求4所述HK2低表达的乳腺癌细胞模型，其特征在于：所述步骤（1）中，细胞为HEK293T细胞。
6.如权利要求4所述HK2低表达的乳腺癌细胞模型，其特征在于：所述乳腺癌细胞系为人乳腺癌细胞ZR-75-1。
7.权利要求1所述抑制HK2蛋白活性和/或表达量的物质的应用，为A1）-A5）中的至少一种；
A1）制备用于抑制乳腺癌肿瘤的生长的产品；
A2）制备用于抑制乳腺癌细胞的增殖的产品；
A3）制备用于降低乳腺癌细胞侵袭能力的产品；
A4）制备用于降低乳腺癌细胞糖酵解能力的产品；
A5）制备用于构建HK2低表达的乳腺癌细胞模型的产品。
8.权利要求3所述重组慢病毒载体的应用，为A1）-A5）中的至少一种；
A1）制备用于抑制乳腺癌肿瘤的生长的产品；
A2）制备用于抑制乳腺癌细胞的增殖的产品；
A3）制备用于降低乳腺癌细胞侵袭能力的产品；
A4）制备用于降低乳腺癌细胞糖酵解能力的产品；
A5）制备用于构建HK2低表达的乳腺癌细胞模型的产品。
9.权利要求4所述HK2低表达的乳腺癌细胞模型的应用，为A1）、A2）、A3）和A4）中的至少一种；
A1）制备用于抑制乳腺癌肿瘤的生长的产品；
A2）制备用于抑制乳腺癌细胞的增殖的产品；
A3）制备用于降低乳腺癌细胞侵袭能力的产品；
A4）制备用于降低乳腺癌细胞糖酵解能力的产品。
10.如权利要求7至9任一所述的应用，其特征在于：所述降低乳腺癌细胞糖酵解能力为降低乳腺癌细胞乳酸含量。
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