CN116769828B - 调控nrf2转录因子活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了调控NRF2转录因子活性的方法。具体地，本发明公开了通过调节UTP11的活性能够实现对NRF2活性水平的调控；验证了靶向抑制UTP11，能够降低NRF2转录因子的活性；进一步揭示了UTP11和NRF2转录本结合形成的蛋白复合物。

Description

调控NRF2转录因子活性的方法

技术领域

本发明属于分子生物学和生物医药领域，具体地，本发明涉及一种调控NRF2转录因子活性的方法。

背景技术

NRF2是一种主要转录因子，通过调节大量抗氧化基因的表达来控制细胞的抗氧化反应。外界刺激(如药物、紫外线和电离辐射)和内源性自由基和活性氧(ROS)会直接或者间接地损伤蛋白质、脂质和DNA等细胞成分，为了抵御这些不利影响，机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统来缓解细胞所受的损害。而NRF2，作为调控抗氧化应激的一种关键转录因子，在诱导机体的抗氧化应答中起着重要作用，如调节氧化还原平衡、药物代谢和排泄、能量代谢、铁代谢、氨基酸代谢、生存、增殖、自噬、蛋白酶体降解、DNA修复和线粒体生理机能。另外，Keap1-NRF2系统已成为癌症和神经退行性疾病以及许多自身免疫和炎性疾病的重要治疗靶点；转录因子NRF2和ATF4可以提高SLC7A11的表达，帮助癌细胞在氧化应激下存活并抵抗铁死亡。

针对NRF2转录因子的靶向调控有利于疾病的致病机理的阐明和实验室药物开发模型的建立。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控NRF2转录因子活性的方法。

本发明的第一方面，提供了一种调控NRF2转录因子活性的方法，所述方法包括步骤：在真核细胞内调节UTP11基因的活性，从而实现对NRF2转录因子活性的调控。

在另一优选例中，所述真核细胞为哺乳动物离体细胞。

在另一优选例中，所述哺乳动物为人或小鼠。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

在细胞培养物中添加UTP11基因抑制，以抑制所述细胞培养物中细胞的UTP11基因的活性，从而实现对NRF2转录因子活性的抑制。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

在细胞培养物中添加UTP11基因激活剂，以促进所述细胞培养物中细胞的UTP11基因的活性，从而实现对NRF2转录因子活性的激活。

在另一优选例中，所述方法为非治疗性的。

在另一优选例中，所述方法为非诊断性的。

在另一优选例中，所述的UTP11基因来源于哺乳动物(包括人)。

在另一优选例中，所述UTP11基因的抑制剂为：UTP11基因特异性的siRNA或其前体、UTP11基因特异性的microRNA或其前体、抑制UTP11基因启动子的抑制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述UTP11基因的抑制剂为UTP11基因特异性的siRNA或其前体、或microRNA或其前体。

在另一优选例中，所述siRNA特异性靶向UTP11基因中SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示的序列或其互补序列。

在另一优选例中，所述UTP11基因编码蛋白的抑制剂选自下组：UTP11基因编码蛋白的抗体、UTP11基因编码蛋白的结合蛋白。

本发明的第二方面，提供了一种蛋白复合物，所述蛋白复合物为UTP11蛋白和NRF2转录本结合而成。

在另一优选例中，所述的UTP11来源于哺乳动物(包括人)。

在本发明的第三方面，提供了一种测试化合物作用靶标的方法，所述方法包括步骤：

在细胞培养物中添加待测试化合物，并检测所述待测化合物是否抑制本发明第二方面所述的蛋白复合物的形成。如果所述化合物抑制了本发明第二方面所述的蛋白复合物的形成，则判断该化合物的作用靶标为UTP11蛋白和NRF2转录本结合而成蛋白复合物。当然，也可以采用该方法，测试化合物活性。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1、图2显示了siUTP11-1、siUTP11-2能够显著降低UTP11 mRNA的转录水平。

图3、图4显示了在MCF-7乳腺癌细胞系中，两个独立的siRNA(siUTP11-1、siUTP11-2)能够敲低UTP11，显著降低UTP11 mRNA的转录水平。

图5、图6显示了在HCT116 p53+/+结直肠癌细胞系中，两个独立的siRNA(siUTP11-1、siUTP11-2)能够敲低UTP11，显著降低UTP11 mRNA的转录水平。

图7、图8显示了在HCT116 p53-/-结直肠癌细胞系中，两个独立的siRNA(siUTP11-1、siUTP11-2)能够敲低UTP11，显著降低UTP11 mRNA的转录水平。

图9显示了敲低UTP11时多个靶基因的表达减少。

图10显示了HCT116 p53+/+结直肠癌细胞系中，使用siUTP11-1、siUTP11-2敲低UTP11时，NRF2基因的mRNA相对表达量显著减少。

图11显示了HCT116 p53+/+结直肠癌细胞系的免疫印迹结果。

图12显示了HCT116 p53-/-结直肠癌细胞系中，使用siUTP11-1、siUTP11-2敲低UTP11时，NRF2基因的mRNA相对表达量显著减少。

图13显示了HCT116 p53-/-结直肠癌细胞系的免疫印迹结果。

图14显示了RNA免疫沉淀(RIP)检测显示异位UTP11与NRF2转录本结合形成蛋白复合物。

图15显示了UTP11敲除显著降低了NRF2 mRNA水平，表明UTP11是NRF2mRNA稳定所必需的。

图16显示了染色质免疫沉淀(ChIP)实验证明UTP11的缺失减少了NRF2与SLC7A11启动子的结合，而UTP11的过表达增加了NRF2与SLC7A11启动子的结合。

图17显示了免疫印迹分析进一步验证了UTP11敲除抑制而其过表达提高了SLC7A11表达。

图18和图19显示了siRNA敲除UTP11显著抑制了CAL-51和MCF-7乳腺癌细胞的活力。

图20和图21显示了siRNA敲除UTP11显著抑制了CAL-51和MCF-7乳腺癌细胞的克隆形成能力。

图22显示了UTP11缺乏显著降低了移植瘤的生长速度.

图23显示了UTP11缺乏并不显著影响小鼠体重。

图24显示肿瘤的重量随着UTP11的损耗而减少。

图25显示肿瘤的大小也随着UTP11的损耗而减少。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外发现通过调节UTP11的活性能够实现对NRF2活性水平的调控。本发明首次公开了靶向抑制UTP11，能够降低NRF2转录因子的活性，并首次揭示了UTP11和NRF2转录本结合形成的蛋白复合物。在此基础上，完成了本发明。

术语

UTP11基因及其编码蛋白

人类UTP11最初是通过比较蛋白质组学方法以秀丽隐杆线虫蛋白质组为模板鉴定出来的。然而，它的生物学功能几十年来一直不清楚。

人UTP11基因(NCBI序列号Gene ID:NM_016037)位于1p34.3染色体上。在人类细胞中，该基因编码的蛋白可能参与核糖体小亚基的生物合成，可能参与肿瘤的发生过程，但其具体功能和作用机制未知。

在本发明优选地实施方式中，所述UTP11基因的序列如SEQ ID NO.1所示：

agtggacttggcggcagaggcagtgcggatccggcgttctccactgatcttttccaaggctgtacagacatggcggcggcttttcggaaggcggctaagtcccggcagcgggaacacagagagcgaagccagcctggctttcgaaaacatctgggcctgctggagaaaaagaaagattacaaacttcgtgcagatgactaccgtaaaaaacaagaatacctcaaagctcttcggaagaaggctcttgaaaaaaatccagatgaattctactacaaaatgactcgggttaaactccaggatggagtacatattattaaggagactaaggaagaagtaaccccagaacaactaaagctgatgagaactcaggacgtcaaatatatagaaatgaagagggttgcagaagctaagaaaatcgaaagactaaaatcagagctccatctgctggatttccaggggaagcaacagaacaagcatgtgttcttttttgacaccaaaaaggaagttgaacagtttgatgtcgcaactcacctgcaaacagccccggagctagtcgacagagtctttaataggcccaggatagagaccttgcagaaagaaaaagtgaaaggagttaccaatcagactggacttaagcgaatagctaaagaaaggcaaaagcagtataactgcctgacacagcggattgaacgagagaagaaattgttcgttattgctcagaaaattcaaacacgcaaagatcttatggataaaactcagaaagtgaaggtgaagaaagaaacggtgaactccccagctatttataaatttcagagtcgtcgaaaacgttgacgtgttatagataagccttgtcattctgtatcaaaaatctgttgtcgttttctagtaacttcaaattccattactccaaatggcatggttttccggtttgtaaccataactaaattgtcagtctgacatttaatgtctttctatggacaacattaaatctccctcccttctgtaattgtttttggattgtgaaattagtcttatttttatatacttaattttttttttctttgagatagggtctttgttgccaggctggaagtgcagtgtgtgattatggctcactgcaactttgaactcctgggctcaagtgatcttcctgcatcagcctcttgagtagctgggaccacagacatgtgccaccatgtctgagtaatgtttaaattttctgtagagaccaggttttgccatgttggccaggctggttttgaactcgtggcctcaagcgatcctcccaccttggcctcccaaagggctgggattacagggatgagccactatgcccagcccataattttttttgttatgaaacataggatctcattacagcagatttggaaagtagattaattcattcctaatcccagtgcttattcaataataacaaatatttattgcatgcttaactgtgctaggagctagagctgtggaggtggacaattactgtgagtagtctagttgatttcctccattttgtaaaacgaggcatcactttttgtccatgtttttgtgttttatagttacagtaaacaatttgatgtcctactttttttttttttttttttgagacggagtctcgctctgtcgcccaggccggactgcggactgcagtggcgcaatctcggctcactgcaagctccgcttcccgggttcacgccattctcctgcctcagcctcccgagtagctgggactacaggcgcccgccaccgcgcctggctaatttttttttgtatttttttagtagagacggggtttcaccttgttagccaggatggtctcgatctcctgacctcatgatccacccgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccaccgcgcccggccgatgtcctactttttaattaaatcattagctctttcccagtttgttacatcacaaaagttttttacagtaatatatgctagagtaaacgttaaaataaatattatttttaatga(SEQ ID NO.1)

在本发明优选地实施方式中，所述UTP11基因编码蛋白的序列如SEQ ID NO.2所示:

MAAAFRKAAKSRQREHRERSQPGFRKHLGLLEKKKDYKLRADDYRKKQEYLK

ALRKKALEKNPDEFYYKMTRVKLQDGVHIIKETKEEVTPEQLKLMRTQDVKYI

EMKRVAEAKKIERLKSELHLLDFQGKQQNKHVFFFDTKKEVEQFDVATHLQTA

PELVDRVFNRPRIETLQKEKVKGVTNQTGLKRIAKERQKQYNCLTQRIEREKKLFVIAQKIQTRKDLMDKTQKVKVKKETVNSPAIYKFQSRRKR(SEQ ID NO.2)

本发明的UTP11基因编码蛋白可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。

UTP11基因的抑制剂

如本文所用，术语“UTP11基因的抑制剂”是指抑制UTP11基因基因复制或转录的物质，或减少UTP11基因表达的物质，UTP11基因的抑制剂包括(但不限于)：siRNA、microRNA、化合物、或其组合。UTP11基因的抑制剂优选siRNA、或microRNA。

如本文所用，术语“RNAi”(RNA interference,RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、高效特异性降解具有互补配对序列的RNA的现象。由于使用RNAi技术可以特异性关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及肿瘤的基因治疗等领域。

如本文所用，术语“siRNA”(Small interfering RNA,siRNA)是指一种小RNA分子(约21-25个核苷酸)，可由Dicer(RNA酶Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)从其前体(比如dsRNA、shRNA等)加工而成，也可由化学方法合成或由其它蛋白加工产生。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之序列互补的目标RNA被迅速切割降解，导致目标基因的沉默，因此成为RNAi中的关键功能分子。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种具有本发明siRNA序列的siRNA前体。如本文所用，术语“siRNA前体”是指可以在哺乳动物细胞中被加工产生siRNA的RNA分子，具体地说，是由Dicer或其它类似蛋白选择性加工从而产生成熟的siRNA，进而实施RNAi。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种核酸构建物。如本文所用，术语“构建物”是包含本发明siRNA前体的核酸构建物。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种表达盒。如本文所用，术语“表达盒”是指包含本发明siRNA前体的编码序列以及与所述编码序列操作性相连的启动子和终止信号的表达盒，所述表达盒在转录后产生本发明的siRNA前体。

在活体中产生“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”的一部分克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列)被表达出来，形成一个带有顶端环结构的“双链RNA”(shRNA)，被细胞内的Dicer蛋白所识别和加工，产生有功能的siRNA。

如本文所用，术语“shRNA”是以人miR-26b的前体作为骨架构建的一种特殊的shRNA。所述shRNA从5′端到3′端依次为：(a)5′端旁侧序列区；(b)5′端配对siRNA区域；(c)顶端环区域；(d)3′端配对siRNA区域，并且所述5′端配对siRNA区域与3′端配对siRNA区域形成双链区域；(e)3′端旁侧序列区；所述shRNA产生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端配对siRNA区域或5′端配对siRNA区域。

广义的shRNA是short hairpin RNA的缩写，即，“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向互补序列，中间由一顶端环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，通常由细胞内源的RNA聚合酶III(RNApolymeraseIII)启动子控制转录，shRNA序列的末端连接5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。shRNA也可以由其它RNA聚合酶的启动子转录产生。

如本文所用，术语“miRNA”(microRNA)是一类由内源基因编码的长度约20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在动植物中参与对大量基因的表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现四千多种miRNA分子。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。每种miRNA可以调控多个靶基因，而几种miRNA也可以共同参与调节同一基因，组成复杂的调节网络。据推测，miRNA调节着人类一半以上基因的表达。miRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA；pri-miRNA经过Drosha加工后，成为pre-miRNA，即miRNA前体，长度大约为50-90个核苷酸；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24个核苷酸的成熟miRNA。miRNA主要通过抑制翻译和加速mRNA的脱腺苷酸化抑制靶基因表达，其机制有别于siRNA介导的mRNA降解。

UTP11基因编码蛋白的抑制剂

如本文所用，术语“UTP11基因编码蛋白的抑制剂”是指抑制UTP11基因编码蛋白活性的物质。

在一个优选地实施方式中，UTP11基因编码蛋白的抑制剂选自下组：特异性抗UTP11基因编码蛋白的抗体、特异性结合UTP11基因编码蛋白的结合蛋白、抑制UTP11基因编码蛋白活性的化合物等。

NRF2基因及其编码蛋白

核因子红血球相关因子2(nuclear factor erythroid 2－related factor 2，Nrf2)是人体细胞感应氧化还原状态的关键转录调控因子，是细胞抵抗氧化损伤维持自身稳定的关键调节蛋白。综合细胞内受Nrf2调控基因的作用显示，其对细胞具有抗氧化、促生存、抗炎症和大分子损伤修复等作用。另一方面，研究发现Nrf2功能失调通常与肿瘤、心血管病和神经退行性病等多种疾病密切相关。但当前，人们对人Nrf2蛋白结构与功能的了解仍十分有限。

NCBI中人Nrf2基因位于2号染色体上(2q31.2)，含有6个外显子(Nrf2－ECHhomology domains)，编码产物NP_001138884.1为该基因的共识编码序列，基因ID为4780。

NRF2是Cap-n-collar(CNC)转录因子家族成员，由七个Neh域(NRF2 ECH同源结构域)组成，每个域具有不同的功能，如Neh1 CNC-bZIP域负责与small Maf(sMAF)蛋白结合和二聚化；Neh2结构域通过DLG和ETGE基序介导与Keap1的相互作用；Neh4、Neh5和Neh3域对于NRF2的反式激活非常重要；Neh6结构域是一个富含丝氨酸的区域，可调节自我的稳定性。

本发明的主要优点在于：

(1)首次发现UTP11通过和NRF2 mRNA结合形成复合物来增加NRF2mRNA的稳定性。

(2)验证了通过调控UTP11基因能够实现对NRF2基因活性的调控。

(3)首次发现了靶向UTP11可通过抑制抗氧化转录因子NRF2诱导p53独立的铁死亡。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计。

实施例

(I)材料与方法

细胞培养和瞬时转染

将人癌细胞系CAL-51、MCF-7、HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-和RKO(购自ATCC)培养在添加含有10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(0.1mg/ml)的Dulbecco改良Eagle培养基中，孵育在含5％ CO2的37℃加湿培养箱中培养。

按照S说明书(中国上海易森)，质粒和RNAsiRNA使用Hieff反式脂质体转染试剂被瞬时转染到细胞中，并按照图例中所示在板上过夜。转染后36-72小时收集细胞用于后续实验。环己酰亚胺(CHX)和蛋白酶体抑制剂MG132购自Med Chem Express(中国)。

质粒和抗体

编码HA-MDM2,p53,His-Ub的质粒为已公开质粒。标记的pENTER-UTPUTP11质粒购自维吉尼生物科学公司(中国)。将人UTP11亚克隆到带有Flag标签的pcDNA3.1载体中。

本实施例所用抗体均购买自相应的商业化公司，例如：

抗UTP11抗体：Cat NO:46701，圣克鲁斯生物技术公司；

抗p53抗体：Cat NO:sc-126,DO-1，圣克鲁斯生物技术公司；

抗GAPDH抗体：Cat NO:60004-1-Ig，Proteintech公司；

抗p21抗体：细胞信号技术公司；

抗NRF2(Cat NO:16396-1-AP，武汉三鹰)；

抗vinculin抗体(Cat NO:13901，细胞信号技术公司)

二抗为酶联亲和山羊抗兔IgG(Cat NO:SA00001-2,武汉三鹰)和抗小鼠IgG(CatNO:SA00001-1，武汉三鹰)。

蛋白质显影用ECL化学发光试剂(Yeasen公司)。

RNA-测序

收集转染了siNC或siUTP11 48小时后的CAL-51细胞，按照说明书(日本，Takara公司)使用RNAiso Plus分离总RNA，由OEbiotech(中国)提供RNA测序服务。

逆转录和实时定量PCR

使用RNAiso Plus(日本，Takara公司)分离总RNA。以0.2-0.5微克RNA为模板，用Hiscript III qRT SuperMix(中国，诺唯赞公司)RNA合成互补DNA(cDNA)。根据说明书(中国，诺唯赞公司)使用SYBR qPCR Master Mix进行定量PCR(qPCR)。用GAPDH作为内部参照，通过比较Ct法计算RNA的mRNA的相对表达量。

免疫印迹

在冰-冷的裂解缓冲液[50mm Tris/HCl(pH 7.5)，0.5％NP-40，1毫摩尔EDTA,150毫摩尔NaCl,1毫摩尔二硫苏糖醇(DTT)，0.2毫摩尔苯甲基磺酰氟(PMSF)，10微摩尔pepstatatin A,1微克/毫升leupeptin和10％蛋白酶抑制剂鸡尾酒]中提取蛋白质。使用等量的透明细胞裂解物(20-80微克)用于免疫印迹(IB)分析。

免疫沉淀反应

CAL-51细胞转染对照或UTP11 siRNA 48小时,MG132处理4-6小时后收获。免疫沉淀(IP)使用抗体进行。简单地说，500-1000微克的蛋白质与指示抗体在4℃孵育5小时。然后加入蛋白A或g珠(美国，圣克鲁斯生物技术有限公司)，混合物在4℃孵育2小时。用裂解缓冲液洗涤6-8次。用免疫吸附法检测蛋白质相互作用。

免疫荧光染色

转染siRNA和质粒的HCT116 p53+/+和HEK293T细胞在-20℃预冷的甲醇中固定过夜。用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗固定细胞，用8％牛血清白蛋白(BSA)在PBS中封闭1小时，然后与含2％牛血清白蛋白的一抗，在4℃孵育过夜。之后，用PBS清洗细胞，并与相应的荧光二抗和DAPI孵育。用倒置荧光显微镜(德国，徕卡)获取图像。

体内泛素化试验

将稳定表达shNC或shUTP11的HCT116 p53-/-细胞转染编码p53、HA-MDM2或His-Ub的质粒，收样前用MG132处理4-6小时。转染48小时后，细胞被收集并分裂成两个等分体，一个用于免疫吸附，另一个用于泛素化试验。简言之，细胞碎片溶解在缓冲液[8摩尔尿素,0.1摩尔Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH值8.0),10毫摩尔Tris-HCl(pH值8.0),10毫摩尔β巯基乙醇,咪唑和5毫摩尔咪唑]，在室温下与Ni-NTA珠子共孵育4小时为了捕获His-tagged蛋白质/复合物。用缓冲液I洗Ni-NTA珠子和洗了两次,然后用缓冲液II[8摩尔尿素,0.1摩尔Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH值6.3),10毫摩尔Tris-HCl(pH值6.3)，10毫摩尔β巯基乙醇]洗两次。洗脱捕获的蛋白并与指示抗体吸附用于免疫印迹分析。

统计学

体外实验均进行生物学三次重复。p值通过GraphPad Prism 5.0进行测试或方差分析获得。采用Kaplan-Meier法分析两组患者生存期的显著差异。P<0.05认为差异有统计学意义。采用多变量Cox比例风险模型计算95％置信区间的风险比。星号表示有统计学意义:*p<0.05；**p<0.01；***P<0.001。定量数据以平均值±标准差表示。

RNA干扰和稳定细胞系的产生

本发明所用的siRNA由GenePharma(中国，上海)合成和纯化。

siRNA序列如下：

siUTP11-1：5'-GAAGCTAAGAAAATCGAAA-3'(SEQ ID NO.3)；

siUTP11-2：5'-GGATGGAGTACATATTATT-3'(SEQ ID NO.4)；

使用Hieff反式脂质体转染试剂，按照说明书的要求将siRNA导入细胞。转染IB或RT-qPCR 48-72小时后收集细胞。将获得的UTP11的shRNA序列亚克隆到pLKO.1质粒中。

shRNA质粒和包装质粒psPAX2和pMD2.G一起转染进HEK293T细胞。转染48小时后收集慢病毒颗粒，然后用于CAL-51、HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-细胞的感染。用1微克/毫升嘌呤霉素培养稳定细胞。

细胞活力测定

根据生产商的说明书(Dojindo)，用细胞计数Kit-8(CCK-8)法评估细胞活力。转染后6～12小时，在96孔培养板中每孔接种2～3.5×10³细胞，每孔重复3次。在不同时间点以最终浓度为10％的CCK-8添加到每个孔中，使用Microplate Reader在450纳米处测量样品的吸光度。

菌落形成试验

转染后6～18小时，将1×10³细胞置于6厘米板上，培养14天。每3天更换一次培养基，直到菌落可见为止。用甲醇固定菌落，用0.2％结晶紫溶液在室温下下染色30分钟。用ImageJ软件对菌落计数进行量化。

小鼠异种移植研究

4周龄雌性BALB/c裸鼠购于复旦大学上海癌症中心并在实验动物科学中心饲养。将稳定表达shNC或shUTP11的CAL-51细胞[6×10⁶细胞悬浮在DMEM与50％Matrigel(BDBiosciences)]注射到小鼠右侧。为了验证UTP11缺陷介导的肿瘤抑制作用是否依赖于p53，我们使用5×10⁶HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-稳定表达shNC或shUTP11的细胞进行了另外一组实验。用电子数字卡尺监测肿瘤的长度和宽度，肿瘤体积计算公式为:肿瘤体积(mm³)＝(长×宽)×0.52。最后采用安乐死法处死小鼠，采集肿瘤进行分析。动物实验方案符合伦理准则，并经复旦大学上海癌症中心动物福利委员会批准。

RNA免疫沉淀反应

收集转染空载体或Flag-UTP11的细胞，并悬浮在RIP缓冲液(10毫摩尔Tris,150毫摩尔NaCl,1毫摩尔Na₂EDTA.2H2O,3.5毫摩尔SDS,1毫摩尔DTT,1％NP-40,pH 7.4)。细胞裂解物用抗flag磁珠(Cat No：B26101,bimake，上海，中国)在4℃下共孵育过夜。用RIP缓冲液冲洗6次，然后进行RNA纯化和RT-qPCR分析。

RNA稳定性试验

为了确定UTP11敲除是否影响HCT116 p53-/-细胞中NRF2 mRNA的稳定性，我们用5微克/毫升放线菌素D(Cat No：HY-17559,MedChemExpress公司)在不同时间点处理细胞。然后收集细胞进行RNA分离和RT-qPCR分析。

染色质免疫沉淀反应

细胞在室温下用37％甲醛交联10分钟，用甘氨酸中和至最终浓度0.2摩尔并交联5分钟。用冷PBS洗涤三次后收集细胞，细胞被悬浮在细胞裂解缓冲液(50毫摩尔Tris-HCl pH7.5,140毫摩尔NaCl,1毫摩尔EDTA,10％甘油，0.5％NP-40,0.25％ TritonX-100和蛋白酶抑制剂)中，在冰上孵育30分钟。细胞核重新悬浮在0.5毫升裂解缓冲液(50毫摩尔Tris-HClpH 8.0,10毫摩尔EDTA,1％SDS，蛋白酶抑制剂裂解液)中。超声处理后(30个循环，开30s，关30s)，裂解物经12000g离心5分钟，上清与抗NRF2或IgG混合过夜，然后与蛋白A/g珠在4℃下混合2小时。用低盐洗涤缓冲液(50毫摩尔Tris-HCl pH 8.0,0.1％ SDS,0.5％脱氧胆酸，1毫摩尔EDTA,1％NP-40，和150毫摩尔NaCl)依次洗涤珠子，高盐洗涤缓冲液(50毫摩尔Tris-HCl pH 8.0,0.1％ SDS,0.5％脱氧胆酸，1毫摩尔EDTA,1％NP-40，和500毫摩尔NaCl)，LiCl洗涤缓冲液(50毫摩尔Tris-HCl pH 8.0,250毫摩尔LiCl,0.1％ SDS,0.5％脱氧胆酸，1毫摩尔EDTA,1％NP-40，和TE缓冲液(10毫摩尔Tris-HCl pH 8.0,1毫摩尔EDTA,1％NP-40，和1毫摩尔EDTA)。蛋白质-DNA复合物用ChIP洗脱缓冲液(1％ SDS和0.1M NaHCO3)洗脱。62℃脱交联2小时后，提取DNA，用qPCR分析。

(II)结果

UTP11的敲减

针对UTP11基因，使用具有明显敲减效果的siRNA(siUTP11-1、siUTP11-2)进行实验。

通过对CAL-51乳腺癌细胞进行了RNA-测序(RNA-seq)分析，发现siUTP11-1、siUTP11-2能够显著降低UTP11 mRNA的转录水平，并观察到多个p53靶基因的上调证明了这一点(图1、图2)。

图3、图4显示了在MCF-7乳腺癌细胞系中，两个独立的siRNA(siUTP11-1、siUTP11-2)同样能够敲低UTP11，显著降低UTP11 mRNA的转录水平。

图5、图6显示了在HCT116 p53+/+结直肠癌细胞系中，两个独立的siRNA(siUTP11-1、siUTP11-2)能够敲低UTP11，显著降低UTP11 mRNA的转录水平。

图7、图8显示了在HCT116 p53-/-结直肠癌细胞系中，两个独立的siRNA(siUTP11-1、siUTP11-2)能够敲低UTP11，显著降低UTP11 mRNA的转录水平。

对RNA-seq数据进行分析，图9显示了敲低UTP11时多个靶基因的表达减少。

图10显示了HCT116 p53+/+结直肠癌细胞系中，使用siUTP11-1、siUTP11-2敲低UTP11时，NRF2基因的mRNA相对表达量显著减少。

HCT116 p53+/+结直肠癌细胞系的免疫印迹结果同样表明，使用siUTP11-1、siUTP11-2敲低UTP11时，NRF2表达量显著减少(图11)。

图12显示了HCT116 p53-/-结直肠癌细胞系中，使用siUTP11-1、siUTP11-2敲低UTP11时，NRF2基因的mRNA相对表达量显著减少。

HCT116 p53-/-结直肠癌细胞系的免疫印迹结果同样表明，使用siUTP11-1、siUTP11-2敲低UTP11时，NRF2表达量显著减少(图13)。

通过设计两对RT-qPCR和凝胶电泳检测特异的引物，用RNA免疫沉淀(RIP)检测显示异位UTP11与NRF2转录本结合形成蛋白复合物(图14)。

此外，当5微克/毫升放线菌素D阻断DNA转录时，UTP11敲除显著降低了NRF2 mRNA水平，表明UTP11是NRF2 mRNA稳定所必需的(图15)。

最后，本发明测试了UTP11是否影响NRF2对SLC7A11启动子的招募。

染色质免疫沉淀(ChIP)实验显示，UTP11的缺失减少了NRF2与SLC7A11启动子的结合，而UTP11的过表达增加了NRF2与SLC7A11启动子的结合(图16)。

免疫印迹分析进一步验证了这一结果，UTP11敲除抑制，而其过表达提高了SLC7A11表达(图17)。

综上所述，本发明对NRF2及其靶基因的表达进行了免疫印迹和RT-qPCR分析。结果表明UTP11的消融显著抑制了多种癌细胞系中NRF2 mRNA和蛋白水平上的表达。由于UTP11可能具有RNA结合能力，本发明证实了UTP11通过与其结合影响NRF2 mRNA的稳定性。

NRF2是一种主要转录因子，通过调节大量抗氧化基因的表达来控制细胞的抗氧化反应。有报道称，抑制NRF2可通过减少SLC7A11的表达引起非依赖p53的铁死亡。因此，本发明证明了UTP11通过NRF2调节SLC7A11的表达，即UTP11缺失通过促进NRF2 mRNA的降解来抑制SLC7A11的表达。

使用两个独立的siRNA敲除UTP11显著抑制了CAL-51和MCF-7乳腺癌细胞的活力(图18和图19)和克隆形成能力(图20和图21)。

与这些基于细胞的结果一致，本发明发现靶向UTP11抑制了乳腺癌细胞在体内的生长。将稳定表达对照细胞或UTP11 shRNA的CAL-51细胞通过皮下注射于裸鼠侧部。UTP11缺乏显著降低了移植瘤的生长速度(图22)，但并不显著影响小鼠体重(图23)。

此外，肿瘤的重量和大小也随着UTP11的损耗而减少(图24和25)。这些结果表明，靶向UTP11在体外和体内均能抑制肿瘤生长。UTP11缺失通过促进NRF2 mRNA的降解来抑制SLC7A11的表达，进而引起肿瘤细胞铁死亡，实现抑制肿瘤的效果。因此，通过UTP11调节NRF2的活性水平，能够建立肿瘤细胞模型用于研究抗肿瘤药物的作用机理，或者用于筛选靶向性的抗肿瘤药物。

讨论

UTP11通过与NRF2 mRNA结合稳定NRF2 mRNA，而靶向UTP11促进NRF2mRNA降解和其靶基因SLC7A11的下调，从而导致铁死亡。

值得注意的是，我们的研究通过多种证据表明，靶向UTP11促进了NRF2/SLC7A11介导的铁死亡。UTP11通过增加NRF2 mRNA的稳定性增强了NRF2介导的SLC7A11的转录。值得注意的是，其他几个NRF2靶基因，如HMOX1和NQO1，它们与抗氧化活性和铁死亡相关，也被发现在UTP11缺失的癌细胞中下调。总之，这些结果表明，靶向UTP11可通过抑制抗氧化转录因子NRF2诱导p53独立的铁死亡。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种用于非治疗和非诊断目的的调控NRF2转录因子活性的方法，所述方法包括步骤：在真核细胞培养物中添加UTP11基因抑制剂，以抑制所述细胞培养物中细胞的UTP11基因的活性，从而实现对NRF2转录因子活性的抑制；

所述UTP11基因抑制剂为UTP11基因特异性的siRNA，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真核细胞为哺乳动物离体细胞。