JP5662766B2 - 癌関連タンパク質を標的とするＲＮＡｉプローブ - Google Patents

Description

本出願は、援用を認める権限内で参照により本明細書に組み込まれる、２００２年８月２１日に出願された米国仮出願第６０／４０５，１９３号、２００２年９月３日に出願された米国仮出願第６０／４０８，１５２号、及び２００３年５月２０日に出願された米国仮出願第６０／４７２，３８７号の利益及び優先権を主張するものである。

本出願は、癌治療及び他の疾患の治療に有用な短鎖ＲＮＡ二本鎖ｉプローブに関する。ＲＮＡ干渉すなわち「ＲＮＡｉ」は、ＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ）が、線虫に導入されると、遺伝子発現を阻害することができるという知見を説明するために、ファイア（Ｆｉｒｅ）とその仲間により最初に作られた用語である（参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｔｕｒｅ ３９１、８０６〜８１１頁、ファイア（Ｆｉｒｅ）ら（１９９８））。ｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後のサイレンシングを指令するものであり、遺伝子の機能研究のための新しい手段を提供した。ＲＮＡｉはｍＲＮＡの分解に関わっているものの、この干渉の基礎となる生化学的メカニズムの多くは未知である。ＲＮＡｉの使用は、参照により本明細書に組み込まれる、カルシュ（Ｃａｒｔｈｅｗ）らによる、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３、２４４〜２４８頁（２００１）、及びエルバシル（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）らによる、Ｎａｔｕｒｅ ４１１、４９４〜４９８頁（２００１）でさらに説明されている。

任意のｍＲＮＡ分子内には、ＲＮＡｉプローブによる影響を受ける部位と影響を受けない部位がある。従って、単に配列全体を適切な長さ（例えば、２１〜２３塩基対）の配列に切り分けるだけでは、機能的なＲＮＡｉベースの治療剤を見いだすことはできない。実際に、公表された米国特許出願２００２−００８６３５６−Ａ１は、標的部位が、ｍＲＮＡ配列のどこに位置するのかを調べるのに使用する方法を開示しているが、この方法が有効なＲＮＡｉ配列を開発する唯一の手段であるわけではない。

米国特許出願２００２−００８６３５６−Ａ１

ファイア（Ｆｉｒｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１、８０６〜８１１頁（１９９８）
カルシュ（Ｃａｒｔｈｅｗ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３、２４４〜２４８頁（２００１）
エルバシル（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ４１１、４９４〜４９８頁（２００１）

本発明は、前立腺癌、骨肉腫などの肉腫、腎細胞癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、未分化大細胞リンパ腫及びメラノーマを含む様々な種類の癌の治療、及びアルツハイマー病の治療における治療剤として有用なＲＮＡｉ配列を提供する。これらの配列は、クラステリン、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＦＢＰ−５の両方、Ｍｉｔｆ並びにＢ−ｒａｆを標的とする。

本発明はさらに、前立腺癌、骨肉腫などの肉腫、腎細胞癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、未分化大細胞リンパ腫及びメラノーマを含む様々な種類の癌の治療、及びアルツハイマー病の治療におけるこれらのＲＮＡｉ配列の使用、並びにＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡ分子を、そうした治療を必要とするヒト個体などの個体に投与することにより、そのような症状を治療する方法を提供する。

本発明は、ＲＮＡｉを仲介する、単離ＲＮＡ分子に関する。すなわち、本発明の単離ＲＮＡ分子は、標的遺伝子とも呼ばれる遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの分解を仲介する。便宜上、このようなｍＲＮＡは、本明細書において、分解されるｍＲＮＡとも呼ぶことができる。ＲＮＡ、ＲＮＡ分子、ＲＮＡセグメント及びＲＮＡ断片という用語は、ＲＮＡ干渉を仲介するＲＮＡを呼ぶのに交換可能に用いることができる。これらの用語は、ＲＮＡ二本鎖、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡ（部分精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えにより作製されたＲＮＡ）、さらに１又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変により、天然のＲＮＡとは異なる改変型ＲＮＡを含む。このような改変は、例えばＲＮＡの末端又は内部における（ＲＮＡの１又は複数のヌクレオチドにおける）ヌクレオチドではない物質の付加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、天然には存在しないヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドなどの非標準的なヌクレオチドを含むこともできる。包括的に、全てのこのような改変されたＲＮＡｉ複合物は、アナログ又は天然ＲＮＡのアナログと呼ばれる。本発明のＲＮＡは、ＲＮＡｉを仲介する能力を有するという点で天然のＲＮＡに十分に類似していることだけを必要とする。本明細書で用いられる「ＲＮＡｉを仲介する」という句は、ＲＮＡｉの機構又はプロセスにより影響を受けるべきｍＲＮＡを識別する能力を指し示す。ＲＮＡｉを仲介するＲＮＡは、特定のｍＲＮＡを分解し、さもなければ標的タンパク質の発現を抑える機構を指令するように、ＲＮＡｉの機構と相互に作用する。１つの実施形態では、本発明は、その配列が対応する特定のｍＲＮＡの分解を指令するＲＮＡ分子に関する。その配列に完全に一致する必要は無いが、その一致が、ＲＮＡが標的ｍＲＮＡの分解又は発現の欠如によりＲＮＡｉ阻害を指令することができるのに十分でなければならない。

前述のように、本発明のＲＮＡ分子は一般に、ＲＮＡ部分及び幾つかの付加的な部分、例えばデオキシリボヌクレオチド部分を含む。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドの総数は、ＲＮＡｉの効果的な仲介物となるためには、４９未満が適当である。好ましいＲＮＡ分子において、ヌクレオチドの数は１６〜２９、さらに好ましくは１８〜２３、最も好ましくは２１〜２３である。

ｓｉＲＮＡ仲介クラステリン遺伝子発現サイレンシング後にＳａ ＯＳ細胞、ＫＨ ＯＳ細胞及びＵ−２ ＯＳ細胞の細胞数の計測により見積った相対増殖率を示す図である。５×１０^３細胞／細胞系を６穴プレートに播き、ｓｉＲＮＡで７０時間処理後、全細胞数を計測した。細胞数の有意な減少が、Ｕ−２ ＯＳ細胞でより顕著であり、全てのクラステリンノックダウン細胞で認められた。 細胞増殖ＥＬＩＳＡ ＢｒｄＵ呈色性免疫測定法により見積った、クラステリンノックダウンＫＨ ＯＳ細胞及びＵ−２ ＯＳ細胞における内生的なＤＮＡ合成レベルを示す図である。クラステリンノックダウンでは、両細胞系においてＤＮＡ合成の減少が付随して起こった。 細胞死検出ＥＬＩＳＡ測光酵素免疫測定法により見積った、クラステリンノックダウンＫＨ ＯＳ細胞及びＵ−２ ＯＳ細胞における自発アポトーシスを示す図である。クラステリンノックダウンでは、両細胞系において内生的自発アポトーシスの速度の増加が付随して起こった。 クラステリンノックダウンＯＳ細胞のクローン原性潜在性の減少を示す図である。ｓｉＲＮＡで７０時間処理後、５×１０^３のＫＨ ＯＳ細胞を６穴プレートに播き、完全培地で５日間増殖させた後に全細胞数を計測した。 クラステリンノックダウンＯＳ細胞のクローン原性潜在性の減少を示す図である。図２Ｂは、Ｕ−２ ＯＳ細胞を用いた比較試験の結果を示す。 ｓｉＲＮＡ仲介性クラステリンノックダウン後のＯＳ細胞におけるＤＸＲ処理の影響を示す図である。黒色の棒線は、２×１０^４個のＫＨ ＯＳ細胞を完全培地の入った６穴プレートに播き、ｓｉＲＮＡで７０時間処理後、回復させた結果である。その後、細胞を０．３５ＭのＤＸＲに２４時間さらし、完全培地中で７２時間二次培養し、計数した。淡色の棒線は、２×１０^４個のＫＨ ＯＳ細胞を完全培地の入った６穴プレートに播き、ｓｉＲＮＡで７０時間処理し、ＤＸＲを終濃度０．３５ΦＭになるようにトランスフェクション培地に直接添加した結果である。細胞を薬剤含有トランスフェクション培地中で２４時間培養後、洗浄し、７２時間完全培地中で回復させ、計数した。 ｓｉＲＮＡ仲介性クラステリンノックダウン後のＯＳ細胞におけるＤＸＲ処理の影響を示す図である。黒色の棒線は、２×１０^４個のＵ−２ ＯＳ細胞を完全培地の入った６穴プレートに播き、ｓｉＲＮＡで７０時間処理後、回復させた結果である。その後、細胞を０．３５ＭのＤＸＲに２４時間さらし、完全培地中で７２時間二次培養し、計数した。淡色の棒線は、２×１０^４個のＵ−２ ＯＳ細胞を完全培地の入った６穴プレートに播き、ｓｉＲＮＡで７０時間処理し、ＤＸＲを終濃度０．３５ΦＭになるようにトランスフェクション培地に直接添加した結果である。細胞を薬剤含有トランスフェクション培地中で２４時間培養後、洗浄し、７２時間完全培地中で回復させ、計数した。 ｓｉＲＮＡ仲介性クラステリンノックダウン後のＤＮＡ損傷に対する細胞の増感性を示す図である。 ｓｉＲＮＡ仲介性クラステリンノックダウン後のＤＮＡ損傷に対する細胞の増感性を示す図である。 ｓｉＲＮＡ仲介性クラステリンノックダウン後の酸化的ストレスに対するＯＳ細胞及び細胞の増感性を示す図である。 ｓｉＲＮＡ仲介性クラステリンノックダウン後の酸化的ストレスに対するＯＳ細胞及び細胞の増感性を示す図である。 ＰＣ３腫瘍細胞におけるｓｉＲＮＡによる配列特異的なクラステリン遺伝子サイレンシングの定量分析を示す図である。 クラステリンノックダウンＰＣ３細胞の増殖及びアポトーシスにおけるパクリタキセル処理の影響を示す図である。細胞に５０ｎＭのＣｌ−ＩＩＩ、Ｃｌ−ＩＶ又はスクランブルコントロールのｓｉＲＮＡで１日間処理した。ｓｉＲＮＡで処理後２日間、細胞を所定濃度のパラクリタキセルに４８時間さらし、細胞生存率をｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＴＴ分析により測定した。 ＰＣ３前立腺癌細胞をＣＬＵ−５のｓｉＲＮＡ（配列番号９及び１０）にさらした場合の定量結果を示す図である。 Ａ５４９肺癌細胞をＣＬＵ−５のｓｉＲＮＡ（配列番号９及び１０）にさらした場合の定量結果を示す図である。 クラステリンを標的とするｓｉＲＮＡでＰＣ３細胞を処理した結果としての、ＲＴ−ＰＣＲにより決定されるクラステリン転写産物の減少を示す図である。 クラステリンを標的とするｓｉＲＮＡでＡ５４９細胞を処理した結果としての、ＲＴ−ＰＣＲにより決定されるクラステリン転写産物の減少を示す図である。 クラステリンを標的とするｓｉＲＮＡでＰＣ３細胞を処理した結果としての、ノザンブロットにより決定されるクラステリン転写産物の減少を示す図である。 ｓｉＲＮＡとタキソールを組み合わせてＰＣ３細胞を処理した後の細胞生存率を示す図である。 ｓｉＲＮＡとタキソールを組み合わせてＡ５４９細胞を処理した後の細胞生存率を示す図である。 クラステリンを標的とするｓｉＲＮＡでＯＶＣＡＲ３細胞を処理した結果としての、ノザンブロットにより測定した場合の、クラステリン転写産物の減少を示す図である。 クラステリンを標的とするｓｉＲＮＡでＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を処理した結果としての、ノザンブロットにより測定した場合の、クラステリン転写産物の減少を示す図である。 クラステリンを標的とするｓｉＲＮＡでＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を処理した結果としての、ＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合の、クラステリン転写産物の減少を示す図である。 クラステリンを標的とするｓｉＲＮＡでＭＣＦ−７細胞を処理した結果としての、ノザンブロットにより測定した場合の、クラステリン転写産物の減少を示す図である。 クラステリンを標的とするｓｉＲＮＡでＭＣＦ−７細胞を処理した結果としての、ＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合の、クラステリン転写産物の減少を示す図である。 スクランブルコントロールと比較した、ｓｉＲＮＡで処理したＭＣＦ−７細胞におけるクラステリンタンパク質量の減少を示す図である。 ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＦＢＰ−５を標的とする二重特異性ｓｉＲＮＡでＡ５４９細胞を処理した結果としての、ＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合の、ＩＧＦＢＰ−２転写産物の減少を示す図である。 ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＦＢＰ−５を標的とする二重特異性ｓｉＲＮＡでＰＣ３細胞を処理した結果としての、ＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合の、ＩＧＦＢＰ−５転写産物の減少を示す図である。 ＰＣ３細胞におけるＩＧＦＢＰ−５のｍＲＮＡの減少を示す図である。 初代ヒト骨線維芽細胞におけるＩＧＦＢＰ−５転写の阻害を示す図である。 ＩＧＦＢＰ−２／ＩＧＦＢＰ−５に対する二重特異性ｓｉＲＮＡによるＣ４２細胞の増殖阻害を示す図である。 ＩＧＦＢＰ−２／ＩＧＦＢＰ−５に対する二重特異性ｓｉＲＮＡによるＡ５４９細胞の増殖阻害を示す図である。

本発明による第１のＲＮＡ分子群は、テストステロン抑制性前立腺メッセージ−２（ＴＲＰＭ−２）又は硫酸化糖タンパク質−２（ＳＧＰ−２）としても知られるタンパク質であるクラステリンをコードするｍＲＮＡを対象とする。クラステリンは、アンドロゲン離脱後に、前立腺腫瘍細胞により多量に発現される。さらに、クラステリンの発現を低下させるアンチセンス療法が癌治療に治療上の利益をもたらすことが判明した。とりわけ、そうしたアンチセンス療法は前立腺癌及び腎細胞癌の治療に適用することができる（参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許公開ＷＯ００／４９９３７）。治療薬クラステリンの投与によってもまた、化学療法薬及び放射線治療に対する癌細胞の感受性をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて増大させることができる。クラステリンの発現の干渉に使用可能な具体的なＲＮＡ分子の配列を表１及び表７に示す。（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第０９／９６７，７２６号を参照。）前立腺癌、骨肉腫などの肉腫、腎細胞癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、未分化大細胞リンパ腫及びメラノーマの治療において、これらの配列は、単独で、或いは他の化学療法薬又はアポトーシス誘導治療コンセプトと組み合わせて使用することができる。さらに、クラステリンはアミロイド斑形成を促進し、アルツハイマー病についてのマウスモデルにおける神経炎性毒性に極めて重要であることが知られている（参照により本明細書に組み込まれる、デマトス（Ｄｅ Ｍａｔｔｏｓ）らによる、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９９、１０８４３〜１０８４８頁（２００２））。従って、本発明の配列をアルツハイマー病の治療にも用いることができる。

表７に示されるＲＮＡｉ種の使用に関する具体的な結果を図に示す。これらの結果は、骨肉腫細胞の増殖を低下させ、骨肉腫細胞のアポトーシスを促進するＲＮＡｉ仲介プロセスによるクラステリン抑制の有効性を明らかにし、これにより本発明によって治療することができる別のタイプの症状も明らかにしている。これらの結果は、クラステリンレベルを下げるＲＮＡｉ処理が、ｐ５３のレベルの増加、ｂｃｌ−２のレベルの減少をもたらすことも明らかにしている。従って、本発明によれば、腫瘍サプレッサを全体的又は部分的に不活性にする変異ではなく、調節により活性ｐ５３レベル又はｂｃｌ−２レベルが影響を受ける症状は、クラステリンの存在量を減少させるのに効果的な量のクラステリンＲＮＡｉを投与し、これにより好ましくないクラステリンの関連するｐ５３レベル及びｂｃｌ−２レベルを変調することにより克服される。

本発明による第２のＲＮＡ分子群は、インスリン様成長因子結合タンパク質−５（ＩＧＦＢＰ−５）をコードするｍＲＮＡを対象とする。ＩＧＦＢＰ−５発現の阻害は、ホルモン調節性（前立腺又は乳）の腫瘍細胞がホルモン（例えばアンドロゲン又はエストロゲン）非依存的になるまで進行するのを遅らせ、乳癌又は前立腺癌などのホルモン調節性の癌に罹患しているヒトなどの個体を治療するための治療法をもたらし、前立腺腫瘍、乳腫瘍及び骨における他のＩＧＦ−１感受性腫瘍の増殖及び転移進行を阻害又は遅延させることが可能であることが示された（参照により本明細書に組み込まれる、公開ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０５４３５号）。表２に記載される配列を有するｓｉＲＮＡ分子を使用する本発明によるＲＮＡｉ治療法を用いれば、これらの同じ結果が得られる。これらの配列は単独でも、或いは他の化学療法薬又はアポトーシス誘導治療コンセプトと組み合わせて使用することができる。

本発明による第３のＲＮＡ分子群は、インスリン様成長因子結合タンパク質−２（ＩＧＦＢＰ−２）をコードするｍＲＮＡを対象とする。ＩＧＦＢＰ−２発現の阻害は、前立腺腫瘍細胞がアンドロゲン非依存的になるまで進行するのを遅らせ、前立腺癌又は乳癌などのホルモン調節性の癌に罹患している、ヒトなどの哺乳類個体に対する治療上の利益をもたらすことが示された。さらに、本発明の組成物は、このような癌の増殖及び転移進行を阻害又は遅らせるのに使用することができる（参照により本明細書に組み込まれる、公開ＰＣＴ出願第ＷＯ０２／２２６４２号）。表３に記載される配列を有するｓｉＲＮＡ分子を使用する本発明によるＲＮＡｉ治療法を用いれば、同じ結果が得られる。これらの配列は単独で、或いは他の化学療法薬又はアポトーシス誘導治療コンセプトと組み合わせて使用することができる。

本発明による第４のＲＮＡ分子群は、インスリン様成長因子−２及び５を同時にコードするｍＲＮＡ（ＩＧＦ−Ｂｉｓ）を対象とする。ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＦＢＰ−５の両者の発現の阻害は、ホルモン調節性（前立腺又は乳）の腫瘍細胞がホルモン（例えばアンドロゲン又はエストロゲン）非依存的になるまで進行するのを遅らせ、乳癌又は前立腺癌などのホルモン調節性の癌に罹患しているヒトなどの個体を治療するための治療法をもたらし、場合によってはこれらの因子のどちらかの阻害よりもさらに効果的に、前立腺腫瘍、乳腫瘍及び骨における他のＩＧＦ−１感受性腫瘍の増殖及び転移進行を阻害又は遅延させることが可能であることが示された（参照により本明細書に組み込まれる、公開ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０５４３５号、公開ＰＣＴ出願第ＷＯ０２／２２６４２号、及び２００２年１月１７日に出願された米国仮出願第６０／３５０，０４６号）。表４に記載される配列を有するｓｉＲＮＡ分子を使用する本発明によるＲＮＡｉ治療法を用いれば、これらの同じ結果が得られる。これらの配列は、単独で、或いは他の化学療法薬又はアポトーシス誘導治療コンセプトと組み合わせて使用することができる。

本発明による第５のＲＮＡ又はＤＮＡアンチセンス分子群は、小眼球症関連転写因子（Ｍｉｔｆ）群をコードするｍＲＮＡを対象とする。Ｂｃｌ−２は、メラノーマ及び他の細胞において、メラノーマ細胞生存率、細胞系生存性、及びアポトーシス感受性を調節することが報告されたマスター調節因子Ｍｉｔｆにより調節を受ける（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｌｌ １０９、７０７〜７１８頁、マッギル（ＭｃＧｉｌｌ）ら（２００２））。Ｍｉｔｆ及びＭｉｔｆにより調節されるＢｃｌ−２は、様々なヒト腫瘍により増殖中に発現される。Ｍｉｔｆの発現を抑えるＲＮＡｉ又はアンチセンス療法は、癌治療において治療上の利益をもたらす可能性がある。本発明によれば、Ｍｉｔｆは、化学療法薬及び放射線治療に対する癌細胞の感受性をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で強めることもできる。Ｍｉｔｆの発現の干渉に使用可能な具体的なアンチセンス又はＲＮＡ分子の配列を表５に示す。これらの配列は、メラノーマ、前立腺癌、腎細胞癌、膀胱癌、肺癌、骨癌及びその他の腫瘍の治療において、単独で、或いは他の化学療法薬又はアポトーシス誘導治療コンセプトと組み合わせて使用することができる。

本発明による第６のＲＮＡ又はＤＮＡアンチセンス分子群は、Ｂ−ｒａｆをコードするｍＲＮＡを対象とする。Ｂ−ｒａｆは細胞シグナル伝達の中心的存在であり、悪性メラノーマの６６％及び多種多様なのヒト癌において比較的低頻度で、体細胞のミスセンス変異により活性化される（参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｔｕｒｅ ４１７、９４９〜９５４頁、デイビス（Ｄａｖｉｅｓ）ら（２００２））。活性化及び／又は不活性化Ｂ−ｒａｆの発現を抑えるＲＮＡｉ又はアンチセンス治療法は、癌治療において治療上の利益をもたらす可能性がある。本発明によれば、Ｂ−ｒａｆの発現抑制は、化学療法薬及び放射線治療に対する癌細胞の感受性をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で強めることも可能である。Ｂ−ｒａｆの発現の干渉に使用可能な具体的なアンチセンス又はＲＮＡ分子の配列を表６に記載する。これらの配列は、メラノーマ、前立腺癌、腎細胞癌、膀胱癌、肺癌、骨癌及びその他の腫瘍の治療において、単独で、或いは他の化学療法薬又はアポトーシス誘導治療コンセプトと組み合わせて使用することができる。

本発明のｓｉＲＮＡ分子は、治療上の利益が標的タンパク質の発現阻害により得られるタイプの癌又はその他の疾患を有するヒト患者を含む患者を治療するための治療に使用される。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、１日１回又は複数回の注射（静脈内、皮下又は髄腔内）、或いは１又は複数の治療サイクルにわたる連続的な静脈内又は髄腔内投与により患者に投与されて、標的となるｍＲＮＡ及びタンパク質の調節に適する血漿濃度及び組織濃度に達する。

ｓｉＲＮＡ二本鎖を用いたＬＮＣａＰ細胞及びＰＣ３細胞のトランスフェクションのプロトコール
１）細胞の調製
抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）を含まない５％のＦＢＳを含む適当な培地中のＬＮＣａＰ細胞０．５×１０^６個を（ＰＣ３細胞では、ウェル当たり０．３×１０^６個の密度で）６穴プレートの各ウェルに播く。
４０〜５０％コンフルエントになるまで、細胞を３７ＥＣの加湿下５％ＣＯ_２インキュベータ内でインキュベートする。
２）ｓｉＲＮＡの調製
以下のｓｉＲＮＡ希釈液を微量遠心チューブに調製する。各ウェル当たり、０．０１〜１００ｎＭ。
３）以下のトランスフェクション試薬希釈液を微量遠心チューブに調製する。
６穴プレートの各ウェルについて、ＯｌｉｇｏＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）試薬４ｍｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（商標）１１ｍｌで希釈し、室温で１０分間インキュベートする。
４）希釈したＯｌｉｇｏＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）を、希釈したｓｉＲＮＡ二本鎖希釈液と合わせて、反転により穏やかに混合する。
５）室温で２０分インキュベートする。
６）ウェルから培地を取り除き、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）８００ｍｌと交換する。
７）細胞にトランスフェクション複合体２００ｍｌを上層する。
８）３７℃のＣＯ_２インキュベータ内で４時間インキュベートする。
９）１５％ＦＢＳを含む培地５００ｍｌを添加する。
１０）２４時間後にリアルタイムＰＣＲにより遺伝子発現をチェックするか、又は
１１）１、６、１２、２４、４８、７２及び９６時間後にウエスタンブロットによりタンパク質発現をチェックする。

ヒトクラステリンｃＤＮＡは、ｓｉＲＮＡに必要な基準を満たすＡＡ（Ｎ_１９）ＵＵ（Ｎは任意のヌクレオチド）型の配列を同定するために、手作業でスキャンした（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１４、４５５７〜４５６０頁、ハーブルス（Ｈａｒｂｏｕｒｔｈ）ら（２００１））。対称的な２−ｎｔ３’突出部（オーバハング）を有するこの２つの配列は、ＣＬＵ遺伝子転写開始コドンの４３３（Ｃｌ−Ｉ）ｎｔ及び６４４（Ｃｌ−ＩＩ）ｎｔ下流に存在した。使用した２つの追加のオリゴヌクレオチドは、ＣＬＵ遺伝子転写開始コドンの１６２０ｎｔ下流の領域（Ｃｌ−ＩＩＩ）及びヒト転写開始部位（Ｃｌ−Ｖ）を標的とした（表を参照）。ＢＬＡＳＴ分析により、他の既知のヒト遺伝子と相同性が無いことが示された。選択したＲＮＡオリゴは、ダーマコンリサーチ社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）（ラファイエット、米国コロラド州）で合成されたものとし、リボヌクレアーゼを含まないｄｄＨ_２Ｏで最終濃度２０Ｍに希釈し、−２０℃で保存した。使用したＳｃｒａｍｂｌｅ−Ｉ（商標）（Ｓｃ−Ｉ）（Ｄ−１２００−２０）及びＳｃｒａｍｂｌｅ−ＩＩ（商標）（Ｓｃ−ＩＩ）（Ｄ−１２０５−２０）オリゴヌクレオチドは、ダーマコンリサーチ社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）から購入した。

指数増殖中のＯＳ細胞におけるＣｌ−Ｉ、Ｃｌ−ＩＩ及びスクランブルＲＮＡ二本鎖のｓｉＲＮＡトランスフェクションは、記載の通りに行った（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３、３１９１〜３１９７頁、ハーブルス（Ｈａｒｂｏｕｒｔｈ）ら、タシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）ら（１９９９））。簡単に述べると、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの前日に５００：１完全培地を含む２４穴プレートに細胞を播き、トランスフェクションの間、約４０〜５０％までコンフルエントにした。トランスフェクション混合には、ウェル当たり１００ｎＭのｓｉＲＮＡ二本鎖を用いた。ＲＮＡ二本鎖を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ（ギブコライフテクノロジー社（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、サンディエゴ、米国カリフォルニア州）無血清培地で希釈し、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬（インビトロジェンライフテクノロジー社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、サンディエゴ、米国カリフォルニア州））を使用することによりトランスフェクション効率を高めた。細胞をＣｌ−ｉ及びＣｌ−ＩＩオリゴヌクレオチドの両方で処理する場合、各ｓｉＲＮＡ二本鎖を１００ｎＭで用いた。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いた細胞処理は２〜３日間続けた。

別法として、ＰＣ３細胞では、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（商標）（インビトロジェンライフテクノロジー社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、サンディエゴ、米国カリフォルニア州））を使用して、Ｃｌ−ＩＩＩ及びＣｌ−Ｖオリゴヌクレオチドによるトランスフェクションを高めた。無血清ＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）Ｉ中のＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬４ｇ／ｍｌによるプレインキュベーションの後、ＰＣ細胞を、１０、５０、又は１００ｎＭのＲＮＡ二本鎖で２０分間処理した。インキュベーション開始の４時間後、ＲＮＡ二本鎖及びリポフェクチンを含む培地を、標準的な組織培養用培地と交換した。細胞を、１日目に一度処理し、３日目の処理後４８時間で集菌した。全ての場合において、用いたコントロールは、（ａ）Ｓｃ−Ｉ及びＳｃ−ＩＩのＲＮＡ二本鎖の使用、並びに（ｂ）核酸不在下でのｍｏｃｋトランスフェクション（Ｃｏｎ−Ｉ）を含むものとした。ＣＬＵ遺伝子サイレンシングは、ＲＮＡブロット分析、イムノブロッティング分析、又は共焦点免疫蛍光法（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）によりアッセイされた。

ＯＳ細胞におけるＣＬＵ遺伝子発現の効果的なサイレンシングはｓｉＲＮＡを使用して実現される。Ｃｌ−Ｉ又はＣｌ−ＩＩのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドによる３種のＯＳ細胞系の処理は非常に有効であると思われ、細胞ＣＬＵタンパク質レベルを有意に減少（ノックダウン）させた。興味深いことに、Ｃｌ−Ｉオリゴヌクレオチドは、ＣＬＵ遺伝子のサイレンシングにおいて、Ｃｌ−ＩＩよりもわずかに有効性が高いようであった。コントロールのＳｃ−Ｉ又はＳｃ−ＩＩオリゴヌクレオチドが存在する場合、或いはトランスフェクション培地にＲＮＡ二本鎖が存在しない場合、ＣＬＵ遺伝子のサイレンシングは全く認められなかった。

次に、細胞をＤＸＲにさらした後も、ＣＬＵ特異的ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが、ＣＬＵタンパク質の蓄積を阻害することができるか否かという課題に取り組んだ。Ｃｌ−Ｉオリゴヌクレオチド、Ｃｌ−ＩＩオリゴヌクレオチド又はＣｌ−ＩとＣｌ−ＩＩの両方のオリゴヌクレオチド混合物の存在下でＫＨ ＯＳ細胞及びＵ−２ ＯＳ細胞をＤＸＲに２４時間さらすと、ＣＬＵタンパク質の蓄積は効果的に阻害された。従って、Ｃｌ−Ｉ又はＣｌ−ＩＩオリゴヌクレオチドの存在下で、細胞をアポトーシス誘導剤にさらした後に、細胞性ＣＬＵタンパク質を誘導することができないことは明白である。

ｓｉＲＮＡによるＣＬＵ遺伝子発現サイレンシングの後のＯＳ細胞における表現型の影響。ＯＳ細胞におけるＣＬＵ遺伝子発現サイレンシングの影響は、ｓｉＲＮＡ処理後に細胞を直接計数すること、細胞形態及び表現型を記録すること、並びにクローン原性アッセイにより調べた。ＫＨ ＯＳ細胞及びＳａ ＯＳ細胞におけるＣＬＵノックダウンは、目視できる表現型を全く示さなかった。しかし、ＣＬＵノックダウン細胞は、それらのコントロール細胞に比べて有意な増殖阻害を受けることが認められた（図１Ａ）。これに対して、高い内生量のＣＬＵタンパク質を発現するＵ−２ ＯＳ細胞では、ＣＬＵノックダウンの影響が非常に顕著であると思われた。特に、ＣＬＵのｓｉＲＮＡで（３日間）処理したＵ−２ ＯＳ細胞は、プラスチックに対する強い付着性を失い、円形の形状となった。この表現型に、深刻な増殖阻害の影響が起こっていた。Ｃｌ−Ｉ及びＣｌ−ＩＩの両方のＲＮＡ二本鎖の組み合わせが細胞増殖を阻害するのにさらに効果的であるか否かを調べるために、細胞をこれら両方のオリゴヌクレオチドで処理した。ＫＨ ＯＳ細胞及びＵ−２ ＯＳ細胞では、Ｃｌ−Ｉで処理した細胞に比べて、増殖遅延のわずかな増進しか観察されなかった。最後に、ＣＬＵタンパク質除去による細胞増殖抑制作用と細胞障害作用とを区別するために、ＣＬＵノックダウンＫＨ ＯＳ細胞及びＵ−２ ＯＳ細胞を、ＤＮＡ合成及び内生的な自発アポトーシスに関して直接アッセイした。ＣＬＵノックダウン細胞は、姉妹コントロール細胞と比較して、ＤＮＡ合成速度の低下（図１Ａ）、及び高レベルの内生的自発アポトーシス（図１Ｂ）を示した。Ｕ−２ ＯＳ細胞でもまた、作用はより顕著であった。つまり、この結果から、ＣＬＵノックダウン細胞数の減少が、自発アポトーシスのレベルの増加だけではなく、細胞増殖率の低下によるものであることが示唆される。

７回を超える細胞の倍加の間、遺伝子サイレンシングが維持される（ハーブルス（Ｈａｒｂｏｕｒｔｈ）ら）ことが最近の研究により実証されたため、ｓｉＲＮＡ後のコロニー形成率及び増殖におけるＣＬＵノックダウンの影響もまた、クローン原性アッセイによって調べた。ストレスの間の内生ＣＬＵ量及びＣＬＵ蓄積の程度に関して、２つの極端に対照的な場合を表すという理由から、ＫＨ ＯＳ細胞及びＵ−２ ＯＳ細胞をこの分析用に選択した。ＣＬＵノックダウンＫＨ ＯＳ細胞は、平板培養すると、プラスチックに強く付着し（９０％を超える播種細胞が付着した）、その付着細胞のわずかしか形態学的異常を示さなかった。しかし、全コロニー数及び形成コロニーのサイズを測定後、５日間培養して認められるように、付着細胞の増殖性は弱められていた（図２Ａ）。ＣＬＵノックダウンＵ−２ ＯＳ細胞は、トリプシン処理後にプラスチックにあまり付着せず（播種細胞の約７０％しか付着しなかった）、付着細胞のほとんどが形状にかなりの異常を示した。細胞は極めて低い増殖性を示し（図２Ｂ）、培養９日後には数個の小さなコロニーしか認められなかった。

ＯＳ細胞におけるｓｉＲＮＡによるＣＬＵ遺伝子発現のサイレンシングの維持により、遺伝毒性及び酸化的ストレスにより誘導されるアポトーシスに対する顕著な増感が起こる。薬物に関連して報告された影響が細胞型によって異なるため（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７、７２７〜７４１頁、ゲウリッツ（Ｇｅｗｒｉｔｚ）ら（１９９９））、ＣＬＵの機能分析の前に、ＯＳ細胞におけるＤＸＲの影響を分析した。処置した患者のＤＸＲ血漿濃度は１〜２Ｍの範囲内であり、１時間以内に０．０２５〜０．２５Ｍの範囲に低下するので（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３２、３７９〜３８４頁、ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）ら（１９９３））、細胞を０．３５Ｍ及び１ＭのＤＸＲで処理した。ＤＸＲ仲介性の細胞死の程度を分析するために、ＴＵＮＥＬによりアポトーシスを等級付けした。薬物で２４時間処理した後の付着細胞は、未処理のコントロール細胞に比べて有意な形態学的変化を受けた。この時、細胞は老化様の表現型を暗示する増大した扁平な形態を示し、その一方で、それらのかなり多数がＴＵＮＥＬ陽性である。進行中のアポトーシスは、２４時間後でも認められ、アポトーシスが、培地からＤＸＲを除去した後でも続く動態過程であることが証明される。ＴＵＮＥＬにより得られる結果と一致して、ＤＸＲ処理には、ＰＡＲＰ開裂が付随し、薬物処理ＫＨ ＯＳ細胞及びＵ−２ ＯＳ細胞において抗アポトーシスタンパク質のｂｃｌ−２は発現に全く変化を示さなかった。ＤＸＲ処理後、ｐ５３タンパク質の蓄積、並びに増殖停止（ｐ２１）又はアポトーシス（ｂａｘ）に関連するその下流のエフェクターはＵ−２ ＯＳ細胞にしか認められず、ＯＳ細胞系においてＤＸＲにより仲介される細胞増殖抑制作用及び細胞障害作用がｐ５３依存性メカニズムとｐ５３非依存性メカニズムの両方に依存していることが示された。

次に、ＤＸＲにさらされたＯＳ細胞のＣＬＵノックダウンの影響を調べるために、２つの補足的な研究を行った（図３Ａ及び図３Ｂ）。ｓｉＲＮＡで処理した細胞を、完全培地で再播種し、次に０．３５ＭのＤＸＲに２４時間さらすか、又はＣｌ−ＩＩ又はＣｌ−Ｉオリゴヌクレオチドの存在下で０．３５ＭのＤＸＲにさらした。両方の場合において、生細胞をＤＸＲ処理３日後に計数した。ＣＬＵノックダウンＫＨ ＯＳ細胞がコントロール細胞よりもＤＸＲに対して高い感受性を示すと思われるが（図３Ａの黒色の棒線）、ＤＸＲ処理は、培地中のＣＬＵ特異的ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの存在との組み合わせた場合、さらに顕著に影響を示すと思われた（図３Ａの淡色の棒線）。同様にＣＬＵノックダウンＳａ ＯＳ細胞は、ＤＸＲ処理に対してさらに高い感受性を示した。Ｕ−２ ＯＳ細胞では、両者の戦略が非常に効果的であると思われ、ＣＬＵノックダウン細胞が、コントロールに比べて、さらに顕著にこの薬物に対する感受性を示した（図３Ｂ）。ＣＬＵ特異的ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でＤＸＲ処理を行った場合、ＣＬＵノックダウン細胞はより顕著にこの薬物に対して感受性を示すようであり（図３Ｂの淡色の棒線）、大量のアポトーシスが観察された。最後に、Ｕ−２ ＯＳ細胞をＣｌ−Ｉ及びＣｌ−ＩＩの両方のオリゴヌクレオチドで処理すると、細胞はほぼ壊滅した。

ＣＬＵノックダウン後の細胞増感のメカニズムを理解するため、遺伝毒性誘導剤（ＤＸＲ）又は酸化的ストレス誘導性（Ｈ_２Ｏ_２）に細胞をさらした直後のアポトーシス誘導の程度を直接アッセイした。図３Ｃ〜図３Ｆに示す。ＣＬＵノックダウン細胞をＤＸＲ又はＨ_２Ｏ_２のいずれかにさらすことにより、ＫＨ ＯＳ細胞及びＵ−２ ＯＳ細胞の両方において顕著に高い割合のアポトーシスが起こった。この知見から、ＣＬＵが細胞保護シグナルを出すことによりアポトーシスに関わる細胞の機構に直接的に影響を与えるか、又は相互作用することが示唆される。

ＣＬＵ遺伝子サイレンシングに起因する遺伝毒性及び酸化的ストレスに対するＯＳ細胞の増感性は、細胞アポトーシスの機構の活性化に関連する。驚いたことに、最近同定された他のＣＬＵタンパク質の発現レベルの分析により、ＫＨ ＯＳ細胞及びＵ−２ ＯＳ細胞の両方において、Ｃｌ−Ｉ及びＣｌ−ＩＩオリゴヌクレオチドが、推定上の５５ｋＤａのｎ−ＣＬＵ^３５ＣＬＵタンパク質形態にいかなる有意な影響も与えないことが認められ、Ｃｌ−Ｉ又はＣｌ−ＩＩオリゴヌクレオチドの結合部位がｓ−ＣＬＵのｍＲＮＡとｎ−ＣＬＵのｍＲＮＡの間で共通しているという事実（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８、１１５９０〜１６０００頁、レスコフ（Ｌｅｓｋｏｖ）ら（２００３））にも関わらず、４９ｋＤａのｃ−ＣＬＵ^４９タンパク質形態レベルにわずかな影響が検出された。この影響は、ｎ−ＣＬＵタンパク質が極めて安定しているという本発明者らの知見に基づいて説明されると我々は推測する。従って、ＣＬ−Ｉオリゴヌクレオチド及びＣｌ−ＩＩオリゴヌクレオチドは分泌されるＣＬＵ（ｓ−ＣＬＵ）タンパク質形態を特異的に分解（ノックダウン）する。

次に、ヒト細胞のアポトーシスの調節に関わる幾つかのタンパク質の発現レベルをアッセイした。ＫＨ ＯＳ細胞及びＵ−２ ＯＳ細胞の両方におけるＣＬＵノックダウンにより、抗アポトーシス分子のｂｃｌ−２のダウンレギュレーションが起こった。ＤＮＡ損傷の修復及びシグナル伝達に関わり、さらにｎ−ＣＬＵに結合するタンパク質であるＫｕ７０（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９７、５９０７〜５９１２頁、ヤング（Ｙａｎｇ）ら（２０００））のレベルには何の影響も検出されなかった。興味深いことに、機能的ｐ５３分子を含むＵ−２ ＯＳ細胞では、ｂｃｌ−２のダウンレギュレーションとは別に、ＣＬＵノックダウンはｐ５３蓄積及びその下流のプロアポトーシスエフェクターであるｂａｘのアップレギュレーションも伴う。これを支持するように、ＣＬＵノックダウンＵ−２ ＯＳ細胞は、ＤＸＲにさらされると、Ｓｃ−Ｉ処理細胞と比べてより強く着実なｐ５３タンパク質の蓄積を示した。ＣＬＵノックダウン後のＯＳ細胞の増感性が、細胞のプロアポトーシス機構の活性化に大きく依存することが示唆される。我々の研究室で継続中の研究は、アポトーシス調節に関連する細胞シグナル伝達カスケードにおけるＣＬＵの関与の調査である。

ＰＣ−３前立腺癌細胞におけるＣＬＵ遺伝子サイレンシングの影響を調べた。ＯＳ細胞におけるＣＬＵノックダウンの有意な影響が立証されたので、次に、ＣＬＵのｓｉＲＮＡをＰＣ３ヒト前立腺癌細胞に適用した。ＰＣ３細胞はｐ５３ヌルであり（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３７、５１〜５９頁、ロルフ（Ｒｏｈｌｆｆ）ら（１９９８））、Ｓａ ＯＳ細胞に類似する、比較的低い内生量のｓ−ＣＬＵタンパク質形態を発現する。ＰＣ３細胞において、Ｃｌ−Ｉオリゴヌクレオチド及びＣｌ−ＩＩオリゴヌクレオチドを用いるのとは別に、さらに別の２つのＣＬＵ特異的ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（Ｃｌ−ＩＩＩ、Ｃｌ−Ｖ）も試験した。これらのオリゴの中で、Ｃｌ−Ｖはｓ−ＣＬＵの転写開始部位を標的とした。ＰＣ３細胞においてＣｌ−Ｉオリゴヌクレオチド及びＣｌ−ＩＩオリゴヌクレオチドを使用することにより、ＯＳ細胞系で述べられたのと同様の影響が起こった。図４から判るように、Ｃｌ−ＩＩＩ及びＣｌ−Ｖの両方のオリゴヌクレオチドが、配列依存的であるが投薬量非依存的な様式で、ＣＬＵのＲＮＡ及びタンパク質発現のサイレンシングに非常に有効である。さらに具体的には、ＰＣ３細胞を、１０、５０及び１００ｎＭのＣｌ−ＩＩＩ又はＣｌ−ＶのｓｉＲＭＮオリゴヌクレオチドで１日間処理したところ、６０％から９８％にわたり、ＣＬＵのｍＲＮＡレベルを大幅に抑えた（図４）。ｍＲＮＡレベルにおけるこの影響は、タンパク質レベルでも明白であった。さらに、Ｕ−２ ＯＳ細胞における結果と一致して、ＰＣ３細胞におけるＣＬＵノックダウンにより、進行中のアポトーシスに似た有意な形態学的変化が起こった。

ＰＣ細胞をＣＬＵのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドで処理することにより化学療法薬の細胞障害作用を強めることができるか否かを判定するために、まず最初にＰＣ３細胞をＣｌ−ＩＩＩ、Ｃｌ−Ｖ又はＳｃ−ＩのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドで処理し、次に様々な濃度のパクリタキセルを含む培地で２日間インキュベートした。その後、ＭＴＴアッセイを行い、細胞生存率を測定した。図５に示すように、ＣＬＵのｓｉＲＮＡの処理により、パクリタキセルの薬剤感受性は、投薬量依存的に有意に強大し、９０％を超えてパクリタキセルのＩＣ_５０（細胞生存率を５０％減少させる濃度）を減少させたが、スクランブルｓｉＲＮＡは全く影響を及ぼさなかった。

クラステリンを標的とする８種のｓｉＲＮＡを、配列番号１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０、１１と１２、１３と１４、並びに１５と１６によりＲＮＡ二本鎖として形成し、それぞれにＣＬＵ１〜ＣＬＵ８とラベルした。ＰＣ３細胞を、様々な投薬量（１０、５０及び１００ｎＭ）の８種のｓｉＲＮＡ又はスクランブルコントロールでトランスフェクトした。処理の３日後、タンパク質を抽出し、クラステリンレベル（ＭＷ＝４０及び６０ｋＤａ）をウエスタンブロット法により分析した。クラステリン量の減少が８種全てのｓｉＲＮＡで認められたが、最も顕著な結果はＣＬＵ−５（配列番号９及び１０）で得られた。

ＣＬＵ−５（配列番号９及び１０）で処理した細胞のブロットをビンキュリンコントロールに対して標準化した後、デンシトメトリー測定を行った。結果を図６にまとめる。「オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）」細胞は、ｏｌｉｇｏＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）のみで処理した。図示のように、ｓｉＲＮＡに対する投薬量依存的な反応が観察された。

実施例７の試験を、ＰＣ３前立腺細胞の代わりにＡ５４９肺癌細胞を使用して繰り返し、同様な結果が得られた。ＣＬＵ−５（配列番号９及び１０）で処理した細胞のブロットをビンキュリンコントロールに対して標準化した後、デンシトメトリー測定を行った。結果を図７にまとめる。「オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）」細胞は、ｏｌｉｇｏＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）のみで処理した。図示のように、ｓｉＲＮＡに対する投薬量依存的な反応が観察された。

ＰＣ３細胞を、１０、５０又は１００ｎＭのレベルのｓｉＲＮＡ、或いは１００ｎＭのスクランブルコントロールでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、全ＲＮＡを抽出し、クラステリン転写産物のレベルをリアルタイムＰＣＲにより定量化した。結果を図８に示す。図示のように、試験した８種のｓｉＲＮＡのそれぞれにおいて、クラステリン転写産物の量が減少した。

実施例９の試験を、ＰＣ３細胞の代わりにＡ５４９細胞を使用して繰り返した。結果を図９に示す。図示のように、試験した８種のｓｉＲＮＡのそれぞれにおいて、クラステリン転写産物の量が減少した。

ＰＣ細胞を、ＣＬＵ−３（配列番号５及び６）又はＣＬＵ−５（配列番号９及び１０）、或いは１０、５０又は１００ｎＭのレベルのスクランブルコントロール、或いはｏｌｉｇｏＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）のみで処理（１パルス）した。２日後に全ＲＮＡを抽出し、ノザンブロット法によりクラステリン及びＧＡＤＰＨを分析した。デンシトメトリー測定を行った。図１０に、ＧＡＤＰＨに対して標準化した後のこれらの測定結果を示す。クラステリン転写産物の量の減少が全投薬量のＣＬＵ−３及びＣＬＵ−５において認められた。

ＰＣ３細胞を、２５ｎＭのヒトクラステリンｓｉＲＮＡ（ＣＬＵ−３及びＣＬＵ−５）、スクランブルコントロール、又はｏｌｉｇｏＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）のみで一回処理した。処理２日後に、培地を、様々な濃度のタキソール（パクリタキセル）を含む培地と交換した。インキュベーション３日後に、細胞生存率をＭＴＴ分析により調べた。図１１に結果をまとめる。図示のように、ｓｉＲＮＡ及びタキソールは、相乗的に作用して、生細胞数を減少させた。

実施例１２の試験を、ＰＣ３細胞の代わりにＡ５４９細胞を使用して繰り返した。結果を図１２にまとめる。

ＯＶＣＡＲ３卵巣癌細胞を、１、１０又は５０ｎＭのＣＬＵ５、スクランブルコントロール又はビヒクルのみのコントロールで一回処理した。未処理コントロールの試験も行った。２日後に、全ＲＮＡを抽出し、ノザンブロットによりクラステリン及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡを分析した。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに対して標準化した後のクラステリンｍＲＮＡレベルのデンシトメトリー測定値を図１３に示す。クラステリン転写産物の量の実質的な投薬量依存的減少が認められた。

ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞を、５、５０又は１００ｎＭのＣＬＵ−５、或いはスクランブルコントロール、或いはｏｌｉｇｏＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ビヒクルのみでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、ＲＮＡを抽出し、ノザンブロット法によりクラステリン及びＧＡＰＤＨを分析した。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに対して標準化した後のクラステリンｍＲＮＡレベルのデンシトメトリー測定値を図１４に示す。クラステリン転写産物の量の実質的な減少が認められた。

クラステリン転写産物をＲＴ−ＰＣＲにより定量化すること以外は、実施例１５の試験を繰り返した。結果を図１５にまとめる。クラステリン転写産物の量の実質的な減少が認められた。

ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を、５、２５又は５０ｎＭのＣＬＵ−５、或いはスクランブルコントロール、或いはｏｌｉｇｏＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ビヒクルのみでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、ＲＮＡを抽出し、ノザンブロット法によりクラステリン及びＧＡＰＤＨを分析した。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに対して標準化した後のクラステリンｍＲＮＡレベルのデンシトメトリー測定値を図１６に示す。クラステリン転写産物の量の実質的な投薬量依存的減少が認められた。

クラステリン転写産物をＲＴ−ＰＣＲにより定量化すること以外は、実施例１７の試験を繰り返した。結果を図１７にまとめる。クラステリン転写産物の量の実質的な減少が認められた。

ＭＣＦ−７細胞を、様々な投薬量（５及び５０ｎＭ）のＣＬＵ−５のｓｉＲＮＡ、又はスクランブルコントロールでトランスフェクトした。処理の３日後、タンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティング法によりクラステリンレベル（ＭＷ＝４０及び６０ｋＤａ）を分析した。図１８は、スクランブルコントロールと比較した、ｓｉＲＮＡ処理細胞のクラステリンタンパク質の量の減少を示す。

クラステリンを過剰に発現するＬＮＣａＰ／Ｔ１細胞を、１０ｎＭのＣＬＵ−５のｓｉＲＮＡ、又はスクランブルコントロールでトランスフェクト（１パルス）した。処理の３日後、タンパク質を抽出し、ウエスタンブロット法によりクラステリンを分析した。ｓｉＲＮＡで処理した細胞においてクラステリンは検出されなかった。

ＩＧＦＢＰ−２及びＩＧＦＢＰ−５を標的とする３種のｓｉＲＮＡを、配列番号３９及び４０、４１及び４２、並びに４３及び４４により二本鎖ＲＮＡとして形成し、それぞれにＢＳ−１〜ＢＳ−３とラベルした。Ａ５４９細胞を、様々な投薬量（１０、５０及び１００ｎＭ）の３種のｓｉＲＮＡ又はスクランブルコントロールでトランスフェクトした。ビヒクルだけのコントロール及び未処理コントロールもまた評価した。全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＩＧＦＢＰ−２転写産物を分析した。図１９に示すように、ＩＧＦＢＰ−２転写産物の量の減少が、３種全てのｓｉＲＮＡで認められた。

ＰＣ３細胞を、様々な投薬量（１０、５０及び１００ｎＭ）の３種の二重特異性ｓｉＲＮＡ（ＢＳ−１、ＢＳ−２及びＢＳ−３）又はスクランブルコントロールでトランスフェクトした。ビヒクルだけのコントロールも評価した。全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＩＧＦＢＰ−５転写産物を分析した。図２０及び図２１に示すように、ＩＧＦＢＰ−５転写産物の量の減少が、３種全てのｓｉＲＮＡで認められた。

初代ヒト骨線維芽細胞を、５０ｎＭの３種の二重特異性ｓｉＲＮＡ（ＢＳ−１、ＢＳ−２及びＢＳ−３）又はスクランブルコントロールでトランスフェクトした。ビヒクルのみ及び未処理コントロールも評価した。全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＩＧＦＢＰ−５転写産物を分析した。図２２に示すように、ＩＧＦＢＰ−５転写産物の量の減少が、３種全てのｓｉＲＮＡで認められた。

Ｃ４２細胞（ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞の亜系）をＢＳ−１、ＢＳ−２及びＢＳ−３で処理し、増殖阻害をクリスタルバイオレット分析により評価した。結果を図２３に示す。

Ａ５４９肺癌細胞をＢＳ−１、ＢＳ−２及びＢＳ−３で処理し、増殖阻害をクリスタルバイオレット分析により評価した。結果を図２４に示す。

Claims (5)

1. 各々の鎖が２３以下の塩基長を有し、標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの分解を仲介するか翻訳を阻害するのに有効な配列を有する二重鎖のＲＮＡ分子であって、前記標的遺伝子がクラステリンをコードする遺伝子であり、該二重鎖ＲＮＡ分子の各々の鎖がＲＮＡ部分とＤＮＡ部分を含み、該ＲＮＡ部分はそれぞれ、
   配列番号１のヌクレオチド１〜１９及び配列番号２のヌクレオチド１〜１９
   からなる相補配列を含む、
   上記ＲＮＡ分子。
2. 各々の鎖が２３以下の塩基長を有し、標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの分解を仲介するか翻訳を阻害するのに有効な配列を有する二重鎖のＲＮＡ分子であって、前記標的遺伝子が、クラステリンをコードする遺伝子であり、前記二重鎖ＲＮＡ分子の鎖がそれぞれ、
   配列番号１及び配列番号２、
   からなる配列を含む、
   上記ＲＮＡ分子。
3. 前記二重鎖ＲＮＡ分子の鎖がそれぞれ、
   配列番号１及び配列番号２、
   からなる配列からなる請求項２に記載のＲＮＡ分子。
4. 請求項１から３までのいずれか一項に記載のＲＮＡ分子及び薬学的に許容される担体を含む医薬品組成物。
5. 前記の薬学的に許容される担体が無菌注射液である請求項４に記載の医薬品組成物。

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