KR101212512B1 - 암-관련 단백질을 표적으로 하는 알엔에이아이 프로브 - Google Patents
암-관련 단백질을 표적으로 하는 알엔에이아이 프로브 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101212512B1 KR101212512B1 KR1020057002963A KR20057002963A KR101212512B1 KR 101212512 B1 KR101212512 B1 KR 101212512B1 KR 1020057002963 A KR1020057002963 A KR 1020057002963A KR 20057002963 A KR20057002963 A KR 20057002963A KR 101212512 B1 KR101212512 B1 KR 101212512B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- misc
- feature
- cells
- denotes uridine
- rnai
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
- C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
본 발명은 전립선암, 골육종과 같은 육종, 신장세포 암종, 유방암, 방광암, 폐암, 결장암, 난소암, 퇴행성 대세포 림프종 및 흑색종을 포함하는 다양한 암; 그리고 알쯔하이머병의 치료에 유용하는 RNAi 서열을 제공한다. 상기 서열은 클러스테린, IGFBP-5, IGFBP-2, IGFBP-2와 -5 둘 모두, MITF 및 B-raf를 표적으로 한다. 또한, 본 발명은 전립선암, 골육종과 같은 육종, 신장세포 암종, 유방암, 방광암, 폐암, 결장암, 난소암, 퇴행성 대세포 림프종 및 흑색종을 포함하는 다양한 암; 그리고 알쯔하이머병을 치료하기 위한 상기 RNAi 서열의 용도를 제공하며, 그리고 인간을 포함하는 개체에 RNAi 활성을 가지는 상기 RNA 분자를 투여하는 단계를 포함하는 상기 질환의 치료방법을 제공한다.
암, 종양, 클러스테린, 안티센스, siRNA, IGFBP-5, IGFBP-2, MITF, B-raf
Description
본 출원은 2002년 8월 21일에 출원된 미국 가출원 60/405,193, 2002년 9월 3일에 출원된 60/408,152, 그리고 2003년 5월 20일에 출원된 60/472,387에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 암과 다른 질환의 치료에 유용한 단(short)이중쇄 RNAi 프로브에 관한 것이다. RNA 방해 또는 "RNAi"는 Fire와 공동연구자들에 의해 처음 명명된 조어로서 이중쇄 RNA(dsRNA)가 해충에 주입되었을 때 유전자 발현이 억제되는 현상을 기술하기 위하여 명명된 것이다(Fire et al.(1998) Nature 391, 806-811, 본 명세서에 참조로서 삽입된다). dsRNA는 척추동물을 포함하는 많은 유기체에서 유전자-특이, 후-전사 사일런싱을 초래하며, 유전자 기능을 연구하는 새로운 도구를 제공하고 있다. RNAi는 mRNA 파괴에 관여하지만, 이러한 방해 작용을 설명하는 생화학적 기전은 대부분 미지이다. RNAi의 용도는 Carthew et al.(2001) Current Opinions in Cell Biology 13, 244-248 및 Elbashir et al.(2001) Nature 411, 494-498에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
어떤 특정 mRNA 분자 내에는, RNAi 프로브에 의해 영향을 받는 위치와 영향을 받지 않는 위치가 있다. 따라서, RNAi-기초 치료에 도달할 수 있도록 적합한 길이(예컨대, 21 내지 23 bp)의 서브서열로 전체 서열을 용이하게 분할시킬 수는 없다. 사실, 미국 특허출원 공개 2002-0086356-A1은 mRNA 서열에 위치할 수 있는 표적 위치를 분석하는 방법을 개시하고 있으나, 이 방법은 유효한 RNAi 서열의 개발에 대한 유일한 방법은 아니다.
본 발명은 전립선암, 골육종과 같은 육종, 신장세포 암종, 유방암, 방광암, 폐암, 결장암, 난소암, 퇴행성 대세포 림프종 및 흑색종을 포함하는 다양한 암; 그리고 알쯔하이머병의 치료에 유용하는 RNAi 서열을 제공한다. 상기 서열은 클러스테린, IGFBP-5, IGFBP-2, IGFBP-2와 -5 둘 모두, MITF 및 B-raf를 표적으로 한다.
또한, 본 발명은 전립선암, 골육종과 같은 육종, 신장세포 암종, 유방암, 방광암, 폐암, 결장암, 난소암, 퇴행성 대세포 림프종 및 흑색종을 포함하는 다양한 암; 그리고 알쯔하이머병을 치료하기 위한 상기 RNAi 서열의 용도를 제공하며, 그리고 인간을 포함하는 개체에 RNAi 활성을 가지는 상기 RNA 분자를 투여하는 단계를 포함하는 상기 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 RNAi를 중재하는 분리된 RNA 분자에 관한 것이다. 즉, 본 발명의 분리된 유전자, 즉 타깃 유전자의 전사 생성물인 mRNA의 파괴를 중재한다. 편의상, 이러한 mRNA는 파괴되는 mRNA로 본 명세서에서 언급될 수 있다. 용어, RNA, RNA 분자(들), RNA 절편(들) 및 RNA 단편(들)은 RNA 방해를 중재하는 RNA를 언급하는 데 상호 교환적으로 이용될 수 있다. 이들 용어들은 이중쇄 RNA, 단일쇄 RNA, 분리된 RNA(부분 정제된 RNA, 필수적으로 정제된 RNA, 합성 RNA, 재조합 생성된 RNA)뿐만 아니라, 자연의 RNA에 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 치환 및/또는 변형이 발생된 변형된 RNA를 포함한다. 이러한 변형들은 RNA의 말단(들) 또는 내부(RNA의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드에서)에서 비-뉴클레오티드 물질이 삽입된 것을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 RNA 분자에서 뉴클레오티드는 비-표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이는 비-자연적 뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 요약하건대, 이러한 모든 변형된 RNAi 분자들은 자연 RNA의 유사체 또는 유사체들로 언급된다. 본 발명의 RNA는 RNAi를 중재할 수 있을 정도로 자연의 RNA와 충분히 유사하면 된다. 본 명세서에서 "RNAi 중재"는 RNAi 장치 또는 과정에 의해 영향을 받는 mRNA가 구별되도록 하는 능력을 의미한다. RNAi를 중재하는 RNA는 RNAi 장치와 상호작용하여 상기 장치가 특정 mRNAs를 파괴하도록 하거나 또는 타깃 단백질의 발현을 감소시킨다. 일 구현예에서, 본 발명은 자신의 서열에 상당한(corresponding) 특정 mRNA의 절단을 유발하는 RNA 분자에 관한 것이다. 서열의 완전한 상당성을 요구하지는 않으나, 그 상당성은 상기 RNA가 타깃 mRNA를 절단하거나 또는 발현을 억제하여 RNAi 억제를 달성할 수 있을 정도이어야 한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 RNA 분자는 RNA 부위 및 다른 추가적 부위, 예컨대, 디옥시리보뉴클레오티드 부위를 포함한다. RNA 분자에서 총 뉴클레오티드의 수는 적합하게는 49 이하이며, 이는 RNAi의 효과적인 중재를 하기 위해서이다. 바람직한 RNA 분자에서, 뉴클레오티드의 수는 16 내지 29이며, 보다 바람직하게는 18 내지 23이고, 가장 바람직하게는 21-23이다.
본 발명에 따른 RNA 분자의 첫 번째 군은 클러스테린을 암호화하는 mRNA를 표적으로 하며, 이 단백질은 테스토스테론-억제 전립선 메시지2(TRPM-2) 또는 설폰화 당단백질-2(SGP-2)로 알려져 있다. 클러스테린은 안드로겐 철회 이후에 전립선 종양세포에서 다량으로 발현된다. 또한, 클러스테린의 발현을 감소시키는 안티센스 치료법은 암의 치료에 치료학적 이점을 제공한다. 특히, 이러한 안티센스 치료법은 전립선암 및 신장세포 암의 치료에 적용될 수 있다(PCT 특허출원 공개 WO 00/49937, 참조로서 본 명세서에 삽입된다). 치료제의 투여는 인 비트로 및 인 비보에서 화학요법제 및 방사선치료에 대한 암 세포의 민감성을 증가시킬 수 있다. 클러스테린의 발현을 방해하는 특정 RNA 분자의 서열은 표 1 및 7에 열거되어 있다(미국 특허출원 09/967,726 참조, 본 명세서에 참조자료로서 삽입된다). 전립선암, 골육종과 같은 육종, 신장세포 암종, 유방암, 방광암, 폐암, 결장암, 난소암, 퇴행성 대세포 림프종 및 흑색종의 치료에 있어서, 상기 서열들은 단독으로 또는 다른 화학요법제 또는 아폽토시스 유도 치료제와 함께 병용으로 투여될 수 있다. 또한, 클러스테린은 아밀로이드 플라크 형성을 촉진하며, 알쯔하이머 질환 마우스 모델에서 신경염성 독성에 결정적으로 관여한다(De Mattos et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 99:10843-10848(2002), 본 명세서에 참조로서 삽입된다). 따라서, 본 발명의 서열은 알쯔하이머병의 치료에 이용될 수 있다.
| cDNA 표적 지역(nt) | 487-505 | 1105-1123 | 1620-1638 |
| 센스 siRNA | ccagagcucg cccuucuac-dtdt (서열번호 1) |
gaugcucaac accuccucc-dtdt (서열번호 3) |
cuaauucaau aaaacuguc-dtdt (서열번호 5) |
| 안티센스 siRNA | guagaagggc gagcucugg-dtdt (서열번호 2) |
ggaggaggug uugagcauc-dtdt (서열번호 4) |
gacaguuuua uugaauuag-dtdt (서열번호 6) |
| cDNA 표적 지역(nt) | HIV 1152-1176 | 53-71 | 비특정 서열 |
| 센스 siRNA | uaauucaaca aaacugu-dtdt (서열번호 7) |
augaugaaga cucugcugc-dtdt (서열번호 9) |
ugaaugaagg gacuaaccug-dtdt (서열번호 11) |
| 안티센스 siRNA | acaguuuugu ugaauua-dtdt (서열번호 8) |
gcagcagagu cuucaucau-dtdt (서열번호 10) |
cagguuaguc ccuucauuca-dtdt (서열번호 12) |
| cDNA 표적 지역(nt) | 비특정 서열 | 비특정 서열 | - |
| 센스 siRNA | cagaaauaga caaagugggg-dtdt (서열번호 13) |
acagagacua agggaccaga-dtdt (서열번호 15) |
- |
| 안티센스 siRNA | ccccacuuug ucuauuucug-dtdt (서열번호 14) |
acagagacua agggaccaga-dtdt (서열번호 16) |
- |
표 7에 기재된 RNAi 분자종의 이용과 관련된 특정 결과들은 도면에 나타나 있다. 이러한 결과는, 골육종 세포의 성장을 감소시키고 아폽토시스를 촉진하는 RNAi 중재 과정에 의한 클러스테린 억제의 효능을 보여주며, 이는 본 발명에 의해 치료될 수 있는 질환의 추가적 종류를 보여준다. 또한, 이 결과들은 클러스테린 양을 감소시키는 RNAi 처치가 p53의 양을 증가시키고 bcl-2의 양을 감소시킨다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명에 따르면, 종양 억제를 전체적으로 또는 부분적으로 불활성시키는 변이에 반대되는 조절에 의해 활성 p53 또는 bcl-2 양이 영향을 받는 질환들은 클러스테린 양, 즉 p53 및 bcl-2 양의 바람직하지 않은 클러스테린-관련 조절의 감소에 유효한 클러스테린 RNAi의 양을 투여함으로써 극복된다.
본 발명에 따른 RNA 분자의 두 번째 군은 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질-5(IGFBP-5)를 암호화하는 mRNA를 표적으로 한다. IGFBP-5 발현의 억제는 호르몬-조절(전립선 또는 유방) 종양세포가 호르몬(예컨대, 안드로겐 또는 에스트로겐) 독립성으로서의 진행을 지연시킬 수 있으며, 유방암 또는 전립선암과 같은 호르몬 조절 암으로 고통을 받는 인간과 같은 개체의 치료에 대한 치료학적 방법을 제공할 수 있고, 전립선 종양, 유방 종양 및 골에서의 다른 IGF-1 민감성 종양의 성장 및 전이성 진행을 억제 또는 지연시킬 수 있다 (PCT 특허출원공개 WO 01/05435, 참조로서 본 명세서에 삽입된다). 동일한 결과들이, 표 2에 열거된 서열을 가지는 siRNA 분자를 이용한 본 발명에 의한 RNAi 치료에 의해 얻어진다. 이러한 서열들은 단독으로 또는 다른 화학요법제 또는 아폽토시스 유도 치료제와 함께 병용으로 투여될 수 있다.
| cDNA 표적 지역(nt) | 44-61 | 876-895 | 비특정 서열 |
| 센스 siRNA | augguguugc ucaccgcg-dtdt (서열번호 17) |
cccugggcug cgagcugguc-dtdt (서열번호 19) |
gaggaaacug aggaccucgg-dtdt (서열번호 21) |
| 안티센스 siRNA | cgcggugagc aacaccau-dtdt(서열목록 제18서열) | gaccagcucg cagcccaggg-dtdt (서열목록 제20서열) |
ccgagguccu caguuuccuc-dtdt (서열목록 제22서열) |
| cDNA 표적 지역(nt) | 비특정 서열 | 850-568 | 1225-1243 |
| 센스 siRNA | cucggauucu caugcaaggg-dtdt (서열번호 23) |
agcccucucc augugcccc-dtdt (서열번호 25) |
gaagcugacc caguccaag-dtdt (서열번호 27) |
| 안티센스 siRNA | cccuugcuag agauuccgag-dtdt (서열번호 24) |
ggggcacaug gagagggcu-dtdt (서열번호 26) |
cuuggacugg gucagcuuc-dtdt (서열번호 28) |
| cDNA 표적 지역(nt) | 1501-1520 | - | - |
| 센스 siRNA | gcugccaggc auggaguacg-dtdt (서열번호 29) |
- | - |
| 안티센스 siRNA | cguacuccau gccuggcagc-dtdt (서열번호 30) |
- | - |
본 발명에 따른 RNA 분자의 세 번째 군은 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질-2(IGFBP-2)를 암호화하는 mRNA를 표적으로 한다. IGFBP-2 발현의 억제는 전립선 종양세포가 안드로겐 독립성으로의 진행을 지연시킬 수 있으며, 유방암 또는 전립선암과 같은 호르몬 조절 암으로 고통을 받는 인간과 같은 포유동물 개체의 치료에 대한 치료학적 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 상기한 암의 성장 및 전이성 진행을 억제 또는 지연시킬 수 있다 (PCT 특허출원공개 WO 02/22642, 참조로서 본 명세서에 삽입된다). 동일한 결과들이, 표 3에 열거된 서열을 가지는 siRNA 분자를 이용한 본 발명에 의한 RNAi 치료에 의해 얻어진다. 이러한 서열들은 단독으로 또는 다른 화학요법제 또는 아폽토시스 유도 치료제와 함께 병용으로 투여될 수 있다.
| cDNA 표적 지역(nt) | 118-138 | 1393-1411 | 906-924 |
| 센스 siRNA | augcugccga gagugggcugc-dtdt (서열번호 31) |
ccccuguguc ccuuuugca-dtdt (서열번호 33) |
cugugacaag cauggccug-dtdt (서열번호 35) |
| 안티센스 siRNA | gcagcccacu cucggcagcau-dtdt (서열번호 32) |
ugcaaaaggg acacagggg-dtdt (서열번호 34) |
caggccaugc uugucacag-dtdt (서열번호 36) |
| cDNA 표적 지역(nt) | 525-542 | - | - |
| 센스 siRNA | gcgccgggac gccgagua-dtdt (서열번호 37) |
- | - |
| 안티센스 siRNA | uacucggcgu cccggcgc-dtdt (서열번호 38) |
- | - |
본 발명에 따른 RNA 분자의 세 번째 군은 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질-2 및 -5(IGF-Bis)를 암호화하는 mRNA를 표적으로 한다. IGFBP-2 및 IGFBP-5 둘 모두의 발현의 억제는 호르몬-조절(전립선 또는 유방) 종양세포가 호르몬(예컨대, 안드로겐 또는 에스트로겐) 독립성으로의 진행을 지연시킬 수 있으며, 유방암 또는 전립선암과 같은 호르몬 조절 암으로 고통을 받는 인간과 같은 개체의 치료에 대한 치료학적 방법을 제공할 수 있고, 전립선 종양, 유방 종양 및 골에서의 다른 IGF-1 민감성 종양의 성장 및 전이성 진행을 억제 또는 지연시킬 수 있으며, 이는 상기 인자 각각을 억제할 때보다 더 효과적이다 (PCT 특허출원공개 WO 01/05435, PCT 특허출원공개 WO 02/22642, 2002년 1월 17일에 출원된 미국 가출원 60/350,046, 참조로서 본 명세서에 삽입된다). 동일한 결과들이, 표 4에 열거된 서열을 가지는 siRNA 분자를 이용한 본 발명에 의한 RNAi 치료에 의해 얻어진다. 이러한 서열들은 단독으로 또는 다른 화학요법제 또는 아폽토시스 유도 치료제와 함께 병용으로 투여될 수 있다.
| cDNA 표적 지역(nt) | BP5 898-919 BP2 346-362 |
BP5 948-964 BP2 416-432 |
BP5 976-991 BP2 444-459 |
| 센스 siRNA | ggagccgggc ugcggcugc-dtdt (서열번호 39) |
cgugcggcgu cuacacc-dtdt (서열번호 41) |
ccaggggcug cgcugc-dtdt (서열번호 43) |
| 안티센스 siRNA | gcagccgcag cccggcucc-dtdt (서열번호 40) |
gguguagacg ccgcacg-dtdt (서열번호 42) |
gcagcgcagccccugg -dtdt (서열번호 44) |
본 발명에 따른 RNA 또는 DNA 안티센스 분자의 다섯 번째 군은 마이크로플탈미아(microphthalmia) 전사 인자(Mitf)의 그룹을 암호화하는 mRNA를 표적으로 한다. Mitf는 흑색종 세포의 생존도, 선형 생존 및 아폽토시스에 대한 민감성을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 매스터 조절자 Mitf에 의해 Bcl-2는 흑색종 세포 및 다른 세포에서 조절된다(McGill et al.(2002) Cell 109, 707-718, 본 명세서에 참조로서 삽입된다). Mitf와 Mitf에 의해 조절되는 Bcl-2는 다양한 인간 종양에서 증가된 양으로 발현된다. Mitf의 발현을 감소시키는 RNAi 또는 안티센스 치료법은 암의 치료에 있어서 치료학적 이점을 제공한다. 본 발명에 따르면, 인 비트로 및 인 비보에서 화학요법제 및 방사선치료에 대한 암 세포의 민감성을 증가시킬 수 있다. Mitf의 발현을 방해하는 특정 RNA 분자의 서열은 표 5에 열거되어 있다. 흑색종, 전립선암, 신장세포 암종, 방광암, 폐암, 골암 및 다른 종류의 종양의 치료에 있어서, 상기 서열들은 단독으로 또는 다른 화학요법제 또는 아폽토시스 유도 치료제와 함께 병용으로 투여될 수 있다.
| cDNA 표적 지역(nt) | 207-225 | 1287-1305 | 2172-2190 |
| 센스 siRNA | ccgcugaaga gcagcaguu-dtdt (서열번호 45) |
augcaggcuc gagcucaug-dtdt (서열번호 47) |
agauacaguaccccucuag-dtdt (서열번호 49) |
| 안티센스 siRNA | aacugcugcu cuucagcgg-dtdt (서열번호 46) |
caugagcucg agccugcau-dtdt (서열번호 48) |
cuagagggguacuguaucu-dtdt (서열번호 50) |
본 발명에 따른 RNA 또는 DNA 안티센스 분자의 여섯 번째 군은 B-raf를 암호화하는 mRNA를 표적으로 한다. B-raf는 세포 신호전달에서 주요한 관여자이며 악성 흑색종에서 66% 및 다양한 인간 암에서 보다 낮은 비율로 발생하는 체세포성 미센스 변이에 의해 활성화된다(Davies et al.(2002) Nature 417, 949-954, 본 명세서에 참조로서 삽입된다). 활성화 및/또는 비활성화 B-raf의 발현을 감소시키는 RNAi 또는 안티센스 치료법은 암의 치료에 있어서 치료학적 이점을 제공한다. 본 발명에 따르면, B-raf의 발현 감소는 인 비트로 및 인 비보에서 화학요법제 및 방사선치료에 대한 암 세포의 민감성을 증가시킬 수 있다. B-raf의 발현을 방해하는 특정 RNA 분자의 서열은 표 6에 열거되어 있다. 흑색종, 전립선암, 신장세포 암종, 방광암, 폐암, 골암 및 다른 종류의 종양의 치료에 있어서, 상기 서열들은 단독으로 또는 다른 화학요법제 또는 아폽토시스 유도 치료제와 함께 병용으로 투여될 수 있다.
| cDNA 표적 지역(nt) | 362-380 | 1184-1202 | 2249-2267 |
| 센스 siRNA | ucucuggggu ucgguucug-dtdt (서열번호 51) |
ccugucaaua uugaugacu-dtdt (서열번호 53) |
cccuccuuguuucgggcug-dtdt (서열번호 55) |
| 안티센스 siRNA | caguuccguu ccccagaga-dtdt (서열번호 52) |
agucaucaau auugacagg-dtdt (서열번호 54) |
cagcccgauucaaggaggg-dtdt (서열번호 56) |
본 발명의 siRNA 분자는 타깃 단백질의 발현을 억제함으로써 치료학적 이점이 달성되는 암 또는 다른 질환들을 가지는 인간을 포함하는 환자의 치료에 이용된다. 본 발명의 siRNA 분자는 하루 한번 또는 그 이상의 주입(정맥내, 피하 또는 초내)으로 환자에게 투여될 수 있고 또는 타깃 mRNA 및 단백질의 조절에 적합한 혈장 및 조직 농도에 도달하도록 한번 또는 그 이상의 치료 사이클을 하기 위한 연속적인 정맥내 또는 초내 투여를 통해 투여될 수 있다.
도 1a는 siRNA-중재 클러스테린 유전자 발현 사일런싱에 따른 Sa OS, KH OS 및 U-2 OS 세포의 세포수 측정에 의해 평가된 상대적 성장속도를 보여준다. 5 x 103 세포/세포주를 6 웰 플레이트에 씨딩하고 siRNA 처리 70시간 이후 세포의 총수를 측정하였다. 세포수의 상당한 감소, 특히 U-2 OS 세포에서 관찰되었고, 이 세포들은 클러스터린 녹다운 세포이다.
도 1b 및 도 1c는 클러스테린 녹다운 KH OS 및 U-2 OS 세포에서 내재성 DNA 합성량 및 자연 아폽토시스를 보여주며, 이들은 각각 세포 증식 ELISA BrdU 발색 면역분석과 세포 사멸 검출 ELISA 광학 효소 면역분석방법으로 측정되었다. 상기 두 세포주에서 클러스테린 녹다운은 감소된 DNA 합성과 내재성 자연 아폽토시스의 증가된 비율을 나타내었다.
도 2a 및 도 2b는 클러스테린 녹다운 OS 세포의 감소된 클론생성능을 보여준다. 70시간 siRNA 처리한 후, 5 x 103 세포/세포주를 6 웰 플레이트에 씨딩하고 완전 배지에서 5일 동안 배양시킨 다음 세포의 총수를 측정하였다(도 2a). 도 2b는 U-2 OS 세포에서의 비교 실험예 결과를 보여준다.
도 3a-도 3f는 siRNA-중재 클러스테린 녹다운에 따른 OS 세포에서 DXR 치료 효과 및 DNA 손상과 산화 스트레스에 대한 세포의 민감성을 보여준다. 도 3a 및 도 3b에서, 어두운 막대는 2 x 104 KH OS 또는 U-2 OS 세포를 완전 배지를 가지는 6 웰 플레이트에 씨딩하고 siRNA 70시간 처리한 후 회복하도록 방치한 경우의 결과를 보여준다. 이어, 세포를 0.35:M DXR에 24시간 노출시키고 완전 배지에서 72시 간 동안 서브배양한 다음 세포수를 측정하였다. 도 3a 및 도 3b에서, 밝은 막대는 2 x 104 KH OS 또는 U-2 OS 세포를 완전 배지를 가지는 6 웰 플레이트에 씨딩하고 siRNA 70시간 처리한 후 DXR를 직접 형질전환 배지에 첨가하여 최종 농도 0.35 ΦM이 되도록 하였다. 의약 함유 형질전환 배지에서 세포를 24시간 동안 배양하였고, 세척한 다음 완전 배지에서 72시간 동안 회복시킨 다음, 세포수를 측정하였다.
도 4는 PC3 종양세포에서 siRNA에 의한 서열-특이 클러스테린 유전자의 사일런싱에 대한 정량적 분석을 보여준다.
도 5는 클러스테린 녹다운 PC3 세포성장 및 아폽토시스에 대한 파클리탁셀 치료 효과를 보여준다. 세포를 C1-Ⅲ, CI-Ⅳ 또는 스크램블 대조군 siRNA로 1일 동안 처리하였다. siRNA 처리 후 2일째에, 세포를 표시된 농도의 파클리탁셀에 48시간 동안 노출시킨 다음, 세포 생존도를 인 비트로 MTT 분석으로 결정하였다.
도 6은 CLU-5 siRNA(서열번호 9 및 10)에 PC3 전립선암 세포를 노출한 경우의 정량적 분석 결과이다.
도 7은 CLU-5 siRNA(서열번호 9 및 10)에 A549 폐암 세포를 노출한 경우의 정량적 분석 결과이다.
도 8은 PC3 세포를 클러스테린-표적 siRNA로 처리한 결과 클러스테린 전사체의 감소를 보여주는 그래프이며, 이는 RT-PCR로 결정한 것이다.
도 9는 A549 세포를 클러스테린-표적 siRNA로 처리한 결과 클러스테린 전사체의 감소를 보여주는 그래프이며, 이는 RT-PCR로 결정한 것이다.
도 10은 PC3 세포를 클러스테린-표적 siRNA로 처리한 결과 클러스테린 전사 체의 감소를 보여주는 그래프이며, 이는 노던 블롯팅으로 결정한 것이다.
도 11은 PC3 세포를 siRNA와 택솔로 병용 처리한 경우의 세포 생존도를 보여준다.
도 12는 A549 세포를 siRNA와 택솔로 병용 처리한 경우의 세포 생존도를 보여준다.
도 13은 OVCAR3 세포를 클러스테린-표적 siRNA로 처리한 결과 클러스테린 전사체의 감소를 보여주는 그래프이며, 이는 노던 블롯팅으로 결정한 것이다.
도 14는 MDA-MB 231 세포를 클러스테린-표적 siRNA로 처리한 결과 클러스테린 전사체의 감소를 보여주는 그래프이며, 이는 노던 블롯팅으로 결정한 것이다.
도 15는 MDA-MB 231 세포를 클러스테린-표적 siRNA로 처리한 결과 클러스테린 전사체의 감소를 보여주는 그래프이며, 이는 RT-PCR로 결정한 것이다.
도 16은 MCF-7 세포를 클러스테린-표적 siRNA로 처리한 결과 클러스테린 전사체의 감소를 보여주는 그래프이며, 이는 노던 블롯팅으로 결정한 것이다.
도 17은 MCF-7 세포를 클러스테린-표적 siRNA로 처리한 결과 클러스테린 전사체의 감소를 보여주는 그래프이며, 이는 RT-PCR로 결정한 것이다.
도 18은 siRNA로 처리된 MCF-7 세포에서의 클러스테린 단백질의 양의 감소를 스크램블 대조군과 비교한 그래프이다.
도 19는 A549 세포를 이중표적 IGFBP-2와 -5-표적 siRNA로 처리한 결과 IGFBP-2 전사체의 감소를 보여주는 그래프이며, 이는 RT-PCR로 결정한 것이다.
도 20은 PC3 세포를 이중특이성 IGFBP-2와 -5-표적 siRNA로 처리한 결과 IGFBP-5 전사체의 감소를 보여주는 그래프이며, 이는 RT-PCR로 결정한 것이다.
도 21은 PC3 세포에서 IGFBP-5 mRNA의 감소를 보여준다.
도 22는 예비 인간 골 섬유아세포에서 IGFBP-5 전사체의 억제를 보여준다.
도 23은 IGFBP-2/IGFBP-5 이중특이성 siRNA에 의한 C42 세포의 성장 억제를 보여준다.
도 24는 IGFBP-2/IGFBP-5 이중특이성 siRNA에 의한 A549 세포의 성장 억제를 보여준다.
실시예 1
siRNA 이합체에 의한 LNCaP 및 PC3 세포의 형질전환 과정
1) 세포 준비:
6-웰 플레이트의 각각의 웰에 항생제[페니실린/스트렙토마이신]가 없는 5% FBS 함유 배지에서 0.5 x 106 LNCaP 세포(PC3 세포의 경우 웰 당 0.3 x 106 밀도로)를 씨딩하였다.
함습 5% CO2 배양기에서 세포를 37E C에서 배양하여 40-50% 컨플루언시가 되도록 하였다.
2) siRNA 준비:
마이크로원심분리 튜브에 하기의 siRNA 희석액을 준비하였다. 각각의 웰 당 0.01-100 nM
3) 마이크로원심분리 튜브에 다음의 형질전환 시약 희석액을 준비하였다: OligoFECTAMINETM 시약 4 ㎖을 6-웰 플레이트의 각각의 웰에 있는 OPTI-MEMTM 11 ㎖에 희석하고 상온에서 10분 동안 항온처리하였다.
4) 희석한 OligoFECTAMINETM을 희석한 siRNA 이합체와 부드럽게 혼합하였다.
5) 상온에서 20분 동안 항온처리 하였다.
6) 웰로부터 배지를 제거하고 OPTI-MEMTM 800 ㎖로 대체하였다.
7) 형질전환 복합체 200 ㎖을 세포 상에 놓았다.
8) CO2 배양기에서 4시간 동안 37℃에서 배양하였다.
9) 15% FBS를 함유하는 배지 500 ㎖을 첨가하였다.
10) 24시간 후, 실시간 PCR로 유전자 발현을 검사하거나 또는
11) 1, 6, 12, 24, 48, 72 및 96시간 이후 웨스턴 블롯팅으로 단백질 발현을 검사하였다.
실시예 2
siRNA에 대한 필요한 기준을 만족시키는 AA(N19)UU(N, 모든 뉴클레오티드)의 서열을 동정하기 위하여 인간 클러스테린 cDNA를 스캐닝하였다(Harbourth et al., J Cell Sci 114:4557-4560(2001)). 대칭의 2-nt 3'-돌출부를 가지는 두 가지 서열이, CLU 유전자 전사 개시 코돈의 다운스트림방향으로 433(C1-I) 및 644(C1-Ⅱ) nts에 해당하는 부분에서 발견되었다. 두가지 추가적인 올리고뉴클레오티드는, CLU 유전자 전사 개시 코돈(Cl-Ⅲ) 및 인간 CLU 전사 개시 위치(Cl-V)의 다운스트림 방향으로 1620 nts에 해당하는 부위를 표적화 하였다(참조 표). BLAST 분석을 통하여, 다른 공지의 인간 유전자와 유사성을 나타내지 않음을 확인하였다. 선택된 RNA 올리고들은 Dharmacon Research, Inc.(Lafayette, CO)에서 합성되었고, RNAase-결여 ddH2O에서 20 :M로 희석되었고, -20℃에서 보관하였다. 이용된 Scramble-ITM(Sc-I)(D-1200-20) 및 Scramble-ⅡTM(Sc-Ⅱ)(D-1205-20) 올리고뉴클레오티드는 Dharmacon Research, Inc.로부터 구입하였다.
C1-I, C1-Ⅱ 및 스크램블 RNA 이합체의 siRNA 형질전환을 대수기 성장 OS 세포에 대하여 실시하였다(Harbourth et la., Tuschl et al., Genes Dev. 13:3191-3197(1999)). 간략하게, 세포를 siRNA 형질전환 전날에 500 :l 완전배지를 함유하는 24-웰 플레이트에 씨딩하고, ~40-50% 컨플루언시에 되도록 하였다. 형질전환 혼합물에서 웰 당 siRNA 이합체 100 nM을 이용하였다. 상기 RNA 이합체를 Opti-MEM®I(Gibco Life Technologies, Inc. San Diego, CA) 혈청 결여 배지에서 희석하고 OligofectamineTM 시약(Invitrogen Life technologies Inc., San Diego, CA)을 이용하여 형질전환 효율을 향상시켰다. 세포를 Cl-I 및 Cl-II 올리고뉴클레오티드로 동시에 처리하는 경우, 각각의 siRNA 이합체 100 nM을 이용하였다. siRNA 올리고뉴클레오티드에 의해 세포 치료를 2-3일 동안 지속시켰다.
선택적으로, PC3 세포에서, LipofectinTM(Invitrogen Life technologies Inc., San Diego, CA)를 이용하여 Cl-Ⅲ 및 CL-V 올리고뉴클레오티드에 의한 형질전환을 향상시켰다. 혈청 결여 Opti-MEM®I 내의 OligofectamineTM 시약 4 :g/ml로 20분 동안 전처리 한 다음, PC3 세포를 10, 50 또는 100 nM의 RNA 이합체로 처리하였다. 반응을 개시한 후 4시간째에 RNA 이합체와 Lipofectin을 함유하는 배지를 표준 조직 배지로 대체하였다. 세포를 1일째에 한번 처리한 다음, 3일째 처리후 48시간에 수집하였다. 모든 실험에서 이용된 대조군은 다음을 포함한다: (a) Sc-I 및 Sc-Ⅱ RNA 이합체의 이용 및 (b) 핵산의 부재 하에서의 모크 형질전환(Con-I). CLU 유전자 사일런싱을 RNA 블롯 분석, 면역블롯 분석 또는 공초점 면역형광으로 평가하였다.
OS 세포에서 CLU 유전자 발현의 효율적인 사일런싱은 siRNA를 이용하여 달성된다. C1-I 또는 Cl-Ⅱ siRNA 올리고뉴클레오티드에 의한 세가지 OS 세포주의 처리는 효율적인 것으로 관찰되었고 CLU 단백질의 세포내 양을 상당히 감소시키는 결과를 초래하였다. 흥미롭게는, Cl-I 올리고뉴클레오티드는 Cl-II와 비교하여 CLU 유전자의 사일런싱에서 보다 효율적인 것으로 확인되었다. 대조군 Sc-I 또는 Sc-Ⅱ 올리고뉴클레오티드의 존재하에서 또는 형질전환 배지에서 RNA 이합체가 결여된 경우에는 CLU 유전자 사일런싱이 관찰되지 않았다.
이어, CLU-특이 siRNA 올리고뉴클레오티드가 세포의 DXR 노출 이후에 CLU 단백질의 축척을 억제할 수 있는 지 여부를 확인하였다. Cl-I, Cl-Ⅱ 또는 Cl-I과 Cl-Ⅱ 올리고뉴클레오티드의 혼합물의 존재하에서 KH OS 및 U-2 OS 세포를 DXR에 24시간 동안 노출한 경우, CLU 단백질의 축척을 효과적으로 억제하였다. 따라서, Cl-I 또는 Cl-Ⅱ 올리고뉴클레오티드는, 아폽토시스 유도제에 노출시킨 세포에서 CLU 단백질의 유도를 억제한다는 것을 알 수 있다.
실시예 3
siRNA에 의한 CLU 유전자 발현 사일런싱에 따른 OS 세포에서의 표현형 효과. OS 세포에서 CLU 유전자의 발현을 사일런싱한 경우의 효과를 세포수를 직접 측정하거나 세포의 형태와 표현형을 기록하거나 클론형성능을 분석해서 연구하였다. KH OS 및 Sa OS 세포에서 CLU 녹 다운은 어떠한 가시성 표현형에도 영향을 미치지 않았다. 그러나, CLU 녹 다운 세포는 대조군과 비교하여 상당한 성장지연을 나타내었다(도 1a). 반대로, 내재성 CLU 단백질의 높은 수준을 발현하는U-2 OS 세포에서, CLU 녹 다운 효과는 상당한 정도로 나타난다. 특히, CLU siRNA 처리된(3일 동안) U-2 OS 세포는 플라스틱에 대한 그들의 견고한 접착성을 상실하고 둥근 모양을 획득하였다. 이러한 표현형은 심각한 성장 지연 효과와 함께 동반되었다. Cl-I과 Cl-Ⅱ RNA 이합체의 조합이 세포성장을 억제하는 데 더 효과적인 지 여부를 연구하기 위하여, 상기 두 올리고뉴클레오티드로 세포를 처리하였다. KH OS 및 U-2 OS 세포에서, Cl-I 처리 세포와 비교하여 단지 미약한 성장지연 효과가 관찰되었다. 최종적으로, CLU 단백질 제거의 정세포(cytostatic) 효과 및 세포독성 효과를 분별하기 위하여, CLU 녹 다운 KH OS 및 U-2 OS 세포에서 DNA 합성 및 내재성 자연 아폽토시스를 직접적으로 분석하였다. CLU 녹 다운 세포는, 그들의 자매세포 대조군과 비교하여, 감소된 DNA 합성 속도를 나타내었고(도 1a), 증가된 내재성 자연 아폽토시스를 나타내었다(도 1b). U-2 OS 세포에서도 이러한 효과가 더욱 명확하게 재연되었다. 요약하면, 상술한 결과들은, CLU 녹 다운 세포의 감소된 수는 세포 성장속도의 감소와 자연적 아폽토시스의 증가된 수준 때문이라는 것을 증명한다.
siRNA에 따른 플레이팅 효율 및 성장에서의 CLU 녹 다운 효과를 클론형성능 분석으로 연구하였고, 최근의 연구에 따르면 유전자 사일런싱은 7 세포 배가기간 동안 지속되었다(Harbourth et al.). 이 분석을 위하여 KH OS 및 U-2 OS 세포를 선택하였는 데, 이는 이 두 세포가 내재성 CLU의 양 및 CLU 축적 정도에서 서로 반대되는 극단의 대표적인 예가 되기 때문이다. CLU 녹 다운 KH OS 세포를 플레이팅한 경우, 플라스틱에 견고하게 결합을 하며(씨딩된 세포의 90% 이상이 결합함) 결합된 소수의 세포만 비정상의 형태를 보였다. 그러나, 결합된 세포의 성장능력은, 총 콜로니수 및 형성된 콜로니의 크기를 분석한 이후 플레이팅 5일째에 손상되었다(도 2a). 트립신 처리 이후 CLU 녹 다운 U-2 OS 세포는 플라스틱에 잘 결합하지 않았고(씨딩 세포 중 단지 70%만이 결합됨), 결합된 세포의 대부분은 다소 비정상적인 모양을 나타내었다. 세포들은 극도의 낮은 성장능력을 나타내었고(도 2b), 배양 9일 이후 단지 몇 몇의 작은 콜로니만이 관찰되었다.
실시예 4
siRNA에 의한 OS 세포에서의 CLU 유전자 발현의 지속적 사일런싱은 유전독성(genotoxic) 및 산화 스트레스에 의해 유도되는 아폽토시스에 대한 상당한 민감성을 초래한다. CLU 기능적 분석 이전에, OS 세포에서 DXR 효과를 분석하였는 데, 이는 약물-관련 효과가 상이한 세포 종류에서 다양하게 나타내기 때문이다(Gewritz et al., Biochem. Pharmacol. 57:727-741(1999)). 처리된 환자에서 DXR 혈장 농도 는 1-2 :M 범위이고 1시간 이내에 0.025-0.25 :M로 감소하기 때문에(Muller et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 32:379-384(1993)), 세포를 0.35 및 1 :M DXR로 처리하였다. DXR-중개 세포 사멸의 정도를 분석하기 위하여, TUNEL로 아폽토시스를 분석하였다. 24시간 약물 처리 후 접착된 세포들은 비처리 대조군 세포와 비교하여 상당한 모양변화를 나타내었다. 이 때, 세포들은 증가된 크기와 평평해진 모양을 나타내었고, 이는 노화-유사 표현형이며, 이들의 상당수는 TUNEL 포지티브이다. 이후의 아폽토시스는 24시간 이후에도 명백하게 나타나며, 이러한 현상은 아폽토시스가 역동적인 과정임을 보여주며, 이는 DXR을 배지로부터 제거하는 경우에도 계속된다. TUNEL에 의해 얻은 결과와 일치되게, DXR 처리는 PARP 절단이 수반되며; 항-아폽토시스 단백질 bcl-2는 약물-처리 KH OS 및 U-2 OS 세포에서 변화된 발현을 나타내지 않았다. DXR 처리 이후, p53 단백질 및 성장 정지(p21) 또는 아폽토시스(bax)와 관련된 그의 다운스트림 효과자들의 축적은 단지 U-2 OS 세포에서만 관찰되었고, 이는 OS 세포주에서 DXR에 의해 중재되는 정세포 및 세포독성 효과가 p53-의존성 및 p53-비의존성 기전에 의존한다는 사실을 증명한다.
이어, DXR에 노출한 OS 세포에서 CLU 녹 다운 효과를 조사하기 위하여, 두 가지 보상적인 접근을 시도하였다(도 3a 및 3b). siRNA 처리 세포를 완전배지에서 재-플레이팅하고 이어 0.35 :M DXR에 24시간 동안 노출시키거나, Cl-Ⅱ 또는 Cl-I 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 0.35 :M DXR에 노출시켰다. 두 경우에서, DXR-처리 3일째에 생존 세포의 수를 측정하였다. CLU 녹 다운 KH OS 세포는 DXR에 대하여 대조군과 비교하여 더욱 민감하였으나(도 3a-암 막대), 배지에서 CLU-특이 siRNA 올리고뉴클레오티드의 존재하는 경우 DXR 처리는 보다 효과적으로 나타난다(도 3a-명 막대). 유사하게, CLU 녹 다운 Sa OS 세포는 DXR 처리에 대하여 더욱 민감하였다. U-2 OS 세포에서 상기 두 접근은 매우 효과적으로 나타났고 CLU 녹 다운 세포는 상기 약물에 대하여 대조군과 비교하여 보다 민감하였다(도 3b). DXT 처리를 CLU-특이 siRNA 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 실시한 경우, CLU 녹 다운 세포는 상기 약물에 대하여 보다 민감하였고(도 3b-명 막대) 과량의 아폽토시스가 관찰되었다. 최종적으로, U-2 OS 세포를 Cl-I 및 Cl-Ⅱ 올리고뉴클레오티드 두 가지로 처리한 경우, 세포들은 거의 완전하게 제거되었다.
CLU 녹 다운 이후의 세포 민감성의 기전을 이해하기 위하여, 유전독성 유도제(DXR) 또는 산화 스트레스 유도제(H2O2)에 세포를 노출시킨 바로 직후의 아폽토시스 유도의 정도를 직접적으로 분석하였다. 도 3c-3f에 나타난 바와 같이, CLU 녹 다운 세포를 DXR 또는 H2O2에 노출시키면 KH OS 및 U-2 OS 세포에서 아폽토시스의 상당한 높은 수준을 나타내었다. 이러한 결과는, CLU가 세포보호 신호를 제공함으로써 직접적으로 아폽토시스에 관여하는 세포적 장치에 영향을 미치거나 또는 아폽토시스에 관여하는 세포적 장치와 상호작용한다는 사실을 보여준다.
실시예 5
CLU 유전자 사일런싱에 의한 유전독성 및 산화성 스트레스에 대한 OS 세포의 민감성은 세포의 아폽토시스 장치의 활성화와 관련된다. 다른 최근 동정된 CLU 단백질 형태의 발현량을 분석하였고, 놀랍게도, Cl-I 또는 Cl-Ⅱ 올리고뉴클레오티드의 결합 위치는 s-CLU 및 n-CLU mRNAs에서 공통적이지만(Leskov et al., J. Biol. Chem. 278:11590-16000(2003)), C1-I 및 Cl-Ⅱ 올리고뉴클레오티드는 KH OS 및 U-2 OS 세포에서의 추정의 55 kDa n-CLU35 CLU 단백질 형태에 대하여 어떠한 상당한 효과도 발휘하지 않았음을 발견하였고; 49 kDa c-CLU49 단백질 형태의 양에 미소한 효과를 발견하였다. 이러한 효과는 n-CLU 단백질이 극도로 안정하기 때문이다. 따라서, CL-I 및 CL-Ⅱ 올리고뉴클레오티드는 분비된 CLU(s-CLU) 단백질 형태를 특이하게 녹 다운한다.
그런 다음, 인간 세포에서 아폽토시스를 조절하는 몇 종의 단백질의 발현량을 분석하였다. KH OS 및 U-2 OS 세포에서 CLU 녹 다운은 항-아폽토시스 분자 bcl-2의 하향-조절을 초래하였다. DNA 손상 복구와 신호전달에 관여하며 n-CLU에 결합하는 Ku70 단백질(Yang et al., Proc. Nat'l Acad. Sci(USA) 97:5907-5912(2000))의 양에는 영향을 미치지 않았다. 흥미롭게는, 기능적 p53 분자를 가지는 U-2 OS 세포에서 bcl-2 하향-조절에서 벗어나는 CLU 녹 다운은 또한 p53 축적을 동반하며 다운스트림 친-아폽토시스 조절자인 bax의 상향-조절을 동반한다. DXR에 노출된 경우 CLU 녹 다운 U-2 OS 세포는 Sc-I 처리 세포와 비교하여 p53 단백질의 보다 높고 확실한 축적을 나타내었다. CLU 녹 다운에 따른 OS 세포의 민감화는 대개 세포의 친-아폽토시스 장치의 활성화에 의존한다. 본 발명자들의 이후의 연구는 아폽토시스 조절에 관여하는 세포 신호전달에 대한 CLU의 관련성에 대한 것이다.
실시예 6
PC-3 전립선암 세포에서 CLU 유전자 사일런싱의 효과를 조사하였다. OS 세포에서 CLU 녹 다운의 상당한 효과는 본 발명자들이 이미 규명하였고, 이어 CLU siRNA를 PC 3 인간 전립선암 세포에 적용하였다. PC3 세포는 p53 활성이 없고(Rohlff et al., Prostate 37:51-59(1998)) Sa OS 세포와 유사한 s-CLU 단백질 형태의 비교적 낮은 내재적 양을 발현한다. PC3 세포에서, Cl-I 및 Cl-Ⅱ 올리고뉴클레오티드를 이용하지 않고, 두 종의 추가적 CLU-특이 siRNA 올리고뉴클레오티드(Cl-Ⅲ, Cl-Ⅴ)를 시험하였다. Cl-V는 s-CLU 전사 개시 위치를 표적화한다. PC3 세포에서 Cl-I 및 Cl-Ⅱ의 이용은 OS 세포주에서의 효과와 유사한 효과를 초래하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, Cl-Ⅲ 및 Cl-Ⅴ 올리고뉴클레오티드는 CLU RNA 및 단백질 발현을 사일런싱하는 데 효과적이며, 이는 서열-의존적이지만, 양-비의존적이다. 보다 상세하게는, Cl-Ⅲ 또는 Cl-V siRNA 올리고뉴클레오티드의 10, 50 및 100 nM로 PC3 세포를 1일 처리한 경우 CLU mRNA 양은 60% 내지 98%까지 크게 감소하였다(도 4). mRNA 양에 대한 이러한 효과는 단백질 수준에서도 명백하게 나타났다. U-2 OS 세포에서 발견된 것과 일치되게, PC3 세포에서 CLU 녹 다운은 상당한 형태학적 변화를 초래하였고, 이는 이후의 아폽토시스와 유사한 것이다.
CLU siRNA 올리고뉴클레오티드에 의한 PC3 세포의 처리가 화학요법제의 세포독성 효능을 강화시키는 지 여부를 결정하기 위하여, PC3 세포를 Cl-Ⅲ, Cl-Ⅴ 또는 Sc-I siRNA 올리고뉴클레오티드로 처리한 다음, 다양한 농도의 파클리탁셀을 함유하는 배지와 2일 동안 반응시켰다. 이어, MTT 분석을 하여 세포 생존도를 결정하였다. 도 5에서 볼 수 있듯이, CLU siRNA 처리는 파클리탁셀의 화학민감성을 처리량-의존적으로 크게 증가시켰고, 이는 파클리탁셀의 IC50(세포 생존도를 50% 감소시키는 농도)을 90% 이상 감소시켰으며, 스크램블 siRNA는 전혀 효과가 없었다.
| - | Cl-I | Cl-Ⅱ |
| 표적 부위 | AAccagagctcgcccttctacTT (서열번호 57) |
AAgtcccgcatcgtccgcagcTT (서열번호 60) |
| 센스 siRNA | ccagagcucgcccuucuacdTdT (서열번호 58) |
gucccgcaucguccgcagcdTdT (서열번호 61) |
| 안티센스 siRNA | guagaagggcgagcucuggdTdT (서열번호 59) |
gcugcggacgaugcgggacdTdT (서열번호 62) |
| - | Cl-Ⅲ | Cl-Ⅴ |
| 표적 부위 | AActaattcaataaaactgtcTT (서열번호 63) |
GCatgatgaagactctgctgcTG (서열번호 66) |
| 센스 siRNA | cuaauucaauaaaacugucdTdT (서열번호 64) |
augaugaagacucugcugc (서열번호 67) |
| 안티센스 siRNA | gacaguuuuauugaauuagdTdT (서열번호 65) |
gcagcagagucuucaucau (서열번호 68) |
| Cl-I, Cl-Ⅱ, Cl-Ⅲ 및 Cl-Ⅴ클러스테린 특이 siRNA 올리고뉴클레오티드는 각각 57/43, 67/33, 24/76 및 43/57의 GC/AT 비율을 갖는다. | ||
실시예 7
클러스테린을 표적화하는 8종의 siRNA는 서열번호 1와 2, 서열번호 3과 4, 서열번호 5와 6, 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12, 서열번호 13과 14, 서열번호 15와 16의 이중쇄 RNA로 형성되며, 각각 CLU1-CLU8로 표시된다. PC3 세포를 siRNA 8종 또는 스크램블 대조군의 다양한 양(10, 50 및 100 nM)로 형질전환시켰다. 처리 3일 후, 단백질을 추출하고 웨스턴 블롯팅으로 분석하여 클러스테린 (MW = 40 및 60 kDa) 양을 검사하였다. 클러스테린 양의 감소는 모든 8종의 siRNA로부터 관찰되었으나, 가장 우수한 결과는 CLU-5(서열번호 9와 10)에서 나타났다.
CLU-5(서열번호 9와 10)로 처리한 세포에 대한 빈쿨린(vinculin) 대조군 블롯에 대하여 정규화한 다음, 덴시토미터 측정을 실시하였다. 결과는 도 6에 정리되어 있다. "Oligo" 세포를 oligoFECTAMINETM으로만 처리하였다. 도면에서 볼 수 있듯이, siRNA에 대한 양 의존적 반응을 관찰할 수 있다.
실시예 8
PC3 전립선 세포 대신에 A549 폐암 세포를 이용하여 실시예 7의 과정을 반복하였다. CLU-5(서열번호 9와 10)로 처리한 세포에 대한 빈쿨린 대조군 블롯에 대하여 정규화한 다음, 덴시토미터 측정을 실시하였다. 결과는 도 7에 정리되어 있다. "Oligo" 세포를 oligoFECTAMINETM으로만 처리하였다. 도면에서 볼 수 있듯이, siRNA에 대한 양 의존적 반응을 관찰할 수 있다.
실시예 9
PC3 전립선 세포를 10, 50 또는 100 nM의 siRNA 또는 100 nM의 스크램블 대조군으로 형질전환시켰다. 형질전환 2일 후, 총 RNA를 추출하고 클러스테린 전사체의 양을 실시간 PCR로 정량화 하였다. 결과는 도 8에 정리되어 있다. 도면에서 볼 수 있듯이, siRNA 8종의 각각은 클러스테린 전사체의 양을 감소시켰다.
실시예 10
PC3 전립선 세포 대신에 A549 폐암 세포를 이용하여 실시예 9의 과정을 반복하였다. 결과는 도 9에 정리되어 있다. 도면에서 볼 수 있듯이, siRNA 8종의 각각은 클러스테린 전사체의 양을 감소시켰다.
실시예 11
PC3 세포를 10, 50 또는 100 nM의 CLU-3(서열번호 5와 6) 또는 CLU-5(서열번호 9와 10) 또는 스크램블 대조군 또는 단지 oligoFECTAMINETM으로만 처리(1 펄스)하였다. 2일 후, 총 RNA를 추출하고 노던 블롯팅으로 클러스테린 및 GADPH에 대하여 분석하였다. 덴시토미터 측정을 실시하였다. 도 10은 GADPH에 대하여 정규한 후의 측정 결과를 보여준다. 클러스테린 전사체의 양의 감소가 CLU-3 및 CLU-5의 모든 처리량에서 관찰되었다.
실시예 12
PC3 세포를 25 nM 인간 클러스테린 siRNAs(CLU-3 및 CLU-5), 스크램블 대조군 또는 단지 oligoFECTAMINETM으로만 1회 처리하였다. 2일 후, 배지를 택솔(파크릴탁셀)의 다양한 농도를 함유하는 배지로 대체하였다. 반응 3일 후, 세포 생존도를 MTT 분석으로 측정하였다. 도 11은 결과를 요약한다. 도면에서 볼 수 있듯이, siRNA 및 택솔은 생존 세포의 수를 시너직하게 감소시켰다.
실시예 13
PC3 세포 대신에 A549 세포를 이용하여 실시예 12의 과정을 반복하였다. 결과를 도 12에 요약하였다.
실시예 14
OVCAR3 난소암 세포를 1, 10 또는 50 nM의 CLU5, 스크램블 대조군 또는 단지 부형제로만 1회 처리하였다. 처리되지 않은 대조군도 같이 실시하였다. 2일 후, 총 RNA를 추출하고 노던 블롯팅으로 클러스테린 및 GADPH에 대하여 분석하였다. GADPH에 대하여 정규한 후 덴시토미터 측정을 실시하였고, 이는 도 13에 나타나 있다. 클러스테린 전사체 양의 실질적인 양 의존적 감소가 관찰되었다.
실시예 15
MDA-MB 231 인간 폐암 세포를 5, 50 또는 100 nM의 CLU5 또는 스크램블 대조군 또는 단지 oligoFECTAMINETM 부형제로만 형질전환시켰다. 2일 후, RNA를 추출하고 노던 블롯팅으로 클러스테린 및 GADPH에 대하여 분석하였다. GADPH에 대하여 정규한 후 덴시토미터 측정을 실시하였고, 이는 도 13에 나타나 있다. 클러스테린 전사체 양의 실질적인 양 의존적 감소가 관찰되었다.
실시예 16
클러스테린 전사체를 RT-PCR로 정량화 하는 것을 제외하고, 실시예 15의 과정을 반복하였다. 결과는 도 15에 요약되어 있다. 클러스테린 전사체 양의 실질적인 양 의존적 감소가 관찰되었다.
실시예 17
MCF-7 인간 폐암 세포를 5, 25 또는 50 nM의 CLU5 또는 스크램블 대조군 또는 단지 oligoFECTAMINETM 부형제로만 형질전환시켰다. 2일 후, RNA를 추출하고 노던 블롯팅으로 클러스테린 및 GADPH에 대하여 분석하였다. GADPH에 대하여 정규한 후 덴시토미터 측정을 실시하였고, 이는 도 16에 나타나 있다. 클러스테린 전사체 양의 실질적인 양 의존적 감소가 관찰되었다.
실시예 18
클러스테린 전사체를 RT-PCR로 정량화 하는 것을 제외하고, 실시예 17의 과정을 반복하였다. 결과는 도 17에 요약되어 있다. 클러스테린 전사체 양의 실질적인 양 의존적 감소가 관찰되었다.
실시예 19
MCF-7 인간 폐암 세포를 CLU-5 siRNA의 다양한 농도(5 및 50 nM) 또는 스크램블 대조군으로 형질전환시켰다. 처리 3일 후, 단백질을 추출하고 웨스턴 블롯팅으로 클러스테린(MW = 40 및 60 kDa)의 양을 분석하였다. 도 18은 siRNA로 처리한 세포에서 클러스테린 단백질의 양의 감소를 스크램블 대조군과 비교하여 보여준다.
실시예 20
클러스테린 과발현 LNCaP/T1 세포를 10 nM CLU-5 siRNA 또는 스크램블 대조군으로 1회 형질전환시켰다. 처리 3일 후, 단백질을 추출하고 클러스테린에 대한 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. siRNA로 처리한 세포에서 클러스테린은 전혀 검출되지 않았다.
실시예 21
IGFBP-2 및 -5를 표적화하는 3종의 siRNA는 서열번호 39와 40, 서열번호 41과 42 및 서열번호 43과 44 서열의 이중쇄 RNA로 형성되며, 각각 BS-1-BS-3으로 표시된다. A549 세포를 siRNA 3종 또는 스크램블 대조군의 다양한 양(10, 50 및 100 nM)로 형질전환시켰다. 부형제 대조군 및 비처리 대조군도 역시 평가하였다. 총 RNA를 분리하고 RT-PCR로 IGFBP-2 전사체를 분석하였다. 도 19에서 볼 수 있듯이, IGFBP-2 전사체 양의 감소가 3종의 siRNA에서 관찰되었다.
실시예 22
PC3 세포를 이중특이성 siRNA 3종(BS-1, BS-2 및 BS-3) 또는 스크램블 대조군의 다양한 양(10, 50 및 100 nM)로 형질전환시켰다. 부형제 대조군도 역시 평가하였다. 총 RNA를 분리하고 RT-PCR로 IGFBP-5 전사체를 분석하였다. 도 20 및 21에서 볼 수 있듯이, IGFBP-5 전사체 양의 감소가 3종의 siRNA에서 관찰되었다.
실시예 23
초기 인간 골 섬유아세포를 이중특이성 siRNA 3종의 50 nM 또는 스크램블 대조군으로 형질전환시켰다. 부형제 대조군 및 비처리 대조군도 역시 평가하였다. 총 RNA를 분리하고 RT-PCR로 IGFBP-5 전사체를 분석하였다. 도 22에서 볼 수 있듯이, IGFBP-5 전사체 양의 감소가 3종의 siRNA에서 관찰되었다.
실시예 24
C42 세포(LNCaP 전립선암 세포)를 BS-1, BS-2 및 BS-3로 처리하고 성장억제를 크리스탈 바이올렛 분석으로 평가하였다. 결과는 도 23에 나타나 있다.
실시예 25
A549 폐암 세포를 BS-1, BS-2 및 BS-3로 처리하고 성장억제를 크리스탈 바이올렛 분석으로 평가하였다. 결과는 도 24에 나타나 있다.
<110> The University of British Columbia
<120> RNAi Probes Targeting Cancer-Related Proteins
<150> US60/405,193
<151> 2002-08-21
<150> US60/408,152
<151> 2002-09-03
<150> US60/472,387
<151> 2003-05-20
<160> 68
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 1
ccagagcncg cccnncnact t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 2
gnagaagggc gagcncnggt t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 3
gangcncaac accnccncct t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> n denotes uridine
<400> 4
ggaggaggng nngagcanct t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> n denotes uridine
<400> 5
cnaanncaan aaaacngnct t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n denotes uridine
<400> 6
gacagnnnna nngaannagt t 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 7
naanncaaca aaacngntt 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(8)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n denotes uridine
<400> 8
acagnnnngn nngaannatt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 9
angangaaga cncngcngct t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n denotes uridine
<400> 10
gcagcagagn cnncancant t 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n denotes uridine
<400> 11
ngaangaagg gacnaaccng tt 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> n denotes uridine
<400> 12
caggnnagnc ccnncannca tt 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)
<223> n denotes uridine
<400> 13
cagaaanaga caaagngggg tt 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(17)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n denotes uridine
<400> 14
ccccacnnng ncnannncng tt 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<400> 15
acagagacna agggaccaga tt 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<400> 16
acagagacna agggaccaga tt 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)
<223> n denotes uridine
<400> 17
anggngnngc ncaccgcgtt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<400> 18
cgcggngagc aacaccantt 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n denotes uridine
<400> 19
cccngggcng cgagcnggnc tt 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> n denotes uridine
<400> 20
gaccagcncg cagcccaggg tt 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 21
gaggaaacng aggaccncgg tt 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n denotes uridine
<400> 22
ccgaggnccn cagnnnccnc tt 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)
<223> n denotes uridine
<400> 23
cncgganncn cangcaaggg tt 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for hman IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n denotes uridine
<400> 24
cccnngcnag agannccgag tt 22
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> n denotes uridine
<400> 25
agcccncncc angngcccct t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n denotes uridine
<400> 26
ggggcacang gagagggcnt t 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> n denotes uridine
<400> 27
gaagcngacc cagnccaagt t 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> n denotes uridine
<400> 28
cnnggacngg gncagcnnct t 21
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 29
gcngccaggc anggagnacg tt 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-5
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> n denotes uridine
<400> 30
cgnacnccan gccnggcagc tt 22
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n denotes uridine
<400> 31
angcngccga gagngggcng ctt 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)
<223> n denotes uridine
<400> 32
gcagcccacn cncggcagca ntt 23
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(16)
<223> n denotes uridine
<400> 33
ccccngngnc ccnnnngcat t 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)
<223> n denotes uridine
<400> 34
ngcaaaaggg acacaggggt t 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> n denotes uridine
<400> 35
cngngacaag canggccngt t 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> n denotes uridine
<400> 36
caggccangc nngncacagt t 21
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 37
gcgccgggac gccgagnatt 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<400> 38
nacncggcgn cccggcgctt 20
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for humanIGFBP-2 and -5
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 39
ggagccgggc ngcggcngct t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2 and -5
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 40
gcagccgcag cccggcncct t 21
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2 and -5
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> n denotes uridine
<400> 41
cgngcggcgn cnacacctt 19
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2 and -5
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> n denotes uridine
<400> 42
ggngnagacg ccgcacgtt 19
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2 and -5
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> n denotes uridine
<400> 43
ccaggggcng cgcngctt 18
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human IGFBP-2 and -5
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)
<223> n denotes uridine
<400> 44
gcagcgcagc cccnggtt 18
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human Mitf
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> n denotes uridine
<400> 45
ccgcngaaga gcagcagnnt t 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human Mitf
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> n denotes uridine
<400> 46
aacngcngcn cnncagcggt t 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human Mitf
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> n denotes uridine
<400> 47
angcaggcnc gagcncangt t 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human Mitf
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n denotes uridine
<400> 48
cangagcncg agccngcant t 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human Mitf
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 49
aganacagna ccccncnagt t 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human Mitf
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n denotes uridine
<400> 50
cnagaggggn acngnancnt t 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human b-raf
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> n denotes uridine
<400> 51
ncncnggggn ncggnncngt t 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human b-raf
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> n denotes uridine
<400> 52
cagnnccgnn ccccagagat t 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human b-raf
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)
<223> n denotes uridine
<400> 53
ccngncaana nngangacnt t 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human b-raf
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> n denotes uridine
<400> 54
agncancaan anngacaggt t 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human b-raf
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> n denotes uridine
<400> 55
cccnccnngn nncgggcngt t 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human b-raf
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> n denotes uridine
<400> 56
cagcccgann caaggagggt t 21
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
aaccagagct cgcccttcta ctt 23
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 58
ccagagcncg cccnncnact t 21
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)
<223> n denotes uridine
<400> 59
gnagaagggc gagcncnggt t 21
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 60
aagtcccgca tcgtccgcag ctt 23
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> n denotes uridine
<400> 61
gncccgcanc gnccgcagct t 21
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> n denotes uridine
<400> 62
gcngcggacg angcgggact t 21
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 63
aactaattca ataaaactgt ctt 23
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> n denotes uridine
<400> 64
cnaanncaan aaaacngnct t 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi forhuman clusterin
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> n denotes uridine
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n denotes uridine
<400> 65
gacagnnnna nngaannagt t 21
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 66
gcatgatgaa gactctgctg ctg 23
<210> 67
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<400> 67
augaugaaga cucugcugc 19
<210> 68
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RNAi for human clusterin
<400> 68
gcagcagagu cuucaucau 19
Claims (17)
- 49개 미만의 뉴클레오티드로 구성된 길이를 가지며, 표적 유전자의 전사 생성물인 mRNA의 파괴(degradation)를 매개하거나 또는 그의 번역(translation)을 방해하기 위해 유효한 서열을 가지며, 상기 표적 유전자는 클러스테린을 암호화하는 유전자인 것인 siRNA로서, 상기 siRNA는 서열번호 9 및 10의 서열로 구성된 것인 siRNA.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 따른 siRNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암 또는 알쯔하이머병 치료용 약제학적 조성물.
- 제 10 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사 용액인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 삭제
- 제10항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 골육종, 신장세포 암종, 유방암, 방광암, 폐암 및 흑색종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 주사 용액인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US40519302P | 2002-08-21 | 2002-08-21 | |
| US60/405,193 | 2002-08-21 | ||
| US40815202P | 2002-09-03 | 2002-09-03 | |
| US60/408,152 | 2002-09-03 | ||
| US47238703P | 2003-05-20 | 2003-05-20 | |
| US60/472,387 | 2003-05-20 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020107028249A Division KR101117673B1 (ko) | 2002-08-21 | 2003-08-21 | 암-관련 단백질을 표적으로 하는 알엔에이아이 프로브 |
| KR1020117025408A Division KR101238701B1 (ko) | 2002-08-21 | 2003-08-21 | 암-관련 단백질을 표적으로 하는 알엔에이아이 프로브 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20050042483A KR20050042483A (ko) | 2005-05-09 |
| KR101212512B1 true KR101212512B1 (ko) | 2012-12-26 |
Family
ID=31950539
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020057002963A KR101212512B1 (ko) | 2002-08-21 | 2003-08-21 | 암-관련 단백질을 표적으로 하는 알엔에이아이 프로브 |
| KR1020117025408A KR101238701B1 (ko) | 2002-08-21 | 2003-08-21 | 암-관련 단백질을 표적으로 하는 알엔에이아이 프로브 |
| KR1020107028249A KR101117673B1 (ko) | 2002-08-21 | 2003-08-21 | 암-관련 단백질을 표적으로 하는 알엔에이아이 프로브 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020117025408A KR101238701B1 (ko) | 2002-08-21 | 2003-08-21 | 암-관련 단백질을 표적으로 하는 알엔에이아이 프로브 |
| KR1020107028249A KR101117673B1 (ko) | 2002-08-21 | 2003-08-21 | 암-관련 단백질을 표적으로 하는 알엔에이아이 프로브 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US8252918B2 (ko) |
| EP (2) | EP2263679B1 (ko) |
| JP (4) | JP4717633B2 (ko) |
| KR (3) | KR101212512B1 (ko) |
| AU (1) | AU2003258426B2 (ko) |
| CA (2) | CA2494766C (ko) |
| IL (3) | IL166658A (ko) |
| NO (2) | NO334573B1 (ko) |
| NZ (1) | NZ552872A (ko) |
| WO (1) | WO2004018676A2 (ko) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU227190B1 (en) | 1999-02-26 | 2010-10-28 | Univ British Columbia | Trpm-2 antisense therapy |
| US7569551B2 (en) | 2000-02-25 | 2009-08-04 | The University Of British Columbia | Chemo- and radiation-sensitization of cancer by antisense TRPM-2 oligodeoxynucleotides |
| KR101265180B1 (ko) | 2002-01-17 | 2013-05-29 | 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 | 아이지에프비피-2 및 아이지에프비피-5를 억제하는 양특이성 안티센스 올리고뉴클레오티드, 이를 이용하여 약학적 조성물을 제조하는 방법 및 그 약학적 조성물 |
| EP2263679B1 (en) * | 2002-08-21 | 2014-10-08 | The University Of British Columbia | RNAi targeting cancer-related proteins |
| NZ538288A (en) * | 2002-08-21 | 2008-04-30 | Univ British Columbia | Treatment of melanoma by reduction in clusterin levels |
| WO2004100977A1 (en) | 2003-03-25 | 2004-11-25 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Inhibition of tumor cell proliferation by foxm1b inhibitors |
| US20040220131A1 (en) * | 2003-04-18 | 2004-11-04 | The University Of British Columbia | Method for treatment of cancerous angiogenic disorders |
| JP2005013221A (ja) * | 2003-06-03 | 2005-01-20 | Keio Gijuku | Ｂｒａｆ発現抑制を利用した癌の治療 |
| US20050019918A1 (en) * | 2003-06-03 | 2005-01-27 | Hidetoshi Sumimoto | Treatment of cancer by inhibiting BRAF expression |
| EP1744788A4 (en) * | 2004-03-19 | 2010-08-18 | Penn State Res Found | COMBINATIVE METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING MELANOMA |
| WO2005094899A1 (en) | 2004-04-02 | 2005-10-13 | The University Of British Columbia | Clusterin antisense therapy for treatment of cancer |
| ATE501252T1 (de) * | 2004-06-22 | 2011-03-15 | Univ Illinois | Verfahren zur inhibierung von tumorzellwachstum mit foxm1 sirns |
| AU2005266948A1 (en) * | 2004-07-23 | 2006-02-02 | Pacific Edge Biotechnology Ltd. | Urine markers for detection of bladder cancer |
| WO2006035432A2 (en) * | 2004-09-27 | 2006-04-06 | Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. | Gene silencing for use in dermatology |
| EP1814595B1 (en) * | 2004-11-23 | 2014-01-08 | The University Of British Columbia | Treatment of cancer with a combination of an agent that perturbs the egf signaling pathway and an oligonucleotide that reduces clusterin levels |
| AU2006291990B2 (en) * | 2005-09-13 | 2012-05-31 | National Research Council Of Canada | Methods and compositions for modulating tumor cell activity |
| US8029980B2 (en) | 2006-09-29 | 2011-10-04 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Identification and use of agents that modulate oncogenic transcription agent activity |
| EP2117557A4 (en) * | 2007-01-16 | 2011-01-19 | Burnham Inst Medical Research | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF COLORECTAL CANCER |
| WO2008094516A2 (en) | 2007-01-29 | 2008-08-07 | City Of Hope | Multi-targeting short interfering rnas |
| US20100112687A1 (en) * | 2007-03-02 | 2010-05-06 | Mdrna, Inc. | Nucleic acid compounds for inhibiting erbb family gene expression and uses thereof |
| US8217161B2 (en) * | 2008-04-22 | 2012-07-10 | Clemson University Research Foundation | Methods of inhibiting multiple cytochrome P450 genes with siRNA |
| RU2627163C2 (ru) | 2009-11-24 | 2017-08-03 | Алетиа Байотерапьютикс Инк. | Антикластериновые антитела и антигенсвязывающие фрагменты и их использование для уменьшения объема новообразований |
| JP6178241B2 (ja) | 2011-02-11 | 2017-08-09 | ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ | 血管新生障害の処置 |
| WO2013123588A1 (en) | 2012-02-22 | 2013-08-29 | Alethia Biotherapeutics Inc. | Co-use of a clusterin inhibitor with an egfr inhibitor to treat cancer |
| CA2844640A1 (en) | 2013-12-06 | 2015-06-06 | The University Of British Columbia | Method for treatment of castration-resistant prostate cancer |
| CN106282185B (zh) * | 2016-08-18 | 2020-06-26 | 广州市锐博生物科技有限公司 | 一种用于抑制簇集蛋白基因表达的成套siRNA及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS631831B2 (ko) * | 1980-08-13 | 1988-01-14 | Hitachi Ltd | |
| WO2002022635A1 (en) * | 2000-09-11 | 2002-03-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of clusterin expression |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992015680A1 (en) | 1991-03-06 | 1992-09-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression |
| AUPM672594A0 (en) * | 1994-07-08 | 1994-08-04 | Royal Children's Hospital Research Foundation | A method for the prophylaxis and/or treatment of proliferative and/or inflammatory skin disorders |
| US20020086386A1 (en) * | 1997-03-04 | 2002-07-04 | Kamb Carl Alexander | B-catenin assays, and compositions therefrom |
| HU227190B1 (en) | 1999-02-26 | 2010-10-28 | Univ British Columbia | Trpm-2 antisense therapy |
| WO2000069454A1 (en) | 1999-05-17 | 2000-11-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Suppression of endogenous igfbp-2 to inhibit cancer |
| KR100856475B1 (ko) | 1999-07-19 | 2008-09-08 | 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 | 호르몬으로 조절되는 종양에 적합한 안티센스 치료법 |
| US6140126A (en) * | 1999-10-26 | 2000-10-31 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of Y-box binding protein 1 expression |
| GB9927444D0 (en) * | 1999-11-19 | 2000-01-19 | Cancer Res Campaign Tech | Inhibiting gene expression |
| US20070026394A1 (en) * | 2000-02-11 | 2007-02-01 | Lawrence Blatt | Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies |
| US7569551B2 (en) | 2000-02-25 | 2009-08-04 | The University Of British Columbia | Chemo- and radiation-sensitization of cancer by antisense TRPM-2 oligodeoxynucleotides |
| CA2403397A1 (en) * | 2000-03-16 | 2001-09-20 | Genetica, Inc. | Methods and compositions for rna interference |
| PT2796553T (pt) * | 2000-03-30 | 2019-09-27 | Massachusetts Inst Technology | Mediadores de interferência de arn específicos de sequência de arn |
| EP1317470B1 (en) | 2000-09-14 | 2011-04-27 | The University Of British Columbia | Antisense insulin-like growth factor binding protein (igfbp)-2-oligodeoxynucleotides for prostate tumor therapy |
| WO2002044321A2 (en) * | 2000-12-01 | 2002-06-06 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Rna interference mediating small rna molecules |
| US20020160393A1 (en) | 2000-12-28 | 2002-10-31 | Symonds Geoffrey P. | Double-stranded RNA-mediated gene suppression |
| KR101265180B1 (ko) | 2002-01-17 | 2013-05-29 | 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 | 아이지에프비피-2 및 아이지에프비피-5를 억제하는 양특이성 안티센스 올리고뉴클레오티드, 이를 이용하여 약학적 조성물을 제조하는 방법 및 그 약학적 조성물 |
| NZ538288A (en) | 2002-08-21 | 2008-04-30 | Univ British Columbia | Treatment of melanoma by reduction in clusterin levels |
| EP2263679B1 (en) * | 2002-08-21 | 2014-10-08 | The University Of British Columbia | RNAi targeting cancer-related proteins |
| PT2284266E (pt) * | 2002-11-14 | 2013-12-17 | Thermo Fisher Scient Biosciences Inc | Siarn contra tp53 |
| US7250496B2 (en) * | 2002-11-14 | 2007-07-31 | Rosetta Genomics Ltd. | Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof |
-
2003
- 2003-08-21 EP EP10010458.7A patent/EP2263679B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-08-21 KR KR1020057002963A patent/KR101212512B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-08-21 AU AU2003258426A patent/AU2003258426B2/en not_active Ceased
- 2003-08-21 KR KR1020117025408A patent/KR101238701B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-08-21 NZ NZ552872A patent/NZ552872A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-08-21 CA CA2494766A patent/CA2494766C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-21 KR KR1020107028249A patent/KR101117673B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-08-21 US US10/646,436 patent/US8252918B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-21 CA CA2882443A patent/CA2882443C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-08-21 EP EP03792075A patent/EP1532249A2/en not_active Ceased
- 2003-08-21 WO PCT/CA2003/001277 patent/WO2004018676A2/en active Application Filing
- 2003-08-21 JP JP2005501198A patent/JP4717633B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-02-02 IL IL166658A patent/IL166658A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-03-17 NO NO20051423A patent/NO334573B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-02-23 US US11/276,300 patent/US7964717B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-05-06 US US12/116,083 patent/US7820635B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-02-22 IL IL197159A patent/IL197159A/en not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-06-04 JP JP2010128382A patent/JP5171887B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-07-28 US US12/845,521 patent/US8759308B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-11-09 JP JP2010250838A patent/JP5662766B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-02-24 US US13/404,741 patent/US9487777B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-09-14 NO NO20121038A patent/NO337130B1/no not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-03-28 JP JP2013067754A patent/JP2013150624A/ja active Pending
-
2014
- 2014-06-24 IL IL233352A patent/IL233352A0/en unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS631831B2 (ko) * | 1980-08-13 | 1988-01-14 | Hitachi Ltd | |
| WO2002022635A1 (en) * | 2000-09-11 | 2002-03-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of clusterin expression |
| US6383808B1 (en) * | 2000-09-11 | 2002-05-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of clusterin expression |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 2001 * |
| DAVID A. SALLMA 등. Clusterin mediates TRAIL resistance in prostate tumor cells. Mol Cancer Ther. 2007, Vol. 6, No. 11, 페이지 2938-2947 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101212512B1 (ko) | 암-관련 단백질을 표적으로 하는 알엔에이아이 프로브 | |
| EP1490490B1 (en) | Antisense iap nucleobase oligomers and uses thereof | |
| AU2007216630B2 (en) | RNAi probes targeting cancer-related proteins | |
| NZ538287A (en) | RNAi probes targeting cancer-related proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| A107 | Divisional application of patent | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| A107 | Divisional application of patent | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| B701 | Decision to grant | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151124 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20161125 Year of fee payment: 5 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |