KR100856475B1

KR100856475B1 - 호르몬으로 조절되는 종양에 적합한 안티센스 치료법

Info

Publication number: KR100856475B1
Application number: KR1020077003731A
Authority: KR
Inventors: 마틴 글리브; 히데아키 미야케
Original assignee: 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아
Priority date: 1999-07-19
Filing date: 2000-07-19
Publication date: 2008-09-08
Anticipated expiration: 2020-07-19
Also published as: NO20020259D0; DE60038680D1; WO2001005435A2; JP5121106B2; AU772480B2; HU228465B1; NZ516701A; EP1200579A2; WO2001005435A3; CA2375467C; DE60038680T2; US7297684B1; AU6144500A; NO332388B1; HUP0201868A2; IL146565A0; ATE393220T1; EP1200579B1; KR20070036180A; KR100779752B1

Abstract

IGFBP-5를 코딩하는 유전자 영역에 상보적인 안티센스 ODN을 투여하는 것에 의해 인간을 포함한 포유동물에서 호르몬으로 조절되는 종양들(예를 들면, 유방암 및 전립선 암)을 치료하는 방법이 제공된다. 시험관내 및 생체내에서 쉬오노지(Shionogi) 종양 모델을 사용했을때 이같은 ODN의 투여가 종양세포들의 증식을 감소시키고, 또한 안드로겐 독립성으로의 진행을 지연시키는것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따라, 인간을 포함한 포유동물의 전립선 암의 치료 및 전립선 암의 안드로겐 독립성 암으로의 진행의 지연이 IGFBP-5를 코딩하는 핵산서열의 영역에 상보적이고, 그와같은 서열과 하이브리드하는 안티센스 올리고디옥시뉴클레오티드를 IGFBP-5의 발현을 억제하기 위해 치료학적으로 유효한 양으로 포유동물에 투여하는 것에 의해 달성된다. 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 특이적 안티센스 ODN들은 쥐의 유전자 서열에서 유래한 GACCACGCTGATCACCAT (서열번호 1)과 인간 유전자 서열에서 유래한 CGCGGTGAGCAACACCAT (서열번호 3) 및 AGGTCATGCAGCAGCCGC (서열번호 4)이다.

전립선암, 유방암, 안티센스 올리고디옥시뉴클레오티드, IGFBP-5

Description

호르몬으로 조절되는 종양에 적합한 안티센스 치료법{Antisense theraphy for hormone-regulated tumors}

도 1은 수술로 안드로겐을 중지시킨 후에 종양 세포의 재성장을 감소하는데 안티센스 IGFBP-5 ODN의 영향을 나타낸다.

도 2는 생체내에서 안티센스 IGFBP-5 ODN으로 처리한 후에, IGFBP-5 mRNA의 감소를 나타낸다.

도 3은 시험관내에서 안티센스 IGFBP-5 ODN으로 처리한 후에, IGFBP-5 mRNA의 감소의 투여량-의존성을 나타낸다.

도 4는 시간의 변화에 따른 안티센스 IGFBP-5 ODN으로 처리한 후에 존재하는 세포의 수를 나타낸다.

도 5는 농도의 변화에 따른 안티센스 IGFBP-5 ODN으로 처리한 후에 존재하는 세포의 수를 나타낸다.

도 6은 안티센스 IGFBP-5 ODN으로 처리한 시료에서 죽은 세포들의 비율을 나타낸다.

도 7은 IGF-1과 항-IGF-1 항체의 관계에서 안티센스 IGFBP-5 ODN의 효과를 나타낸다.

도 8은 안티센스 IGFBP-5 ODN으로 처리된 세포들의 플로사이토메트리(flow cytometry) 결과를 나타낸다.

도 9는 10개의 안티센스 ODN들의 위치가 표시된 인간 IGBFP-5의 뉴클레오티드 서열의 개략 대표도를 나타낸다.

도 10은 IGBFP-5 mRNA 수준에의 도 9에 표시된 10개의 안티센스 ODN들 각각의 영향을 나타낸다.

본 발명은 인슐린형 성장인자 결합 단백질(IGFBP)-5에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 호르몬으로 조절되는 종양(예를 들면, 유방암 및 전립선암)을 치료하는 방법에 관한 것이다.

전립선암은 남성에 감염되는 가장 흔한 암으로, 서양에서 남성의 암사망의 원인중 두 번째이다. 전립선암은 안드로겐 민감성 암이기 때문에, 예를 들면, 거세(castration)에 의한 안드로겐 중지가 전립선암이 진행된 환자의 임의의 치료섭생으로 이용된다.

안드로겐 중지는 전립선암에서 심한 아폽톱시스(apoptosis)를 일으키므로, 질환이 퇴행된다. 그러나, 거세에 의해 유도된 아폽톱시스는 완전하지 않으며, 결국 생존한 암세포들의 안드로겐-독립성(androgen-independence) 세포로의 진행이 발생한다. 이 진행은 생존과 삶의 질의 향상에 주요한 장애물이고, 따라서, 안드로겐에 독립적인 세포들을 표적화하는 많은 시도들이 이루어지고 있다. 이같은 시도들은 안드로겐에 독립적인 종양세포들을 표적화한 비-호르몬 치료에 초점이 맞추어져 있었지만, 지금까지 비호르몬제제로 향상된 생존성을 갖는 것은 없었다(Oh et al., J. Urol 160: 1220-1229 (1998)). 따라서, 다른 접근들이 필요하게 되었다.

인슐린형 성장인자(IGF)-I 및 IGF-Ⅱ은 많은 정상 및 악성 세포들에서 강력한 유사분열물질(mitogen)이다. IGF들이 전립선 질환 및 유방암의 병리생리학(pathophysiology)에서 중요한 역할을 한다는 것을 축적된 증거들이 제안하였다(Boudon et al., J. Clin . Endocrin . Metab . 81: 612-617 (1996); Angelloz-Nicoud et al., Endocrinology 136: 5485-5492 (1995); Nickerson et al., Endocrinology 139: 807-810 (1998); Figueroa et al., J. Urol . 159: 1379-1383 (1998)).

IGF의 생물학적 반응은 IGFBP들을 포함한 다양한 인자에 의해 조절된다. 지금까지, 높은 친화성 상호작용을 통해 IGF들의 생물학적 작용의 조절에 관여할 것으로 믿어지는 6개의 IGFBP들이 확인되었다(Rajaram et al., Endocrin . Rev . 18: 801-813 (1997)). 그러나, 어떤 증거는 IGF들에 독립적인 IGFBP들의 생물학적 활성을 보고하였고(상술한 바와 같음, Andress et al., J. Biol . Chem . 267: 22467-22472 (1992); Oh et al., J. Biol . Chem . 268: 14964-14971 (1993)), 세포증식에서 IGFBP들의 자극 및 억제효과가 다양한 실험실 조건하에서 보고되었다(상기 Andress et al.; Elgin et al., Proc . Nat'l . Acad . Sci . ( USA ), 84, 3254-3258 (1987); Huynh et al., J. Biol . Chem . 271: 1016-1021 (1996); Damon et al., Endocrinology 139: 3456-3464 (1998)). 따라서, IGFBP들의 정확한 작용 역할은 논 쟁의 여지가 있다.

이 때문에 보고된 결과들이 전립선 및 유방암에서의 IGF와 관련이 있는데도 이러한 관련성에 기초한 치료학적 접근은 분명하게 보고되지 않았다.

본 발명은 전립선 및 유방암의 치료법으로서 IGFBP-5를 표적화한 안티센스 올리고디옥시뉴클레오티드(oligodeoxynucleotide; ODN)들을 이용한다. 안티센스 ODN들은 표적유전자의 mRNA영역에 상보적인 단일가닥 DNA의 화학적으로 변형된 스트레치들이어서 RNA/DNA 이중가닥을 형성하여 유전자의 발현을 효과적으로 억제한다(Figueroa, et al., J. Urol ., 159: 1379-1383 (1998)).

포스포로티오에이트(Phosphorothioate) ODN들은 DNA의 결합하지 않는 포스포릴 산소중 하나를 황으로 치환하는 것에 의해 뉴클레아제 소화를 막는데 안정하다. 최근에, 특히 신생형성(neoplastic) 진행에 관여하는 유전자를 표적화한 몇 가지 안티센스 ODN들이 생체내 및 시험관내에서 평가되었고, 가능성 있는 치료제로서 안티센스 전략(strategy)의 효율성이 증명되었다(Monia, et al. Nature Med. 2: 668 675 (1996.); Cucco, et al., Cancer Res. 56 : 4332-4337 (1996); Ziegler, et al., J. Natl. Cancer Inst. 89 : 1027-1036 (1997); Jansen, et al., Nature Med. 4 : 232-234 (1998)).

발명의 요약

본 발명은 IGFBP-5을 코딩하는 유전자의 영역에 상보적인 안티센스 ODN을 투여하는 것에 의해 인간을 포함한 포유동물에서 호르몬으로 조절되는 암(예를 들면, 유방암 및 전립선암)을 치료하는 방법을 제공한다. 시험관내 및 생체내에서 쉬오노지(Shionogi) 종양 모델을 사용했을때, 이같은 ODN의 투여가 종양세포들의 증식을 감소시키고, 또한 안드로겐 독립성으로의 진행을 지연시키는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따라, IGFBP-5를 코딩하는 핵산서열의 영역에 상보적이고, 그와같은 서열과 하이브리드(hybrid)하는 안티센스 올리고디옥시뉴클레오티드를 IGFBP-5의 발현을 억제하기 위해 치료학적으로 유효한 양으로 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 포함한 포유동물의 전립선 암의 치료법 및 전립선 암의 안드로겐 독립성 암으로의 진행을 지연시키는 방법이 제공된다.

본 발명의 방법에 사용하기 적합한 특이적 안티센스 ODN들은 쥐의 유전자 서열에서 유래한 GACCACGCTGATCACCAT (서열번호 1)과 인간 유전자 서열에서 유래한 CGCGGTGAGCAACACCAT (서열번호 3) 및 AGGTCATGCAGCAGCCGC (서열번호 4)이다.

본 발명은 호르몬으로 조절되는(전립선 또는 유방) 종양 세포들의 호르몬(예를 들면, 안드론겐 또는 에스트로겐) 독립성 세포들로의 진행을 지연시키는 방법, 유방암 또는 전립선암과 같은 호르몬으로 조절되는 암들로 고통을 받는 인간을 포함한 개체(individual)들의 치료를 위한 치료방법 및 이 같은 방법에 사용하기에 효과적인 치료제를 제공한다. 또한, 본 발명의 조성물은 전립선, 유방 및 뼈에서의 다른 IGF-1 민감성 종양의 성장 및 전이성 진행을 억제하거나 또는 지연시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 치료방법은 유방암 또는 전립선암이 진행된 개체의 치료에 가장 일반적으로 사용될 것이다.

본 발명의 첫 번째 실시예에 따르면, 안드로겐-민감성 전립선 암 세포들의 안드로겐 독립성 세포로의 진행은 세포들에 의해 IGFBP-5의 발현을 억제하는 것에 의해 지연될 수 있다. 실험은 쉬오노지 종양 모델로 실험관내 및 생체내에서 수행되었다. 쉬오노지 종양 모델은 수컷 유성생식 숙주에서 피하로 성장하는 안드로겐에 의존적인 마우스 유방암(androgen-dependent mouse mammary carcinmoa )의 이종이식(xenograft)이다.

쉬오노지 종양 모델은 암 유발가능성(tumorigenic)이 높고, 지역적으로 침입한다. 세포들은 전립선 암 세포에서 관찰된 행동과 유사한 방식으로 안드로겐 중지에 반응하는 것으로 나타났고, 인간에서 전립선암을 위한 유효한 모델로서 인정되었다(Bruchovsky et al., Cancer Res . 50: 2275-2282 (1990); Rennie et al., Cancer res. 48: 6309-6312 (1988); Bruchovsky et al., Cell 13: 272-280 (1978); Gleave et al., in Genitourinary Oncology , pp. 367-378, Lange et al. eds., Lippencott (1997); Gleave et al., J. Urol . 157: 1727-1730 (1997); Bruchovsky et al., The Prostate 6: 13-21 (1996)).

따라서, 안드로겐 중지는 매우 높은 재현성 있는 방법으로 아폽톱시스 및 암의 퇴행에 관여한다. 또한, 거세후 및 안드로겐 독립성으로의 진행동안에 인간 전립선암에서 TRPM-2 및 Bcl-2과 같은 펩티드들의 발현에서의 변화들이 쉬오노지 종양 세포들에서 관찰된 것과 유사하다. 이 유사성들 때문에, 쉬오노지 종양 모델은 인간 전립선암과 흡사하고, 안드로겐 독립성의 개시를 지연시키는 화합물의 능력을 평가하는데 매우 유용한 모델을 제공한다. 거세후 완전한 암의 퇴행에도 불구하고, 빠르게 성장하는 안드로겐 독립성 쉬오노지 종양은 한 달후에 변함없이 다시 되살아나 안드로겐 독립성으로의 진행을 지연시킬 수 있는 약물을 평가하기 위한 신뢰성있는 종점을 제공한다.

본 발명에서 시작한 연구에서, 우리는 거세후 및 AI 진행동안 쉬오노지 종양 모델에서 IGFBP들의 발현의 변화들의 특성을 처음으로 밝혔다. 노턴 블럿 분석이 거세전 AD 원래 종양, 거세 4일 및 7일 후의 퇴행한 종양 및 거세 28일 후의 AI 재발 종양에서 IGFBP들의 mRNA 발현의 변화를 확인하는데 사용되었다. IGFBP-2,-3,-4 및 -5 mRNA 발현 변화의 다양한 패턴이 관찰되었다.

쉬오노지 종양 모델에서 IGFBP-1 및 IGFBP-6 mRNA들은 검출되지 않았다. 쉬오노지 종양 모델에서 발현된 IGFBP들 중에 가장 효과적인 발현변화는 IGFBP-5에서 관찰되었다. AD 원래 암세포에서는 검출될 수 없는 수준임에도 불구하고, IGFBP-5 발현은 거세후 높게 상향조절되었고, AI 암세포에 높게 발현되었다. AI 진행 동안 쉬오노지 종양 모델에서 IGFBP-5 상향조절의 패턴은 랫트 전립선(상기 Angelloz-Nicoud 문헌) 및 인간 전립선암(상기 Figueroa 문헌)의 패턴과 유사하고, 따라서, 안드로겐- 독립성으로의 진행에서 보조제 안티센스 IGFBP-5 치료법의 효과를 평가하는데 이 모델의 사용이 뒷받침된다.

이 상향조절의 기능적 의미를 연구하기 위하여, 우리는 쉬오노지 모델을 사용하여 생체내 및 시험관내에서의 IGF-1 매개된 세포성장에서 안티센스 IGFBP-5 ODN의 효과를 검사하였다. 이 검사들은 쥐의 IGFBP-5 유전자부위에 작용하는 안티센스 ODN을 사용하여 수행하였다. 이 실험은 마우스 IGFBP-5 번역개시부위에 대응 하는 포스포로티오에이트 안티센스 IGFBP-5 ODN이 투여량에 의존하는 방식으로 IGFBP-5 mRNA의 발현을 억제한다는 것을 보여주었다. 서열 특이성은 쉬오노지 종양 모델에서 IGFBP-5 mRNA 발현에 영향을 미치지 않는 2-염기 IGFBP-5 불합치 ODN을 사용하여 확인하였다. 또한, 우리는 안티센스 IGFBP-5 ODN이 표적 특이적 방법으로 IGFBP-5 발현을 감소시킨다는 것을 확인하였다; 즉, IGFBP-2,-3 및 -4를 포함한 다른 mRNA들의 발현은 안티센스 IGFBP-5 ODN 처리에 의해 영향을 받지 않는다.

안티센스 IGFBP-5 ODN은 세포증식을 억제하고, 시간 및 투여량에 의존하는 방식으로 쉬오노지 종양 모델에서 세포 사이클 억제를 유도한다. 안티센스 IGFBP-5 ODN 처리는 생체내 또는 시험관내에서 아폽톱시스를 유도하는 것으로 보이지 않으며, 안티센스 IGFBP-5 ODN 활성이 아폽톱시스의 유도라기 보다는 세포의 증식억제에 의해 발생된다는 것을 제안하였다. 더우기, 안티센스 IGFBP-5 ODN의 성장억제효과는 외인성 IGF-1에 의해 역전될 수 있다는 것과 IGF-1 활성이 항-IGF-1 항체들에 의해 상쇄되었을 때, 안티센스 IGFBP-5 ODN 처리는 세포증식의 부가적인 억제를 유발하지 않는다는 것이 관찰되었다. 또한, 안티센스 IGFBP-5 ODN이 MAPK 활성을 억제한다는 것과, 이 억제가 또한 외인성 IGF-1에 의해 역전될 수 있다는 것 및 IGF-1이 항-IGF-1 항체들에 의해 상쇄될 때 안티센스 IGFBP-5 ODN이 MAPK 활성에 독립적인 억제 효과를 갖지 않는 다는 것이 발견되었다. 정리하면, 이같은 발견들은 안티센스 IGFBP-5이 적어도 한부분에서 MAPK의 불활성을 포함한 IGF-I에 의존적인 메카니즘을 통해 세포증식을 억제하였다는 것을 증명한다.

이 시험관내에서의 데이터에 기초하여, 우리는 안티센스 전략을 사용한 안드 로겐에 의해 촉진되는 표적 IGFBP-5 상향조절이 안드로겐 독립성으로의 진행을 억제한다는 것을 가정하였다. 생체내 실험에서, 거세후 안티센스 IGFBP-5 ODN의 투여는 AI 진행으로의 시간을 지연시켰고, AI 재발성 종양의 성장을 억제하였다. 시험관내 처리와 일치되게, 쉬오노지 종양을 지닌 마우스들의 안티센스 IGFBP-5 ODN으로의 생체내 처리에서 IGFBP-5 mRNA 발현이 또한 억제되었다. 이 발견들은 생체내에서 ODN의 전신투여가 종양세포들에서 표적유전자의 서열특이적 하향 조절을 초래할 수 있다는 것을 설명한다.

안드로겐 중지후, 정상 및 악성 전립선 조직에서 인슐린형 성장인자(insulin-like growth factor; IGF) 결합 단백질-5(binding protein-5; IGFBP-5)가 매우 높게 상향 조절될지라도, 거세로 유도된 아폽톱시스 및 안드로겐 독립적인 세포로의 진행에서 그것의 기능적인 역할이 명확하지 않다. IGF-I으로 매개된 유사분열생식(mitogenesis) 및 안드로겐 독립성으로의 진행에서 IGFBP-5 과발현의 기능적 의미를 분석하기 위하여, IGFBP-5를 과발현하는 인간 안드로겐 의존적인 LNCaP 전립선 암세포를 안정한 형질감염에 의해 생산하였다.

IGFBP-5가 형질감염된 LNCaP의 성장률은 디하이드로테스토스테론의 존재 및 부존재시에 모두 모세포 또는 벡터만 형질감염된 LNCaP 세포들과 비교하여 유의적으로 빠르다. LNCaP 세포 증식에서 IGFBP-5로 유도된 증가는 사이클린 D1 mRNA 발현 및 세포 주기의 S + G2/M 상에서의 세포들의 분획에 대응하는 증가로 IGF-I 의존적 및 독립적인 경로 모두를 통하여 발생한다. Akt/단백질 키나제 B (PKB), 포스파티딜이노시톨 3'-키나제(PI3K) 경로의 하류성분, LNCaP 서브라인에서 변화들은 그들의 성장율에 평행하게 변화한다. PI3K 억제제로의 처리가 대조구 및 IGFBP-5-과발현 LNCaP 세포들에서 아폽톱시스를 유도할지라도, 이 PI3K 억제제로 유도된 아폽톱시스는 IGFBP-5 과발현이 IGF-1의 항아폽톱시스성 효과를 발휘할 수 있다는 것이 알려진 IGFBP-5 형질감염체에서 단지 외인성 IGF-1의 처리에 의해 방지될 수 있다. 또한, 종양의 성장 및 혈청 PSA 수준은 거세전 손상되지 않은 마우스들에서 성장될 때는 대조구와 종양 발생률 및 종양 성장율이 유사함에도 불구하고, 거세후에는 IGFBP-5로 형질감염된 LNCaP 종양을 지닌 마우스들에서 몇 배이상 빠르게 증가되었다. 정리하면, 이 데이터들은 거세후 전립선암 세포들에서 IGFBP-5 과발현이 IGF-1의 항아폽톱시성 및 유사분열적 효과를 발휘하도록 도와주는 적응성이 있는 세포 생존 메카니즘으로, 이것에 의해 PI3K-Akt/PKB 시그널 경로의 활성을 통하여 안드론겐 독립성으로의 진행이 가속화된다는 것을 제시한다.

AI 진행을 지연시키기 위한 합리적인 전략은 분자 메카니즘에 기초하여야 하고, 확립된 호르몬 난치병을 갖는 환자의 치료를 위한 종래의 접근법보다 안드로겐 중지로 촉진된 유전자 발현에서 순응 변화를 표적화하는 것이다.

진행의 생물학적 메카니즘 및 유전자 발현에서 거세로 유도된 변화들에 기초한 병행치료법들의 통합 및 적합한 타이밍은 주요 방법에서 AI 진행을 억제하기 위한 수단을 제공할 수 있다. 현재 연구는 AI 진행에서 IGFBP-5의 기능적 역할을 뒷받침하기 위한, 그리고, 안티센스 IGFBP-5 ODN을 사용한 IGFBP-5 유전자 발현의 감소가 AI 암의 재발 및 성장을 지연시킨다는 직접적인 증거를 제공한다.

본 발명의 치료방법은 개별적으로 사용될 수 있다. 그러나, 안티센스 ODN들 은 안드론겐 금지가 되는 다른 치료법과 병행하여 이용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 전립선 암으로 고통을 받은 인간 개체들을 포함한 개체들의 치료법은 개체에서 전립선 암세포들의 아폽톱시스 세포사멸을 유도하기 위해 안드로겐 중지를 개시하고, 암세포들에 의해 IGBFP-5의 발현을 억제하기에 유효한 조성물을 투여하는 것에 의해 개체에서 전립선암의 안드로겐에 독립적인 상태로의 진행이 지연되는 것에 의해 달성된다. 뼈에서 IGFBP-5의 발현의 관점에서, IGF-1 및 IGFBP-5로 매개된 종양 세포 성장은 또한 뼈에서 IGF-1 민감성 전이성 암세포들의 성장을 촉진하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 이 성장은 본 발명의 안티센스 IGBFP-5 ODN의 사용에 의해 억제될 수 있고, 따라서, 전이성 질환의 진행이 억제 또는 지연된다.

안드로겐 중지의 개시는 전립선 암의 치료를 위해 현재 알려진 외과적 거세(양쪽 고환의 제거) 또는 내과적 거세(약물-유도 테스토스테론의 억제)에 의해 달성될 수 있다. 내과적 거세는 LHRH 약물 및 항안드로겐을 포함한 다양한 섭생으로 달성될 수 있다(Gleave et al. CAMJ 160: 225-232 (1999)). 가역적인 안드로겐 중지를 만드는 주기적인 치료법은 Gleave et al. Eur . Urol . 34, Supp 3: 37-41 91998에 기재되어 있다. 유방암의 경우에 호르몬 중지는 타목시펜(tamixifen)과 같은 항-에스트로겐을 사용한 약물치료를 통해 달성될 수 있다.

IGFBP-5 발현 억제는 일시적일 수 있고, 안드로겐 중지 후에 발생되어야 한다. 인간에 있어서, 이것은 발현억제가 안드로겐 중지의 수 주이내에 시작하여 3 내지 6달 동안 계속되어야 효과적이라는 것을 의미한다. 이것을 달성하기 위하여 다수의 투여량이 필요할 수 있다. 그러나, 시간 주기는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 거세전에 시작하여 이후의 상당한 시간동안 계속하는 것으로 더 연장될 수 있다고 인식될 것이다.

상기에서 설명한 실험들 및 하기 실시예들에서 사용된 ODN(서열번호 1)은 번역 개시부위와 겹치는 쥐의 IGFBP-5 유전자 부분에 상보적이다. 또한, 번역 개시부위에 겹치는 ODN종들 보다 다소 길거나 짧은 것(예를 들면 15~30nt 범위에서) 및 번역 말단 부위와 겹치는 ODN종들을 포함하여 다른 ODN 종들이 사용될 수 있다. 중간 생성물 ODN들이 또한 효과적일 수 있고, 실시예들에 기재된 발현 분석법을 사용하여 충분한 수준의 IGFBP-5 억제를 제공하기 위한 그들의 능력이 스크리닝(screening)될 수 있다. 사용되기 위한 안티센스 ODN의 선정에 있어서, 다른 IGFBP들과는 실질적인 상보성을 갖지 않는 것이 바람직하다. 이는 다른 단백질들의 발현억제가 원하지 않는 부작용을 유발할 수 있기 때문이다. 이같은 ODN을 유도할 수 있는 마우스 IGFBP-5의 핵산 서열은 서열번호 13에 나타내었다.

인간을 포함한 다른 포유동물에 본 발명을 적용하기 위하여, 치료의 안티센스 ODN들이 표적종의 IGFBP-5 유전자에서 대응하는 위치로부터 유래된다. 예를 들면, 인간의 경우, IGFBP-5 유전자 서열은 Kiefer 등(Biochem. Biophys Res. Commun. 176: 219 (1991) Accession No. M65062 for human) 및 James 등( J. Biol. Chem. 258: 22305 (1993), Accession No. L 12447 for mouse)으로부터 알려졌다. 도 10은 서열번호 3의 서열을 포함하여 인간에서의 IGFBP-5의 발현을 억제하기 위한 능력이 시험된 몇 가지 안티센스 ODN들의 위치를 나타낸다. 이 ODN은 인간 IGFBP-5의 번역 개시 부위와 겹친다. 마우스 모델의 경우에서처럼, 번역개시부위와 겹쳐지거나 근방에 위치한(예를 들면 서열번호 4) ODN종보다 다소 길거나 짧은(예를 들면, 15~30nt 범위) ODN종들 및 번역말단 부위와 겹치는 ODN종들(예를 들면 서열번호 10)을 포함한 다른 인간 치료의 안티센스 ODN들이 사용될 수 있다. 중간생성물 ODN들이 또한 효과적일 수 있고, 실시예들에 기재된 발현 분석법을 사용하여 충분한 수준의 IGFBP-5 억제를 제공하기 위해 그들의 능력이 스크리닝될 수 있다. 사용하기 위한 안티센스 ODN의 선정에 있어서, 다른 IGFBP들과 실질적인 상보성을 갖지 않는 것이 바람직하다. 이는 이들 다른 단백질들의 발현억제가 원하지 않는 부작용을 유발할 수 있기 때문이다. 다른 안티센스 ODN이 유도될 수 있는 인간 IGFBP-5의 완전한 서열을 서열 번호 14에 나타내었다. 서열번호 15~66은 인간 IGFBP-5의 서열로부터 유래된 부가적인 안티센스 ODN의 서열들을 나타낸다.

사용된 ODN들은 생체내에서 ODN의 안정성을 증가시키기 위하여 변형될 수 있다. 예를 들면, ODN들은 뉴클레아제 절단에 증가된 저항성을 갖는 포스포로티오에이트 유도체(결합하지 않는 포스포릴 산소원자를 황원자로 대체)로서 사용될 수 있다. 또한, 증가된 ODN 안정성은 2-메톡시에틸 치환된 골격을 갖는 분자들을 사용하여 달성될 수 있다.

안티센스 ODN들의 투여는 단독(naked) 투여 및 약리학적으로 허용가능한 담체에서의 투여를 포함한 공지의 다양한 메커니즘을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 전달을 위한 액체 담체로는 참고문헌으로 통합되어 있는 USP 5,855,911호 및 USP 5,417,978호에 개시되어 있다. 일반적으로, 안티센스는 정맥, 복막내(intraperitoneal), 피하 또는 경구의 경로로 투여될 수 있다.

투여된 안티센스 ODN의 양은 유방암 또는 전립선 세포에서 IGFBP-5의 발현을 억제하기에 유효한 양이다. 이 양은 사용된 안티센스 ODN의 효율성 및 사용된 임의의 담체 특성에 따라 변할 것이라는 것이 인식되야 할 것이다. 어떤 주어진 조성물의 적당한 양의 결정은 적당한 치료학적 수준을 지원하기 위해 설계된 표준 시험들을 통하여 당업계의 범위안에 있다.

본 발명에 따라 전립선 또는 유방암을 치료하기 위한 방법은 화학치료제 및/또는 다른 표적에 관련된 부가적인 안티센스 ODN들을 더 포함할 수 있다. 예들 들면, 탁솔(팩리탁셀(paclitaxel) 또는 도씨탁셀(docitaxel)) 및 미토크산트론(mitoxanthrone)과 같은 공지의 화학치료제가 사용될 수 있다. 유사하게, 안티센스 Bcl-2 ODN 또는 TRPM-2 ODN과 같은 다른 안티센스 종과 안티센스 IGFBP-5의 조합이 사용될 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예를 참고로 더 상세히 설명될 것이지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

쉬오노지 종양 모델 실험은 조직이식가능한 SC-115 AD 마우스 유방암의 토론토 서브라인으로부터의 세포들을 사용하여 수행하였고, 5% 열에 비활성인 우태아 혈청이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)에서 보존하였다. 생체내 연구를 위하여, 대략 5X10⁶세포의 쉬오노지 암을 성숙한 수컷 DD/S주 마우스들에 피하내 주사하였다. 쉬오노지 종양의 직경이 1~2㎝가 되었을 때(보통 주사후 2~3주후), 메톡시플루란 마취하에서 복부절제를 통해 거세를 행하였다. 마우스들의 보존, 종양주 및 수술 순서의 상세한 설명은 상술하였다(Bruchovsky et al., Cancer Res. 5; 2275-2282 (1990); Rennie et al., Cancer Res. 48: 6309-6312 (1988); Bruchovsky et al., Cell 13: 272-280 (1978)).

쥐의 포스포로티오에이트 안티센스 IGFBP-5 ODN(서열번호 1) 또는 이 안티센스 IGFBP-5 ODN의 서열과 두 개의 염기가 다른 서열 GACCACGCTCATGACCAT (서열 번호 12)를 갖는 불합치 대조구를 가지고 처리하기 위한 마우스들을 임의로 선택하였다. 각각의 시험군들은 8마리의 마우스로 이루어졌다. 거세일에 시작해서 15㎎/㎏의 안티센스 IGFBP-5 또는 불합치 대조구 ODN을 50일동안 각각의 마우스에게 하루에 한번 복강내로 주사하였다. 종양의 부피를 일주일에 두 번 측정하고, 길이×폭×깊이×0.5236의 식으로 계산하였다(Gleave, Cancer Res . 52: 1598-1605 (1992)). 데이타의 점들은 평균 종양 부피 ±표준편차를 기록한 것이다.

이 연구의 결과들을 도 1에 나타내었다. 안티센스 IGFBP-5 ODN 치료는 불합치 대조 ODN 치료와 비교하여 AI 종양의 재발을 지연시켰다. 비록 AI 종양이 거세후 60일간의 관찰동안에 양쪽군의 마우스들 모두에서 재발되었을 지라도, 불합치 대조구 ODN과 대비하여 처음 뚜렷한 AI 재발을 나타내는 중간 시간인 28~35일까지 안티센스 IGFBP-5으로 처리한 마우스들에서 25% 증가되었다. 종양의 무게가 3㎤ 이상 또는 체중의 10%이상으로 증가되었을 때는 마우스들의 희생이 필요했다. 재발한 AI 종양의 성장은 불합치 대조구 ODN군과 비교하여 안티센스 IGFBP-5 ODN 처리군에서 실질적으로 억제되었다. 마우스들을 희생시키는 시간은 안티센스 IGFBP-5 ODN 처리군에서 유의적으로 연장되었는데, 안티센스 IGFBP-5 처리군에서는 60일 후 단지 8마리중의 한 마리가 희생되는 것과 비교하여 불합치 ODN군에서는 53일 반나절후에 모든 마우스들이 희생되었다(p < 0.05).

실시예 2

IGFBP-5 mRNA 수준에서 생체내 ODN 처리의 효과를 검사하기 위해서 마우스들로부터의 쉬오노지 종양 조직을 가지고 노턴 블롯 분석을 수행하였다.

거세일부터 시작하여 안티센스 IGFBP-5 ODN(n=3) 또는 불합치 대조구(n=3) 15㎎/㎏을 복강내 주사로 마우스들에게 매일 처리하였다. 거세후 4일째에, 종양 조직을 회수하고, IGFBP-5 mRNA를 위한 노턴블롯을 분석하였다. 그 결과, 안티센스 IGFBP-5 ODN은 불합치 대조구 ODN으로 처리된 종양 조직과 비교하여 쉬오노지 종양에서 IGFBP-5 mRNA 수준이 약 61% 감소되었다(도 2).

실시예 3.

안티센스 IGFBP-5 ODN(서열번호 1) 또는 불합치 대조구(서열번호 12)를 다양한 수준으로 처리한 후, 시험관내에서 보존된 쉬오노지 종양 세포에서의 IGFBP-5 mRNA의 발현수준을 비교하는 것에 의해 안티센스 IGFBP-5 ODN(서열번호 1)의 서열 감수성을 확인하였다.

ODN들의 세포들내로의 흡수를 용이하게 하기 위하여, 양이온성 액체 담체(Lipofectin^TM, (Life Technologies, Inc.))로 제형화하였다. 세포들은 다음의 순서로 2일 동안 2번 이상 처리하였다. 세포들을 혈청을 함유하지 않는 OPTI-MEM^TM(Life Technologies, Inc.)에서 리포펙틴 4㎍/㎖와 함께 20분동안 예비 배양한 다음, 선정된 농도의 ODN 및 리포펙틴을 함유하는 배지에서 4시간 동안 배양하였다. 그다음, 배지를 실시예 1에 기재된 표준 배양배지로 교체하였다.

세포에서 IGFBP-5 mRNA의 양은 노턴블럿분석법으로 사용하여 측정하였다. 도 3에 나타낸바와 같이, 안티센스 IGFBP-5 ODN(서열번호 1)을 50, 100, 500 또는 1000nM 수준으로 쉬오노지 세포들에 매일 처리하면 투여량에 따라 각각 0, 7, 54 또는 83%로 투여량에 의존하는 방법으로 IGFBP-5 mRNA 수준들을 감소시켰다. 반대로, IGFBP-5 mRNA 수준은 불합치 ODN(서열번호 12)이 사용된 농도의 어디에서도 영향을 받지 않았다. 따라서, 안티센스 IGFBP-5 ODN의 영향은 명백하게 서열 특이적이다.

안티센스 IGFBP-5 ODN의 특이성을 더 분석하기 위하여, 다른 IGFBP(IGFBP-2, -3 및 -4) 유전자들의 발현에서 변화를 정량하기 위하여 1μM의 안티센스 IGFBP-5 ODN(서열번호 1)으로 쉬오노지 종양 세포의 처리후에 노턴 블럿팅을 수행하였다. 여기서, 다른 IGFBP 유전자들은 IGFBP-5와 중요한 서열 상동성을 공유한다. 안티센 스 IGFBP-5 ODN은 IGFBP-5 mRNA 발현을 뚜렷하게 감소시키지만, IGFBP-2, -3 및 -4의 발현수준에서는 이러한 효과가 관찰되지 않았다. 총괄적으로, 이들 데이터들은 이 연구에서 사용된 안티센스 IGFBP-5 ODN이 서열 특이적, 유전자 특이적 및 투여량 의존적으로 그것의 표적 유전자의 하향 조절을 유도한다는 것을 설명한다.

실시예 4

세포증식에서 안티센스 IGFBP-5 ODN의 효과를 검사하기 위하여, 2일 동안 1μM의 안티센스 IGFBP-5 또는 불합치 대조군 ODN으로 매일 한번 쉬오노지 종양 세포들을 치료하고, 72시간 동안 세포수를 측정하였다. 그 결과, 안티센스 IGFBP-5 ODN로 처리한 세포에서 72시간 동안 쉬오노지 종양 세포 증식을 유의적인 억제가 나타난 반면에 불합치 대조구 ODN으로 처리한 것은 세포성장에 아무런 영향을 미치지 않았다(도 4).

또한, 세포증식에서 안티센스 IGFBP-5 ODND의 효과는 100~1000nM의 농도범위에서 투여량에 의존한다는 것을 발견하였다(도 5). 이 증식억제효과들은 안티센스 IGFBP-5 ODN에 의한 쉬오노지 종양 세포들에서의 IGFBP-5 mRNA 감소정도와 직접적으로 관련이 있다. 반대로, 불합치 대조구 ODN이 사용된 어떠한 농도에서도 세포증식에서 유의적인 효과적들이 관찰되지 않았다.

안티센스 IGFBP-5가 아폽톱시스 유도를 통하여 세포사멸인자로서 작용할 가능성을 배제하기 위하여, 안티센스 또는 불합치 IGFBP-5 ODN 처리 후에 살아있는 세포들의 수와 죽은 세포들의 수를 측정하였다. 각각의 서브배양으로부터의 살아있 는 쉬오노지 세포와 죽어있는 쉬오노지 세포들을 ODN 처리 48시간 후 트립판 불루를 사용하여 계수하고, 전체 세포에 대한 죽은 세포의 비율을 계산하였다. 각각의 분석은 세 번 반복 수행하였다.

안티센스 IGFBP-5 ODN으로 처리된 세포들에서 관찰된 전체세포에 대한 죽은 세포의 비율은 불합치 대조구 ODN의 그것과는 유의적으로 다르지 않았다(도 6). 따라서, 안티센스 IGFBP-5 처리후의 세포수에서의 차이는 아폽톱시스 진행의 결과가 아니다.

실시예 5

쉬오노지 종양 세포 성장의 조절에서 IGFBP-5와 IGF-I사이의 관련성을 분석하기 위하여, 항 IGF-I 항체 및/또는 재조합 IGF-I로의 쉬오노지 종양 세포 증식에서 안티센스 IGFBP-5 ODN 처리의 효과를 평가하였다. 첫 번째 실험에서, 쉬오노지 종양 세포의 성장에 안티센스 IGFBP-5 ODN, 항-IGF-I-항체(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) 및/또는 재조합 IGF-I(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)의 시험관내에서의 효과들의 상기의 Miyake등(Oncogene 16:933-943 (1998))에 기재된 MTT 분석법으로 평가하였다. 간략하게는, 1×10⁴세포들을 96 웰 마이크로타이터(microtiter) 플레이트의 각각의 웰에 접종하고, 하룻밤동안 방치하였다. 그 다음, 세포들을 5nM의 재조합 IGF-I 또는 10㎍/㎖의 항-IGF-I 항체를 함유하는 배지에서 2일 동안 다양한 농도의 ODN으로 하루에 한번 처리하였다. ODN 처리 48시간 후, 5㎎/㎖의 MTT(Sigma Chemical Co.)를 함유하는 PBS 20㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 다음, 포르마잔 결정을 디메틸 술폭사이드에 용해시켰다. 광학밀도는 540nm에서 미세배양 플레이트 리더(microculture plate reader; Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ)로 측정하였다. 흡광도 값은 생존%를 결정하기 위해서 전색제로 처리된(vehicle-treated) 세포로 얻어진 값으로 표준화하였다. 각 분석법은 3번 반복되었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 재조합 IGF-I은 쉬오노지 종양 세포의 증식을 증가시켰으나, 항 IGF-1 중화항체들은 쉬오노지 세포성장을 60%까지 억제하였다. 더구나, 안티센스 IGFBP-5에 의한 세포증식 억제는 외인성 재조합 IGF-I 처리에 의해 역전될 수 있다. 항 IGF-1 중화항체에 안티센스 IGFBP-5 ODN의 부가는 항 IGF-1 중화항체 단독의 억제효과에 부가되지 않는다. 정리하면, 이 발견들은 세포증식에서 IGFBP-5의 증강 및 IGF-I 의존 효과를 뒷받침한다.

MAPK가 IGF-I 신호 변환을 위한 가장 강력한 경로중에 하나이기 때문에, 쉬오노지 종양 세포에서 MAPK 활성에 안티센스 IGFBP-5 및 항 IGF-1 중화항체가 미치는 효과를 측정하였다. 유사분열물질로 활성화된 단백질 키나아제(Mitogen activeted protein kinase; MAPK)활성은 MAP 키나아제 분석 키트(New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 측정하였다.

간략하게, 세포들을 PBS로 세척하고, 용해 완충액으로 용해시키며, 초음파 조사하고, 4℃에서 20분동안 미세원심분리(microcentrifuge)하였다. 상등액을 1:100으로 희석된 항-포스포-MAPK 항체와 함께 4시간동안 배양하였다. 그 다음, 단 백질 A-아가로스 비드들을 첨가하고, 3시간 동안 더 배양하였다. 펠릿들을 얼음처럼 찬 용해 완충액으로 두 번 세척하고, 키나아제 완충액으로 두 번 세척하였다. 펠릿들을 100mM ATP 및 20㎎/㎖의 Elk1 융합단백질, MAPK의 기질과 함께 30℃에서 30분 동안 배양하였다. 시료들을 끓인 다음 10% SDS-폴리아크릴 아마이드 겔을 통한 전기영동으로 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막에 옮겼다. 막을 블로킹 완충액에서 실온하에 1시간 동안 배양한 다음, 1: 1000으로 희석된 항-포스포-Elk1 융합 단백질로 프로브(probe)하였다. 세척한 후에, 막을 1: 1000으로 희석된 서양고추냉이 과산화수소(horseradish peroxidase)가 콘쥬게이트(conjugate)된 항-토끼 면역글로블린과 함께 배양하였다. 포스포릴화된 Elk1의 면역반응성은 ECL 화학루미네센스(chemiluminescence) 키트를 사용하여 측정하였다.

MAPK 활성에서 관찰된 변화들은 이들 시약들에 의해 유도된 세포증식에서의 변화들을 반영하였다; 즉, 안티센스 IGFBP-5 ODN은 MAPK 활성을 감소시키고, MAPK 활성 효과에서 이 안티센스 IGFBP-5로 유도된 감소는 재조합 IGF-I에 의해 역전될 수 있으며, IGF-I의 유사분열 효과가 항-IGF-1 항체에 의해 상쇄될 때 안티센스 IGFBP-5는 MAPK 활성에의 부가적인 억제 효과를 갖지 않는다.

실시예 6

세포 사이클 조절하에서 IGFBP-5 발현수준에서의 변화의 효과를 검사하기 위하여, 플로사이토메트리 분석(flow cytometric analysis)을 쉬오노지 종양 세포에서 수행하였다. 프로피디움 요오드로 염색된 핵의 프로사이토메트리 분석을 상기 Miyake 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 쉬오노지 종양 세포들을 6㎝ 디쉬들에 5×10⁶의 세포 밀도로 도포하고, 상술한 바와 같이 처리하였다. 세포들을 ODN 처리 48시간 후 트립신화하고, PBS로 두 번 세척한 다음, 4℃에서 5시간 동안 70%의 에탄올로 고정하였다. 고정된 세포들은 PBS를 가지고 두 번 세척한 다음, 1㎍/㎖의 RNaseA(Sigma Chemical Co.)로 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 5㎍/㎖의 프로피디움 요오드(Sigma Chemical Co.)를 가지고 실온에서 1시간 동안 염색하였다. 염색된 세포들을 FACScan TM(Becton Dickinson Labware)에서 상대적 DNA 함량을 분석하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 안티센스 IGFBP-5 ODN 처리에 의해 유도된 IGFBP-5 수준에서의 감소들은 G1 세포 사이클 억제를 일으키고 그 결과 불합치 대조구 ODN 처리와 비교하여 S + G2/M 상에서 세포들의 분획이 50% 이상 감소된다.

실시예 7

인간 처리에서 사용하기 적합한 안티센스 IGFBP-5 ODN 서열을 확인하기 위하여, 인간 IGFBP-5 유전자의 10개의 다른 부위에 작용하는 안티센스 ODN 서열들(도 9, 서열번호 2~11)을 합성하고, 인간 전립선 암 PC3 세포들 및 LNCaP/T 1(IGFBP-5를 과발현하기 위해 LNCaP세포들에 안정하게 형질감염되었다.)에서 IGFBP-5 유전자 발현을 감소시키는 그들의 능력을 시험관내 세포배양에서 검사하였다. 그 결과들을 도 10에 정리하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 서열번호 3, 4 및 10은 IGFBP-5 발현 감소에 활성을 나타내고, 특히 서열 번호 3은 가장 큰 잠재성을 갖는다. 이들 3개의 서열은 번역 개시 또는 종결부위에 겹치거나 바로 접하여 인접해 있다.

실시예 8

전이성 전립선 및 유방암은 자주 뼈의 조직에 침범한다. 그와 같은 전이성의 처리는 매우 어렵고, 뼈로의 암의 진행은 일반적으로 오래 생존하는 동안 약한 예후를 나타낸다. 따라서, 이 진행을 억제하거나 지연시키기 위한 방법론을 갖는 것이 바람직하다. IGF-1 및 IGFBP-5가 IGF-1 민감성 암 특히 전립선 또는 유방암을 포함한 IGF-1 민감성 암의 성장에 중요한 인자들이기 때문에, 뼈에서 IGFBP-5의 높은 수준으로의 존재는 전이성 병변의 성장 및 진행을 촉진하기 위한 중요한 메카니즘이 될 수 있을 것이라고 추측하는 것이 논리적이다. 따라서, 전이성 전립선 암으로 고통을 받는 환자로부터 얻은 최초의 인간 뼈 조직 시료로 웨스턴 분석을 수행하였다. 이 실험은 뼈에서 IGFBP-5의 높은 수준으로의 존재를 입증하였다. 본 발명에 따른 안티센스 IGFBP-5 ODN 사용한 이들 수준의 억제는 뼈에서 전이성 병변의 진행을 억제하거나 지연시키기 위한 효과적인 처리법을 제공한다.

본 발명의 인티센스 IGFBP-5 올리고디옥시뉴클레오티드를 사용하여 전립선암, 유방암과 같은 호르몬으로 조절되는 종양을 효과적으로 치료할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> The University of British Columbia Gleave, Martin Miyake, Hideaki <120> Antisense Therapy for Hormone-Regulated Tumors <130> UBC.P-021WO <140> PCT/CA00/00853 <141> 2000-07-19 <150> US 60/144,495 <151> 1999-07-19 <160> 66 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> murine <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(18) <400> 1 gaccacgctg atcaccat 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(18) <400> 2 gtcgccccct ttacctcg 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(18) <400> 3 cgcggtgagc aacaccat 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(18) <400> 4 aggtcatgca gcagccgc 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(18) <400> 5 gctcgcggta gctctttt 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> human 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60 tttccccctt tttgttcctt tttgttaccc cccccctcgg tctgcaccct tctccggact 120 tcacgcagaa cctgcgggtt tcgaagaggt ggtgacagag caggtgttgg ggtccaggtt 180 tggtgaggtc tgggtttttg ccctttttcc cccctcgatt tcaacatttt cccgatcttg 240 ttgtcagccg ccgacgcctc ttacctgttc tgcggcagca gcgcagctgg ccgctgagac 300 cgagcggagt ggggttgcgt tttagatttt aagcaaaggg gggaaaatta agcccaatcc 360 atttttttct tcacctcctc ccttttcaag gcctccaagc taattatttc tgttgctttg 420 gagtgagcaa ttctgtggtt ctctccacca ccacccccaa ttctgacccg atcccgcctg 480 ggggtttcta cggtctccgc tcgctctgcg tgcacctggc gcgcctcttt ttttcacccc 540 caacctgttg caagtcttta atcctcgcaa ttgggacttg cgtgcaggca tctgaatcct 600 ccttgcctca tattttgcaa gtgtttgggg gagagcacct gctctacctg caagagattt 660 aaaaggaaaa aaatctccag gctccctctt tctccacaca ctctcgctct cctgccccgc 720 cccgaggtaa agccagactc cgagaaaatg gtgatcagcg tggtcctcct gctgctggcc 780 gcctatgccg taccggctca aggcctgggt tctttcgtgc actgtgaacc ctgcgacgag 840 aaagctctgt ccatgtgtcc ccccagccct ctgggctgtg agctggtcaa agagcccggc 900 tgtggctgct 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aatgtattcc tttttgaagc aagttgaacg gacagagaag ggaaggagag 1800 aagaagcaag agggagcgag agatggaaag aaagcaaagc gttggaatag aggaaaagag 1860 ggaaggacag ataggattag agagagaaga gagaaacagc aaggcagaaa ggactccaca 1920 accaaggctg aatctgccct tttgctttca gctctagcct ggggtcagaa aaagtgtggc 1980 attcagtgac acccagttta gattggtcaa ggggagaaaa gaaacaaggt gtgtcagtgc 2040 ctctcgggtc tgtcccctcc tgcagccagc agtgtggatg gctagacccc tcaccctcct 2100 ctcctcttac ccaagtgcag ggtgatttca tccccaaatt tacaaagact aaaatgcatt 2160 ccatccctct gaaaataaac aaaagtgagt gattgaagat aggttttccc ccagcagaca 2220 agtgaactca gaatgtgtgc aaattttact cttgttaaag atttttttaa gaagtcagta 2280 cgcaccccca acactggaaa gacttgattc tccagggtga caagcaattc agaagcgcgt 2340 ggcttcggcc cttgatttca ctagactcaa agctggcccg gcagcctctg tggaggagga 2400 tgagaggtgg agaaaaccaa ggggcttgta ctcacccaca agactccatg tagactttat 2460 aggcatataa atctattttc tttacctttt tttccctttc cctttctttc gaagttttgc 2520 attacctctt taaagtagtt ttttttagga cactgaagat cttcctcatt ctgggaaaaa 2580 tccatatttc acaaatacaa cccagaacgc cagcttggcc tgcgtccagg cagcctttct 2640 cgtgagctac aagtgtggct cttttgtggg gcaccgattt ggatcttctc atgattccaa 2700 acgtgtgttg aagtgaatcc accaagccag gtaactgcca gcacccaagg gtgcatcaag 2760 tgcatagccc aggtcacccc atttcagcct tccaacccgc agaaagtaac tgtctcacac 2820 cacaccacat aaacctgcca gatccatctg taacccactg gcctgcccag accttttttt 2880 cccatctgca tttttttttt tgaactgcat tttgaaagcc tccctcagat gccaggctga 2940 cagatcagag agaaactaac atgagagatg acagaggagg aggaagtgga gggtgggggc 3000 agagacttcc acagagagac atagaagatg gagcagaggt ctgggggtgg ggaggacaag 3060 aaagagacag agagaggaaa ataccaatag aattttcctt ggtgtctccc atctaatcaa 3120 ctctctgaga tttgagagga aaaagaaggc aggggaagaa cttgaggtag aaatgaggtc 3180 agttcaagtc acagggccca gatggtgggt aactgaggca ggatccaaaa aaaatactta 3240 tgctttttac tggtgaaaca gattgaaaaa aaaattgaac aacaaaccag tttgtgaaaa 3300 aaaaaaatgg gaaaaaaaat caccccgatg tggaagagct cggctcctct ttagcatttt 3360 ggtacttaag gaaataaaaa agaaaaacct ggaagatctc acattttatt acaaagtga 3419 <210> 14 <211> 1612 <212> DNA <213> human insulin-like growth factor binding protein-5 <400> 14 ctctcctgcc ccaccccgag gtaaaggggg cgactaagag aagatggtgt tgctcaccgc 60 ggtcctcctg ctgctggccg cctatgcggg gccggcccag agcctgggct ccttcgtgca 120 ctgcgagccc tgcgacgaga aagccctctc catgtgcccc cccagccccc tgggctgcga 180 gctggtcaag gagccgggct gcggctgctg catgacctgc gccctggccg aggggcagtc 240 gtgcggcgtc tacaccgagc gctgcgccca ggggctgcgc tgcctccccc ggcaggacga 300 ggagaagccg ctgcacgccc tgctgcacgg ccgcggggtt tgcctcaacg aaaagagcta 360 ccgcgagcaa gtcaagatcg agagagactc ccgtgagcac gaggagccca ccacctctga 420 gatggccgag gagacctact cccccaagat cttccggccc aaacacaccc gcatctccga 480 gctgaaggct gaagcagtga agaaggaccg cagaaagaag ctgacccagt ccaagtttgt 540 cgggggagcc gagaacactg cccacccccg gatcatctct gcacctgaga tgagacagga 600 gtctgagcag ggcccctgcc gcagacacat ggaggcttcc ctgcaggagc tcaaagccag 660 cccacgcatg gtgccccgtg ctgtgtacct gcccaattgt gaccgcaaag gattctacaa 720 gagaaagcag tgcaaacctt cccgtggccg caagcgtggc atctgctggt gcgtggacaa 780 gtacgggatg aagctgccag gcatggagta cgttgacggg gactttcagt gccacacctt 840 cgacagcagc aacgttgagt gatgcgtccc cccccaacct ttccctcacc ccctcccacc 900 cccagccccg actccagcca gcgcctccct ccaccccagg acgccactca tttcatctca 960 tttaagggaa aaatatatat ctatctattt gaggaaactg aggacctcgg aatctctagc 1020 aagggctcaa cttcgaaaat ggcaacaaca gagatgcaaa aagctaaaaa gacacccccc 1080 ccctttaaat ggttttcttt ttgaggcaag ttggatgaac agagaaggga agagaggaag 1140 aacgagagga agagaaggga aggaagtgtt tgtgtagaag agagagaaag acgaatagag 1200 ttaggaaaag gaagacaagc aggtgggcag gaaggacatg caccgagacc aggcaggggc 1260 ccaactttca cgtccagccc tggcctgggg tcgggagagg tgggcgctag aagatgcagc 1320 ccaggatgtg gcaatcaatg acactattgg ggtttcccag gatggattgg tcagggggag 1380 aaaggaaaag gcaaaacact ccaggacctc tcccggatct gtctcctcct ctagccagca 1440 gtatggacag ctggacccct gaacttcctc tcctcttacc tgggcagagt gttgtctctc 1500 cccaaattta taaaaactaa aatgcattcc attcctctga aagcaaaaca aattcataat 1560 tgagtgatat taaatagaga ggttttcgga agcagatctg tgaatatgaa at 1612 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 15 tttttttttt ttttttcaaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 16 atgatagata tatatttttc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 17 ccttaaatga gatgaaatga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 18 gtggcgtcct ggggtggagg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 19 gaggcgctgg ctggagtcgg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 20 ggctgggggt gggagggggt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 21 gagggaaagg ttgggggggg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 22 acgcatcact caacgttgct 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 23 acgcatcact caacgttgct 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 24 gaaagtcccc gtcaacgtac 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 25 tccatgcctg gcagcttcat 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 26 cccgtacttg tccacgcacc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 27 agcagatgcc acgcttgcgg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 28 ccacgggaag gtttgcactg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 29 ctttctcttg atgaatcctt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 30 tgcggtcaca attgggcagg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 31 tacacagcac ggggcaccat 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 32 gcgtgggctg gctttgagct 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 33 cctgcaggga agcctccatg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 34 tgtctgcggc aggggccctg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 35 ctcagactcc tgtctcatct 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 36 caggtgcaga gatgatccgg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 37 gggtgggcag tgttctcggc 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 38 tcccccgaca aacttggact 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 39 gggtcagctt ctttctgcgg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 40 tccttcttca ctgcttcagc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 41 cttcagctcg gagatgcggg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 42 tgtgtttggg ccggaagatc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 43 ttgggggagt aggtctcctc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 44 ggccatctca gaggtggtgg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 45 gctcctcgtg ctcacgggag 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 46 tctctctcga tcttgacttg 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 47 ctcgcggtag ctcttttcgt 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 48 tgaggcaaac cccgcggccg 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 49 tgcagcaggg cgtgcagcgg 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 50 cttctcctcg tcctgccggg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 51 ggaggcagcg cagcccctgg 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 52 gcgcagcgct cggtgtagac 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 53 gccgcacgac tgcccctcgg 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 54 cctgggcgca ggtcatgcag 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 55 cagccgcagc ccggctcctt 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 56 gaccagctcg cagcccaggg 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 57 ggctgggggg gcacatggag 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 58 agggctttct cgtcgcaggg 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 59 ctcgcagtgc acgaaggagc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 60 ccaggctctg ggccggcccc 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 61 gcataggcgg ccagcagcag 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 62 gaggaccgcg gtgagcaaca 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 63 ccatcttctc ttagtcgccc 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 64 cctttacctc ggggtggggc 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(20) <400> 65 aggagagcga gagtgcaggg 20 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> human <220> <221> antisense IGFBP-5 oligodeoxynucleotide <222> (1)..(21) <400> 66 gaccgcggtg agcaacacca t 21

Claims

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호르몬으로 조절되는 종양 세포에 의한 IGFBP-5(Insulin-like Growth Factor Binding Protein-5)의 발현을 억제하는 IGFBP-5 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 호르몬으로 조절되는 종양 치료용 조성물로서, 상기 IGFBP-5 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 서열로서 서열번호 14의 서열에 상보적인 서열을 가지며, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 10 중 어느 하나의 서열이 상보적으로 결합하는 상기 표적 서열의 일부에 상보적으로 결합하는 것인 조성물.
제3항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15 내지 30의 뉴클레오티드 길이를 가지는 것인 조성물.
제3항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하고, 종양 세포들에 의한 IGFBP-5의 발현을 억제하는 IGFBP-5 안티센스 올리고뉴클레오티드로 호르몬-민감성 종양 세포들을 처리하여 호르몬으로 조절되는 종양 세포들의 안드로겐에 독립적인 상태로의 진행을 지연시키는 것인 호르몬으로 조절되는 종양 치료용 약리학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 종양 세포들은 전립선암 세포들인 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 종양 세포들은 유방암 세포들인 것인 조성물.
제3항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하고, 호르몬에 민감한 암으로 고통을 받는 개체에서 호르몬에 민감한 암을 치료하기 위한 약리학적 조성물로서, 상기 약리학적 조성물은 상기 개체에서 호르몬에 민감한 암 세포들의 아폽톱시스성 세포사멸을 유도하기 위해서 호르몬-중지의 개시 후에 상기 개체에 투여되고, 이에 의해 상기 개체에서 상기 호르몬 민감성 암세포의 호르몬에 독립적인 상태로의 진행이 지연되게 하는 것인 조성물.
제8항에 있어서, 상기 호르몬에 민감한 암은 전립선암인 것인 조성물.
제3항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하고, 호르몬에 민감한 암세포들에 의한 IGFBP-5의 발현을 억제하는데 유효한 양으로 포유동물에게 투여하여, 상기 포유동물에서 IGF(Insulin-like Growth Factor)-1에 민감한 종양의 뼈에서의 전이성 진행(metastatic boney progression)을 억제 또는 지연시키는 것인 호르몬에 민감한 종양 치료용 약리학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 IGF-1에 민감한 종양은 전립선암인 것인 조성물.