HU228465B1 - Antisense therapy for hormone-regulated tumors - Google Patents
Antisense therapy for hormone-regulated tumors Download PDFInfo
- Publication number
- HU228465B1 HU228465B1 HU0201868A HUP0201868A HU228465B1 HU 228465 B1 HU228465 B1 HU 228465B1 HU 0201868 A HU0201868 A HU 0201868A HU P0201868 A HUP0201868 A HU P0201868A HU 228465 B1 HU228465 B1 HU 228465B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antisense
- igfbp
- cells
- human
- odn
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 50
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title claims description 8
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title claims description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 title description 141
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 55
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 37
- 239000003098 androgen Substances 0.000 claims description 27
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 24
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 12
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 94
- 101500027983 Rattus norvegicus Octadecaneuropeptide Proteins 0.000 description 51
- 108090000961 Insulin-like growth factor binding protein 5 Proteins 0.000 description 37
- 102000004371 Insulin-like growth factor binding protein 5 Human genes 0.000 description 36
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 24
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 10
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 8
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 6
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 5
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 5
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 4
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- 101000840566 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein 5 Proteins 0.000 description 3
- 102000004372 Insulin-like growth factor binding protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000964 Insulin-like growth factor binding protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 3
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000003780 Clusterin Human genes 0.000 description 2
- 108090000197 Clusterin Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001441754 Heteralocha acutirostris Species 0.000 description 2
- 102000004374 Insulin-like growth factor binding protein 3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000965 Insulin-like growth factor binding protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 108090000969 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 208000010658 metastatic prostate carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 2
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- 125000004200 2-methoxyethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 101710183811 Glia-derived nexin Proteins 0.000 description 1
- 235000010044 Hernandia moerenhoutiana Nutrition 0.000 description 1
- 244000084296 Hernandia moerenhoutiana Species 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101100018355 Homo sapiens IGFBP5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000904173 Homo sapiens Progonadoliberin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102000004369 Insulin-like growth factor-binding protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100029225 Insulin-like growth factor-binding protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 102000004883 Insulin-like growth factor-binding protein 6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001014 Insulin-like growth factor-binding protein 6 Proteins 0.000 description 1
- 101150117406 Mafk gene Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102100024028 Progonadoliberin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000996723 Sus scrofa Gonadotropin-releasing hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100039190 Transcription factor MafK Human genes 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 229960003473 androstanolone Drugs 0.000 description 1
- 230000002280 anti-androgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940046836 anti-estrogen Drugs 0.000 description 1
- 230000001833 anti-estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 description 1
- 229940030495 antiandrogen sex hormone and modulator of the genital system Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- QLHULAHOXSSASE-UHFFFAOYSA-N butan-2-yl 2-(2-hydroxyethyl)piperidine-1-carboxylate Chemical compound CCC(C)OC(=O)N1CCCCC1CCO QLHULAHOXSSASE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- -1 cat ionic lipid Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000018486 cell cycle phase Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000003073 embolic effect Effects 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 239000000328 estrogen antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N gonadorelin Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940125697 hormonal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000000021 kinase assay Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 1
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000017497 prostate disease Diseases 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
A találmány tárgyát olyan anfeiszensz oligonukleotid alkalmazása képezi hormon-szabályzott tumorok (például mell- es prosztatatumorok) kezelésére, amely inzulínszerű növekedési faktort kötő, 5. szárná fehérje (XGFBP-S) génjének expre-sszióját képes gátolni.
A találmány szerinti megoldás alkalmas bizonyos tumorok kezelésére és megelőzésére.
A prosztatarák a leggyakrabban előforduló, férfiakat sújtó rákbetegség, és a második vezető helyen álló, rákbetegségre visszavezethető halálok férfiak esetén a nyugati világban. Hívei a prosztatarák androgén-szehzitiv tumor, néhány kezelési előirat szerint ahdrőgén-megvonást (például kasztráción keresztül) alkalmaznak előrehaladott prosztataapoptózí
| ás androgé | n-megvonás | a p.ross~ |
| :i.shoz, és | ennélfogva | a beteg- |
| Azonban a | kasztráció- | indukált |
| a túlélő | tumorsejtek | tovább- |
| llapotba... | Ez a tovább | fejlődés |
| s az élet | minőségének | j 5V1 Lei'** |
Sára, és ezért az erőfeszítések arra irányultak, hogy célba vegyék az. androgén-független sejteket. Ezek az erőfeszítések olyan nem-hormonális terápiákra irányulnak, melyek az tkt tszaaunx
95794-8603/PÁ
X * φ φ «»»φ ΦΦΧ androgén-független tumorsejteket veszik célba [Yagoda. és mtsai., Cancer 71 (Supp.3}, 1098-1109 {1993}; Oh és mtsai.,
J. Urol. 60, 1220-1229 {1998}}, azonban eddig nem-hormonális ágens még ne® javította a túlélést. Ezért alternatív megközelítésekre van szükség.
Az I. számú inzulinszerö növekedési faktor (IGF-I) és IGF-1I potenciális mitogén a legtöbb normál, és malignus sejt számára. A felhalmozott bizonyítékok alapján feltételezzük, hogy az IG.F~ek fontos szerepet játszanak prosztatabetegségek és mellrák patofízioiógiágában (Boádon és mtsai., -J. Clin. Endocrin. Metab. 81, 612-817 {1996}; Angelloz-Niooud és mtsai..Endocrinology 136, 5485-5492 {1995}; Hickers-on és mtsai./ Endocrinoiogy 139, 807-810 {1998}; Fígueroa és· mtsai., J. Urol. 159, 1379-1383 {1998} ] .
IGF-ekre adott biológiai választ különböző faktorok, például IGFBP~k szabályozzák. Jelenleg hat IGFBP-t azonosítottak, amelyek funkciójáról feltételezzük, hogy l.GF-ek biológiai hatásainak modulálásában játszanak szerepet nagy affínitású kölcsönhatásokon keresztül [Rajaram. és mtsai.., Endocrin. Rév. 18 ? 801-813 {1997}]. Azonban néhány tény alapján feltételezzük, hogy IGFBP-k biológiai aktivitása független IGF-éktől [ugyanaz; Andress és mtsai., J. Bioi. Chem. 267, 22467-22472 {1992}; Oh és mtsai., J. Bioi. Chem.
68, 14964-14971 (1993}'j:, és leírták, hogy IGFBP-k stimulátor és inhibitor hatást egyaránt képesek kifejteni sejtproliferációra, különböző kísérleti körülmények között [Andress és mtsai., mint fent; Élőin és mtsai., Proc. Nati.
Acad. Sex. USA 84, 3254-3258 (1987); Huynh és -mtsai., J, 3iol. Chem. .2 7 1 , .1016-1.021 {1996} ; Damon és mtsai., Endocrinology 139, 3456-3464 {1998}]. Tehát IGFB?~k pontos funkcionális szerepe ellentmondásos maradt. Emiatt, bár a közölt eredmények szerint IGF szerepet játszik prosztataés mellrákban, nem alakult ki. világosan megfogalmazott terápiás megközelítés, amelyekben ezeket alkalmaznák.
A találmány szerinti megoldásban antiszensz oligonukleotidokát {ODN-sket) alkalmazunk TGFBP-5 megcélzására, prosztata- és mellrák, kezelése céljából. Antiszensz ODN-ek kémiailag módosított, egyszálú DNS—ek, amelyek komplementerek a megcélzott gén mRNS-régióival, és ezáltal hatékonyan képesek génezpresszíót gátolni RNS/DNS-duplexek kialakításával (Figueroa és mtsai., J. ürol. 159, 1379-1383 {1993}]. Foszforotioát-GDN-ek stabilizálva vannak abból a célból, hogy rezísztensek legyenek nukleázos emésztéssel szemben, úgy, hogy egy hidat nem képezd foszforil-oxigénatom helyettesítve van kénatommal. A közelmúltban neopláziás fejlődésben szerepet játszó gének specifikus megcélzására szolgáló, számos antiszensz ODN-t vizsgáltak in vitzo és ín vivő egyaránt, és kimutatták az antiszensz. stratégia hatékonyságát potenciális terápiás ágensként (Mónia és mtsai., Natúré Med. 2, 868-675 (1936); Cueco és mtsai., Cancer Rés. 56, 4332-4337 (1996); .Zíegler és mtsai., J. .Nati. Canoer Inst. 89, 1027-1036 {1997}; Jansen és mtsai., Natúré Med. 4, 232234 (1998)].
A találmány tárgya eljárás hormon-szabályzott 'tumorok (például mell- és prosztatatumorok) kezelésére emlősszerve«φ '♦ φ ·>
V Φ »»·♦ * ζetekben, például emberekben lGFBP-5~t kódoló gén egy részletével komplementer, antiszensz ODN beadásával, Shionogítumormodeil in vitro és ín vivő alkalmazásával kimutattuk,, hogy Ilyen OT beadása csökkenti tumorsejtek proli béradójának mértékét, és késlelteti androgén-független állapotba való kifejlődést is. Tehát, a találmány tárgyát képezik eljárások prosztatarák kezelésére emlősszervezetekben, például emberekben, és prosztatatumo-rok androgén-független állapotba való kifejlődésének, késleltetésére, amelyben az emlősszervezetnek beadunk olyan antiszensz oligonukleotid terápiásán hatásos mennyiségét, amely IGFBP-S-t kódoló nukleinsavszekvencia egy részletével komplementer, és amely ilyen szekvenciával hibridizalódni képes as XGFBP-5 expressz lójának gátlása céljából, As eljárásban alkalmazható, speciális antiszensz ODN-ek az alábbiak: GACCACGCTGATGACCAT {!.. azonosítószámú szekvencia), amely rágcsáló eredetű gén. szekvenciájából származik, és CGGGGTGAGCAACACCAT (3. azonosítószámú szekvencia) és .AGGTGATGCAGCAGCCGC (4. azonosítószámú szekvencia), amelyek humán gén szekvenciájából szárma znak As 1. ábrán bemutatjuk antiszensz IG.FBP-5-0DN tumorsejtek újranövekedésére kifejtett hatásait, sebészeti andr ogén-megvonás t köve t öen;
A 2. ábrán bemutatjuk IGFSP-5-mRNS mennyiségének csökkenését in vivő antiszensz XGFBP-5—G.DN-kezeiés után?
A 3. ábrán bemutatjuk XGFBP-5-mKNS mennyiségének dózisfüggö csökkenését in vitro antiszensz IGFBP-5-ODN-kezelés után;
A 4. ábrán bemutatjuk antiszensz után jelenlévő sejtek, számat az idő függvényében;
Az 5. ábrán bemutatjuk antiszensz IGFBP-S-ODN~keze.lés után jelenlévő sejtek számát a koncentráció függvényében;
A 6. ábrán bemutatjuk az elpusztult sejtek arányát olyan mintában, amelyet antiszensz IGFBP-5-ODN-kezeitün.k?
A 7, ábrán bemutatjuk antiszensz IGFBP-S-ODN hatásait IGF-l-hes és anti-IGF- 1-ellenanyaghoz viszonyítva;
A o. ábrán bemutatjuk antiszensz XGFSP-5-ODN-el kezelt sejtek áramlási citometriás eredményeit;
A 3. ábrán vázlatosan ábrázoljuk humán IGBFP-S nukieotidszekvenciáját, amelyen megjelöltük a lö antiszensz O.DH h e 1 y z e t é t; és
A 19. ábrán bemutatjuk a 9, ábrán szereplő, 10 antiszensz ODN hatását XGBFP-5-ráülS-ek mennyiségére.
A találmány tárgya eljárás hormon-szabályzott (például prosztata- vagy mell-) tumorsejtek hormon-független (például androgén- vagy ösztrogén-független) állapotba való kifejlődésének késleltetésére, terápiás eljárás hormon-szabályzott. rákbetegségekben, például mellrákban vagy prosztatarákban .szenvedő egyének, például emberek kezelésére, valamint ilyen eljárásokban történő alkalmazásra hatékony terápiás ágensek. A találmány szerinti készítményeket továbbá prosztata-, melltumor és más, csontban lévő IGF-1-érzékeny tumor növekedésének és metasstázisossá való átalakulásának gátlására vagy késleltetésére lehet alkalmazni. A találmány szerinti terápiás eljárást leggyakrabban előrehaladott állapotban lévő mell- vagy prosztatarákban szenvedő egyénekIG FB Ρ - 5~ ODN - ke z e 1 é S ben lehet alkalmazni.
A találmány első előnyös megvalósítási módja szerint, androgén-szent ítív pros ztatarák-sej tek androgén-független állapotba való kifejlődését lehet gátolni JGFSP-5 sejtek általi expresssíőjának gátlásával. A kísérleteket in vitro és in vivő Shionogi-tumoosodellben végeztük. A Shinogi~tu~ mormodéi! androgén-függő, egéréredetö emiókarcinőma xenograftja, amely szubkután növekszik hím szingenikus gazdaszervezetekben . Shinogi-tumorsejtek nagymértékben tumoráéitőek és lokálisan invazívek (behatolók). Kimutatták, hogy a sejtek ágy adnak választ androgén-megvonásra, hogy prosztatatumor-sejbek megfigyelt tulajdonságait mimetizálják, és elfogadott, valádáit prosztatarák-modelInek számítanak emberekben [Bruchovsky és mtsai., Cancer Rés. Sö, 2275-22.82 (1330); Kennie efc al., Cancer Rés. 48, 63-03-6312 (1388);
Bruchovsky és mtsai ., Ceil 13, 272-280 (1378); Gieave és mtsai., ^Genitourinary Oncolog^, 367-373, old., szerk. hangé és mtsai., hippenco-tt (1337); Gieave és mtsai., J. Vrol. 157, 1727-1733 (1397); Bruchovsky és mtsai., The
Prostate 6, 13-21 (133-6)3. Tehát az androgén-megvonás apópözisf. és tumor-regressziót vált ki nagymértékben reprodukálható módon. Továbbá, peptídexpressziö, például TRPM-2és Bcl-2-expresszió: mértékének változásai kasztrácíót követő humán prosztatarákban, és az androgén-.függetlenség kialakulása alatt hasonlóak azokhoz, amelyeket megfigyeltek Shionogí-tnmorsejbekben. Esen hasonlóságok miatt a Sh iono g i -1umo rmodé 11 kép e s mimet i z á 1 η í pr o s z t a t a rá k - s e j: t e k sok tulajdonságát, és nagyon hasznos modellt jelent vegyületek elemzéséhez abban a vonatkozásban, hogy azok milyen mértékben képesek az androgén-függetlenség kialakulását késleltetni. Kasztráció után a tumor teljes visszafejlődése ellenére, gyorsan növekvő, androgén-független Shionogitumorok egységesen kiújulnak egy hónap után, amely .megbízható végpontot jelent olyan ágensek elemzésére, amelyek az androgén-függetlenség kialakulását .képesek késleltetni.
A találmány szerinti megoldáshoz vezető vizsgálatokban először TSFBF-k expressZiójónak változásait jellemeztük a Shionogi-tumormodellben kasztráció után és AI kifejlődése alatt.. Northern-blot-analíziseket alkalmaztunk az ISFBPmRNS-expres-szióöan bekövetkezett változások jellemzésére AD intakt tumorokban kasztráció előtt, visszafejlődő tumorokban kasztráció után 4 és 7 nappal és AI kiújult tumorokban kaszt ráció után 28 nappal·. 1GFBP-2, -3, -4 és -5-nek. megfelelő mRNS-express.zió változásaira megfigyeltünk különböző mintázatokat. XGFB.F~.l~ és IGFBP-6-mRNS nem. volt detektálható a .Shionogi-tumormodellben.. Shionogi-tumorokban expressszélt IGFBP-k közül a legdrámaibb változásokat 1GFBP-5expresszióra figyeltük meg. Annak ellenére, hogy nem voltak detektálh-afcóak AD intakt tumorokban, IGFBP-5-expresszíójának mértéke nagymértékben fokozódik kasztráció után, és nagymértékben expr-esszélt marad AI-tumorokban. IGFBP-5 aktiválódást mutató mintázata a Shionogi-tumormodellben A.1 kifejlődése alatt hasonló ahhoz, amit patkányból származó prosztatában ^Angelloz-Nicoud,· mint fent) és humán prosztata-rákban -{Figueroa, mint fent) megfigyeltek, és ezért alátámasztja a modell alkalmazhatóságát adjuváns antiszensz
IGFBP-5-terápia audrogén-függetlenség kifejlődésér-e kifej~ tett hatékonyságának kiértékelésére»
Az említett aktiválódás funkcionális jelentőségének vizsgálata céljából teszteltük antiszensz IGFBF-5-ODN hatásait IGF-1-médiáit sejtnövekedésre in vítro és in vivő egyaránt, Shíonogí-tustormodell alkalmazásával ♦ Ezeket a teszteket rágcsálóból származó IGEBP-5-génre specifikus, antiszensz ODH alkalmazásával végeztük. Ezekben a kísérletekben kimutattuk, hogy egéreredetű. IGFBP-5 transzláció ínieiá'C.iós helyének megfelelő, antiszensz IGPB.P-5-ODH foszforotioát származéka dózisfüggő módon képes gátolni IGFBP-5-mPNS expressz lóját.· A szekvenciaspecifit ást 2, nem párosodó bázist tartalmazó („mismatch) IGFBP-5-0D^ alkalmazásával igazoltuk, amelynek nem volt semmilyen hatása IGFSP-5-mFNS~expresszióra Shíonogí~tumorsejtökben. Továbbá .kimutattuk, hogy antiszensz IGFBB-5-ODN csökkentette az lGFBP-5-expres-szíó mértékét cél-specifikus módon? azaz. más rnRNS, például lGFBF-2, ~3 és -4 expresszióját nem lehetett befolyásolni antiszensz IGFBP-5-GDH-kezelésssl.
Antiszensz IGFBP-5-ODH sejtproliferációt gátol és a sejtciklus befagyasztását indukálja Shíonogi-tumórsejtekben idő- és dózisfüggő módon. Úgy tűnik, hogy antiszensz IGFBP5-ÖDN-kezelés nem indukál apoptózist sem in vitró, sem in vivő, ami alapján feltételezzük, hogy antiszensz IGF8P-5•ODN-aktivitás inkább sejtprolíferáció gátlásán keresztül működik, mint apoptózís .indukcióján keresztül. Továbbá megfigyeltük, hogy antiszensz. IGFSP-5-QDN növekedést gátló hatásait vissza lehet fordítani exogén IGF-l-el, és azt, hogy * ♦♦*!» ΦΦ φΧ »**♦
ΦΦ XX φ X Φ Φ φ <, Χφφ φ ΧΦΦ
X X X ♦ *
XX* X ΦΦ Φ«ΧΧ ΦΧΧ antiszensz IGFBP-5-ObN-kezelés nem okozott további sejtproiiferáció-gátlási, ha az IGF-l-aktivitást anti-IGF-l-ellenanyagokkal semlegesítettük. .Még azt találtuk, hogy antiszensz IGFBP-5-0DK lihFK-aktivítást gátolt, amely gátlást •szintén vissza lehetett fordítani exogén IGF-1-el, és hogy antiszensz IGFBP-5-ÖDN nem rendelkezett független MAPK~ak~ tívitást gátló hatással, ha. IGF-l-et antí-IGF-l-ellenanyagokkal semlegesítettük. összefoglalva, ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy antiszensz IGFBP-5-GDN sejtprolíferáoiőt képes gátolni, legalább részben, MAPK-inaktiválásban szerepet játszó, IGF-1-függő mechanizmuson keresztül.
Ezekből, az in vit.ro adatokból kiindulva alapozva feltételeztük, hogy androgénne.1 kiváltott, IGFBP-5-aktiváiódás megcélzása antiszensz stratégiával gátolhatja az androgénfüggetlenség kifejlődését., Γη vívó kísérleteinkben antíszensz IGFBP-5-0DN beadása kasstráeíó után késleltette AI kifejlődésének idejét és gátolta Al-tumornövekedés kiújulósát. Ib vitro kezeléseinkkel összhangban, Shíonogi-tumorokat tartalmazó egerek in vivő kezelése antiszensz IGFBP-5GBN-el szintén gátolta az IGFBP-S-mBNS-expressziót. Ezek az eredmények szemléltetik, hogy OBN ín vívó szisztémás beadása tumorsejtekben lévő cél-gének szekveneiaspecifikus leszabályzását eredményezheti.
Sár az inzulinsserű növekedési faktort {IGF} kötő 5.
számú fehérje (IGFBP-S) nagymértékben aktiválódott normál és maiignus prosztata-szövetekben androgén-megvonás után, f«.kc.i ónál is szerepe kasztfáció-indukált apoptózisban és androgén-független állapot kifejlődésében tisztázatlan ma10 radt. IGFBP-S-túltermelődés IGF-1-médiáit mifcogenezisben és androgén-független állapot kifejlődésében betöltött, funkcionális jelentőségének analizálása céljából, előállítottunk IGF8P-S~et túltermelő, humán, androgén-függő LNCaPjelű, prosztatarák-sejteket stabil transzfekcióval. IGFBP5-transzfektált LNCaP-sejtek növekedési sebessége szignifikánsan gyorsabb volt akár a szülői sejtekhez képest, akár a csak vektorral transziektált LNCaP-sejlekhez képest, dihidrotesztoszteron jelenlétében és hiányában egyaránt. LNCaPsejtproliferáciő IG.FBP-5·-indukált növekedése IGF-l-függö és IGF-1-független folyamatsorokon keresztül egyaránt megtörténik, melyet ciklin-Dl-mRN-S-expresszió fokozódása és S ·*· G2/H sejtciklus-fázisban lévő sejtek arányának növekedése kísér. Akt/fehérjekináz-δ (PKB), amely a foszfatidil-inozi'tol-3# kináz (P13K) folyamatsorban később elhelyezkedő komponens, az LNCaP-alvonalakban szintén párhuzamosan változott növekedési sebességükkel. Bár Pl3K-inhibitorral való kezelés apoptőzist indukált mind kontroll, mind IGFBP-5-t túl termelő LíSCaP-sejtekben, ez a PX3K-inhibi tor-indukált apoptózís csak XGFBP-S-transzfektánsokban volt meggátolható exogén TGF-l-kezeléssel, ami alapján feltételezzük, hogy IGFBP-S-táltermelés hatékonnyá képes tenni IGF-1 apoptotíkus hatásait. Továbbá, a. tumornövekedés és a szérum-P'SAssintek néhányszor nagyobb mértékben növekedtek IGFBP-5transzfektált INGaP-tümorokat tartalmazó egerekben kasztrácíő után, annak ellenére, hogy a tumor előfordulási gyakorisága és a tuinornövekedés sebessége hasonló mértékű kontroliokkal, ha intakt egerekben növesztjük kasztráciö előtt.
*« 4
Összefoglalva, ezen adatok alapján feltételezzük, hogy IÖF3P-5 túltermelődése prosstatarák-sej tekfoen, kasztráciő után adaptív sejt-túlélési mechanizmust képvisel, amely segíti az IGF-X ant iapopto· tikos és mitogén hatásainak hatékonyabbá tételét, ezáltal felgyorsítja az .androgén-független állapot kifejlődését a P13K-Akfc/PK8 jeltovábbítási folyama tso-r ón keresztül,
AI kifejlődésének késleltetésére szolgáló ésszerű stratégia molekuláris mechanizmusokra épül, és inkább androgén-megvonással kiváltott adaptív változásokat céloz a génexpresszióban, mint hormonhatássál szemben nem reszponziv, kifejlődött betegségben szenvedő páciensek kezelésére szolgáló hagyományos megközelítéseket, Kombinációs terápiák integrálása és megfelelő időzítése a fejlődés és a génexpresszióban lezajló, kaszfráció-indukált változások biológiai mechanizmusára alapozva lényegi módon felhasználható eszközöket biztosíthat Al kifej tüdősének gátlására, A találmány szerinti megoldásban közvetlen bizonyítékot nyújtunk IGFBP-5· AI kifejlődésében betöltött funkcionális szerepének alátámasztására, és IGFBP-5-génexpresszió mértékének ez a csökkentése antiszensz IGFBP-S-ODN alkalmazásával késlelteti Al-tumorok kiújolását és növekedését,
A találmány szerinti kezelési eljárást egyénenként alkalmazhatjuk, Azonban antiszensz· COT-eket előnyösen kombinációban alkalmazunk más terápiákkal, amelyek androgénmegvonást eredményeznek, Tehát, a találmány egy további vonatkozásában, prosztatarákban szenvedő egyének, beleértve emberek terápiás kezelését úgy végezzük, hogy androgén> X »« X φ >
megvonást inlei álunk a.z egyénben, prosztatatumor-sej tekek apopto-tikus sejfcpusztulásának indukálása céljából, és beadunk az egyénnek olyan készítményt, amely hatékonyan képes tumorsejtek IGBFP-S~expresszíój át gátolni, ezáltal az egyénben késleltetjük prosztatatumor-sejtek kifejlődését, androgén-független állapotba. IGFBP-S csontban való expressziőját tekintve, tumorsejtek IGF-2.- és IGFBP-S-siedíáit. növekedése szintén, lényegi szerepet játszhat IGF-l-szenzitív metasztázisos tumorsajfcek csontban való növekedésének elősegítésében. Ez a növekedés megakadályozható a találmány szerinti, anfc.lszan.sz IGBFP~5~öDN alkalmazásával, Így gátolható vagy késleltethető metasztázisos betegség kifejlődése.
Az androgén-megvonás iniciálását sebészeti (mindkét here eltávolításával) vagy orvosi (tesztoszteron drog-indukált szupresszíójával) kasztrálással lehet elérni, ami jelenleg alkalmazott javallat prosztatarák kezelésére. Az orvosi kasztrálást különböző kezelési előíratok szerint lehet elérni, például LHRH-ágensek vagy antiandrogének alkalmazásával [Gleave és atsai., CffiJ léd, 225-232 (1999)]. Időszakos terápiában reverzibilis androgén-megvonást Gleave és munkatársai (Eur. Urol. 34 (Supp.3.·) 37-41 (1998) J által leírtak szerint végeznek. Hormon-megvonást mellrák esetén úgy lehet elérni, hogy drogterápiában anti-ösztrogéneket, például fcamoxifént alkalmaznak.
lGBFB-5-expressziő gátlása lehet tranziens, és androgén-megvonás után kell megtörténnie.. Emberek esetén ez azt jelenti, hogy az expresszié· gátlásának egy vagy két nappal az androgén-megvonás után keli hatásosnak lennie, és körülff* ♦ * w * X * ff ♦ «ff ff ffX« ff ff * ** ***ff *♦* belül 3-6 hónapig kell tartania. Ehhez több dózisra is szükség lehet. Azonban nyilvánvaló, hogy az időtartam meghosszabbítható, kezdődhet a kasztráoíó előtt és azután bármeddig tarthat anélkül, hogy eltérnénk a találmány által igényeit oltalmi körtől.
A fentebb leírt tesztekben és a lentebb leírt példákban alkalmazott ODN (1. azonosítószámú szekvencia} kompiéme.nt.er a rágcsálóból származó IGFBP-5-gén egy részletével., és átfed a transzlációs inieiáeiós hellyel. Más OSN-fajtékát is lehet alkalmazni, például olyanokat, amelyek valamivel hosszabb vagy valamivel rövidebb ODN-fajták (például 15-30 nukleotiából állnak), és átfednek a transzlációs inicíácíós hellyel, valamint olyan ODN-eket, amelyek átfednek a transzlációs termináclös hellyel. Közepes hosszúságú ODNek is hatékonyak lehetnek, és szkríhélni lehet azokat arra .nézve, hogy képesek-e kellő mértékű IGFBP-5-gátlást biztosítani a példákban leírt expresszién vizsgálati eljárás alkalmazásával . Az antiszensz ODN találmány szerinti megoldásban történő alkalmazásra való szelektálásakor kívánatos, hogy elkerüljünk lényegi komplementéritást más IGFBP-kel, mivel ezen más fehérjék expresssiójának gátlása nemkívánatos mellékhatásokhoz vezethet. Egérből származó IGFBP-5 nukleinsavszekvenciáját, amelyből ilyen ODN származhat, megadjuk 13. azonosítószámú szekvenciaként.
A találmány szerinti megoldás más erdősszervesetekben, például emberekben való alkalmazására a terápiás hatású antiszensz ODrt-ek a célfajból származó IGFSP-S-gén megfelelő· helyeiről származnak. Emberek esetén például az IGFBF-ö** gén szekvenciája ismerfc (Elefér és Ktsai., Biochem. Siophys. 'Rés. Commun.. 176, 219 (1991), humán szekvencia nyilvántartási szama M65062, és James és mtsai., J. Siói. Chem. 258, 22305 (1993), egéreredetű szekvencia nyilvántartási száma 1.12447] . A. 10. ábrán bemutatjuk néhány antiszensz ODN helyzetét, melyeket teszteltünk XGFBP-5-expreszszió gátlására emberekben, amelyek közül a 3. azonosítószámú szekvenciával rendelkező a leghatékonyabb. Ez az ODN átfed humán IGFBP-5 transzlációs iniciációs helyével. Az egér-modell esetén leírtakhoz hasonlóan, más .humán, terápiás hatású, antiszensz ODN-t ís lehet alkalmazni, például olyanokat, amelyek valamivel hosszabb vagy valamivel rövidebb ODN—fajták (például 15-30 nukleotidból állnak), és átfednek a transzlációs iniciációs hellyel, vagy annak közelében helyezkednek el ('például 4. azonosítószámú szekvencia), valamint olyan ODN-eket, amelyek átfednek a transzlációs terminációs hellyel, vagy annak közelében helyezkednek el {például 1Ö„ .azonosítószámú szekvencia) . Közepes hosszúságú ODN-ek is hatékonyak lehetnek, és szkrinelni lehet .azokat arra nézve, hogy képesek-e kellő mértékű IGFBP-5gátlást biztosítani a példákban leírt expressziős vizsgálati eljárás alkalmazásával. Az antiszensz ODN találmány szerinti megoldásban történő alkalmazásra való szelektálásakor kívánatos, hogy elkerüljünk lényegi komplemanierítást más IGFBP-kel, mivel ezen más fehérjék expressziéjának gátlása, nemkívánatos mellékhatásokhoz vezethet.. Humán IGFBP-5 teljes szekvenciáját, amelyből .más antiszensz ODN származhat, megadjuk 14. azonosítószámú szekvenciaként.
15-6 6. azonosí« * ««*» 9 * Φ X >
XX* ♦ *** * * * «« 5«*
1Ο· fcós zárná szekvenciaként felsorolunk további antiszensz ODN'szekvenciákat# Melyeket humán ISF3P~5-szekvenciából kiindulva terveztünk ·.
Az alkalmazott ODN-eket módosítani lehet az öDN ín vivő stabilitásának fokozása céljából. Például az ODN-eket foszforotíoát—származékok. formájában lehet alkalmazni (hidat nem képező foszferil-oxigénatomok helyettesítése- bánat ómmal), amelyek fokozott rezisztenciát mutatnak nukleázos emésztéssel szemben» Fokozott ODN-stabilitást 2-metozietil-szubsztituált vázzal rendelkező molekulák alkalmazásával is el lehet érni.
Antiszensz ODN-eket különböző/ szakember által ismert mechanizmusok alkalmazásával lehet beadni# például önmagukban vagy gyógyászatilag elfogadható hordozók formájában. Antiszensz ODN célba juttatására alkalmas lipídhordo-zókat leírnak például az 5f855#9ii. és az 5#-41?#S7S. számú OSAbel.i szabadalmi leírásban# melyet a kitanítás részének tekintünk. Antíszensz ÖDR~t általában beadhatunk intravénásán# intraperítoneálisan#· szubkután vagy orálisan.
A beadott antiszensz ODN mennyisége akkora# ami hatékonyan képes IGBFP-S-ex.pr ess siót gátolni mellrák- vagy prosztatasejtekbe.ru Nyilvánvaló# hogy ez a mennyiség változhat az alkalmazott antiszensz. ODN hatékonyságától és az alkalmazott hordozó természetétől függően. A megfelelő mennyiséget szakember képes meghatározni bármelyik adott készítményre nézve# standard tesztsorozatok tervezésén keresztül# a megfelelő terápiás színt becslése céljából.
« ««X« X* *« í« * x e X » « * φ 9 9» 3Í «*:« * * # # ♦' **· X «* «*·« »♦*
A találmány szerintx, prosztata- vagy mellrák kezelésére szolgáló eljárásban beadhatunk továbbá kemoterápiás ágenseket és/vagy további, különböző célpontokra irányuló antiszensz öW-eksfc·. Például hagyományos kemoterápiás ágenseket# például taxolt {paclitaxeit vagy docitaxelt) és mitoxantront lehet alkalmazni. Ehhez hasonlóan# antiszensz IGFBP-5—ODN-t más antiszensz ODN-fajtákkal# például antiszensz 8c.l-2-0DN-eI vagy TRPM-2~0DN~el kombináclóban lehet alkalmazni.
A. találmány szerinti megoldást a továbbiakban az alábbi példákra hivatkozva ismertetjük.
„ példa
Shionogi-tumormodéiIben kisárieteket végeztünk egéreredetű emlőkarcinómából származó# SC-115 AD# transzplantálhatő# Toronto-alvonálhoz tartozó sejteket alkalmazva# és 5% hőinakfcivált# magzati borjűszérummal kiegészített# Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegben {Life Technologies# Inc.# Gaithersbnrg# MD) tartottuk fent. Tn vivő kísérletekhez körülbelül 5 x ICC Shionogi-karcinómasejtet injektáltunk szubkután kifejlett DD/S--törzshöz tartozó egerekbe» Amint a Shionogi-tumorok mérete elérte az 12 cm átmérőt# rendszerint. 2-3 héttel az injektálás után# alhasi metszés alkalmazásaval kasztrálást végeztünk# metoxiflarán-anesztézia alatt. Az. egerek és a tumorkészlet fenntartását# és as operáció, műveletét korábban már leírták (Bruchovsky és mtsai.# Cancer Rés... 50, 2275-2282 {1990};
Kennie et al.# Cancer Rés. 48# 6309-6312 (1988) ; Bruchovsky ésmtsai., Coli 13# 272-280 {1978}j.
« ** 4* ΦΦΦΦ «ί Λ Λ « β> * * φ ίφφ Φ β « Φ Φ Φ φΛ* * ΦΦ Φβ#φ ΦΦΦ
Az egereket random szelektáltuk rágcsálóból szárnzó, antiszensz f oszf ©rőt Ioát~IGFBP-5-O.DN fi. azonositószámú szekvencia) vagy ne® párosodó bázist tartalmazó („mismatctA) , kontroll ODN (GACCACGCTCATGACCAT: 1.2. azonosítószámú szekvenciával rendelkezett) alkalmazásával végzett kezeléshez# ez utóbbiban két bázis különbözött az antiszensz 1GFBP-5—ODK-től. Az egyes kísérleti csoportok 8 egeret tartalmaztak. A kasztráció napjától kezdve, 15 mg/kg antiszensz JGFBB-5-t vagy se® párosodó bázist tartalmazó·, kontroll ODN-t injektáltunk intraperitoneálisan, naponta egyszer minden egérbe, 50 napig, A tumortérfogatót hetente kétszer mértük, és az alábbi .képlet szerint számítottuk:
hossz X szélesség X mélység X 0,5236 (Gleave# Cahcer Rés. 52, 1538-1605 (1.992) } . Az adatok ábrázolása: átlagos tumortérfogat + standard deviáció.
A kísérlet eredményeit bemutatjuk az 1. ábrán. Antiszánsz IGFBP-S-ODN-es· kezelés késleltette AJ-tumorok· kiújulását a nem párosodó bázist tartalmazó kontroll ODN-es kezeléshez képest. Bár az Al-tumorok kiújultak valamennyi egérben, mindkét csoportban a kaeztráció után 60 napig tartó megfigyelési időszak alatt, az első tapintható Al-kiújulás átlagos ideje 25%-al növekedett, 28. napról 35. napra azokban az egerekben, amelyeket antiszensz IGFBP-5—ODN-el kezeltünk, a nem. párosodó bázist tartalmazó kontroll ODN-es kezeléssel szemben. Az egereket akkor pusztítottuk el, amikor tumortömeg 3 osr-nél nagyobb lett, vagy elérte a testtömeg 10%~át. Kiújult Al-tumorok növekedése lényegi módon gátolva volt antiszensz IGFB.r-5-GDN-ei kezelt csoportban, a
IS «»» nem párosodó bázist tartalmazó kontroll ODN-es kezeléshez képest. Az elpusztítás ideje szignifikánsan, meghosszabbodott az antiszensz IGF3P~S~0DN~el kezelt csoportban, átlagosan 53 nap múlva valamennyi, állatot elpusztítottunk abban a csoportban, amelyet nem párosodó bázist tartalmazó kontroll ODrt-el kezeltünk, míg az antiszensz IGFBP-5-0DN-el kezelt csoportban a 8 nyolc közül 1 egeret pusztítottunk el 50 nap után ,{p<ö,05|..
2. példa
Annak vizsgálata, céljából, hogy az ODN-kezeiés milyen hatásokat képes kifejteni IGFBP-5-m.RNS mennyiségére, Northern-blot-anaiizist végeztünk egerekből származó Shionogl-tumorszöveten. Az egereket naponta egyszer kezeltük 15 .mg/kg antiszensz IGFBF-5-ODN (n-3) vagy nem párosodó bázist tartalmazó, kontroll (n-3) íntraperitoneáiis injektálásával, a kasztráció napjától kezdve. A kasztráció utáni negyedik napon a tumorszöveteket eltávoiitottuk, és Northern-blot alkalmazásával analizáltuk IGFBP-5-mRNS-re. Antiszensz iGF8P~5-OB.N beadása 61% csökkenést, eredményezett az IGFBP-5-mRNS mennyiségében Shionogí-tumorokban, nem párosodó bázist tartalmazó, kontroli ODN-el kezelt tumorokhoz képest :{2. ábra}.
3. példa
Antiszensz TRFK-2-0DN (I. azonosítószámú szekvencia; szekvenciaszelektivitását igazoltuk IGFBP-S-mRNS-e^presszíó mértékének összehasonlításával in vítro fenntartott Shionogi-tumorsejtekfoen, különböző mennyiségű antiszensz IGFBF-S-C-DN-el vagy nem párosodó bázist tartalmazó kontroli
Ο
ODN-el (12. azonosítószámú szekvencia) való kezelés után. Az OBN~ek sejtek általi felvételének elősegítése céljából az OW-eket kát ionos lípidhordozóban (Lipofectin™, Life Technologies, Inc.) szereltük ki. A sejteket kétszer, két napos időtartamban kezeltük az alábbi eljárás szerint. A sejteket 20 percig edőínkubáituk 4 gg/ml lipoíektínnel, szérummentes OPTI-MEIü'^-ben (Life Technologies, Inc.), és azután a kiválasztott koncentrációjú ODN~t és lipofektint tartalmazó tápközegben Inkuháltuk 4 óra. hosszáig. A tápközeget azután standard tenyésztő tápközegre cseréltük, az 1. példában leírtak szerint.
A sejtekben lévő IGFSF-5-mRNS mennyiségét Northernbiot-analizissel értékeltük ki. A 3. ábrán bemutatottak szerint, Shionogi-sejtek kezelése napi 50, 100, 500 vagy lööO nM antiszensz lGFBP-5-OBh-eI (1. azonosítószámú szekvencia) dózisfüggő módon csökkentette a IGFBP-5-mRhS mennyiségét, ö, 7, 54 vagy 831-kal, sorrendben. Ezzel ellentétben, IGFBP-S-mRhS mennyiségét nem befolyásolta ne® párosodó bázist tartalmazó („mismatchi) ODN (3. azonos!tószámú szekvencia), bármilyen alkalmazott koncentrációban, Tehát az antiszensz IGFBP-S-ODN látszólag szekveneíaspecifikas.
Antiszensz IGFBP-5-ODN spécifífásának további analizálása céljából Northern-blot kísérletet végeztünk azután, hogy Shionogi-tumor sej tékát kezeltünk 1 pH antiszensz IGFBP-5-GDb-eI (1. azonosítószámú szekvencia) abból a célból, hogy meghatározzunk olyan más IGFBF-gének (IGFBP-2, -3 és -4-gének) expressziójában bekövetkezett változásokat,
I '»♦ amelyek szignifikáns szekvencxahomológxát mutatnak. IGFBP-5el. Antiszensz IGPSP-S-ODN határozottan csökkentette IGFSF5-mBNS expressziőjának mértékét, de nem figyeltük meg, hogy hatással lenne IGFBP-2, -3 és -4 expressz iájának mértékére. Összefoglalva, ez adatok azt mutatják, hogy ezekben a vizsgálatokban alkalmazott, antiszensz IGFBF-S-C'BF célgénjének szekvenciaspecxf ikus, g-énspeci fi kus és dózis-függő leszabályzását képes indukálni.
Antiszensz IGFBP-5-ODN sejtproliferációra kifejtett hatásainak meghatározása céljából, Shionogi-tumo-rsejteket kezeltünk naponta egyszer, 1 μΜ antiszensz IGFBP~5~el vagy nem párosodó bázist tartalmazó („mismatch} , kontroli ODNel két napig, és meghatároztuk a sejtssámot 72 órás időtartam alatt. A sejtek antiszensz IGFBP-5-ÖDN~es kezelése Shionogi-tumorsejt-proliferáció szignifikáns gátlását -eredményezte ebben a 72 órában, mig a sejtnövekedést nem befolyásolta nem párosodó bázist tartalmazó („mismatch}, kontroll ODN-es kezelés.
Antiszensz IGFBP-S-ODN sejtproliferációra kifejtett hatásait dózisfüggőnek is találtuk 100 és 1000 nM közötti koncentrácíótartományban (5, ábra). Ezek az antiproliferativ hatások közvetlenül összhangban vannak IGFBB-5-mRFS mennyiségének antiszensz IGFBP-5-ODN által kiváltott csökkenésével S-hxonogi-tumorsej tekben. Ezzel ellentétben, nem figyeltünk meg sejtproliferációra kifejtett szignifikáns hatást nem párosodó bázist tartalmazó („mlsmatch}, kontroll OEO-es kezelés eseten, egyik, alkalmazott koncentrációbán sem.
Annak a lehetőségnek kizárása céljából, hogy antiszenss IGFBP-5-ODN sejtpusztulást okozó faktorként hat, apoptózis indukálásán keresztül, megszámoltuk az élő és elpusztult sejteket antiszensz ODN-t vagy nem párosodó bázist tartalmazó IGFBP-ODN-t alkalmazó kezelés után. .Megszámoltuk az élő és elpusztult Shionogí-sejteket *tryptan-biue alkalmazásával, 48 órával ODN-kezelés után, és kiszámítottuk az elpusztult/összes sejt arányát. Minden egyes vizsgálati eljárást három párhuzamossal végeztük. Az elpusztult sejtek és összes sejtek számának megfigyelt aránya antiszensz ICFBP-S-ODN-el kezelt, sejtek esetén szignifikánsan különbözött a nem párosodó bázist tartalmazó („mismatch}, .kontroll O'DN-el kezelt sejtekétől {€. ábra) . Ezért antiszensz IGFBP-5-0DN-es kezelés után a sejtszámban, tapasztalt különbség nem fokozott mértékű apoptózis eredménye.
Ida
IGFBP-5- és IGF-l között, Shionogi-tumorsejt-növekedés szabályzásában fennálló összefüggés analizálása céljából, antiszensz IG F8.P- 5 - ODN -kezelés Shi ono gi -1 umo r s e j t -p r ο 1 i f e rációra kifejtett hatásait elemeztük anti-lSF-l-ellenanyagok és/vagy rekombináns IGF-1 alkalmazásával. Az első kísérletben antiszensz IGFBP-S-ODN, anti-IGF-l-ellenanyag (üpstate· Biotechnology, Laké Piacid, NY) és/vagy rekombináns l'GF-1 (Sigma Chemical Co., St. Louís, MO) Shionogitumor sej t-novekedésre kifejtett, in vitro hatásait, vizsgáltuk korábban leírt (Mi.yake és mtsai., Oncogene 16, 933-94 3 (1938)] MT? vizsgálati eljárás alkalmazásával.
5. péJ
Röviden összefoglalva, 1 χ lö4 sejtet szélesztettünk 96 tenyésztőhelyet tartalmazó mikrotiter-tálcára, és egy éjszakán át hagytuk letapadni. A sejteket azután naponta egyszer kezeltük különböző koncentrációjú ODN-ei, 2 napig, 5 riM re'komfoináns IGF-l-et. vagy 10 gg/mi anti-IGF-l-ellenanyagot tartalmazó tápkőzegben. 48 órával az ODN-kezelés után, 20 pl, PBS-ben oldott 5 mg/ml MTT-t (Sigma Chemical. Co.}· adtunk az egyes tenyésztőhelyekhez, azután 4 óra hosszáig inkubáltuk 37°C~on. Azután formazan-kristályokat feloldottunk dimetilszulfoxidban. Az optikai sűrűséget mikrotenyészetek leolvasására alkalmas tálcaleolvasóval (Beetón Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) határoztuk meg, 540 nm-en. A százalékos túlélés meghatározása céljából, az abszorbancia-értékeket azokra az értékekre normálizáitűk, amelyeket a vivőanyaggal kezeit sejtekre kaptunk. Minden egyes vizsgálati eljárásban három párhuz aaos t ál 11 tót tünk. ös sze.
A 7. ábrán bemutatottak, szerint, rekombináns 1GF-1 fokozta Sh.íonog.í-tumor sejtek proliterációjának mértékét, mig anti-.IGF-l .semlegesítő ellenanyagok 60%-al gátolták a Shionogi-sejtnövekedést. Továbbá, a sejtproiiferáció gátlása antiszensz IGFBP-S-ODK-et alkalmazva képes megfordítani exo-gén rekombináns IGF-l-kezelés hatását. Antiszensz IGF3P5-ODN beadása anti-IGF-l semlegesítő ellenanyaggal együtt nem eredményezett plusz gátló hatásokat ahhoz képest, amit anti-IGF-1 semlegesítő ellenanyagok egyedül alkalmazva elérnek. összefoglalva, ezek az eredmények alátámasztják azt, hogy IGFBP-5 LGF-l-függő hatást képes kifejteni a sejtprolíferáciőra.
Mivel ΜΑΡΚ az XGF-l-szignáltranszdukciós folyamatsor egyik leghatékonyabb tagja, mértük antiszensz TGFBP-5 és anti-IGF-1 semlegesítő ellenanyagok MAPK-aktivitásra kifejtett hatásait Shionogi-tumorsejtekben. Mitogén-akti vált féhérjeklnáz-afctivifást (MAPK) Shionogi-tumorsejtekben „MAP Kinase Assay Kit (New Sngland Biolabs, Beverly, MA) alkalmazásával mértünk. Röviden összefoglalva, a sejteket PBB-el mostuk, llzis-pufferben iizáltuk, ultrahanggal kezeltük és mikrocentrifugában centrifugáltuk 20 percig, 4®C/on. A felül úszókat 1:löö-hlgított anti-foszfo-MAPK-elIenanyaggal inkubáltuk 4 óra hosszáig. Azután hozzáadtunk Proteín-Aagaróz-gyöngyöket, és további 3 óra hosszáig inkubáltuk azokat. Az üledékeket kétszer mostuk jéghideg lízispufferrel, és kétszer mostuk kináz-pufferrel,. Az üledékeket 100' mM ATP-vsi és 20 mg/mi EX ki fúziós fehérjével (amely MAPK szubsztrátja) inkubáltuk 30 percig, 30eC-on. A mintákat forral tűk, elektrofc-rézissel elválasztottuk 10%-os S.DSpoliakri.lamid^gélben, és átvittük polivini 1 idén~difluoridmembránokra. A membránokat. 1 óra hosszáig inkubáltuk szobahőmérsékleten blokkoló pufferben, és azután próbaként 1: lOÖÖ-higított anti-foszfo-Elkl-ellenanyaggal inkubáltuk. Mosás után a membránokat 1: lööö-bígított tormából .származó peroxidázzal. konjugált, anti-nyúl ixmunoglobulinnal inkufoáltuk. A foszforílált Eik.l immunoreaktívitíását RCL-kérnilimineszcenci-ás reagenskészlet. alkalmazásával határoztuk meg.
MAPK-aktivításban megfigyelt változások visszatükrözték ezen ágensek sejtproliférádéban indukált változásait;
azaz antiszensz XGF3P-S~öD$ csökkentette- a MAPK- akti vitást, a MAFK-aktivítás antiszensz IGFBF-5-índukáit csökkenése visszafordítható volt rekombináns 1GF---Í~el, és antiszensz XGFBP-S nem fejtett ki plusz inhibitor-hatást fiAFK-aktívifcásra, ha IGF--1 mxtogén hatásait anti-XGF-l-ellenauyagokkal semlegesítettük.
ff. példa
Annak meghatározása céljából, hogy az IGFSP-5-expreszszió változásai milyen hatásokat képesek kifejteni a sejtciklus szabályzására, citometriás analízist végeztünk Shionogi-tumorsejteken. A vizsgálatot propidxum-jcdiddai festett sejtmagvak áramlási citometriás analízisével, végeztük, Miyake által korábban leírtak szerint (mint fent), Róvi den ö ss z efog!a1va, S hío no g í ~tumorsej te kefc szélesz tettünk S x lö* sejt/ff cm-es csésze sűrűségben, és a fentebb leírtak szerint kezeltük azokat. A sejteket ODN~es kezelés után triposinnel kezeltük 48 óra hosszáig, kétszer mostuk F3Seí, és 70%-os etanolban fixáltuk 5 óra hosszáig, 4
0/tzi i fixáit sejteket kétszer mostuk PBS-el, 1 gg/mi RHáz-A-va.1 (Sigma Chemical Co.) inkubáltuk 1 óra hosszáig, 37®C-on, és 5 pg/ml propídinm-jodiddal (Sigma Chemical Co.) festettük 1 éra hosszáig, szobahőmérsékleten. A festett sejteket relatív DNS-tartalomra analizáltuk FACScan TM készüléken (Bec-kton Dickinson La.bware) .
A 8. ábrán bemutatottak szerint, antiszensz XGFBP-5ODN-kezeléssel indukált 1GFBF-5 mennyiségi csökkenése a sejtciklus Gl-fázisban való leállításét eredményezte, ezáltal 50%-nal nagyobb mértékben csökkentette az 5 + G2/.M25 fázisban lévő sejtek arányát azokhoz képest, amelyeket bem párosodó bázist tartalmazó -(„mismatch), kontroll ODN-el keze1tünk.
Alkalmas antiszensz IGFBP-5-QBN~sze.kvencíák azonosítása céljából, humán terápiában való alkalmazásra, a humán IGFBP-5-gén 10 különböző helyére specifikus (9, ábra, 2-11. azonosítószámú szekvenciák), antiszensz. ODN-szekvencíát szintetizáltunk és teszteltünk arra vonatkozóan, hogy milyen mértékben, képesek csökkenteni JGFSP-5-gén expresszlójának mértékét PC3~jeiű, humán prosztatarák-sejtekben, és LNCaP/Tl-sejbekben (azaz stabilan transzfektált LNCaPsejtekben, .amelyek IGFBP-5-t tűXtermelnek) in vitro sejttenyészetben. Az eredményeket összefoglaljuk a 10. ábrán.. Amint látható·, a 3,, 4. és 10. azonosítószámú szekvencia aktív IGFBP-S-expresszió mértékének csökkentésére, közülük a 3. azonosítószámú szekvencia a leghatékonyabb. Ez a három szekvencia átfed vagy közvetlenül szomszédos a transzlációs in.iciáciős vagy terminációs hellyel.
SL példa
Metasztázisos prosztata- és mellrák gyakran behatol a csontszövetbe. Ilyen m-etasztázisok kezelése nagyon nehéz, és ha rák csontban kifejlődik, aligha prognosztizálható hosszú távú túlélés. Tehát kívánatos lehet olyan módszerekkel rendelkezni, amely képes gátolni vagy késleltetni ezt a fejlődést. Logikus feltételezni, hogy mivel IGF-l és ISF3P5 fontos faktorok IGF-X-szenzitív rák, például prosztataés mellrák növekedésében, nagy mennyiségű IGFBP-S jelenléte « * csontban fontos mechanizmus része lehet metasztázisos károsodások növekedésének és kifejlődésének elősegítésében. Ennék megfelelően, Western-analízíst végeztünk olyan primer humán csontszövetből származó mintákon, melyeket metasztázisos prosztatarákban szenvedő páciensektől vettünk. A kísérlet eredménye megerősítette nagy mennyiségű IGFBP-5 jelenlétét csontban.. Ennek gátlása antiszensz IGFBP-S-GDN találmány szerinti alkalmazásával minden bizonnyal hatékony terápiát biztosít metasztázisos károsodások kifejlődésének gátlására vagy késleltetésére csontban.
Szek ven cialista
| <210> | X |
| <211> | 18 |
| <2.12 > | DNS |
<213> egér
| <220> | |
| <221> | antiszensz I.G'FBP-5 oligodeoxíuukieotid |
| <222> | U) , (18) |
| <400> | 1 |
| gaccac | ;gctg atcaccat l.g |
| <210 > | 2 |
| <2H> | 18 |
| <212> | DNS |
| <2.13 > | .humán |
| <221 > | aut.iszensz IGFBP-5 oligodeozinukleotld |
| <222> | (1)..(18) |
| <4ÖO> |
gtcgcecect tt.acctcg χθ
| <21 ü> | |
| <211> | 18 |
<212>
| <213> | humán |
* ♦ _ ·'} Q .. fi * **♦
Λ. O “· « * * * » 0 fi * *» ** <220>
| <22.l> | anti szensz IGFBP-5 olígodeoxinukieotid |
| <222> | (1) . . US) |
| <4Ö0> | 3 |
cgcggtgagc aacaoeat
| <210> | 4 |
| <211> | IS |
| <212> | DNS |
| <213 > | huiaán |
<22Q>
| <221> | antiszensz IGFBP-S oligodeoxinukleotid |
| <222> | (1) . , (18? |
| <22I> | antiszensz IGFBP-S oligodeoxinukleotid |
| <222> | (1) . , (18? |
| <4 00 > | 4 |
aggtcatgcá gcagccgc 13
| 'CZ | |
| < 211 ö | 18 |
| <212> | DNS |
<213> humá
| <220> | |
| <221> | antiszensz 1GFBP-5 oligodeoxinukleotid |
| <222> | (1)..(18) |
| <220> | |
| <221> | antiszensz 1GFBP-5 oligodeoxinukleotid |
| <222> | m ..(is) |
| <4ÖÖ> |
gct cgeggtagctctttt 13
| <210> | 6 |
| <211> | 18 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <220> | |
| <221> | antiszensz Σί |
| <222> | (1) . . US) |
| <400> | 6 |
| .-A ·£“ Ί*· ζ·· | ;tgeg gtcctt-ct |
| <210> | *·< |
| <” Ο 1 | 1 & |
| χ j. . .JL | .1. í? |
| <212> | DNS |
| <2Ι3> | humán |
| <400> | 7 |
| tgcgtg | ggct ggctttga |
| <210> | 8 |
| < 211 > | 18 |
| <212> | |
| <213> | humán |
| <220> | |
| <221> | antiszensz IG |
| < 2 2 2 > | U) . . (18) |
| <400> | 8 |
e*~ φ φφ* ;g t ca a cg t a ct cc a £ g <
| <21ö> | 0 |
| < Z i 1 í | 18 |
| <212> | DNS |
| <2I3> | humán |
| <22 0> | |
| <221> | antiszensz IGFSP |
| <222> | (1) ..(18; |
| <4Q0> | 9 |
| aggggg | rtgag ggaaaggt |
| <210> | 10 |
| <211> | 18 |
| <212> | DNS |
| <213> | húrnál·; |
| <220> | |
| <221> | antiszensz IGFSP- |
| <222> | (1)..(13} |
| <4ÖO> | 10 |
| tcaaatagafc agatatat | |
| <210> | •t i Λ Λ. |
| <211> | 18 |
| < 2 2.2 > | DNS |
| <213> | humán |
| <220> | ||
| <221> | antiszensz. IGFSP-S oiigodeoxínukle | n t* Ί H w 4.- 6%A |
| <222> | (1)..(18) | |
| <4GÖ> | 11 |
;acaaaca cttccttc <211> 18 <212> DNS <213> egér <220>
<221 > '♦‘mxsmatch*’ kontroll <222> (1) . . (18) <400> 12 gaccacgetc atgaccat 1.8 <210> 13 <211> 3419 <212> DNS <2I3> egéreredetű ínzulins zerű növekedési faktor-kötő o-ro<400> 13 gcagtctctt tggaaacttc taaaagagct aggaaagagc tgcaaagctg tttgggcttt
| - 32 - | * * * * w * | |
| ttfccccccfct | tttgttcctt tttgttaccc cccccctcgg | tctgcaccct |
| tctecggact | 1 ,Λ X X V | |
| tcacgcagaa | cctgcgggtt tcgaagaggt ggtgacagag | caggtgttgg |
| ggtccaggtt | 180 | |
| tggtgaggtc | tgggtttttg ccctttttcc -cccctcgatt | tcaacatttt |
| ccegatettg | 240 | |
| ttgtcagccg | ccgacgcctc ttacctgfctc tgcggcagca | gegcagctgg |
| ccgctgagac | 300 | |
| cgagcggagt | ggggttgcgt tttagatttt aagcaaaggg | gggaaaatta |
| agcccaatcc | 360 | |
| atttttttct | tcacctcctc ccttttcaag gcctccaagc | taattatttc |
| tgtt.gct.ttg | 420 | |
| gagtgagcaa | ftctgtggtt ctctccacca ccacccccaa | ttctgacccg |
| atcccgcctg | 480 | |
| ggggtttcfca | c gg fcctocgc tcgcfcc tgcg tgcacc t ggc | gcgcctcttt |
| ttttcacccc | 54 0 | |
| caacctgttg | caagtcfctfca atccfccgcáa ttgggacttg | cgfcgcaggca |
| tctgaatcct | 600 | |
| •ccttgcctca | tafcttfcgcaa gtgfctfcgggg gagagcacct | gctctacctg |
| caagagattt | 660 | |
| aaaaggaaaa | aaatctccag gctccctctt tcfcccacaca | ctctcgctct |
cctg-ccccgc 720 cccgaggfcaa agc-cagactc cgagaaaatg gígafccagcg tggtcctcct rctgctggcc 780 gcetafcgccg fcaccggctca aggcctgggfe tctfctcgtgc actgtgaacc ctgcgacgag 840 aaagclctgt ccatgtgtcc ccccagccct ctgggctgtg agctggtcaa agagcccggc 900 ·>: 3
Φ *Φ ΦΦ φ-φ»Φ «φ Μ φ «ΧΦΦ χ « φφ* φ ·**Φ
X * * X * » % ΦΦ φχχ-χ- χ*·φ fcgtggcfcgcfc ctacacgga g cgctgcgccc gcfcgcacgcc ctgctgcacg aaccaagata agagactcfcc gacctactoe cccaaggtct ggctgtgaag aaggaccgca gaacactgcc caceeeagag cccetgccgc agacaeatgg gccccgtgct gtgfcacctgc taagcccfccc cgtggccgca gctgccgggc atggagtacg egtfcgagtga cgcgtcccct gccagcgccfc ccctccaccc atacatatat atttgaggaa geafcgaettg
960 agggttfcgcg
1020 gccgcggggt
1080 gggaacacga
1140 fc ccggcecaa
1200 gaaagaagct
1260 fccatccctgc
1320 aagcttccct
1380 ceaaefcgtga
1440 aacgtggcat
1500 tggatgggga
1560 cccttcctcc
1620 caggacgtca
1680 a ctg ag g a c. c.
cgccctggcg etgcctcccc ttgcctcaac ggaacccacc gcac se tcg c gacccagtcc accfcgagatg ccaggagttc ccgcaaagga ctgctggtgt ctttcagtgc ccctatccta ctcatttcat.
gagggacagt cggcaggatg gaaaagagct aectcegaga atttccgagc aagfcttgfcgg agacaggaat aaagccagcc tfcctacaaga gtggacaagt cacgccttcg cccccccagc ctcatttagg cgfcgtggcgt aggagaagcc acggcgagca tggctgaaga fcgaaggctga ggggtgcaga ccgaacaagg cacgcafcggt gaaagcagtg acggaatgaa acagcagtaa cccaactcca ctccccacca 1740 tcggaatctc tagcaagggc taaggagaca
| a a | * Φ ♦ w » | |
| tgaccccgga | aatgtattcc tttttgaagc aagttgaacg | gacaga-gaag |
| ggaaggagacf | 1800 | |
| aagaagcaag | agggagcgag agatggaaag aaagcaaagc | gttggaatag |
| aggaaaagag | 18 60 | |
| ggaaggacag | ataggattag agagagaaga gagaaaeagc | aaggcagaaa |
| ggactccaca | 1920 | |
| accaaggctg | aatefcgeeet tttgetttea gctctagcct | ggggteagaa |
| aaagtgtggc | 1980 | |
| attcagtgac | acccagttta gattggteaa. ggggagaaaa | gaaacaaggt |
| gtgtcagcgc | z v 4 0 | |
| ctctcgggtc | tgtcceefcee tgcagceagc agtgtggatg | gctagaecce |
| tcaccctcct | ·? ·? en íU. -k V | |
| ctcctcttac | ccaagtgcag ggtgatfctea tccccaaatt | tacaaagact |
| <A űLi£t;& B CÍ C éí. U B | 2160 | |
| ccatccctct | gaaaataaac aaaagtgagt gattgaagat | aggttttecc |
| ccagcagaca | 22 2 v | |
| agfcgaactca | gaatgtgtgc aaattttact cttgttaaag | atttttttaa |
| gaagteagta | 2280 | |
| cgcaccccca | acactggaaa gaettgatte tceagggtga | caagcaattc |
»»Φ φφ φ* » « φ φ X Φ Φ t *»« φ φφ« a ga a gcgcgt 234 0 ggctfccggcc cttgatttc-a ctagactcaa agctggcecg gcagcctctg tggaggagga 2400 tgagaggtgg agaaaaceaa ggggcttgta ctcacccaca agactccatg tagactttat 2460 aggca-tataa atctattttc tttacctttt tttccctttc cet t tett te gaagttttgc 2520 attacctctt taaagfcagtt ttttttagga cactgaagat cttcctca-tt ctgcgaaaaa 2530
| - 35 - | Φ Ί »♦* 4 | |
| tccatatttc | acaaafcacaa cccagaacgc eagefcfcggcc | tgcgtccagg |
| cagccfcrtcfc | 2640 | |
| cgtgagctac | aagtgfcggcfc' cfcfcfctgtgg-g -gcaccgatfct | ggatcfctctc |
| atgattccaa | 2700 | |
| acgtgtgttg | a a gtgaatcc accaagccag gtaacfcgcca | gcacccaagg |
| gtgcatcaag | 2760 | |
| tgcatagccc | aggtcacccc atttcagcct tccaacccgc | agaaagtaac |
| tgtctcacac | 2820 | |
| ca caccaca fc | aaaccfcg-cca gatccstctg taacccacfcg | gccfcgcccag |
| accfcfctrxtt | 2880 | |
| c c c a t c t g c a | fctfcttttttt tgaactgcafc fcttga-aagcc | fcccctcagafc |
| gccaggctga | 2940 | |
| cagatcagag | agaaacfcaac atgagagatg acagaggagg | aggaagfcgga |
| gggtgggggc | 3000 | |
| agagacttcc | acagagagac atagaagatg gagcagaggt | ctgggggtgg |
| ggaggacaag | 3060 | |
| aaaga-gacag | agagaggaaa afcaccaatag aattttcctt | ggtgtcfcccc |
| afcctaatcaa | 3120 | |
| ctctctgaga | fcttgagagga aaaagaaggc ag-gggaagaa | cttgaggta-g |
| aaafcgaggtc | 3180 | |
| agttcaagfcc | acagcjgccca gatggtgggfc aacfcgaggca | ggafcccaaaa |
| aaaatacfcfca | 3240 | |
| tgctfctttac | tggtgaaaca gafctgaaaaa aaaatfcgaac | aacaaaccag |
| tttgfcgaaaa | 3300 | |
| aaaaaaacgg | gaaaaaaaafc cac-cccgatg fcggaagagct | -cggctcctcfc |
| ttagcatfcfcfc | 3360 | |
| ggfcacfcfcaag | gaaataaaaa agaaaaacct -ggaagafccfcc | acattttatfc |
a c a aa g t g a 3419 nö v ek e dé s i f a k t o r - ke t ő <210>
<2ΐ;
161 ♦ «*«« *··» «Φ «*»* ♦ Φ * * ♦ Λ
Φ * ΦΦΦ Λ *»Φ φ X * Φ * .«« Λ Φ» ΦΦΦΑ »»♦
DNS fe urnán eredetű, i n z u 1 i ns s e r ü protein-5 <400> 14
| ctctcctgee | ccaccccgag | gtaaaggggg | cgacfcaagsg | aagatggtgt |
| tgetcecege | 60 | |||
| ggtcctectg | ctgctggccg | cetatgeggg | gccggcccag | agcctgggct |
| ccttcgtgea | 120 | |||
| ctgcgagecc | tgeg-aegaga | aagcectctc | catgtgcccc | cecagece.ee |
| tgggctgcga | 130 | |||
| gctggtcaag | gagccgggct | gcggetgctg | catgacctgc | gecetggccg |
| aggggcagte | 240 | |||
| gtgeggegte | tacaccgagc | gctgcgecca | ggggctgcgc | tgcctccccc |
| ggeaggacga | 300 | |||
| ggagaagccg | ctgcacgccc | tgctgcacgg | ecgcggggtt | tgcctcaacg |
| aaaagagcta | 360 | |||
| ccgegagcaa | gtcaagatcg | agagagaete | ccgtgagcac | gaggagccea |
| ccacctetga | /! ·<Χ v\ -X V | |||
| gatggccgag | gagacetact | cccccaagat | cttccggccc | aaacacacce |
| gcatetccga | 480 | |||
| getgaagget | gaagcagtga | agaaggaeeg | cagaaagaag | ctgacceagt |
| ccaagtttgt | 54 0 | |||
| cgggggagec | gagaacactg | cccacccccg | gateatetet | geacetgaga |
| tgagacagga | 600 |
| 37 - | X 4 * * ** * * | ||
| gtctgagcag | ggccccfcgcc | gcagacacat | g ga g g c tt c c c t gc a g g a gc |
| tcaaagccag | 660 | ||
| cccacgcatg | gtgccccgtg | ctgtgtacct | gcccaattgt gaccgcaaag |
| gafctctacaa | 720 | ||
| gagaaagcag | tgcaaacctf | cccgtggccg | caagcgtggc atct.gcfcggfc |
| gcgtggacaa | 780 | ||
| gtacgggafcg | aagctgccag | gcatggagta | cgfctgacggg gacfcfcfccagt |
| gccacacctt | 840 | ||
| cgacagcagc | aacgttgagfc | gatgcgtecc | cccccaaccfc fctcccfccacc |
| .ecetcccacc | 900 | ||
| cccagccccg | aefcecagcca | gcgcctccct | ccacccc a gg a cgccacfcca |
| tttcatcfcca | 960 | ||
| tttaagggaa | gaatatatat | cfcatctattt | gaggaaac tg aggaccfccgg |
| aatetetage | 1020 | ||
| aagggetcaa | cttcgaaaat. | ggeascaaca | gagatgcaaa aagctaaaaa |
| gacacccccc | 1080 | ||
| ccctttaaat | ggttttcttt | ttgaggcaag | tfcggafcgaa e agagaaggga |
| agagaggaag | 1140 | ||
| aacgagagga | aga gaaggga | aggaagtgtt | fcgfcgtagaag agagagaaag |
| acgaafcagag | 1200 | ||
| ttaggaaaag | gaagacaagc | aggtgggcag | g a ag ga c a fc g caccgagacc |
| aggcaggggc | 1260 | ||
| ccaactttca | cgtccagccc | fcggcctgggg | fc cg g g a ga gg tgggcgc fc a g |
aagatgcagc 1320 ccaggatgtg gcaatcaatg acactafctgg ggtttcccag gatgga-ttgg tcagggggag 1380 aaaggaaaag gcaaaacact ccaggacctc tcccggatct gtctcctcct ctacccagca 1440
3θ ««X JS β χΛΦ* ♦ * β> ® β «
Ifi «Φ* * ΦΦΧ φ φ φ φ X φφφ φ XX Χίί« ««♦ «ΦΦ gta-fcggacag ctggacccct gaacttcctc teetcttaec fcgggcagagt gttgtctctc 1500 cccaaattta taaaaactaa aatgcattcc attcctctga aagcaaaaca aattcataat 1560 tgagtgatat taaatagaga ggttttcgga agcagatctg tgaatatgaa at
1612 <210>
<211>
<21.2>
<213>
<220>
<221>
<222 >
<400>
0
DNS hur&án antíszensz 1GFBP-5 oligodeoxinukleotíd {1}..(20) tttttttttt ttttttcaaa
| <210> | 16 | |
| <211> | 20 | |
| <212> | DNS | |
| <213> | huiaán | |
| S Ο· Ο Λ % | ||
| <221> | antíszeasz IGFBP-2 | 5 oligodeoxinukleotld |
| <222> | UH.(20) | |
| <400> | 16 |
atgatagata tata11.111c2 0 ««#* 9* 9 9 999« «9 * « « * « 9«9 « «99
9 9 9 Μ
999 9 *9 «99« 999
| <210> | 17 |
| < 2 '11 > | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <22 Ö> | |
| <2.21> | antiszensz IGFBP- |
| <222 > | (1)-. (20; |
| <400> | 17 |
| c c fc t a a a t g a ga t ga a a fcga | |
| <210> | .18 |
| < 211 > | 2Q |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <22 0> | |
| <221> | antiszensz IGFBP- |
| <222> | (1).„{20} |
| <400> | IS |
| gtggcgt | •cet ggggtggagg |
| % Z11‘ s | 1 9 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
οΐi godeoxí mikleotid •<22Ö>
* »«« φφ Φ ΦΦ Φ «»>
| <221> | antiszensz | XGP8P-5 |
| <22 2 > | UJ . .. (20) | |
| <40 0> | 19 | |
| gaggcg | ctgg ctggagt | :cgg |
| <210> | 20 | |
| <211> | 20 | |
| < 212 > | DNS | |
| <213> | huxaán | |
| s 'Ύ'Χ ít x | ||
| v Zi U | ||
| <221> | antiszensz | IGFSP-S |
| <222> | í.1) . , (20) | |
| <40ű> | 20 |
ggctgggggt gggagggggt
| <210> | 21 |
| <211> | 20 |
| <212 > | DNS |
| <213 > | humán |
| <22 0> | |
| <221 > | antiszensz |
| <222> | (15 ..(20) |
| <40Ö> | 21 |
gagggaaagg ttgggggggg ♦ ♦
| <210> | 22 |
| Cl ΐ i 5- | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| χ ο 'Ά -x % 2 a v > | |
| <221> | antíssensr IGFBP-5 |
| <22 2 > | (1) . . (20) |
| <400> | 22 |
| acgcatc | ;act caacgttgct |
| <210> | 7? ü -2 |
| <2I1> | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <220 | |
| <221> | antiszensz IGFBP-5 |
| <222> | (1)..(20) |
| <400> | |
| acgcatc | acfc caacgttgcfc |
| <21Ö> | 24 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNS |
n urnán ο1ϊ godeoxinu kieotí d oli gcdeox inufcleot id ?0>
««
| <221> | antiszensz IGFBP-5 -ol.igodeoxínukleot.i.d |
| <222> | (1) .. . (20) |
| <400> | 24 |
gaaagtcccc gtcaa-cgtac 20
| <21 ö> | 25 |
| <211> | 20 |
<212>
| s .C.. a r | .humán |
<22Ö>
| <221> | antiszensz IG.FBP-5 oiigodeoxinukleotid |
| <222> | U) . . (20) |
| <400> | 25 |
tccatgc-ctg gcagcttoat
| <· O 1 Λ > < íU Λ V | 26 |
<211>
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
<220>
| <221> | antiszensz IGF5F-5 oiigodeoxinukleotid |
| <222> | ;1). ..(20; |
| <40ö> | 26 |
| cccntac | :tfca tccacacacc |
* Λ <210> 27 <211> 20 <212> DNS <2.13 > humán.
<220>
<221> antiszensz IGFBP-5 oligodeoxinukleotid <22 2 > (1),.(20) <4ÖQ> 27 acfcagatgcc acgct <210> 28
| <21I> | 2 0 |
| <212 > | DNS |
| <213> | humán |
| <220> | |
| <22I> | antissenss 1GFBF |
| <222> | il) . . (20) |
| <400> | 28 |
| ccacgg | gaag gtttgcactg |
| <210> | 29 |
| <2xl> | 2 0 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
ligodeoxinukleotid '•J f\ A.
:22 Ο >
| < 2 z i <222> <4Ö0> | antiszensz IGFBP (1) , .. (20) 29 |
| ctttel | tcttg atgaafccctt |
| <210> | 30 |
| <211> | 20 |
| <212 > | DNS |
| <213> | humán |
| <220> | |
| <221> | antiszensz IGFB?· |
| <22 2 > | (1;..(20) |
| <400> | 30 |
| tgcggt | :caca attgggcagg |
| <210> | 31 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <22 0> | |
| <221> | antiszensz IGFBP- |
| <222> | (1)..(20) |
<400> 31 eoxinukieo t i d
IGFBP-5 ol igodeoxinukieotíd ’C 3 C3C33 C3.C GC3QCJC3CC3. C.
* * * «· « « « ** *
| <210> | Oj. |
| <211 > | 20 |
| <2L2> | DNS |
| <213> | humán |
<22 0>
| <221 > | antiszensz 1GFBP-5 oligodsoxínuk.leot..id |
| <22 2> | (1) . . (20) |
| <4Ö0> | 32 |
gcgtgggct.g gctttgagct 20
| <210> | 33 |
| <21 1 ·> | 20 |
<212>
| <213> | humán |
<220>
| <221 > | antiszensz IGFBF-5 oligodeoxinukleotíd |
| <222> | (1) .,(20) |
| <4QQ> | 33 |
c c t g g a g g g a a g c c t c c a t g
| <210> | 34 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <220> |
* *
| <22I> | antiszéns | s IGFBP-S -oligo-deoxinukieotí |
| <222> | (1) , . (20) | |
| <400 | 34 |
tg tct gcggc aggggccctg
| <210 | 35 | |
| <211> | 20 | |
| <212> | DNS | |
| <213> | humán | |
| <220 | ||
| <221> | antiszensz | IGFSP™5 oiigodeoxinukleoti |
| <222> | (1)..(20) | |
| <400> | 35 |
;tcaga c t c c tgtct-catct
| <210> | 36 |
| <2x1 > | 20 |
| <212 > | DNS |
| <213> | humán |
| <22Ö> | |
| <221> | antiszensz |
| <222> | íl)..(20) |
| <4 Ö0> | 3 € |
| caggtgc | aga gatgat< |
| <21ö> | 37 |
| <211 > | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> <22 0> | humán |
| <22.1 > | antiszens |
| <222> | (Xí .... (20) |
| <400> | 37 |
ISPBF οΐί godeox inuk1eotí d gggtgggcag tgttctcggc
| <210> | 38 |
| <211 > | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <220> | |
| <221> | antiszensz TG |
| <222> | (1) .. (20) |
| <400> | 38 |
| tccccc | gaca aacttggac- |
| <210> | 39 |
| <211> | 20 |
| <212 > | DNS |
| <213> | humán |
| <22'0> |
oligoáeoxinukleotid * fc 0 0
| <221 > | antiszensz IGFBP |
| <222 > | (!)..(20) |
| <4 00> | 39 |
| gggtc< | agctt ctttctg-cgg |
| <21ö> | 40 |
| S '‘Λ S t | •9 A |
| % 2 a 1 | |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <22 0> | |
| <221> | antiszensz IGF3P- |
| <22 2 > | (1) . .(20) |
| <40 0> | 4 0 |
| tccttcttca ctgcttcagc | |
| <210> | 41 |
| <211 > | 20 |
| v <1. i ,6 > | DNS |
| H l I MI SS S·' | |
| : i txiti ís x x | |
| <220> | |
| <221> | antiszensz IGFB.P- |
| < 2 r 2 z | (1).,(20) |
| <400> | 41 |
| cttcag | e t cg ga g a t gcg g g |
Φ χ·.« Χφ χφ«* ♦'* ♦ Φ X φ Φ X
| χ ♦ * ♦ * X φ Φ X Λ Μ *** * Φ ΦΦΦ φ Φφτχ 3 — * ♦ Φ Φ χ XX* ♦ Χ« «φφ | ||
| <210> | 42 | |
| <211> | 20 | |
| <212> | DNS | |
| <2Ι3> | ί ro ά r$ « . 5 \<\Λ.·.\Α λ Α | |
| <220> | ||
| <22.1 > | antiszensz IGFB.P | -5 eligodeoxinukXeotid |
| <222> | (1)..(20) | |
| <4 00S | 42 | |
| tgtgtt | tggg dcggaagatc | 2 Ö |
| <210> | 43 | |
| <211> | 20 | |
| <212 > | DNS | |
| V X a w» χ | humán | |
| <220> | ||
| <221> | antiszensz IGFBP- | - 5 ο 1 i go de © x i n u k 1 e© t i d |
| <222> | {1} , . (203 | |
| <4Ό0> | 43 | |
| ttggggí | jagfc aggtctcctc | 20 |
| <23.Ο> | 44 | |
| <23.3 > | 20 | |
| <212> | DNS | |
| <213> | humán | |
| <220> | ||
| <221> | antiszensz IGFBP- | •5 oXígodeoxlnukleotid |
»»*| <222> (1)..(20} <400> 44 ggccatetca gaggtggtgg 20
| <21 Q> | 45 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <220> | |
| <221> | antiszensz IGFBP-5 oligodeoxinukleotíd |
<222> (1)..(20} <400> 45 gctecfccgfcg ctcacgggag 20
| <210> | 46 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <220> | |
| <22.1> | antiszensz. IGF8P--5 oligodeox.inuki.eoti |
| <222> | (1} . . (20} |
| <400> | 4 6 |
| tetetct | .caa tettqacttg |
X
ΦΦ«Χ χ* *Φ «*»» * Φ * Φ φ X * 4 »«χ.
* Φ * * ♦ X χ· χ Φ φ φ Φ Φ χ <210> 47 <211> 20 <212> DNS <213> humán <220>
<221> antiszensz IGFBP-S oligo-deoxinukleotiá <222> (!) . . {20} ;400>
| ctcgcgc | jtag ctcttttcgt | 2. U | |
| <210> | 48 | ||
| <21Γ> | 20 | ||
| <2!2> | DNS | ||
| <21 3> | humán | ||
| <220 | |||
| <221 > | antiszensz IGFBP-5 oligode | :-oxinukleotid | |
| <222> | (1) . .(20) | ||
| <400 | 48 | ||
| tgaggca | .aac cccgcggccg | 20 |
| <210 | 49 |
| <2.1.!> | 20 |
| <2.12 > | DNS |
| <2.13 > | humán |
| <220> |
ffff*» ♦ *»ff * * ffffff * * ff * ff-ff » ff x* «x»v <221> antiszensz IGFBP-5 oligodeQxiuukleotid <222> (1)..(20) :400>
tgcagcaggg cgfcgcagc gg <211> 20 <212> DNS <213> humán <220>
<221> antiszensz IGFBP-5 oiigodeoxinukleotid <222> (1)..(20) <400> 50 : t fc c fc ce t cg t-cc t gccggg '7 írt z. VJ <210>
<211>
<212>
DNS <213> humán <220>
<221> antiszensz <222> (1)..(20) <400> 51 ΐ G FB P-5 öli godeoxinukleot id ggaggcagcg cag c ccctgg #» X» «Ο* * » » « ««« 0 ¢#¢,
-~·
| <2Xö> | £.* |
| <2'11> | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <220> | |
| <221> | antiszensz l'GFBF |
| <222> | ch..(20) |
| <400> | 52 |
| gcgcagcgct ogg tgtagac | |
| <210> | 53 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <220> | |
| <221 > | antiszensz. J.GFBP- |
| <222> | (1),.(20) |
| <400> | 53 |
| gccgca | cgac tgcccctcgg |
| <210> | 54 |
| <211> | 20 |
| <2X2> | DNS |
| <213> | humán |
öligodeoxínuklao ti d ólig odeoxinuk1eot id antiszensz IGFSF-5 olioodeoxinukieotid '9? .<·>
ΦΦ Φ ♦* 0 <222>
<4Ό0> 54 cctgggcgca ggtcatgcag
| <210> | 55 | |
| <211> | 20 | |
| <212 > | DNS | |
| <213> | humán | |
| <220> | ||
| <221> | antiszensz 1G | FB2- 5 o 1.1 godeox1 nuki eo t1 d |
| <222> | (1).,(20) | |
| <4Ö0> | 55 |
cagccgcagc ccggct.ee1t <21 ö>
<211>
<212> DNS <213> humán <22 0>
<221> antiszensz <222> (1)..(20) <400> 56
-y χ<ί·χ r\ C ...
ibs or~;> O ligodeoxinukleotid gaccag c t c g c ag c c ca.ggg *
| <210> | 57 |
| <21Ι> | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <220> | |
| <22 ϊ> | antiszensz IGFBP-- |
| <22 2 > | (1)..(20) |
| <400> | 57 |
| ggct gggggg gca cafcggag | |
| <210> | 5S |
| <211> | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <22 0> | |
| <221> | antiszensz IGF3P- |
| <222> | (1)..(20) |
| <40ö> | 58 |
| agggct | fc'fcct cgfccgcaggg |
| <210> | 59 |
| A | |
| Z .·. X | «£ V |
| <212> | DNS |
| <213 > | humán |
| <22 ö> |
X. X
| <221> | antíszánsz IGFSP-5 old | 3odeoxinu k1se t í d |
| <222> | (1),.(20) | |
| <400> | 59 |
ctcgeagtgc aegaaggagc 20
| <210> <211> | 60 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | hncár |
<220>
<221> antiszensz IGFBP~5 oligodeoxinukleotid <222> UH. (20) <4G0> 60 ccaggctctg ggccggccce
| <210> | 61 |
| <211 > | 2 0 |
| <212> | DNS |
| <213> | hunián |
<22 0>
<221> anxissensz 1GFBP~5 oligodeoxinukleotid <222> (1)..(20) <400> 61 gcataggcgg ccagcagcag <:
Q>
| <211> | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
| <220> | |
| <221> | antiszensz IGFBP-S |
| <222> | {li.. (20) |
| <400> | 62 |
| gaggacegeg gtgago aaca | |
| <21G> | 63 |
| <211> | 20 |
| i-vfc? r* | |
| <'2 X > | |
| <213> | humán |
| <220> | |
| <22 1> | antiszensz IGFBP-S |
| <222.> | (1) . . (20) |
| <400> | 63 |
| ccatct | tete ttagfccgeoc |
| <210> | 64 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNS |
| <213> | humán |
oiigodeoxinukleotid öli g ode o.x i nukleoti d
SS # Λ * * * *♦* ♦
Λ 9 * ♦ ♦' * * ♦ *
* < ♦ »·♦9
| <22ö> | |
| <221> | ant |
| '/“i S\ x. <\ χ | (1) |
| <4 00> | 64 |
cetttacctc ggggtggggc <210> 65 <211> 20 <212> DNS
| <2I3> | humán | |
| <220> | ||
| <221> | anfciszensz IGE | B.P-5 oligodeoxinukleot id |
| <222> | (1) ., <20> | |
| < 4 0 0 > | 65 |
aggagagega gagtgcaggg :A
| <21ö> | 66 |
| < z 11 | 21 |
| <2I2> | DNS |
| <213> | húsúin |
| <22ö> | |
| <2? i > | antiszens |
| <222> | (!).. (21) |
| <4 00> | 66 |
gaccgcggtg agcaaeacca t « «X *Χ ·*4 φ ♦ · * ♦ * *«♦ .♦'*♦· ♦♦♦' χ * ♦ ♦
Claims (6)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1.. Készítmény, amely bormon-szabályozeit tatnersejtekbett íGPBP-S-expressziöt gátolni képes antiszensz oligonakleotidot tartalmaz, .amely cligonukteotid tnmbsazza a 3,, 4, vagy- IS, szonositőszámú szekvenciát (SEQ H>'NO: 3,4 vagy lö).•
- 2, Az 1. igénypont szerinti késsiteásty, hormon-szeíszitív femorsejtek kezelésében történő alkalmazásra, a bonnon-szenzltív tamorsejtek androgén-függeíien állapotba való kifejlődesáitek késleltetése útján.
- 3. Az L igénypont .szerinti készfenérty,. homon-reszponzfv rákban szenvedő egyénben bortnon-resrpisnziv rákbetegség kezelésére történő alkalmazásra, hortnort-inegvosásf követően, a bormon-reszponzív ráksejtek apoptoíikos sepptisztoiásának bdakálása céljából,
- 4. Az 1. igénypont szerinti késztímény, emiősszervezetber! IGF-l-szertziíív tumor meíasztázisos csonttá való kifejlődésének gátlására vagy késleltetésére történő alkalmazásra,
- 5. A 2-4,. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol a lamorsejtek prosztata eredetű tomorsejtsk.
- 6. Az 2-4. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, ahol a tnmorsejíck mellrák-sejtek.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14449599P | 1999-07-19 | 1999-07-19 | |
| PCT/CA2000/000853 WO2001005435A2 (en) | 1999-07-19 | 2000-07-19 | Antisense therapy for hormone-regulated tumors |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0201868A2 HUP0201868A2 (en) | 2002-12-28 |
| HU228465B1 true HU228465B1 (en) | 2013-03-28 |
Family
ID=22508861
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0201868A HU228465B1 (en) | 1999-07-19 | 2000-07-19 | Antisense therapy for hormone-regulated tumors |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7297684B1 (hu) |
| EP (1) | EP1200579B1 (hu) |
| JP (1) | JP5121106B2 (hu) |
| KR (2) | KR100779752B1 (hu) |
| AT (1) | ATE393220T1 (hu) |
| AU (1) | AU772480B2 (hu) |
| CA (1) | CA2375467C (hu) |
| DE (1) | DE60038680T2 (hu) |
| HU (1) | HU228465B1 (hu) |
| IL (2) | IL146565A0 (hu) |
| NO (1) | NO332388B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ516701A (hu) |
| WO (1) | WO2001005435A2 (hu) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPR633101A0 (en) * | 2001-07-13 | 2001-08-02 | University Of Sydney, The | Method |
| NZ577565A (en) * | 2001-10-09 | 2010-10-29 | Isis Pharmaceuticals Inc | Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expressions |
| US6750019B2 (en) * | 2001-10-09 | 2004-06-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression |
| AU2003237616B2 (en) | 2002-01-17 | 2007-07-05 | The University Of British Columbia | Bispecific antisense oligonucleotides that inhibit IGFBP-2 and IGFBP-5 and methods of using same |
| KR101117673B1 (ko) | 2002-08-21 | 2012-03-07 | 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 | 암-관련 단백질을 표적으로 하는 알엔에이아이 프로브 |
| ES2345330T3 (es) | 2002-10-02 | 2010-09-21 | The University Of British Columbia | Oligonucleotidos para el tratamiento del cancer de prostata y otros canceres. |
| US8722872B2 (en) | 2002-10-02 | 2014-05-13 | The University Of British Columbia | Compositions and methods for treatment of prostate and other cancers |
| WO2005030260A1 (en) * | 2003-10-01 | 2005-04-07 | The University Of British Columbia | Bispecific oligonucleotide for the treatment of cns malignancies |
| PT2444505T (pt) * | 2004-07-23 | 2017-01-13 | Pacific Edge Ltd | Marcadores urinários para a deteção de cancro da bexiga |
| WO2008106781A1 (en) | 2007-03-05 | 2008-09-12 | The University Of British Columbia | Treatment of squamous cell carcinoma with hsp27 antisense oligonucleotides and radiotherapy |
| JP5390179B2 (ja) * | 2008-12-24 | 2014-01-15 | 花王株式会社 | Ｉｇｆｂｐ−５発現抑制剤 |
| WO2010146059A2 (en) | 2009-06-16 | 2010-12-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2090702A1 (en) | 1990-08-28 | 1992-03-01 | Michael C. Kiefer | Insulin-like growth factor binding protein igfbp-5 |
| JPH06503947A (ja) | 1990-08-28 | 1994-05-12 | カイロン コーポレイション | Ｉｇｆｂｐ―５をコードする遺伝物質 |
| US5801154A (en) * | 1993-10-18 | 1998-09-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein |
| US6750019B2 (en) | 2001-10-09 | 2004-06-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression |
-
2000
- 2000-07-19 IL IL14656500A patent/IL146565A0/xx unknown
- 2000-07-19 NZ NZ516701A patent/NZ516701A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-07-19 CA CA2375467A patent/CA2375467C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-19 DE DE60038680T patent/DE60038680T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-19 KR KR1020027000686A patent/KR100779752B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-07-19 JP JP2001510523A patent/JP5121106B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-19 HU HU0201868A patent/HU228465B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-07-19 KR KR1020077003731A patent/KR100856475B1/ko active IP Right Grant
- 2000-07-19 US US09/619,908 patent/US7297684B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-19 AT AT00947725T patent/ATE393220T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-07-19 AU AU61445/00A patent/AU772480B2/en not_active Ceased
- 2000-07-19 EP EP00947725A patent/EP1200579B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-19 WO PCT/CA2000/000853 patent/WO2001005435A2/en active IP Right Grant
-
2001
- 2001-11-19 IL IL146565A patent/IL146565A/en active IP Right Grant
-
2002
- 2002-01-17 NO NO20020259A patent/NO332388B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP0201868A2 (en) | 2002-12-28 |
| DE60038680D1 (de) | 2008-06-05 |
| DE60038680T2 (de) | 2009-05-07 |
| KR100856475B1 (ko) | 2008-09-08 |
| NZ516701A (en) | 2004-11-26 |
| KR20070036180A (ko) | 2007-04-02 |
| US7297684B1 (en) | 2007-11-20 |
| JP5121106B2 (ja) | 2013-01-16 |
| NO332388B1 (no) | 2012-09-10 |
| WO2001005435A2 (en) | 2001-01-25 |
| KR100779752B1 (ko) | 2007-11-27 |
| CA2375467C (en) | 2013-10-29 |
| IL146565A0 (en) | 2002-07-25 |
| ATE393220T1 (de) | 2008-05-15 |
| EP1200579B1 (en) | 2008-04-23 |
| AU6144500A (en) | 2001-02-05 |
| IL146565A (en) | 2012-02-29 |
| WO2001005435A3 (en) | 2001-03-22 |
| CA2375467A1 (en) | 2001-01-25 |
| NO20020259D0 (no) | 2002-01-17 |
| KR20020033735A (ko) | 2002-05-07 |
| EP1200579A2 (en) | 2002-05-02 |
| JP2003504418A (ja) | 2003-02-04 |
| NO20020259L (no) | 2002-01-17 |
| AU772480B2 (en) | 2004-04-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Eder et al. | Inhibition of LncaP prostate cancer cells by means of androgen receptor antisense oligonucleotides | |
| US8580761B2 (en) | Bispecific antisense oligonucleotides that inhibit IGFBP-2 and IGFBP-5 and methods of using same | |
| HU228465B1 (en) | Antisense therapy for hormone-regulated tumors | |
| US20070253954A1 (en) | Epha4 As Therapeutic Target Of Prc And Pdaca | |
| WO2008102906A1 (en) | Hspc-hrpc transition genes | |
| JP4874503B2 (ja) | 前立腺及びその他の内分泌腺腫瘍治療のためのアンチセンス・インシュリン様成長因子結合蛋白質（ｉｇｆｂｐ）−２オリゴデオキシヌクレオチド | |
| US20160083798A1 (en) | Methods and uses involving genetic aberrations of nav3 and aberrant expression of multiple genes | |
| AU2001290920A1 (en) | Antisense insulin-like growth factor binding protein (IGFBP)-2-oligodeoxynucleotides for prostate and other endocrine tumor therapy | |
| US7491816B2 (en) | Antisense therapy for hormone-regulated tumors | |
| Liao et al. | Mechanisms for c-myc Induced Mouse Mammary Gland Carcinogenesis and for the Synergistic Role of TGF (alpha) in the Process | |
| De Biase | Molecular analysis of special type breast carcinomas |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |