WO2023234410A1 - 心筋細胞死の抑制剤及び心筋障害又は心不全の予防又は治療剤 - Google Patents

心筋細胞死の抑制剤及び心筋障害又は心不全の予防又は治療剤 Download PDF

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WO2023234410A1
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taok1
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inhibitor
myocardial
heart disease
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友哉 木谷
聖明 的場
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京都府公立大学法人
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Definitions

  • the present invention relates to an agent for suppressing myocardial cell death, an agent for preventing or treating myocardial damage or heart failure, and the like.
  • Adriamycin (doxorubicin) is widely used as a therapeutic drug for leukemia, breast cancer, etc.
  • adriamycin often causes cardiotoxicity (myocardial damage, heart failure), which may limit the continuation of treatment using this drug.
  • cardiotoxicity myocardial damage, heart failure
  • dexrazoxane For the cardiotoxicity of adriamycin, only dexrazoxane is approved by the US FDA as a therapeutic drug. However, dexrazoxane has carcinogenic effects and may reduce the anticancer effect of adriamycin.
  • TAOK1 is a serine-threonine protein kinase that is involved in the regulation of stress-responsive MAP kinase pathways including p38 and extracellular signal-regulated protein kinases (ERKs) and kinases (MEKs).
  • ERKs extracellular signal-regulated protein kinases
  • MEKs kinases
  • An object of the present invention is to provide an agent for suppressing myocardial cell death and an agent for preventing or treating myocardial damage or heart failure.
  • the present inventors have found that the above problems can be solved by using at least one component selected from the group consisting of TAOK1 function inhibitors and TAOK1 expression inhibitors. .
  • the present inventor conducted further research based on this knowledge and completed the present invention. That is, the present invention includes the following aspects.
  • Item 1 A cardiomyocyte death inhibitor containing at least one component selected from the group consisting of a TAOK1 function inhibitor and a TAOK1 expression inhibitor.
  • Section 1A A method for inhibiting myocardial cell death, which comprises administering to a subject at least one component selected from the group consisting of a TAOK1 function inhibitor and a TAOK1 expression inhibitor.
  • Section 1B An agent containing at least one component selected from the group consisting of TAOK1 function inhibitors and TAOK1 expression inhibitors for use in suppressing cardiac muscle cell death.
  • Item 1C Use of at least one component selected from the group consisting of a TAOK1 function inhibitor and a TAOK1 expression inhibitor for the production of a cardiomyocyte death inhibitor.
  • Section 1D Use of at least one component selected from the group consisting of TAOK1 function inhibitors and TAOK1 expression inhibitors for suppressing myocardial cell death.
  • Section 2. The inhibitor according to item 1, wherein the component is at least one selected from the group consisting of a polynucleotide targeting TAOK1, an expression cassette for the polynucleotide, a low molecular compound, a peptide, a protein, and an antibody.
  • the component is at least one selected from the group consisting of a polynucleotide targeting TAOK1, an expression cassette for the polynucleotide, a low molecular compound, a peptide, a protein, and an antibody.
  • Section 4 The inhibitor according to item 1, which is used to be administered in combination with an anticancer drug.
  • Section 5 The inhibitor according to Item 3 or 4, wherein the anticancer agent is an anthracycline anticancer agent.
  • Section 6 The inhibitor according to item 1, for use in the prevention or treatment of heart disease.
  • Section 7. The inhibitor according to Item 6, wherein the heart disease is at least one heart disease selected from the group consisting of myocardial disorder and heart failure.
  • Section 8 The inhibitor according to item 6, wherein the heart disease is a heart disease caused by anticancer drug treatment.
  • Section 9 A prophylactic or therapeutic agent for at least one heart disease selected from the group consisting of myocardial disorders and heart failure, which contains at least one component selected from the group consisting of TAOK1 function inhibitors and TAOK1 expression inhibitors.
  • Section 9A A method for preventing or treating heart disease, which comprises administering to a subject at least one component selected from the group consisting of a TAOK1 function inhibitor and a TAOK1 expression inhibitor.
  • Section 9B An agent containing at least one component selected from the group consisting of a TAOK1 function inhibitor and a TAOK1 expression inhibitor for use in the prevention or treatment of heart disease.
  • Section 9C Use of at least one component selected from the group consisting of TAOK1 function inhibitors and TAOK1 expression inhibitors for the production of a preventive or therapeutic agent for heart disease.
  • Section 9D Use of at least one component selected from the group consisting of TAOK1 function inhibitors and TAOK1 expression inhibitors for the prevention or treatment of heart disease.
  • Section 10 The preventive or therapeutic agent according to item 9, wherein the heart disease is a heart disease caused by anticancer drug treatment.
  • Section 11 Selected from the group consisting of an active ingredient of an inhibitor of myocardial cell death, or myocardial damage and heart failure, as indicated by the amount, concentration, or kinase activity of TAOK1 in a test sample derived from animals or cells treated with a test substance.
  • an agent for suppressing myocardial cell death and an agent for preventing or treating myocardial damage or heart failure can be provided. Further, according to the present invention, there is provided a method of screening for an active ingredient of an agent for suppressing myocardial cell death, or an active ingredient of an agent for preventing or treating at least one heart disease selected from the group consisting of myocardial damage and heart failure. You can also do that.
  • Test Example 1 An overview of screening for genes involved in doxorubicin-induced cardiomyocyte death (Test Example 1) is shown.
  • the survival rate of cardiomyocytes after doxorubicin treatment is shown (Test Example 2).
  • the vertical axis shows cell viability, and the horizontal axis shows doxorubicin concentration.
  • NTC KO indicates the use of non-targeting gRNA
  • TAOK1 KO indicates the use of gRNA targeting TAOK1
  • 1 and 2 indicate the use of different types of gRNA.
  • Figure 2 shows live cell/dead cell staining images of cardiomyocytes after treatment with doxorubicin (Test Example 2).
  • the survival rate of cardiomyocytes after doxorubicin treatment is shown (Test Example 3).
  • the vertical axis shows cell viability, and on the horizontal axis, C43 10nM shows the case treated with TAOK1 inhibitor (Patent Document 1: Compound 43) (final concentration 10nM), and Ctrl shows the negative cell not treated with TAOK1 inhibitor. Show control. The concentration at the time of doxorubicin treatment is shown above the graph.
  • An overview of Test Example 4 is shown. TAOK1 mRNA amount measurement results (left) and LVEF (left ventricular ejection fraction) (right) are shown (Test Example 4).
  • the horizontal axis shows the elapsed period after administration of AAV9-sh-TAOK1 targeting TAOK1 or non-targeting AAV-sh-Scramble.
  • the measurement results of oxygen consumption are shown (Test Example 5).
  • NTC KO indicates the case where non-targeting gRNA was used
  • TAOK1 KO indicates the case where gRNA targeting TAOK1 was used.
  • the legend shows the doxorubicin treatment concentration.
  • the horizontal axis shows the elapsed time from the start of the test, and the vertical axis shows the oxygen consumption rate. The arrow in the graph indicates the timing at which the drug shown above was added.
  • the measurement results of mitochondrial membrane potential (left graph, vertical axis) and active oxygen production amount (right graph, vertical axis) are shown (Test Example 6).
  • the horizontal axis shows the treatment concentration of doxorubicin (unit: ⁇ M).
  • the percentage of ⁇ H2AX-positive cells among troponin T-positive cells is shown (Test Example 7).
  • the vertical axis shows the percentage of ⁇ H2AX-positive cells among troponin T-positive cells.
  • NTC KO indicates the case where non-targeting gRNA was used
  • TAOK1 KO indicates the case where gRNA targeting TAOK1 was used.
  • the horizontal axis shows the doxorubicin treatment concentration.
  • the measurement results of the ratio of the amount of phosphorylated p38 to the amount of p38 are shown (Test Example 8).
  • the vertical axis shows the ratio of the amount of phosphorylated p38 to the amount of p38.
  • NTC KO indicates the case where non-targeting gRNA was used
  • TAOK1 KO indicates the case where gRNA targeting TAOK1 was used
  • DOX indicates the doxorubicin treated group.
  • the measurement results of cell viability are shown (Test Example 9).
  • the vertical axis shows cell viability.
  • the cell lines used are shown on the horizontal axis.
  • the siRNA used is shown in the legend.
  • a tissue staining image is shown (Test Example 10).
  • the siRNA used is shown on the left side of the photograph.
  • the type of staining is shown above the photographic image.
  • a cell staining image is shown (Test Example 11).
  • the presence or absence of hypoxic load is shown on the left side of the photographic image.
  • the siRNA used is shown above the photographic image.
  • the measurement results of the percentage of dead cells are shown (Test Example 12).
  • the vertical axis shows the percentage of dead cells.
  • the horizontal axis shows the siRNA used.
  • Identity of amino acid sequences refers to the extent to which two or more comparable amino acid sequences match each other. Therefore, the higher the similarity between two certain amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences.
  • the level of amino acid sequence identity is determined, for example, using the sequence analysis tool FASTA using default parameters.
  • the algorithm BLAST by Karlin and Altschul Karlin and Altschul (KarlinS, Altschul SF. “Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes” Proc Natl Acad Sci USA. 87:2264-2268 (1990), KarlinS, Altschul SF. "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences.” Proc Natl Acad Sci USA.
  • BLASTX has been developed based on the BLAST algorithm. Specific methods of these analysis methods are publicly known, and the website of the National Center of Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) may be referred to. Furthermore, “identity" of base sequences is also defined according to the above.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • conservative substitutions include substitutions between amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine.
  • amino acid residues with acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues with uncharged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, and cysteine
  • Amino acid residues with nonpolar side chains such as proline, phenylalanine, methionine, and tryptophan
  • amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine, and isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine. Substitutions between amino acid residues are also considered conservative substitutions.
  • nucleic acid and polynucleotide are not particularly limited, and include both natural and artificial ones. Specifically, in addition to DNA, RNA, etc., materials that have been subjected to known chemical modifications may be used, as exemplified below. To prevent degradation by hydrolytic enzymes such as nucleases, the phosphate residues of each nucleotide are replaced with chemically modified phosphate residues such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, etc. I can do it.
  • PS phosphorothioate
  • methylphosphonate methylphosphonate
  • phosphorodithionate etc. I can do it.
  • the hydroxyl group at the 2-position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is replaced by -OR (R is, for example, CH3 (2 ⁇ -O-Me), CH2CH2OCH3 (2 ⁇ -O-MOE), CH2CH2NHC(NH)NH2, CH2CONHCH3, CH2CH2CN, etc.) may be substituted.
  • R is, for example, CH3 (2 ⁇ -O-Me), CH2CH2OCH3 (2 ⁇ -O-MOE), CH2CH2NHC(NH)NH2, CH2CONHCH3, CH2CH2CN, etc.
  • the base moiety pyrimidine, purine
  • Further examples include, but are not limited to, those in which the phosphoric acid moiety or hydroxyl moiety is modified with biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group, or the like.
  • BNA LNA
  • LNA LNA
  • the conformation of the sugar part of the nucleotide is fixed to N-type by cross-linking the 2' oxygen and 4' carbon of the sugar part of the nucleotide, can also be used.
  • the present invention contains at least one component selected from the group consisting of a TAOK1 function inhibitor and a TAOK1 expression inhibitor. , an inhibitor of myocardial cell death, or an agent for preventing or treating myocardial damage or heart failure (herein sometimes referred to as "the agent of the present invention"). This will be explained below.
  • the TAOK1 gene is a gene encoding serine-threonine protein kinase.
  • TAOK1 (TAOK1 protein, TAOK1 mRNA) whose expression or function is to be suppressed is the expression product of the TAOK1 gene, and is the TAOK1 protein expressed in the organism or its cells (particularly cardiomyocytes) to which the agent of the present invention is applied.
  • TAOK1 mRNA TAOK1 mRNA. Therefore, the TAOK1 protein and TAOK1 mRNA to be suppressed also vary depending on the target biological species.
  • the biological species is not particularly limited, and includes various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer.
  • human TAOK1 protein includes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (NCBI Reference Sequence: NP_065842.1) and a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (NCBI Reference Sequence: NP_079418).
  • Human TAOK1 mRNA includes mRNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (NCBI Reference Sequence: NM_020791.4) and mRNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 (NCBI Reference Sequence: NM_025142). .1).
  • the TAOK1 protein and TAOK1 mRNA may also include the above splicing variants.
  • the TAOK1 protein to be suppressed may have amino acid mutations such as substitutions, deletions, additions, and insertions as long as it has its original property, that is, serine-threonine protein kinase activity.
  • the mutation is a substitution, and more preferably a conservative substitution, from the viewpoint that the activity is less likely to be impaired.
  • TAOK1 mRNA which is the target of suppression, does not contain base mutations such as substitutions, deletions, additions, or insertions, as long as the protein translated from the mRNA retains its original property, that is, serine-threonine protein kinase activity. Good too.
  • Preferable mutations include mutations that do not result in amino acid substitutions or mutations that result in conservative amino acid substitutions in the protein translated from the mRNA.
  • Preferred specific examples of the TAOK1 protein to be suppressed include the proteins listed in (a) below and the proteins listed in (b) below: (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2; and (b) a protein consisting of an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and a serine-threonine protein kinase. At least one type selected from the group consisting of proteins having activity is mentioned.
  • the identity is more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more.
  • an example of the protein described in (b) above is, for example, (b') an amino acid in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2. and a protein having serine-threonine protein kinase activity.
  • the plural number is, for example, 2 to 50, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10, and even more preferably 2 or 3.
  • Preferred specific examples of the TAOK1 mRNA to be suppressed include the mRNA described in (c) below and the mRNA described in (d) below: (c) mRNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4; and (d) mRNA consisting of a base sequence having 85% or more identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4, and a serine-threonine protein kinase. At least one type selected from the group consisting of mRNA encoding an active protein can be mentioned.
  • the identity is more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more.
  • mRNA described in (d) above is, for example, (d') a base in which one or more bases are substituted, deleted, added, or inserted into the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
  • mRNA that encodes a protein that consists of a sequence and has serine-threonine protein kinase activity can be mentioned.
  • the plural number is, for example, 2 to 150, preferably 2 to 60, more preferably 2 to 30, and even more preferably 2 to 10.
  • the active ingredient of the agent of the present invention is at least one ingredient selected from the group consisting of TAOK1 expression inhibitors and TAOK1 function inhibitors.
  • the components preferably include polynucleotides targeting TAOK1, expression cassettes for the polynucleotides, low molecular weight compounds, peptides, proteins, antibodies, and the like.
  • the TAOK1 expression inhibitor and the TAOK1 function inhibitor will be specifically explained below.
  • a TAOK1 expression inhibitor is one that can suppress the expression level of TAOK1 protein and/or TAOK1 mRNA expressed in an organism or its cells (especially cells of lung tissue) to which the agent of the present invention is applied. There are no particular restrictions as long as.
  • One type of TAOK1 expression inhibitor can be used alone, or two or more types can be used in combination.
  • TAOK1 expression inhibitors include TAOK1-specific small interfering RNA (siRNA), TAOK1-specific microRNA (miRNA), TAOK1-specific antisense nucleic acid, and expression cassettes thereof; TAOK1-specific ribozyme; TAOK1 gene using CRISPR/Cas system Examples include editing agents.
  • siRNA small interfering RNA
  • miRNA microRNA
  • TAOK1-specific antisense nucleic acid and expression cassettes thereof
  • TAOK1-specific ribozyme TAOK1 gene using CRISPR/Cas system Examples include editing agents.
  • expression suppression means that the expression level of TAOK1 protein, TAOK1 mRNA, etc. is reduced to 1/2, 1/3, 1/5, 1/10, 1/20, 1/30, 1/50, 1/100, etc. , 1/200, 1/300, 1/500, 1/1000, 1/10000 or less, and also includes reducing the expression level to 0.
  • siRNA, miRNA, antisense nucleic acid, ribozyme TAOK1-specific siRNA is not particularly limited as long as it is a double-stranded RNA molecule that specifically suppresses the expression of the gene encoding TAOK1.
  • the siRNA preferably has a length of, for example, 18 bases or more, 19 bases or more, 20 bases or more, or 21 bases or more. Further, the siRNA preferably has a length of, for example, 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, or 22 bases or less. It is envisaged that the upper and lower limits of the length of siRNA described herein may be combined arbitrarily.
  • siRNA may be shRNA (small hairpin RNA).
  • shRNA can be designed so that a portion thereof forms a stem-loop structure. For example, in shRNA, if the sequence of a certain region is sequence a, and the complementary strand to sequence a is sequence b, then these sequences exist in one RNA strand in the order of sequence a, spacer, and sequence b. It can be designed to have a total length of 45 to 60 bases.
  • Sequence a is a partial region of the target nucleotide sequence encoding TAOK1, and the target region is not particularly limited, and any region can be used as a candidate. The length of sequence a is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases.
  • TAOK1-specific siRNA may have an additional base at the 5' or 3' end.
  • the length of the additional base is usually about 2 to 4 bases.
  • the additional base may be DNA or RNA, but the use of DNA may improve the stability of the nucleic acid.
  • Sequences of such additional bases include, for example, ug-3', uu-3', tg-3', tt-3', ggg-3', guuu-3', gttt-3', ttttt-3. Examples include, but are not limited to, sequences such as ', uuuuu-3'.
  • the siRNA may have a protrusion sequence (overhang) at the 3' end, and specific examples include those to which dTdT (dT represents deoxythymidine) is added. Alternatively, it may have a blunt end without any terminal addition.
  • the sense strand and antisense strand may have different numbers of bases, for example, "asymmetrical interfering RNA" (where the antisense strand has overhangs at the 3' and 5' ends). aiRNA).
  • a typical aiRNA has an antisense strand consisting of 21 bases, a sense strand consisting of 15 bases, and an overhang structure of 3 bases at each end of the antisense strand.
  • the location of the target sequence of the TAOK1-specific siRNA is not particularly limited, but in one embodiment, the target sequence is selected from the 5'-UTR and up to about 50 bases from the start codon, and from a region other than the 3'-UTR. It is desirable to do so.
  • BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ) to confirm the specificity of the selected target sequence.
  • a sense strand with a 3'-terminal overhang of TT or UU at bases 19-21 after AA (or NA), a sequence complementary to the 19-21 bases, and a sequence of TT or A double-stranded RNA consisting of a UU strand and an antisense strand having a 3'-terminal overhang may be designed as siRNA.
  • siRNA which is a precursor of siRNA
  • an arbitrary linker sequence (for example, about 5 to 25 bases) that can form a loop structure is appropriately selected, and the sense strand and antisense strand are connected via the linker sequence. It can be designed by connecting them.
  • siRNA Target Finder from Ambion (http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html) Insert Design Tool for pSilencer® Expression Vector (http://www.ambion.com/ jp/techlib/misc/psilencer_converter.html) GeneSeer provided by RNAi Codex (http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi).
  • siRNA is produced by synthesizing the sense and antisense strands of the target sequence on mRNA using an automatic DNA/RNA synthesizer, denaturing them in an appropriate annealing buffer at about 90 to about 95°C for about 1 minute, and then It can be prepared by annealing at about 30 to about 70°C for about 1 to about 8 hours. Alternatively, it can also be prepared by synthesizing shRNA, which is a precursor of siRNA, and cleaving this using the RNA cutting protein dicer.
  • TAOK1-specific miRNA is optional as long as it inhibits translation of the gene encoding TAOK1.
  • miRNAs may pair with the 3' untranslated region (UTR) of a target and inhibit its translation, rather than cleaving the target mRNA as siRNAs do.
  • miRNA may be any of pri-miRNA (primary miRNA), pre-miRNA (precursor miRNA), and mature miRNA.
  • the length of miRNA is not particularly limited; pri-miRNA length is usually several hundred to several thousand bases, pre-miRNA length is usually 50-80 bases, and mature miRNA length is usually 18 ⁇ 30 bases.
  • the TAOK1-specific miRNA is preferably a pre-miRNA or a mature miRNA, more preferably a mature miRNA.
  • Such TAOK1-specific miRNA may be synthesized by a known method or purchased from a company that provides synthetic RNA.
  • a TAOK1-specific antisense nucleic acid is a nucleic acid that contains a base sequence that is complementary or substantially complementary to the base sequence of the mRNA of the gene encoding TAOK1, or a part thereof, and that is specific and stable to the mRNA base sequence of the gene encoding TAOK1. It is a nucleic acid that has the function of suppressing TAOK1 protein synthesis by forming a double strand and binding together.
  • the antisense nucleic acid may be DNA, RNA, or a DNA/RNA chimera.
  • the target sequence may be not only a sequence in mRNA but also a sequence in the intron region of the early translation product of the TAOK1 gene.
  • the intron sequence can be determined by comparing the genome sequence and the cDNA base sequence of the TAOK1 gene using a homology search program such as BLAST or FASTA.
  • the length of the target region of the TAOK1-specific antisense nucleic acid is not limited as long as hybridization of the antisense nucleic acid results in inhibition of translation into TAOK1 protein.
  • the TAOK1-specific antisense nucleic acid may be the entire sequence or a partial sequence of mRNA encoding TAOK1. In consideration of ease of synthesis, antigenicity, intracellular distribution, etc., oligonucleotides consisting of about 10 to about 40 bases, particularly about 15 to about 30 bases, are preferred, but are not limited thereto.
  • ' terminal hairpin loops and the like may be selected as preferred target regions for antisense nucleic acids, but are not limited thereto.
  • the TAOK1-specific antisense nucleic acid not only hybridizes with the mRNA and early transcripts of the TAOK1 gene and inhibits its translation into protein, but also binds to these genes, which are double-stranded DNA, to form a triplex. ) and can inhibit transcription into RNA (antigene).
  • TAOK1-specific siRNA, TAOK1-specific miRNA, TAOK1-specific antisense nucleic acid, etc. are obtained by determining the target sequence of mRNA or initial transcript based on the cDNA sequence or genomic DNA sequence of the TAOK1 gene, and then using a commercially available DNA/RNA automated It can be prepared by synthesizing a complementary sequence to this using a synthesizer. Furthermore, antisense nucleic acids containing various modifications can also be chemically synthesized by known techniques.
  • the expression cassette of TAOK1-specific siRNA, TAOK1-specific miRNA, or TAOK1-specific antisense nucleic acid is integrated in a state that can be expressed. There are no particular limitations as long as it is a polynucleotide.
  • the expression cassette is a polynucleotide comprising a promoter sequence and a coding sequence for a TAOK1-specific siRNA, a TAOK1-specific miRNA, or a TAOK1-specific antisense nucleic acid (and optionally a transcription termination signal sequence). , including other arrays as needed.
  • Promoters are not particularly limited, and include, for example, RNA polymerase II (polII) promoters such as CMV promoter, EF1 promoter, SV40 promoter, MSCV promoter, hTERT promoter, ⁇ -actin promoter, and CAG promoter; mouse and human U6-snRNA promoters; Examples include RNA polymerase III (polIII) promoters such as the human H1-RNase P RNA promoter and the human valine-tRNA promoter. preferable. Various drug-inducible promoters can also be used. Other sequences are not particularly limited, and various known sequences that can be included in expression vectors can be employed. Examples of such sequences include origins of replication, drug resistance genes, and the like. Furthermore, the types of drug resistance genes and vectors can be exemplified by those mentioned above.
  • a TAOK1 expression inhibitor includes a TAOK1-specific ribozyme.
  • ribozyme means RNA that has enzymatic activity to cleave nucleic acids, but in this application it also includes DNA as long as it has sequence-specific nucleic acid cleavage activity.
  • the most versatile ribozyme nucleic acids are self-splicing RNAs found in infectious RNAs such as viroids and virusesoids, and are known to have hammerhead and hairpin shapes.
  • the hammerhead type exhibits enzymatic activity with about 40 bases, and a few bases at both ends (about 10 bases in total) adjacent to the hammerhead structure are made into a sequence complementary to the desired cleavage site of mRNA. By doing so, it is possible to specifically cleave only the target mRNA.
  • This type of ribozyme nucleic acid uses only RNA as a substrate, so it has the advantage of not attacking genomic DNA. If the TAOK1 gene mRNA itself has a double-stranded structure, the target sequence can be made into a single strand by using a hybrid ribozyme linked to an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to RNA helicase.
  • hybrid ribozymes may be created in which a modified tRNA sequence is further linked to promote the transfer of transcripts to the cytoplasm.
  • the TAOK1 gene editing agent is not particularly limited as long as it can suppress the expression of the TAOK1 gene using a target sequence-specific nuclease system (eg, CRISPR/Cas system).
  • the expression of the TAOK1 gene can be suppressed by, for example, disrupting the TAOK1 gene or modifying the promoter of the TAOK1 gene to suppress the activity of the promoter.
  • a vector for TAOK1 gene editing
  • a vector for TAOK1 gene editing
  • a vector for TAOK1 gene editing
  • vector can be used, but is not limited thereto.
  • a combination of a vector containing a guide RNA targeting the TAOK1 gene or its promoter and/or its expression cassette, and a vector containing a Cas protein and/or its expression cassette can be used as a TAOK1 gene editing agent. It can be used as
  • the guide RNA expression cassette is not particularly limited as long as it is a polynucleotide used for the purpose of expressing the guide RNA in the target organism.
  • Typical examples of the expression cassette include a polynucleotide comprising a promoter and a coding sequence for all or part of a guide RNA placed under the control of the promoter.
  • "placed under the control of a promoter” means that the guide RNA coding sequence is placed so that transcription of the sequence is controlled by the promoter.
  • the guide RNA coding sequence is placed directly under the 3' side of the promoter (for example, between the base at the 3' end of the promoter and the base at the 5' end of the guide RNA coding sequence).
  • the number of base pairs (bp) is, for example, 100 bp or less, preferably 50 bp or less).
  • the promoter of the guide RNA expression cassette is not particularly limited, and a pol II promoter can be used, but a pol III promoter is preferred from the viewpoint of more accurate transcription of relatively short RNAs.
  • pol III promoters include, but are not limited to, mouse and human U6-snRNA promoters, human H1-RNase P RNA promoters, human valine-tRNA promoters, and the like.
  • Various drug-inducible promoters can also be used.
  • the guide RNA coding sequence is not particularly limited as long as it is a base sequence that codes for guide RNA.
  • the guide RNA is not particularly limited as long as it can be used in the CRISPR/Cas system.
  • a variety of substances can be used that can induce the target site of genomic DNA.
  • the target site refers to a PAM (Proto-spacer Adjacent Motif) sequence and a 17 to 30 base length (preferably 18 to 25 base length, more preferably 19 to 22 base length) adjacent to the 5' side thereof, Particularly preferably, it is a site on genomic DNA consisting of a DNA strand (target strand) having a sequence of about 20 bases in length and its complementary DNA strand (non-target strand).
  • PAM Proto-spacer Adjacent Motif
  • the PAM sequence differs depending on the type of Cas protein used.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from S. pyogenes (type II) is 5 ⁇ -NGG
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from S. solfataricus (type I-A1) is 5 ⁇ -CCN
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from S. solfataricus (type I-A2) is 5 ⁇ -TCN
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from H. walsbyl type I-B
  • coli-derived Cas9 protein (I-E type) is 5 ⁇ -AWG, and the PAM sequence corresponding to the E. coli-derived Cas9 protein (I-F type) is 5 ⁇ -CC,
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from P. aeruginosa (type I-F) is 5 ⁇ -CC
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from S. thermophilus (type II-A) is 5 ⁇ -NNAGAA
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from S. agalactiae (type II-A) is 5 ⁇ -NGG
  • aureus is 5 ⁇ -NGRRT or 5 ⁇ -NGRRN.
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from N. meningitidis is 5′-NNNNGATT
  • the PAM sequence corresponding to the Cas9 protein from T. denticola is 5′-NAAAAC.
  • Guide RNA has a sequence (sometimes referred to as crRNA (CRISPR RNA) sequence) that is involved in binding to the target site of genomic DNA, and this crRNA sequence
  • the guide RNA can bind to the target site of the genomic DNA by complementary (preferably complementary and specific) binding to the sequence.
  • complementary binding refers not only to binding based on a completely complementary relationship (A and T, and G and C), but also to a complementary relationship that allows hybridization under stringent conditions. This also includes cases where the combination is based on .
  • Stringent conditions are defined as the melting temperature of the nucleic acid to which the complex or probe is bound, as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). (Tm).
  • washing conditions after hybridization include conditions such as "1x SSC, 0.1% SDS, 37°C". It is preferable that the hybridized state be maintained even after washing under such conditions.
  • more severe hybridization conditions include cleaning conditions such as "0.5 ⁇ SSC, 0.1%SDS, 42°C”
  • even more severe hybridization conditions include cleaning conditions such as "0.1 ⁇ SSC, 0.1%SDS, 65°C”. I can do it.
  • the sequence that binds to the target sequence has a ratio of, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, particularly preferably 100% to the target strand. % identity. It is said that the 12 bases on the 3' side of the sequence that binds to the target sequence in the crRNA sequence are important for guide RNA binding to the target site. Therefore, if the sequence that binds to the target sequence in the crRNA sequence is not completely identical to the target strand, the bases that differ from the target strand are the 12 bases on the 3' side of the sequence that binds to the target sequence in the crRNA sequence. It is preferable that the
  • Guide RNA has a sequence that is involved in binding with Cas protein (sometimes referred to as tracrRNA (trans-activating crRNA) sequence), and this tracrRNA sequence activates Cas protein by binding to Cas protein. It can be directed to the target site of genomic DNA.
  • Cas protein sometimes referred to as tracrRNA (trans-activating crRNA) sequence
  • the tracrRNA sequence is not particularly limited.
  • the tracrRNA sequence is typically an RNA with a length of about 50 to 100 bases that can form multiple (usually three) stem loops, and the sequence varies depending on the type of Cas protein used. .
  • As the tracrRNA sequence various known sequences can be employed depending on the type of Cas protein used.
  • the guide RNA usually includes the crRNA sequence and tracr RNA sequence described above.
  • the guide RNA may be a single-stranded RNA (sgRNA) containing a crRNA sequence and a tracr RNA sequence, or an RNA complex formed by complementary binding of an RNA containing a crRNA sequence and an RNA containing a tracrRNA sequence. It may be the body.
  • sgRNA single-stranded RNA
  • the Cas protein expression cassette is not particularly limited as long as it is a polynucleotide used for the purpose of expressing the Cas protein in the target organism.
  • Typical examples of the expression cassette include a polynucleotide comprising a promoter and a Cas protein coding sequence placed under the control of the promoter. Note that "placed under the control of a promoter" is the same as the definition for the guide RNA expression cassette.
  • the promoter for the Cas protein expression cassette is not particularly limited, and various pol II promoters can be used.
  • the pol II promoter include, but are not limited to, CMV promoter, EF1 promoter, SV40 promoter, etc. Examples include MSCV promoter, hTERT promoter, ⁇ -actin promoter, and CAG promoter.
  • Various drug-inducible promoters can also be used.
  • the Cas protein coding sequence is not particularly limited as long as it is a base sequence that encodes the amino acid sequence of a Cas protein.
  • the Cas protein is not particularly limited as long as it can be used in the CRISPR/Cas system.
  • various types of Cas proteins that can bind to the target site of genomic DNA in a complex with guide RNA and cleave the target site can be used. can do.
  • Cas proteins derived from various organisms are known, such as Cas9 protein derived from S. pyogenes (type II), Cas9 protein derived from S. solfataricus (type I-A1), and Cas9 protein derived from S. solfataricus. (type I-A2), Cas9 protein derived from H. walsbyl (type I-B), Cas9 protein derived from E. coli (type I-E), Cas9 protein derived from E.
  • Cas9 protein derived from P. aeruginosa type I-F
  • Cas9 protein from S. thermophilus type II-A
  • Cas9 protein from S. agalactiae type II-A
  • Cas9 protein from S. aureus Cas9 protein from N. meningitidis
  • T Examples include the Cas9 protein derived from F. denticola and the Cpf1 protein (type V) derived from F. novicida.
  • Cas9 protein is preferred, and Cas9 protein endogenously possessed by bacteria belonging to the genus Streptococcus is more preferred.
  • Information on the amino acid sequences of various Cas proteins and their coding sequences can be easily obtained on various databases such as NCBI.
  • the Cas protein may be a wild-type double-stranded Cas protein or a nickase-type Cas protein.
  • Cas proteins may have amino acid sequence mutations (e.g., substitutions, deletions, insertions, additions, etc.) as long as their activity is not impaired, or they may contain known protein tags, signal sequences, enzyme proteins, etc. It may be added with a protein such as.
  • protein tags include biotin, His tag, FLAG tag, Halo tag, MBP tag, HA tag, Myc tag, V5 tag, PA tag, and the like.
  • signal sequences include cytoplasmic transport signals.
  • the TAOK1 gene editing vector may have other sequences.
  • Other sequences are not particularly limited, and various known sequences that can be included in expression vectors can be employed. Examples of such sequences include origins of replication, drug resistance genes, and the like.
  • TAOK1 gene editing agents can be easily produced according to known genetic engineering techniques. For example, it can be produced using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, in vitro transcription/translation technology, recombinant protein production technology, etc.
  • the TAOK1 function inhibitor is one that can regulate the function of TAOK1 protein and/or TAOK1 mRNA expressed in the organism or its cells (especially cells of lung tissue) to which the agent of the present invention is applied. There are no particular restrictions as long as there are.
  • One type of TAOK1 function inhibitor can be used alone, or two or more types can be used in combination.
  • the TAOK1 function inhibitor is not particularly limited as long as it can reduce serine-threonine protein kinase activity.
  • TAOK1 function inhibitor examples include low molecular weight compounds (eg, molecular weight of 1000 or less, 800 or less, 700 or less, 600 or less, or 500 or less; for example, molecular weight of 100 or more, 150 or more, or 200 or more).
  • low molecular weight compounds eg, molecular weight of 1000 or less, 800 or less, 700 or less, 600 or less, or 500 or less; for example, molecular weight of 100 or more, 150 or more, or 200 or more.
  • TAOK1 function inhibitors examples include TAOK1 antibodies.
  • the TAOK1 antibody is preferably an antibody that has antigen-binding ability to an amino acid sequence near the active center of serine-threonine protein kinase of TAOK1. By using such an antibody, TAOK1 function can be suppressed more reliably.
  • the binding site can be determined based on known information and/or inferred based on known information (eg, by constructing a docking model, etc.).
  • Antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, and some of the above antibodies that have antigen-binding properties, such as Fab fragments and fragments produced by Fab expression libraries.
  • Antibodies of the present invention also include antibodies that have antigen-binding ability to a polypeptide consisting of at least consecutive amino acids of TAOK1, usually consisting of 8 amino acids, preferably 15 amino acids, and more preferably 20 amino acids. These antibodies are available, and for example, ab67017 manufactured by abcam, STJ117738 manufactured by St Johns Laboratory, and LS-C766558-60 manufactured by LifeSpan Biosciences are known as Anti-TAOK1 antibodies.
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, TAOK1 expressed in Escherichia coli etc. and purified according to a conventional method, or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the TAOK1 is synthesized according to a conventional method. It is possible to immunize a non-human animal such as a domestic rabbit and obtain it from the serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • non-human animals such as mice are immunized with TAOK1 expressed and purified in Escherichia coli etc. according to conventional methods, or oligopeptides having a partial amino acid sequence of TAOK1, and the resulting spleen cells and myeloma (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11).
  • TAOK1 which is used as an immunizing antigen for antibody production, is based on known gene sequence information, and is used for DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into the host, culture of transformants, and protein recovery from the culture. It can be obtained by manipulation. These operations are performed according to methods known to those skilled in the art or methods described in literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). It can be done by
  • a recombinant DNA that allows the gene encoding TAOK1 to be expressed in a desired host cell is prepared, this is introduced into the host cell for transformation, and the transformant is cultured.
  • the protein as an immunizing antigen for producing the antibody of the present invention can be obtained.
  • a partial peptide of TAOK1 can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) according to known gene sequence information.
  • the antibody of the present invention may be prepared using an oligopeptide having a partial amino acid sequence of TAOK1.
  • the oligo(poly)peptides used for the production of such antibodies need not have functional biological activity, but preferably have immunogenic properties similar to TAOK1.
  • an oligo(poly)peptide having this immunogenic property and consisting of at least 8 consecutive amino acids, preferably 15 amino acids, and more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of TAOK1 can be exemplified.
  • Antibodies against such oligo(poly)peptides can also be produced by enhancing the immunological response using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surface adjuvants such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol. It includes the active substance and human adjuvants such as BCG (Bacillus Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum.
  • BCG Bacillus Calmette-Guerin
  • TAOK1 function inhibitors molecules that have binding (preferably specific binding) to TAOK1 (e.g., peptides, proteins, artificial antibodies, aptamers, etc.) may be used. is possible.
  • a protein or peptide such as an antibody is employed as a TAOK1 function inhibitor
  • an expression cassette thereof may be employed instead.
  • the expression cassette is the same as the definition in "2-2-1. TAOK1 expression inhibitor" above.
  • TAOK1 inhibitors can inhibit cardiomyocyte death (e.g., mitochondrial dysfunction in cardiomyocytes, DNA damage in cardiomyocytes, apoptosis in cardiomyocytes, Inhibitory effect on myocardial cell death due to hypoxic stress (e.g., myocardial cell death due to ischemic heart disease such as myocardial infarction), cardiac dysfunction (e.g., myocardial cell death, myocardial cell mitochondrial dysfunction, myocardial cell DNA damage, myocardial cell It has the effect of reducing cardiac dysfunction caused by apoptosis, hypoxic stress on cardiac muscle cells (for example, ischemic heart disease such as myocardial infarction), etc.
  • cardiomyocyte death e.g., mitochondrial dysfunction in cardiomyocytes, DNA damage in cardiomyocytes, apoptosis in cardiomyocytes, Inhibitory effect on myocardial cell death due to hypoxic stress (e.g., myocardial cell death due to ischemic heart disease
  • TAOK1 inhibitors have the effect of suppressing mitochondrial dysfunction in cardiomyocytes (e.g., reduction in oxygen consumption, reduction in mitochondrial membrane potential, increase in active oxygen), suppression of DNA damage in cardiomyocytes, and suppression of apoptosis in cardiomyocytes. It has an effect.
  • TAOK1 inhibitors have an inhibitory effect on myocardial cell death caused by anticancer drug treatment, and further have an effect of alleviating cardiac dysfunction caused by anticancer drug treatment.
  • TAOK1 inhibitors have an inhibitory effect on mitochondrial dysfunction (e.g., decrease in oxygen consumption, decrease in mitochondrial membrane potential, increase in active oxygen) in cardiomyocytes caused by anticancer drug treatment, It has an inhibitory effect on DNA damage in cardiomyocytes caused by anticancer drug treatment, and has an inhibitory effect on cardiomyocyte apoptosis caused by anticancer drug treatment.
  • At least one (active ingredient) selected from the group consisting of TAOK1 expression inhibitors and TAOK1 function inhibitors is a drug that inhibits myocardial cell death (particularly myocardial cell death caused by anticancer drug treatment or hypoxic stress of myocardial cells).
  • myocardial cell death caused by ischemic heart disease such as myocardial infarction
  • myocardial damage/heart failure particularly myocardial damage/heart failure caused by anticancer treatment, or hypoxic stress on myocardial cells
  • prevention or treatment of myocardial damage/heart failure caused by ischemic heart disease such as myocardial infarction mitochondrial dysfunction of myocardial cells (e.g., decreased oxygen consumption, decreased mitochondrial membrane potential, increased active oxygen) (especially , mitochondrial dysfunction in cardiomyocytes caused by anticancer drug treatment), suppression of DNA damage in cardiomyocytes (especially DNA damage in cardiomyocytes caused by anticancer drug treatment), and apoptosis in cardiomyocytes (especially It is effective in suppressing myocardial cell apoptosis caused by anticancer drug treatment.
  • mitochondrial dysfunction of myocardial cells e.g., decreased oxygen consumption, decreased mitochondrial membrane potential, increased active oxygen
  • suppression of DNA damage in cardiomyocytes especially DNA damage in cardiomyocyte
  • This active ingredient can be used as an active ingredient in, for example, medicines, reagents, food compositions, health promoters, nutritional supplements (supplements, etc.).
  • the active ingredient can be applied (eg, administered, ingested, inoculated, etc.) to animals, humans, and various cells as it is or in various compositions with conventional ingredients.
  • Anticancer drugs are not particularly limited as long as they cause myocardial cell death, cardiac dysfunction, mitochondrial dysfunction in myocardial cells, DNA damage in myocardial cells, and apoptosis in myocardial cells. Suitable examples include anthracycline anticancer drugs. Examples of anthracycline anticancer drugs include doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, liposomal doxorubicin, mitoxantrone, and the like.
  • anticancer drugs include anti-HER2 antibodies (trastuzumab), VEGF inhibitors (bevacizumab), tyrosine kinase inhibitors (sunitinib, imatinib, lapatinib, osimertinib), MEK inhibitors (trametinib), etc. .
  • the agent of the present invention is preferably used in combination with an anticancer drug. Thereby, it is possible to suppress, prevent, and treat cardiomyocyte death, myocardial damage, heart failure, mitochondrial dysfunction in myocardial cells, DNA damage in myocardial cells, apoptosis in myocardial cells, etc. caused by anticancer drug treatment.
  • the timing of the combination is not particularly limited; for example, the agent of the present invention and the anticancer agent may be taken at the same time or on the same day, or one or more days (for example, 2 to 14 days) before the intake date of the other, or You may take the other one later.
  • the cell type of the target cell for the agent of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell type that can express TAOK1, but cardiomyocytes are particularly preferred.
  • the target organisms for the agent of the present invention are not particularly limited, and include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits, pigs, horses, cows, sheep, goats, and deer. .
  • the form of the agent of the present invention is not particularly limited, and depending on the use of the agent of the present invention, it can take any form commonly used for each purpose.
  • the application is for medicine, health promotion agents, nutritional supplements (supplements, etc.), for example, tablets (including orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, troches, jelly-like drops, etc.) ), pills, granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, and syrups), and jelly preparations suitable for oral ingestion.
  • tablets including orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, troches, jelly-like drops, etc.
  • pills granules, fine granules, powders, hard capsules, soft capsules, dry syrups, liquids (including drinks, suspensions, and syrups), and jelly preparations suitable for oral ingestion.
  • forms oral formulations
  • formulations suitable for parenteral ingestion such as nasal drops, inhalers, rectal suppositories, inserts, enemas, jellies, injections, patches, lotions, and creams. oral preparation
  • liquid, gel, or solid foods such as juice, soft drinks, tea, soup, soy milk, salad oil, dressing, yogurt, jelly, pudding, furikake, and powdered milk for infants.
  • the agent of the present invention may further contain other components as necessary.
  • Other ingredients are not particularly limited as long as they can be included in medicines, food compositions, health promoters, nutritional supplements (supplements, etc.), and examples include bases, carriers, solvents, Examples include dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, humectants, colorants, fragrances, and chelating agents.
  • the content of the active ingredient in the agent of the present invention depends on the type of active ingredient, purpose, mode of use, target, condition of the target, etc., and is not limited to, for example, 0.0001 to 100% by weight, Preferably it can be 0.001 to 50% by weight.
  • the amount of the agent of the present invention to be applied is not particularly limited as long as it is an effective amount that exhibits medicinal effects, and is generally 0.1 to 1000 mg per day as the weight of the active ingredient. /kg body weight.
  • the above dosage is preferably administered once a day or divided into 2 to 3 times a day, and can be increased or decreased as appropriate depending on age, pathological condition, and symptoms.
  • the present invention provides an active ingredient of a cardiomyocyte death inhibitor, which uses the amount, concentration, or kinase activity of TAOK1 in a test sample derived from an animal or cell treated with a test substance as an indicator. , or a screening method for an active ingredient of a prophylactic or therapeutic agent for at least one heart disease selected from the group consisting of myocardial disorders and heart failure (herein sometimes referred to as "active ingredient screening method of the present invention”) ). This will be explained below.
  • the test sample is not particularly limited as long as it is a sample in which animal or cell-derived TAOK1 can be detected.
  • the test sample includes cardiac muscle cells.
  • the method for measuring the amount and concentration of TAOK1 is not particularly limited.
  • mass spectrometry immunoassay using antibodies that specifically recognize target biomarkers (e.g. ELISA, EIA, RIA, Western blotting, etc.), Northern hybridization, DNA microarray, Examples include PCR method.
  • the method for measuring the kinase activity of TAOK1 is also not particularly limited. It can be measured according to or analogously to a known method for measuring kinase activity.
  • animal species include various mammals such as monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits.
  • test substances can be used, regardless of whether they are naturally occurring compounds or artificially created compounds.
  • purified compounds not only purified compounds but also compositions containing a mixture of various compounds and extracts of animals and plants can be used.
  • Compounds include not only low-molecular compounds but also high-molecular compounds such as proteins, nucleic acids, and polysaccharides.
  • the method includes the step of selecting the test substance as an active ingredient of an agent for suppressing myocardial cell death, or an active ingredient of an agent for preventing or treating at least one heart disease selected from the group consisting of myocardial damage and heart failure.
  • Low means, for example, that the index value is 9/10, 8/10, 7/10, 6/10, 1/2, 1/5, 1/10, 1/20, 1/50 of the control value. , or 1/100 or less.
  • Test example 1 Screening using cardiomyocytes According to the scheme shown in Figure 1, genes involved in doxorubicin-induced cardiomyocyte death were screened. Specifically, it was performed as follows.
  • iPS cells Human pluripotent stem cells (SCVI-273) derived from healthy individuals were provided by Stanford University Cardiovascular Institute Biobank (https://med.stanford.edu/scvibiobank.html) and Growth Factor Reduced Matrigel (Corning) Maintenance culture was performed in Essential 8 medium (Thermo Fisher) in the above non-feeder environment. Based on an existing report (Circulation. 2019 May 21;139(21):2451-2465. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.037357.), we performed directed differentiation into cardiomyocytes using low-molecular compounds and placed them in glucose-free medium.
  • iPS cells and iPS cell-derived cardiomyocytes were detached using Accutase (Nacalai Tesque) and Accutase (Nacalai Tesque), respectively. All cell lines were maintained in an incubator at 37 degrees with 5% CO2 .
  • lentivirus-based CRISPR single vector constructs > psPAX2 (addgene plasmid # 12260) and pMD2 from a Cas9 expression lentiviral library (addgene plasmid #75314, #75315) targeting all 763 kinases.
  • Lentiviral vectors were created using a packaging system using G (addgene plasmid #12259) (Lenti-X 293T was used as the packaging cell line) and collected as a virus solution 48-72 hours later.
  • Cardiomyocyte survival screening using CRISPR/Cas9 system > 5,000,000-10,000,000 iPS cell-derived cardiomyocytes were infected with Cas9-expressing lentiviral gRNA library at MOI 0.3-0.5, and treated with puromycin (2 ⁇ g/ml). After killing the infected cells, 14 days later, groups treated with doxorubicin (0.5 ⁇ M) for 72 hours and non-treated groups were created, and the cells were collected. Genomic DNA was collected from the collected cells using NucleoSpin (registered trademark) Tissue (Macherey-Nagel) and was analyzed as previously reported (Nature. 2019 Nov;575(7782):375-379.
  • NucleoSpin registered trademark
  • a library was prepared using 3-step PCR based on 4.).
  • the prepared library was sequenced using NovaSeq6000, adapter sequences were removed using Cutadapt, alignment was performed based on the Brunello library gRNA sequence information, and RRA scores for each gene were calculated using the MAGeCK program (Genome Biol . 2014;15(12):554. doi: 10.1186/s13059-014-0554-4.).
  • TAOK1 was selected as a candidate gene from the top RPA score ranking. Although TAOK1 is known to be effective against cancer (Patent Document 1), its relationship with cardiac muscle cell death is not known.
  • Test example 2 Evaluation of TAOK1 gene as a target gene 1
  • TAOK1 was knocked out TAOK1 and examined the survival rate of cardiomyocytes after treatment with doxorubicin. Specifically, it was performed as follows. Regarding the points not mentioned below, the same procedure as Test Example 1 was carried out.
  • iPS cell-derived cardiomyocytes were drug-selected with puromycin and seeded onto a 96-well plate coated with Growth Factor Reduced Matrigel.
  • Doxorubicin was added after 14 days after viral vector infection, and PrestoBlue was added after 3 days.
  • Cell viability was measured using SpectraMaxM2e (molecular devices) using reagents (Thermo Fisher).
  • iPS cell-derived cardiomyocytes were drug-selected with puromycin and seeded on a glass bottom dish coated with Growth Factor Reduced Matrigel.
  • Doxorubicin was added 14 days after viral vector infection, and Cellstain was added 1 day later. (registered trademark)-Double Staining Kit (Dojindo), and imaging was performed using BZ-X800 (Keyence).
  • Test example 3 Evaluation of TAOK1 gene as a target gene 2
  • the survival rate of cardiomyocytes after treatment with a TAOK1 inhibitor (Patent Document 1: Compound 43) and doxorubicin treatment was investigated. Specifically, it was performed as follows. Regarding the points not mentioned below, the same procedure as Test Example 1 was carried out.
  • iPS cell-derived cardiomyocytes were seeded in a 96-well plate coated with Growth Factor Reduced Matrigel, TAOK1 inhibitor C43 (MedChemExpress) and doxorubicin were added simultaneously from 5 days after seeding, and 3 days later they were transferred to SpectraMaxM2e using PrestoBlue reagent. Cell viability was measured.
  • Test example 4 Evaluation of TAOK1 gene as a target gene 3
  • TAOK1 was knocked down TAOK1 and performed cardiac function evaluation and gene expression measurement after doxorubicin treatment. An overview is shown in Figure 5. Specifically, it was performed as follows.
  • a self-complementary adeno-associated virus serotype 9 vector (AAV9-sh) expressing hairpin RNA (shRNA) was created at VectorBuilder.
  • AAV9-sh-TAOK1 targeting TAOK1 or non-targeting AAV-sh-Scramble was administered to 8-10 week old wild type C57BL/6 males via the orbital venous plexus at 1 ⁇ 10 11 vg.
  • doxorubicin was administered intraperitoneally to the mice at 5 mg/kg every week for 5 weeks, and cardiac function was evaluated using a cardiac ultrasound device Vevo 2100 (FUJIFILM).
  • mice were euthanized by administering a large amount of anesthetic, and their hearts were collected.
  • Total RNA was extracted from the collected mouse hearts using Direct-zol RNA Kit (Zymo Research). Reverse transcription was performed using the PrimeScript RT reagent Kit (Takara) from the recovered RNA, and gene expression was evaluated using the KAPA SYBR FAST qPCR kit on the CFX 384 Real-Time system (Biorad).
  • Test example 5 Evaluation of TAOK1 gene as a target gene 4 TAOK1 knockout cells were obtained from iPS cell-derived cardiomyocytes in the same manner as in Test Example 2-1. The obtained cells were treated with 0 ⁇ M or 1 ⁇ M doxorubicin for 3 hours, and oxygen consumption was measured using Seahorse XFe 96 Flux Analyzer (Agilent) and Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit (Agilent).
  • Figure 7 shows the measurement results of oxygen consumption. Doxorubicin treatment significantly reduced oxygen consumption by cardiomyocytes. Compared to the non-specific knockout group, the decrease in oxygen consumption was attenuated in the TAOK1 knockout group.
  • Test example 6 Evaluation of TAOK1 gene as a target gene5 TAOK1 knockout cells were obtained from iPS cell-derived cardiomyocytes in the same manner as in Test Example 2-1. The obtained cells were treated with 0, 1, or 2 ⁇ M doxorubicin for 3 hours, and mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species (ROS) were measured using Cell Meter JC-10 (AAT bioquest) and ROS Assay (Dojindo), respectively. went.
  • ROS reactive oxygen species
  • Figure 8 shows the measurement results of mitochondrial membrane potential and amount of active oxygen produced. The decrease in mitochondrial membrane potential and generation of reactive oxygen species induced by doxorubicin treatment were alleviated in TAOK1 knockout.
  • Test example 7 Evaluation of TAOK1 gene as a target gene6 TAOK1 knockout cells were obtained from iPS cell-derived cardiomyocytes in the same manner as in Test Example 2-1. The obtained cells were treated with 0 to 1 ⁇ M doxorubicin for 24 hours, and the cells were collected using Accutase (Nacalai Tesque). After fixation with 4% PFA, staining with Purified anti-H2A. ⁇ H2AX-positive cells were detected among troponin T-positive cells.
  • Figure 9 shows the percentage of ⁇ H2AX-positive cells among troponin T-positive cells.
  • Test example 8 Evaluation of TAOK1 gene as a target gene7 TAOK1 knockout cells were obtained from iPS cell-derived cardiomyocytes in the same manner as in Test Example 2-1. The obtained cells were treated with 1 ⁇ M doxorubicin for 24 hours, the protein was collected, and p38 phosphorylation was evaluated by Western blotting (9216, 9212 Cell Signaling Technology).
  • Figure 10 shows the measurement results of the ratio of the amount of phosphorylated p38 to the amount of p38.
  • TAOK1 knockout cardiomyocytes the p38 pathway was suppressed, and p38 activation by doxorubicin was inhibited.
  • Test example 9 Evaluation of TAOK1 gene as a target gene8 siRNA (Silencer Select, Thermo Fisher The TAOK1 gene was knocked down at a laboratory (Scientific), and 2 ⁇ M of doxorubicin was administered from the third day of siRNA administration. Cell viability was measured using PrestoBlue reagent on the third day after doxorubicin administration.
  • Test example 10 Evaluation of TAOK1 gene as a target gene9
  • Mouse hearts collected during cardiac function evaluation in Test Example 4 (Week 8 in FIG. 6) were used. The collected hearts were fixed in 4% PFA and embedded in paraffin, and section slides were prepared. Fibrosis was evaluated with Picosirius Red and apoptosis was evaluated with TUNEL staining.
  • the histological staining image is shown in Figure 12. Doxorubicin-induced fibrosis and cell death in mouse hearts were reduced in the TAOK1 knockdown group compared to the nonspecific gene knockdown group.
  • Test example 11 Evaluation of TAOK1 gene as a target gene10 TAOK1 gene was knocked down in human iPS cell-derived cardiomyocytes using siRNA (Silencer Select, Thermo Fisher Scientific), and from the 3rd day of siRNA administration, cells were cultured under 0.1% oxygen conditions using the BIONIX hypoxic culture kit (Sugiyamagen) for 16 days. Cell death was induced by culturing for hours. After staining viable cells with Cellstain-Double Staining Kit (Dojindo), images were acquired.
  • siRNA Silencer Select, Thermo Fisher Scientific
  • Figure 13 shows the cell staining image.
  • the number of myocardial cells that survived under hypoxic conditions increased.
  • Test example 12 Evaluation of TAOK1 gene as a target gene11 TAOK1 gene was knocked down in human iPS cell-derived cardiomyocytes using siRNA (Silencer Select, Thermo Fisher Scientific), and from the 3rd day of siRNA administration, cells were cultured under 0.1% oxygen conditions using the BIONIX hypoxic culture kit (Sugiyamagen) for 16 days. Cell death was induced by culturing for hours. Quantitative evaluation of dead cells was performed by flow cytometry using 7AAD reagent.
  • Figure 14 shows the percentage of dead cells. Cardiomyocyte death was reduced in the TAOK1 knockdown group under hypoxic conditions.

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Abstract

心筋細胞死の抑制剤及び心筋障害又は心不全の予防又は治療剤を提供することを課題とする。当該課題を、TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分を含有する、心筋細胞死の抑制剤、又は心筋障害又は心不全の予防又は治療剤、により解決する。

Description

心筋細胞死の抑制剤及び心筋障害又は心不全の予防又は治療剤
　本発明は、心筋細胞死の抑制剤、心筋障害又は心不全の予防又は治療剤等に関する。
　アドリアマイシン（ドキソルビシン）は、白血病や乳がん等の治療薬として広く使用されている。しかし、アドリアマイシンは、しばしば心毒性（心筋障害、心不全）を起こすので、これを用いた治療の継続が制限されることがある。特に、高齢者、心血管疾患既往歴、放射線治療の経験、併用化学療法の経験等が心毒性の発症頻度を増加させることが報告されている。
　アドリアマイシンの心毒性に対しては、デクスラゾキサンのみが米国FDAから治療薬として認可されている。しかし、デクスラゾキサンは、発がん作用を有しており、アドリアマイシンによる抗がん効果を減弱させる恐れがある。
　TAOK1は、セリンスレオニンタンパク質キナーゼであり、p38を含むストレス応答性MAPキナーゼ経路や細胞外シグナル制御型タンパク質キナーゼ(ERK)キナーゼ(MEKs)の制御に関与する。特許文献１には、TAOK1阻害剤が抗がん作用を有し得ることが記載されている。
特表2007-527412号公報
　本発明は、心筋細胞死の抑制剤及び心筋障害又は心不全の予防又は治療剤を提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分を用いることにより、上記課題を解決できることを見出した。本発明者はこの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分を含有する、心筋細胞死の抑制剤。
　項１Ａ．　TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分を対象に投与することを含む、心筋細胞死の抑制方法。
　項１Ｂ．　心筋細胞死の抑制における使用のための、TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分を含有する剤。
　項１Ｃ．　TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分の、心筋細胞死の抑制剤の製造のための使用。
　項１Ｄ．　TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分の、心筋細胞死の抑制のための使用。
　項２．　前記成分が、TAOK1を標的としたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドの発現カセット、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、及び抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、項１に記載の抑制剤。
　項３．　前記心筋細胞死が抗がん剤治療に起因する心筋細胞死である、項１に記載の抑制剤。
　項４．　抗がん剤と併用投与されるように用いられる、項１に記載の抑制剤。
　項５．　前記抗がん剤がアントラサイクリン系抗がん剤である、項３又は４に記載の抑制剤。
　項６．　心疾患の予防又は治療に用いるための、項１に記載の抑制剤。
　項７．　前記心疾患が心筋障害及び心不全からなる群より選択される少なくとも1種の心疾患である、項６に記載の抑制剤。
　項８．　前記心疾患が抗がん剤治療に起因する心疾患である、項６に記載の抑制剤。
　項９．　TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分を含有する、心筋障害及び心不全からなる群より選択される少なくとも1種の心疾患の予防又は治療剤。
　項９Ａ．　TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分を対象に投与することを含む、心疾患の予防又は治療方法。
　項９Ｂ．　心疾患の予防又は治療における使用のための、TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分を含有する剤。
　項９Ｃ．　TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分の、心疾患の予防又は治療剤の製造のための使用。
　項９Ｄ．　TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分の、心疾患の予防又は治療のための使用。
　項１０．　前記心疾患が抗がん剤治療に起因する心疾患である、項９に記載の予防又は治療剤。
　項１１．　被検物質で処理された動物又は細胞由来の被検試料におけるTAOK1の量、濃度、又はキナーゼ活性を指標とする、心筋細胞死の抑制剤の有効成分、又は心筋障害及び心不全からなる群より選択される少なくとも1種の心疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。
　本発明によれば、心筋細胞死の抑制剤及び心筋障害又は心不全の予防又は治療剤を提供することができる。さらに、本発明によれば、心筋細胞死の抑制剤の有効成分、又は心筋障害及び心不全からなる群より選択される少なくとも1種の心疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法を提供することもできる。
ドキソルビシンによる心筋細胞死に関与する遺伝子のスクリーニング（試験例1）の概要を示す。 ドキソルビシン処理後の心筋細胞の生存率を示す（試験例2）。縦軸は細胞生存率を示し、横軸はドキソルビシン濃度を示す。NTC KOは非標的gRNAを使用した場合を示し、TAOK1 KOはTAOK1を標的としたgRNAを使用した場合を示し、1、2は互いに異なる種類のgRNAを使用した場合を示す。 ドキソルビシン処理後の心筋細胞の生細胞/死細胞染色像を示す（試験例2）。 ドキソルビシン処理後の心筋細胞の生存率を示す（試験例3）。縦軸は細胞生存率を示し、横軸中、C43 10nMはTAOK1阻害剤（特許文献1：化合物43）で処理した場合（終濃度10nM）を示し、CtrlはTAOK1阻害剤で処理していないネガティブコントロールを示す。グラフ上方にドキソルビシン処理時の濃度を示す。 試験例4の概要を示す。 TAOK1 mRNA量測定結果（左）、及びLVEF（左室駆出率：Left ventricular ejection fraction）（右）を示す（試験例4）。横軸は、TAOK1を標的としたAAV9-sh-TAOK1、ないしは非標的AAV-sh-Scrambleを投与してからの経過期間を示す。 酸素消費量の測定結果を示す（試験例5）。凡例中、NTC KOは非標的gRNAを使用した場合を示し、TAOK1 KOはTAOK1を標的としたgRNAを使用した場合を示す。凡例にドキソルビシン処理濃度を示す。横軸は試験開始からの経過時間を示し、縦軸は酸素消費速度を示す。グラフ中の矢印は、その上方に示す薬剤を添加したタイミングを示す。 ミトコンドリア膜電位（左側グラフ、縦軸）および活性酸素生成量（右側グラフ、縦軸）の測定結果を示す（試験例6）。横軸に、ドキソルビシンの処理濃度（単位：μM）を示す。 トロポニンT陽性細胞中のγH2AX陽性細胞の割合を示す（試験例7）。縦軸は、トロポニンT陽性細胞中のγH2AX陽性細胞の割合を示す。横軸中、NTC KOは非標的gRNAを使用した場合を示し、TAOK1 KOはTAOK1を標的としたgRNAを使用した場合を示す。横軸にドキソルビシン処理濃度を示す。 p38量に対するリン酸化p38量の割合の測定結果を示す（試験例8）。縦軸は、p38量に対するリン酸化p38量の割合を示す。横軸中、NTC KOは非標的gRNAを使用した場合を示し、TAOK1 KOはTAOK1を標的としたgRNAを使用した場合を示し、DOXはドキソルビシン処理群を示す。 細胞生存率の測定結果を示す（試験例9）。縦軸は、細胞生存率を示す。横軸に使用した細胞株を示す。凡例に使用したsiRNAを示す。 組織染色像を示す（試験例10）。写真像左側に使用したsiRNAを示す。写真像上方に染色の種類を示す。 細胞染色像を示す（試験例11）。写真像左側に低酸素負荷の有無を示す。写真像上方に使用したsiRNAを示す。 死細胞の割合の測定結果を示す（試験例12）。縦軸は、死細胞の割合を示す。横軸に使用したsiRNAを示す。
　1．定義
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
　本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　本明細書において、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、特に制限されず、天然、人工のいずれのものも包含する。具体的には、DNA、RNA等の他にも、次に例示するように、公知の化学修飾が施されたものであってもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したものであるBNA（LNA）等もまた、用いられ得る。
　2．心筋細胞死の抑制剤、又は心筋障害又は心不全の予防又は治療剤
　本発明は、その一態様において、TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分を含有する、心筋細胞死の抑制剤、又は心筋障害又は心不全の予防又は治療剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　2-1．抑制対象（TAOK1）
　TAOK1遺伝子は、セリンスレオニンタンパク質キナーゼをコードする遺伝子である。発現又は機能抑制対象であるTAOK1（TAOK1タンパク質、TAOK1 mRNA）は、TAOK1遺伝子の発現産物であり、本発明の剤の適用対象の生物又はその細胞（特に心筋細胞）内で発現しているTAOK1タンパク質又はTAOK1 mRNAである。よって、該対象の生物種に応じて、抑制対象であるTAOK1タンパク質及びTAOK1 mRNAも変わる。該生物種としては、特に制限されず、動物、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類が挙げられる。
　種々の生物種由来TAOK1タンパク質のアミノ酸配列及びTAOK1 mRNAの塩基配列は公知である。具体的には、例えば、ヒトTAOK1タンパク質としては配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_065842.1）、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_079418.1）が挙げられ、ヒトTAOK1 mRNAとしては配列番号3に示される塩基配列からなるmRNA（NCBI Reference Sequence：NM_020791.4）、配列番号4に示される塩基配列からなるmRNA（NCBI Reference Sequence：NM_025142.1）が挙げられる。また、TAOK1タンパク質及びTAOK1 mRNAとしては、上記のスプライシングバリアントも包含され得る。
　抑制対象であるTAOK1タンパク質は、その本来の性質、すなわちセリンスレオニンタンパク質キナーゼ活性を有する限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入などのアミノ酸変異を有していてもよい。変異としては、活性がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。
　抑制対象であるTAOK1 mRNAも、該mRNAから翻訳されるタンパク質が、その本来の性質、すなわちセリンスレオニンタンパク質キナーゼ活性を有する限りにおいて、置換、欠失、付加、挿入などの塩基変異を有していてもよい。変異としては、該mRNAから翻訳されるタンパク質においてアミノ酸置換が生じない変異やアミノ酸の保存的置換が生じる変異が好ましい。
　抑制対象であるTAOK1タンパク質の好ましい具体例としては、下記（a）に記載するタンパク質及び下記（b）に記載するタンパク質：
　（a）配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び　（b）配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つセリンスレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（b）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。
　上記（b）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（b’）配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つセリンスレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質
が挙げられる。
　上記（b’）において、複数個とは、例えば2～50個であり、好ましくは2～20個であり、より好ましくは2～10個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。
　抑制対象であるTAOK1 mRNAの好ましい具体例としては、下記（c）に記載するmRNA及び下記（d）に記載するmRNA：
　（c）配列番号3又は4に示される塩基配列からなるmRNA、及び
　（d）配列番号3又は4に示される塩基配列と85％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つセリンスレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするmRNAからなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。
　上記（d）において、同一性は、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上である。
　上記（d）に記載するmRNAの一例としては、例えば
（d’） 配列番号3又は4に示される塩基配列に対して1若しくは複数個の塩基が置換、欠失、付加、又は挿入された塩基配列からなり、且つセリンスレオニンタンパク質キナーゼ活性を有するタンパク質をコードするmRNA
が挙げられる。
　上記（d’）において、複数個とは、例えば2～150個であり、好ましくは2～60個であり、より好ましくは2～30個であり、よりさらに好ましくは2～10個である。
　2-2．有効成分
　本発明の剤の有効成分は、TAOK1発現抑制剤及びTAOK1機能抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分である。当該成分としては、好ましくはTAOK1を標的としたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドの発現カセット、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、抗体等が挙げられる。以下に、TAOK1発現抑制剤及びTAOK1機能抑制剤について具体的に説明する。
　2-2-1．TAOK1発現抑制剤
　TAOK1発現抑制剤は、本発明の剤の適用対象の生物又はその細胞（特に肺組織の細胞）内で発現しているTAOK1タンパク質及び／又はTAOK1 mRNAの発現量を抑制可能なものである限り、特に制限されない。TAOK1発現抑制剤は、1種単独で用いることもできるし、2種以上を組み合わせて用いることもできる。
　TAOK1発現抑制剤としては、例えばTAOK1特異的small interfering RNA（siRNA）、TAOK1特異的microRNA（miRNA）、TAOK1特異的アンチセンス核酸、これらの発現カセット；　TAOK1特異的リボザイム；　CRISPR/CasシステムによるTAOK1遺伝子編集剤などが挙げられる。
　なお、発現抑制とは、TAOK1タンパク質、TAOK1 mRNAなどの発現量を、例えば1/2、1/3、1/5、1/10、1/20、1/30、1/50、1/100、1/200、1/300、1/500、1/1000、1/10000以下に抑制することを意味し、これらの発現量を0とすることをも包含する。
　2-2-1-1．siRNA、miRNA、アンチセンス核酸、リボザイム
　TAOK1特異的siRNAは、TAOK1をコードする遺伝子の発現を特異的に抑制する二本鎖RNA分子である限り特に制限されない。一実施形態において、siRNAは、例えば、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、又は21塩基以上の長さであることが好ましい。また、siRNAは、例えば、25塩基以下、24塩基以下、23塩基以下、又は22塩基以下の長さであることが好ましい。ここに記載するsiRNAの長さの上限値及び下限値は任意に組み合わせることが想定される。例えば、下限が18塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が19塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が20塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ；下限が21塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さの組み合わせが想定される。
　siRNAは、shRNA(small hairpin RNA)であっても良い。shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、shRNAは、ある領域の配列を配列aとし、配列aに対する相補鎖を配列bとすると、配列a、スペーサー、配列bの順になるようにこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するようにし、全体で45～60塩基の長さとなるように設計することができる。配列aは、標的となるTAOK1をコードする塩基配列の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されず、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列aの長さは19～25塩基、好ましくは19～21塩基である。
　TAOK1特異的siRNAは、5’又は3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常2～4塩基程度である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシチミジンを表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもよく、例えば、アンチセンス鎖が3'末端及び5'末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「asymmetrical interfering RNA（aiRNA）」を挙げることができる。典型的なaiRNAは、アンチセンス鎖が21塩基からなり、センス鎖が15塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々3塩基のオーバーハング構造をとる。
　TAOK1特異的siRNAの標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、一実施形態において、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）などのホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認することが好ましい。特異性が確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19－21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19－21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるshRNAは、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
　siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、以下を挙げることができる。Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）pSilencer（登録商標）Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）。
　siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90～約95℃で約1分程度変性させた後、約30～約70℃で約1～約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるshRNAを合成し、これを、RNA切断タンパク質ダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
　TAOK1特異的miRNAは、TAOK1をコードする遺伝子の翻訳を阻害する限り任意である。例えば、miRNAは、siRNAのように標的mRNAを切断するのではなく、標的の3’非翻訳領域（UTR）に対合してその翻訳を阻害してもよい。miRNAは、pri-miRNA（primary miRNA）、pre-miRNA（precursor miRNA）、及び成熟miRNAのいずれでもよい。miRNAの長さは特に制限されず、pri-miRNAの長さは通常数百～数千塩基であり、pre-miRNAの長さは通常50～80塩基であり、成熟miRNAの長さは通常18～30塩基である。一実施形態において、TAOK1特異的miRNAは、好ましくはpre-miRNA又は成熟miRNAであり、より好ましくは成熟miRNAである。このようなTAOK1特異的miRNAは、公知の手法で合成してもよく、合成RNAを提供する会社から購入してもよい。
　TAOK1特異的アンチセンス核酸とは、TAOK1をコードする遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、該mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、TAOK1タンパク質合成を抑制する機能を有する核酸である。アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA/RNAキメラのいずれでもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性リボヌクレアーゼH（RNase H）に認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こす。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、TAOK1遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、TAOK1遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTAなどのホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。
　TAOK1特異的アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてTAOK1タンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さは制限されない。TAOK1特異的アンチセンス核酸は、TAOK1をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよい。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題などを考慮すれば、約10～約40塩基、特に約15～約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、TAOK1遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域又は3’端ヘアピンループなどをアンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されるものではない。
　TAOK1特異的アンチセンス核酸は、TAOK1遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン（antigene））であってもよい。
　TAOK1特異的siRNA、TAOK1特異的miRNA、及びTAOK1特異的アンチセンス核酸などは、TAOK1遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも公知の手法により、化学的に合成することができる。
　TAOK1特異的siRNA、TAOK1特異的miRNA、又はTAOK1特異的アンチセンス核酸の発現カセットについては、TAOK1特異的siRNA、TAOK1特異的miRNA、又はTAOK1特異的アンチセンス核酸が発現可能な状態で組み込まれているポリヌクレオチドである限りにおいて特に限定されない。典型的には、該発現カセットは、プロモーター配列、及びTAOK1特異的siRNA、TAOK1特異的miRNA、又はTAOK1特異的アンチセンス核酸のコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチド、必要に応じて他の配列を含む。プロモーターは、特に制限されず、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーターなどのRNA polymerase II（polII）系プロモーター；　マウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどのRNA polymerase III（polIII）系プロモーターなどが挙げられ、これらの中でも、短いRNAの転写を正確に行うことができるという観点から、polIII系プロモーターが好ましい。また、薬剤により誘導可能な各種プロモーターも使用することができる。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、薬剤耐性遺伝子の種類及びベクターの種類は上述のものを例示できる。
　TAOK1発現抑制剤の別の例としては、TAOK1特異的リボザイムなどが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAを意味するが、本願では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものは、ウイロイドやウイルソイドなどの感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型などが知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないという利点を有する。TAOK1遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
　2-2-1-2．遺伝子編集剤
　TAOK1遺伝子編集剤は、標的配列特異的ヌクレアーゼシステム（例えばCRISPR/Casシステム）により、TAOK1遺伝子の発現を抑制可能なものである限り特に制限されない。TAOK1遺伝子の発現抑制は、例えばTAOK1遺伝子の破壊、TAOK1遺伝子のプロモーターの改変による該プロモーターの活性抑制により可能である。
　TAOK1遺伝子編集剤としては、例えばCRISPR/Casシステムを採用する場合は、典型的には、TAOK1遺伝子又はそのプロモーターを標的とするガイドRNA発現カセット、及びCasタンパク質発現カセットを含むベクター（TAOK1遺伝子編集用ベクター）を用いることができるが、これに限定されない。この典型例以外にも、例えばTAOK1遺伝子又はそのプロモーターを標的とするガイドRNA及び／又はその発現カセットを含むベクターと、Casタンパク質及び／又はその発現カセットを含むベクターとの組み合わせを、TAOK1遺伝子編集剤として用いることが可能である。
　ガイドRNA発現カセットは、対象の生物内でガイドRNAを発現させる目的で用いられるポリヌクレオチドである限り特に制限されない。該発現カセットの典型例としては、プロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置されたガイドRNA全体又は一部のコード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。なお「プロモーターの制御下に配置」とは、換言すれば、ガイドRNAコード配列が、該配列の転写がプロモーターによって制御されるように配置されていることを意味する。具体的な配置の態様としては、例えばプロモーターの3´側直下にガイドRNAコード配列が配置されている態様（例えば、プロモーター3´末端の塩基からガイドRNAコード配列の5´末端の塩基までの間の塩基対数（bp）が、例えば100 bp以下、好ましくは50 bp以下である態様）が挙げられる。
　ガイドRNA発現カセットのプロモーターとしては、特に制限されず、pol II系プロモーターを使用することもできるが、比較的短いRNAの転写をより正確に行わせるという観点から、pol III系プロモーターが好ましい。pol III系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばマウス及びヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどが挙げられる。また、薬剤により誘導可能な各種プロモーターも使用することができる。
　ガイドRNAコード配列は、ガイドRNAをコードする塩基配列である限り特に制限されない。
　ガイドRNAは、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばゲノムDNAの標的部位（例えばTAOK1遺伝子、そのプロモーターなど）に結合し、且つCasタンパク質と結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導可能なものを各種使用することができる。
　本明細書において、標的部位とは、PAM（Proto-spacer Adjacent Motif）配列及びその5´側に隣接する17～30塩基長（好ましくは18～25塩基長、より好ましくは19～22塩基長、特に好ましくは20塩基長）程度の配列からなるDNA鎖（標的鎖）とその相補DNA鎖（非標的鎖）からなる、ゲノムDNA上の部位である。
　PAM配列は、利用するCasタンパク質の種類によって異なる。例えば、S. pyogenes由来のCas9タンパク質（II型）に対応するPAM配列は5´-NGGであり、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A1型）に対応するPAM配列は5´-CCNであり、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A2型）に対応するPAM配列は5´-TCNであり、H. walsbyl由来のCas9タンパク質（I-B型）に対応するPAM配列は5´-TTCであり、E. coli由来のCas9タンパク質（I-E型）に対応するPAM配列は5´-AWGであり、E. coli由来のCas9タンパク質（I-F型）に対応するPAM配列は5´-CCであり、P. aeruginosa由来のCas9タンパク質（I-F型）に対応するPAM配列は5´-CCであり、S. Thermophilus由来のCas9タンパク質（II-A型）に対応するPAM配列は5´-NNAGAAであり、S. agalactiae由来のCas9タンパク質（II-A型）に対応するPAM配列は5´-NGGであり、S. aureus由来のCas9タンパク質に対応するPAM配列は、5´-NGRRT又は5´-NGRRNであり、N. meningitidis由来のCas9タンパク質に対応するPAM配列は、5´-NNNNGATTであり、T. denticola由来のCas9タンパク質に対応するPAM配列は、5´-NAAAACである。
　ガイドRNAはゲノムDNAの標的部位への結合に関与する配列（crRNA（CRISPR RNA）配列といわれることもある）を有しており、このcrRNA配列が、非標的鎖のPAM配列相補配列を除いてなる配列に相補的（好ましくは、相補的且つ特異的）に結合することにより、ガイドRNAはゲノムDNAの標的部位に結合することができる。
　なお、「相補的」に結合とは、完全な相補関係（AとT、及びGとC）に基づいて結合する場合のみならず、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係に基づいて結合する場合も包含される。ストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1% SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。かかる条件で洗浄してもハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。
　具体的には、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列は、標的鎖と例えば90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上、特に好ましくは100％の同一性を有する。なお、ガイドRNAの標的部位への結合には、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列の3´側の12塩基が重要であるといわれている。このため、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列が、標的鎖と完全同一ではない場合、標的鎖と異なる塩基は、crRNA配列の内、標的配列に結合する配列の3´側の12塩基以外に存在することが好ましい。
　ガイドRNAは、Casタンパク質との結合に関与する配列（tracrRNA（trans-activating crRNA）配列といわれることもある）を有しており、このtracrRNA配列が、Casタンパク質に結合することにより、Casタンパク質をゲノムDNAの標的部位に誘導することができる。
　tracrRNA配列は、特に制限されない。tracrRNA配列は、典型的には、複数（通常、3つ）のステムループを形成可能な50～100塩基長程度の配列からなるRNAであり、利用するCasタンパク質の種類に応じてその配列は異なる。tracrRNA配列としては、利用するCasタンパク質の種類に応じて、公知の配列を各種採用することができる。
　ガイドRNAは、通常、上記したcrRNA配列とtracr RNA配列を含む。ガイドRNAの態様は、crRNA配列とtracr RNA配列を含む一本鎖RNA（sgRNA）であってもよいし、crRNA配列を含むRNAとtracrRNA配列を含むRNAとが相補的に結合してなるRNA複合体であってもよい。
　Casタンパク質発現カセットは、対象の生物内でCasタンパク質を発現させる目的で用いられるポリヌクレオチドである限り特に制限されない。該発現カセットの典型例としては、プロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置されたCasタンパク質コード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。なお「プロモーターの制御下に配置」とは、ガイドRNA発現カセットにおける定義と同様である。
　Casタンパク質発現カセットのプロモーターとしては、特に制限されず、例えばpol II系プロモーターを各種使用することができる、pol II系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えば例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーターなどが挙げられる。また、薬剤により誘導可能な各種プロモーターも使用することができる。
　Casタンパク質コード配列は、Casタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列である限り特に制限されない。
　Casタンパク質は、CRISPR/Casシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばガイドRNAと複合体を形成した状態でゲノムDNAの標的部位に結合し、該標的部位を切断できるものを各種使用することができる。Casタンパク質としては、各種生物由来のものが知られており、例えばS. pyogenes由来のCas9タンパク質（II型）、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A1型）、S. solfataricus由来のCas9タンパク質（I-A2型）、H. walsbyl由来のCas9タンパク質（I-B型）、E. coli由来のCas9タンパク質（I-E型）、E. coli由来のCas9タンパク質（I-F型）、P. aeruginosa由来のCas9タンパク質（I-F型）、S. Thermophilus由来のCas9タンパク質（II-A型）、S. agalactiae由来のCas9タンパク質（II-A型）、S. aureus由来のCas9タンパク質、N. meningitidis由来のCas9タンパク質、T. denticola由来のCas9タンパク質、F. novicida由来のCpf1タンパク質（V型）などが挙げられる。これらの中でも、好ましくはCas9タンパク質が挙げられ、より好ましくはストレプトコッカス属に属する細菌が内在的に有するCas9タンパク質が挙げられる。各種Casタンパク質のアミノ酸配列、及びそのコード配列の情報は、NCBIなどの各種データベース上で容易に得ることができる。
　Casタンパク質は、野生型の2本鎖切断型Casタンパク質であってもよいし、ニッカーゼ型Casタンパク質であってもよい。また、Casタンパク質は、その活性を損なわない限りにおいて、アミノ酸配列の変異（例えば、置換、欠失、挿入、付加など）を有していてもよいし、公知のタンパク質タグ、シグナル配列、酵素タンパク質などのタンパク質が付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグなどが挙げられる。シグナル配列としては、例えば細胞質移行シグナルなどが挙げられる。
　TAOK1遺伝子編集用ベクターは、他の配列を有していてもよい。他の配列としては、特に制限されず、発現ベクターが含み得る公知の配列を各種採用することができる。このような配列の一例としては、例えば複製起点、薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。
　TAOK1遺伝子編集剤は、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に作製することができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術などを利用して作製することができる。
　2-2-2．TAOK1機能抑制剤
　TAOK1機能抑制剤は、本発明の剤の適用対象の生物又はその細胞（特に肺組織の細胞）内で発現しているTAOK1タンパク質及び／又はTAOK1 mRNAの機能を調節可能なものである限り、特に制限されない。TAOK1機能抑制剤は、1種単独で用いることもできるし、2種以上を組み合わせて用いることもできる。
　TAOK1機能抑制剤としては、セリンスレオニンタンパク質キナーゼ活性を低下させることができる限りにおいて特に制限されない。
　TAOK1機能抑制剤としては、例えば低分子化合物（例えば分子量1000以下、800以下、700以下、600以下、又は500以下。例えば分子量100以上、150以上、又は200以上）が挙げられる。
　TAOK1機能抑制作用を有する低分子化合物は、これまで、各種文献において多数報告されている。例えば、特許文献１、J Enzyme Inhib Med Chem. 2021; 36(1): 98-108.、Molecular cancer therapeutics vol. 16,11 (2017): 2410-2421.、Acta neuropathologica communications vol. 6,1 37. 7 May. 2018等で、TAOK1機能抑制作用を有する低分子化合物が報告されている。このような低分子化合物の具体例は、以下のとおりである。
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　他のTAOK1機能抑制剤としては、例えばTAOK1抗体等が挙げられる。TAOK1抗体は、好ましくは、TAOK1のセリンスレオニンタンパク質キナーゼ活性中心付近のアミノ酸配列に対して、抗原結合性を有する抗体である。このような抗体を用いることにより、より確実に、TAOK1機能を抑制することができる。結合部位は公知の情報に基づいて決定すること、及び／又は公知の情報に基づいて推測すること（例えば、ドッキングモデル構築等により）が可能である。
　抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。TAOK1のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。これらの抗体は入手可能であり、例えば、Anti-TAOK1抗体として、abcam社製のab67017、St Johns Laboratory社製のSTJ117738、LifeSpan Biosciences社製のLS-C766558-60等が知られている。
　また、これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、これらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology , Chapter 11.12～11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したTAOK1を用いて、あるいは常法に従って当該TAOK1の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したTAOK1、あるいはTAOK1の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4～11.11）。
　抗体の作製に免疫抗原として使用されるTAOK1は、公知の遺伝子配列情報に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
　具体的には、TAOK1をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。またTAOK1の部分ペプチドは、公知の遺伝子配列情報に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
　また本発明の抗体は、TAOK1の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、TAOK1と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つTAOK1のアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
　かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、BCG（カルメット－ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
　TAOK1機能抑制剤としては、上記以外にも、TAOK1に結合性を有する（好ましくは、特異的結合性を有する）分子（例えば、ペプチド、タンパク質、人工抗体、アプタマー等）であれば、使用することが可能である。また、TAOK1機能抑制剤として抗体等のタンパク質又はペプチドを採用する場合は、それに代えて、その発現カセットを採用することもできる。発現カセットについては、上記「2-2-1．TAOK1発現抑制剤」における定義と同様である。
　2-3．用途、その他の成分
　後述の実施例で明らかにされているように、TAOK1抑制剤は、心筋細胞死（例えば、心筋細胞のミトコンドリア機能障害、心筋細胞のDNA障害、心筋細胞のアポトーシス、心筋細胞の低酸素負荷（例えば、心筋梗塞等の虚血性心疾患）等による心筋細胞死）の抑制作用、心機能障害（例えば、心筋細胞死、心筋細胞のミトコンドリア機能障害、心筋細胞のDNA障害、心筋細胞のアポトーシス、心筋細胞の低酸素負荷（例えば、心筋梗塞等の虚血性心疾患）等による心機能障害）の軽減作用を有する。また、TAOK1抑制剤は、心筋細胞のミトコンドリア機能障害（例えば酸素消費量の低下、ミトコンドリア膜電位の低下、活性酸素増加）の抑制作用、心筋細胞のDNA障害の抑制作用、心筋細胞のアポトーシスの抑制作用を有する。
　特に、TAOK1抑制剤は、抗がん剤治療に起因する心筋細胞死に対して抑制作用を有し、さらに抗がん剤治療に起因する心機能障害の軽減作用を有する。また、特に、TAOK1抑制剤は、抗がん剤治療に起因する心筋細胞のミトコンドリア機能障害（例えば酸素消費量の低下、ミトコンドリア膜電位の低下、活性酸素増加）に対して抑制作用を有し、抗がん剤治療に起因する心筋細胞のDNA障害に対して抑制作用を有し、抗がん剤治療に起因する心筋細胞のアポトーシスに対して抑制作用を有する。
　TAOK1発現抑制剤及びTAOK1機能抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種（有効成分）は、心筋細胞死（特に、抗がん剤治療に起因する心筋細胞死、又は心筋細胞の低酸素負荷（例えば、心筋梗塞等の虚血性心疾患）に起因する心筋細胞死）の抑制、心筋障害・心不全（特に、抗がん剤治療に起因する心筋障害・心不全、又は心筋細胞の低酸素負荷（例えば、心筋梗塞等の虚血性心疾患）に起因する心筋障害・心不全）の予防又は治療、心筋細胞のミトコンドリア機能障害（例えば酸素消費量の低下、ミトコンドリア膜電位の低下、活性酸素増加）（特に、抗がん剤治療に起因する心筋細胞のミトコンドリア機能障害）の抑制、心筋細胞のDNA障害（特に、抗がん剤治療に起因する心筋細胞のDNA障害）の抑制、心筋細胞のアポトーシス（特に、抗がん剤治療に起因する心筋細胞のアポトーシス）の抑制に有効である。この有効成分は、例えば医薬、試薬の他、食品組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）など）の有効成分としての利用が可能である。有効成分は、これをそのまま、あるいは慣用の成分とともに各種組成物となし、動物、ヒト、及び各種細胞に適用（例えば、投与、摂取、接種など）することができる。
　抗がん剤としては、心筋細胞死、心機能障害、心筋細胞のミトコンドリア機能障害、心筋細胞のDNA障害、心筋細胞のアポトーシスを引き起こすものである限り特に制限されない。好適には、アントラサイクリン系抗がん剤が挙げられる。アントラサイクリン系抗がん剤としては、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、リポソーム系ドキソルビシン、ミトキサントロン等が挙げられる。抗がん剤としては、そのほかにも、例えば抗HER2抗体（トラスツズマブ）、VEGF阻害剤（ベバシズマブ）、チロシンキナーゼ阻害薬（スニチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、オシメルチニブ）、MEK阻害薬（トラメチニブ）等が挙げられる。
　本発明の剤は、抗がん剤と併用投与されるように用いられることが好ましい。これにより、抗がん剤治療に起因する心筋細胞死、心筋障害、心不全、心筋細胞のミトコンドリア機能障害、心筋細胞のDNA障害、心筋細胞のアポトーシス等を、抑制、予防、治療することができる。併用のタイミングは特に制限されず、例えば本発明の剤と抗がん剤とが同時又は同日摂取であってもよいし、一方の摂取日の1又は複数日（例えば2～14日）前又は後に他方を摂取してもよい。
　本発明の剤の対象細胞の細胞種は、TAOK1を発現し得る細胞種である限り特に限定されないが、特に好適には心筋細胞である。
　本発明の剤の対象生物は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどの種々の哺乳類動物などが挙げられる。
　本発明の剤の形態は、特に限定されず、本発明の剤の用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
　形態としては、用途が医薬、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、点鼻剤、吸入剤、肛門坐剤、挿入剤、浣腸剤、ゼリー剤、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられる。
　形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキーなどが挙げられる。
　本発明の剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば医薬、食品組成物、健康増進剤、栄養補助剤（サプリメントなど）などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
　本発明の剤の有効成分の含有量は、有効成分の種類、用途、使用態様、適用対象、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001～100重量％、好ましくは0.001～50重量％とすることができる。
　本発明の剤の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、薬効を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の重量として、一般に一日あたり0.1～1000 mg/kg体重である。上記投与量は1日1回又は2～3回に分けて投与するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
　3．スクリーニング方法
　本発明は、その一態様において、被検物質で処理された動物又は細胞由来の被検試料におけるTAOK1の量、濃度、又はキナーゼ活性を指標とする、心筋細胞死の抑制剤の有効成分、又は心筋障害及び心不全からなる群より選択される少なくとも1種の心疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法（本明細書において、「本発明の有効成分スクリーニング方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
　被検試料は、動物又は細胞由来のTAOK1を検出可能な試料である限り、特に制限されない。被検試料として、好ましくは心筋細胞が挙げられる。
　TAOK1の量、濃度の測定方法は、特に制限されない。例えば、質量分析法、対象バイオマーカーを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法（例えばELISA法、EIA法、RIA法、ウェスタンブロッティング法等）、ノーザンハイブリダイゼーション法、DNAマイクロアレイ法、PCR法等を挙げることができる。
　TAOK1のキナーゼ活性の測定方法も、特に制限されない。公知のキナーゼ活性測定方法に従って又は準じて測定することができる。
　動物の生物種は特に制限されない。動物の生物種としては、例えばサル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられる。
　被検物質としては、天然に存在する化合物又は人工に作られた化合物を問わず広く使用することができる。また、精製された化合物に限らず、多種の化合物を混合した組成物や、動植物の抽出液も使用することができる。化合物には、低分子化合物に限らず、タンパク質、核酸、多糖類等の高分子化合物も包含される。
　本発明の有効成分スクリーニング方法は、より具体的には、TAOK1に関する前記指標の値が、被検物質で処理されていない場合の被検試料におけるTAOK1に関する前記指標の値よりも低い場合に、前記被検物質を、心筋細胞死の抑制剤の有効成分、又は心筋障害及び心不全からなる群より選択される少なくとも1種の心疾患の予防又は治療剤の有効成分として選択する工程、を含む。
　「低い」とは、例えば指標の値が、対照値の9/10、8/10、7/10、6/10、1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、又は1/100以下であることを意味する。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．心筋細胞を用いたスクリーニング
　図１に記載のスキームに従って、ドキソルビシンによる心筋細胞死に関与する遺伝子をスクリーニングした。具体的には以下のようにして行った。
　＜1-1．細胞培養＞
　健常人由来ヒト多能性幹細胞（iPS細胞）（SCVI-273）はStanford University Cardiovascular Institute Biobank （https://med.stanford.edu/scvibiobank.html）より提供を受け、Growth Factor Reduced マトリゲル（Corning）上のノンフィーダー環境においてEssential 8 培地（Thermo Fisher）にて維持培養を行った。既存の報告（Circulation. 2019 May 21;139(21):2451-2465. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.037357.）に基づきに低分子化合物を用いて心筋細胞に指向性分化を行ない、無グルコース培地にて純化を行なった後、RPMI1640およびB27 培地（Thermo Fisher）で維持を行ない実験に使用した。iPS細胞、iPS細胞由来心筋細胞はAccutase（Nacalai Tesque）、Accutase（Nacalai Tesque）で各々剥離した。すべての細胞株は、5％CO2 37度の環境下でインキュベーター内で維持した。
　＜1-2．レンチウイルスベースCRISPRシングルベクターコンストラクトの作成＞　763の全キナーゼを標的としたターゲットgRNAを標的としたCas9発現レンチウイルスライブラリー（addgene plasmid #75314, #75315）からpsPAX2（addgene plasmid # 12260）とpMD2.G（addgene plasmid #12259）を用いたパッケージングシステム（パッケージング用細胞株はLenti-X 293Tを使用）にてレンチウイルスベクターを作成し、48-72時間後にウイルス液として回収した。
　＜1-3．CRISPR/Cas9システムを用いた心筋細胞生存スクリーニング＞　iPS細胞由来心筋細胞5,000,000-10,000,000細胞にMOI=0.3-0.5でCas9発現レンチウイルスgRNAライブラリーを感染させ、ピューロマイシン（2 μg/ml）にて非感染細胞を死滅させたのち、14日後にドキソルビシン（0.5μM）にて72時間の処理および非処理群の各々の群を作成し細胞を回収した。回収した細胞よりNucleoSpin（登録商標） Tissue（Macherey-Nagel）を用いてゲノムDNAを回収し、既報（Nature. 2019 Nov;575(7782):375-379. doi: 10.1038/s41586-019-1667-4.）に基づいて3step-PCRにてライブラリーを調整した。調整したライブラリーはNovaSeq6000を用いてシークエンスされ、Cutadaptにてアダプター配列を取り除いた後、Brunello library gRNA配列情報に基づいてアライメントを行い、MAGeCK プログラムを用いて各遺伝子におけるRRAスコアを算出した（Genome Biol. 2014;15(12):554. doi: 10.1186/s13059-014-0554-4.）。
　＜1-4．結果＞
　RPAスコアのランキングの上位から、TAOK1を候補遺伝子として選択した。TAOK1は、がんに対する効果が知られているものの（特許文献１）、心筋細胞死との関連は知られていない。
　試験例2．TAOK1遺伝子の標的遺伝子としての評価1
　TAOK1をノックアウトし、ドキソルビシン処理後の心筋細胞の生存率を調べた。具体的には以下のようにして行った。以下に記載の無い点については、試験例1と同様にして行った。
　＜2-1．CRISPR/Cas9システムによるTAOK1ノックアウト＞
　TAOK1を標的とした二種類のgRNA（TAOK 1-1, 1-2）および二種類の非標的gRNA（NTC1, 2）をLentiCRISPRv2puro（addgene plasmid #98290）に組み込み、上記と同様の方法でレンチウイルスベクターを作成し、MOI=0.8-1.0でiPS細胞由来心筋細胞に感染させ、ピューロマイシン（2 μg/ml）にて非感染細胞を死滅させたのち、120,000 cells/cm2の細胞濃度で再播種を行い、14日後以降に実験に使用した。
　＜2-2．細胞生存率定量＞
　レンチウイルスベクター感染後ピューロマイシンにて薬剤選択を行ったiPS細胞由来心筋細胞をGrowth Factor Reduced マトリゲルでコーティングした96ウェルプレートに播種し、ウイルスベクター感染後14日後以降にドキソルビシンを加え、3日後にPrestoBlue試薬（Thermo Fisher）を用いてSpectraMaxM2e（molecular devices）にて細胞生存率を測定した。
　＜2-3．生細胞/死細胞染色＞
　レンチウイルスベクター感染後ピューロマイシンにて薬剤選択を行ったiPS細胞由来心筋細胞をGrowth Factor Reduced マトリゲルでコーティングしたガラスボトムディッシュに播種し、ウイルスベクター感染後14日後以降にドキソルビシンを加え、1日後にCellstain（登録商標）-Double Staining Kit （Dojindo）にて染色を行い、BZ-X800 （Keyence）にて撮像を行なった。
　＜2-4．結果＞
　細胞生存率の定量結果を図２に示す。また、生細胞/死細胞染色結果を図３に示す。TAOK1ノックアウトによりドキソルビシン処理後の心筋細胞の生存率が大幅に改善することが分かった。心筋細胞死は、心疾患、特に心筋障害及び心不全の発症及び悪化に関与していることが知られている。このため、TAOK1抑制は、これらの疾患の予防又は治療に有効であると考えられた。
　試験例3．TAOK1遺伝子の標的遺伝子としての評価2
　TAOK1阻害剤（特許文献1：化合物43）で処理し、ドキソルビシン処理後の心筋細胞の生存率を調べた。具体的には以下のようにして行った。以下に記載の無い点については、試験例1と同様にして行った。
　iPS細胞由来心筋細胞をGrowth Factor Reduced マトリゲルでコーティングした96ウェルプレートに播種し、播種後5日目以降にTAOK1阻害剤C43（MedChemExpress）およびドキソルビシンを同時に加え、3日後にPrestoBlue試薬を用いてSpectraMaxM2eにて細胞生存率を測定した。
　結果を図４に示す。TAOK1阻害剤により、ドキソルビシンによる心筋細胞死が抑制されることが分かった。
　試験例4．TAOK1遺伝子の標的遺伝子としての評価3
　TAOK1をノックダウンし、ドキソルビシン処理後の心機能評価及び遺伝子発現測定を行った。概要を図５に示す。具体的には以下のようにして行った。
　ヘアピン型RNA（shRNA）発現自己相補型アデノ随伴ウイルスセロタイプ 9 ベクター(AAV9-sh）はVectorBuilder社にて作成された。ベクターを8-10週齢の野生型C57BL/6雄に1匹あたりTAOK1を標的としたAAV9-sh-TAOK1、ないしは非標的AAV-sh-Scrambleを1 × 1011vg眼窩静脈叢より投与し、3週間後よりマウス腹腔内に毎週5mg/kg、5週間、ドキソルビシン投与を行い、心臓超音波装置Vevo 2100（FUJIFILM）にて心機能の評価を行なった。実験を終了したマウスは麻酔薬の多量投与により安楽死させ、心臓を回収した。回収したマウス心臓はDirect-zol RNA Kit （Zymo Research）を使用してtotal RNAの抽出を行った。回収したRNAよりPrimeScript RT reagent Kit（Takara）を用いて逆転写を行い、CFX 384 Real-Time system（Biorad）にてKAPA SYBR FAST qPCR kitを用いて遺伝子発現の評価を行なった。
　結果を図６に示す。TAO1ノックダウンは、ドキソルビシンによる心機能障害を軽減することが分かった。
　試験例5．TAOK1遺伝子の標的遺伝子としての評価4
　試験例2-1と同様にして、iPS細胞由来心筋細胞からTAOK1ノックアウト細胞を得た。得られた細胞をドキソルビシン0μMないしは1μMにて3時間処理を行い、酸素消費量をSeahorse XFe 96 Flux Analyzer (Agilent)およびSeahorse XF Cell Mito Stress Test Kit (Agilent)を用いて測定した。
　酸素消費量の測定結果を図７に示す。ドキソルビシン処理により心筋細胞の酸素消費量は大幅に低下した。非特異的ノックアウト群に比較して、TAOK1ノックアウト群では酸素消費量の低下が軽減されていた。
　試験例6．TAOK1遺伝子の標的遺伝子としての評価5
　試験例2-1と同様にして、iPS細胞由来心筋細胞からTAOK1ノックアウト細胞を得た。得られた細胞をドキソルビシン0、1、ないしは2μMにて3時間処理を行いCell Meter JC-10(AAT bioquest)およびROS Assay（Dojindo）を用いて各々ミトコンドリア膜電位および活性酸素（ROS）の計測を行った。
　ミトコンドリア膜電位および活性酸素生成量の測定結果を図８に示す。ドキソルビシン処理によるミトコンドリア膜電位の低下および活性酸素の生成はTAOK1ノックアウトにて軽減された。
　試験例7．TAOK1遺伝子の標的遺伝子としての評価6
　試験例2-1と同様にして、iPS細胞由来心筋細胞からTAOK1ノックアウト細胞を得た。得られた細胞をドキソルビシン0ないしは1μMにて24時間処理を行い、Accutase(Nacalai Tesque)にて細胞を回収した。4％PFAにて固定後、Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody(biolegend, 613401)およびAnti-Cardiac Troponin T antibody （abcam, ab45932）にて染色を行いフローサイトメトリー(SONY, MA900)にてトロポニンT陽性細胞中のγH2AX陽性細胞を検出した。
　トロポニンT陽性細胞中のγH2AX陽性細胞の割合を図９に示す。ドキソルビシン処理によるDNA損傷マーカーであるγH2AX陽性細胞の増加はTAOK1ノックアウトにて軽減された。
　試験例8．TAOK1遺伝子の標的遺伝子としての評価7
　試験例2-1と同様にして、iPS細胞由来心筋細胞からTAOK1ノックアウト細胞を得た。得られた細胞をドキソルビシン1μMにて24時間処理を行い蛋白質を回収し、ウェスタンブロットにてp38のリン酸化を評価した（9216, 9212 Cell Signaling Technology）。
　p38量に対するリン酸化p38量の割合の測定結果を図１０に示す。TAOK1ノックアウト心筋細胞ではp38経路の抑制が認められ、ドキソルビシンによるp38の活性化が阻害されていた。
　試験例9．TAOK1遺伝子の標的遺伝子としての評価8
　ヒトiPS細胞(line1:SCVI-273およびline2: SCVI-116)より分化誘導した心筋細胞およびヒト子宮頸がん由来のHela細胞、ヒト乳がん由来のMCF7細胞を用いて、siRNA (Silencer Select, Thermo Fisher Scientific)にてTAOK1遺伝子のノックダウンを行い、siRNA投与3日目よりドキソルビシン2μMを投与。ドキソルビシン投与後3日目にPrestoBlue試薬にて細胞生存率を測定した。
　細胞生存率の測定結果を図１１に示す。ドキソルビシン処理により、ヒト心筋細胞ではTAOK1ノックダウン群は非特異的遺伝子ノックダウン群と比較して細胞生存率が改善していた。一方、ヒトがん細胞株ではTAOK1ノックダウン群は非特異的遺伝子ノックダウン群と比較して細胞生存率の改善は認められなかった。
　試験例10．TAOK1遺伝子の標的遺伝子としての評価9
　試験例4の心機能評価時（図６のWeek8）に回収したマウスの心臓を使用した。回収した心臓を4％PFAにて固定し、パラフィン包埋した後に切片スライドを作成し、線維化をPicosirius Red、アポトーシスをTUNEL染色にて評価した。
　組織染色像を図１２に示す。TAOK1ノックダウン群では非特異的遺伝子ノックダウン群と比較してドキソルビシンによるマウス心臓での繊維化および細胞死が軽減されていた。
　試験例11．TAOK1遺伝子の標的遺伝子としての評価10
　ヒトiPS細胞由来心筋細胞においてsiRNA (Silencer Select, Thermo Fisher Scientific)にてTAOK1遺伝子のノックダウンを行い、siRNA投与3日目よりBIONIX低酸素培養キット（Sugiyamagen）にて0.1％酸素条件下にて16時間培養を行い、細胞死を誘導した。Cellstain- Double Staining Kit（Dojindo）により生存細胞を染色後、画像取得を行った。 
　細胞染色像を図１３に示す。TAOK1のノックダウン群では低酸素条件下において生存する心筋細胞は増加していた。
　試験例12．TAOK1遺伝子の標的遺伝子としての評価11
　ヒトiPS細胞由来心筋細胞においてsiRNA (Silencer Select, Thermo Fisher Scientific)にてTAOK1遺伝子のノックダウンを行い、siRNA投与3日目よりBIONIX低酸素培養キット（Sugiyamagen）にて0.1％酸素条件下にて16時間培養を行い、細胞死を誘導した。死細胞を７AAD試薬を用いたフローサイトメトリーによる定量評価を行った。
　死細胞の割合を図１４に示す。TAOK1のノックダウン群では低酸素条件下において心筋細胞死は減少していた。

Claims (11)

  1. TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分を含有する、心筋細胞死の抑制剤。
  2. 前記成分が、TAOK1を標的としたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドの発現カセット、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、及び抗体からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１に記載の抑制剤。
  3. 前記心筋細胞死が抗がん剤治療に起因する心筋細胞死である、請求項１に記載の抑制剤。
  4. 抗がん剤と併用投与されるように用いられる、請求項１に記載の抑制剤。
  5. 前記抗がん剤がアントラサイクリン系抗がん剤である、請求項３又は４に記載の抑制剤。
  6. 心疾患の予防又は治療に用いるための、請求項１に記載の抑制剤。
  7. 前記心疾患が心筋障害及び心不全からなる群より選択される少なくとも1種の心疾患である、請求項６に記載の抑制剤。
  8. 前記心疾患が抗がん剤治療に起因する心疾患である、請求項６に記載の抑制剤。
  9. TAOK1機能抑制剤及びTAOK1発現抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種の成分を含有する、心筋障害及び心不全からなる群より選択される少なくとも1種の心疾患の予防又は治療剤。
  10. 前記心疾患が抗がん剤治療に起因する心疾患である、請求項９に記載の予防又は治療剤。
  11. 被検物質で処理された動物又は細胞由来の被検試料におけるTAOK1の量、濃度、又はキナーゼ活性を指標とする、心筋細胞死の抑制剤の有効成分、又は心筋障害及び心不全からなる群より選択される少なくとも1種の心疾患の予防又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法。 
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