WO2004027061A1

WO2004027061A1 - 抗増殖性疾患治療薬のスクリーニング方法

Info

Publication number: WO2004027061A1
Application number: PCT/JP2003/011765
Authority: WO
Inventors: Masahiro Takeuchi
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.; The Circle For The Promotion Of Science And Engineering
Priority date: 2002-09-17
Filing date: 2003-09-16
Publication date: 2004-04-01
Also published as: AU2003264441A1; AU2003264441A8; JPWO2004027061A1

Abstract

　ＦＢＰを抑制するか否かを分析する工程、及び、ＦＢＰ−２を抑制するか否かを分析する工程を含む、スクリーニング方法を開示する。また、ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質を有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物を開示する。更に、ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質を投与することからなる、増殖性疾患治療方法を開示する。　前記スクリーニング方法は、増殖性疾患治療薬として有用な物質を得るためのスクリーニング系として有用である。前記増殖性疾患治療用医薬組成物及び増殖性疾患治療方法は、新たな作用機序に基づく。

Description

明細書抗増殖性疾患治療薬のスクリーニング法技術分野

本発明は、増殖性疾患治療薬のスクリーニング法に関する。背景技術

癌をはじめとする増殖性疾患は、細胞外刺激に対する伝達機構、細胞の基礎的代謝機構、細胞周期進行に直接的に関わる機構、又はアポトーシスなどの細胞死に直接関わる機構を標的としてその治療が試みられてきた。しかし、毒性などの種々の理由から、未だ完治につながる分子標的型治療法は確立していない。

遺伝子発現異常に基づく細胞死調節の脱制御は、増殖性疾患の原因と考えられるが、増殖性疾患の理想的な治療標的分子に関しては同定されていない。遺伝子転写を司る転写因子は一般には二本鎖 DN Aを標的とするが、 KH (h n RNP K p r o t e i n Homo l o g y) ドメインを有する或るクラスの D N A 結合性タンパク質は、特異的な一本鎖 DN Aに結合し、遺伝子転写を活性化することが知られている（非特許文献 1 ) 。そのクラスに属する FBP (FUSE— B i n d i n P r o t e i n) は、細胞増殖及び細胞分化に関わる c一 m y c癌原遺伝子のプロモーター配列の 1 500塩基対上流に位置するフューズ（F US E, f a r u p s t r e am e l eme n t) の逆向き一本鎖 D N Aに結合するタンパク質として単離■同定された（非特許文献 2) 。アンチセンスを用いて F BPの発現抑制を行なうと、細胞増殖抑制はおきるが、細胞死は誘導されないこと（非特許文献 3) 、 F BPはフューズに結合する以外に、 DNAヘリカーゼ活性を有する T FllH (T r a n s c r i p t i o n F a c t o r II H) と結合しうること（非特許文献 4) 、 F BPの発現抑制が腫瘍細胞成長を阻むこと（特許文献 1〜3) 、分化により FBPの mRNAは減少すること（非特許文献 2) が知られている。また、 KHドメインを含む構造的特徴及びアミノ酸配列に関して、 FBPとの類似性が高いタンパク質として、 FBP— 2及び FB P-3が知られておリ、分化誘導により F B Pの発現が止まるが、 F B P— 2の発現抑制は不完全であり、 F BP— 3は分化誘導による発現抑制されない（非特許文献 5) 。し力、し、これら 3種の F BPタンパク質の本質的な細胞内機能は不明であり、細胞死調節への関与は知られていない。

(非特許文献 1 ) 「プロシーディングス 'ォブ■ザ■ナショナル'ァカデミ一-ォブ'サイエンス■ォブ■ザ■ュナイテツド■ステイツ■ォブ 'アメリカ

(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) 」，（アメリカ）， 1996年，第 95巻， p.5830-5835

(非特許文献 2) 「ジーンズ'アンド 'ディべロブメント（Genes and

Development) 」，（アメリカ）， 1994年，第 8巻， ρ· 465-480

(非特許文献 3) 「ザ■ェンボ■ジャーナル（The EMBO Journal) 」，（ドィッ）， 2000年，第 19巻， p.1034-1044

(非特許文献 4) 「モレキュラー 'セル（Molecular Cel l) 」，（アメリカ）， 2000年，第 5巻， p.331-341

(非特許文献 5) 「ザ■ジャーナル 'ォブ 'バイオロジカル'ケミストリ一

(The Journal of Biological Chemistry) J , (アメリカ）， 1996年，第 271巻, p.31679-31687

(特許文献 1 ) 国際公開 VV09419465号パンフレツト

(特許文献 2) 米国特許第 US 5734016号明細書

(特許文献 3 ) 米国特許第 US 5580760号明細書発明の開示

本発明の課題は、癌をはじめとする増殖性疾患の治療薬を得るための新たな標的分子を見出し、増殖性疾患治療薬として有用な物質を得るための新たなスクリ一二ング系及び新たな作用機序に基づく増殖性疾患治療用医薬組成物を提供するしと I あ o

本発明者は、鋭意研究を行なった結果、癌細胞において、 FBP、 FBP— 2, 及び FBP— 3の内、 FBP、 FBP— 2、若しくは F B P— 3の単独発現抑制, 又は F B P及び FBP— 3、若しくは FBP— 2及び F B P— 3の同時発現抑制を行なっても細胞死が誘導されないが、 F B P及び F B P— 2の同時発現抑制を行なうと細胞死が誘導されることを見出した。増殖性疾患では病巣における異常な細胞増殖を抑制することが治療標的と考えられる為、前記知見に基づき、 FB P及び F B P— 2を抑制する物質を選択することにより新たな増殖性疾患治療薬スクリーニング、並びに F BP及び F BP— 2を抑制する物質、又は、 FBPを抑制する物質及び F B P— 2を抑制する物質を投与することによリ新たな増殖性疾患治療が可能になることを明らかにし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、

[1 ] F BPを抑制するか否かを分析する工程、及び、 FBP— 2を抑制するか否かを分析する工程を含む、増殖性疾患治療薬として有用な物質のスクリーニング方法；

[2] 抑制が発現抑制である、 [1] に記載のスクリーニング方法；

[3] 増殖性疾患が癌である、 [1 ] 又は [2] に記載のスクリーニング方法；

[4] [1 ] に記載の分析工程、及び製剤化工程を含む、増殖性疾患治療用医薬組成物の製造方法；

[5] [1 ] に記載のスクリーニング方法で得ることができる物質を有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物；

[6] FBPを抑制する物質及び FBP— 2を抑制する物質、又は FBP及び F BP-2を抑制する物質を有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物；

[7] F BPを抑制する物質及び F BP— 2を抑制する物質、又は、 FBP及び FBP-2を抑制する物質を投与することを含む、増殖性疾患治療方法；

[8] F BPを抑制する物質及び F BP— 2を抑制する物質、又は、 FBP及び F BP— 2を抑制する物質の、増殖性疾患治療用医薬組成物製造のための使用；

[9] F BP及び Z又は F BP— 2の DN A塩基配列の A Aに続く 1 9〜21塩基からなる、 F B P及び Z又は F B P— 2に特異的な塩基配列に基づいて設計される s i RNA ;

[1 0] (1 ) 二重鎖 RNA部分が、配列番号 1 3で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の 3' 末端が 1若しくは 2塩基欠失した塩基配列からなる s i RN A；

(2) 二重鎖 RNA部分が、配列番号 1 4で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の 3' 末端が 1若しくは 2塩基欠失した塩基配列からなる s i RNA；あるいは (3) 二重鎖 RNA部分が、配列番号 1 5で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の 3' 末端が 1若しくは 2塩基欠失した塩基配列からなる s i RNA ;並びに

[1 1 ] [9] 又は [1 0] に記載の s i RNAを有効成分とする、増殖性疾患 ίム療 ί]

Π 用医薬組成物

に関する。

「増殖性疾患」とは、病巣における細胞の異常増殖に基づく疾患であり、例えば、種々組織に病巣を有する癌、関節部位に病巣を有するリウマチ、腎臓メサンギゥム細胞の病巣を有する腎疾患、前立腺間質に病巣を有する前立腺肥大症、あるいは、血管に病巣を有する動脈硬化などが挙げられる。

本発明の「増殖性疾患治療用医薬組成物」若しくは「増殖性疾患治療方法」としては、「癌治療用医薬組成物」若しくは「癌治療方法」が好ましい。「FBP を抑制する物質」又は「F BP— 2を抑制する物質」としては、それぞれ、「F BPの発現を抑制する物質」又は「FBP— 2の発現を抑制する物質」が好ましい。また、「増殖性疾患治療用医薬組成物」としては、 F BPを抑制する物質及び FBP— 2を抑制する物質、又は、 FBP及び FBP— 2を抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物が好ましいが、 F B Pを抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物と F B P— 2を抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物とを併用することもでき、 F B Pを抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物と併用用の F B P— 2 を抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物、及び、 FBP— 2を抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物と併用用の F B Pを抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物も本発明に含まれる。

本明細書において、「_s i RNA」とは、小分子量干渉 RNA (sma I I i n t e r f e r i n g RNA) を意味する。 s i RNAは、二重鎖の RNA 部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の 3' 末端のオーバーハングとからなリ、 RNA干渉（RNA i ； RNA i n t e r f e r e n c e) と呼ばれる配列特異的な遺伝子発現抑制を誘導する（Fire, Α·等， Nature, 391, 806- 811, 1998) 。

また、本発明の s i RNAとしては、配列番号 5で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 9で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる s i RN A；

配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 1 0で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる s i RNA；又は

配列番号 8で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 1 2で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる s i RNA

がより好ましい。

本明細書において、「FBP」は、細胞増殖及び細胞分化に関わる c一 my c 癌原遺伝子のプロモーター配列の 1 500塩基対上流に位置するフユ一ズ（FU S E, f a r u p s t r e am e l eme n t) の逆向き一本鎖 D N Aに結合するタンパク質として単離 '同定された（Genes Dev., 8， 465-480, 1994) 公知のヒトタンパク質である。また、「FBP— 2」及び「FBP— 3」は、アミノ酸配列に関して、前記 F BPとの類似性が高い公知のヒトタンパク質（J. Biol. Chem. , 271, 31679-31687, 1996) である。図面の簡単な説明

図 1は、各種 s i RNAを導入した PC 3癌細胞株における、 FBP、 FBP —2、及び FBP— 3の発現抑制の結果を示す、図面に代わる写真である。

(a) は導入後 24時間、（b) は導入後 48時間、（c) は導入後 72時間後の結果を示す。また、記号「Ac t」は、ァクチンを意味する。

図 2は、各種 _S i RNAを導入した PC3癌細胞株における、生細胞数の変化を示すグラフである。縦軸は細胞数を、横軸は導入後時間（時間）を示す。図 3は、各種 s i RNAを導入した H e La S3癌細胞株における、生細胞数の変化を示すグラフである。縦軸は細胞数を、横軸は導入後時間（時間）を示す発明を実施するた'めの最良の形態

1. 本発明のスクリーニング方法

本発明のスクリーニング方法は、 F BPを抑制するか否かを分析（すなわち、検出又は測定）する工程、及び、 F BP— 2を抑制するか否かを分析する工程を含む、増殖性疾患治療薬として有用な物質のスクリーニング方法である。 FBP 及び F BP— 2の「抑制」には、 FBP及び FBP— 2の「発現抑制」及び「機能抑制」の両方が含まれるが、「発現抑制」がより好ましい。

(1 ) F BP及び F BP— 2の発現を抑制するか否かを分析する方法

FBPをコードする mRNA及び FBP— 2をコードする mRNA、又は、 F B Pタンパク質の発現及び F B P— 2タンパク質の発現を抑制するか否かを分析することにより、増殖性疾患治療薬として有用な物質のスクリ一二ングが可能である。具体的には、細胞における FBP及び FBP— 2の発現量の変化を分析することによってスクリーニングすることができる。

FBPをコードする mRNA及び FBP— 2をコードする mRNA、又は、 F BP及び FBP— 2タンパク質が、特定の細胞において産生されるか否かを決定するために、多様な核酸技術及び免疫学的技術を使用することができる。

例えば、 FBP及び FBP— 2を発現する任意のヒト細胞、若しくは、 FBP を発現する任意のヒト細胞及び F BP— 2を発現する任意のヒト細胞を用い、試験物質の存在下若しくは非存在下で培養した後、細胞の抽出物を調製し、次いで, 抽出物を分析することにより、前記試験物質が FBPの mRNA及び FBP— 2 の mRNA、又は、タンパク質の発現を減少若しくは抑制するか否かを分析することができ。すなわち、 FBP及び FBP— 2発現を減少若しくは抑制する試験物質は、前記試験物質を含むサンプルに存在する F B Pの m R N A及び F B P — 2の mRNA、並びに、タンパク質の量を減少させるので、公知の分析方法、例えば、ノーザンプロット又は E L I S A法 [例えば、 FBP及び又は FBP —2を認識する抗体をプレート等の固相に吸着させた後、そこに試験物質を含むサンプルを加え、次いで、先の抗体とは抗原ェピトープが異なる F BP及び FB P— 2を認識する抗体、又は、 F BPを認識する抗体及び F BP— 2を認識する抗体を加えて、後者の抗体の固相への結合度合いを分析する（Methods in

Enzymology, 118, 742-766, 1986) ] 等で同定することができる。 F BPの発現抑制及び F BP— 2の発現抑制は、同時に分析することもできるし、順次分析することもできる。より具体的には、実施例 2に記載した方法で、 FBP及び FB P-2の発現抑制を分析することができる。

本発明のスクリーニング方法は、例えば、 F BP及び Z又は F BP— 2を発現する細胞（好ましくはヒト細胞）を、試験物質の存在下若しくは非存在下で培養する工程、並びに、試験物質存在下で培養した前記細胞における FBPの mRN A及び FBP— 2の mRN A、又は、タンパク質の量が、試験物質非存在下で培養した前記細胞と比較して減少したか否かを分析する工程を含む。

別の方法としては、プロモータ一活性の阻害は下流の遺伝子の転写の抑制を生じる一般的事象に基づき、 FBP及び FBP— 2の各プロモータ一領域を、それぞれ、レポーター遺伝子（例えば、ルシフ Xラーゼ遺伝子）上流に連結した作動可能なベクター、あるいは、 F BPのプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結した作動可能なベクター及び F BP— 2のプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結した作動可能なべクターを作製し、外因的に導入した宿主細胞を利用し. 試験物質の存在下若しくは非存在下におけるレポーター活性（例えば、ルシフエラーゼ活性）を分析することにより、前記試験物質がレポーター遺伝子の発現を減少又は抑制するか否かを分析することができる。 F B Pの発現抑制及び F B P 一 2の発現抑制は、 FBP及び FBP— 2の各プロモータ一領域をレポ一タ一遺伝子上流に連結した作動可能なベクター、あるいは、 F BPのプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結した作動可能なべクター及び FBP— 2のプロモータ一領域をレポーター遺伝子に連結した作動可能なべクターを導入した宿主細胞を用い、同時に分析することもできるし、 FBPのプロモーター領域をレポ一ター遺伝子に連結した作動可能なベクターを導入した宿主細胞、及び、 F BP— 2のプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結した作動可能なベクターを導入した宿主細胞を用いて分析することもできる。

前記ベクターとしては、例えば、 F BP及び又は F BP— 2の各プロモータ —領域（例えば、 FBPのプロモーター領域としては、ゲノム登録番号 AC01 1 539の塩基配列における、開始コドン AT Gの上流域を用いることができ、 F BP— 2のプロモーター領域としては、ゲノム登録番号 AC 1 03591の塩基配列における、開始コドン ATGの上流域を用いることができる）をレポータ一遺伝子上流に連結した組み換え DN Aであって、しかも、一過的な複製、あるいは、宿主染色体への挿入を可能とするベクターを用いることができる。こうして外因的に得られた宿主細胞を試験物質の存在下又は非存在下で培養した後、細胞の抽出物を調製し、次いで、抽出物を分析することにより、前記試験物質が F B P及び F B P— 2のプロモーター活性を減少又は抑制するか否かを決定することができる。 F B P及び F B P— 2のプロモーター活性を減少又は抑制する試験物質は、前記試験物質を含むサンプルに存在するレポーター活性の量を減少させるので、それを指標として同定することができる。

発明のスクリーニング方法は、例えば、 F BP及び又は F BP— 2の各プロモーター領域の下流にレポーター遺伝子を連結したベクターで形質転換した細胞を、 Ϊ式験物質の存在下又は非存在下で培養する工程、並びに、試験物質存在下で培養した前記細胞におけるレポーター活性が、試験物質非存在下で培養した前記細胞と比較して減少したか否かを分析する工程を含む。

(2) FB P及び F B P— 2の機能を抑制するか否かを分析する方法

FBP及び FBP— 2の機能を発揮するためには、 F B P及び F B P— 2力《結合分子と相互作用をする必要がある。そこで、 FBP及び FBP— 2と結合分子との相互作用を阻害することを指標に、 F B P及び F B P— 2の機能を抑制する物質を同定することができる。本発明には、 FBP及び FBP— 2と結合分子との会合を減少又は抑制する物質を同定することによる、増殖性疾患治療薬として有用な物質のスクリーニング方法が含まれる。

具体的には、試験物質の存在下又は非存在下で、 F BP及び F BP— 2と結合分子との会合が許容される条件下での混合後、前記試験物質が F B P及び F B P 一 2と結合分子との会合を減少又は抑制するか否かを分析することにより、分析することができる。 F B P及び F B P— 2と結合分子との会合を減少又は抑制する試験物質は、前記試験物質を含むサンプルに存在する会合の量を減少させるので、それを指標として同定することができる。

あるいは、 F BP及び F BP— 2に結合することを指標に、 F BP及び F BP —2の機能を抑制する物質を同定することができる。具体的には、 FBP及び F B P— 2タンパク質を捕獲プローブとして使用し、 F B P及び F B P— 2の結合分子を同定する。 F BP及び F BP— 2の結合分子は、本発明で見出した FBP 及び F BP— 2による細胞死調節を媒介する、生体分子（例えば、タンパク質、 DNA、 RNA、又は他の補因子）である。詳細には、周知の方法である酵母ッ一ハイブリッド系（Nature, 340， 245-247, 1989) 、あるいは、「8卩及ぴ又は F BP— 2を発現する任意のヒト細胞の抽出物若しくは画分と混合し、生化学的手法により、 FBP及び FBP— 2の結合分子を回収し、分析することができる。

前記項目（1 ) の FBP及び FBP— 2の発現を抑制するか否かを分析する方法、又は、前記項目（2) の FBP及び FBP— 2の機能を抑制するか否かを分析する方法を用いる本発明のスクリーニング方法でスクリーニングすることのできる試験物質は、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル■ケミストリー技術 (Tetrahedron, 51, 8135-8137， 1995) によって得られた化合物群, あるいは、ファージ 'ディスプレイ法（ ol. Biol., 222, 301-310, 1991) などを応用して作成されたランダム■ぺプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。

2. 細胞死誘導の確認

本発明のスクリーニング方法によれば、「FBP及び FBP— 2を抑制する物質」を得ることができる。「FBP及び FBP— 2を抑制する物質」を単独で、あるいは、「F BPを抑制する物質」及び「F BP— 2を抑制する物質」を併用すると、 FBP及び FBP— 2が同時に発現抑制され、細胞死が誘導される。本明細書において、細胞死の誘導は、所定の細胞集団において、細胞の数が減少することを意味する。また、細胞死の誘導効果は、例えば、実施例 3に記載の方法で確認することができる。好ましくは、所定の細胞集団における細胞の減少は、この集団における細胞のうちの少なくとも約 1 0%、好ましくは少なくとも 200/₀、よリ好ましくは少なくとも 40 o/o、更に好ましくは少なくとも約 50 % である。

3. 本発明の増殖性疾患治療用医薬組成物、及びその製造法

前項目 1. に記載の方法による分析工程、及び製剤化工程を含む、増殖性疾患治療用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。

本発明の医薬組成物の有効成分は、 F B Pを抑制する物質及び F B P— 2を抑 1765

10 制する物質、又は、 FBP及び FBP— 2を抑制する物質である限り、特に限定されるものではない。これらは、例えば、本発明のスクリーニング方法と同様の工程で、 FBP、 FBP— 2、又は、 F BP及び F BP— 2を抑制する物質を選択することにより得ることができる。

本発明の医薬組成物の有効成分として、例えば、 s i RN Aを用いることができる。 s i RNAは、二重鎖の RN A部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の 3' 末端のオーバーハングとからなリ、 RNA ίを誘導する。 RNA i は進化的に保存された現象で、 RN a s e Mlエンドヌクレアーゼによって生じる 21〜23塩基の s i RNAを介して起こる（Genes Dev. 15, 485-490, 2001) 。その 21〜23塩基の s i RNA間には、効果に差はあるもののいずれも RNA i効果を示す。また、 3' 側のオーバーハングはそれぞれ 1又は 2塩基の任意の核酸（リボ核酸又はデォキシリボ核酸）であるが、 2塩基が好ましく、標的に相補した塩基が好ましいが、相補していないものでも充分な RN A ί効果が認められる (EMB0. 丄， 20， 6877-7888, 2001； Genes Dev. , 15, 188-200, 2001) 。また、オーバーハングがない s i RNAも RNA ί効果を示す。

なお、前記塩基数（21〜23塩基）は、オーバーハングを含むセンス鎖又はアンチセンス鎖の各々の塩基数である。また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。

s i RNAの 3' 側オーバーハングを構成するリボ核酸としては、例えば、 U (ゥリジン）、 A (アデノシン）、 G (グアノシン）、又は C (シチジン）を用いることができ、 3' 側のオーバーハングを構成するデォキシリボ核酸としては, 例えば、 d T (チミジン）、 dA (デォキシアデノシン）、 dG (デォキシグァノシン）、又は d C (デォキシシチジン）を用いることができる。

本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる、本発明の s i RN Aには、

FBPの発現を特異的に抑制することのできる s i RNA (以下、 FBP特異的 s i RNAと称する）；

F BP— 2の発現を特異的に抑制することのできる s i RNA (以下、 FBP— 2特異的 s i RNAと称する）；並びに F BP及び F BP— 2の両方の発現を特異的に抑制することのできる s i RNA (以下、 F BP及び F BP— 2特異的 s i RNAと称する）

が含まれる。

F B P及び又は F B P— 2特異的 s i RNAは、 F BP及び Z又は F BP— 2に特異的な D N A塩基配列（好ましくは 21塩基〜 23塩基からなる塩基配列）に基づいて設計され、 F BP及び Z又は F BP— 2の発現を特異的に抑制することのできる s i RNAである限り、特に限定されるものではなく、常法（例えば、 J. Am. Chem. Soc. , 120, 11820-11821, 1998；及び Methods, 23， 206 - 217, 2001) により製造することができる。より具体的には、 FBP及び Z又は F BP— 2に特異的な DN A塩基配列は、例えば、以下の手順により選択することができる。すなわち、 FBP及び又は FBP— 2の開始コドンから 50塩基以上下流の最初の A Aを見つける（転写因子の結合部位を避けるため）。 AAに続く 1 9〜21の塩基配列を記録し、 A Aを含む 21〜 23塩基の GCコンテントを計算し、 50%前後であることを確認する。 GCコンテントが 30<½以下や 70%以上である場合、あるいは、 50%前後であっても複数の候補が必要な場合には、更に下流の A Aを選択し、同様にして GCコンテン卜を計算する。得られた塩基配列候補について、データベース検索を実施し、 F BP及び/又は FB P-2に特異的であることを確認する。

なお、 F BP及び又は F BP— 2に特異的であるか否かは、例えば、 N a t i o n a I Ce n t e r f o r B i o t e c h n o l o g y I n τ o r ma t i o n (N C B I ) の BLAST (Bas ic local a I ί gnment search too I； J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990) サーチで F B P及び Z又は F B P— 2とは完全に一致するが、他には完全に一致する配列が存在しないことにより確認することができる。

s i RNAを設計するための DN A塩基配列が得られると、その配列に基づいて s i RNAを設計することができる。例えば、二重鎖 RNA部分が、得られた DN A塩基配列をそのまま RN A配列に変換した RN A塩基配列からなる、 s i RNAを設計することができる。なお、本明細書において、 DNA塩基配列を R N A塩基配列に変換するとは、 DNA塩基配列にぉけるd TをUに変換し、それ以外の塩基、すなわち、 dA、 dG、及び d Cを、それぞれ、 A、 G、及び Cに変換することを意味する。

FBP、 FBP— 2、又は、 F BP及び F BP— 2特異的 s i RNAの設計に用いる FBP、 FBP— 2、又は、 F BP及び F BP— 2特異的な塩基配列としては、例えば、 FBP、 FBP— 2、又は、 8 及び 8卩ー2の01^ 塩基配列の AA (好ましくは開始コドンから 50塩基以上下流の A A) に続く 1 9〜 21塩基からなる、特異的な塩基配列（GCコンテントが好ましくは 40〜 6 0%、より好ましくは 45~ 550/₀) を挙げることができる。

F BP特異的な塩基配列としては、例えば、配列番号 1又は配列番号 1 6〜1 9で表される各塩基配列を挙げることができる。

FBP-2特異的な塩基配列としては、例えば、配列番号 2又は配列番号 20 〜 25で表される各塩基配列を挙げることができる。

FBP及び FBP— 2特異的な塩基配列としては、例えば、配列番号 4で表される塩基配列を挙げることができる。

配列番号 1で表される塩基配列に基づいて設計される、本発明の F B P特異的 s i RNAとしては、例えば、二重鎖 RN A部分が、配列番号 1 3で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の 3' 末端が 1若しくは 2塩基欠失した塩基配列（すなわち、配列番号 1 3で表される塩基配列における第 1番目〜第 20番目の塩基からなる配列、若しくは配列番号 1 3で表される塩基配列における第 1番目〜第 1 9番目の塩基からなる配列）からなる s i RNAを挙げることができる。配列番号 2で表される塩基配列に基づいて設計される、本発明の F BP— 2特異的 s i RNAとしては、例えば、二重鎖 RN A部分が、配列番号 1 4で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の 3 ' 末端が 1若しくは 2塩基欠失した塩基配列 (すなわち、配列番号 1 4で表される塩基配列における第 1番目〜第 20番目の塩基からなる配列、若しくは配列番号 1 4で表される塩基配列における第 1番目〜第 1 9番目の塩基からなる配列）からなる s i RNAを挙げることができる。配列番号 4で表される塩基配列に基づいて設計される、本発明の F BP及び F 8卩ー2特異的₃ i RNAとしては、例えば、二重鎖 RN A部分が、配列番号 1 5で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の 3' 末端が 1若しくは 2塩基欠失した塩基配列（すなわち、配列番号 1 5で表される塩基配列における第 1番目〜第 20番目の塩基からなる配列、若しくは配列番号 1 5で表される塩基配列における第 1番目〜第 1 9番目の塩基からなる配列）からなる s i RNAを挙げることができる。

これらの本発明の F BP及び又は F BP— 2特異的 s i RNAには、例えば, センス鎖及び Z又はアンチセンス鎖の 3' 末端に、それぞれ独立して、 1又は 2 塩基の任意の核酸 [例えば、リボ核酸（U、 A、 G、若しくは C等）又はデォキシリポ核酸（d T、 dA、 dG、若しくは dC等）〗力付加されたオーバーハングを有する s i RNA, 並びにオーバーハングを有しない s i RNAが含まれる_C なお、センス鎖及びアンチセンス鎖（オーバーハングを有する場合には、それを含む）は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできる力同じ塩基数であることが好ましい。

前記オーバーハングとしては、センス鎖及び又はアンチセンス鎖の 3' 末端に、それぞれ独立して、 1又は 2塩基の U又は d Tが付加されたオーバーハングが好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の 3' 末端に、それぞれ独立して、 1 又は 2塩基の U又は d Tが付加されたオーバーハングがより好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の 3' 末端に、 2塩基の U又は d Tが付加されたオーバ一ハングが特に好ましい。

本発明の FBP特異的 s i RNAとしては、配列番号 5で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 9で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる s i RNAが特に好ましい。配列番号 5で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号 9で表される塩基配列からなるァンチセンス鎖は、それぞれ、第 1番目〜第 21番目の塩基からなる RN A部分の 3' 側に、 d Tが 2つ付加された RNAZDN Aキメラポリヌクレオチドである。このセンス鎖とこのアンチセンス鎖とからなる s i RNAにおいては、第 1番目〜第 21番目の塩基からなる RN A部分が二重鎖を形成し、第 22番目及び第 23番目の d Tが 3' 側ォーバーハングを形成する。

本発明の F BP— 2特異的 s i RNAとしては、配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 1 0で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる s i 1¾ カ特に好ましぃ。配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号 1 0で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖は、それぞれ、第 1番目〜第 21番目の塩基からなる RNA部分の 3' 側に、 d Tが 2 つ付加された RN AZDN Aキメラポリヌクレオチドである。このセンス鎖とこのアンチセンス鎖とからなる s i RN Aにおいては、第 1番目〜第 21番目の塩基からなる RN A部分が二重鎖を形成し、第 22番目及び第 23番目の d丁が

3' 側オーバーハングを形成する。

本発明の F BP及び F BP— 2特異的 s i RNAとしては、配列番号 8で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 1 2で表される塩基配列からなるァンチセンス鎖とからなる s i RNAが特に好ましい。配列番号 8で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号 1 2で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖は、それぞれ、第 1番目〜第 21番目の塩基からなる RN A部分の 3' 側に, d Tが 2つ付加された RN AZDN Aキメラポリヌクレオチドである。このセンス鎖とこのアンチセンス鎖とからなる s i RNAにおいては、第 1番目〜第 21 番目の塩基からなる RN A部分が二重鎖を形成し、第 22番目及び第 23番目の d Tが 3' 側オーバーハングを形成する。

本発明の医薬組成物の有効成分としては、 s i RNAの他にも、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド（DN A及び RN Aを含む）を用いることができる。アンチセンスポリヌクレオチドを設計及び作製する方法は、周知であり（丄

Am. Chem. Soc. , 103： 3185-3191, 1981) 、まず、例えば、 N CB Iの B LAS Τサーチで F Β Ρ及び又は F Β Ρ— 2特異的な配列（例えば、配列番号 1、配列番号 2、又は配列番号 4で表される塩基配列）を選択し、それに対するアンチセンスポリヌクレオチドを、本発明の医薬組成物の有効成分として用いることができる。

本発明の医薬組成物は、非経口経路（例えば、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮経路、又は頰内経路）を介して投与することができる。あるいは、または同時に、経口経路によって投与することもできる。投薬量は、レシピエントの年齢、健常度、及び体重、同時処置される種類（もしあれば）、処置の頻度、並びに所望される効果の性質に依存する。各成分の有効な量の至適な範囲の決定は、当業者の範囲内である。典型的な投薬量は 0. 1〜1 00jU g ノ k g体重であり、好ましい投薬量は、 0. 1〜 1 0 gZk g体重であり、最も好ましい投薬量は、 0. 1 ~1 gZk g体重である。薬理学的に活性な薬剤に加えて、本発明の組成物は、薬学的に受容可能な適切なキャリアーを含むことができ、これには、作用の部位に到達するために薬学的に使用可能な、調製物への活性な化合物のプロセシングを容易にする賦形剤及び又は補助剤を含む。

非経口投与のために適切な処方物は、水溶性形態の活性化合物（例えば、水溶性の塩）の水溶液を含む。更に、適切な油性の注入懸濁液としての活性化化合物の懸濁液が投与可能である。適切な親油性溶媒又はべヒクルは、脂肪油又は合成の脂肪酸エステルを含む。水溶性注入懸濁液は、懸濁液の粘度を増加する物質を含むことができる。必要に応じて懸濁液は安定剤を含むことができる。リポソ一ムも、細胞への送達のために、薬剤をカプセル化するために使用することができる。本発明に従う全身投与についての薬学的組成物は、腸投与、非経口投与、又は局所投与について処方することができる。実際、処方物の全ての 3つのタイプは、有効成分の全身性投与を達成するために同時に使用することができる。

経口投与のための適切な処方物は、堅質又は軟質ゼラチンカプセル、丸剤、錠剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、又は吸入薬、及びそれらの制御された放出形態を含む。本発明の医薬組成物は、単独で、又は組み合わせで、あるいは、他の治療剤又は診断剤と組み合わせて使用することができる。特に好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、一般的に受容されている医療の実施に従つて、これらの状態について典型的に処方される他の化合物（例えば、化学療法剤）とともに投与することができる。

本発明の医薬組成物は、 F B Pを抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物と、 F B P— 2を抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物とを組み合わせて、キッ卜にすることもできる。

また、 F B Pを抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物と, F B P - 2を抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物とは、同時に、あるいは、時間差をおいて、投与することができる。

4 . 遺伝子治療

細胞増殖性疾患、例えば、癌の治療において、 F B P及び F B P— 2発現の調節因子をコードする遺伝子発現単位（例えば、配列番号 1、配列番号 2、又は配列番号 4で表される塩基配列に対するアンチセンス分子又は s i R N A分子）を. 処置される被験体に導入することにより、遺伝子治療をすることができる。このような調節因子は、細胞又は特定の標的細胞で、構成的に継続的に産生させることもできるし、あるいは、誘導性とすることもできる。

具体的には、前記アンチセンス分子、又は s i RNA分子（例えば、配列番号 5で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号 9で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる s i RNA、配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号 1 0で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる s i RNA、又は配列番号 8で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号 1 2で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる s i RNA) を作製するための方法は、当該分野において周知である（vJ. Am. Ghem. Soc. , 103： 3185-3191, 1981) 。

配列番号 1、配列番号 2、又は配列番号 4で表される塩基配列に対するアンチセンス分子を含む組み換え DN Αを作製する方法は、当該分野において周知であリ ("Molecular Cloning-A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor

Laboratory, NY, 1989等）、好ましい組み換え D N Aにおいて、配列番号 1、配列番号 2、又は配列番号 4で表される塩基配列は、発現制御配列及び Z又はべクター配列に作動可能に連結することができる。前記べクタ一は、配列番号 1、配列番号 2、又は配列番号 4で表される塩基配列を含む組み換え DNAの複製、あるいは、宿主染色体への挿入を少なくとも可能とし、遺伝子治療に用いることができる。

更に、本発明では、配列番号 1、配列番号 2、又は配列番号 4で表される塩基配列に対するアンチセンスを含む組み換え D N Aを外因的に導入した宿主細胞を提供し、これも遺伝子治療に用いることができる。宿主細胞は、任意のヒト細胞に限る。本発明の組み換え DN Aでの適切な宿主細胞の形質転換は、周知の方法によって達成される。実施例

以下、実施例により本発明を詳述するが，本発明は実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（例えば、 "Molecular C I on i ng-A Laboratory Manual ， Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989等の遺伝子操作実験マニュアル）や試薬等に添付の指示書に従った。実施例 1 ： FBP、 FBP— 2、又は F BP— 3に特異的な s i RNAの作製

F BPをコードする塩基配列の内、配列番号 1で表される塩基配列からなる D N Aに対応する s i RNAとして、配列番号 5で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 9で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる、 F BP特異的な s i RNA (ダ一マコンリサーチ社）を使用した。配列番号 5で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号 9で表される塩基配列からなるァンチセンス鎖は、それぞれ、第 1番目〜第 21番目の塩基からなる RNA部分の 3' 側に、 d T (チミジン）が 2つ付加された RN AZDN Aキメラポリヌクレォチドである。

同様に、 F BP— 2をコードする塩基配列の内、配列番号 2で表される塩基配列からなる DNAに対応する s i RNAとして、配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 1 0で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる、 FBP— 2特異的な s i RNA (ダーマコンリサーチ社）を使用した。また、 F BP— 3をコードする塩基配列の内、配列番号 3で表される塩基配列からなる DNAに対応する s i RNAとして、配列番号 7で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 1 1で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる、 FBP— 3特異的な s i RNA (ダーマコンリサーチ社）を使用した。配列番号 6又は 7で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号 1 0又は 1 1で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖は、それぞれ、第 1番目〜第 21番目の塩基からなる RN A部分の 3' 側に、 d Tが 2つ付加された RN A/ DN Aキメラポリヌクレオチドである。

NCB Iの BLAS Tサーチの結果、配列番号 1、配列番号 2、及び配列番号 3で表される塩基配列は、それぞれ、 FBP、 FBP— 2、及び FBP— 3に特異的な配列であることが示された。

更に、 FBPをコードする塩基配列と、 FBP— 2をコードする塩基配列とが相同な部分の内、配列番号 4で表される塩基配列からなる DN Aに対応する s i RNAとして、配列番号 8で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 1 2で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる、 8 及ぴ「曰ー 2の両方に対する s i RNAを合成した。配列番号 8で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号 1 2で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖は、それぞれ、第 1番目〜第 21番目の塩基からなる RN A部分の 3' 側に、 d Tが 2 つ付加された RN AZDN Aキメラポリヌクレオチドである。

NCB Iの B LAS Tサーチの結果、配列番号 4で表される塩基配列は、 FB P及び FBP— 2の両方に特異的な配列であることが示された。

非特異的な s i RN Aの影響を検討する対照実験のために、哺乳類細胞に存在しない二本鎖 RN Aのコントロール s i RN A (Scramble Duplex; ダーマコンリサーチ社）を入手した。

実施例 2 ： FBP、 FBP— 2、又は FBP— 3特異的な s i RN Aの癌細胞株への導入による FBP、 FBP— 2、又は FBP— 3特異的な発現抑制

アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC) から入手したヒト子宮頸部癌由来細胞株 H e L a S 3及ぴヒト前立腺癌由来細胞株 P C 3を用いた。各癌細胞株は、 1 0%熱不活化胎児ゥシ血清（FBS; JRHバイオサイエンス社）を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（DMEM) に培養して維持した。

トランスフエクシヨン実験は、以下の手順で実施した。

卜ランスフエクシヨンの前日に、細胞培養用 6穴プレート（イワキ）に、 H e L a S 3癌細胞株については、 1穴当たり 40000細胞を、 PC 3癌細胞株については、 1穴当たり 20000細胞を播いた。トランスフエクシヨン当日に、血清無添加培地 O PT I— MEM (インビトロジヱン社）で細胞を洗浄した後、 H e L a S 3癌細胞株の場合は、 1 %熱不活化胎児ゥシ血清を添加した O P T I 一 MEM800〃 Lを加え、 PC3細胞株の場合は、 OPT I— MEM800〃 Lを加えた。

実施例 1で作製した各 s i RNAを、卜ランスフエクシヨン試薬（オリゴフエクタミン；インビ卜ロジェン社）を用いて、添付指示書に従い、前記状態の 2種の癌細胞株に導入した。導入した s i RNAは、

F BP特異的な s i RNA単独、

F BP— 2特異的な s ί RNA単独、

FBP— 3特異的な s i RNA単独、

F BP及び FBP— 2の両方に特異的な s i RNA単独、

コントロール s i RNA単独、

F BP特異的な s i RN Αと FBP— 2特異的な s i RNAとの等量混合、 F BP特異的な s i RN Aと FBP— 3特異的な s i RN Aとの等量混合、及び F BP— 2特異的な s i RN Αと FBP— 3特異的な s i RN Aとの等量混合であった。

導入から 4時間経過後に、熱不活化胎児ゥシ血清の最終濃度が 1 0<½となるように DMEMを加えた。卜ランスフエクシヨンは、各サンプルに対して独立に 4 穴を用いて行なった。

前記各 s i RN Aを導入してから 24、 48、又は 72時間経過後に細胞を回収した。回収した細胞に、細胞溶解用溶液 [50mmo I /L-T r i s (p H 7. 5) , 0. 25mo l /L-N a C I , 1 0%グリセロール， 1 %トリトン (T r i t o n) X— 1 00, 1 mm o I ZL— EDTA, I mmo l Zし一 E G T A, 1 mm o I ZL— PMS F (phenylmethylsulfonyl fluoride; シグマ社） ] を加えて溶解し、エツペンドルフチューブ遠心機（トミー精ェ社）にて 1 5000回転で 1 5分間遠心した後の上清を回収した。

各 s i RN Aの特異性及び効果を、各々のタンパク質レベルでの発現抑制で確認するために、各導入細胞ライゼートについて、 FBP及び FBP— 2を認識するャギ抗体 FBP (N-15; サンタクルズ社）、若しくは FBP— 3を認識するャギ抗体 FBP3 (卜 20; サンタクルズ社）、又は非特異的な効果の検討を行なうための、ァクチンを認識するゥサギ抗体（アンチアクチン；シグマ社）を用いたウェスタンブロッテイングで確認した。

具体的には、前記各ライゼ一トを S DSZ1 0%アクリルアミドゲル（第一化学薬品社）で電気泳動（還元条件下）した後、ブロッテイング装置を用いて PV DF Lp o l y v i n y l i d e n e d i f l u o r i d e) ] te ( リポァ社）に転写した。 FBP、 FBP— 2、及び FBP— 3の分子量が近いため、 FBP及び FBP— 2検出用と、 FBP— 3及びァクチン検出用の 2セットを作成した。そして、 FBP— 3及ぴァクチン検出用セットは、ブロッテイング後、併行して流した分子量マーカをもとに、分子量 45KDa〜1 1 6KDaの範囲で PVD F膜を切り出して F BP— 3の検出に使用し、分子量 45 K D a以下の範囲で P V D F膜を切リ出してァクチンの検出に使用した。

転写後の PVDF膜にブロッキング剤（ブロックエース；大日本製薬社）を添加してブロッキングした後、 FBP及び FBP— 2検出用 P VD F膜をャギ抗体 03011765

20

FBP (N- 1 5) と反応させ、次いで、西洋わさびパーォキシダーゼ標識抗ャギ抗体と反応させた。同様に、 FBP— 3検出用 PVDF膜をャギ抗体 FBP 3 ( 1 -20) と反応させ、次いで、西洋わさびパーォキシダーゼ標識抗ャギ抗体と反応させた。また、ァクチン検出用 PVD F膜をゥサギ抗体（アンチアクチン）と反応させ、次いで、西洋わさびパーォキシダーゼ標識抗ゥサギ抗体（アマシャムフアルマシア社）と反応させた。

反応後、市販のウェスタンブロッテイング検出システム（ECLウェスタンプロッティング検出システム；アマシャムフアルマシア社）を用いて目的タンパク質の発現を確認した。

P C 3癌細胞株に関する結果を図 1に示す。図 1において、

レーン 1は、コントロール s i RN A単独の場合の結果であり；

レーン 2は、 F BP特異的な s i RN A単独の場合の結果であり；

レーン 3は、 F BP— 2特異的な s i RN Α単独の場合の結果であり；

レーン 4は、 F BP— 3特異的な s i RN A単独の場合の結果であり；レーン 5は、 F BP特異的な s ί RN Αと FBP— 2特異的な s i RNAとの等量混合の場合の結果であり；

レーン 6は、 FBP特異的な s i RNAと FBP— 3特異的な s i RNAとの等量混合の場合の結果であり；

レーン 7は、 F BP— 2特異的な s i RNAと FBP— 3特異的な s i RNAとの等量混合の場合の結果であり；

レーン 8は、 F BP及び F BP— 2の両方に特異的な s i RNA単独の場合の結果である。また、（a) は導入後 24時間、（b) は導入後 48時間、（c) は導入後 72時間後の結果を示す。

図 1に示すように、 FBP特異的な s i RNA (配列番号 5で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 9で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖との組合せ；レーン 2) 、 FBP— 2特異的な s i RNA (配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 1 0で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖との組合せ；レーン 3) 、又は FBP— 3特異的な s i RNA (配列番号 7で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号 1 1で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖との組合せ；レーン 4) は、それぞれ、特異的に FB P、 FBP— 2、又は F BP— 3の発現を抑制した。

また、 F BP特異的な s i RN Aと FBP— 2特異的な s i RNAとの等量混合（レーン 5) 、 F BP特異的な s i RN Αと FBP— 3特異的な s i RNAとの等量混合（レーン 6) 、又は F BP— 2特異的な s i RNAと FBP— 3特異的な s i RNAとの等量混合（レーン 7) は、それぞれ、 F BP及び F BP— 2、 FBP及び FBP— 3、又は FBP— 2及び F B P— 3の発現を抑制した。

更に、 F BP及び F BP— 2の両方に特異的な s i RNA (レーン 8) は、 F B P及び F B P— 2の発現を抑制した。

これらのタンパク質の発現抑制は、 48時間後及び 72時間後に顕著に認められた。一方、コントローレ s i R N A (S c r amb l e Du p l e x ; レーン 1) の導入によっては、 FBP、 FBP— 2、 FBP— 3、及びァクチンの各タンパク質の発現は抑制されなかった。これらの結果より、前記各 s i RNAの特異性と効果が確認された。

実施例 3 ： FBP及び FBP— 2の同時発現抑制による細胞死誘導

実施例 2で行なった s i RNA導入実験において、導入から 24時間、 48時間、 72時間、及び 96時間経過後に、それぞれ、独立の 3穴から細胞を回収し、トリパンブルー染色によって生細胞数を計測した。 s ί RNA導入時の細胞数は、 H e L a S 3癌細胞株では 80000個、 P C 3癌細胞株では 50000個であつた。

P C 3癌細胞株に関する結果を図 2に、 H e L a S 3癌細胞株に関する結果を図 3に示す。図 2及び図 3において、

記号「SJ は、コントロール s i RNA単独の場合の結果であり；

記号「F 1」は、 F BP特異的な s i RNA単独の場合の結果であり；

記号「F2」は、 F BP— 2特異的な s ί RNA単独の場合の結果であり；記号「F3J は、 FBP— 3特異的な s i RNA単独の場合の結果であり；記号 Γ F 1 + F 2 J は、 F B P特異的な s i RNAと FBP— 2特異的な s i R N Aとの等量混合の場合の結果であり；

記号 Γ F 1 + F 3」は、 F B P特異的な s i RNAと FBP— 3特異的な s i R N Aとの等量混合の場合の結果であり；

記号 Γ F 2 + F 3 J は、 F B P特異的な s i RNA— 2と FBP— 3特異的な s i RN Aとの等量混合の場合の結果であり；

記号 Γ F 1 F 2」は、 F B P及び F B P— 2の両方に特異的な s ί R N Α単独の場合の結果である。

FBP、 FBP— 2、若しくは FBP— 3特異的な s i RNA単独による、 F BP、 FBP— 2、若しくは FBP— 3単独の発現抑制、又は F BP特異的な s i RNAと FBP— 3特異的な s i RNAの等量混合、若しくは FBP— 2特異的な s i RN Aと FBP— 3特異的な s i R Ν Αの等量混合の導入による、 FB Pと F B P— 3の同時発現抑制、若しくは FBP— 2と FBP— 3の同時発現抑制した細胞は、それぞれ、コントロール s i RNAを導入した細胞と同じく、経時的に細胞数を増加させた。

一方、 8卩と已卩一2両者に対する3 i RNA単独、又は FBP特異的な s i RNAと FBP— 2特異的な s i R N Aの等量混合を導入した細胞では、導入から 48時間経過後までは、他の s i RNAを導入した細胞と同様に細胞数を増加させたが、導入から 72時間及び 96時間経過後では、細胞数を減少させた _c 細胞数が減少することは、細胞死が誘導されたことを意味する。実施例 2で示したように、これらの導入細胞では、導入から 48時間経過後から FBPと FBP - 2の同時抑制が認められたことから、 FBPと FBP— 2の同時発現抑制が細胞死を誘導することが確認された。産業上の利用可能性

本発明のスクリーニング方法によれば、増殖性疾患（例えば、癌）の治療薬として有用な物質を得ることができる。本発明のスクリーニング方法で得られた物質は、 FBP及び FBP— 2を同時に発現抑制することにより細胞死を誘導するという全く新たな作用機序に基づく増殖性疾患治療剤として有用である。また、 FBPを抑制する物質と F B P— 2を抑制する物質を併用することによつても、細胞死を誘導するという作用機序に基づく増殖性疾患治療が可能となる。

また、本発明の s i RNAは、本発明の増殖性疾患治療用医薬組成物の有効成分として有用である。配列表フリーテキス卜配列番号 5〜 8の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成した s i RNA のセンス鎖であり、第 1番目〜第 21番目は RNAであり、第 22番目〜第 23 番目は DN Aである。

配列番号 9〜1 2の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成した s i RN Αのアンチセンス鎖であり、第 1番目〜第 21番目は RN Aであり、第 22番目〜第 23番目は DN Aである。以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims

請求の範囲

1. F BPを抑制するか否かを分析する工程、及び、 FBP— 2を抑制するか否かを分析する工程を含む、増殖性疾患治療薬として有用な物質のスクリーニング方法。

2. 抑制が発現抑制である、請求項 1に記載のスクリーニング方法。

3. 増殖性疾患が癌である、請求項 1又は 2に記載のスクリーニング方法。

4. 請求項 1に記載の分析工程、及び製剤化工程を含む、増殖性疾患治療用医薬組成物の製造方法。

5. 請求項 1に記載のスクリーニング方法で得ることができる物質を有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物。

6. FBPを抑制する物質及び FBP— 2を抑制する物質、又は、 FBP及び F BP-2を抑制する物質を有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物。

7. F BPを抑制する物質及び F BP— 2を抑制する物質、又は、 8卩及び「 BP-2を抑制する物質を投与することを含む、増殖性疾患治療方法。

8. F BPを抑制する物質及び F BP— 2を抑制する物質、又は、 8 及び BP-2を抑制する物質の、増殖性疾患治療用医薬組成物製造のための使用。

9. F BP及び又は F BP— 2の DN A塩基配列の A Aに続く 1 9〜21塩基からなる、 F B P及び又は F B P— 2に特異的な塩基配列に基づいて設計される s i R N A。

1 0. (1 ) 二重鎖 RN A部分が、配列番号 1 3で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の 3' 末端が 1若しくは 2塩基欠失した塩基配列からなる s i RN A；

(2) 二重鎖 RNA部分が、配列番号 1 4で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の 3' 末端が 1若しくは 2塩基欠失した塩基配列からなる s i RNA；あるいは

(3) 二重鎖 RNA部分が、配列番号 1 5で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の 3' 末端が 1若しくは 2塩基欠失した塩基配列からなる s i RNA。

1 1. 請求項 9又は 1 0に記載の s i RNAを有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物。