CN101962642B - 靶向ccp22基因的干扰性rna、含有该干扰性rna的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及靶向CCP22(complement control protein 22，CCP22)的干扰性RNA(interfering RNA)、含有该干扰性RNA的药物组合物及其医药用途。

Description

靶向CCP22基因的干扰性RNA、含有该干扰性RNA的药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及靶向CCP22(complement control protein 22，CCP22)的新的干扰性RNA(interfering RNA)、含有该干扰性RNA的药物组合物及其医药用途。 

背景技术

CCP22(SEQ ID NO：1，GeneBank登记号AY916667)是2005年我们实验室首次报道的从人乳腺文库中分离得到的新基因，该基因的开放阅读框架编码1497个氨基酸。CCP22能够与抑癌蛋白Smad4相互作用(引用文献：韩聚强，方言，严景华，焦园园，吕秋军，黄翠芬，杨晓，叶棋浓.一种含多个CCP结构域的新型基因的克隆及生物学特性初探.中华微生物学和免疫学杂志.2005，25(12)：963-969)，但CCP22的具体功能目前未见报道。 

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)诱导细胞内同源mRNA发生特异性降解，从而抑制基因表达的现象。在RNAi过程中，长链dsRNA被Dicer酶剪切成小干扰RNA(siRNA)，siRNA的一条链与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合，随后以碱基互补配对的方式与靶mRNA结合，导致mRNA的降解。由于siRNA可以抑制特定基因的表达，该技术已被广泛用于各种研究领域，包括基因治疗研究。目前siRNA导入体内的方法主要有两种：一是直接注射裸露的shRNA(short hairpin RNA)或经化学修饰的shRNA；二是使用病毒载体表达siRNA，如慢病毒、腺病毒和腺相关病毒等。 

RNA干扰技术虽然已被用于肿瘤治疗研究，但目前所能达到的效 果仍然有限，现有技术中迫切需要新的、有效治疗肿瘤的方法。 

发明内容

定义 

本文中使用的术语“CCP22基因靶区域”指的是本发明的多核苷酸或siRNA所针对的CCP22基因mRNA上的区域，其中编码或表达的siRNA或者所述的siRNA本身能够指导通过RNA干扰作用裂解CCP22靶基因的mRNA。CCP22基因靶区域既可以位于CCP22基因mRNA的5’端，又可以位于3’端，还可以位于中间部位。 

在本发明中，针对多核苷酸或siNA、siRNA、shRNA提及“正义链”时，指的是包含与CCP22基因靶区域相同或高度相似的核苷酸序列的核酸链；提及“反义链”时，指的是与前述正义链基本或完全互补的核苷酸序列。 

因此，本发明一方面提供了一种干扰性RNA分子，其中包含与CCP22基因靶区域互补的第一核苷酸序列，能够通过RNA干扰作用而降低或消除CCP22基因mRNA的表达。所述干扰性RNA分子可以是双链RNA，例如siRNA(short interfering RNA)、miRNA(microinterfering RNA)等，或者单链RNA，例如shRNA(short hairpinRNA)，它们能通过RNA干扰作用引起CCP22靶基因mRNA的降解(例如siRNA或miRNA的情形)或者能够形成具有这种功能的分子(例如shRNA的情形)。 

在本发明中，所述干扰性RNA分子可以针对CCP22基因mRNA内的任何合适靶区域。例如，CCP22基因靶区域位于CCP22基因编码序列内，或者可以位于CCP22基因mRNA的5’或3’非编码序列内。该靶区域可以具有任何合适的长度，例如5-30nt，优选18-25nt，更优选20-23nt。最优选地，所述靶区域选自下述组中：5’ATGCATGGAAGGCTTTGTA3’(SEQ ID NO：2)，和 5’GAACCAATCTGCATTCTTC 3’-(SEQ ID NO：3)。 

在一些实施方案中，本发明的干扰性RNA分子是siRNA(short interfering RNA)。这样的siRNA分子包含与CCP22基因mRNA内的靶区域反向互补的一条核糖核酸链(称为“反义链”)，以及与之互补的另一核糖核酸链(称为“正义链”)。在本发明中，所述siRNA可以具有任何合适的长度。优选地，其长度为15-30bp，更优选18-25bp，尤其优选20-23bp。例如，所述siRNA的长度可以是15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp或30bp。 

优选地，本发明的干扰性RNA分子是siRNA，其靶向CCP22基因cDNA或“mRNA”中的以下区域：ATGCATGGAAGGCTTTGTA(SEQ ID NO：2)或GAACCAATCTGCATTCTTC(SEQ ID NO：3)。 

在另一些实施方案中，本发明的干扰性RNA分子是shRNA，其在同一核酸链中包含与CCP22基因mRNA靶区域互补的第一核苷酸序列(在本文中称为“反义区”)、与所述第一核苷酸序列反向互补的第二核苷酸序列(在本文中称为“正义区”)以及位于其间的连接序列。在shRNA中，所述正义区可以位于5’端，而反义区位于3’端；或者，所述反义区可以位于5’端，而正义区位于3’端。所述shRNA可以是单链的，能够形成具有发夹结构的RNA，其中正义区和反义区构成双链体部分，而连接序列形成环。形成环的连接序列的长度可以变化。例如，在一些实施方式中，所述连接序列具有5个核苷酸(nucleotide，简称nt)、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt或13nt的长度。该shRNA形成的发夹结构还可以包含5’或3’突出端。在一些实施方式中，所述突出端具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸长。 

在一些实施方案中，本发明的干扰性RNA分子是靶向CCP22基因cDNA或“mRNA”中区域：5’GAACCAATCTGCATTCTTC3’(SEQID NO：3)的shRNA。优选地，其具有下述核苷酸序列： 

5′-Nx GAACCAATCTGCATTCTTCTTCAAGAGA 

GAAGAATGCAGATTGGTTC TTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID NO：4， 在RNA的情形下“T”替换为“U”)； 

其中N为任何合适的核苷酸残基，x为0-10的任何整数，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8或9。 

在另一些实施方案中，本发明的干扰性RNA是靶向CCP22基因cDNA或“mRNA”中区域：5’ATGCATGGAAGGCTTTGTA3’(SEQID NO：2)的shRNA。优选地，其具有下述核苷酸序列： 

5′-N’y ATGCATGGAAGGCTTTGTATTCAAGAGA 

TACAAAGCCTTCCATGCAT TTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID NO：5，在RNA的情形下“T”替换为“U”)； 

其中N’为任何合适的核苷酸残基，y为0-10的任何整数，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8或9。 

在本发明中，可以对本发明的干扰性RNA分子如siRNA或shRNA进行多种方式修饰。在一个实施方案中，所述干扰性RNA分子中包含硫代磷酸酯键，即包含硫原子取代磷酸二酯键的非桥氧原子，也即P-S键替代P-O键。在另一个实施方案中，所述干扰性RNA分子如siRNA或shRNA中包含的一个或多个核苷酸的2′-羟基被氟或甲基等替代。在另一个实施方案中，所述干扰性RNA分子如siRNA或shRNA的一条或两条链末端有1、2、3或4个核苷酸被修饰。在又一个实施方案中，所述干扰性RNA分子如siRNA或shRNA在正义链或正义区中包含一个或多个修饰。在又一个实施方案中，所述干扰性RNA分子如siRNA或shRNA在正义链/正义区或者反义链/反义区的3′端突出核苷酸被脱氧核苷酸替代。在又一个实施方案中，所述干扰性RNA分子如siRNA或shRNA的正义链/正义区末端含有亲脂性基团，例如胆固醇等。可列举的胆固醇基团有：C16烷醇、C18烷醇或C20烷醇等。 

本发明的干扰性RNA分子如siRNA或shRNA还可以被化学修 饰。通过化学修饰，可以提高siRNA分子对核酸酶降解的抗性和/或改善其细胞摄取，而仍保留了降低CCP22基因表达的能力。这样的化学修饰的非限制性实例有硫代磷酸酯核苷间键(phosphorothioateinternucleotide linkages)，2’-脱氧核糖核苷酸(2′-deoxyribonucleotides)，2’-O-甲基核糖核苷酸(2′-O-methylribonucleotides)，2’-脱氧-2’-氟核糖核苷酸(2′-deoxy-2′-fluororibonucleotides)，4’-硫代核糖核苷酸(4′-thio ribonucleotides)，2’-O-三氟甲基核苷酸(2′-O-trifluoromethyl nucleotides)，2’-O-乙基三氟甲氧基核苷酸(2′-O-ethyl-trifluoromethoxy nucleotides)，2’-O-二氟甲氧基乙氧基核苷酸(2′O-difluoromethoxy-ethoxy nucleotides，″通用碱基″核苷酸，″无环″核苷酸，5-C-甲基核苷酸，2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖基(2′-deoxy-2′-fluoroarabino，FANA)掺入。这些化学修饰在siNA构建体(例如基于RNA的siNA构建体)中的应用仍能保留它们在细胞内的RNAi活性，同时能极大地提高其血清稳定性。 

在又一个实施方案中，本发明的siRNA分子或shRNA分子在形成的双链体内包含一个或多个核苷酸或非核苷酸突出。术语“突出”指的是本发明的siRNA分子或shRNA形成的双链体在两条链之间并不能碱基配对的核苷酸序列末端部分。“突出”可以位于任意一条或两条链的3’端。在一个实施方案中，所述siRNA分子或shRNA形成的双链体包含选自下述的核苷酸突出端：2′-O-甲基、2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟，2′-脱氧-2′-氟阿拉伯糖(FANA)，4′-硫、2′-O-三氟甲基、2′-O-乙基-三氟甲氧基，2′-O-二氟甲氧基-乙氧基、通用碱基或5-C-甲基核苷酸。 

为了提高siRNA或shRNA的稳定性或者CCP22靶基因mRNA区域与siRNA的特异性相互作用，还可以通过化学合成在siRNA两条链的3’末端或者shRNA内正义区和反义区的3’末端延伸两个核苷酸-dTdT或UU。在一些实施方案中，可以通过化学衍生物或者标记分子对合成的siRNA/shRNA改性，以便提高其生理学稳定性和追踪其在细胞内的分布。 

本发明的siRNA或shRNA可以通过多种方式获得，包括例如化学合成、由载体表达或者酶促合成等。 

在一些实施方案中，本发明的siRNA或shRNA是通过化学合成而得到的。有关化学合成和修饰核酸的方法，在本领域中有众多的教导，这些都在所属领域的普通技术人员的能力范围内。 

在另一些实施方案中，本发明的siRNA或shRNA是通过酶促合成的。有关酶促合成核酸的方法，在本领域中也有众多的教导，这些也都在所属领域的普通技术人员的能力范围内。 

本发明的干扰性RNA如siRNA或shRNA可通过多种合适的方法引入到靶细胞、组织、器官或受试者内，例如脂质体转导法、电穿孔、显微注射、微粒轰击等。 

在又一些实施方案中，本发明的干扰性RNA分子如siRNA或shRNA在细胞、组织或生物体内产生。 

因此，本发明还提供了核酸构建体，其中包含编码本发明干扰性RNA的核苷酸序列，以及与之可操作连接的、驱动该核苷酸序列在导入到宿主细胞内后表达所述干扰性RNA的表达元件。在本文中，凡提及第一核酸序列与第二核酸序列“可操作连接”时，指的是该第一核酸序列与第二核酸序列相对处于发挥其各自预定功能的位置，例如启动子序列能够启动与其“可操作连接”的编码序列在靶细胞内的转录或表达。所述表达元件包括例如启动子、转录终止子、增强子等。可选用的启动子有多种，包括例如RNA聚合酶II启动子(pol II)、RNA聚合酶III启动子(pol III)，比如人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子、持家基因启动子如肌动蛋白启动子等。为实现特异性表达，还可以选用一些特异性表达启动子，例如时间特异性启动子、组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子、发育阶段特异性启动子等，其实例有珠蛋白启动子等。还可选用一些可诱导型启动子，例如四环素可诱导型启动子。病毒启动子在本发明中也可应用，例如SV40早期启动子、逆转录病毒启动子、巨细胞病毒立即早期启动子等。终止子和增强子的选择是本领域普通技术人员所熟知的，例如终止子可选用 5′-TTTTT-3′。 

在一些实施方案中，本发明的核酸构建体包含编码本发明shRNA的核苷酸序列。所述shRNA能够形成siRNA。优选地，所述siRNA的双链体部分长度不超过30bp，例如长度为12-30bp、15-28bp、18-25bp或20-23bp。例如，所述siRNA的长度可以是12bp、13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp或30bp。 

在本发明中，还可以各从两个分开的启动子表达siRNA的两条链即正义链和反义链，然后组合成双链siRNA。因此，在另一些实施方案中，本发明的核酸构建体包含编码本发明siRNA正义链的核苷酸序列。在又一些实施方案中，本发明的核酸构建体包含编码本发明siRNA反义链的核苷酸序列。在又一些实施方案中，本发明的核酸构建体包含编码本发明siRNA两条链的核苷酸序列，它们各在分开的启动子控制下表达。 

本发明还提供表达载体，其中包含本发明上述的核酸构建体。在一些实施方案中，其是质粒或病毒形式。优选的，所述表达载体是腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或慢病毒表达载体。 

有多种合适的载体可用于表达本发明的干扰性RNA，如siRNA或shRNA，包括例如质粒载体、病毒载体如腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等。这样的载体中不仅包含用于启动转录的启动子，还包含增强子、转录终止信号或其它表达调节序列。本发明的载体可以作为裸质粒DNA、与转染剂或靶递送材料相复合的复合物或者作为重组病毒载体而递送到宿主细胞内。表达载体的选择和构建是本领域普通技术人员所知晓的，并可参考一些因素进行，例如待转染的宿主细胞的状态或类型、期望的siRNA表达时间和水平等。 

本发明的表达载体可通过转染载体递送到靶细胞或宿主细胞内，所述转染载体例如有脂质体、水凝胶、生物粘合性微球等(Akhtar et al.，Trends Cell Bio.1992，2，139)。本发明的表达载体还可通过磷酸钙沉淀法、直接显微注射法、电穿孔法、微粒轰击法等递送到靶细胞或宿主细胞内。这样的方法也是本领域普通技术人员所熟知的。 

本发明还提供了一种宿主细胞，其中转化或转染了本发明的核酸 构建体或表达载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在另一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞，例如原代细胞培养物、细胞系、酵母、完整器官或生物体的细胞群等。 

本发明还提供了一种药物组合物，其中包含药学有效量的本发明的干扰性RNA(如siRNA或shRNA)、核酸构建体、表达载体和/或宿主细胞以及药学上可接受的载体。“药学有效量”指的是在导入受试者后可降低CCP22mRNA水平至期望程度或者可实现期望效果的药物剂量。药学有效量可由治疗医师根据经验确定，并可能取决于多种因素，例如给药途径、制剂性质、疾病状况、受试者的体格、体重、年龄、性别等。 

本发明的药物组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体的形式，例如可以是片剂、胶囊、粉剂、颗粒、油膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂等。这类制剂的制备方法是本领域普通技术人员所知晓的。 

本发明的药物组合物可通过合适的给药途径施用给待处理/治疗的细胞、组织、器官和/或受试者，例如可以将药物组合物配制成合适的制剂形式而通过口服、口含、胃肠外、皮下、眼内、肌内、腹膜内、静脉内、经鼻、经直肠等方式给药。 

为了促进本发明的干扰性RNA分子、核酸构建体或表达载体递送到目的细胞、组织、器官或受试者内，可以将所述干扰性RNA分子、核酸构建体或表达载体与运载体或赋性剂相混合。可应用的运载体或赋性剂包括盐水、缓冲液(如乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液等)、氨基酸、抗坏血酸、醇类、蛋白质、脂质体、甘油、山梨醇等。本领域熟知制备这样的制剂的方法，例如可参见Remington′sPharmaceutical Sciences。 

本发明还提供了一种降低受试者体内CCP22表达水平和/或活性的方法，其包括对有此需要的受试者、细胞或组织施用本发明的一种或多种干扰性RNA、核酸构建体、表达载体、宿主细胞或者药物组合物，其中降低CCP22水平能取得有益效果。 

本发明又提供了一种预防、治疗或缓解CCP22基因相关疾病或病 症、例如肿瘤的方法，其包括对有此需要的个体施用本发明的一种或多种干扰性RNA、核酸构建体、表达载体、宿主细胞或者药物组合物， 

在本发明中，术语“受试者”和“个体”可以互换使用，指的是在其中降低CCP22水平能取得有益效果的任何动物，优选脊椎动物，例如哺乳动物，其实例有人、马、牛、小鼠、大鼠等。 

附图说明

图1显示CCP22siRNA-Z的序列分析结果。 

图2显示CCP22siRNA-F的序列分析结果。 

图3显示了siRNA表达载体pSilencer 2.1-U6neo的结构示意图。 

图4显示CCP22 siRNA能降低细胞中CCP22蛋白质水平。将对照siRNA(con siRNA)表达载体和CCP22 siRNA表达载体转染MCF7细胞72h后，收集细胞，提取蛋白质，用针对CCP22的抗体进行Western blot检测，GAPDH作为内参。 

图5显示CCP22 siRNA可显著抑制不同肿瘤细胞锚定依赖的生长。将对照siRNA表达载体和CCP22 siRNA表达载体转染乳腺癌细胞系MCF7和肝癌细胞系HepG2后，按图中所示不同时间点测定细胞生长情况。 

图6显示CCP22 siRNA可抑制多种肿瘤细胞锚定非依赖的生长能力。对照siRNA表达载体和CCP22 siRNA表达载体转染肺癌细胞系H460、乳腺癌细胞系ZR75-1和肝癌细胞系HepG2后，利用软琼脂实验观察集落形成情况。“-”：100μm。 

图7显示CCP22 siRNA可升高抑癌基因p15和p21的表达。对照siRNA表达载体和CCP22 siRNA表达载体转染乳腺癌细胞系MCF7后，收集细胞总蛋白，利用p15和p21抗体进行检测，GAPDH作为内参。 

图8显示了CCP22基因cDNA全序列(SEQ ID NO：1)及靶序列。 

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。 

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。 

实施例1、靶向CCP22基因mRNA的siRNA的构建 

(一)、方法 

选取的CCP22 siRNA靶向CCP22基因cDNA(mRNA)的核心序列为5’ATGCATGGAAGGCTTTGTA3’(SEQ ID NO：2)和5’ GAACCAATCTGCATTCTTC3’-(SEQ ID NO：3)。 

1、CCP22 siRNA表达载体的构建 

根据siRNA靶序列筛选设计原则，结合分析人CCP22的基因序列，以Ambion公司提供的siRNA靶序列分析设计系统，选择确定2条特异性siRNA靶序列，分别命名为CCP22 siRNA-Z和CCP22siRNA-F。利用NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，对该序列进行Blast分析，证明选定的siRNA序列与其他已知基因没有同源性，然后设计并合成寡核苷酸的正义链和反义链，用于CCP22 siRNA表达载体的构建。 

用于构建CCP22 siRNA-Z的正义链为： 

5′-GATCC-GAACCAATCTGCATTCTTC-TTCAAGAGA 

GAAGAATGCAGATTGGTTCTTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID NO：6)， 

反义链为： 

5′-AGCTTTTCCAAAAAAGAACCAATCTGCATTCTTC

TCTCTTGAAGAAGAATGCAGATTGGTTCG-3’(SEQ ID NO：7)； 

用于构建CCP22 siRNA-F的正义链为： 

5′-GATCC ATGCATGGAAGGCTTTGTA TTCAAGAGA 

TACAAAGCCTTCCATGCAT-TTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID NO：8)， 

反义链为： 

5′-AGCTTTTCCAAAAAA ATGTTTCGGAAGGTACGTA

TCTCTTGAATACAAAGCCTTCCATGCATG-3′(SEQ ID NO：9)。 

将合成的寡核苷酸片段的正义链和反义链进行退火处理。即先将其分别溶于双蒸水中，等摩尔数混合后95℃加热3min，自然降温至37℃后，形成双链的寡核苷酸。将合成的发卡cDNA插入经BamH I和HindIII(购自英国Biolabs公司)双酶切的siRNA表达载体pSilencer2.1-U6neo(结构参见图3，购自美国Ambion公司)中，构建成CCP22siRNA重组质粒，并经DNA序列分析鉴定。 

2、CCP22抗体的制备

由于没有商业化的抗体，我们根据推测的CCP22氨基酸序列，分别在其N端和C端各选取一个肽段作为抗原制备抗体，这2条肽段序列分别为GEPPSIMNGYASGS和SWTGHNCSRKRRTGF，其序列与人类基因组中其他编码序列无同源性。由Abmart(www.ab-mart.com.cn)公司制备针对这2条肽段的兔源性多克隆抗体，获得的抗体分别称为CCP22-N和CCP22-C。 

3、Western免疫印迹分析

(1)SDS-PAGE电泳：将变性的细胞总蛋白离心后以每孔20μg的总蛋白进行SDS-PAGE电泳；电压120V，约1.5h。 

(2)转膜：电泳结束后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上；电压15V，转移约2h。 

(3)封闭：5％脱脂奶粉(用TBST溶液配制，TBST溶液为每升水溶液中含Tris 2.42g、NaCl 8g、Tween-20 10ml，pH7.6)室温封闭硝酸纤维素膜1h或4℃封闭过夜。 

(4)一抗结合：在硝酸纤维素膜上，加入用5％脱脂奶粉按一定比例稀释的一抗(兔抗人CCP22抗体，购自上海Ab-Mart公司；兔抗人GAPDH抗体购自美国Santa Cruz Biotech公司)，室温轻摇1h，TBST溶液洗膜3次，每次7min。 

(5)二抗结合：在硝酸纤维素膜上，加入用5％脱脂奶粉按一定比例稀释的辣根过氧化物酶偶联的IgG(羊抗兔IgG抗体，购自美国Santa Cruz Biotech公司)，室温轻摇1h，TBST溶液洗膜3次，每次7min。 

(6)显影：按公司提供的说明(美国Pierce公司)，用化学发光法显色5min，压片显影。 

(二)结果

1、CCP22siRNA抑制CCP22基因表达的鉴定

CCP22 siRNA-Z和CCP22 siRNA-F表达载体经DNA序列分析测 

定表明，插入到载体中的靶向CCP22的cDNA序列完全正确(参见图1和图2)，表明已重组成功。 

将CCP22 siRNA表达载体和相应空载体转染细胞后，收集细胞裂解物，利用CCP22-N或CCP22-C抗体进行Western blot，检测CCP22 siRNA抑制CCP22基因表达的效果(参见图4，其中代表性地显示CCP22 siRNA表达载体转染MCF7细胞后能抑制CCP22蛋白水平的表达)。 

实施例2、CCP22 siRNA抑制体外培养的肿瘤细胞锚定依赖的生长

(一)方法

用MTT实验测定CCP22 siRNA对不同肿瘤细胞系锚定依赖生长的影响，步骤如下：用0.25％胰酶(购自美国Sigma-Aldrich公司)消化肿瘤细胞，包括乳腺癌细胞株MCF7和肝癌细胞株HepG2(均购自美国ATCC细胞库)。细胞计数后，稀释至合适的浓度，将0.1ml细胞 液放入96孔板中，使每孔中的细胞数约为200个。按实施例1中所述方法将CCP22 siRNA表达载体转染这些肿瘤细胞。细胞培养期间，每天每孔加入20μl MTT(购自美国Amerreso公司，50mg/100ml)，结合4-6h后，吸出上清，每孔加入0.1ml 10％SDS，充分裂解后在490nm的波长处测定OD值，以OD值代表细胞相对生长速率。 

(二)结果

结果表明，CCP22 siRNA-Z和CCP22 siRNA-F均能不同程度地抑制上述肿瘤细胞的生长(参见图5，其代表性地显示CCP22 siRNA表达载体转染乳腺癌细胞株MCF7和肝癌细胞株HepG2后能抑制这些细胞的生长)。 

实施例3、CCP22 siRNA抑制多种肿瘤细胞的锚定不依赖生长

(一)方法

用软琼脂实验测定CCP22 siRNA对肿瘤细胞锚定不依赖生长的影响。首先，按实施例1中所述方法将对照siRNA表达载体和CCP22siRNA表达载体转染人肿瘤细胞株。这些肿瘤细胞株包括肺癌细胞株H460、乳腺癌细胞株MCF7和肝癌细胞株HepG2。然后采用60mm²细胞培养皿，在培养皿中加入3ml含0.7％琼脂的DMEM培养基(购自美国Invitrogen公司)，凝固后在其上加入3ml含上述5,000个肿瘤细胞和0.25％琼脂的DMEM培养基，每组细胞设3个平行样，培养3周后在倒置显微镜下计数每组细胞的集落形成数。 

(二)结果

结果表明，无论集落大小，还是集落数量，CCP22 siRNA-Z和CCP22 siRNA-F均能抑制上述所有肿瘤细胞的集落形成(参见图6，其代表性地显示CCP22 siRNA重组表达载体转染人肺癌细胞株H460、乳腺癌细胞株MCF7和肝癌细胞系HepG2后能抑制这些细胞的锚定不依赖生长能力。 

实施例4、CCP22 siRNA能增强肿瘤细胞中抑癌基因的表达

(一)方法

将5×10⁵个细胞接种到细胞培养板中，然后将对照siRNA表达载体和CCP22 siRNA表达载体转染MCF7。细胞转染72小时后，收集细胞，按实施例1中的方法分别用p15抗体(鼠抗人p15抗体，购自美国Santa Cruz Biotech公司)、p21抗体(兔抗人p21抗体，购自美国Santa Cruz Biotech公司)等进行Western免疫印迹分析，检测上述MCF7细胞中相应蛋白的表达情况。 

(二)结果

图7结果表明，CCP22 siRNA-Z和CCP22 siRNA-F在人乳腺癌MCF7细胞中促进了抑癌基因p15和p21的表达。 

由此看来，通过CCP22 siRNA可以降低乳腺癌、肝癌、肺癌等肿瘤细胞中CCP22基因的表达，并达到抑制这些肿瘤细胞生长的目的。 

本文中引用的多篇出版物，包括专利文件和非专利文件等，它们的公开内容均通过引用而全文并入本文中。 

序列表 

<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 

<120>靶向CCP22基因的干扰性RNA、含有该干扰性RNA的药物组合物及其应用 

<130>IDC100094 

<160>9 

<170>PatentIn version 3.5 

<210>1 

<211>4494 

<212>DNA 

<213>CCP22基因的cDNA序列 

<400>1 

atgccccgtt gtatagctca tttctgtgaa aaacctccat cggtttccta tagcatcttg     60 

gaatctgtga gcaaagcaaa atttgcagct ggctcagttg tgagctttaa atgcatggaa    120 

ggctttgtac tgaacacctc agcaaagatt gaatgtatga gaggtgggca gtggaaccct    180 

tcccccatgt ccatccagtg catccctgtg cggtgtggag agccaccaag catcatgaat    240 

ggctatgcaa gtggatcaaa ctacagtttt ggagccatgg tggcttacag ctgcaacaag    300 

gggttctaca tcaaagggga aaagaagagc acctgcgaag ccacagggca gtggagtagt    360 

cctataccga cgtgccaccc ggtatcttgt ggtgaaccac ctaaggttga gaatggcttt    420 

ctggagcata caactggcag gatctttgag agtgaagtga ggtatcagtg taacccgggc    480 

tataagtcag tcggaagtcc tgtatttgtc tgccaagcca atcgccactg gcacagtgaa    540 

tcccctctga tgtgtgttcc tctcgactgt ggaaaacctc ccccgatcca gaatggcttc    600 

atgaaaggag aaaactttga agtagggtcc aaggttcagt ttttctgtaa tgagggttat    660 

gagcttgttg gtgacagttc ttggacatgt cagaaatctg gcaaatggaa taagaagtca    720 

aatccaaagt gcatgcctgc caagtgccca gagccgcccc tcttggaaaa ccagctagta    780 

ttaaaggagt tgaccaccga ggtaggagtt gtgacatttt cctgtaaaga agggcatgtc    840 

ctgcaaggcc cctctgtcct gaaatgcttg ccatcccagc aatggaatga ctctttccct    900 

gtttgtaaga ttgttctttg taccccacct cccctaattt cctttggtgt ccccattcct    960 

tcttctgctc ttcattttgg aagtactgtc aagtattctt gtgtaggtgg gtttttccta   1020 

agaggaaatt ctaccaccct ctgccaacct gatggcacct ggagctctcc actgccagaa   1080 

tgtgttccag tagaatgtcc ccaacctgag gaaatcccca atggaatcat tgatgtgcaa   1140 

ggccttgcct atctcagcac agctctctat acctgcaagc caggctttga attggtggga   1200 

aatactacca ccctttgtgg agaaaatggt cactggcttg gaggaaaacc aacatgtaaa    1260 

gccattgagt gcctgaaacc caaggagatt ttgaatggca aattctctta cacggaccta    1320 

cactatggac agaccgttac ctactcttgc aaccgaggct ttcggctcga aggtcccagt    1380 

gccttgacct gtttagagac aggtgattgg gatgtagatg ccccatcttg caatgccatc    1440 

cactgtgatt ccccacaacc cattgaaaat ggttttgtag aaggtgcaga ttacagctat    1500 

ggtgccataa tcatctacag ttgcttccct gggtttcagg tggctggtca tgccatgcag    1560 

acctgtgaag agtcaggatg gtcaagttcc atcccaacat gtatgccaat agactgtggc    1620 

ctccctcctc atatagattt tggagactgt actaaactca aagatgacca gggatatttt    1680 

gagcaagaag acgacatgat ggaagttcca tatgtgactc ctcaccctcc ttatcatttg    1740 

ggagcagtgg ctaaaacctg ggaaaataca aaggagtctc ctgctacaca ttcatcaaac    1800 

tttctgtatg gtaccatggt ttcatacacc tgtaatccag gatatgaact tctggggaac    1860 

cctgtgctga tctgccagga agatggaact tggaatggca gtgcaccatc ctgcatttca    1920 

attgaatgtg acttgcctac tgctcctgaa aatggctttt tgcgttttac agagactagc    1980 

atgggaagtg ctgtgcagta tagctgtaaa cctggacaca ttctagcggg ctctgactta    2040 

aggctttgtc tagagaatag aaagtggagt ggtgcctccc cacgctgtga agccatttca    2100 

tgcaaaaagc caaatccagt catgaatgga tccatcaaag gaagcaacta cacatacctg    2160 

agcacgttgt actatgagtg tgaccccgga tatgtgctga atggcactga gaggagaaca    2220 

tgccaggatg acaaaaactg ggatgaggat gagcccattt gcattcctgt ggactgcagt    2280 

tcacccccag tctcagccaa tggccaggtg agaggagacg agtacacatt ccaaaaagag    2340 

attgaataca cttgcaatga agggttcttg cttgagggag ccaggagtcg ggtttgtctt    2400 

gccaatggaa gttggagtgg agccactccc gactgtgtgc ctgtcagatg tgccaccccg    2460 

ccacaactgg ccaatggggt gacggaaggc ctggactatg gcttcatgaa ggaagtaaca    2520 

ttccactgtc acgagggcta catcttgcac ggtgctccaa aactcacctg tcagtcagat    2580 

ggcaactggg atgcagagat tcctctctgt aaaccagtca actgtggacc tcctgaagat    2640 

cttgcccatg gtttccctaa tggtttttcc tttattcatg ggggccatat acagtatcag    2700 

tgctttcctg gttataagct ccatggaaat tcatcaagaa ggtgcctctc caatggctcc    2760 

tggagtggca gctcaccttc ctgcctgcct tgcagatgtt ccacaccagt aattgaatat    2820 

ggaactgtca atgggacaga ttttgactgt ggaaaggcag cccggattca gtgcttcaaa    2880 

ggcttcaagc tcctaggact ttctgaaatc acctgtgaag ccgatggcca gtggagctct    2940 

gggttccccc actgtgaaca cacttcttgt ggttctcttc caatgatacc aaatgcgttc    3000 

atcagtgaga ccagctcttg gaaggaaaat gtgataactt acagctgcag gtctggatat    3060 

gtcatacaag gcagttcaga tctgatttgt acagagaaag gggtatggag ccagccttat    3120 

ccagtctgtg agcccttgtc ctgtgggtcc ccaccgtctg tcgccaatgc agtggcaact    3180 

ggagaggcac acacctatga aagtgaagtg aaactcagat gtctggaagg ttatacgatg    3240 

gatacagata cagatacatt cacctgtcag aaagatggtc gctggttccc tgagagaatc    3300 

tcctgcagtc ctaaaaaatg tcctctcccg gaaaacataa cacatatact tgttcatggg    3360 

gacgatttca gtgtgaatag gcaagtttct gtgtcatgtg cagaagggta tacctttgag    3420 

ggagttaaca tatcagtatg tcagcttgat ggaacctggg agccaccatt ctccgatgaa    3480 

tcttgcagtc cagtttcttg tgggaaacct gaaagtccag aacatggatt tgtggttggc    3540 

agtaaataca cctttgaaag cacaattatt tatcagtgtg agcctggcta tgaactagag    3600 

gggaacaggg aacgtgtctg ccaggagaac agacagtgga gtggaggggt ggcaatatgc    3660 

aaagagacca ggtgtgaaac tccacttgaa tttctcaatg ggaaagctga cattgaaaac    3720 

aggacgactg gacccaacgt ggtatattcc tgcaacagag gctacagtct tgaagggcca    3780 

tctgaggcac actgcacaga aaatggaacc tggagccacc cagtccctct ctgcaaacca    3840 

aatccatgcc ctgttccttt tgtgattccc gagaatgctc tgctgtctga aaaggagttt    3900 

tatgttgatc agaatgtgtc catcaaatgt agggaaggtt ttctgctgca gggccacggc    3960 

atcattacct gcaaccccga cgagacgtgg acacagacaa gcgccaaatg tgaaaaaatc    4020 

tcatgtggtc caccagctca cgtagaaaat gcaattgctc gaggcgtaca ttatcaatat    4080 

ggagacatga tcacctactc atgttacagt ggatacatgt tggagggttt cctgaggagt    4140 

gtttgtttag aaaatggaac atggacatca cctcctattt gcagagctgt ctgtcgattt    4200 

ccatgtcaga atgggggcat ctgccaacgc ccaaatgctt gttcctgtcc agagggctgg    4260 

atggggcgcc tctgtgaaga accaatctgc attcttccct gtctgaacgg aggtcgctgt    4320 

gtggcccctt accagtgtga ctgcccgcct ggctggacgg ggtctcgctg tcatacagct    4380 

gtttgccagt ctccctgctt aaatggtgga aaatgtgtaa gaccaaaccg atgtcactgt    4440 

ctttcttctt ggacgggaca taactgttcc aggaaaagga ggactgggtt ttaa 4494 

<210>2 

<211>19 

<212>核酸 

<213>CCP22基因靶区域 

<400>2 

atgcatggaa ggctttgta                                                 19 

<210>3 

<211>19 

<212>核酸 

<213>CCP22基因靶区域 

<400>3 

gaaccaatct gcattcttc                                                 19 

<210>4 

<211>59 

<212>人工序列 

<213>靶向CCP22基因的shRNA 

<220> 

<221>misc_feature 

<222>(1)..(1) 

<223>n是长度为0-10个核苷酸的任意核苷酸 

<400>4 

ngaaccaatc tgcattcttc ttcaagagag aagaatgcag attggttctt ttttggaaa     59 

<210>5 

<211>59 

<212>人工序列 

<213>靶向CCP22基因的shRNA 

<220> 

<221>misc_feature 

<222>(1)..(1) 

<223>n是长度为0-10个核苷酸的任意核苷酸 

<400>5 

natgcatgga aggctttgta ttcaagagat acaaagcctt ccatgcattt ttttggaaa     59 

<210>6 

<211>63 

<212>人工序列 

<213>构建CCP22 siRNA-Z的正义链 

<400>6 

gatccgaacc aatctgcatt cttcttcaag agagaagaat gcagattggt tcttttttgg    60 

aaa                                                                  63 

<210>7 

<211>63 

<212>人工序列 

<213>构建CCP22 siRNA-Z的反义链 

<400>7 

agcttttcca aaaaagaacc aatctgcatt cttctctctt gaagaagaat gcagattggt    60 

tcg                                                                  63 

<210>8 

<211>63 

<212>人工序列 

<213>构建CCP22 siRNA-F的正义链 

<400>8 

gatccatgca tggaaggctt tgtattcaag agatacaaag ccttccatgc atttttttgg    60 

aaa                                                                  63 

<210>9 

<211>63 

<212>人工序列 

<213>构建CCP22 siRNA-F的反义链 

<400>9 

agcttttcca aaaaaatgtt tcggaaggta cgtatctctt gaatacaaag ccttccatgc    60 

atg                                                                  63 

Claims (12)

1.一种多核苷酸，其正义链序列为： 

5′-GATCCGAACCAATCTGCATTCTTCTTCAAGAGAGAAGAATGCAGATTGGTTCTTTTTTGGAAA-3′，即SEQ ID NO：6，其反义链序列为： 

5′-AGCTTTTCCAAAAAAGAACCAATCTGCATTCTTCTCTCTTGAAGAAGAATGCAGATTGGTTCG-3’，即SEQ ID NO：7。 

2.一种多核苷酸，其正义链序列为： 

5′-GATCCATGCATGGAAGGCTTTGTATTCAAGAGATACAAAGCCTTCCATGCATTTTTTTGGAAA-3′，即SEQ ID NO：8，其反义链序列为： 

5′-AGCTTTTCCAAAAAAATGTTTCGGAAGGTACGTATCTCTTGAATACAAAGCCTTCCATGCATG-3′，即SEQ ID NO：9。 

3.一种核酸构建体，其中包含编码权利要求1或2的多核苷酸以及与之可操作连接的表达元件。 

4.权利要求3的核酸构建体，其中所述表达元件是启动子和终止子。 

5.权利要求4的核酸构建体，其中所述表达元件还包括增强子。 

6.一种表达载体，其中包含权利要求3-5中任一项的核酸构建体。 

7.权利要求6的表达载体，其是质粒或病毒形式。 

8.权利要求7的表达载体，其是腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或慢病毒表达载体。 

9.一种宿主细胞，其中转化或转染了权利要求3-5中任一项的核酸构建体或者权利要求6-8中任一项的表达载体。 

10.一种药物组合物，其中包含至少一种权利要求3-5中任一项的核酸构建体、权利要求6-8中任一项的表达载体和/或权利要求9的宿主细胞，以及药学可接受载体。 

11.一种非治疗性的降低细胞内CCP22活性水平的方法，其中包括以有效降低CCP22活性水平的量将权利要求3-5中任一项的核酸构建体、权利要求6-8中任一项的表达载体、权利要求9的宿主细胞或者权利要求10的药物组合物与所述细胞接触。 

12.权利要求3-5中任一项的核酸构建体、权利要求6-8中任一项的表达载体或者权利要求9的宿主细胞在制备用于预防、治疗或缓解患者中肿瘤的药物中的用途。 

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