CN111394352B - PDCD11-shRNA及其在治疗结直肠癌中的应用 - Google Patents

PDCD11-shRNA及其在治疗结直肠癌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种PDCD11‑shRNA，为根据核仁蛋白PDCD11的基因序列设计的针对PDCD11的shRNA分子，能够显著抑制人结直肠癌细胞HCT116的生长。本发明PDCD11‑shRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的优点是能显著降低HCT116肿瘤细胞内PDCD11的表达水平，显著抑制细胞的增殖速率。因此，本发明设计的shPDCD11分子具有治疗结直肠癌的潜能。

Description

PDCD11-shRNA及其在治疗结直肠癌中的应用
技术领域
本发明涉及一种PDCD11-shRNA及其在作为结直肠癌治疗靶点中的应用，分类号为C12N15/113，属于生物医药技术领域。
背景技术
结直肠癌是目前最常见的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生命和健康，其发病率位居常见恶性肿瘤的前列，其病死率也居癌症死亡的前列。结直肠癌的发生发展是一个多步骤、多阶段以及多基因参与的过程，其中基因异常表达在结肠癌发生发展过程中又起着重要作用。因此，寻找出新的结直肠癌治疗靶点对疾病的治疗，降低直结肠癌死亡率具有重要的科学意义。
肿瘤靶向治疗是针对肿瘤特异性表达的功能分子，设计开发靶向性的抑制剂，包括抗体、小分子、生物载体等。该类靶向性分子可以特异性抑制肿瘤细胞的生长、运动及化疗抵抗等功能，而对正常的组织细胞不具有破坏作用。因此，靶向治疗可以极大的延长患者的生存时间及生存质量。然而，现阶段可用的靶向治疗靶点有限，可用的靶向药匮乏，只有极少部分患者可以从靶向治疗中受益，因此提供一种新型的肿瘤治疗靶点是目前亟需解决的问题。
核仁是细胞核内合成核糖体RNA和组装核糖体大、小亚基的重要场所（Tan BC, etal. J Biomed Sci. 2012; 19: 57）。核仁蛋白是组成核仁的主要成分，在细胞的蛋白质生物合成中发挥重要作用。研究发现，核仁蛋白能调节细胞增殖（Liu, S. J., et al. WorldJ Gastroenterol. 2004; 10, 1246-1249）、细胞凋亡和细胞周期（Wu, Q., et al. PLoSOne. 2011; 6: e26401）。申请人最近发现，在人结直肠癌细胞中，某些核仁蛋白如RSL1D1高表达，与肿瘤的发生、发展密切相关。
PDCD11 (Programmed cell death 11)是一种核仁蛋白（Scherl A, et al. MolBiol Cell. 2002 13:4100-4109），为18S rRNA的成熟所必需（Sweet T, et al. J CellPhysiol.2008. 214:381-388）。据报道，PDCD11在p53介导的程序性细胞死亡中至关重要（Kevin M.Ryan, et al. Nature. 2000;404: 892-897）。
近年来，RNA干扰技术经历着高速发展，也为癌症治疗带来了新的曙光和革命性的转变。RNA干扰技术作为一种新兴的癌症治疗方法，具有巨大的潜力和发展前景。短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）是一类人工合成的具有紧密的发夹转弯结构的RNA，它可以通过RNA干扰技术的原理沉默靶向基因的表达。因此，为了研究某个治疗靶点在肿瘤治疗中的重要性，通常利用shRNA干扰技术进行评估。设计针对某个靶点的shRNA分子，利用所述shRNA分子干扰靶点的表达，从而影响靶点的功能，然后通过考察所述shRNA分子对细胞增殖速率的影响，评估该分子是否具有潜在的肿瘤治疗效应。
如何利用RNA干扰技术，研究出特异性针对恶性肿瘤细胞的shRNA，为结直肠癌等相关癌症的治疗提供一种有益的途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足而提供一种PDCD11-shRNA及其在治疗结直肠癌中的应用，PDCD11-shRNA是以核仁蛋白PDCD11的基因序列为靶标，设计出的特异性shRNA分子，能够达到抑制恶性肿瘤细胞生长的目的。
本发明提供了一种PDCD11-shRNA，所述PDCD11-shRNA为根据核仁蛋白PDCD11的基因序列设计的针对PDCD11的shRNA分子，能够显著抑制人结直肠癌细胞HCT116的生长。本发明PDCD11-shRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。
据申请人尚未发表的数据表明，在人结直肠癌细胞中，PDCD11的沉默能抑制肿瘤细胞的生长，说明PDCD11是一个潜在的肿瘤治疗靶点。本发明根据核仁蛋白PDCD11的基因序列设计了一种针对PDCD11的shRNA分子（即sh PDCD11）。将表达 shRNA分子的质粒包装慢病毒，感染人结直肠癌，成功降低了PDCD11在人结直肠癌细胞中的mRNA和蛋白质表达水平。进一步研究发现，PDCD11表达水平的降低能显著抑制人结直肠癌细胞的生长速率，因此本发明涉及的shRNA分子可开发为治疗结直肠癌的药物。
优选地，所述PDCD11-shRNA包含用于沉默人源PDCD11基因的靶点序列。
优选地，所述靶点序列为GCAGTCAGTTGAACAAGACAA。
优选地，所述PDCD11-shRNA包含正义链和反义链，所述正义链的寡核苷酸序列为：
5’-CCGGGCAGTCAGTTGAACAAGACAACTCGAGTTGTCTTGTTCAACTGACTGCTTTTTG-3’；所述反义链的寡核苷酸序列为：
5’-AATTCAAAAAGCAGTCAGTTGAACAAGACAACTCGAGTTGTCTTGTTCAACTGACTGC-3’。
本发明还提供了PDCD11-shRNA在治疗直结肠癌中作为治疗靶点的应用。
本发明设计的shPDCD11分子能显著降低HCT116肿瘤细胞内PDCD11的表达水平，显著抑制细胞的增殖速率。因此，本发明设计的shPDCD11分子具有治疗结直肠癌的潜能。
本发明设计了一条针对PDCD11的shRNA分子，该分子能显著降低结直肠癌细胞中PDCD11的mRNA和蛋白质的表达水平，从而显著抑制了直结肠癌细胞生长速率，对于恶性肿瘤的治疗具有十分重要的意义，将该shRNA分子进一步开发成为临床治疗药物，具有广泛的市场应用前景，其潜在的社会和经济效益必将十分巨大。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR检测结果图。
图2为免疫印迹法检测结果图。
图3为细胞计数法检测sh PDCD11影响HCT116肿瘤细胞增殖的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护权限不限于下述的实施例。
实施例中所涉及材料的来源：
TE缓冲液(pH=8.0)购自北京索莱宝科技有限公司；胰酶、Opti-MEM® I培养基和DMEM培养基购自Gibco公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；限制性核酸内切酶AgeI、EcoRI和BamHI购自NEB公司；T4 DNA连接酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司；大肠杆菌DH5α购自北京康为世纪生物科技有限公司；Lenti-X 293T细胞购自Clontech公司；嘌呤霉素购自Amresco公司；MTT购自Sigma公司；质粒pLKO.1、pCMV-VsVg和pCMV-dR8.2购自Addgene公司；HCT116细胞购自中国科学院细胞库。
DMEM培养基，购自Gibco公司。其配方如下：称取DMEM粉剂13.37 g，NaHCO3 3.7 g，丙酮酸钠110 mg，加入Milli Q超纯水800 mL，磁力搅拌，充分溶解，加入100×青霉素-链霉素贮存液（浓度为青霉素10000 U/mL和链霉素10000 μg/mL）10 mL，用浓盐酸调pH 7.2–7.4，Milli Q水定容至1 L，双层0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，加10%胎牛血清，置4 ℃冰箱保存备用。
McCoy’s 5A 培养基，购自Sigma公司。其配方如下：称取McCoy’s 5A粉剂11.9 g，碳酸氢钠2.2 g，加入800 mL MilliQ超纯水，磁力搅拌，充分溶解，加入100×青霉素-链霉素贮存液（终浓度为青霉素10000 U/mL和链霉素10000 μg/mL）10 mL，用浓盐酸调pH 7.2-7.4，Milli Q水定容至1 L，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，加10%胎牛血清，置4 ℃冰箱保存备用。
本实施例所涉及的其余试剂及材料均为市购，此处不在一一列举。
本实施例的具体实施步骤如下：
1、设计PDCD11的shRNA（即PDCD11-shRNA，又称sh PDCD11）
通过GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)获得人源PDCD11的基因序列信息（NM_014976.2），然后根据shRNA的设计原则，设计了针对人源PDCD11基因的shRNA序列，记为shPDCD11，其编码序列如SEQ ID NO:1所示。其靶序列为GCAGTCAGTTGAACAAGACAA，用于沉默人源PDCD11基因。根据靶序列设计了两条寡核苷酸序列，用于将shPDCD11编码序列克隆至慢病毒载体pLKO.1。合成的寡核苷酸序列如下所示：
正义链：
5’-CCGGGCAGTCAGTTGAACAAGACAACTCGAGTTGTCTTGTTCAACTGACTGCTTTTTG-3’
反义链：
5’-AATTCAAAAAGCAGTCAGTTGAACAAGACAACTCGAGTTGTCTTGTTCAACTGACTGC-3’。
同时，采用荧光素酶（Luciferase）基因作为对照组，设计了针对荧光素酶的对照shRNA序列（标记为shLuc），其编码序列如SEQ ID NO:2所示，其靶点序列为CGCTGAGTACTTCGAAATGTC。针对靶点序列设计了两条寡核苷酸序列，用于将shLuc编码序列克隆至慢病毒载体pLKO.1。合成的寡核苷酸序列如下所示：
正义链：
5’-CCGGCGCTGAGTACTTCGAAATGTCCTCGAGGACATTTCGAAGTACTCAGCGTTTTT-3’
反义链：
5’-AATTAAAAACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCTCGAGGACATTTCGAAGTACTCAGCG-3’。
2、构建慢病毒重组质粒pLKO.1-shPDCD11
将shPDCD11的编码序列克隆至慢病毒表达载体pLKO.1（购自Addgene公司），以构建重组质粒pLKO.1-shPDCD11。
其中，pLKO.1-shPDCD11的构建方法如下:
将针对PDCD11合成的正义链和反义链寡核苷酸配制为浓度为100 μM的溶液。取上述溶液各1 μL 加入装有8 μL 1×TE缓冲液的PCR管中，混匀。置于常规PCR仪中在94 ℃条件下处理3 min，随后以0.5 ℃/min的速度缓慢退火至25 ℃。待反应结束后，先采用1×TE缓冲液将反应产物稀释100倍；再将慢病毒表达载体pLKO.1经AgeI/EcoRI双酶切并纯化；然后将稀释后的反应产物与双酶切载体pLKO.1采用T4 DNA连接酶按常规方法连接，连接后转化至大肠杆菌DH5α，挑单克隆过夜培养，抽提质粒，得到重组制粒。经EcoRI/BamHI双酶切和测序鉴定重组质粒。
慢病毒重组质粒pLKO.1-shLuc的构建方法与上述pLKO.1-shPDCD11的构建方法相同。
3、包装慢病毒
采用重组质粒包装慢病毒：取鉴定准确的慢病毒重组质粒pLKO.1-shPDCD11、pLKO.1-shLuc，参照Lipofectamine 2000试剂的操作说明书包装慢病毒（以6孔细胞培养板为例）。重组质粒pLKO.1-shPDCD11包装慢病毒的方法如下：
(1)接种Lenti-X 293T细胞至6孔细胞培养板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中过夜培养，当细胞融合度（confluence）达90%时开始实验；
(2)取一支1.5 mL 离心管一，加入195 μL Opti-MEM® I培养基，按慢病毒重组质粒pLKO.1-shPDCD11: 包膜质粒pCMV-VsVg : 包装质粒pCMV-dR8.2（辅助质粒VsVg、包装辅助质粒pCMV delta R8均购自Addgene公司）的质量比为 3:1:2，分别向离心管加入上述质粒（保证后续 6 孔细胞培养板中质粒的总量为2.34 μg），混匀，室温静置待用；
(3)取一支新的 1.5 mL离心管二，加入195 μL Opti-MEM® I培养基和4.68 μLLipofectamin 2000（购自Invitrogen公司），上下颠倒轻轻混匀，室温静置5 min；
(4)将离心管二中的所有混合液加至离心管一种，轻轻上下颠倒混匀，室温放置20min；
(5)将上述步骤（4）的混合液转移至接种Lenti-X 293T细胞的6孔细胞培养板孔中，轻轻混匀，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养11 h后换培养液（采用DMEM培养基）；
(6)换培养液后继续培养48 h，收集细胞培养上清液于15 mL离心管三中，并将上清液暂时保存于4 ℃，同时在6孔细胞培养板中补加新鲜培养基（采用DMEM培养基），于37℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h；
(7)再次收集细胞培养上清液于15 mL离心管三中，上下颠倒轻轻混匀两次收集的上清；
（8）将混匀的上清在室温下于3000 rpm离心10 min，然后分装至1.5 mL离心管中，1 mL/管，于-80 ℃保存备用或直接用于细胞的感染。
重组质粒pLKO.1-shLuc包装慢病毒的方法如上述重组质粒pLKO.1-shPDCD11包装慢病毒的方法相同。
4、用shRNA慢病毒感染HCT116细胞并评价其沉默效果
采用荧光定量PCR法和免疫印迹法检测shPDCD11沉默PDCD11基因表达的效果：采用重组质粒pLKO.1-shPDCD11包装慢病毒后，感染处于对数生长期的人结直肠癌细胞HCT116，然后采用荧光定量PCR法和免疫印迹法分别检测胞内PDCD11的mRNA和蛋白质水平，以评价所述shPDCD11分子抑制PDCD11基因表达的效果。具体方法如下：
在6 cm细胞培养板中接种人结直肠癌细胞HCT116（源于中国科学院细胞库），4×105个细胞/孔，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24小时。采用shPDCD11、shLuc慢病毒分别感染6 cm细胞培养板中的人结直肠癌细胞HCT116。感染时，向培养的人结直肠癌细胞HCT116中加入终浓度为8 μg/mL的聚凝胺（polybrene）；16-18小时后更换新鲜培养基（采用McCoy’s5A 培养基），2天后加入嘌呤霉素（puromycin）进行筛选，得到稳定感染慢病毒的HCT116细胞，继续培养5天后收集已经感染shPDCD11和shLuc慢病毒细胞。针对收集的感染慢病毒细胞HCT116，一部分细胞用于提取总RNA并反转录合成cDNA，再用荧光定量PCR法检测细胞内PDCD11 mRNA的相对水平；另一部分细胞用于提取总蛋白，再用免疫印迹法检测转染细胞内PDCD11蛋白的相对水平。最后，根据实时荧光定量PCR法和免疫印迹法的检测结果（见图1和图2）综合评价shPDCD11的基因沉默效果。
5、细胞计数法检测PDCD11基因沉默对HCT116细胞增殖的抑制作用
将shPDCD11基因沉默的HCT116细胞接种至6孔细胞培养板，置二氧化碳培养箱中继续培养，然后用细胞计数法在不同时间点计数细胞以检测不同时间点的细胞活力，评价PDCD11基因的沉默对细胞增殖的影响。
感染shPDCD11慢病毒的HCT116细胞采用细胞计数法检测的过程如下：
将已经感染慢病毒shPDCD11并筛选稳定的HCT116细胞株接种于6孔细胞培养板，1×105/孔。于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2天后经胰酶（购自Gibco公司）消化，计数，同时将细胞再次接种于6孔细胞培养板，1×105/孔。继续培养，于第4天和第6天重复上述步骤。
感染shLuc慢病毒的HCT116细胞采用细胞计数法检测的过程如上所述。最终根据计数结果绘制细胞生长曲线，以评价PDCD11基因的沉默是否抑制HCT116细胞的增殖。结果如图3所示，shLuc对照组细胞正常生长，shPDCD11沉默组细胞生长受到极大抑制。因此，本发明设计的shPDCD11分子可用于制备治疗结直肠癌的药物。
以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
序列表
<110> 扬州大学
<120> PDCD11-shRNA及其在治疗结直肠癌中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgggcagtc agttgaacaa gacaactcga gttgtcttgt tcaactgact gctttttg 58
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccggcgctga gtacttcgaa atgtcctcga ggacatttcg aagtactcag cgttttt 57

Claims (1)

1.PDCD11-shRNA在制备治疗结直结肠癌的药物中的应用，PDCD11-shRNA的序列如SEQID NO:1所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Proteins, which are upregulated at early time points following Apc deletion, are involved in intestinal tumourigenesis and represent potential colorectal cancer biomarkers;Dr Shahram Ali Ibrahim;《The University of Liverpool》;20190529;图4.10-4.15、第159-164页 *

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