CN113230268B

CN113230268B - 一种非编码小rna基因、载体和细胞在制备抑制乳腺癌的药物中的用途

Info

Publication number: CN113230268B
Application number: CN202110503796.2A
Authority: CN
Inventors: 俞作仁; 赵倩; 吕金辉; 钱璐
Original assignee: Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Current assignee: Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Priority date: 2021-05-10
Filing date: 2021-05-10
Publication date: 2023-02-21
Anticipated expiration: 2041-05-10
Also published as: CN113230268A

Abstract

本发明提供了一种非编码小RNA基因在制备抑制乳腺癌的药物中的用途，所述的非编码小RNA基因的基因序列如SEQ ID NO.8‑13中任一序列所示。本发明还提供了一种载体在制备抑制乳腺癌的药物中的用途，所述的载体含有一段基因，所述的基因的序列如SEQ ID NO.1‑6中任一序列所示。本发明还提供了一种细胞在制备抑制乳腺癌的药物中的用途，所述的细胞含有一段基因，所述的基因的序列如SEQ ID NO.1‑6中任一序列所示。体外及体内实验均证明非编码小RNA基因piR_002158具有抗乳腺癌功能，有潜力用于乳腺癌的生物治疗。

Description

一种非编码小RNA基因、载体和细胞在制备抑制乳腺癌的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种非编码基因，具体来是一种非编码小RNA基因、激动剂、载体和细胞在制备抑制乳腺癌的药物中的用途。

背景技术

《2020年全球癌症负担报告》显示乳腺癌已取代肺癌成为全球第一大癌，占全球每年新发病例的近12％。2020年，约有230万女性乳腺癌新增病例，即每8例确诊的癌症中就有1例是乳腺癌，这也是乳腺癌首次成为全球最常见的癌症。本世纪全球乳腺癌发病率的快速增长严重威胁女性健康。尽管乳腺癌早期诊断以及手术技术和放化疗水平的提高降低了乳腺癌死亡率，但恶性乳腺癌伴随肺、骨、脑等器官转移的致死率仍居高不下。

Piwi-interacting RNA(piRNA)是一类存在于哺乳动物生殖细胞及干细胞中、长度约为30nt的非编码小RNA，主要来源于含有大量转座子和重复序列的基因间隔区。piRNA可从正义、反义2个方向被转录，有初级生成途径和次级生成途径两种生成方式。在初级生成途径中，双链piRNA簇转录生成的piRNA前体经转运蛋白NXT1、NXF1等转运到细胞质Yb结构域内进行加工；piRNA前体的5'端被Zuc酶等识别并切割产生具有5'U的短链piRNA中间体；piRNA中间体在SHU(Shutdown)和HSP83(heat shock protein 83)等蛋白的作用下与PIWI结合，其3'端被核酸外切酶TRIMMER和PAPI剪切以及被HEN1甲基化酶催化产生成熟piRNA；成熟piRNA最终以PIWI/piRNA复合物的形式转运到细胞核内,招募表观遗传学修饰蛋白进行表观遗传学调控,也可以在细胞质中进行mRNA切割和降解调控,促进配子发育。在次级生成途径中，来自转座子和piRNA簇的互补转录本在一个电子密集和非晶体的核周结构区(nuage)被AUG和AGO不断切割，形成一个正向放大的次级piRNA生成循环通路，该过程被称为“乒乓循环”。

“乒乓循环”是由一个结合了PIWI蛋白的“启动”piRNA对前体转录物进行剪切所启动，PIWI裂解得到的5'-单磷酸基片段被作为piRNA前前体(pre-pre-piRNA)传递给相应的PIWI蛋白，随后被裂解。由此产生的5'裂解片段被称为piRNA前体(pre-piRNA)，其3'-末端可被3',5'-核酸外切酶进一步修饰剪切为成熟长度，同时被甲基转移酶Hen1催化发生2'-O-甲基化，从而成为“应答”piRNA。Hen1介导的2'-O-甲基化作用可以保护成熟的piRNA不被降解，并加强其与PIWI蛋白的结合。与此同时，pre-pre-piRNA的3'端裂解片段作为新的pre-pre-piRNA与下一个PIWI蛋白结合，并再次被裂解，产生一个新的结合了PIWI的pre-piRNA，然后，经过Trimmer和Hen1在3'-端的加工成为成熟的“尾随”piRNA，而这次得到的3'切割片段也被引入到下一个PIWI蛋白中，作为新的pre-pre-piRNA。自此，在“应答”piRNA下游连续产生了一系列“尾随”piRNA。“乒乓循环”产生成对的piRNA(“启动”和“应答”piRNA)，它们在5'-端有10个碱基的重叠，并在“应答”piRNA的下游有多个“尾随”piRNA产生。通过“乒乓循环”，piRNA大量扩增，与此同时转座子转录本被大量消耗，导致转座活性被抑制。

piRNA在结构上5'端首位通常为单磷酸的尿嘧啶核糖核酸，在第10个核苷酸位点有缺乏腺嘌呤的倾向性，3'端进行了甲基化修饰，彼此间没有共有序列。PIWI蛋白是piRNA-PIWI通路的核心。不仅参与piRNA信号的放大机制，且发挥支架作用，结合数种与该通路密切相关的功能蛋白。它促进了常染色质上组蛋白的修饰和piRNA的转录。PIWI蛋白已经在种系和干细胞中得到广泛研究，并且具有结合2'-O-甲基化RNA的独特能力和在3'端结合piRNA的显着特征。piRNA通过与Piwi亚家族特异性结合形成piRNA沉默复合物(piRNA-induced silencing complex,piRISC)，维持生殖细胞DNA稳定、抑制转座子转录、调控翻译、参与异染色质的形成、执行表观遗传调控和维持生殖干细胞干性等。

人类基因组中piRNAs的编码数量很多。近年来，越来越多的证据表明piRNA在肿瘤细胞，尤其是肿瘤干细胞异常表达，调控肿瘤干细胞自我更新、分化和成瘤能力，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移等调控。在结肠癌、肺癌和乳腺癌组织以及肝癌、间皮瘤、宫颈癌、乳腺癌和肺癌细胞系中观察到piR-651的上调，表明其在癌症类型中的致癌作用。piR-054265已被证实可促进结直肠癌的增殖与转移；piR-014620在转移的肾癌、肺癌等低表达，piR-014620表达缺失与肺癌的远端转移相关；piR-022437高表达与肾癌转移相关；piR-021285可能通过重塑癌症表观基因组而参与乳腺肿瘤的发生；piR-004987高表达与乳腺癌的淋巴结转移相关；piR-036712通过与SEPW1假基因SEPW1P RNA相互作用抑制乳腺癌的发生和化学耐药性。piRNA的异常表达及其与恶性组织中临床特征的相关性表明piRNA具有成为肿瘤诊断、预后和治疗靶点的潜力。

hsa-piR_002158(DQ572892)，也叫hsa-piR-2980,hsa-piR-21067,hsa-piR-41004,hsa-piR-3200,hsa-piR-35356，hsa-piR-35976具体序列如下：NCBI数据库登录号(ACCESSION：DQ572892)，链接https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/DQ572892；piRNA Database(piRNAdb)注册号hsa-piR-2980，链接https://www.pirnadb.org/ information/pirna/hsa_piR_002158；

上述piR_002158(DQ572892)序列:5’ucacaaugcugacacucaaacugcugacagc3’,acagc保留0、1(a)、2(ac)、3(aca)、4(acag)、5(acagc)个碱基的序列均存在，均通过克隆测序手段从乳腺癌细胞株及乳腺肿瘤组织中得以鉴定。目前还未见piR_002158(DQ572892)调控肿瘤发生及发展的功能研究和报道。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种非编码小RNA基因、激动剂、载体和细胞在制备抑制乳腺癌的药物中的用途，所述的这种非编码小RNA基因、激动剂、载体和细胞在制备抑制乳腺癌的药物中的用途要解决现有技术中的药物抑制乳腺癌的效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种非编码小RNA基因在制备抑制乳腺癌的药物中的用途，所述的非编码小RNA基因的基因序列如SEQ ID NO.8-13中任一序列所示(5’到3’)。

ucacaaugcugacacucaaacugcugacagc，SEQ ID NO.8；

ucacaaugcugacacucaaacugcugacag，SEQ ID NO.9；

ucacaaugcugacacucaaacugcugaca，SEQ ID NO.10；

ucacaaugcugacacucaaacugcugac，SEQ ID NO.11；

ucacaaugcugacacucaaacugcuga，SEQ ID NO.12；

ucacaaugcugacacucaaacugcug，SEQ ID NO.13；

本发明还提供了一种载体在制备抑制乳腺癌的药物中的用途，所述的载体含有一段基因，所述的基因的序列如SEQ ID NO.1-6中任一序列所示(5’到3’)。

tcacaatgctgacactcaaactgctgacagc，SEQ ID NO.1；

tcacaatgctgacactcaaactgctgacag，SEQ ID NO.2；

tcacaatgctgacactcaaactgctgaca，SEQ ID NO.3；

tcacaatgctgacactcaaactgctgac，SEQ ID NO.4；

tcacaatgctgacactcaaactgctga，SEQ ID NO.5；

tcacaatgctgacactcaaactgctg，SEQ ID NO.6；

进一步的，所述的载体为质粒。

本发明还提供了一种细胞在制备抑制乳腺癌的药物中的用途，所述的细胞含有一段基因，所述的基因的序列如SEQ ID NO.1-6中任一序列所示。

无论质粒或者细胞内SEQ ID NO.1-6中任一序列，均通过基因细胞基因转录，从DNA序列转录为RNA序列，即SEQ ID NO.1-6序列转录为SEQ ID NO.8-13序列，才发挥piR_002158(DQ572892)功能。

本发明还提供了一种生物或者化学激动剂，所述的激动剂可激活或模拟一种非编码小RNA基因，所述的非编码小RNA基因的基因序列如SEQ ID NO.8-13中任一序列所示。

本发明发现piR_002158(D Q572892)在乳腺肿瘤中异常低表达，细胞实验证实其可抑制乳腺癌细胞的增殖及迁移，体内动物实验证实其可抑制乳腺癌生长。

在不同的乳腺癌细胞系及不同患者乳腺癌组织样本测序发现，piR_002158序列在3'端有1-5个碱基的差异，源自piRNA前体被核酸内切酶剪切的时候，选择了不同的剪切位点。

本发明实验应用的是GenBank数据库的序列：5'ucacaaugcugacacucaaacugcugaca3'，相当于SEQ ID NO.10。另外，根据微小RNA的背景知识，5'端序列对基因功能最重要，3'端序列重要性不比5'端序列。自此申请人认为，3'端不同的序列，和本项目应用的序列，具有相同的抑癌功能。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明研究发现，非编码基因piR_002158(DQ572892)在乳腺癌组织中表达缺失。将外源性piR_002158(DQ572892)转染到乳腺癌细胞MDA-MB-231，显著抑制了乳腺癌细胞的增殖能力、迁移能力。稳定表达piR_002158的乳腺癌细胞MDA-MB-231移植到免疫缺陷小鼠乳腺脂肪垫位置，可显著抑制乳腺肿瘤的生长。可见，体外及体内实验均证明piR_002158具有抗乳腺癌功能，有潜力用于乳腺癌的生物治疗。

附图说明

图1显示了piR_002158(DQ572892)在临床患者乳腺癌标本中表达缺失。

图2显示了piR_002158(DQ572892)在MMTV-wnt及MMTV-PyMT转基因小鼠自发乳腺肿瘤组织中表达降低。

图3显示了piR_002158(DQ572892)转染到MDA-MB-231乳腺癌细胞。

图4显示了piR_002158(DQ572892)显著抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖。

图5显示了piR_002158(DQ572892)显著抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移。

图6显示了piR_002158(DQ572892)稳定转染到MDA-MB-231乳腺癌细胞。(A：稳定过表达piR_002158(DQ572892)MDA-MB-231细胞白光图，B：稳定过表达piR_002158(DQ572892)MDA-MB-231细胞绿色荧光图。备注：piR_002158表达载体携带绿色荧光)

图7显示了piR_002158(DQ572892)在小鼠体内抑制乳腺肿瘤生长。(左侧：piR_002158高表达癌细胞移植后成瘤，右侧：对照癌细胞移植后成瘤)。

图8显示了piR_002158(DQ572892)和对照组小鼠肿瘤质量比较。

具体实施方式

实施例1

1、实验方法及步骤

1)人乳腺肿瘤组织RNA抽提

(1)在高温高压灭菌后的研钵中加入液氮，取50-100mg患者乳腺肿瘤组织及癌旁正常组织标本剪成小块，在液氮中速冻并充分研磨成粉。用液氮预冷的药匙将50-100mg组织粉末加入已盛有1mL Trizol液体的RNase-free 2mL离心管中(组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10％，避免DNA污染)，再次用电动研磨机进行研磨2min。室温静置5min。

(2)在每毫升Trizol中加入200uL氯仿，剧烈震荡15s以充分混匀样品。

(3)冰上静置15min，至上下分层清晰；4℃，12000g，离心15min。

(4)小心取上清(避免吸到中间层)，加入等体积(约500uL)异丙醇，轻柔上下颠倒均匀，冰上静置15-20min。

(5)4℃，12000g，离心15min。

(6)倾倒上清，用枪头吸出壁上剩余液体。

(7)加入1mL 75％的预冷乙醇；7500g，4℃，离心10min。

(8)弃去上清，重复步骤(7)2次。

(9)室温静置5-10min，至沉淀半透明状。

(10)加入10-30μL DEPC-H2O，冰上静置溶解30min至沉淀彻底溶解。

(11)以无RNase-free水作空白对照，用NanoDrop2000超微量分光光度计检测RNAOD 260/280，OD260/230值。确定RNA的浓度和质量。-80℃储存备用。

2)piRNA定量检测

(1)利用市售miRNA反转录(Clontech，638315)及实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒(Clontech，638316)，检测piRNA表达。

(2)hsa_piR_002158(DQ572892)检测用上游引物序列：5’tcacaatgctgacactcaaac3’

2、实验结果

如图1所示，与癌旁正常组织相比，piR_002158(DQ572892)在乳腺肿瘤组织中显著低表达(检测引物可涵盖检测到SEQ ID NO.8-13的所有序列)。

实施例2

1、实验方法及步骤

MMTV-wnt及MMTV-PyMT转基因小鼠(美国Jackson Lab)，小鼠乳腺肿瘤组织RNA抽提及piRNA定量检测方法及步骤同实施例1

2、实验结果

如图2所示，与正常乳腺组织相比，piR_002158(DQ572892)在MMTV-wnt及MMTV-PyMT转基因小鼠乳腺肿瘤组织显著低表达。(检测引物可涵盖检测到SEQ ID NO.8-13的所有序列)

实施例3

1、实验方法及步骤

1)piRNA-mimic和对照转染

(1)对数期生长的MDA-MB-231乳腺癌细胞(ATCC)以1×10⁵个细胞铺于6孔板，培养24小时后进行转染，转染时细胞融合度为50-60％。

(2)以单个培养孔为例：用100μL Opti-MEM稀释60pmol hsa_piR_002158(DQ572892)mimic(序列：5’UCACAAUGCUGACACUCAAACUGCUGACA 3’)或者阴性对照，颠倒混匀数次，室温下静置5min。

(3)稀释混合液中加入12μL HiPerFect转染试剂轻轻颠倒混匀，室温静置15min。

(4)转染复合物滴加至6孔培养板中，100μL/孔，前后上下轻摇混合均匀。

(5)将细胞板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，转染6小时后更换新鲜培养基。

(6)转染24小时后用于后续实验。

2)细胞RNA抽提及piRNA定量检测方法及步骤同实施例1

2、实验结果

如图3所示，qPCR结果显示piR_002158(DQ572892)成功转染到MDA-MB-231乳腺癌细胞，piR_002158(DQ572892)在实验组表达量相比对照组显著上调。(检测引物可涵盖检测到SEQ ID NO.8-13的所有序列)

实施例4

1、实验方法及步骤

1)piRNA-mimic和阴性对照转染方法及步骤见实例3

2)细胞增殖能力检测(MTT)

(1)生长状态良好的乳腺癌细胞MDA-MB-231转染hsa_piR_002158(DQ572892)mimic/阴性对照24小时后，消化细胞，并计数。

(2)调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞密度为3000个细胞/孔，共铺3个96孔板(0h、24h、48h、72h)。

(3)常规细胞培养贴壁后测定0小时细胞活性，每孔中加入10μL 0.5％MTT溶液(5mg/ml)，空白对照组不加MTT。

(4)5％CO₂，37℃细胞培养箱内孵育3h。

(5)终止培养，小心吸弃孔内培养液。

(6)每孔加入80μL盐酸-异丙醇，轻拍孔板，使其溶解，避光放置于摇床上，室温240speed/min摇荡10min，使结晶物充分溶解。

(7)设置好调零孔，对照孔后在酶联免疫检测仪OD570nm波长处测量各孔吸光值。

2、实验结果

如图4所示，piR_002158(DQ572892)显著抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖。(本实验应用的是GenBank数据库的序列：5'ucacaaugcugacacucaaacugcugaca 3'，相当于SEQID NO.10)

实施例5

1、实验方法及步骤

1)piR_002158(DQ572892)-mimic(序列：5’UCACAAUGCUGACACUCAAACUGCUGACA 3’，相当于SEQ ID NO.10)和阴性对照转染方法及步骤见实例3

2)MDA-MB-231乳腺癌细胞划痕实验检测细胞迁移能力

(1)细胞转染24h后，用含0.2％FBS DMEM培养基饥饿细胞18h。

(2)饥饿18h后，把细胞从培养箱取出，在超净台操作，定位划痕，用电动移液枪移除培养基，并用PBS轻柔清洗两边，将漂浮细胞悉数除去。

(3)以划痕时为0h，分别在0h、24h、48h拍照。

(4)计算细胞相对迁移距离。

2、实验结果

如图5所示，piR_002158(DQ572892)显著抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移。

实施例6

1、实验方法及步骤

1)构建稳定过表达hsa_piR_002158(DQ572892)的细胞系

(1)从GenePharma公司构建稳定表达hsa_piR_002158(DQ572892)(序列：5’UCACAAUGCUGACACUCAAACUGCUGACA 3’，相当于SEQ ID NO.10)的慢病毒载体LV3(H1/GFP&Puro)-hsa_piR_002158(DQ572892)及空载体对照。

(2)利用293T工具细胞包装病毒，感染乳腺癌细胞MDA-MB-231，通过绿色荧光筛选、分离、培养，制备稳定过表达hsa_piR_002158(DQ572892)的MDA-MB-231细胞株。

(3)通过上述实时荧光定量PCR方法，验证hsa_piR_002158(DQ572892)的表达。

2、实验结果

如图6所示，A图为MDA-MB-231细胞白光图，B图为MDA-MB-231细胞荧光图。图片显示稳定过表达piR_002158(DQ572892)MDA-MB-231细胞株绿色荧光率大于90％，表明成功构建稳定过表达piR_002158(DQ572892)MDA-MB-231细胞。

实施例7

1、实验方法及步骤

1)制备乳腺癌荷瘤动物模型：从上海斯莱克实验动物公司购置6周龄免疫缺陷型雌性裸小鼠。在免疫缺陷小鼠的第四对乳腺脂肪垫皮下注射5×10⁵个以上乳腺癌细胞，制备乳腺癌模型(n＝11)。为减小个体差异，每只小鼠右侧注射MDA-MB-231阴性对照细胞(转染空载体)，左侧注射稳定过表达piR_002158(DQ572892)的MDA-MB-231细胞。

2)肿瘤生长记录及后续分析：一周后开始每天观察，记录小鼠健康、饮食、肿瘤起始准确日期，用游标卡尺隔日测量肿瘤大小，连续观察和记录4周，绘制肿瘤生长曲线。最后处死小鼠，解剖收集肿瘤组织。测量肿瘤体积和重量，并提取蛋白、RNA以及甲醛固定。以备后续分析。

2、实验结果

如图7所示，每只免疫缺陷小鼠左侧注射稳定过表达piR_002158(DQ572892)(SEQID NO.10)的MDA-MB-231细胞，肿瘤明显小于右侧对照细胞生长的肿瘤。

如图8所示，piR_002158(DQ572892)(SEQ ID NO.10)组小鼠肿瘤质量显著低于对照组。

图7、图8结果证实piR_002158(DQ572892)(SEQ ID NO.10)显著抑制小鼠体内乳腺肿瘤的生长。

序列表

<110> 上海市东方医院(同济大学附属东方医院）

<120> 一种非编码小RNA基因、载体和细胞在制备抑制乳腺癌的药物中的用途

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcacaatgct gacactcaaa ctgctgacag c 31

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcacaatgct gacactcaaa ctgctgacag 30

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcacaatgct gacactcaaa ctgctgaca 29

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcacaatgct gacactcaaa ctgctgac 28

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcacaatgct gacactcaaa ctgctga 27

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcacaatgct gacactcaaa ctgctg 26

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcacaatgct gacactcaaa c 21

<210> 8

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ucacaaugcu gacacucaaa cugcugacag c 31

<210> 9

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ucacaaugcu gacacucaaa cugcugacag 30

<210> 10

<211> 29

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ucacaaugcu gacacucaaa cugcugaca 29

<210> 11

<211> 28

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ucacaaugcu gacacucaaa cugcugac 28

<210> 12

<211> 27

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ucacaaugcu gacacucaaa cugcuga 27

<210> 13

<211> 26

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ucacaaugcu gacacucaaa cugcug 26

Claims

1.一种非编码小RNA基因在制备抑制乳腺癌的药物中的用途，所述的非编码小RNA基因的基因序列如SEQ ID NO.8-13中任一序列所示。

2.一种载体在制备抑制乳腺癌的药物中的用途，其特征在于：所述的载体含有一段基因，所述的基因的序列如SEQ ID NO.1-6中任一序列所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的载体为质粒。

4.一种细胞在制备抑制乳腺癌的药物中的用途，其特征在于：所述的细胞含有一段基因，所述的基因的序列如SEQ ID NO.1-6中任一序列所示。