CN108997488B

CN108997488B - 具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质及其制法与应用

Info

Publication number: CN108997488B
Application number: CN201810921044.6A
Authority: CN
Inventors: 王贤纯; 徐德宏
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2018-08-14
Filing date: 2018-08-14
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2038-08-14
Also published as: CN108997488A

Abstract

本发明提供一种具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质及其制备方法与应用，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其分子量为10172.2 Da。该蛋白质可通过从间斑寇蛛卵粒转录组中获得编码基因，然后利用大肠杆菌异源表达制备。该蛋白质能特异性作用于人乳腺癌细胞系MDA‑MB‑231细胞，抑制MDA‑MB‑231细胞增殖和转移，并诱导其凋亡，从而实现抗乳腺癌的作用，能应用于制备抑制MDA‑MB‑231细胞生长的药物、作为前体分子制备治疗乳腺癌的药物以及与其他抗肿瘤药物联用制备治疗乳腺癌的药物。具有抗乳腺癌活性的蛋白质可以从多个方面抑制乳腺癌细胞，从而不仅可以作为治疗乳腺癌药物开发的前体分子，而且可在肿瘤发生、发展机理等相关研究中发挥作用，显示出有价值的应用前景。

Description

具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质及其制法与应用

技术领域

本发明涉及一种具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质及其制备方法与应用，尤其涉及一种能抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞增殖和转移、诱导其凋亡的间斑寇蛛卵粒蛋白质及其制备方法与应用。

背景技术

女性乳腺癌是世界上普遍发生的恶性癌症之一，患病风险一般随着年龄的增加而增加，严重威胁女性的身体健康乃至生命安全。乳腺癌的发病率正在增长，这与寿命增长，城市化水平增加和西方生活方式的广泛采纳等均有关。在中国，乳腺癌发病率在11.61/10万人，其发病率是相对较高的。同时因为乳腺癌的准确筛查诊断、干预和有效治疗方案，使乳腺癌患者生存率逐渐增加，死亡率也在逐步下降。目前，治疗乳腺癌的方法主要包括手术治疗、放疗和化疗等。

目前，用化疗法治疗乳腺癌的主要问题是现有化疗小分子治疗药物特异性不强，因而其副作用大，病人遭受许多不必要的痛苦；此外，传统的小分子治癌药物还易产生耐药性，随着用药时间的延长，药效下降，用药量增加。因此，发现和研制作用特异性强、能定向作用于癌细胞的治癌药物是目前相关领域的研究热点。能产生抗癌活性蛋白质和多肽的有毒动物为新型抗癌药物的筛选提供了丰富的资源。与传统的小分子治癌药物相比，蛋白质类治癌药物具有作用靶细胞明确、特异性强和不易产生耐药性等优点。

在已公开的有关抗乳腺癌蛋白的报道中：

CN105194646A公开一种虾蛄多肽在抗乳腺癌中的应用，尤其涉及虾蛄多肽在抑制乳腺癌SKBR-3细胞增殖药物中的应用。

CN104784677A公开蜂毒肽在制备抑制乳腺癌细胞侵润转移药物中的应用，具体的，所述蜂毒肽可阻断CD147和MMP9表达，从而抑制MCF-7细胞的浸润和转移。

CN104418952B公开一类双特异性抗体，为包含Trastuzumab和Pertuzumab的抗原结合区的抗体蛋白，可特异性与ErbB2分子细胞外II区和IV区结合，并且具有显著体外和体内抗乳腺癌的作用。

本发明拟提供一种从间斑寇蛛卵粒中发现的一种新的具有抗乳腺癌活性的蛋白质，目前暂未见有关间斑寇蛛卵粒中具有抗乳腺癌活性蛋白质的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从间斑寇蛛卵粒中发现的，能特异性作用于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞，抑制其增殖和转移，且能诱导其凋亡的具有抗乳腺癌活性的蛋白质。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其分子量为10172.2Da。

SEQ ID NO：1如下：(由91个氨基酸组成)

SQAGEWGSGAGKGGGSGGSVRDAGGSFGKMEAAREEEYFRKQQKEQLKALKSHLHEEIDHHEEEIERLQEEIKRHKKKISDLAKEEKKIDG

进一步地，

编码上述氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

SEQ ID NO：2如下：(由336个碱基对组成)

上述编码基因的核苷酸序列中：64-336个碱基对为成熟肽编码区。

对于活性蛋白质和多肽来说，与其活性或生物学功能直接相关的往往只是分子中的一部分。所以，在非功能区进行一些改变往往不会改变分子的活性。

因此本发明还提供上述具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质，在其如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且仍具有抗乳腺癌活性的衍生蛋白质。

本发明还提供上述具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质的制备方法，具体是从间斑寇蛛卵粒转录组中获得编码基因，编码基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，然后利用大肠杆菌异源表达获得氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质。

由于上述具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质能特异性作用于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞，抑制MDA-MB-231细胞增殖和转移，并诱导其凋亡，从而实现抗乳腺癌的作用。

本发明还提供上述具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质在制备抑制乳腺癌细胞生长的药物中的应用。尤其是在制备抑制MDA-MB-231细胞生长的药物中的应用。

上述具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质作为前体分子在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

上述具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质上述具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质与其他抗肿瘤药物联用在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

上述具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质在制备乳腺癌发生、发展机制研究的工具试剂中的应用。

上述方案中：

1、MDA-MB-231取自人乳腺肿瘤患者的胸腔积液，为上皮样细胞，该细胞系为ER-，PR-，HER2-三重阴性，具备EGF，TGF-a和WNT7B癌基因的表达能力；在使用ALS处理过的BALB/c小鼠和裸鼠体内均可形成分化程度较低(III级)的腺癌；对化疗具有中等响应。

2、间斑寇蛛(Latrodectus tredecimguttatus)(俗称“黑寡妇”蜘蛛)。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次从间斑寇蛛卵粒中发现一种能抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞增殖和转移，并能诱导其凋亡的新蛋白质。所以，该蛋白能从抑制乳腺癌细胞增殖和迁移，以及诱导其凋亡等多个方面发挥治疗乳腺癌的作用。

(2)本发明从间斑寇蛛卵粒转录组中选取一个基因序列，经克隆和异源表达得到一种分子量为10172.2Da的蛋白质。该蛋白对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞活力(增殖)的抑制性影响显著大于对非癌HEK293细胞的影响，证明该蛋白对乳腺癌细胞的抑制作用具有选择性。该蛋白可以从多个方面抑制乳腺癌细胞，从而不仅可以作为治疗乳腺癌药物开发的前体分子，而且可在肿瘤发生、发展机理等相关研究中发挥作用，显示出有价值的应用前景。与传统的小分子治癌药物相比，以这种蛋白质为前体分子开发的蛋白质类治癌药物具有作用靶标明确、作用特异性强和不易产生耐药性等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明抗乳腺癌蛋白基因克隆的重组质粒图谱(图中具有抗乳腺癌活性的蛋白命名为Latroeggtoxin-V)；

图2为图1中表达载体的鉴定(A)和诱导表达效果(B)的SDS-PAGE检测图；

图3为本发明抗乳腺癌蛋白融合蛋白经肠激酶酶切后的RP-HPLC分离图(图中第二个主要峰为目的峰)；

图4为对本发明抗乳腺癌蛋白质的质谱法分子量测定图谱；

图5为本发明抗乳腺癌蛋白质对MDA-MB-231细胞增殖、HEK293细胞的抑制作用比较；(图中：relative cell viability指细胞相对活力)

图6a为Hoechst 33258染色观察本发明抗乳腺癌蛋白质诱导MDA-MB-231细胞凋亡的效果，其中箭头所指为凋亡细胞；图6b为对照组(未经处理的MDA-MB-231细胞)的情况；

图7a为采用细胞划痕实验观察不同浓度的抗乳腺癌蛋白处理后的MDA-MB-231细胞的迁移；

图7b为不同浓度的抗乳腺癌蛋白处理后的MDA-MB-231细胞的迁移距离(图中：migration distance指迁移距离)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对发明进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

由于间斑寇蛛卵粒来源有限，该抗乳腺癌活性蛋白在卵粒中的含量不高，所以难以直接从卵粒中提取制备样品，本发明实施例通过大肠杆菌异源表达的方式制备样品。

1、抗乳腺癌蛋白编码基因的克隆和异源表达

(1)首先，通过对间斑寇蛛卵粒的转录组分析，得到一系列可能编码活性蛋白质和多肽的开放阅读框(ORF)。根据生物信息学分析结果，我们选择其中一个ORF进行基因的克隆和异源表达，选取编码基因的核苷酸序列如下：

上述编码基因的核苷酸序列由336个碱基对组成，其中：64-336个碱基对为成熟肽编码区。

异源表达得到的蛋白质的氨基酸序列如下SEQ ID NO：1所示：

(2)采用大肠杆菌异源表达制备抗乳腺癌蛋白样品

利用Trizol试剂提取间斑寇蛛卵粒中的RNA，反转录生成cDNA后作为PCR扩增抗乳腺癌蛋白基因的模板。根据卵粒转录组中获取的该基因的核苷酸序列，设计合成上游引物和下游引物。反应条件为：94℃，3min；然后30个循环，每个循环包括：(1)变性，条件为：94℃，30s；(2)退火，条件为：55℃，30s；(3)延长，条件为：72℃，2min；(4)最后延长，条件为：72℃，5min。

上游引物F，CATGGGATCCGACGACGACGACAAGTCTCAGGCTGGTGAATGGGGTTCTG

下游引物R，CCGCTCGAGTTAACCGTCGATTTTTTTTTCTTCTTTAGC

PCR产物经凝胶电泳纯化回收后连接入pMD19-T载体，培养后挑选菌落PCR阳性及测序正确的菌落，从挑选的菌落中提取质粒与表达载体pET-28a连接。双酶切及凝胶电泳证明连接正确后，用重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)。37℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8后，按终浓度0.25m mol/L添加IPTG，诱导表达5h。然后取样用SDS-PAGE检测抗乳腺癌蛋白的诱导表达效果。实验结果表明，表达载体构建正确；在大肠杆菌中诱导表达成功，如图1、图2所示。

1)Trizol试剂：是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。

2)RNA：Ribonucleic acid的缩写，译称核糖核酸，是存在于细胞生物的遗传讯息中间载体，并参与蛋白质合成，还参与基因表达调控。

3)cDNA：complementary DNA，是一种互补脱氧核糖核酸。

4)PCR：Polymerase Chain Reaction，简称PCR，聚合酶链式反应，又称多聚酶链式反应。

5)pMD19-T载体：一种高效克隆PCR产物的专用载体。

6)表达载体pET-28a：一种表达载体。

7)大肠杆菌BL21(DE3)：一种大肠杆菌。

8)SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE)，是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。

9)IPTG：Isopropylβ-D-Thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷，一种作用极强的诱导剂。

10)OD₆₀₀：某种溶液在600nm波长处的吸光值。

2、抗乳腺癌蛋白的纯化与分子量测定

离心收集培养的大肠杆菌细胞，超声破碎后10 000转离心30min，收集上清液。为了分离上清液中的抗乳腺癌蛋白融合蛋白，先让上清液通过nickel-NTA琼脂糖亲和柱，充分洗涤去除非特异结合的杂蛋白后，用0.25mol/L咪唑溶液将抗乳腺癌蛋白融合蛋白洗脱。为了去掉融合蛋白中的亲和标签，将得到的融合蛋白用肠激酶酶切，然后用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离酶解产物，从而得到纯化的重组抗乳腺癌蛋白。RP-HPLC分离时利用C18反相柱(4.6mm×250mm，颗粒直径5μm。酶解产物用线性梯度洗脱：含0.1％三氟乙酸的乙腈的浓度40min内由0％升至70％；流速为1.0mL/min。分别收集主要的洗脱峰，用电喷雾质谱仪测定各洗脱峰成分的分子量，从而确定含有重组抗乳腺癌蛋白的洗脱峰，如图3所示，图中第二个主要峰为目的峰。

如图4所示，电喷雾质谱分析时，重组抗乳腺癌蛋白形成带7-17个电荷的多电荷峰。据此可以计算出该蛋白的分子量为10 172.2Da，与理论值相符，提示该蛋白的基因克隆和异源表达成功。

3、抗乳腺癌蛋白对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞活力的影响

以人胚胎肾293(HEK293)细胞(非癌细胞)为对照，检测不同浓度(0，20，40，60，80μM)的抗乳腺癌蛋白对培养的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞活力的影响。

如图5所示，结果表明，抗乳腺癌蛋白能以剂量依赖的方式抑制MDA-MB-231细胞的活力，提示该蛋白能抑制MDA-MB-231细胞的增殖。对比分析发现，抗乳腺癌蛋白对MDA-MB-231细胞活力的抑制作用极显著高于对HEK293的抑制作用，如图5中显示：与非癌HEK293细胞比较*P<0.05；**P<0.01，说明抗乳腺癌蛋白对癌细胞的影响具有特异性。

4、测定抗乳腺癌蛋白诱导乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞凋亡的活性

用0μM(对照组)和40μM的抗乳腺癌蛋白分别处理培养的MDA-MB-231细胞48h后，利用HOECHST 33258染色的策略观察细胞的凋亡特征。

结果表明(如图6a、6b所示)，与对照组相比，40μM抗乳腺癌蛋白处理导致部分MDA-MB-231细胞出现典型的凋亡特征，如核固缩等，图6a中箭头所指为凋亡细胞。

5、测定抗乳腺癌蛋白对MDA-MB-231细胞迁移的抑制作用

利用细胞划痕实验(wound-healing assay)观察抗乳腺癌蛋白对MDA-MB-231细胞迁移的抑制作用。用不同浓度(0，20，40，80μM)的抗乳腺癌蛋白处理MDA-MB-231细胞(培养24h)后，观察MDA-MB-231细胞的迁移。

如图7a、7b所示，结果表明，抗乳腺癌蛋白能以浓度依赖的方式(浓度越高，迁移距离越短)，极显著地抑制MDA-MB-231细胞的迁移，缩短细胞的迁移距离。

重组抗乳腺癌蛋白在图中命名为rLatrseggtocin-V。与对照组(0μM，即未经抗乳腺癌蛋白处理)比较**P<0.01。

结论分析：

1、本发明从间斑寇蛛卵粒转录组中选取一个基因序列，经克隆和异源表达得到一种分子量为10172.2Da的蛋白质。本发明已鉴定出该蛋白质的编码基因全序列和氨基酸序列，有利于该蛋白质的利用和结构-功能改造等。

2、经实验验证：本发明首次从间斑寇蛛卵粒中得到的这种蛋白质，能抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞增殖和转移，并能诱导其凋亡。所以，该蛋白能从抑制乳腺癌细胞增殖和迁移，以及诱导其凋亡等多个方面发挥治疗乳腺癌的作用。此外，该蛋白对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞活力(增殖)的抑制性影响显著大于对非癌HEK293细胞的影响，证明该蛋白对乳腺癌细胞的抑制作用具有选择性。因此，本发明提供的抗乳腺癌蛋白不仅可以作为治疗乳腺癌药物开发的前体分子，而且可在乳腺癌肿瘤发生、发展机理等相关研究中发挥作用，显示出有价值的应用前景。与传统的小分子治癌药物相比，以这种蛋白质为前体分子开发的蛋白质类治癌药物具有作用靶标明确、作用特异性强和不易产生耐药性等优点。

3、由于间斑寇蛛卵粒来源有限，该抗乳腺癌活性蛋白在卵粒中的含量不高，所以难以直接从卵粒中提取制备样品。本发明提供大肠杆菌异源表达的方式制备样品，可规模化制备样品，为进一步的研究和药物开发提供充足的原料(前体)。

但理论上也可以采用其他方式制备样品，如直接从卵粒提取，或用其他表达系统(如酵母表达系统)异源表达制备样品。

4、该抗乳腺癌活性蛋白的分子量约1万。可以推测，该蛋白分子中与活性直接有关的序列可能只占分子的一(小)部分，即部分结构“功能片段”。到目前为止，我们还未鉴定出该蛋白质的“功能片段”。可以对该蛋白进行结构修饰、突变改造，然后再开发利用。该蛋白可能还有其他方面的用途。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质及其制法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 91

<212> PRT

<213> 间斑寇蛛（Latrodectus tredecimguttatus）(2 Ambystoma laterale xAmbystoma jeffersonianum)

<400> 1

Ser Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ala Gly Leu Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Ser Val Ala Ala Ala Gly Gly Ser Pro Gly Leu Met Gly Ala

20 25 30

Ala Ala Gly Gly Gly Thr Pro Ala Leu Gly Gly Leu Gly Gly Leu Leu

35 40 45

Ala Leu Leu Ser His Leu His Gly Gly Ile Ala His His Gly Gly Gly

50 55 60

Ile Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ile Leu Ala His Leu Leu Leu Ile Ser

65 70 75 80

Ala Leu Ala Leu Gly Gly Leu Leu Ile Ala Gly

85 90

<210> 2

<211> 336

<212> DNA

<400> 2

atgtttcgaa ttgcgcgtct tcgaggagca tctgtaatgt tttcatcatt ccgctgtaat 60

ggttctcaag caggtgaatg gggtagcggt gctggaaagg gtggaggatc tggtggatct 120

gtaagagatg ctggtggcag ttttggtaag atggaggctg cacgagaaga agagtatttt 180

agaaaacaac aaaaggaaca acttaaagca ttgaaaagcc atttgcatga agaaattgat 240

caccatgaag aagagattga gaggttgcag gaagaaatta agaggcataa gaaaaagatt 300

tctgacttag ctaaagaaga gaagaaaatt gatgga 336

Claims

1.一种具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO：1所示，其分子量为10172.2 Da。

2.一种编码如权利要求1所述的具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质的基因，其特征在于，编码所述氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质的基因的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

3.具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质的制备方法，其特征在于，具体是从间斑寇蛛卵粒转录组中获得编码基因，编码基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，然后利用大肠杆菌异源表达获得氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质。

4.氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质在制备抑制乳腺癌细胞生长的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体是指所述具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质在制备抑制MDA-MB-231细胞生长的药物中的应用。

6.氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质作为前体分子在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

7.氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的具有抗乳腺癌活性的间斑寇蛛卵粒蛋白质与其他抗肿瘤药物联用在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。