CN116790616B - 编码sCXCL16的基因及表达载体、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种编码sCXCL16的基因及表达载体、制备方法和应用，涉及基因重组技术领域。该基因包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，可用于构建sCXCL16的表达载体，进而表达得到高纯度可溶型趋化因子sCXCL16。
Description
技术领域
本发明涉及基因重组技术领域，特别是涉及编码sCXCL16的基因及表达载体、制备方法和应用。
背景技术
肿瘤严重危害人民健康，但尚缺乏有效的治疗方式。而趋化因子作为细胞因子家族中一个重要分支，与受体结合后能激发细胞内信号传导，介导一系列细胞生物反应，与炎症反应、免疫防御、血管生成等重要的机体功能密切相关。
有研究表明可溶型趋化因子sCXCL16在多种恶性肿瘤中呈现高表达，与肿瘤细胞的增殖、凋亡、肿瘤血管生成、预后等均有密切关系，sCXCL16与受体CXCR6结合后，可通过受体G蛋白的结构变化激活微环境下的信号通路，进而发挥相应的生理病理功能，如影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、肿瘤血管生成、预后等，有重要的研究价值。
高纯度的可溶型趋化因子sCXCL16用途广泛，包括但不限于：(1)通过外源添加重组蛋白sCXCL16研究CXCL16-CXCR6趋化因子轴在肿瘤中的相关机制；(2)探寻与sCXCL16相关的肿瘤细胞因子、趋化因子等在肿瘤微环境中角色；(3)为sCXCL16蛋白结构测定提供实验基础；(4)稳定其唯一受体G蛋白偶受体CXCR6结构，为CXCR6的蛋白结晶及结构测定提供基础；(5)为以CXCL16-CXCR6为靶点的抗肿瘤相关药物提供实验基础。
正因此，趋化因子CXCL16在炎症性疾病和肿瘤中的角色日益受到关注，以sCXCL16为靶点的抗肿瘤靶向药物开发具有潜在重要意义，然而目前暂时还没有能够简单有效制备得到高纯度可溶型趋化因子sCXCL16的方法。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种编码sCXCL16的基因，该基因可用于构建sCXCL16的表达载体，进而表达得到高纯度可溶型趋化因子sCXCL16。
为了达到上述目的，本发明提供了一种编码sCXCL16的基因，包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
本发明人在研究过程中发现，人-CXCL16蛋白由254个氨基酸组成，具有跨膜型(TM-CXCL16)和可溶型(sCXCL16)两种存在形式，TM-CXCL16为非分泌型蛋白，sCXCL16为分泌型蛋白。前期研究发现，解整合素金属蛋白酶10和17(Adisintegrin andmetalloproteinase，ADAM 10、ADAM17)可以促进非分泌型的TM-SCXCL16胞外域发生脱落，从而成为分泌型的sCXCL16，这两种不同存在形式的蛋白在肿瘤中的功能不尽相同，TM-CXCL16可在肿瘤附近趋化免疫细胞及清除细菌，而sCXCL16可促进部分肿瘤细胞的增殖和迁徙，因此，这两种形式的CXCL16的结构、功能及机制应当被区别研究。而本发明人旨在制备得到的是sCXCL16，经过大量的序列对比实验，本发明人发现非可溶型TM-CXCL16上的N59-P137片段为分泌型sCXCL16，进而得到上述基因的核苷酸序列，该核苷酸序列能够编码得到sCXCL16。
在其中一个实施例中，所述编码sCXCL16的基因选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
本发明还提供了一种sCXCL16的表达载体，包括所述基因。
在其中一个实施例中，所述表达载体的初始载体为pRSETA0质粒。
本发明人经过大量实验，分别尝试了以pENTER，pFastBac1，pTH101，pACT等多种载体为初始载体进行表达，但最终只有pRSETA0表达成功。
在其中一个实施例中，所述表达载体如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
本发明还提供了一种表达菌株，包括所述表达载体。
本发明还提供了一种sCXCL16的制备方法，包括以下步骤：培养所述表达菌株，加入诱导剂，诱导表达，得到菌液，离心，得到sCXCL16。
本发明人通过实验发现，当表达载体如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示时，均能表达得到目标蛋白sCXCL16。
在其中一个实施例中，所述表达菌株含有如SEQ ID NO:5所示的表达载体；所述培养的温度为35-40℃；所述诱导剂为ITPG，所述诱导剂的工作浓度为0.8-1.2mM。
本发明人通过Western Blot实验发现，当表达载体如SEQ ID NO:4时，表达得到的目标蛋白与Western Blot中的抗体结合不佳，其原因可能是因为受到N-端6×His标签结构的干扰导致结合效果较差。而当表达载体如SEQ ID NO:5时，表达得到的目标蛋白与Western Blot中的抗体结合效果较好。
同时，本发明人还通过大量筛选实验发现，采用上述温度进行培养，采用上述浓度的诱导剂进行诱导，目标蛋白的表达效果更优。
在其中一个实施例中，所述制备方法还包括离心步骤后的纯化，所述纯化包括以下步骤：菌液离心后，收集沉淀，超声破碎，离心，取上清液，进行亲和层析，洗脱，得到sCXCL16。
在其中一个实施例中，所述洗脱步骤的洗脱液包括工作浓度为35-45mM的咪唑和/或工作浓度为280-320mM的咪唑。
所述工作浓度为上述成分在使用时能够达到预期效果的浓度，可以理解的，本领域技术人员在配制上述洗脱液时，可以配制浓度更高的母液或者储备液，待使用时再稀释，所述母液或者储备液及其浓度均在本发明的保护范围之内。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的编码sCXCL16的基因及表达载体、制备方法和应用，该编码sCXCL16的基因可用于构建sCXCL16的表达载体，进而表达得到高纯度可溶型趋化因子sCXCL16。通过该表达载体能够获得高蛋白表达量的sCXCL16，且因携带了6×His标签，更易于纯化操作。
附图说明
图1为实施例中pRSETA0-6xHisTEV-sCXCL16的结构示意图；
图2为实施例中pRSETA0-sCXCL16-6xHis的结构示意图；
图3为实施例中pRSETA0质粒的结构示意图；
图4为实施例中pFASTBac1载体-sCXCL16-6xHis的结构示意图；
图5为实施例中利用pFastBac1载体未见显著的sCXCL16表达的结果图；
图6为实施例中sCXCL16-C在20℃、200rpm条件下利用大肠杆菌表达sCXCL16-C后，菌体中表达位置的鉴定结果图，其中，电泳槽M：蛋白标记；电泳槽A：A组(未经处理的菌液)；电泳槽B：B组(离心后的菌液上清)；电泳槽C：C组(经过超声破碎后菌液沉淀；红色箭头指向sCXCL16-C；
图7为实施例中12％ SDS-PAGE显示IPTG对sCXCL16-N和sCXCL16-C的诱导表达结果，其中，电泳槽M为蛋白标记；电泳槽1-4为sCXCL16-N的表达结果；电泳槽5-8为sCXCL16-C的表达结果；减号为未加入IPTG的非诱导表达组，加号按从左至右的顺序为分别加入了0.5，1.0，2.0mM IPTG的诱导表达组；红色箭头指向sCXCL16-N及sCXCL16-C的表达；
图8为实施例中Western Blot显示IPTG对sCXCL16-N和sCXCL16-C的诱导表达结果图，其中，电泳槽M为蛋白标记；电泳槽1-4为sCXCL16-N的表达结果；电泳槽5-8为sCXCL16-C的表达结果；减号为未加入IPTG的非诱导表达组，加号按从左至右的顺序为分别加入了0.5，1.0，2.0mM IPTG的诱导表达组；红色箭头指向sCXCL16-N及sCXCL16-C的表达；
图9为实施例中12％ SDS-PAGE显示不同温度下sCXCL16-C的表达结果图，其中，电泳槽M：蛋白标记；电泳槽1-3：sCXCL16-C的表达结果，其中样本1未经过IPTG诱导，样本2-3经过1.0mM IPTG诱导；2为37℃培养条件下的表达结果，3为20℃培养条件下的表达结果，红色箭头指向sCXCL16-C的表达；
图10为实施例中Western Blot显示不同温度下sCXCL16-C的表达结果图，其中，电泳槽M：蛋白标记；电泳槽1-3：sCXCL16-C的表达结果，其中样本1未经过IPTG诱导，样本2-3经过1.0mM IPTG诱导；2为37℃培养条件下的表达结果，3为20℃培养条件下的表达结果，红色箭头指向sCXCL16-C的表达；
图11为实施例中蛋白质IMAC的纯化结果图，其中，左侧红色箭头指向利用40mM咪唑对IMAC柱进行清洗时出现的峰值，右侧红色箭头指向利用300mM的咪唑对IMAC柱进行洗脱时出现的峰值；
图12为实施例中12％ SDS-PAGE显示不同咪唑浓度对sCXCL16-C的洗脱结果图，其中，电泳槽M：蛋白标记；电泳槽1-3：利用300mM进行洗脱时所收集的样本，其中电泳槽2为洗脱时出现的高峰；电泳槽4-7：利用40mM进行洗脱时收集的样本，红色箭头指向sCXCL16-C。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
定义：
ITPG：指异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
实施例
一、获得sCXCL16序列。
本发明人经过大量序列对比，确定非可溶型TM-CXCL16上的N59-P137片段为分泌型sCXCL16，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示：NEGSVTGSCYCGKRISSDSPPSVQFMNRLRKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGGNKDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLP，共计89个氨基酸。
发明人针对上述氨基酸序列设计得到编码sCXCL16的基因，其核苷酸序列如下所示：GATCCATGAACGAGGGCAGCGTCACTGGAAGTTGTTATTGTGGTAAAAGAATTTCTTCCGACTCCCCGCCATCGGTTCAGTTCATGAATCGTCTCCGGAAACACCTGAGAGCTTACCATCGGTGTCTATACTACACGAGGTTCCAGCTCCTTTCCTGGAGCGTGTGTGGAGGCAACAAGGACCCATGGGTTCAGGAATTGATGAGCTGTCTTGATCTCAAAGAATGTGGACATGCTTACTCGGGGATTGTGGCCCACCAGAAGCATTTACTTCCTTGAG(SEQ ID NO:1)。
为了方便sCXCL16后续的蛋白纯化，本发明人在上述核苷酸序列SEQ ID NO:1的基础上，进一步设计了两个sCXCL16片段：一个为在N端添加了6×His(SEQ ID NO:7：CACCACCACCACCACCAC)标记以及TEV酶切位点(SEQ ID NO:8：GAGAACCTGTACTTCCAAGGC)的总长度为324bp的人源可溶型sCXCL16片段，如SEQ ID NO:2所示：
acattgGATCCATGcaccaccaccaccaccacGAGAACCTGTACTTCCAAGGCAACGAGGGCAGCGTCACTGGAAGTTGTTATTGTGGTAAAAGAATTTCTTCCGACTCCCCGCCATCGGTTCAGTTCATGAATCGTCTCCGGAAACACCTGAGAGCTTACCATCGGTGTCTATACTACACGAGGTTCCAGCTCCTTTCCTGGAGCGTGTGTGGAGGCAACAAGGACCCATGGGTTCAGGAATTGATGAGCTGTCTTGATCTCAAAGAATGTGGACATGCTTACTCGGGGATTGTGGCCCACCAGAAGCATTTACTTCCTTGAG；
上述SEQ ID NO:2所示序列中，下划线标记的序列为6×His，斜体标记的序列为TEV酶切位点。
另一个为在C端添加了6×His(SEQ ID NO:7：CACCACCACCACCACCAC)标记的总长度为303bp的人源可溶型sCXCL16片段，如SEQ ID NO:3所示：
acattgGATCCATGAACGAGGGCAGCGTCACTGGAAGTTGTTATTGTGGTAAAAGAATTTCTTCCGACTCCCCGCCATCGGTTCAGTTCATGAATCGTCTCCGGAAACACCTGAGAGCTTACCATCGGTGTCTATACTACACGAGGTTCCAGCTCCTTTCCTGGAGCGTGTGTGGAGGCAACAAGGACCCATGGGTTCAGGAATTGATGAGCTGTCTTGATCTCAAAGAATGTGGACATGCTTACTCGGGGATTGTGGCCCACCAGAAGCATTTACTTCCTcaccaccaccaccac cacTGAG。
上述SEQ ID NO:3所示序列中，下划线标记的序列为6×His。
本发明人之所以选择添加6×His(SEQ ID NO:7：CACCACCACCACCACCAC)作为蛋白纯化标签，是由于其使用便捷，特异性高，易于在镍柱上纯化蛋白，且分子量小，在测定蛋白功能时不易与蛋白的活性位点发生交互从而影响蛋白活性。而选择在N段添加TEV酶切位点(SEQ ID NO:8：GAGAACCTGTACTTCCAAGGC)的目的是通过分子对接，发现sCXCL16的在活性位点可能靠近N端，在极端情况下当6×His(SEQ ID NO:7：CACCACCACCACCACCAC)与sCXCL16蛋白活性位点发生冲突时可利用TEV酶切位点将6×His切除。SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示DNA片段均由广州维真生物有限公司合成。
二、pRSETA0-6×HisTEV-sCXCL16质粒构建。
设计引物如下：
5’-CGGGATCCATGCACCACCACCACCACCACGAGAACCTGTACTTCCAAGGCAACGAGGGCAGCGTCACTGGA-3’(SEQ ID NO:9)；
5’-GGAATTCTCAAGGAAGTAAATGCTTCTGGTGGGC-3’(SEQ ID NO:10)。
在N端添加了6xHis以及TEV酶切位点的总长度为324bp的人源可溶型sCXCL16片段用KAPAHiFiHotstartPCR聚合酶扩增，采用该聚合酶常规的扩增体系。所得片段纯化后用BamHI和EcoRI双酶切，然后插入用BamHI和EcoRI线性化后的pRSETA0质粒片段，所得的克隆产物即为pRSETA0-6xHisTEV-sCXCL16，简称sCXCL16-N，结构示意图如图1所示。
其全序列如下所示：
gatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacattgGATCCATGcaccaccaccaccaccacGAGAACCTGTACTTCCAAGGCAACGAGGGCAGCGTCACTGGAAGTTGTTATTGTGGTAAAAGAATTTCTTCCGACTCCCCGCCATCGGTTCAGTTCATGAATCGTCTCCGGAAACACCTGAGAGCTTACCATCGGTGTCTATACTACACGAGGTTCCAGCTCCTTTCCTGGAGCGTGTGTGGAGGCAACAAGGACCCATGGGTTCAGGAATTGATGAGCTGTCTTGATCTCAAAGAATGTGGACATGCTTACTCGGGGATTGTGGCCCACCAGAAGCATTTACTTCCTTGAGaattcgaagcttgatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcag(SEQ ID NO:4)。
三、pRSETA0-sCXCL16-6xHis质粒构建。
设计引物如下：
5’-CGGGATCCATGAACGAGGGCAGCGTCACTGGAAGT-3’(SEQ ID NO:11)；
5’-GGAATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGAAGTAAATGCTTCTGGTGGGC-3’(SEQ ID NO:12)。
在C端添加了6×His残基(SEQ ID NO:7：CACCACCACCACCACCAC)的总长度为303bp的人源可溶型sCXCL16片段用KAPA HiFiHotstartPCR聚合酶扩增。纯化所得片段，并利用BamHI和EcoRI进行双酶切，插入用BamHI和EcoRI线性化后的pRSETA0质粒片段，所得的克隆产物即为pRSETA0-sCXCL16-6xHis，简称sCXCL16-C，结构示意图如图2所示。
其全序列如下所示：
gatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacattgGATCCATGAACGAGGGCAGCGTCACTGGAAGTTGTTATTGTGGTAAAAGAATTTCTTCCGACTCCCCGCCATCGGTTCAGTTCATGAATCGTCTCCGGAAACACCTGAGAGCTTACCATCGGTGTCTATACTACACGAGGTTCCAGCTCCTTTCCTGGAGCGTGTGTGGAGGCAACAAGGACCCATGGGTTCAGGAATTGATGAGCTGTCTTGATCTCAAAGAATGTGGACATGCTTACTCGGGGATTGTGGCCCACCAGAAGCATTTACTTCCTcaccaccaccaccaccacTGAGaattcgaagcttgatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcag(SEQ ID NO:5)。
除pRSETA0质粒(结构示意图如图3所示)外，发明人也使用了pENTER，pFastBac1、pTH101、pACT等多种载体进行了表达，结果显示只有pRSETA0表达成功。例如当初始载体为pFastBac1时，构建得到质粒的结构示意图如图4所示，表达结果为阴性(如图5所示)。
四、sCXCL16的表达及鉴定。
1、sCXCL16表达位置鉴定。
为鉴定目标蛋白sCXCL16的表达位置，利用大肠杆菌在20℃、200rpm的条件下振荡扩培，对sCXCL16进行表达。由于sCXCL16-N及sCXCL16-C表达位置应一致，因此随机选取了sCXCL16-C进行表达位置鉴定。
表达后将样本分为三组分别进行处理：A组为收集表达后未经处理的菌液，B组为菌液经过离心(13000rpm，5min)后所收集的上清；C组为B组离心后所收集的沉淀菌体加了适量缓冲液后，利用迷你超声破碎机减少沉淀(超声功率为20％，超声2.5s，暂停4.0s)后的样本。将上述样本上样于Western Blot以鉴定目标蛋白为可溶性还是包含体。
Westernblot结果如图6所示，A组及B组未呈现条带；而C组于10-15kDa区域显示有蛋白条带，位置与sCXCL16的分子量大小(13kDa)基本相符，说明sCXCL16表达位置在包含体中。
2、sCXCL16-N及sCXCL16-C的表达差异及优化IPTG诱导效果。
为对比sCXCL16-N及sCXCL16-C的表达差异以及IPTG浓度对其表达的诱导影响，将携带目标质粒(sCXCL16-N和sCXCL16-C)的DH5α菌株加入含有100μg/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基内，在37℃、200rpm条件下培养16h。次日加入新鲜培养基培养调整OD600值到0.7-0.9，并加入不同浓度的IPTG(0.5，1.0，2.0mM)，继续培养4h以测试IPTG对sCXCL16的诱导效果。将实验组样本及T0对照组(即未加入IPTG的非诱导表达组)在13000rpm下离心5分钟收菌，超声破碎后利用12％ SDS-PAGE和Western Blot对蛋白的表达和分子大小进行鉴定。
结果显示，经过IPTG诱导的sCXCL16-N样本在SDS-PAGE中(图7)10-15kDa处显示有条带(见红色箭头)，位置与sCXCL16的分子量(13kDa)基本相符，说明发生蛋白表达；然而在Western Blot结果中的相应位置没有显示条带(图8)，说明sCXCL16-N在与抗体结合时可能受到N-端6×His标签结构的干扰从而结合不佳。sCXCL16-C的表达在SDS-PAGE和WesternBlot结果中均清晰可见，且与其蛋白分子量(13kDa)基本相符(如图7、图8所示)，说明发生蛋白表达；且添加IPTG能显著提高sCXCL16-C的表达量，其中添加1.0mM ITPG的诱导效果最为显著(即图8中的7号电泳槽)。
3、培养温度的优化。
基于以上结果，N端的6×His标签结构可能对sCXCL16与Westernblot抗体的结合造成干扰，因此对其进行排除，以下实验利用sCXCL16-C完成，测定sCXCL16-C的最佳表达温度。在20℃和37℃两种温度条件下，分别以20℃、200rpm；37℃、200rpm的条件，利用大肠杆菌内对sCXCL16-C进行表达，振荡扩培，加入1.0mM IPTG进行诱导，利用12％SDS-PAGE和Western Blot对蛋白表达结果进行分析。
结果显示，经过终浓度为1mM IPTG诱导剂诱导后的sCXCL16-C样本在SDS-PAGE结果(图9)和Western Blot结果(图10)中均显示发生表达(红色箭头)。Western Blot结果显示，在37℃(图10)条件下培养的CXCL16-C所呈现的条带比在20℃颜色略深，提示表达量略高，为更优表达温度。
五、sCXCL16的纯化和鉴定。
1、sCXCL16的纯化。
按照以上最优条件培养sCXCL16-C后，收集菌液，经过4000rpm离心30min(上文优化IPTG诱导效果环节，因是采用1.5mL离心管的小型实验，故采用13000rpm下离心5分钟的离心条件收菌即可，此处为大型扩增培养环节，故采用4000rpm离心30min的离心条件)，弃上清液，收集菌液沉淀。基于以上实验结果，上样的样本加入了Tris缓冲液(pH 8.0)，放入冰盒中超声破碎细胞18min(超声功率为20％，超声2.5s，暂停4.0s)后，低温9000rpm离心40min所分离的上清液(含有可溶性的sCXCL16-C)。
使用AKTA全自动层析仪及镍亲和层析柱(IMAC柱)对蛋白进行纯化。IMAC柱利用待分离蛋白表面暴露的组氨基酸残基(6×His)和吸附柱上镍离子间的相互吸附作用，将目标蛋白与杂质分开，并利用咪唑进行洗脱。
纯化前，将上清液与IMAC柱填料充分混合，使上清液中的带有6×His标签的趋化因子CXCL16与层析柱上填料的配基充分结合。使用流动相(Tris缓冲液)将IMAC柱平衡后，设置流速为1.5ml/min，压力为0.14MPa，上样量为95ml。
经过使用不同浓度的咪唑进行纯化实验，得出先利用低浓度40mM的咪唑进行洗脱20-25min，将结合不紧密的杂质清洗掉，至吸收峰趋于稳定，然后再利用高浓度300mM的咪唑进行洗脱20-25min，直至吸收峰趋于稳定，上述采用不同浓度咪唑进行洗脱的纯化方法，能较好地将吸收峰进行分离且能较好将sCXCL16-C从镍柱上进行洗脱，提高纯度。收集洗脱液于收集管内，每个收集管各1ml。实验结束后，依次使用TBS、NaOH清洗IMAC柱，并利用20％的乙醇贮存IMAC柱。
纯化结果如图11所示，在使用40mM咪唑进行缓冲时，在流动相177mL时出现吸收峰，峰值约为300mAU；在使用300mM咪唑进行洗脱时，在流动相208mL时出现另一个吸收峰，峰值约为300mAU。
2、sCXCL16纯化鉴定。
将所得的洗脱液样本通过12％ SDS-PAGE进行鉴定。结果如图12所示，在37℃下利用1.0mM IPTG扩增诱导培养后，经过离心并超声所得的菌液上清液存在sCXCL16-C。在经过IMAC纯化后，40mM的咪唑可有效清除部分无法与镍柱进行特异性结合的杂质，300mM咪唑可清除更多杂质，且在高峰值将sCXCL16-C从镍柱上进行有效洗脱，其IMAC中高峰值所收集的1mL样本在10-15kDa区域内呈现浅色清晰条带，纯化效果可达到90％以上。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种sCXCL16的表达载体，其特征在于，该表达载体如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体中编码sCXCL16的基因选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
3.一种表达菌株，其特征在于，包括权利要求1-2中任一项所述的表达载体。
4.一种sCXCL16的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：培养权利要求3所述的表达菌株，加入诱导剂，诱导表达，得到菌液，离心，得到sCXCL16。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述表达菌株含有如SEQ ID NO:5所示的表达载体；所述培养的温度为35-40℃；所述诱导剂为ITPG，所述诱导剂的工作浓度为0.8-1.2mM。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括离心步骤后的纯化，所述纯化包括以下步骤：菌液离心后，收集沉淀，超声破碎，离心，取上清液，进行亲和层析，洗脱，得到sCXCL16。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述洗脱步骤的洗脱液包括工作浓度为35-45mM的咪唑和/或工作浓度为280-320mM的咪唑。
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| CN202310835348.1A Active CN116790616B (zh) | 2023-07-07 | 2023-07-07 | 编码sCXCL16的基因及表达载体、制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| CN (1) | CN116790616B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN110573529A (zh) * | 2017-04-05 | 2019-12-13 | 韩国生命工学研究院 | 激活nk细胞的融合蛋白、nk细胞和包含其的药物组合物 |
| CN115109782A (zh) * | 2022-05-26 | 2022-09-27 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 重组人源cxcl16蛋白的表达及复性方法 |
-
2023
- 2023-07-07 CN CN202310835348.1A patent/CN116790616B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110573529A (zh) * | 2017-04-05 | 2019-12-13 | 韩国生命工学研究院 | 激活nk细胞的融合蛋白、nk细胞和包含其的药物组合物 |
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