CN113880930B - 一种多肽毒素THTX-Cl19及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽毒素THTX‑Cl19，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。该多肽毒素THTX‑Cl19是从长霜足蛛毒素中筛选到的，其在体外能有效抑制MT‑SP1对多种底物的降解作用；并抑制Matriptase高表达的PC‑3前列腺癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力。THTX‑Cl19对MT‑SP1蛋白酶有较高的选择性，目前仅发现它对胰蛋白酶酶促反应有抑制作用(Ki＝0.371μM)，对其他蛋白酶及电压门控离子通道无明显抑制效果。

Description

一种多肽毒素THTX-Cl19及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种多肽毒素THTX-Cl19及其应用。

背景技术

Matriptase，也称细胞膜丝氨酸蛋白酶1(membrane type-serine protease 1,MT-SP1)，最先在人乳腺癌细胞系中被发现，是目前研究最为广泛的TTSPs之一。Matriptase在正常生理条件下主要表达在各种组织的上皮来源细胞中(如前列腺、小肠、胃、肾脏、结肠、肺和胎盘等)；另外，在免疫系统细胞中也有表达，包括巨噬细胞、单核细胞和肥大细胞。

细胞膜锚定丝氨酸蛋白酶Matriptase在多种肿瘤组织中过量表达，且参与体内细胞膜和细胞外基质中多种生物大分子底物(如pro-HGF、pro-uPA及PAR-2等)的蛋白水解激活，并通过增强肿瘤细胞的增殖、浸润和迁移，来促进肿瘤的发生、发展和转移。因此，Matriptase作为肿瘤细胞侵袭和转移发生的关键节点，被认为是一个抗肿瘤治疗的重要靶点，开发一种能够抑制Matriptase的酶促作用并适用于抗肿瘤药物的化合物本领域就有十分重要的意义。

长霜足蛛(Cyriopagopus longipes)是一种栖息在泰国、老挝和柬埔寨等东南亚国家的大型捕鸟蛛。目前对长霜足蛛毒素研究甚少，其多肽毒素的潜力还有很大的挖掘价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种多肽毒素THTX-Cl19及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种多肽毒素THTX-Cl19，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其相对分子量为3559.14Da。

本发明以安全高效的筛选靶向抑制Matriptase的多肽为目标，利用有毒动物毒液资源库，拟筛选出具有Matriptase蛋白酶抑制作用的活性成分。利用PET24a大肠杆菌蛋白表达载体系统对Matriptase丝氨酸蛋白酶结构域MT-SP1区域(596-855aa)进行蛋白原核表达和纯化；并通过参数测定确定重组蛋白MT-SP1相关酶动力学参数：Km＝30.9±3.2mM,kcat＝2.9*102±4.8s-1以及kcat/Km＝7.8x106±1.6*106M-1·s-1。通过MT-SP1催化水解Pefachrome tPA拟肽类小分子底物发生显色反应，从长霜足蛛、五步蛇、中华眼镜蛇、间角蜈蚣、黑粗尾蝎等10余种毒液中筛选出对蛋白酶MT-SP1活性有抑制作用的毒素。粗毒筛选实验发现：长霜足蛛粗毒能够显著抑制MT-SP1对Pefachrome tPA底物的降解作用。

收集RP-HPLC分离纯化后的样品再次进行上述活性筛选。长霜足蛛毒素活性组分(出峰时间25.6min)对MT-SP1重组蛋白表现出较强的抑制作用，其对MT-SP1降解底物作用的半数抑制浓度IC50为0.165μM，经公式换算该组分对MT-SP1的抑制参数Ki值为0.163μM，MALDI-TOF质谱鉴定其相对分子质量为3553.53Da。使用Edman降解法对该组分进行蛋白N端序列测定，比对长霜足蛛cDNA文库预测的多肽序列后，确定该组分多肽序列为：ACGHLHDPCKPGPPSTNTCCIGLQCRYGSCLVQV(pI/Mw:7.83/3559.14)。根据国际多肽毒素标准命名规则，将该成分命名为THTX-Cl19。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种多肽毒素THTX-Cl19在制备抗肿瘤药物中的应用。优选的，所述抗肿瘤药物为抗前列腺癌细胞的药物。

经过大量实验表明：THTX-Cl19能有效抑制PC-3前列腺癌细胞的增殖能力；但不影响DU145细胞系和RWPE-1细胞系的增值能力。抗迁移实验表明：THTX-Cl19明显抑制Transwell小室中的细胞迁移；而不同浓度的THTX-Cl19不影响DU145前列腺癌细胞的Transwell小室迁移；而RWPE-1细胞系中几乎没有细胞迁移的发生。同时，划痕愈合实验表明THTX-Cl19有效减缓PC-3前列腺癌细胞的划痕愈合情况；而THTX-Cl19对DU145细胞系的细胞迁移几乎没有影响。此外，THTX-Cl19显著抑制PC-3前列腺癌细胞的Transwell小室侵袭。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的多肽毒素THTX-Cl19，是从长霜足蛛毒素中筛选到的，其在体外能有效抑制MT-SP1对多种底物的降解作用；并抑制Matriptase高表达的PC-3前列腺癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力。THTX-Cl19对MT-SP1蛋白酶有较高的选择性，目前仅发现它对胰蛋白酶酶促反应有抑制作用(Ki＝0.371μM)，对其他蛋白酶及电压门控离子通道无明显抑制效果。说明THTX-Cl19能够用于制备抗肿瘤药物，尤其是防治前列腺癌的药物，对Matriptase介导的前列腺癌症具有一定的防治效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是PET24a载体原核表达Matriptase丝氨酸蛋白酶结构域MT-SP1区域(596-855aa)纯化前/后(A/B)SDS-Page图(纯度＞90％；c＝0.1mg/mL)；

图2是蛋白酶活性域MT-SP1的酶动力学活性检测；A、Matriptase催化PefachrometPA底物显色反应示意图；B、Pefachrome tPA底物剂量依赖性分析；C、米氏(Michaelis-Menten)方程拟合曲线反应；D、MT-SP1酶剂量依赖性分析。

图3是长霜足蛛粗毒毒液(浓度为1、0.1、0.01、0.001mg/ml)呈剂量依赖性抑制蛋白酶MT-SP1对其活性底物Pefachrome tPA的降解作用。

图4是长霜足蛛毒素粗分的MT-SP1活性筛选与质谱鉴定；A、长霜足蛛毒液的RP-HPLC纯化图谱；B、MALDI-TOF质谱仪线性模式检测*号色谱峰的分析图谱；C、不同浓度的长霜足蛛活性组分对重组蛋白酶MT-SP1的Pefachrome tPA底物降解作用的影响；D、THTX-Cl19多肽对MT-SP1抑制效率的浓效关系曲线。

图5是长霜足蛛活性组分N端测序；A、19种PTH氨基酸的混合标准品校准测试图谱；B、多肽样品的N-端第1位丙氨酸Ala测试图谱。

图6是样品第2-15位Edman降解法的N端序列测试图谱。

图7是THTX-Cl19多肽的RP-HPLC分离纯化与质谱鉴定；包括THTX-Cl19合成多肽复性前(A)和复性后(C)的RP-HPLC分离纯化图谱，以及复性前(B)和复性后(D)的MALDI-TOF反射模式分析检测图谱。

图8是不同浓度THTX-Cl19对MT-SP1裂解底物pro-HGF的作用；A、THTX-Cl19浓度依赖性的抑制MT-SP1裂解重组鼠源的肝细胞生长因子前体pro-HGF(～80.8kDa)成α-HGF(～54kD)和β-HGF(～26kD)的作用；B-C、C-端含HIS Tag的pro-HGF(B)和β-HGF(C)灰度扫描定量统计图(mean±SEM,n＝3independent experiments)。

图9是THTX-Cl19对MT-SP1裂解底物pro-HGF抑制作用的时效关系；A、THTX-Cl19时间依赖性的抑制Matriptase裂解重组鼠源的肝细胞生长因子前体pro-HGF(～80.8kDa)成α-HGF(～54kD)和β-HGF(～26kD)的作用；B-C、C-端含HIS Tag的pro-HGF(B)和β-HGF(C)灰度扫描定量统计图(mean±SEM,n＝3independent experiments)。

图10是不同浓度THTX-Cl19对MT-SP1裂解底物pro-uPA的作用；A、THTX-Cl19显著抑制Matriptase裂解C-端含HIS Tag重组鼠源的肝细胞生长因子前体pro-uPA(～50kDa)成A-uPA(～32kD)和B-uPA(～18kD)的作用；B-C、不同处理后的pro-uPA和B-uPA灰度扫描定量统计图(mean±SEM,n＝3independent experiments)。

图11是THTX-Cl19对MT-SP1裂解底物pro-uPA抑制作用的时效关系；A、THTX-Cl19对Matriptase裂解pro-uPA的抑制作用呈时间依赖性；B-C、不同处理后的pro-uPA(B)和B-uPA(C)灰度扫描定量统计图(mean±SEM,n＝3independent experiments)。

图12是THTX-Cl19对三种丝氨酸蛋白酶降解底物能力的影响；AC-D、THTX-Cl19分别对胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶和MMP-2酶促反应的影响；B、THTX-Cl19抑制胰蛋白酶降解能力的量效曲线绘制；数据表示为mean±SEM，n＝3(ns指无统计学意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs.Control)。

图13是调节离子通道的蜘蛛Knottins多肽数量。

图14是THTX-Cl19对电压门控钠通道Nav1.5–Nav1.8的选择性；A-C、THTX-Cl19处理前(黑色)与处理后(蓝色)代表性电流图；10μM的THTX-Cl19可抑制部分Nav1.5通道电流，而对Nav1.7和Nav1.8无明显抑制作用；数据表示为mean±SEM，每个点的细胞数为n＝3-6。

图15是THTX-Cl19对电压门控钾通道Kv1.3–Kv4.2的选择性；A-J，THTX-Cl19处理前(黑色)与处理后(红色)代表性电流图；10μM的THTX-Cl19可微弱的抑制Kv3.1、Kv3.2通道电流，而对Kv1.3、Kv1.4、Kv1.5、Kv2.1、Kv2.2、Kv3.4、Kv4.1和Kv4.2无明显抑制作用；数据表示为mean±SEM，每个点的细胞数为n＝3-6。

图16是THTX-Cl19对不同前列腺细胞的增殖能力和细胞毒活性分析；A-C、分别表示在PC-3、DU145和RWPE-1前列腺细胞系中，0-5天之间给予不同浓度的THTX-Cl19后该细胞的增殖情况；D-F、不同浓度的THTX-Cl19对于PC-3、DU145和RWPE-1细胞系的细胞毒活性；数据表示为mean±SEM，n＝3(ns指无统计学意义vs.T-CL195μM)。

图17是THTX-Cl19的细胞集落形成测试与统计；A，0-5μM THTX-Cl19对PC-3前列腺癌细胞的细胞集落形成检测的形态表征图；B，THTX-Cl19对PC-3、DU145和RWPE-1前列腺细胞系细胞集落形成数量的统计图；数据表示为mean±SEM，n＝3(ns指无统计学意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs.Control)。

图18是THTX-Cl19的Transwell小室细胞迁移检测；A-C、Transwell小室实验验证不同浓度THTX-Cl19对于PC-3、DU145和RWPE-1细胞系迁移的影响；D-F、THTX-Cl19对于PC-3、DU145和RWPE-1细胞系迁移影响的统计图；数据表示为mean±SEM，n＝3(ns指无统计学意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs.control)。

图19是THTX-Cl19对PC-3和DU145细胞的划痕愈合检测；不同浓度THTX-Cl19对PC-3(A,B)和DU145(C,D)前列腺癌细胞系的损伤愈合实验结果及其统计图(E-F)；数据表示为mean±SEM，n＝3(ns指无统计学意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs.control)。

图20是THTX-Cl19的Transwell小室细胞侵袭检测；A-C、Transwell小室实验验证不同浓度THTX-Cl19对于PC-3、DU145和RWPE-1细胞系侵袭的影响；D-F、THTX-Cl19对于PC-3、DU145和RWPE-1细胞系侵袭影响的统计图。数据表示为mean±SEM，n＝3(ns指无统计学意义，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs.control)。

具体实施方式

本发明主要以有毒动物多肽毒液所含有的成分多样性为基础，筛选能够抑制MT-SP1酶促反应活性的单一组分；并对活性成分THTX-Cl19进行分离纯化、Edman降解序列测定、以及化学合成复性，获得THTX-Cl19多肽活性样品。检测复性纯化的THTX-Cl19多肽对MT-SP1对生物大分子底物pro-HGF和pro-uPA的催化裂解作用；并进一步检测THTX-Cl19对部分蛋白酶和电压门控离子通道的选择性作用。

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

本发明用到的主要材料和仪器——高效液相色谱仪，MALDI-TOF MS质谱仪，超级工作台，酶标仪，厌氧培养箱等菌来自于本实验室。标准变形链球菌购置于北纳生物。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

一种多肽毒素THTX-Cl19，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

为了说明THTX-Cl19的获得过程和应用效果，特提供如下实验。

1、Matriptase蛋白结构分析与原核表达

构建pet24a-ST14载体，在酶切位点NdeI、XhoI之间进行双酶切，插入II型跨膜丝氨酸蛋白酶Matriptase(ST14基因)596-855aa区段(MT-SP1区域)，C-端带有avi+6*his标签。PET24a-ST14载体携带核酸序列如SEQ ID NO：2所示，酶切位点NdeI位于第6位碱基G之后，XhoI位于第852位碱基G之后。将这个约846碱基对长的扩增产物克隆到PET24A(Novagen,Merck Biosciences,Bad Soden,Germany)中在大肠杆菌中表达。II型跨膜丝氨酸蛋白酶Matriptase的催化区域在包涵体中表达，然后进行变性、纯化、折叠和活化。

采用抗性筛选法筛选重组的阳性克隆，经卡拉霉素抗性筛选到的阳性克隆经过质粒测序，目的蛋白基因序列与目的蛋白基因序列一致后，对阳性克隆经原核表达。按照实验操作流程，对测序正确的阳性克隆扩增后收集破菌后的上清、沉淀样品进行SDS-PAGE检测。从图1A结果表明：经放大培养、超声破菌获得的MS-SP1重组蛋白(～33kDa)仅大量表达在包涵体中，在破菌后的上清液中未见目的蛋白的表达。所用包涵体溶解液、包涵体复性液以及复性蛋白活性液依次对重组蛋白包涵体进行变性和复性；并最终重组蛋白包涵体经复性、Ni-NTA纯化浓缩得到重组蛋白，并进行SDS-PAGE检测(图1B)。MS-SP1重组蛋白分子量约33kDa，大小符合目的蛋白分子量预期，蛋白纯度超过90％，经BCA蛋白定量后，置于-20℃用于后续酶动力学检测及筛选等实验。

1.2Matriptase的酶动力学活性检测

Pefachrome tPA是一种组织型纤溶酶原激活物(tPA)的高敏感显色肽底物；在多种蛋白酶，如Matriptase、单链tPA(sc-tPA)和双链tPA(tc-tPA)等，作用下裂解，产生呈淡黄色的分解产物--对硝基苯胺(pNA)。本实验通过Biotek多功能酶标仪在OD 405nM处的吸光值变化，来监测MT-SP1蛋白酶结构域对Pefachrome tPA水解产物硝基苯胺(呈淡黄色)的形成能力，从而反映了MT-SP1重组蛋白的酶活性强弱(图2A)。MT-SP1重组蛋白酶的动力学参数测定在酶浓度为0.2nM，tPA显色底物浓度变化在1μM到400μM之间。如图2B所示：当酶-底物相互作用时间在0min-40min时，MT-SP1的活性呈时间依赖性的增加，即分解产物产生的量与时间呈线性关系。而作用时间在40min-120min时，MT-SP1的活性则逐渐减弱，及单位时间内分解产物产生的量逐渐减少(图2C)。并在90min后，随着吸光值的变化为0，MT-SP1分解显色底物的能力彻底消失。同时，在相同的酶浓度孵育下，吸光值的变化(即分解产物的产量)随底物浓度的增大而增加。根据Michaelis-Menten方程，MT-SP1重组蛋白酶的相关酶动力学参数为：K_m＝30.9±3.2mM,k_cat＝2.9*10²±4.8s^-1以及k_cat/K_m＝7.8x10⁶±1.6*10⁶M^-1·s^-1。这与之前文献所报道的MT-SP1蛋白酶活性相似。此外，在相同浓度的显色底物tPA处理下，分解产物pNA的产量也随MT-SP1蛋白酶浓度的升高而增加(图2D)。

1.3粗毒的配制和Matriptase-tPA底物降解活性作用的筛选

将保存在-20°的雷氏大疣蛛、五步蛇、线蛛、中华捕鸟蛛、苔藓猎人蛛、智利火玫瑰、长霜足蛛、间角蜈蚣、屏东猎人蛛、黑粗尾蝎等10余种有毒动物粗毒冻干粉末恢复室温、称取并溶于超纯水。充分震荡后置于离心机，转速10000rpm,离心5min，将上清液用0.22μm的滤头过滤两次后，收集滤液。根据毒素的可溶性不同，最终配制成母液浓度为10mg/mL或1mg/mL的粗毒溶液。在70μL储存缓冲液中依次加入1mg/mL或0.1mg/mL不同粗毒溶液(对照组加10μL的储存缓冲液)10μL、400μM Pefachrome tPA底物Buffer 10μL，经混匀后；最后加入10μL 0.2nM Matriptase酶工作液，37℃孵育60min，OD＝405nM的吸收值每5min测一次，检测不同粗毒处理后的pNA产物-时间曲线。

如图3可知，长霜足蛛粗毒对MT-SP1降解tPA底物能力有显著的抑制作用。1mg/mL长霜足蛛粗毒几乎完全抑制MT-SP1的蛋白酶活性，0.1mg/mL粗毒仍然能够抑制72％的蛋白酶活性。进一步实验计算，长霜足蛛粗毒对Matriptase酶的蛋白酶活性的抑制作用的IC50＝26.58μg/mL。

1.4长霜足蛛粗毒的分离纯化

1.4.1制备型分离纯化

鉴于长霜足蛛粗毒对MT-SP1降解tPA底物有较强的抑制作用，为筛选出其中的单一活性成分，我们使用Waters e2695半制备型反相高效液相色谱仪对长霜足蛛粗毒进行分离纯化。打开HPLC色谱仪(Waters e2695)，安装C18反相柱(Welch)，按照表预先设置的洗脱梯度平衡色谱柱。使用Empower控制软件，215/280nm双波长检测吸收值。流动相的洗脱液配制：A(ddH₂O，0.1％TFA)；B(ACN，0.1％TFA)。收集分离纯化的目标峰样品，并冻干后于-20℃保存。

1.4.2目标峰质谱鉴定与纯度分析

将CCA溶于50％乙腈(0.1％TFA)中，配制成过饱和溶液。震荡混合助溶CCA，12000rpm，离心5min，取上清备用。先取0.5μL待测样品至点样板上，干燥后再取0.5μL CCA溶液均匀覆盖待测样品，待自然风干后进行质谱测定。

结果如图4A所示，根据乙腈比例的变化收集到51个组分；将分离的51个洗脱峰放入真空冷冻干燥机冻干并称量(部分组分无法称重，用BCA蛋白定量试剂盒对其定量)，分别检测不同组分对MT-SP1降解底物的抑制活性。如图4B-D所示，*号色谱峰对MT-SP1重组蛋白表现出较强的抑制作用，其对MT-SP1降解底物作用的半数抑制浓度IC50为0.165μM。该成分对MT-SP1抑制作用的抑制常数ki＝0.163μM。经MALDI-TOF质谱鉴定*号目的峰纯度＞90％，并无其他干扰成分，线性模式检测的相对分子质量为3553.53Da(图4D)。

1.5蛋白N端序列测定(Edman降解法)与cDNA文库序列比对分析

本实验采用基于Edman降解法的N端序列分析方法，通过岛津全自动蛋白质多肽测序仪(PPSQ-33A)对*号组分的N端序列进行测定。将样品滴至膜上，膜放置到反应器中，组装好反应器后将其放置于仪器固定位置，通过软件PPSQ-30Analysis设置：样品名称-THTX-Cl19、样品号-1、测试循环数-15、选择方法文件，设置完成后开始测试。数据及图谱处理：PPSQ-33A产生的原始数据及图谱由PPSQ-30DataProcessing软件识别标峰并导出对应图谱。

为对19种PTH-氨基酸进行校准，故先测试19种PTH氨基酸的混合标准品，混合标准品的校准测试图谱见图5A。PTH氨基酸混合标准品校准测试完成后，测试*号样品的第1位N-端序列，并确定样品N-端第1位氨基酸为丙氨酸(Ala)(图5B)。并依次对*号样品进行15次测试循环，确定该目标峰N端序列为:NH₂-Ala-X-Gly-His-Leu-His-Asp-Pro-X-Lys-Pro-Gly-Pro-Pro-Ser，其中X指代Cys(样品第2-15位N端测试图谱见附图6)。

实验室前期构建了长霜足蛛毒腺cDNA文库，获得323条表达序列标签。根据序列相似性，将104条毒素前体序列归类为10个超家族。通过N端序列与cDNA文库所预测的蛋白序列进行比对，找到了与该N端氨基酸序列相对分子量一致的多肽序列，其序列为：ACGHLHDPCKPGPPSTNTCCIGLQCRYGSCLVQV(Theoretical pI/Mw:7.83/3559.14)，由34个氨基酸残基组成(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)。根据国际多肽毒素标准命名规则，将该成分命名为THTX-Cl19。

1.6THTX-Cl19的多肽化学合成与复性

本文采用F-moc固相化学合成法先合成直链多肽，在对色谱纯化后的直链多肽复性，配制10mL复性液(0.1M NaCl、0.1M Tris-HCl、5mM EDTA、5mM GSH和0.5mM GSSG,PH＝7.3)，称取1mg经HPLC纯化的合成样品，用100μL超纯水溶解。将配好的复性液转移至用锡箔纸包好的50mL离心管中，将溶解好的样品缓慢滴入离心管中，盖好离心管盖子并用封口膜封好口放入4℃冰箱，24h后加入0.5mL 50％TFA终止反应。终止反应后，需要将复性好的多肽进行进一步的HPLC纯化并用质谱检测确定其是否复性成功。获得具有正确空间构型的多肽，并经HPLC纯化、质谱鉴定。

THTX-Cl19氨基酸序列的相对分子量为3559.14Da，包含34个氨基酸残基和三对二硫键，属于典型的ICK结构。本实验使用固相化学合成法合成THTX-Cl19，并通过HPLC对合成样品进行分离纯化(图7A)。经质谱鉴定图7B中的*号峰为THTX-Cl19的线性多肽(相对分子量：3559.12)。将真空冷冻干燥机冻干后的线性多肽，通过GSH/GSSG氧化还原对的方法进行氧化复性。复性后的HPLC图谱出现了一个主峰，且该主峰较复性前的组分的出峰的乙腈浓度减少了4％(图7C)。经质谱验证，鉴定其分子量为3553.46Da，比复性前线性多肽的分子量少6Da，说明复性成功(图7D)。

1.7THTX-Cl19显著抑制MT-SP1裂解肝细胞生长因子前体pro-HGF的作用

在确定THTX-Cl19能显著的抑制可溶性MT-SP1对小肽底物tPA的活性后，我们进一步研究THTX-Cl19是否能有效的抑制MT-SP1对大分子底物的水解作用。我们采用WesternBlotting检测THTX-Cl19对MT-SP1重组蛋白激活pro-HGF的影响。

本实验的所有反应均在37°孵育60min后，加入含溴酚蓝的Loading Buffer沸水浴10min让蛋白变性从而停止反应。如图8A-C所示：20nM的MT-SP1在孵育时间内能完全裂解10μMpro-HGF，并检测到活性的β-HGF片段的表达。随着MT-SP1浓度的增加，THTX-Cl19逐渐抑制了MT-SP1促pro-HGF的激活作用。该抑制作用在10nM及以上浓度时可检测到，THTX-Cl19浓度在1μM以上时，其对MT-SP1降解大分子底物pro-HGF的抑制作用基本完全。10μM的Matriptase小分子化合物抑制剂SRI 31215(TFA)在孵育时间内也几乎完全抑制了MT-SP1的水解作用。

此外，THTX-Cl19抑制MT-SP1重组蛋白水解底物pro-HGF的作用呈明显的时间依赖性。在1-12h期间，THTX-Cl19对MT-SP1的抑制作用较为明显，而这种抑制现象在孵育了48h后彻底消失，肝细胞生长因子前体pro-HGF全部被激活成活性的α-HGF和β-HGF(图9A-C)。

1.8THTX-Cl19有效抑制MT-SP1蛋白水解尿激酶型纤溶酶原激活剂前体pro-uPA的作用

我们进一步研究了THTX-Cl19是否能有效抑制MT-SP1对pro-uPA水解激活作用。与上小节原理相同，本实验选用表达C-端连有HIS标签的重组鼠源肝细胞生长因子前体pro-uPA。同时，经MT-SP1降解后的B-uPA也含有HIS标签。因此，同样通过6*His,His-Tag的鼠源一抗孵育，Western Blot蛋白测pro-uPA和B-uPA在以反映THTX-Cl19对MT-SP1的抑制能力。

与THTX-Cl19抑制MT-SP1水解激活大分子底物pro-HGF的作用类似，20nM的MT-SP1在孵育时间内能完全水解10μM pro-uPA，并检测到含有HIS标签的B-uPA蛋白的表达(图10A)。与此同时，MT-SP1对pro-uPA的水解激活作用也随THTX-Cl19浓度的增加而逐渐减弱；而活性B-uPA的量则随着THTX-Cl19浓度的增加而逐渐增多(图10B,C)。另外，THTX-Cl19抑制MT-SP1重组蛋白水解底物pro-uPA的能力呈明显的时间依赖性，这种抑制现象最终在孵育了48h后彻底消失，即尿激酶型纤溶酶原激活剂前体pro-uPA全部激活成为活性的A-uPA和B-uPA(图11A-C)。

1.9THTX-Cl19对其他丝氨酸蛋白酶的选择性分析

本实验检测了不同浓度的长霜足蛛毒素THTX-Cl19对胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶和基质金属蛋白酶三种蛋白酶酶促反应的抑制作用。

1.9.1胰蛋白酶抑制活性检测

本文使用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)法测定胰蛋白酶的酶活性。胰蛋白酶能够选择性水解变性蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，并能高效水解碱性氨基酸形成的酯键，比如：胰蛋白酶能够催化水解BAEE的酯键，生成H-苯甲酰-L-精氨酸(BA)，BA在253nm处有吸收峰，通过测定酶标仪253nm处的吸光度变化速率，计算胰蛋白酶的活性。实验所用胰蛋白酶购于Sigma-Aldrich公司(货号：T1426)；胰蛋白酶活性检测试剂盒(微量法)购于Solarbio公司(货号:BC2315-100T/96S)。

酶标仪预热30min以上，调节波长至253nm，蒸馏水调零。96孔板中加入190μL BAEE工作液，再加入10μL0.1-20mg/mL的胰蛋白酶工作液(空白组则加入2μL的去离子水)，迅速测定在253nm处0s和60s的吸光值变化。

1.9.2基质金属蛋白酶(MMP-2)抑制活性检测

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人基质金属蛋白酶2(MMP-2)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人基质金属蛋白酶2(MMP-2)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

1.9.3α-胰凝乳蛋白酶抑制活性检测

本文用胡梅尔(Hummel)法测定胰凝乳蛋白酶活性。糜蛋白酶能迅速分解变性蛋白质，并优先催化水解结合有氨基酸(比如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的L-异构体等)的肽键。糜蛋白酶催化水解苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)，其水解产物苯甲酰-L-精氨酸(BT)在256nm处有特征峰吸收；通过测定256nm吸收值变化速率计算糜蛋白酶活性。实验所用α-胰凝乳蛋白酶购于Sigma-Aldrich公司(货号：C4129)；α-胰凝乳蛋白酶活性检测试剂盒(微量法)购于Solarbio公司(货号:BC2335-100T/96S)。

(1)酶标仪预热30min以上，调节波长至256nm，蒸馏水调零；试剂一置于25℃水浴中保温30min。96孔板中依次加入90μL BTEE工作液一、90μL BTEE工作液二和20μL BTEE工作液三，最后加入20μL 0.1-20mg/mL的α-胰凝乳蛋白酶工作液(空白组则加入20μL的去离子水)，于256nm处测定初始吸光值A1和3min时的吸光值A2，计算ΔA＝A2-A1。

(2)α-胰凝乳蛋白酶活性计算：活性单位定义：25℃每毫克蛋白每分钟水解1μmolBTEE为一个酶活单位。糜蛋白酶活(U/mg prot)＝(ΔA×V反总÷ε÷d)÷(Cpr×V样)÷T＝3.8×ΔA÷Cpr(V样：加入反应体系中粗酶液体积，0.02mL；Cpr：粗酶液蛋白浓度，mg/mL，需要另外测定；W：样本质量，g；V反总：反应总体积，0.22mL；V提取：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，3min；ε：BTEE消光系数，0.964mL/μmol/cm；d：96孔板光径，0.6cm)。

胰蛋白酶活性检测结果表明，终浓度2n M的胰蛋白酶能有效水解200μM BAEE底物，而经0.006-100μM的长霜足蛛活性组分THTX-Cl19处理后，能不同程度地抑制胰蛋白酶水解底物的能力以及水解产物(检测OD值为253nm)的产生，根据量效曲线计算其IC50为0.431μM；经公式换算的Ki＝0.371μM(图12A,B)。同时，THTX-Cl19不影响α-胰凝乳蛋白酶(2nM)对底物BTEE(200μM)催化水解作用(图12C)。采用ELISA酶联免疫吸附剂测定基质金属蛋白酶(MMP-2)的活性检测结果显示，5nM的MMP-2能有效降解底物TMB，而不同浓度的THTX-Cl19药物处理几乎对MMP-2降解能力无明显影响(图12D)。

1.10THTX-Cl19对电压门控钠、钾离子通道的选择性分析

长霜足蛛毒液的活性成分THTX-Cl19属于三对二硫键组成的Knottins多肽，因此本节检测了THTX-Cl19对部分电压门控离子通道的作用。图13是调节离子通道的蜘蛛Knottins多肽数量。

根据α-亚基内的电压敏感构象变化，Nav通道的门控行为主要分为三种状态：关闭、开放和失活。与Nav通道相互作用的毒素或药物通常优先结合这些构象中的一种，以改变Na+电导或通道的门控特性。Nav通道抑制能力的Knottins多肽毒素往往具有靶向多种Nav亚型的潜力，但大多数都被优化为单通道亚型hNaV1.7的效力和选择性。如图14所示，我们用全细胞电压钳技术检测了THTX-Cl19对表达在HEK293T细胞表面的Nav1.5离子通道的活性(图14A)。细胞钳制在-100mV，去极化刺激电压为-10mV，持续时间为50ms。10μM的THTX-Cl19毒素对Nav1.5通道有较弱的抑制作用(22.3％)。检测表达在ND7/23细胞上的Nav1.7通道电流时，细胞钳制在-120mV，去极化刺激电压为-40mV，细胞外液加入10μM THTX-Cl19；检测ND7/23细胞上Nav1.8通道电流时，去极化刺激电压为+20mV细胞外液中加入10μM THTX-Cl19。如图14B,C所示，10μM的THTX-Cl19毒素对Nav1.7-Nav1.8通道电流无明显抑制作用。

作用于电压门控钾离子(Kv)通道的ICK型毒素广泛存在，如PVIIA、HaTX1和ChTx等。其中，来自芋螺毒液的Knottins多肽kappa-Conotoxin PVIIA能够有效阻断shaker Kv-1型离子通道。蝎子毒素衍生出的Charybdo毒素(ChTx)能够抑制钙激活钾通道KCa3.1,KCa1.1和Kv1.3,Kv1.2,Kv1.6等多种钾通道。如图15所示，本文共检测了10μM的THTX-Cl19刺激对表达在HEK293T细胞的Kv1.3-Kv4.2离子通道的影响。10μM的THTX-Cl19毒素能够微弱的抑制Kv3.1、Kv3.2通道电流(6.5％和13.9％)(图15F,G)。对Kv1.3、Kv1.4、Kv1.5、Kv2.1、Kv2.2、Kv3.4、Kv4.1和Kv4.2通道电流，10μM的μ-TRTX-Ca2a毒素的刺激无明显作用(图15A-E,H-J)。

3.2.1THTX-Cl19显著抑制PC-3前列腺癌细胞的增殖能力

为了检测THTX-Cl19对PC-3细胞生长的影响，确保培养5d后细胞的生长保持在对数期，将细胞按1.5*104cells/cm2的密度接种，分别用0-5μM THTX-Cl19处理。通过CCK-8检测，图16A显示THTX-Cl19以时间和剂量依赖的方式有效抑制PC-3细胞的生长，在THTX-Cl19处理浓度在1μM和5μM时，细胞的生长完全停止；且随着处理时间的延长，细胞数量逐渐低于原始细胞的数量。5μM的药物处理3天后，PC-3活细胞数量无法检测。而在DU145细胞以及RWPE-1细胞系中(图16B,C)，不同浓度的THTX-Cl19处理对它们的细胞生长没有出现明显的统计学变化。

如图17A所示，0.008-5μM的THTX-Cl19分别处理PC-3前列腺癌细胞15天后结晶紫染色，对照组的单细胞增殖呈现明显可见的细胞集落且集落数量较多。处理组的细胞集落随THTX-Cl19的给药浓度增大而显著减少，5μM THTX-Cl19处理后，6孔板内几乎未观察到细胞集落形成。用image J Pro Plus软件分别对PC-3、DU145和RWPE-1细胞的集落数目进行统计，THTX-Cl19抑制细胞集落形成的能力仅发生在PC-3前列腺癌细胞中，而对其他两种前列腺细胞的细胞集落形成能力无明显影响(图17B)。

为了进一步检测THTX-Cl19对三种前列腺细胞的细胞毒活性，将对数期的细胞按3*105cells/cm2的密度接种，分别用0-5μM THTX-Cl19处理24小时后，CCK-8检测细胞的生存情况。实验结果显示：不同浓度的THTX-Cl19对于三种前列腺细胞系基本没有细胞毒活性，安全性较高。综上所述，THTX-Cl19能有效抑制PC-3前列腺癌细胞的增殖能力，但对DU145和RWPE-1细胞系的增殖能力无影响；THTX-Cl19对于三种前列腺细胞系没有细胞毒活性，具有一定程度的安全性。

3.2.2THTX-Cl19抑制PC-3前列腺癌细胞的Transwell小室迁移

为了验证THTX-Cl19对细胞迁移活性的影响，我们选定了PC-3、DU145和RWPE-1前列腺细胞系进行Transwell小室迁移实验测定。如图18A,D所示，用0.2-5μM浓度的THTX-Cl19分别处理PC-3、DU145和RWPE-1前列腺细胞系48小时。结果发现THTX-Cl19呈浓度依赖性的抑制PC-3前列腺癌细胞系的细胞迁移活性，10μM的Matriptase小分子抑制剂SRI(TFA)也能够发挥很强的抗迁移活性。0.2μM的THTX-Cl19处理明显抑制了PC-3细胞向Transwell下室迁移且具有统计学差异(P<0.01)。但在前列腺癌脑转移肿瘤来源的DU145细胞中，不同浓度的THTX-Cl19和10μM的TFA均无法抑制DU145细胞在小室中的迁移能力，且无统计学差异(图18B,E)。而正常的RWPE-1前列腺上皮细胞在Transwell小室中无法发生迁移现象，说明该细胞系无细胞迁移的能力(图18C,F)。

3.2.3THTX-Cl19有效减缓PC-3前列腺癌细胞的划痕愈合情况

细胞划痕实验是检测细胞在二维层面迁移能力的方法，即通过人为划线制造伤痕，高转移的癌细胞通过自身的细胞运动(迁移)使伤痕愈合，通过划痕的宽度计算细胞的迁移能力。针对THTX-Cl19对前列腺癌细胞的抗迁移活性验证，对PC-3和DU145前列腺癌细胞系开展了细胞划痕实验。如图19B,E所示,未经过药物处理组在划痕处理48h后划痕愈合率达到约80％。而不同浓度(0.2-5μM)的THTX-Cl19处理后，PC-3细胞的划痕愈合速率明显降低，并呈浓度依赖性。10μM的TFA同样有效的抑制了PC-3细胞划痕的愈合效率。而DU145前列腺癌细胞系在未经过药物处理组，在划痕处理48h后划痕愈合率约60％。当0.2-5μM浓度的THTX-Cl19和TFA处理后，DU145细胞的划痕愈合率与空白组无明显统计学差异(图19D,F)。因此，与Transwell小室迁移实验结论相似，THTX-Cl19能有效减缓PC-3前列腺癌细胞划痕愈合现象的发生。

3.2.4THTX-Cl19抑制PC-3前列腺癌细胞的Transwell小室侵袭

肿瘤在体内转移的过程中伴随着一定程度的肿瘤细胞侵袭，本文在细胞水平检测了THTX-Cl19对不同前列腺癌细胞系迁移能力的影响后，将进一步了解THTX-Cl19对于PC-3、DU145和RWPE-1细胞系侵袭能力的影响。Transwell小室细胞侵袭实验是在原本的Transwell小室的聚碳酸酯膜上铺一层基质胶，通过计算聚碳酸酯膜下方的细胞数，来模拟体内肿瘤细胞对于细胞外基质的侵袭能力强弱。

如图20A,D所示，用0.2-5μM浓度的THTX-Cl19处理PC-3前列腺细胞系48小时后，铺基质胶的Transwell小室下室侵袭的细胞数量呈浓度依赖性的减少。这说明，PC-3前列腺癌细胞系的侵袭能力在给予THTX-Cl19处理后受到了削减；THTX-Cl19能够有效抑制PC-3细胞系的侵袭能力。但在DU145细胞中，不同浓度的THTX-Cl19和TFA则无法抑制DU145细胞在小室中的侵袭能力(图20B,E)；而Transwell迁移实验结果相似，正常的RWPE-1前列腺上皮细胞在有无THTX-Cl19处理情况下，均无法发生侵袭现象，说明RWPE-1细胞系不具备细胞侵袭能力(图20C,F)。

总的来说，THTX-Cl19在体外能有效抑制MT-SP1对多种底物的降解作用；并抑制Matriptase高表达的PC-3前列腺癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力。THTX-Cl19对MT-SP1蛋白酶有较高的选择性，目前仅发现它对胰蛋白酶酶促反应有抑制作用(Ki＝0.371μM)，对其他蛋白酶及电压门控离子通道无明显抑制效果。说明THTX-Cl19能够用于制备抗肿瘤药物，尤其是防治前列腺癌的药物，对Matriptase介导的前列腺癌症具有一定的防治效果。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 一种多肽毒素THTX-Cl19及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> 长霜足蛛(Cyriopagopus longipes)

<400> 1

Ala Cys Gly His Leu His Asp Pro Cys Lys Pro Gly Pro Pro Ser Thr

1 5 10 15

Asn Thr Cys Cys Ile Gly Leu Gln Cys Arg Tyr Gly Ser Cys Leu Val

20 25 30

Gln Val

<210> 2

<211> 858

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catatgggct cagatgagaa ggactgcgac tgtgggctgc ggtcattcac gagacaggct 60

cgtgttgttg ggggcacgga tgcggatgag ggcgagtggc cctggcaggt aagcctgcat 120

gctctgggcc agggccacat ctgcggtgct tccctcatct ctcccaactg gctggtctct 180

gccgcacact gctacatcga tgacagagga ttcaggtact cagaccccac gcagtggacg 240

gccttcctgg gcttgcacga ccagagccag cgcagcgccc ctggggtgca ggagcgcagg 300

ctcaagcgca tcatctccca ccccttcttc aatgacttca ccttcgacta tgacatcgcg 360

ctgctggagc tggagaaacc ggcagagtac agctccatgg tgcggcccat ctgcctgccg 420

gacgcctccc atgtcttccc tgccggcaag gccatctggg tcacgggctg gggacacacc 480

cagtatggag gcactggcgc gctgatcctg caaaagggtg agatccgcgt catcaaccag 540

accacctgcg agaacctcct gccgcagcag atcacgccgc gcatgatgtg cgtgggcttc 600

ctcagcggcg gcgtggactc ctgccagggt gattccgggg gacccctgtc cagcgtggag 660

gcggatgggc ggatcttcca ggccggtgtg gtgagctggg gagacggctg cgctcagagg 720

aacaagccag gcgtgtacac aaggctccct ctgtttcggg actggatcaa agagaacact 780

ggggtaggcc tgaacgatat ttttgaagcc cagaaaattg aatggcatga acatcaccat 840

catcaccatt agctcgag 858

Claims (3)

1. 一种多肽毒素THTX-Cl19，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的多肽毒素THTX-Cl19，其特征在于，相对分子量为3559.14Da。

3.一种如权利要求1或2所述的多肽毒素THTX-Cl19在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗前列腺癌细胞的药物。

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