RO112032B1 - Procedeu pentru purificarea chimopapainei - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la procedeu pentru purificarea chimopapainei, chimopapaina astfel purificată fiind utilizată în aplicațiile clinice, în special în chemonucleoliză.

Chimopapaina este o cisteinproteinază în latexul arborelui papaia (pawpaw; Carica papaya], S-a constatat că are utilizare clinică, în special pentru tratamentul discurilor cu hernie sau cu prolaps sau a sciaticii printr-un procedeu care este denumit “chemonucleoliză”, Smith L. (1964), J. Amer. Med. Assoc. 187, pag, 137-140.

Purificarea și caracterizarea chimopapainei a fost încercată prima oară de Jansen și Balls (1941), J. Biol. Chem., 137, pag. 405-417, care au utilizat precipitarea cu un acid și un procedeu de desalifiere pentru a prepara enzima. Mai recent s-au întrebuințat metode de purificare bazate pe cromatografia cu schimb ionic. Astfel, de exemplu, în brevetele GB 2098997 și 2156821 se descrie utilizarea rășinilor schimbătoare de cationi pentru a separa chimopapaina de alte cisteinproteinaze cunoscute și ambele aceste procedee au fost utilizate la prepararea chimopapainei pe scară industrială. însă, se constată că materialul obținut are o activitate specifică relativ mică în comparație cu chimopapaina preparată de Buttle și Barrett(1984), Biochem.J., 223, pag. 8188, utilizând un procedeu în multe trepte, pe scară mică, în care se include printre altele o treaptă de cromatografie cu schimb cationic. Dacă acest material rezultă cu o activitate specifică mare, el se obține însă cu randamente foarte mici și procedeul nu este corespunzător pentru a se aplica pe scară industrială. Buttle și alții au constatat apoi, Biochem.J. (Iulie 1989) 261, pag. 469479, că acest material este contaminat cu o proteinază recent izolată și caracterizată, proteinaza papaia IV, care este co-eluată cu chimipapaina din rășinile schimbătoare de cationi. Cromatografia cu schimb cationic nu poate să separe chimipapaina de proteinaza papaia IV într-o asemenea măsură încât să fie utilă la prepararea chimopapainei substanțial lipsită de contaminarea cu proteinază papaia IV.

Literatura de specialitate conține de asemenea referințe la metode care întrebuințează etapele de cromatografie de afinitate. Polgar (1981), Biochem. Biophys. Acta, 658, pag 262-269, descrie purificarea chimipapainei utilizând, printre un număr de alte tehnici, cromatografia de afinitate pe o coloană de agaroză cu mercur iar Dubois și alții, Biol. Chem. Hoppe-Seyler [1988], 369, pag. 733-740 au prezentat separarea cisteinproteinazelor din latexul de Carica papaya folosind o tehnică asemănătoare. Acest tip de cromatografie de afinitate se bazează pe interacțiunea dintre liganzii mercurici fixați pe o matrice inertă și grupele tiolice ale proteinelor expuse la aceștia. Astfel, alte proteine decât chimopapaina, în special alte cisteinproteinaze cum este proteinaza papaia IV, se pot lega de astfel de coloane și pot apoi să fie co-eluate cu chimopapaina.

Recent, lucrările științifice au descris utilizarea cromatografiei de afinitate folosind derivați de peptide imobilizați pentru a purifica proteinazele specifice cum este catepsina umană B (Rich și alții, 1986, Biochem.J. 235, pag 731734) și histolizina din Entamoeba histolytica (Luaces & Barrett, 1988, Biochem.J. 250, 903-909). Această lucrare nu a fost până în prezent aplicată la procedeele de purificare a chimopapainei, de aceea rămâne încă necesitatea de a avea un procedeu îmbunătățit de purificare a chimopapainei care să se poată aplica la scară industrială.

Anumiți derivați de peptide sintetice care sunt inhibitori ai serinchimo/ tripsinproteinazei au fost descriși în WO 84/00365.

Procedeul conform invenției înlătură dezavantajele menționate prin aceea că el cuprinde:

a) incubarea unei soluții apoase de chimopapaină brută cu o matrice cromatografică cu afinitate direcționată spre o poziție activă care cuprinde o matrice suport cuplată covalent, eventual

RO 112032 Bl printr-un braț distanțator, la N-terminal al unei peptide reversibile inhibitoare de chimopapaină, în care aminoacidul C-terminal al respectivei peptide este un derivat de fenilalanină, alanină, ciclohexilalanină sau leucină și respectiva peptidă fiind capabilă să se lege la poziția activă a chimopapainei mai puternic decât la poziția activă a PPIV astfel că respectiva peptidă se leagă la poziția activă a moleculei de chimopapaină; și

b] eluarea chimopapainei cu un eluent adecvat.

într-o altă variantă, conform invenției, purificarea chimopapainei se desfășoară în următoarele etape:

a) precipitarea unui amestec apos conținând chimopapaină brută la un pH de la 1,2 la 1,8;

b) separarea unei soluții apoase de chimopapaină brută din amestecul respectiv; și

c) neutralizarea și eventual desalinizarea soluției de chimopapaină brută.

în conformitate cu o altă variantă a invenției, procedeul de purificare a chimopapainei constă în:

a) precipitarea unui amestec conținând chimopapaină brută la un pH mai mic de 2,0;

b) sepaparea unei soluții apoase de chimopapaină brută din respectivul amestec;

c) neutralizarea și eventual desalinizarea respectivei soluții de chimopapaină brută;

d) incubarea soluției obținute în etapa c) cu o matrice cromatografică cu afinitate direcționată la o poziție activă conținând o matrice suport cuplată covalent, eventual printr-un braț distanțator la N-terminal al unei peptide reversibile inhibitoare de chimopapaină în care aminoacidul cu C-terminal al respectivei peptide este un derivat de fenilalanină, alanină, ciclohexilalanină sau leucină și respectiva peptidă fiind capabilă să se lege la poziția activă a moleculei de chimopapaină; și

e) eluarea chimopapainei cu un eluent adecvat.

Prezenta invenție dezvăluie un procedeu nou de purificare și izolare de chimopapaină foarte activă, lipsită de contaminanți și, în particular, lipsită de alte cisteinproteinaze prezente în latexul de papaia, inclusiv proteinaza papaia IV.

Prin prezenta invenție se obține chimopapaină care este substanțial pură și care conține o proporție mare de formă activă a enzimei.

Chimopapaina din prezenta invenție este substanțial lipsită de proteinaze distincte imunologic ce se găsesc în latexul de papaia, și anume papaina, proteinaza papaia III [PPIII], ambele descrise de Buttle și Barrett (1984), Biochem.J., 223, pag. 81-88 și în special recent descoperita proteinază papaia IV (PPIV). Cuvintele “substanțaial pură” utilizate aici pot din acest motiv să fie definite și ca “substanțial imunologic pură” și se referă la absența oricărei reacții secundare importante între chimopapaina din prezenta invenție și anticorpii specifici crescuți contra PPIV pură, izolați și caracterizați de Buttle și alții, Biochem.J., [iulie 1989], 261, pag. 469-476 și descriși pe scurt aici, precum și la absența oricărei reacții secundare importante cu anticorpii specifici crescuți contra papainei și PPIII cum s-a descris anterior de Buttle și Barrett (1989), Este de reținut în mod special că așa numita chimopapaină “pură” preparată prin metoda lui Buttle și Barrett s-a constatat că conține cantități mari (circa 14 %) de PPIV și deci preparatul anticorpului anti-chimopapaină inițial produs de ei are specificitatea atât pentru chimopapaină purificată conform acestei invenții cât și pentru PPIV purificată. Chimopapaina din prezenta invenție conține mai puțin de 0,2 %, de preferință nu mai mult de 0,1 % din fiecare dintre PPIV, PPIII și papaină.

Reacția secundară dintre antigen și anticorp poate fi determinată prin tehnici convenționale bine cunoscute în domeniu. Printre aceste tehnici sunt, de exemplu, imunoelectroforeza cu rachetă topită și dubla imunodifuzie (descrisă de Buttle și Barrett (1984), imunoanaliza radială singură, radioimunoanaliza (RIA)

RO 112032 Bl și analiza cu imunoabsorbant legat de enzimă (ELISA).

Cantitatea de enzimă activă prezentă în orice preparat de enzimă este în general indicată în termenii ce redau activitatea sa specifică față de un substrat menționat, în condiții de analiză stabilite. Expresia “activitatea specifică față de ΒΑΡΝΑ” care se utilizează aici arată activitatea proteinazei în picomoli de pnitroanilină formată pe secundă pe mg greutate uscată pe produs (pmol/ sec/ mg) când se face analiza cu un substrat sintetic N- -benzoil-DL-arginin-p-nitroanilidă (ΒΑΡΝΑ) în condiții de testare standard. Condițiile de testare standard utilizate pentru preparatele farmaceutice cunoscute ale chimopapainei sunt descrise în detaliu în continuare ca “Metoda de analiză ΒΑΡΝΑ nr. 1 sau “analiza Smith” și activitățile specifice derivate din aceasta sunt prezentate în termeni de activitate specifică contra ΒΑΡΝΑ (1 mM] la 37°C și pH 6,0. Chimopapaina din prezenta invenție este definită ca având o activitate specifică contra ΒΑΡΝΑ (1mM) la 37°C pH 6,0 între 800 și 1700 unități per mg, de preferință între 1000 și 1700 unități per mg, de exemplu de 1200 până la 1500 unități per mg, când se face analiza la 37°C și pH 6,0. într-un alt aspect preferat, se obține papaină care are o activitate specifică contra ΒΑΡΝΑ (1 mM) la 37°C și pH 6,0 de cel puțin 1300 unități per mg.

în timp ce activitatea proteinazei este definită foarte pe larg în întreaga literatură referitoare la chimopapaină și alte cisteinproteinaze în legătură cu eliberarea de p-nitroanilină din substratul sintetic ΒΑΡΝΑ, sunt probleme când se face comparație între cifrele activității specifice măsurate. Valorile precise s-au dovedit a fi dependente de o serie de factori corelați în particular de condițiile precise, de exemplu de pH, temperatură, compoziția tamponului și concentrația de substrat folosită în analiză. Chimopapaina preparată de Buttle și Barrett (1984) citat anterior, a fost prezentată în lucrarea lor ca având o activitate specifică față de ΒΑΡΝΑ de 0,154 pmol/minut/mg care reprezintă 2567 pmol/sec/mg. însă, condițiile de încercare utilizate de Buttle și Barrett diferă de cele utilizate pentru tipurile farmaceutice cunoscute de chimopapaină și activitățile specifice nu pot fi comparate direct.

întrucât materialul preparat de Buttle și Barrett se consideră a fi preparatul de chimopapaină având activitatea specifică cea mai mare relatată până acum, lucrările inițiale ale prezentei invenții au fost efectuate utilizând condițiile de încercare specificate în lucrarea lor. Această metodă este denumită aici ca Metoda de analiză ΒΑΡΝΑ nr. 2 și activitățile specifice derivate din ea sunt prezentate în termeni de activitate specifică față de ΒΑΡΝΑ (2,5 mM) la 40°C și pH 6,8 pentru a reieși clar că condițiile de analiză diferă de cele folosite pentru preparatele farmaceutice de chimopapaină. Rezultatele obținute utilizând această analiză s-au dovedit a fi de două până la trei ori mai mari decât cele obținute utilizând metoda de analiză ΒΑΡΝΑ farmaceutică convențională nr. 1, deși este incorect din punct de vedere științific să se aplice un simplu factor de conversie pentru a transforma rezultatele obținute dintr-o metodă de analiză în cele ale alteia. Cu toate acestea, primele lucrări ale acestei invenții au arătat că activitatea specifică față de ΒΑΡΝΑ (2,5 mM) la 40°C și pH 6,8 a chimopapainei conform invenției poate fi definită ca fiind între 3000 și 4500 unități per mg, de exemplu 3500 până la 4500 unități per mg.

Autorii prezentei invenții, într-o lucrare care a fost recent publicată (iulie 1989) și care este descrisă pe scurt aici, au purificat și caracterizat un contaminant anterior necunoscut al chimopapainei preparat prin metodele din stadiul tehnicii, și anume proteinaza papaia IV (PPIV). în timp ce PPIV este inactiv față de ΒΑΡΝΑ, are activitate de proteinază față de azocazeină. în plus, s-a constatat că activitatea PPIV față de azocazeină nu este inhibată substanțial de concentra

RO 112032 Bl țiile de cistatină de pui până la 1 pm. Activitatea față de azocaseină a chimopapainei conform invenției este de cel puțin 95 % inhibată de aceste concentrații de cistatină de pui. Expresia “activitate față de azocazeină” așa cum se folosește aici înseamnă activitatea proteinazei exprimată în cantitatea de peptide solubile în acid tricloracetic formate pe unitatea de timp pe unitatea de greutate uscată de produs când se analizează cu azocazeina ca substrat de proteină derivatizat în condițiile de încercare standard descrise mai jos. De preferință chimopapaina conform invenției are o activitate față de azocazeină care este de cel puțin 97 % mai ales 98 până la 1DO % inhibată de concentrațiile de cistatină de pui până la 1 pm.

Autorii consideră că chimopapaina preparată conform prezentei invenții este chimopapaină substanțial pură preparată pentru prima oară fără proteine contaminante și conținând în mare proporție forma activă a enzimei. Această realizare poate fi atinsă numai pe baza descoperirii că o proteină contaminantă a fost până acum copurificată cu chimopapaina, de exemplu prin schimb ionic și coloane de afinitate cunoscute. Lucrările în continuare au condus la izolarea și caracterizarea contaminantului ca fiind PPIV. Procedeul utilizat pentru prepararea PPIV nu a fost aplicabil la prepararea chimopapainei pure, dar prin prepararea PPIV au ieșit în evidență doi parametri importanți prin care ar putea fi caracterizată chimopapaina pură și anume: 1 ] absența reactivității secundare a chimopapainei pure cu anticorpii specifici PPIV și 2] activitatea diferită a chimopapainei pure de a PPIV față de azocazeină în prezența cistatinei de pui. Aceste două caracteristici au fost elementele esențiale necesare pentru elaborarea procedeelor corespunzătoare de purificare a chimopapainei.

Este ușor de recunoscut faptul că chimopapaina conform invenției va fi chimopapaina de ales în aproape toate domeniile de activitate prevăzute. Preparatele de enzimă pură sunt de importanță vitală pentru cei care încearcă să caracterizeze complet enzimele, de exemplu prin specificitatea lor catalitică și prin structura lor.

Compozițiile care conțin chimopapaină purificată conform invenției prezintă o activitate specifică față de ΒΑΡΝΑ (1mM) la 37°C și pH 6,0 între 800 și 1700 unități per mg. Compozițiile pot fi sub formă de unități distincte cu o greutate corespunzătoare, de exemplu sub formă de părți alicote de chinopapaină izolate în condiții anhidre cum ar fi în fiole sau ampule golite. Aceste compoziții mai pot conține un agent reducător cum este ditiotreitolul, cisteina ca bază liberă sau o sare de adiție cu acizi a acesteia, pentru a împiedica complet inactivarea enzimei prin oxidare. într-o altă variantă, compozițiile mai pot conține un inhibitor reversibil al cisteinproteinazei sub forma unei sări cum ar fi, de exemplu, tetrationatul de sodiu sau clorura mercurică. Acești inhibitori reversibili blochează locurile active ale enzimei în felul acesta împiedicând inactivitatea ei prin oxidare, până ce sunt scoși, de exemplu, printr-un agent reducător care reactivează enzima. Alți aditivi obișnuiți, de exemplu agenți de păstrare, cum este bisulfitul de sodiu, agenți de chelatizare cum este EDTA și suporturi cum este clorura de sodiu, pot fi adăugați dacă se dorește.

Utilizarea unui preparat de enzimă pură este deosebit de importantă în aplicațiile clinice ale chimopapainei, de exemplu chemonucleoliza, observându-se faptul că reacțiile alergice la acest tratament pot apare la 3 % din pacienții tratați. Extractul de papaia pulbere este folosit pe larg în industria alimentară și se consideră că multe dintre reacțiile alergice la chemonucleoliza se datorează presensibilizării cu aceste preparate, însă, este bine cunoscut că injectarea de antigeni de proteină străină la mamifere prezintă un risc de șoc anafilactic. în concordanță cu practica medicală rațională se utilizează cea mai pură și cea mai activă formă din orice asemenea proteină disponibilă pentru a obține efec

RO 112032 Bl tele benefice optime ale procedurii precum și reducerea la minimum a reacțiilor alergice.

Astfel, invenția mai cuprinde o compoziție farmaceutică care conține chimopapaina purificată conform invenției. Compoziția este substanțial lipsită de PPIV.

Chimopapaina are o activitate specifică față de ΒΑΡΝΑ (1 mM] la 37°C și pH 6,0 între 800 și 1700 unități per mg. Compozițiile farmaceutice mai conțin, de preferință, un agent reducător netoxic acceptabil farmaceutic cum ar fi cisteina ca bază liberă sau o sare de adiție cu acizii acesteia, de exemplu clorhidratul monohidrat de L-cisteină. în general agentul reducător este prezent într-o cantitate de aproximativ 0,5 până la 3 mg per 4000 unități chimopapaină, reprezentând de exemplu, 15 până la 90 % în greutate față de papaină. însă compozițiile farmaceutice conform prezentei invenții mai pot conține orice diluant cunoscut acceptabil farmaceutic, excipient sau suport, de exemplu agent de păstrare cum este bisulfitul de sodiu, agent de chelatizare cum este EDTA și suporturi cum este clorură de sodiu, care pot fi adăugate dacă se dorește.

Compozițiile farmaceutice care conțin chimopapaina din prezenta invenție pot fi folositoare în oftalmologie, de exemplu la tratamentul leziunilor ochiului, sau pentru desprinderea țesuturilor uscate de exemplu prin arderi, ulcere, necroze de presiune, răni provocate prin ședere în pat și alte răni în care sunt prezente țesuturi devitalizate. Aceste compoziții sunt în general prezentate sub formă adecvată pentru aplicații topice, de exemplu soluții sterile, geluri, suspensii sau unguente care se pot aplica direct pe rană sau se pot aplica prin intermediul unui bandaj al rănii impregnat cu compoziția respectivă.

De preferință, chimopapaina conform invenției este formulată pentru uzul ortopedic. Aceste compoziții farmaceutice pot fi preparate convenabil sub forma unităților de dozare pentru administrarea parenterală, de exemplu sub for mă de soluție sterilă lipsită de pirogen sau de suspensie într-un suport adecvat, sau sub formă concentrată corespunzătoare pentru a fi reconstituită înainte de folosire. Formele de unități de dozare corespunzătoare pentru utilizarea la dizolvarea sau tratarea nucleului moale al unui disc intervertebral anormal sau bolnav prin injectarea în el pot conține între 500 și 5000 unități ΒΑΡΝΑ (analizate cu 1 mM ΒΑΡΝΑ la’37°C și pH 6,0) de chimopapaină conform invenției și un agent reducător cum ar fi clorhidratul de cisteinat de sodiu, ambalate în fiole vidate. O formă de unitate de dozare preferată conține concret 2000 sau 4000 unități ΒΑΡΝΑ (1mM ΒΑΡΝΑ, 37°C, pH 6,0) de chimopapaină. O formă de unitate de dozare poate în mare să conțină, de exemplu, 2 până la 5 mg, de preferință 2,5 până la 3,5 mg chimopapaină și 0,2 până la 3 mg, de preferință 1,0 până la 2,0 mg clorhidrat de cisteinat de sodiu ambalate într-un container vidat, eventual în amestec cu un suport adecvat cum este clorură de sodiu.

în experimentele descrise în continuare s-a constatat că 26 de probe de ser individuale au anticorpi IgE dobândiți natural față de un preparat de chimopapaină existent în comerț, Chymodiactin⁰, produs conform cu procedeul descris în brevetul GB nr. 2.098.997. S-a demonstrat pe cale experimentală că aceste seruri conțin anticorpi IgE la chimopapaină conform prezentei invenții și la alte trei cisteinproteinaze existente în latexul de papaia, și anume papaina, PPIII și PPIV. însă, cantitățile medii de IgE pentru chimopapaină, PPIII și PPIV au arătat că PPIII și PPIV împreună corespund la aproape 75 % din IgE detectată. Aceste rezultate arată clar că aceste proteine au un caracter practic imunogen și pot reprezenta o proporție majoră a determinanților antigenici conținuți în formele disponibile până acum de chimopapaină și produc un risc antigenic potențial surprinzător de mare. Astfel compozițiile farmaceutice ale prezentei invenții au avantaje mari față de compozițiile din

RO 112032 Bl stadiul tehnicii

Metoda, conform invenției, pentru tratarea discurilor spinale anormale la un mamifer, constă în:

i) introducerea unui ac în acel disc;

ii) confirmarea așezării acului cu ajutorul razelor X;

iii) injectarea în acel disc a unei soluții acceptabile farmaceutic de chimopapaină conform invenției într-o cantitate suficientă pentru a dizolva selectiv porțiuni din acel disc.

Chimopapaina brută utilizată ca materie primă pentru purificarea chimopapainei conform invenției poate fi un extract de latex de papaia propaspăt, o soluție obținută dintr-un preparat existent în comerț de latex uscat prin pulverizare, concentrat de papaină sau chimopapaină parțial purificată, sau poate fi o soluție de preparat comercial de așa numită chimopapaină “pură”. însă, specialiștii în acest domeniu vor aprecia că extractele relativ complete de papaia, cum este talexul de papaia, vor conține cantități foarte mari de alte componente existente natural care este de dorit să fie înlăturate. De preferință o mare proporție din aceste componente este înlăturată înainte ca chimopapaina brută în soluție să fie incubată cu matricea cromatografică de afinitate de exemplu prin filtrare sau centifugare pentru a îndepărta materialul insolubil. însă, autorii au găsit că o etapă de precipitare acidă, în cursul căreia sunt precipitate o mare parte din impurități, prezintă un avantaj deosebit.

Procedeele de precipitare acidă în care pH-ul soluției apoase de chimopapaină brută este redus la pH 2, soluția de chimopapaină se lasă să stea și apoi se separă, s-au întrebuințat pentru purificarea chimopapainei timp de aproape 50 de ani. în mod surprinzător autorii au arătat că pH-ul precis utilizat în asemenea procedee influențează foarte mult contaminarea soluției de chimopapaină obținute cu PPIV. Controlarea și conducerea cu grijă a acestui procedeu, până acum considerat a fi o etapă preliminară brută în purificarea chimopapainei s-a constatat că reduce foarte mult contaminarea cu PPIV, proteina despre care s-a aflat acum că se copurifică cu chimopapaina utilizând tehnicile convenționale. Ca urmare, un procedeu de purificare conform invenției prevede următoarele faze:

1. Precipitarea unui amestec apos care conține chimopapaină brută la un pH de 1,2 până la 1,8;

2. Separarea unei soluții apoase de chimopapaină brută din acest amestec; și

3. Neutralizarea și eventual desalifierea acestei soluții de chimoapapaină brută.

Este preferabil să se îndepărteze orice contaminanți de proteină rămași de la precipitare prin includerea a cel puțin unei etape convenționale de cromatografie cu schimb cationic în timpul procesului de purificare, de exemplu, așa cum au descris Buttle și Barrett, 1984, menționat mai sus. Este deosebit de preferabil să se întrebuințeze cromatografia de înaltă performanță, de exemplu FPLC^r pe o rășină schimbătoare de cationi cum sunt cele disponibile sub numele comercial Mono-S sau SSepharose^R HP (Pharmacia), ca etapă finală.

Astfel, într-o altă variantă, conform invenției, după faza 3, de neutralizare și eventual desalifizare a soluției de chimopapaină brută, se includ următoarele faze:

4. Incubarea soluției obținute în etapa 3 cu o matrice de cromatografie de afinitate îndreptată spre un loc activ care cuprinde o matrice suport legată covalent, eventual prin intermediul unui braț de distanțare, de un azot terminal al unei peptide reversibile inhibitoare de chimopapaină, astfel încât peptida să se lege de locul activ al moleculei de chimopapaină; și

5. Eluarea chimoapapainei cu un element adecvat.

Este evident pentru specialiștii în acest domeniu că etapa de cromatografie cu schimb cationic preferată poate

RO 112032 Bl fi întrebuințată imediat înainte sau după etapa de cromatografie de afinitate, în locul acesteia sau în plus de aceasta, după dorință.

Amestecul apos care conține chimopapaina brută poate să fie de exemplu latex de papaia proaspăt, latex de papaia uscat prin pulverizare sau concentrat de papaia (de exemplu latexul uscat prin pulverizare din comerț de la firma Powel & Schelefield, Marea Britanie sau de la Siebels SUA) suspendat în apă sau într-un tampon apos cum este un tampon fosfat sau acetat. De preferință materialul insolubil este îndepărtat în mod obișnuit, de exemplu prin filtrare sau centrifugare, înainte de precipitarea acidă a amestecului. Amestecul poate fi acidulat prin adăugarea treptată a unui acid organic sau anorganic de preferință un acid anorganic în apă cum ar fi acidul clorhidric, pentru a reduce pH-ul amestecului la o valoare între 1,0 și 2,0, de preferință între 1,2 și 1,8, preferabil la un pH de aproximativ 1,5. Materialul precipitat se poate îndepărta în mod cunoscut, de exemplu prin filtrare sau centrifugare. Soluția de chimopapaină brută acidă obținută se constată că este golită de PPIV, papaină și, în mai mică măsură, de PPIII.

înainte de a supune soluția de chimopapaină brută acidă la orice etapă de cromatografiere, specialiștii în acest domeniu vor aprecia necesitatea neutralizării acestei soluții cu un reactiv alcalin cum este soluția apoasă de hidroxid de sodiu și de preferință necesitatea îndepărtării sărurilor în exces din soluție în mod cunoscut, de exemplu prin filtrare pe gel sau dializă. Orice material precipitat rămas în continuare se poate îndepărta prin filtrare sau centrifugare.

Este binecunoscut în domeniul cisteinproteinazelor că activitatea acestor enzime poate fi mărită considerabil prin activare cu un agent reducător cum este ditiotreitolul sau cisteina și prin îndepărtarea urmelor de metale grele cum este mercurul, cu un agent de o chelatizare ca EDTA sau o rășină de chelatizare cum este cea cu denumirea comercială

Chelex (Bio-Rad, Marea Britanie). Aceste măsuri optimizează prezența grupelor tiol libere despre care se știe că sunt elementele esențiale ale locurilor active ale cisteinproteinazelor și sunt necesare pentru activitate. îndepărtarea metalelor grele se realizează de preferință prin dializă folosind un tampon care conține EDTA. Alt mod de lucru este ca, dacă se folosește etapa de cromatografie cu schimbători de cationi, metalele grele să se îndepărteze prin activarea chimopapainei cu un agent reducător în timp ce este legată de coloana de schimbători de cationi și după aceea să se spele coloana.

Soluția de chimopapaină brută obținută după neutralizare este în mod avantajos tratată cu un agent reducător cum este cisteina, pentru a asigura expunerea maximă a locurilor active și este diluată până la un conținut de proteină corespunzător, de exemplu 30 mg/ml. Soluția de chimopapaină brută neutralizată este apoi incubată cu o matrice cromatografică de afinitate îndreptată spre un loc activ astfel încât chimopapaina este legată spcific, prin locul activ, de o peptidă inhibitoare. Soluția de chimoapapină se poate aplica pe o coloană de matrice cromatografică de afinitate cu o viteză, de exemplu de 35-40 ml/oră/cm². Aproximativ 1-4 g chimopapaină se pot lega per litru matrice cromatografică de afinitate. Matricea cromatografică de afinitate este o matrice suport cum ar fi un gel sau o matrice membrană de care este cuplată covalent o peptidă inhibitoare și deci este imobilizată. De preferință matricea suport este un gel de agaroză, cum sunt cele existente sub denumirea comercială Sepharose² (Pharmacia], deși se pot utiliza și matricele membrane celulozice derivatizate cum sunt cele existente sub denumirea comercială Zeta (Anachem). Terminația cu azot a peptidei se poate lega de matricea suport fie direct, fie indirect printr-un braț de distanțare, de exemplu un braț cu nouă atomi de carbon ca cel dat de o matrice gel preferată existentă sub denumirea comercială ECH

RO 112032 Bl

Sepharose^R 4B (Pharmacia). Cuplarea între între grupele carboxil libere ale acestei matrice gel și grupele amino libere ale peptidei inhibitoare, care conduce la formarea legăturii peptidice, se poate realiza prin procedee cunoscute, de exemplu prin condensarea catalizată acid, stimulată cu o carbodiimidă solubilă în apă cum este clorhidratul de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil]-carbodiimida (EDC). în general cuplarea se realizează prin agitarea ușoară a matricei gel și a soluției de peptidă inhibitoare împreună și în prezența EDC, de exemplu la temperatura camerei timp de 24 ore. Un raport de cuplare corespunzător între peptidă și matricea gel este, de exemplu, 3-4 g peptidă per litru gel.

Matricea cromatografică de afinitate poate fi preambalată într-o coloană înainte de utilizare. însă, dacă matricea cromatografică utilizată este o matrice gel, este de asemenea posibil să se utilizeze o etapă de incubare de tip șarjă și apoi, dacă se dorește, să se introducă matricea într-o coloană pentru eluarea ulterioară a enzimei. De preferință matricea este spălată bine cu tampon apos înainte de utilizare pentru a îndepărta urmele de peptidă nelegată și de catalizator de condensare. Pentru utilizarea în producție, o coloană cu matrice cromatografică de afinitate trebuie de preferință să reziste sanitației in situ, de exemplu cu etanol apos pentru a fi reutilizabilă.

Peptidele reversibile inhibitoare de chimopapaină sunt peptidele care, când se imobilizează pe o matrice suport, sunt capabile să se lege de locul activ al chimopapainei mai puternic decât de locurile active ale altor cisteinproteinaze existente în preparatele de chimopapaină brută, în special PPIV, dar care pot după aceea să se desprindă de acolo. într-o grupă preferată de peptide inhibitoare carbonul terminal de aminoacid conține un derivat de aldehidă cum este o semicarbazonă, o metoxiimină sau o enzimă de fenilalanină sau un analog de fenilalanină. Mai corect, aminoacidul C-terminal poate fi un derivat de fenilalanină cum este D sau L-fenilalaninsemicarbazona (LeuSc). Următoarele dipeptide Cterminale s-a constatat că sunt avantajoase ca peptide inhibitoare de chimopapaină: L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, LPhe-D-PheSc, L-Phe-L-PheSc, L-Phe-LPheMe, L-Phe-L-PheOx, L-Tyr-L-PheSc și L-Ala-L-LeuSc. Dipeptida L-Phe-L-PheSc a fost descrisă de Luaces și Barrett (1988) 250, pag. 9D3-9O9. Peptidele deosebit de preferate sunt dipeptidele, în special L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc și LPhe-D-PheSc.

înainte de eluarea chimopapainei din matricea cromatografică de afinitate, este de preferat să se spele matricea pentru a îndepărta materialul legat nespecific, de exemplu cu un tampon apos cum este tamponul citrat sau acetat cu pH 4 până la 5. S-a constatat că este deosebit de avantajos să se adauge reactivi tamponului de spălare și tamponului de eluare care să reducă interacțiunile hidrofobe și alte reacții de legare nespecifice între matrice și componentele chimopapainei brute. Printre acești reactivi sunt de exemplu EDTA, izopropanolul și etandiolul.

Apoi chimopapaina poate fi eluată de pe matrice cu un eluent corespunzător. Eluenții corespunzători rup legătura dintre peptidă inhibitoare imobilizată și chimoipapaina legată de aceasta, fie prin reducerea afinității locului activ pentru peptide inhibitoare, fie prin desprinderea selectivă a peptidei de pe locul activ. Afinitatea chimopapainei pentru peptidă inhibitoare se poate reduce, de exemplu, prin alterarea caracteristicilor locului activ cu un agent de denaturare cum este izopropanolul sau cu un eluant care are un pH mai mare sau mai mic decât intervalul de pH activ al chimopapainei. Dar este de la sine înțeles pentru specialiști că acești eluenți trebuie să fie astfel încât să nu se producă inactivarea ireversibilă a enzimei eluate. Lucrând în alt mod, chimopapaina paote fi desprinsă selectiv de pe peptidă inhibitoare imobilizată de către un eluent care conține în exces o componentă ce se leagă strâns de peptidă inhibitoare, de exemplu o altă

RO 112032 Bl cisteinproteinază.

Totuși, într-o realizare preferată a prezentei invenții, eluantul conține un inhibitor reversibil al cisteinproteinazei care se leagă competitiv de locul activ al chimopapainei și astfel o desprinde de peptida inhibitoare imobilizată. Ca inhibitori cunoscuți sunt, de exemplu, disulfurile cu greutate moleculară mică, cum sunt 2,2'-dipiridildisulfura, hidroxietildisulfura, metil-2-piridildisulfura și tetrationatul de sodiu și reactivii cu mercur cum sunt clorură mercurică, p-clormercurbenzoatul și mersalilul. Este de la sine înțeles pentru specialiști că afinitatea dintre chimopapaină și peptida inhibitoare imobilizată va diferi în funcție de peptida anumită utilizată, de pH, de rezistența ionică a compoziției tamponului de eluare și de temperatură, întrebuințate. Ca urmare, natura și concentrația precisă a inhibitorului proteinazei necesare pentru eluarea chimopapainei vor fi de asemenea variabile. în plus, reactivii cu mercur în general se echilibrează cu chimopapapina legată mai repede decât reactivii disulfuri și eluarea continuă se poate întrebuința în cazul acestora inhibitori. Inhibitorii care se echilibrează lent cu chimopapaina legată pot necesita incubarea matricei cu inhibitorul, de exemplu timp de 1-2 ore sau mai mult, înaintea eluării chimopapainei. însă, conținutul de proteină și activitatea proteinazică a fracțiilor eluate pot fi controlate în mod uzual și rezistența ionică sau natura eluantului și timpul de incubare a matricei cu inhibitorul pot varia în scopul de a desprinde efectiv și selelctiv chimopapaina de pe matrice. După aceea se pot descărca fracțiile eluate care conțin cantități mici de proteină sau cantități mici de chimopapaină după activitate.

pH-ul eluantului este de preferință suficient de mic pentru a slăbi interacțiunea dintre chimopapaină și peptida inhibitoare, de exemplu pH 4 până la 5, mai special pH 4,5. Ca eluanți corespunzători s-au dovedit a fi, de exemplu, hidroxietildisulfura (100 mM) în etandiol apos (33 %) care conține citrat de sodiu (50 mM) și EDTA (1 mM), cu pH 4,5; dipiridildisulfura (30 mM) în etandiol apos (33 %) care conține citrat de sodiu (50 mM) și EDTA (1 mM), pH 4,5; metilpiridildisulfura (30 mM) în etandiol apos (33 %) care conține citrat de sodiu (50 mM) și EDTA (1 mM), pH 4,5; acid mersalil (10 mM) în etandiol apos (33 %) care conține hidroxid de sodiu (50 mM) și EDTA (25 mM) ajustat la pH 4,5 cu acid acetic; precum și clorură mercurică (10 mM) în etandiol apos (33 %) care conține acetat de sodiu (50 mM), pH 4,5. Clorură mercurică este un inhibitor reversibil de cisteinproteinază deosebit de preferat.

Etapa de cromatografiere de afinitate în procedeul conform invenției mărește considerabil activitatea specifică a chimopapainei purificate astfel, măsurată prin activitatea față de ΒΑΡΝΑ sau prin titrarea locului activ cu E-64 sau acid iodacetic. Forma activă a chimopapainei este legată preferențial și se eluează și astfel se distinge de formele inactive de chimopapaină și de alte cisteinproteinaze prezente în preparatul brut. Chimopapaina preparată proaspăt conform cu această invenție, purificată prin cromatografie de afinitate conține în general cel puțin 70 %, de preferință cel puțin 80 %, mai specific cel puțin 90 % enzimă activă.

în general, chimopapaina purificată este recuperată din eluat înainte de depozitare sau utilizare. Chimopapaina eluată este de preferință purificată în continuare pentru a îndepărta inhibitorul cisteinproteinază din locul activ al enzimei. Inhibitorul poate fi desprins prin adăugarea unui agent reducător în exces cum ar fi cisteina și eventual, dacă se dorește, îndepărtarea inhibitorului desprins utilizând tehnici cunoscute cum este filtrarea pe gel sau dializa.Lucrând în alt mod, inhibitorul poate fi îndepărtat prin absorbție pe o rășină specifică, de exemplu disulfurile cu greutate moleculară mică pot fi absorbite pe o coloană de afinitate cu glutationă și reactivii mercurici pot fi absorbiți pe o rășină de chelatizare. De preferință, inhibitorul este în

RO 112032 Bl depărtat prin activarea enzimei cu un agent reducător cum este cisteina în timp ce este legat de o coloană cu schimbătorii de cationi și după aceea spălat pentru a scoate inhibitorul din coloană. Chimopapaina purificată recuperată este de preferință liofilizată înainte de depozitare, de exemplu, prin înghețare.

Chimopapaina conform cu prezenta invenție poate fi caracterizată în continuare prin metodele cunoscute în acest domeniu. Printre aceste metode sunt, de exemplu, analiza aminoacidului N-terminal, titrarea locului activ cu E-64 sau acid iodacetic și vitezele de inactivarea cu acesta, dodecilsulfatul de sodiu sau electroforeza multizonală catodică cu gel de poliacrilamidă și activitatea față de diferite substraturi de proteinază.

Noile peptide inhibitoare, conform cu prezenta invenție se pot prepara în manieră analogă cu metodele cunoscute în domeniul acesteia. De exemplu derivații de dipeptidă se pot sintetiza într-o serie de etape după cum urmează:

a) carbonul terminal al aminoacidului care se intenționează să formeze carbonul terminal al peptidei inhibitoare (primul aminoacid) se poate proteja, de exemplu, prin reacție cu clorhidrat de Q,N-dimetilhidroxilamină în prezența cloroformiatului de izobutil și a N-metilmorfolinei pentru a da un derivat dimetilhidroxilamido. De preferință azotul terminal al primului aminoacid este inițial protejat, de exemplu cu grupa ter-butoxicarbonil.

b) Primul aminoacid protejat, de exemplu un derivat dimetilhidroxiamido, poate să reacționeze apoi cu un acid puternic, de exemplu cu acid trifluoracetic, pentru a forma o sare de amoniu cuaternară.

c) Sarea de amoniu cuaternară a primului aminoacid protejat poate apoi să reacționeze cu al doilea derivat de aminoacid, de exemplu cu un derivat Ncarbobenzoxi, pentru a forma derivatul dipeptidic.

d) Derivatul dipeptidic format mai sus se poate reduce cu un agent reducător blând, de exemplu hidrură de diizobutaluminiu sau hidrură de litiualuminiu pentru a produce o grupă de aldehidă liberă la carbonul terminal al dipeptidei.

e) Aldehidă formată mai sus poate fi transformată de exemplu la o semicarbazonă prin reacție cu semicarbazida, la o metoxiimină prin reacție cu clorhidrat de metoxiamină sau la o oximă prin reacție cu hidroxilamină.

f] în final, azotul terminal protejat poate fi deprotejat, de exemplu o grupă N-carbobenzoxi poate fi îndepărtată prin reducere catalitică utilizând paladiu 10 % pe cărbune.

Procedeul, conform invenției, prezintă avantaje prin faptul că chimopapaina rezultată este substanțial imunologic pură, fără proteine contaminante, conținând în mare proporție forma activă a enzimei.

Se dau, în continuare, exemple de realizare a procedeului conform invenției, prezentându-se în prealabil metodele analitice utilizate.

Determinarea proteinei.

Acolo unde este posibil, concentrația proteinei se determină prin A_28O folosind A₂₈₀; 1 % = 20,0 pentru preparatele de latex de papaia și A_28O, 1% = 18,3 pentru preparatele de chimopapaină purificate sau parțial purificate (Robinson, 1975], Biochemistry 14, pag. 3695-3700]. Anumiți reactivi care conțin grupe tiol și disulfuri tind să absoarbă la 280 nm. Când aceștia sunt prezenți, analiza Bio-Rad cu legarea colorantului (Bio-Rad Laboratories, Marea Britanie) se utilizează pentru determinarea concentrației de proteină. Drept standard se folosesc soluții de latex de papaia filtrate și uscate prin pulverizare (A_28Q 1 % = 20,0). Această metodă este mai puțin înclinată spre interferență decât A_28O în preparatele de enzimă purificate proteina se estimează prin greutatea totală uscată a produsului.

Determinarea activității chimopapainei.

RO 112032 Bl

a) Activitatea față de ΒΑΡΝΑ (metoda de analiză nr. 1) - analiza Smith.

Fiecare probă se adaugă la “tampon 1, soluție apoasă de tampon de fosfat de sodiu (0,1 M), pH 6,0 care conține EDTA ( 1mM) și clorhidrat de cisteină monohidrat (10 mM), până la un volum final de 1,0 ml. Enzima (dacă este prezentă în probă) se lasă să se activeze timp de 5 min la 37°C înainte de a începe reacția prin adăugarea a 4 ml N-abenzoil-DL-arginin-p-nitroanilidă (ΒΑΡΝΑ) (1,25 mM] ca soluție substrat care a fost întâi preîncălzită la 37°C.

De reținut că soluția substrat se prepară prin dizolvarea a 300 mg ΒΑΡΝΑ în dimetilsulfoxid cald, adăugând soluția încet la 450 ml tampon 1 preîncălzit la 37°C și apoi aducând la 500 ml tot cu tampon 1. Soluția substrat se menține la peste 30°C pentru a evita precipitarea ΒΑΡΝΑ.

Incubarea la 37°C se continuă timp de 30 min și apoi se întrerupe reacția prin adăugarea a 1 ml acid acetic (4 N). Se măsoară eliberarea 4-nitroanilinei prin măsurarea Δ A₄₁₀ . O unitate de activitate corespunde la eliberarea a 1 picomol de 4-nitroanilină (e = 8800 M’ ¹. cm’¹) pe secundă în aceste condiții.

Aceste condiții de analiză corespund celor prezentate în brevetul GB 2.098.997 cu titular Smith Laboratories Inc. și se utilizează pentru încercarea preparatelor farmaceutice de chimopapaină ce se comercializează în întreaga lume, de exemplu chimopapaina vândută sub numele comercial Chymediactin de firma The Boots Company PLC, Marea Britanie și chimopapaina vândută sub numele comercial Disken de firma Sinpsong în Coreea de Sud. Aceste unități de activitate sunt recunoscute internațional și sunt recunoscute internațional și sunt denumite de obicei “Unități de analiză Smith ΒΑΡΝΑ”.

b) Activitatea față de ΒΑΡΝΑ (metoda de analiză 2],

Fiecare probă se adaugă la soluția apoasă tampon de fosfat de sodiu (0,10 M), pH 6,8, care conține EDTA (1 mM) și fie ditiotreitol (2 mM] fie cisteină (4 mM] până la un volum final de 0,975 ml Enzima (dacă este prezentă în probă] se lasă să se activeze timp de 5 min la 40°C înainte de reacția care începe prin adăugarea a 25 pl N-a-benzoil-DL-argininp-nitroanilidă (ΒΑΡΝΑ) (100 mM] în dimetilsulfoxid. Incubarea la 40°C se continuă timp de 10 min și apoi se oprește reacția prin adăugarea a 1 ml soluție apoasă de cloracetat de sodiu (0,10 M]/acetat de sodiu (0,20 M] ca tampon, pH 4,3. Se determină eliberarea de 4-nitroanilină prin măsurarea Δ A₄₁₀. O unitate de activitate corespunde la eliberarea a un picomol de 4-nitroanilină (e = 8800 M'¹ . cm’¹] pe secundă în aceste condiții.

Aceste condiții de analiză corespund exact celor descrise de Buttle și Barrett (1984] în materialul citat mai sus și se folosește în experimentele preliminare descrise în exemplele 21, 23 și 26.

Valorile absolute obținute pentru activitatea chimopapainei utilizând metoda de analiză ΒΑΡΝΑ nr. 1 și 2 diferă, valorile obținute prin metoda nr. 2 fiind aproximativ 2 până la 3 ori mai mari decât valorile obținute prin metoda nr. 1 (vezi exemplul 31).

c] Titrarea locului activ cu acid iodacetic.

Titrarea locului activ al chimopapainei cu acidul iodacetic se efectuează în mod asemănător cu tirarea locului activ cu E-64 descrisă de Zucker și alții în Biochim. Biophys. Acta 828, (1985), pag 196-204. Soluția de chimopapaină se diluează în pampon 1 cum s-a descris la punctul (a) de mai sus pentru a da o soluție ce conține 60 pM proteină (e₂₈₀ = 4,3284 x lO^M^cm’¹ calculat din A₂₈n 1 % =18,3, Robinson (1975) menționat mai sus și greutatea moleculară = 23656 calculată din secvența de aminoacid de Jaquet și alții (mai 1989] Biol.Chem. Hoppe-seyler, 370, pag. 425-434), 20 pl părți alicote de soluție de chimopapaină se așează în tuburile de titrare și se incubează timp de 5 min la 37°C cu 20 pl tampon 1 (40 pl în proba martor). Se adaugă 20 pl soluție apoasă

RO 112032 Bl de acid iodacetic (10, 20, 30, 40, 50 și respectiv 60 pM) la fiecare tub de titrare și amestecul se preinoculează timp de 10-20 min la 37°C. Reacția începe prin adăugarea a 4 ml de ΒΑΡΝΑ ca soluție substrat așa cum s-a descris la punctul (a) de mai sus, care a fost preîncălzită la 37°C. Incubarea se continuă la 37°C și reacția se oprește după 30 min așa cum s-a descris la punctul (a) de mai sus și se determină eliberarea de 4-nitroanilină prin Δ A_41O. Concentrația molară a chimopapainei active astfel obținută este comparată cu concentrația molară a proteinei pe baza unui coeficient molar de extincție de 4,3284 x IC^M^crrî¹ pentru chimopapaină. Cantitatea de proteină activă este exprimată apoi ca procente din totalul proteinei.

D] Activitatea față de azocazeină.

Activitatea față de azocazeină se determină prin metoda descrisă anterior de Rowan și alții (1988), Arch. Biochem. Biophys. 267, pag. 262-270) folosind mai puțin de 1 pM enzimă (raportat la o greutate moleculară de 24.000) și, dacă se dorește, 1 pm de cistatină de pui. Toate concentrațiile enzimelor și inhibitorului se referă la concentrația moleculelor active.

Analiza imunologică prin imunodifuzia radiată unică.

Analizele de imunodifuzie radială unică se bazează pe metoda lui Mancini și alții, 1965, Immunchem 2, pag. 235254 după cum urmează. Agaroză (1 % greutate/volum) în fosfat de sodiu apos (10 mM) care conține NaCI (0,14 M). pH 7,3 conținând un preparat TgG monospecific, se toarnă pe Gel Bond^R (FMC Corporation, Mâine, SUA) și se taie o rețea de celule rectangulare (r=1 mm] la distanță de 1,5 cm. Martorii și probe necunoscute se distribuie la întâmplare printre aceste celule pentru a reduce la minimum erorile datorate efectelor de margine. După ce se aplică antigenul în celule, plăcile se lasă timp de 24 ore pentru ca inelele care precipită să se dezvolte. Apoi se spală, se usucă și se păstrează. Antigenul carbonimetilat pur, blând, se folosește pentru a genera curbele standard, care se trasează ca antigen față de pătratul diametrului cercului. Intervalul util pentru analiză este la 25-300 ng antigen per celulă.

Prepararea PPIV și a anticorpilor săi.

a] Prepararea coloanei de afinitate.

Esterbutiloxicarbonil-L-Phe-P-nitrofenilic (10 mmol) se adaugă la un amestec sub agitare de a-NH_aCH_aCN.HCI (20 mmoli) și diizopropiletilamină (20 mmoli] în dimetilformamidă (20 ml). Amestecul se agită la 20°C timp de 2 ore și apoi se diluează cu acetat de etil (100 ml], se spală cu apă (2 x), trietilamină în apă (5 x], apă (3 x) bisulfat de potasiu în apă (2 x], apă (3 x], se usucă și se evaporă. Reziduul se cristalizează din acetat de etil: hexan pentru a da Boc-L-PheNHCH₂CN cu punct de topire 134,5 ... 135°C.

Soluție apoasă de acid trifluoracetic răcită cu gheață (10 ml) se adaugă la o soluție de Boc-L-Phe-NHCH₂CN (5 mmoli] în diclormetan (10 ml). Amestecul de reacție se incubează la 20°C timp de 30 min și apoi solventul se îndepărtează prin evaporare la 40°C. Reziduul se dizolvă în cloroform, se evaporă și procedeul se repetă de două ori. Sarea trifluoracetat brută obținută se dizolvă într-o soluție de diizopropiletilamină (7,5 mmoli] în dimetilformamidă (10 ml) și Boc-Gly-p-nitrofenilester (6,25 mmoli) și monohidratde N-hidroxibenztriazol (6,25 mmoli] se adaugă apoi. După aceea se adaugă în picături suficientă diizopropiletilamină pentru a genera p-nitrofenol (culoare aurie] și amestecul se agită la temperatura camerei timp de 2 ore. Se adaugă N,N-dietiletilendiamină (1,5 ml) urmată după 15 min de acetat de etil (60 ml) și amestecul se spală cu apă, trietilamină în apă, apă, bisulfat de poatasiu în apă, apă, se usucă și se evaporă. Reziduul se purifică prin cromatografie pe silice, eluând cu acetat de etihhexan (20:1) pentru a obține Boc-GlyL-Phe-NHCH_aCN sub forma unei spume. Boc-Gly-L-Phe-NHCH_aCN (30 mg) se di

RO 112032 Bl zolvă în acid trifluoracetic: diclormetan: anisol (25:65:10:1 ml) și se incubează la O°C timp de 30 minute. Amestecul se usucă prin evaporare rotativă la 34°C și reziduul se dizolvă în metanol (1,5 ml) și NaHCOg apos (0,1 N, pH 8,0, 1,5 ml) pentru a da soluția ligand.

CH-Sepharoseⁿ 4B activată (Pharmacia; 3 g greutate uscată) se hidratează peste noapte în acid clorhidric apos (1 mM, 75 ml) la 4°C și apoi se spală cu acid clorhidric (1 mM, 600 ml) urmat de NaHV0₃ apos (0,1 M, pH 8,0, 300 ml). Gelul se suspendă în NaHC0₃ apos (0,1 M, pH 8,0, 30 ml) se adaugă soluția ligand de mai sus și amestecul se agită ușor peste noapte la 20°C. Gelul se colectează pe un filtru de sticlă sinterizată, se spală cu metanol apos (50 % în volum/volum, 180 ml) și apoi cu apă (180 ml) și se suspendă în etanolamină apoasă (0,1 M, 30 ml) adusă la pH 9,0 cu acid clorhidric. Suspensia se agită energic timp de 4 ore la 20°C și apoi gelul se colectează, se spală cu apă (500 ml) și se depozitează în tamponul de aplicare (fosfat de sodiu 50 mM; EDTA 1 mM; etandiol 33 % pH 6,8) la 4°C.

b) Purificarea PPIV.

O coloană (volumul de pat 4 ml) de Sepharose^R-Ahx-Gly-L-Phe-NHCH₂CN se spală cu tamponul de “eluare” (citrat de sodiu 50 mM; etandiol 33 %, pH 4,5; 12 ml) și apoi cu tamponul de aplicare (vezi mai sus, 12 ml).

Latex de papaia uscat prin pulverizare (0,5 g) se dizolvă în tamponul de aplicare (10 ml) și se filtrează (pori de 0,22 cm). Concentrația de proteină a filtratului se determină folosind analiza Bio-Rad cu legarea colorantului (Rio-Rad Laboratories, Marea Britanie). Se adaugă ditiotreitol la amestec până la concentrația finală de 2 ml și amestecul se incubează la 0°C timp de 20 minute. 80 mg de proteină din latex se aplică pe o coloană (38 ml/oră/cm²) la 20°C, apoi tamponul de aplicare (8 ml) și tamponul de eluare (8 ml) . Pe urmă se aplică tampon de eluare (4 ml) care conține hidroxietildisulfură (50 mM), se oprește curgerea și coloana se lasă peste noapte la 20°C. Apoi se repetă eluarea cu hidroxietildisulfură conținând tampon de eluare (10 ml) și fracțiile eluate (1 ml) se colectează. Fracțiile care prezintă activitate față de ΒΑΡΝΑ se adaugă într-un vas și se aplică direct pe o Mono S HR 5/5^R (schimbător de cationi) în coloană care anterior a fost pre-echilibrată cu acetat de sodiu apos/acid acetic (50 mM), pH 5,0 care conține EDTA (L mM) și apoi coloana se spală cu același tampon (1 ml/minut) până ce A_280nm revine la zero. După aceea se aplică în coloană un gradient (21,5 mM Na⁺/ml) la acetat de sodiu 1 M (Buttle și Barrett, 1984, menționat anterior) și se colectează fracțiile (1 ml). Se eluează două maxime de proteină majore, primul vârf eluânduse la aproximativ 0,17 M Na⁺, corespunzător papainei, iar al doilea vârf eluându-se la aproximativ 0,38 m Na⁺ corespunzător PPIV. Fracțiile de vârf PPIV sunt puse la un loc, dializate contra EDTA apoasă (1 mM), uscate prin înghețare și depozitate la -20°C. PPIV pură nu are activitate detectabilă față de ΒΑΡΝΑ, dar se asociază cu activitatea de digerare a azocazeinei care nu a fost inhibată de cisteina de pui la o concentrație de 1 pm.

c) Prepararea anticorpilor PPIV specifici.

Antigenul pur PPIV se carboximetilează cu blândețe înainte de utilizare prin metoda descrisă de Zucker și alții, 1985, Biochim. Biophys. Acta, 828, pag. 196-204. Apoi antiserul pentru PPIV este dezvoltat într-un iepure prin injectarea intramusculară a 360 pg proteină carboximetilată în adjuvantul complet Freund, apoi după două săptămâni prin injectarea subcutanată a 100 pg în adjuvant incomplet. IgG se purifică parțial din antiser prin fracționare cu sulfat de amoniu așa cum au descris Heide și Schwick (1978) în Handbook of Experimental Immunology (Weir, D.M., ed] voi. 1, 7.1-7,11, Blackwell, Oxford, după care se face dializa în fosfat de sodiu apos (100 mM) care conține NaCI (0,14 M), pH 7,3.

RO 112032 Bl

Preparatul IgG specific PPIV se utilizează pentru analiza PPIV prin imunodifuzie radială unică așa cum s-a descris mai sus.

Prescurtările utilizate în exemple sunt: ABTS, 2,2'-azinobis (3-etilbentiazolinsulfonic acid); Ahx, 6-aminohexanoil; Ala., alanină; ΒΑΡΝΑ, Ν-α-benzoil-DL-arginin-p-nitroanilidă; Bec. Butiloxicarbonil; CBZ, carbobenzoxi; Cha, ciclohexilalanină; DMF, Ν,Ν-dimetilformamidă; E-64, L-3-carboxi-2,3-trans-opxi-propionilleucilamido-(4-guanidino)-butan; EDC, N-etil-N‘(3-dimetileminopropil)-carbodiimidă clorhidrat; EDTA, acid etilendiaminotetraacetic (sarea disodică) Gly, glicină; Leu, leucină; Mo, metoxiimină; OBZ, oxibenzil; Ox, oximă; Try, tirosină.

Bio-Rad, Chelex, Chymodiactin, CH-Sepharese 4B, Chymofast, Diaken, ECH-Sepharose, Enzfitter, FPLC, Gel Bend, Mono S HR, S-Sephrose HP, Tween, Zeta și Zetaffinity sunt toate denumiri comerciale.

Toate etapele din exemple se realizează la temperatura camerei dacă nu este indicat altfel.

Exemplul 1. L-alanil-L-fenilalanilsemicarbazona.

Etapa a.

A) Clorhidrat de ϋ,Ν-dimetilhidroxilamină (10,23 g) se adaugă sub agitare la Ν,Ν-dimetilforamidă (DMF) (100 ml) la temperatura camerei. Se adaugă N-metilmorfolină (10,6 g) o perioadă de timp de 5 min menținându-se la temperatura în acest timp sub 30°C. Se formează un precipitat alb și amestecul se răcește la 0°C.

B) N-t-Boc-L-Phe (26,5 g) se dizolvă în tetrahidrofuran uscat (THF) (200 ml) și se răcește la -10°C. La această soluție se adaugă cloroformiat de izobutil (14,38 g) pe o perioadă de 5 min, interval în care se menține temperatura la -1°C. Se adaugă N-metilmorfolină (10,6 g) pe o perioadă de 10 min, timp în care se menține temperatura la -10°C și se continuă agitarea încă timp de 10 min.

C) Suspensia A se adaugă la suspensia B într-o perioadă de timp de 15 min la -10°C. Amestecul se lasă să se încălzească la temperatura camerei și apoi se agită timp de 3 ore. Pe urmă amestecul obținut se răcește la 0°C și i se adaugă 3-dimetilaminopropilamină (10,2 g) într-o perioadă de 5 min. Se adaugă apă (200 ml) și acetat de etil (200 ml) și stratul superior organic se separă și se spală pe urmă cu (a) apă (200 ml), (b) KHC0₃ apos (5 %, 200 ml), (c) HCI apos (0,5 N, 200 ml) și (d) apă (3 x 200 ml). Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid cu meținerea temperaturii sub 30°C pentru a se obține N-t-Boc-L-Phe-0,N-dimetilhidroxamat.

Etapa b.

N-t-B oc-L-Ph e-0, N-d i metil hidroxamat (2,9 g) și acid trifluoracetic (8 ml) se agită timp de 4 ore la temperatura camerei. După aceea se îndepărtează excesul de acid trifluoracetic prin evaporare rotativă sub vid cu meținerea temperaturii sub 30°C. La reziduu se adaugă dietileter (30 ml) pentru a forma o soluție și apoi eterul se îndepărtează sub vid. Tratamentul cu eter se repetă până când are loc cristalizarea. Solidul se colectează prin filtrare, se spală cu eter și apoi se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da sarea trifluoracetat a L-Phe-0, N-dimetilhidroxamatului.

Etapa c.

A) . Trifluoracetatul de L-Phe-O,Ndimetilhidroxamat (7,15 g) se dizolvă în DMF uscată (30 ml) sub agitare la temperatura camerei. Se adaugă N-metilmorfolină (2,35 g) într-o perioadă de 5 min, timp în care temperatura se menține sub 30°C și amestecul obținut se răcește la 0°C.

B) CBZ-L-Ala (4,96 g) se dizolvă în THF uscat (55 ml) sub agitare și amestecul se răcește la -10°C. Se adaugă cloroformiat de izobutil (3,05 g) într-o perioadă de 5 min la -10°C, apoi se adaugă N-metilmorfolină (2,35 g) pe o perioadă de 10 min și amestecul de reacție se agită la -10°C timp de încă 10 minute.

C) Soluția A se adaugă la soluția B pe o perioadă de 15 min la -10°C și apoi

RO 112032 Bl se lasă ca temperatura amestecului să se ridice la temperatura camerei și agitarea continuă încă 3 ore. Amestecul se răcește la O°C, se adaugă în decurs de 5 min 3-dimetilaminopropilamină (2,27 g) și se continuă agitarea încă alte 5 min. Apoi se adaugă apă (50 ml] și acetat de etil (50 ml), faza organică superioară se separă și se spală pe rând cu (a) apă (50 ml) și NaCI apos saturat (5 ml), (b) KHC0₃ apos (5 %, 50 ml], (c) HCI apos (0,5 H, 50 ml) și (d) apă (3 x 50 ml). Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid, menținânduse temperatura sub 30°C. Se adaugă acetat de etil proaspăt (50 ml) și aceasta se îndepărtează apoi prin evaporare pentru a da CBZ-L-Ala-L-Phe-O.N-dimetilhidroxamat.

Etapa d.

CBZ-L-Ala-L-Phe-0, N-dimetilhidroxamatul (27,8 g) se dizolvă în THF uscat (280 ml) și se răcește la -70°C sub azot. Se adaugă sub azot hidrură de diizobutilaluminiu în THF (1M, 372 ml) pe o perioadă de 60 min la -70°C cu agitare și agitarea continuă încă 60 min la 70°C. Reacția se întrerupe brusc în soluție apoasă saturată de NaCI (400 ml) și soluție de sare Rochell (600 ml) cu agitare la 0°C sub azot și apoi amestecul se lasă să se încălzească la temperatura camerei. Se adaugă acetat de etil (600 ml), amestecul se filtrează și stratul apos se separă și se extrage cu acetat de etil (200 ml). Fazele organice combinate se spală cu apă (600 ml)/ soluție saturată de NaCI (400 ml) de trei ori. Solventul se îndepărtează prin evaporare repetată sub vid, cu menținerea temperaturii sub 30°C. Reziduul se recristalizează din toluen și soliduul se usucă în vid pe P₂0₅ pentru a da CBZ-L-Ala-Phe aldehidă.

Etapa e.

A) Aldehidă CBZ-L-Ala-L-Phe (3 g) se dizolvă în spirt metilat industrial (20 ml). Soluția se încălzește la 50°C și se filtrează pentru a îndepărta insolubilele.

B) O soluție de clorhidrat de semicarbazidă (1,3 g) în apă (10 ml) se adaugă la o soluție de KHC0₃ (1,1 g) în apă (10 ml).

C) Soluția B se adaugă la soluția A și amestecul obținut se agită la 50°C timp de 2 ore. Se adaugă acetat de etil (50 ml) și apă (100 ml). Stratul apos se separă și se extrage cu acetat de etil (2 x 20 ml) și fazele organice combinate se spală pe rând cu (a) KHC0₃ apos (5%, 50 ml); (b) HCI apos (0,5 N, 50 ml) și (c) apă/soluție apoasă saturată de NaCI (50 ml/20 ml x 3). Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid, cu menținerea temperaturii sub 30°C, pentru a da CBZL-Ala-PheSc.

Etapa f.

CBZ-L-Ala-L-PheSc (680 mg) se dizolvă în metanol (90 ml) și materialele insolubile se îndepărtează prin filtrare. Aparatul care conține soluția metanolică de CBZ-L-Ala-L-PheSc se purjează cu N₂ și se adaugă catalizatorul, 10 % paladiu pe cărbune (100 mg). în sistemul închis se trece H₂ timp de 75 minute. Catalizatorul se îndepărtează prin filtrare și metanolul prin evaporare rotativă sub vid cu menținerea temperaturii sub 30°C. Reziduul cristalizează prin ședere și solidul se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da L-alanil-L-fenilalanilsemicarbazona (LAla-L-PheSc).

Exemplul 2. L-fenilalanil-L-fenilalanilsemicarbazona.

Sarea trifluoracetat a L-Phe-C,Ndimetilhidroxamatului se prepară conform cu etapele a și b din exemplul 1.

Etapa c.

A) Trifluoracetatul de L-Phe-O,Ndimetilhidroxamat (2,932 g) se dizolvă în DMF anhidră (8 ml) sub agitare la temperatura camerei. Se adaugă N-metilmofolină (0,606 g) pe o perioadă de 5 min, timp în care temperatura se menține sub 30°C și amestecul obținut se răcește la 0°C.

B) CBZ-L-Phe (1,794 g) se dizolvă în THF uscat (15 ml) sub agitare și amestecul se răcește la -10°C, apoi se adaugă cloroformiat de izobutil (0,822 g) pe o perioadă de 5 min la -10°C, apoi se adaugă N-metilmorfolină (0,606 g) pe o perioadă de 10 min și amestecul de re

RO 112032 Bl acție se agită la -10°C încă alte 1 □ minute.

C] Soluția A se adaugă la soluția B în interval de 15 min la -1O°C și apoi temperatura amestecului se lasă să se ridice la temperatura camerei și agitarea continuă timp de 3 ore. Amestecul se răcește la Q°C, i se adaugă 3-dimetilaminopropilamină (0,612 g) pe o perioadă de 5 min și agitarea continuă încă alte 5 minute. Apoi se adaugă apă (20 ml) și acetat de etil (30 ml), faza organică se separă și se spală pe rând cu (a) KHC0₃ apos (5'%, 20 ml), (b) HCI apos (0,5 N, 20 ml) și (c) apă (2 x 30 ml). Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid, cu menținerea temperaturii sub 35°C și reziduul se recristalizează din alcool izopropilic pentru a da CBZ-L-PheL-Phe-O,N-dimetilhidroxamat.

Etapa d.

CBZ-L-Phe-L-Phe-O,N-dimetilhidroxamatul (4,89 g) se dizolvă în THF uscat (40 ml). Un balon uscat se încarcă cu hidrură de litiu și aluminiu (0,493 g) și THF uscat (20 ml) se adaugă sub azot și se agită la temperatura camerei timp de 10 min înainte de a se răci la -50°C. Soluția de hidroxamat în THF uscat se adaugă după aceea în interval de 10 min și la -50°C sub azot, continuându-se agitarea timp de încă 20 min, la 0-5°C.

Amestecul de reacție se răcește la -50°C și i se adaugă soluția saturată de sare Rochell (60 ml) sub azot. Amestecul se lasă să se încălzească la temperatura camerei, i se adaugă HCI concentrat (10 ml) pentru a aduce faza apoasă la pH 3 și insolubilele se îndepărtează prin filtrare. Se adaugă acetat de etil (50 ml) și faza organică se separă și se spală pe rând cu (a) apă (50 ml), (b) KHC0₃ apos (5 %, 50 ml) (c) Hcl apos (0,5 N, 50 ml] și (d) apă (3 x 50 ml). Acetatul de etil se îndepărtează apoi prin evaporare rotativă sub vid, cu menținerea temperaturii sub 30°C. Reziduul se lasă să stea peste noapte, se usucă în vid peste P₂0₅ și în final cristalizează din toluen pentru a da CBZ-L-Phe-L-Phealdehidă.

Etapa e.

A) Aldehida CBZ-L-Phe-L-Phe (0,645 g) se dizolvă în spirt metilat industrial (10 ml) la 70°C.

B) Acetat de sodiu trihidrat (0,224 g) se adaugă la o soluție de clorhidrat de semicarbazidă (0,183 g) în apă (3 ml), se adaugă spirt metilat industrial (2 ml) și amestecul se încălzește la 60°C.

C) Soluția A se adaugă la soluția B și balonul care a conținut soluția A se spală cu încă 3 ml spirt metilat industrial și spălările se adaugă la amestecul care se agită la 6O-7O°C timp de 30 minute. Amestecul se lasă să se răcească încet timp de o oră, se lasă să stea la gheață încă o oră și în final se lasă peste noapte la 4°C. Reziduul se colectează prin filtrare, se spală cu spirt metilat industrial: apă (4:1,3 ml) și se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da CBZ-L-Phe-L-PheSc.

Etapa f.

CBZ-L-Phe-L-PheSc (2,1 g) se dizolvă în metanol (315 ml] la 30°C și insolubilele se îndepărtează prin filtrare. Aparatul care conține soluția metanolică de semicarbazonă se purjează cu N₂, se adaugă catalizatorul paladiu 10 % pe cărbune (0,35 g) și prin sistemul închis se trece H₂ timp de 30 minute. Catalizatorul se îndepărtează prin filtrare și solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid cu menținerea temperaturii sub 30°C. Reziduul se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da L-fenilalanil-Lfenilalanilsemicarbazona (L-Phe-L-PheSc).

Exemplul 3. L-fenilalanil-L-fenilalanilmetoxiimina.

Etapele a - d.

Aldehida CBZ-L-Phe-L-Phe se prepară așa cum s-a descris în exemplul 2, etapele a - d.

Etapa e.

A) Aldehida CBZ-L-Phe-L-Phe (0,645 g) se dizolvă în spirt metilat industrial (35 ml) la 60 - 65°C și se filtrează pentru a îndepărta insolubilele.

B) Acetat de sodiu trihidrat (0,224 g) se adaugă la o soluție de clorhidrat de metoxilamină (0,138 g) în apă (25 ml], la 60°C.

RO 112032 Bl

C) Soluția B se adaugă la soluția A, balonul care a conținut soluția B se spală cu apă (10 ml) la 6O-70°C, spălările se combină cu amestecul și se încălzește la 6O°C timp de 1/2 oră,apoi se lasă să se răcească la temperatura camerei timp de 2 ore, Solidul se colectează prin filtrare, se spală cu spirt metilat industrial:apă (1:1,6 ml) și se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da CBZ-L-PheL- Phe-metoxiimina.

Etapa f.

CBZ-L-Phe-L-Phe-metoxiimina (550 mg) se dizolvă în metanol (300 ml) și insolubilele se îndepărtează prin filtrare. Aparatul care conține metoxiimina în metanol se purjează cu N₂ și apoi se adaugă catalizatorul paladiu 10 % pe cărbune (100 mg). Prin vasul etanșat se trece H₂ și se reîncarcă dacă este necesar timp de 4 1/2 h. Catalizatorul se îndepărtează prin filtrare și solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid cu menținerea temperaturii sub 30°C pentru a da L-fenilalanil-L-fenilalanil-metoxiimina (L-Phe-L-PheMo).

Exemplul 4. L-fenilalanil-D-fenilalanilsemicarbazona.

Etapa a.

A) Clorhidrat de O,N-dimetilhidroxilamină (3,891 g) se suspendă în DMF uscată (40 ml) la temperatura camerei. Se adaugă N-metilmorfolină (4,032 g) o perioadă de 5 minute,în timp ce temperatura se menține sub 30°C și amestecul se răcește la 0°C.

B) N-t-Boc-D-Phe (10,08 g) se dizolvă în THF uscat (80 ml] și se răcește la -10°C. Se adaugă cloroformiat de izobutil (5,47 g) la o soluție pe o perioadă de 5 min cu menținerea în acest timp a temperaturii la -10°C. Se adaugă Nmetilmorfolină (4,032 g) pe o perioadă de 10 min cu menținerea temperaturii în acest timp la -10°C și agitarea se continuă încă alte 10 minute.

C) Suspensia A se adaugă la suspensia B pe o perioadă de 15 min la 10°C, amestecul se lasă să se încălzească la temperatura camerei și se agită timp de 3 ore. Amestecul este apoi răcit la 0°C, se adaugă 3-dimetil- aminopropilamină (3,88 g) pe o perioadă de 5 min și se continuă agitarea încă 5 minute. Se adaugă apă (60 ml] și acetat de etil (60 ml], stratul organic se separă și se spală pe rând cu (a) apă (60 ml), (b) KHCOg apos (5 %, 60 ml), (c) Hcl apos (0,5 N, 60 ml) și (d) apă (3 x 60 ml]. Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid în timp ce temperatura se menține sub 30°C, pentru a se obține N-t-Boc-D-Phe-O,N-dimetilhidroxamat.

Etapa b.

N-t-Boc-D-Phe-O, N-dimetilhidroxamatul (11,3 g) se răcește pe gheață, se adaugă acid trifluoracetic (30 ml) și amestecul se agită la temperatura camerei timp de 3 ore. Acidul trifluoracetic în exces se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid cu meținerea temperaturii sub 30°C și se adaugă dietileter (100 ml) la reziduu pentru a forma o soluție. Solventul se îndepărtează sub vid și procesul se repetă până când are loc cristalizarea. Solidul se colectează prin filtrare, se spală cu dietileter și se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da sarea trifluoracetat a D-Phe-O, N-dimetilhidroxamatului.

Etapa c.

A) . Trifluoracetatul de D-Phe-O,Ndimetilhidroxamatul (10,1 g] se dizolvă în □MF uscat (41 ml) și agitare la temperatura camerei. Se adaugă N-metilmorfolină (3,155 g] pe o perioadă de 5 min, timp în care se menține temperatura sub 30°C și amestecul obținut se răcește la 0°C.

B) CBZ-L-Phe (9,4 g) se dizolvă în THF uscat (80 ml] sub agitare și amestecul se răcește la -10°C. Se adaugă la interval de 5 min la -10°C cloroformiat de izobutil (4,307 g], apoi se adaugă într-un interval de 10 min N-metilmorfolină (3,155 g) și amestecul de reacție se agită la -10°C timp de încă 10 minute.

C) Soluția A se adaugă la soluția B timp de 15 min la -10°C și apoi temperatura amestecului se lasă să crească la temperatura camerei și se continuă agitarea timp de 3 ore. Amestecul se ră

RO 112032 Bl ceste la O°C, se adaugă 3-dimetilaminopropilamină (3,20 g) pe o perioadă de 5 min și agitarea se continuă încă alte 5 min.Apoi se adaugă apă (6Q ml) și acetat de etil (60 ml), faza organică superioară se separă și se spală pe rând cu (a) apă (60 ml) și soluție apoasă saturată de NaCI (60 ml), (b) KHC0₃ apos (5 %, 60 ml), (c) HCI apos (0,5 H, 60 ml) și (d) apă (3 x 60 ml). Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid cu menținerea temperaturii sub 30°C. Se adaugă acetat de etil proaspăt și apoi se îndepărtează prin evaporare. Reziduul se recristalizează din izopropanol pentru a da CBZ-L-Phe-D-Phe-O,Ndimetilhidroxamat.

Etapa d.

Hidrură de diizobutilaluminiu în diclormetan (1 m, 10 ml) se introduce într-un balon purjat cu N₂. Balonul se încălzește la 50°C până când tot diclormetanul se evaporă și sistemul este din nou purjat cu N₂. Se adaugă THF uscat (10 ml) și amestecul se răcește la 70°C.

CBZ-L-Phe-O-Phe-O,N-dimetilhidroxamat (0,978 g) se dizolvă în THF uscat (10 ml) și se adaugă pe o perioadă de 10 min la -70°C soluției de hidrură de diizobutilaluminiu și agitarea se continuă timp+ de încă 10 min la -70°C. Amestecul de reacție se toarnă pentru oprirea reacției în metanol (30 ml) și în soluție saturată de sare Rochell (30 ml) la 60°C și amestecul se lasă să se încălzească la temperatura camerei. Se adaugă apă (50 ml] și acetat de etil (50 ml),și faza apoasă se separă, iar faza apoasă se extrage cu acetat de etil (50 ml). Fazele organice combinate se spală cu apă (2 x 200 ml) și se filtrează. Faza organică se separă și solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid cu menținerea temperaturii sub 30°C. Se adaugă acetat de etil propaspăt și apoi se îndepărtează pentru a da CBZ-LPhe-D-Phe aldehidă.

Etapa e.

A) Aldehidă CBZ-L-Phe-D-Phe (400 mg) se dizolvă în spirt metilat industrial (10 ml) la 50°C.

B) Acetat de sodiu trihidrat (0,298 g) în apă (3 ml) la 60°C se adaugă la o soluție de semicarbazidă clorhidrat (0,224 g) în apă (3 ml) la 60°C.

C) Soluțiile A și B se combină și amestecul rezultat se agită la 60°C timp de 5 ore, apoi se lasă să stea peste noapte la 4°C. Soluția se colectează prin filtrare și se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da CBZ-L-Phe-D-PheSc.

Etapa f.

CBZ-L-Phe-D-PheSc (600 mg] se dizolvă în metanol (90 ml) și insolubilele se îndepărtează prin filtrare. Aparatul care conține soluția metanolică de semicarbazonă se purjează cu N₂ și se adaugă catalizatorul paladiu 10 % pe cărbune (100 mg). în vasul închis se încarcă H₂ timp de 2 ore. Catalizatorul se îndepărtează prin filtrare și metanolul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid în timp ce temperatura se menține sub 30°C pentru a da L-fenilalanil-D-fenilalanilsemicarbazona (L-Phe-D-PheSc).

Exemplul 5. L-fenilalanil-L-fenilalaniloxima.

Etapele a - d.

CBZ-L-Phe-L-Phe aldehida se prepară așa cum s-a descris în exemplul 2, etapele a - d.

Etapa e.

A) CBZ-L-Phe-L-Phe aldehida preparată cum s-a descris mai sus (0,645 g) se dizolvă în spirt metilat industrial (35 ml) la 60 - 65°C și soluția se filtrează pentru a îndepărta insolubilele.

B) Acetat de sodiu trihidrat (0,224 g) se adaugă la o soluție de clorhidrat de hidroxilamină (0,114 g) în apă (25 ml) la 60°C.

C) Soluția B se adaugă la soluția A, balonul care a conținut soluția B se spală cu apă (10 ml) și spălările se adaugă la amestecul care apoi este agitat la 60 - 65°C timp de 3/4 h, și pe urmă este răcit timp de 2 - 3 ore la 4°C. Solidul se separă prin filtrare, se spală cu spirt metilat industrial/apă (1:1,5 ml) și se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da CBZ-L-Phe-L-PheSc ca un amestec de izomeri sin și anti.

RO 112032 Bl

Etapa f.

CBZ-L-Phe-L-PheOx (5OO mg] se dizolvă în metanol (130 ml] și insolubilele se îndepărtează prin filtrare. Aparatul care conține oxima în metanol se purjează cu N₂ și se adaugă catalizatorul, paladiu 10 % pe cărbune (83 mg). în vasul etanșat se încarcă H₂ timp de 30 min.Catalizatorul se îndepărtează prin filtrare și solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid cu menținerea temperaturii sub 30°C. în continuare se îndepărtează solventul folosind o pompă de vid înaintat și reziduul se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da L-fenilalanil-Lfenilalaniloxima (L-Phe-L-PheOx).

Exemplul 6. L-alanil-E)-fenilalanilanilsemicarbazona.

Etapele a și b.

Sarea trifluoracetat a D-Phe-O,Ndimetilhidroxamatului se prepară conform cu etapele a și b din exemplul 4.

Etapa c.

A) . Trifluoracetatul de D-Phe-O,Ndimetilhidroxamat (5,000 g) se dizolvă în THF uscat (20 ml). Se adaugă încet Nmetilmorfolină (1,578 g) menținând în acest timp temperatura sub 30°C și amestecul rezultat se răcește la 0°C.

B) CBZ-L-Ala (3,463 g) se dizolvă în THF uscat (40 ml) sub agitare și amestecul se răcește la -10°C. Cloroformiatul de izobutil (2,158 g), se adaugă pe o perioadă de 5 min la -10°C, apoi se adaugă N-metilmorfolină (1,578 g) pe o perioadă de 10 min și amestecul de reacție se agită la -10°C timp de încă 10 minute.

C) Cele două soluții A și B, se amestecă la -10°C timp de 10 min și apoi se lasă să se ridice temperatura amestecului la temperatura camerei și se continuă agitarea timp de 3 ore. Amestecul se răcește la 0°C, se adaugă 3-dimetilaminopropilamină (1,585 g) și reacția se oprește brusc cu apă (50 ml). Se adaugă acetat de etil (50 ml), faza organică se separă și stratul apoas se extrage cu acetat de etil (2 x 30 ml). Straturile organice se combină și se spală pe rând cu (a) apă (50 ml) și soluție apoasă de NaCI (10 ml) , (b) KHCOg apos (5 %, 50 ml), (c) HCI apos (0,5 H, 50 ml) și (d) apă (3 x 50 ml). Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid cu menținerea temperaturii sub 30°C. Solidul se recristalizează din acetat de etil pentru a da CBZ-L-AlaD-Phe-O,N-dimetilhidroxamat.

Etapa d.

CBZ-L-Ala-L-Phe-O.N-dimetilhidroxamatul (2,9 g) se dizolvă la -70°C sub azot. Se adaugă pe o perioadă de 10 min la -70°C hidrură de diizobutilaluminiu în THF (1M, 37 ml) și se continuă agitarea timp de încă 10 minute.

Reacția se oprește brusc în soluție saturată de sare Rochell (125 ml) și THF (125 ml) cu agitare la -30°C, sub N₂ purjat și amestecul se lasă să se încălzească la temperatura camerei. Se adaugă acetat de etil (100 ml), și faza organică se separă. Stratul apos se extrage cu acetat de etil (2 x 30 ml) și straturile organice se combină și se spală cu apă (3 x 100 ml).

Amestecul de reacție se filtrează și solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid, cu menținerea temperaturii sub 30°C. Se adaugă acetat de etil proaspăt și apoi se îndepărtează pentru a da CBZ-L-Ala-D-Phe aldehidă.

Etapa e.

A) Aldehidă CBZ-L-Ala-D-Phe (1,2 g) se dizolvă în THF (20 ml) și spirt metilat industrial (20 ml) și se încălzește la 50°C.

B) O soluție fierbinte de clorhidrat de semicarbazidă (1,8 g) în apă (15 ml] se adaugă la o altă soluție fierbinte de KHC0₃ (1,5 g) în apă (15 ml).

C) Soluția B se adaugă la soluția A și amestecul obținut se agită la 50°C timp de 4 ore.

Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid, cu menținerea temperaturii sub 30°C,

Se adaugă apă (50 ml) la reziduu, solidul se colectează prin filtrare, se spală cu apă: spirt metilat industrial (1:1) și se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da CBZ-L-Ala-D-PheSc.

RO 112032 Bl

Etapa f.

CBZ-L-Ala-D-PheSc (750 mg) se dizolvă în metanol (50 ml) și materialele insolubile se îndepărtează prin filtrare. Aparatul care conține soluția metanolică se purjează cu N₂ și se adaugă catalizatorul, paladiu 10 % pe cărbune (100 mg). în sistemul închis se trece H₂ timp de 90 min.Catalizatorul se îndepărtează prin filtrare și solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid cu menținerea temperaturii sub 30°C. și se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da Lalanil-D-fenilalanilsemicarbazona (L-Ala-DPheSc).

Exemplul 7. L-tierosinil-L-fenilalanilsemicarbazona.

Etapele a și b.

Sarea trifluoracetat a L-Phe-O,Ndimetilhidroxamatului se prepară conform cu etapele a și b din exemplul 5.

Etapa c.

A) . Trifluoracetatul de D-Phe-O,Ndimetilhidroxamatului (7,95 g) se dizolvă în THF uscat (30 ml) cu agitare la temperatura camerei. Se adaugă N-metilmorfolină (2,49 g) pe o perioadă de 5 min în timp ce se menține temperatura sub 30°C și amestecul rezultat se răcește la 0°C.

B) CBZ-OBZ-L-Tyr (10 g) se dizolvă în DMF uscată (60 ml] sub agitare și amestecul se răcește la -10°C. Se adaugă cloroformiat de izobutil (3,39 g) pe o perioadă de 5 min la -10°C, Se adaugă apoi N-metilmorfolină (2,49 g) pe o perioadă de 10 min și amestecul de reacție se agită la -10°C timp de încă 10 minute.

C) Soluția A se adaugă la soluția B pe o perioadă de 15 min la -10°C timp și apoi temperatura amestecului se lasă să crească la temperatura camerei și se continuă agitarea timp de 3 ore. Amestecul se răcește la 0°C, se adaugă 3dimetilaminopropilamină (2,52 g) pe o perioadă de 5 min.Se adaugă după aceea apă (50 ml] și acetat de etil (50 ml), faza organică superioară se separă și se spală pe rând cu (a) apă (50 ml), (b) KHCO₃ apos (5 %, 50 ml), (c) HCI apos (0,5 M, 50 ml) și (d) apă (3 x 50 ml). Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid cu menținerea temperaturii sub 30°C și reziduul se recristalizează din alcool izopropilic pentru a da CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-O,N-dimetilhidroxamat.

Etapa d.

CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe-O, N-dimetilhidroxamatul (1,012 g) se dizolvă în THF uscat (10 ml). Se adaugă hidrură de diizobutilaluminiu în THF (1M, 8,5 ml) sub azot pe o perioadă de 10 min la 70°C și agitarea se continuă timp de încă 10 minute.

Reacția se oprește brusc în metanol (20 ml] și soluție de sare Rochell (30 ml) sub agitare la -60°C, sub N₂ și amestecul se lasă apoi să se încălzească la temperatura camerei. Se adaugă apă (50 ml) și acetat de etil (50 ml), și faza organică se separă și se spală cu apă (200 ml). Amestecul de reacție, se filtrează și solventul se îndepărtează din filtrat prin evaporare rotativă sub vid, cu menținerea temperaturii sub 30°C. După aceea se adaugă acetat de etil proaspăt și apoi se îndepărtează prin evaporare rotativă. Solidul rezultat se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da CBZOBZ-L-Tyr-LPhe aldehidă.

Etapa e.

A) Aldehidă CBZ-OBZ-L-Tyr-L-Phe (400 mg) se dizolvă în spirt metilat industrial (20 ml) și THF (10 ml) și se încălzește la 60°C.

B) O soluție fierbinte de clorhidrat de semicarbazidă (600 mg) în apă (5 ml) se adaugă la o altă soluție fierbinte de KHC0₃ (500 mg) în apă (5 ml).

C) Soluția B se adaugă la soluția A și amestecul rezultat se agită la 60°C timp de 2 ore.

Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid, cu menținerea temperaturii sub 30°C și reziduul se răcește brusc cu apă. Solidul se colectează prin filtrare, se spală cu apă și spirt metilat industrial și se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da CBZ-OBZ-L-Tyr-L-PheSc.

Etapa f.

CBZ-OBZ-L-Tyr-L-PheSc (770 mg) se dizolvă în THF uscat (70 ml), se fii

RO 112032 Bl trează și apoi se adaugă metanol (20 ml) la filtrat. Aparatul care conține soluția de semicarbazonă se purjează cu N₂ și se adaugă catalizatorul, paladiu 10 % pe cărbune (100 mg). în sistemul închis se trece H₂ timp de câteva ore. Catalizatorul se îndepărtează prin filtrare și solventul se scoate prin evaporare rotativă sub vid pentru a da L-tirosinil-L-fenilalanilsemicarbazona (L-Tyr-L-PheSc).

Exemplul 8. L-alanil-L-cidohexilalanil-semicarbazona.

Etapa a.

A) Clorhidrat de O,N-dimetilhidroxilamină (8,51 g) se adaugă sub agitare la DMF uscată (75 ml) și se adaugă N-metilmorfolină (8,8 g) o perioadă de 5 minute, în timp ce temperatura se menține sub 30°C. Se formează un precipitat alb și amestecul se răcește la 0°C.

B) N-T-Boc-L-Cha (22,5 g) se dizolvă în THF uscat (200 ml) și se răcește la -10°C. Se adaugă cloroformiat de izobutil (11,94 g) pe o perioadă de 5 min menținând în acest timp temperatura la -10°C. Se adaugă N-metilmorfolină (8,8 g) o perioadă de 10 min cu menținerea în acest timp a temperaturii la -10°C și se agită în continuare timp de 10 minute.

C) Suspensia A se adaugă la suspensia B pe o perioadă de 15 min la 10°C și apoi amestecul se lasă să se încălzească la temperatura camerei și se agită timp de 4 ore. Amestecul se răcește la 0°C, și i se adaugă 3-dimetilaminopropilamină (8,6 g) pe o perioadă de 5 min și se continuă agitarea încă 5 min.Se adaugă apă (200 ml) și acetat de etil (100 ml), și stratul apos se separă și se extrage cu acetat de etil (2 x 100 ml). Fazele organice combinate de spală pe rând cu (a) apă (100 ml) și soluție apoasă saturată de NaCI (20 ml), (b) KHC0₃ apos (5 %, 100 ml), (c) HCI apos (0,5 N, 100 ml] și (d) apă (3 x 100 ml). Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă sub vid cu menținerea temperaturii sub 30°C, pentru a da N-t-Boc-LCha-O.N-dimetilhidroxamat.

Etapa b.

N-t-B oc-L-Ch a-0, N-d i m eti I h id r oxa matul (26 g] și acid trifluoracetic (65 ml] se agită la 0°C timp de 5 min și apoi temperatura amestecului se lasă să se ridice la temperatura camerei și agitarea continuă încă 3 ore. Excesul de acid trifluoracetic se îndepărtează apoi prin evaporare rotativă sub vid cu meținerea temperaturii sub 30°C. La reziduu se adaugă dietileter pentru a forma o soluție și apoi eterul se îndepărtează sub vid. Tratamentul cu eter se repetă pentru a da un ulei galben de sarea trifluoracetat de L-Cha-O,N-dimetilhidroxamat.

Etapa c.

A) . Trifluoracetat de L-Cha-O,Ndimetilhidroxamatul (17 g] se dizolvă în THF uscat (50 ml). Se adaugă N-metilmorfolină (3,95 g] pe o perioadă de 5 min cu menținerea în acest timp a temperaturii sub 30°C și amestecul obținut se răcește apoi la 0°C.

B) CBZ-L-Ala (9,25 g) se dizolvă în THF uscat (100 ml] sub agitare și amestecul se răcește la -10°C. Se adaugă cloroformiat de izobutil (5,35 g) pe o perioadă de 5 min la -10°C, apoi se adaugă N-metilmorfolină (3,95 g] pe o perioadă de 10 min și amestecul de reacție se agită la -10°C timp de încă 10 minute.

C) Soluția A se adaugă la soluția B în decurs de 15 min la -10°C și apoi temperatura amestecului se lasă să se ridice la temperatura camerei și se continuă agitarea timp de 3 ore. Amestecul se răcește la 0°C, se adaugă 3-dimetilaminopropilamină (3,98 g) în decurs de 5 min și se continuă agitarea încă timp de alte 5 min.După aceea se adaugă apă (150 ml) și acetat de etil (150 ml], și faza apoasă se separă și se extrage cu acetat de etil (2 x 75 ml). Fazele organice combinate se spală după aceea cu (a) apă (125 ml), (b) KHC0₃ apos (5 %, 125 ml), (c) HCI apos (0,5 H, 125 ml) și (d) apă (3 x 125 ml). Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă cu menținerea temperaturii sub 30°C. Se adaugă acetat de etil proaspăt și se îndepărtează prin evaporare pentru a da CBZ-L-Ala-L-Cha-0,N-dimetilhidroxamat.

RO 112032 Bl

Etapa d.

CBZ-L-Ala-L-Cha-O,N-dimetilhidroxamatul (7,22 g] se dizolvă în THF uscat (160 ml) și se răcește la -7O°C sub N₂. Se adaugă hidrură de diizobutilaluminiu în THF (1M, 86 ml) sub azot pe o perioadă de 20 min la -7O°C și agitarea se continuă încă timp de 20 minute.

Reacția se întrerupe brusc în soluție de sare Rochell (400 ml) sub agitare la 0°C sub N₂ și amestecul se lasă apoi să se încălzească la temperatura camerei. Se adaugă acetat de etil (150 ml), și amestecul se agită 5 min. Amestecul de reacție se filtrează, stratul organic se separă și faza apoasă se extrage cu acetat de etil (2 x 50 ml). Fazele organice combinate se spală cu apă (3 x 200 ml) cu adăugarea la spălările finale de soluție saturată apoasă de NaCI. Solventul se îndepărtează cu un evaporator rotativ, cu menținerea temperaturii sub 30°C. pentru a da CBZ-L-Ala-L-Cha aldehidă.

Etapa e.

A) CBZ-L-Ala-L-Cha aldehida (8 g) se dizolvă în spirt metilat industrial (50 ml) și se încălzește la 50°C.

B) O soluție fierbinte de clorhidrat de semicarbazidă (3,0 g] în apă (25 ml) se adaugă la o soluție fierbinte de KHC0₃ (2,67 g) în apă (25 ml).

C) Soluția B se adaugă la soluția A și amestecul rezultat se agită la 50°C timp de 3 ore.

Amestecul se lasă să se răcească și stă peste noapte la 4°C. Se îndepărtează cea mai mare parte din spirtul metilat industrial prin evaporare rotativă, cu menținerea temperaturii sub 30°C și se adaugă acetat de etil (50 ml) la reziduu. Faza organică se separă și se spalăpe rând cu (a) apă (30 ml), (b) KHC0₃ apos (5 %, 30 ml), (c) HCI apos (0,5 H, 30 ml) și (d) apă (2 x 50 ml) cu adaos de soluție apoasă saturată de NaCI pentru a ajuta la separare. Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă cu menținerea temperaturii sub 30°C și solidul se recristalizează din izopropanol pentru a da CBZ-L-Ala-L-ChaSc.

Etapa f.

CBZ-L-Ala-L-ChaSc (900 mg) se dizolvă în metanol (30 ml], se filtrează și se adaugă catalizatorul, paladiu 10 % pe cărbune (100 mg) sub N₂. în sistemul închis se trece H₂ timp de 6 ore și apoi catalizatorul se îndepărtează prin filtrare. Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă cu menținerea temperaturii sub 30°C și solidul se spală cu eter și se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da Lalanil-L-ciclohexilIalanilsemicarbazona (LAla-L-ChaSc).

Exemplul 9. L-alanil-L-leucilsemicarbazona.

Etapa a.

A) Clorhidrat de O,N-dimetilhidroxilamină (9,17 g) se adaugă sub agitare la DMF uscată (110 ml) la temperatura camerei. Se adaugă N-metilmorfolină (9,51 g) o perioadă de 5 minute, în timp ce temperatura se menține sub 30°C. Se formează un precipitat și amestecul se răcește la 0°C.

B) N-t-Boc-L-Leu (23,3 g) se dizolvă în THF uscat (220 ml] și se răcește la -10°C. Se adaugă cloroformiat de izobutil (12,90 g) pe o perioadă de 5 min în timp ce temperatura se menține la -10°C. Se adaugă N-metilmorfolină (9,51 g) o perioadă de 10 min în timp ce temperatura se menține la -10°C și agitarea continuă încă 10 minute.

C) Suspensia A se adaugă la suspensia B pe o perioadă de 15 min la -10°C. Amestecul se lasă să se încălzească la temperatura camerei și se agită timp de 3 ore. Amestecul este apoi răcit la 0°C, și i se adaugă 3-dimetilaminopropilamină (9,13 g) pe o perioadă de 5 min și agitarea continuă încă timp de 5 min.Se adaugă apă (110 ml) și acetat de etil (110 ml), și stratul organic se separă și se spală pe rând cu (a) apă (2 x 100 ml), (b) KHC0₃ apos (5 %, 100 ml), (c) HCI apos (0,5 N, 100 ml) și (d) apă (3 x 100 ml). Solventul se îndepărtează cu un evaporator rotativ cu menținerea temperaturii sub 30°C, pentru a da N-t-Boc-L-Leu-Q,N<limetilhidroxamat.

RO 112032 Bl

Etapa b.

N-t-B oc-L-Le u-0, N-d i meti I hid roxamatul (23,4 g] și acid trifluoracetic (165 ml răcit la O°C) se agită împreună la temperatura camerei timp de 18 ore. Excesul de acid trifluoracetic se îndepărtează apoi prin evaporare rotativă cu menținerea temperaturii sub 3O°C. Se adaugă dietileter la reziduu pentru a forma o soluție și după aceea eterul se îndepărtează sub vid. Acest lucru se repetă până când se produce cristalizarea la 4°C, pentru a da sarea trifluoracetat a L-Leu-O,N-dimetilhidroxamatului.

Etapa c.

A) . Trifluoracetat de L-Leu-O,N-dimetilhidroxamatul (1,8 g] se dizolvă în THF uscat (10 ml) sub agitare la temperatura camerei. Amestecul se răcește la 0°C și i se adaugă N-metilmorfolină (0,635 g) pe o perioadă de 5 minute.

B) CBZ-L-Ala (1,40 g) se dizolvă în THF uscat (20 ml) și se răcește la 10°C. Se adaugă cloroformiat de izobutil (0,869 g) pe o perioadă de 5 min la 10°C, apoi se adaugă N-metilmorfolină (0,639 g) pe o perioadă de 10 min și amestecul de reacție se agită la -10°C timp de încă 10 minute.

C) Soluția A se adaugă la soluția B pe o periadă de 15 min la -10°C și apoi temperatura amestecului se lasă să se ridice la temperatura camerei și agitarea continuă încă 18 ore. Amestecul se răcește la 0°C, i se adaugă 3-dimetilaminopropilamină (0,64 g) și pe urmă amestecul de reacție se răcește brusc cu apă (25 ml) și acetat de etil (25 ml). Faza apoasă se separă și se extrage cu acetat de etil (2 x 25 ml). Fazele organice combinate se spală pe rând cu (a) apă (50 ml) și soluție apoasă saturată de NaCI (pentru a ajuta separarea) (b) KHC0₃ apos (5 %, 30 ml], (c) HCI apos (0,5 H, 30 ml] și (d) apă (3 x 30 ml). Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă cu menținerea temperaturii sub 30°C și solidul se usucă în vid peste P₂0₅ pentru a da CBZ-L-Ala-L-l_eu-O,N-dimetilhidroxamat.

Etapa d.

CBZ-L-Ala-L-l_eu-0,N-dimetilhi droxamatul (1,9 g] se dizolvă în THF uscat (40 ml) și se răcește la -70°C sub N₂. Se adaugă sub N₂ pe o perioadă de 10 min hidrură de diizobutilaluminiu în THF (1M, 29,5 ml) la -70°C și agitarea se continuă încă timp de 10 minute.

Reacția se întrerupe brusc în metanol (50 ml) și soluție de sare Rochell (50 ml) sub agitare la -60°C sub N₂ și apoi amestecul se lasă apoi să se încălzească la temperatura camerei. Se adaugă apă (50 ml) și acetat de etil (50 ml), amestecul se filtrează și stratul apos se separă și se extrage cu acetat de etil (2 x 50 ml). Fazele organice combinate se spală cu apă (3 x 100 ml) și cu soluție apoasă saturată de NaCI pentru a ajuta separarea. Solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă, cu menținerea temperaturii sub 30°C, se adaugă acetat de etil proaspăt și apoi acesta se îndepărtează prin evaporare rotativă pentru a da CBZ-L-Ala-L-Leu aldehidă.

Etapa e.

Â) CBZ-L-Ala-L-Leu aldehida (6,7 g] se dizolvă în spirt metilat industrial (50 ml] și se încălzește la 50°C.

B) O soluție fierbinte de KHC0₃ (9 g) în apă (30 ml) se adaugă la o soluție fierbinte de clorhidrat de semicarbazidă (10,8 g) în apă (30 ml).

C) Soluția B se adaugă la soluția A și amestecul se agită la 50°C timp de 3 ore și se lasă să stea peste noapte la temperatura camerei. Solidul se separă prin filtrare, se spală cu spirt metilat industrial: apă (1:1, 20 ml) și se ususcă în vid peste P₂0₅ pentru a da CBZ-L-AlaL-LeuSc.

Etapa f.

CBZ-L-Ala-L-LeuSc (950 mg] se dizolvă în metanol (100 ml), și insolubilele se îndepărtează prin filtrare. Se mai adaugă metanol (50 ml] și aparatul se purjează cu azot. Se adaugă catalizatorul, paladiu 10 % pe cărbune (100 mg] sub N₂ și apoi se trece H₂ în sistemul închis timp de 135 min. Catalizatorul se îndepărtează prin filtrare și solventul se îndepărtează prin evaporare rotativă cu menținerea temperaturii sub

RO 112032 Bl

3O°C. Solidul se usucă sub vid peste P_aO₅ pentru a da L-alanil-L-leucinilsemicarbazona (L-Ala-L-LeuSc).

Exemplul 10. Prepararea matricei cromatografice de afinitate dirijată spre locul activ ECH-Sepharose 4B-LAla-L-PheSc.

ECH-Sepharose^R 4B (3 g greutate în stare uscată) se spală pe filtru se sticlă sinterizată cu NaCI (0,5 M, 240 ml) și apoi cu apă (120 ml). Clorhidrat de Netil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimidă (EDC) se dizolvă ăn apă pentru a da o soluție 0,1 M de EDC și pH-ul soluției de EDC se stabilizează la pH 4,5 prin adăugarea de acid clorhidric sau de acetat de sodiu solid. L-Ala-L-PheSc (10 mg), preparată așa cum s-a descris în exemplul 1, se dizolvă în metanol (400 ml) și se adaugă la gelul spălat împreună cu EDC apos (0,1 M, 2,4 ml). Amestecul se agită ușor la 20°C timp de o oră, pH-ul se reduce la 4,5 dacă este necesar și se continuă agitarea la 20°C timp de 23 ore. După aceea se adaugă L-glicină până la o concentrație finală de 1 M și agitarea la 20°C continuă încă 3 ore. Gelul cromatografic de afinitate se spală pe rând cu metanol apos (50 %, 60 ml), apă (60 ml) și tamponul de aplicare (60 ml) și se depozitează la 4°C până când este cerut

Exemplele 11-18. Prepararea matricelor de cromatografie de afinitate.

Fiecare dintre derivații dipeptidici preparați așa cum s-a descris în exemplele 2 până la 9 se cuplează cu o matrice gel în manieră asmenătoare cu cea descrisă la exemplul 10 pentru a da gelurile de cromatografie de afinitate ale exemplelor 11 la 18.

Exemplul 19. Cromatografia de afinitate.

Latex de papaia uscat prin pulverizare (0,03 g proteină) obținut dela Powell & Scholefield, Marea Britanie în tamponul de “aplicare” (fosfat de sodiu (50 mM); EDTA (1 mM); etadiol (33 %, pH 6,8) plusditiotreitol (2 mM) sau cisteină (4 mM) (1,5 ml) se aplică la o coloană de 1 ml din fiecare din matericele cromatografice de afinitate din exemplele 10-18. Se întrebuințează cel puțin unul din cei 5 eluanți care urmează:

Eluantul A = hidroxietildisulfură (100 mM) în etandiol apos (33 %) care conține citrat de sodiu (50 mM) și EDTA (1 mM), pH 4,5; coloana este echilibrată peste noapte înainte de folosire.

Eluentul B = 2,2'-dipiridildisulfură (30 mM) în etandiol apos (33 %) care conține citrat de sodiu (50 mM) și EDTA (1 mM), pH 4,5; coloana este echilibrată peste noapte înainte de utilizare.

Eluentul C = metilpiridildisulfură (30 mM) în etandiol apos (33 %) care conține citrat de sodiu (50 mM) și EDTA (1 mM), pH 4,5; coloana este echilibrată peste noapte înainte de utilizare.

Eluentul D = acid mersalil (10 mM) în etandiol apos (33 %] care conține hidroxid de sodiu (50 mM) și EDTA (25 mM), ajustat la pH 4,5 cu acid acetic; eluare continuă.

Eluentul E = HgCI₂ (10 mM) în etandiol apos (33 %) care conține acetat de sodiu (50 mM), pH 4,5; eluare continuă.

Eluarea cu fiecare dintre eluanți a fost evaluată prin inspectarea urmelor A_2Q0 în materialul eluant după cromatografia standard Mono S (Pharmacia). Rezultatele sunt prezentate în tabelul 1 de mai jos:

RO 112032 Bl

Tabelul 1 Legarea și eluarea chimopapainei

Peptida inhibitoare	Matricea (exemplul nr.)	Eluantul
A	B	C	D	E
L-Ala-L-PheSc	10	-	ND	+	+	+
L-Phe-L-PheSc	11	-	+	+	+	+
L-Phe-L-PheMo	12	-	+	ND	ND	ND
L-Phe-D-PheSc	13	-	ND	+	+	+
L-Phe-L-PheOx	14	+	+	ND	ND	ND
L-Ala-D-PheSc	15	+	ND	ND	+	ND
L-Tyr-L-PheSc	16	+	ND	ND	+	ND
L-Ala-L-ChaSc	17	+	ND	ND	ND	+
L-Ala-L-LeuSc	18	+	ND	ND	ND	+

+ Chymopapaină legată și eluată

- Chimopapaină nelegată și/sau neeluată ND nedeterminat

Exemplul 20. Purificarea chimo- 25 papainei (i) Latex uscat prin pulverizare din comerț de la Carica papaya (1 g) obținut de la firma Powell & Scholefield, Marea Britanie, se agită timp de o oră cu apă 30 distilată (5 ml) și materialul nedizolvat se îndepărtează prin centrifugare la 9000 xg timp de 30 min la 4°C. Peletele se descarcă și supernatantului i se modifică pH-ul la pH-ul la 1,8 cu acid clorhidric (1 35 M) pe o perioadă de 20 min.Se continuă agitarea la 4°C timp de 60 min și pH-ul se reajustează la pH 1,8 dacă este necesar.

(ii) Amestecul se centrifughează la 40 9000 xg timp de 30 min la 4°C și peletele se descarcă.

(iii) (a) pH-ul supernatantului se modifică la pH 6,8 prin adăugarea în picături de NaOH (5M) pe o perioadă de 45 10 min.Se observă că se produce o colorație albastru-purpuriu în soluție.

(b) Soluția albastru-purpuriu obținută se dializează extensiv cu 10 volume de tampon de “aplicare (fosfat de sodiu) (50 mM); EDTA (1 mM); etanadiol (33 %), pH 6,8 cu trei schimbări de tampon. Dializantul se centrifughează la 4000 x g timp de 10 min și conținutul de proteină al supernatantului decantat care conține chimopapaina se aduce la aproximativ 30 mg/ml. Soluția de chimopapaină se activează prin adăugarea de cisteină până la concentrație finală de 4 mM și se lasă să stea timp de 15 min la 0°C.

(iv) Soluția de chimopapaină activată se aplică la o coloană de 8 ml ECHSepharose³ cuplată cu L-Ala-L-PheSc (preparată așa cum s-a descris în exemplul 10), echilibrată în prealabil prin aplicare de tampon, cu o viteză de curgere de 36 ml/cm²/h. Coloana se spală după aceea cu tampon de aplicare (2 volume de pat), citrat de sodiu apos (50 mM) în etandiol (33 %), pH 4,5 (2 volume de pat) și acetat de sodiu apos (50 mM);

RO 112032 Bl

EDTA (25 mM); mersalil (10 mM] în etandiol (33 %), pH 4,5 (2 volume de pat) și apoi se incubează la temperatura camerei timp de 2 ore.

(v) Chimopapaina se eluează cu acetat de sodiu apos (50 mM) care conține mersalil (10 mM) (3 volume de pat) și fracțiile (4 ml) se colectează. Activitatea enzimei din fracțiile eluate se analizează pentru activitatea specifică față de ΒΑΡΝΑ așa cum s-a descris mai sus.

Fracțiile active se pun la un loc și se purifică în continuare prin cromatografie cu schimb de cationi pe o coloană Momo-S HR^r 10/10 (Pharmacia) cu un tampon fosfat de “pornire” de Na⁺ (50 mM); EDTA (1 mM); NaN3 (0,01 %), pH 7,2 și un tampon fosfat de eliminare” de Na⁺' (800 mM); EDTA (1 mM); NaN3 (0,01 %), pH 7,2. Eluarea se realizează cu un gradient de sare de 2,7 mM/ml și o viteză de curgere de 2 ml/min. Fracțiile (4 ml) se colectează, concentrațiile proteinei se estimează prin măsurarea absorbției la 280 mm și activitatea enzimei se analizează prin hidroliza ΒΑΡΝΑ.

Fracțiile care conțin chimopapaină se adună la un loc și se distilează extensiv față de apă distilată și deionizată sau EDTA apoasă (1 mM) și se ususcă prin înghețare pentru depozitare.

Exemplul 21. Purificarea chimopapainei - rezultatele analizei ΒΑΡΝΑ.

(i) Latex de Carica papaya uscat prin pulverizare din comerț (1 g) obținut de la firma Powell & Scholefield, Marea Britanie, se agită în apă (5 ml) timp de 60 min la 20°C. Materialul insolubil se îndepărtează prin centrifugare la 9000 x g timp de 30 min la 4°C. Peletele se descarcă și supernatantului i se modifică pH-ul la pH-ul la 1,8 prin adăugarea în picături de acid clorhidric (1 M) pe o perioadă de 20 min.Amestecul se agită 15 min la 4°C și după 5 min pH-ul se verifică și se modifică dacă este necesar.

(ii) Precipitatul se îndepărtează prin centrifugare la 9000 x g timp de 30 min la 4°C.

(iii) (a) Supernatantului i se modifică pH-ul la 7,0 prin adăugarea în picături sub agitare de hidroxid de sodiu apos (5M). Precipitatul se îndepărtează prin centrifugare la 9000 x g timp de 30 min la 4°C.

(b) Suprnatantul rezultat se aplică pe o coloană schimbătoare de cationi Mono S HR 10/10 (Pharmacia) care a fost în prealabil echilibrată cu Na₂HP0₄/ NaH₂P0₄ (50 mM Na⁺) apos care conține EDTA (1 mM), pH 7,2 (tamponul A). După aplicarea probei, coloana se spală cu 2 ml/min tampon A până ce A280 revine la zero. După aceea se aplică un gradient de 2,7 mM Na⁺/ml la Na2HP0₄/NaH₂P0₄ (0,80 mM Na⁺) pe coloană și se colectează fracțiile de 4 ml. Fracțiile se analizează pentru activitatea față de ΒΑΡΝΑ. Vârful mare al chimopapainei, determinat imunologic, eluează între 0,17 - 0,28 M Na⁺. Fracțiile active față de ΒΑΡΝΑ din această regiune se adună la un loc și se adaugă etandiol până la 33 % volum/volum. Toate celelalte fracții, inclusiv cele active față de ΒΑΡΝΑ din eluarea ulterioară (0,47 - 0,59 M Na⁺) a vârfului de proteină papaia III, se descarcă.

(iv) O colană (15 ml volum de pat) de ECH-Sepharose^R cuplată cu L-Ala-LPheSc (preparată așa cum s-a descris în exemplul 10) se spală (39 ml/oră/cm²) cu NaH₂P0₄/Na₂HP0₄ (50 mM Na⁺) apos (50 mM Na⁺) care conține EDTA (1 mM) în etandiol (33 %) volum/volum), pH 6,8 (tamponul de aplicare). Chimopapaina adunată (de mai sus) se activează prin adăugarea de cisteină bază (concentrație finală 4 mM) și se lasă timp de 15 min la 0°C. După aceea se aplică pe coloană, urmată de aplicarea tamponului 60 ml.

(v) Pe urmă se aplică acetat de sodiu (50 mM) tampon, pH 4,5 care conține HgCI₂ (10 mM), 45 ml). Se colectează tot timpul fraccții de 5 ml. Fracțiile se supun analizei pentru activitatea față de ΒΑΡΝΑ.

Fracțiile care conțin vârful de activitate care a fost întârziat pe coloană și eluate cu tamponul care conține HgCI₂

RO 112032 Bl se adună la un loc și se reaplică pe coloana Mono S.

Coloana se spală cu tampon A care conține cisteină bază (4 mM). Curgerea se oprește timp de 30 min 5 pentru a lăsa timp ca mercurul să fie scos din enzimă. Apoi curgerea este reluată și coloana se spală din nou cu tamponul A, după care se aplică un gradient până la NaH₂P0₄/Na_aHP0₄ (0,08 io M Na⁺) așa cum s-a descris mai sus. Fracțiile active față de ΒΑΡΝΑ se combină, se adaugă cisteină bază (4 mM concentrație finală] și materialul adunat se lasă apoi la 0°C timp de 15 minute.

într-o coloană se introduce rășină Chelex (Bio-Rad, Marea Britanie; 0,5 g) și se spală cu tamponul A. Materialul adunat conținând chimopapaină se trece prin coloana Chelex, apoi se dializează extensiv în EDTA apos (1 mM) și se usucă prin înghețare.

Procedeul de purificare a chimopapainei este prezentat în tabelul 2.

Tabelul 2

	Proteină (mg)	Activitate ΒΑΡΝΑ* (unități]	Activitate specifică ΒΑΡΝΑ* (unități mg1)	Randament* (%)	Purificare (ori)
Latex uscat prin pulverizare	441	493,712	1,210	100	1
Tratament acid	361	238,636	661	48	0,59
Cromatografie cu schimb cationic	58	133,748	2,306	27	2,06
Sepharose-L-Ala-L-PheSc	27,5	112,475	4,090	23	3,65
Cromatografie cu schimb cationic	11	44,687	4,062	9	3,63
Chelex	10,5	43,301	4,124	9	3,68

* Randamentul dat este randamentul activității față de ΒΑΡΝΑ (și cu un substrat pentru papaină și papaia proteinază III] * Metoda de analiză nr. 2 ΒΑΡΝΑ

Exemplul 22. Prepararea anticorpilor IgG specifici chimopapainei produși În iepure.

Chimopapaina pură preparată așa cum s-a descris în exemplul 21 se carboximetilează blând înainte de utilizarea prin metoda descrisă de Zucke și alții (1985) menționată mai sus. Antiserul de chimopapaină se dezvoltă într-un iepure prin injectarea intramusculară a 360 pg proteină carboximetilată în adjuvantul complet Freund urmată după două săptămâni de injectarea subcutanată a 100 pg în adjuvant incomplet. IgG este parțial purificată din antiseruri prin fracționare cu sulfat de amoniu cum este descris de Heide și Schwick (1978) citat anterior, urmată de dializă în fosfat de sodiu apos (10 mM] care conține NaCI (0,14 M), pH 7,3.

Exemplul 23. Purificarea chimopapainei și cuantificarea imunologică a chimopapainei și a PPIV.

(i-iii) Latex de Carica papaya uscat prin pulverizare din comerț (1 g) obținu t de la firma Powell & Scholefield, Marea Britanie se prepară și se supune tratamentului de ajustare a pH-ului la 1,8 așa cum s-a descris în exemplul 21 (i-iii).

RO 112032 Bl (iv) 0 coloană (15 ml volum al patului] de ECH-Sepharose^R cuplată cu LAla-L-PheSc (preparată cum s-a descris în exemplul 10) se spală așa cum s-a descris în exemplul 21 (iv). Superna- 5 tantul final de la tratamentul pentru pH

1,8 se dializează în NaH₂P0₄/Na₂HP0₄ apos (50 mM Na⁺) care conține EDTA (1 mM) în etandiol (33 % în volum] pH 6,8 (tamponul de aplicare], se centrifughează 10 la 4000 x g timp de 10 min și supernatantul se activează prin adăugarea de ditiotreitol (2 mM concentrație finală] timp de 15 min la 20°C. După aceea se aplică pe o coloană de afinitate (39 15 ml/oră/cm^p) și este urmată de 60 ml tampon de aplicare. Pe coloană se aplică apoi tampon citrat de sodiu (50 mM], pH 4,5, care conține EDTA (1 mM) și metilpiridildisulfură (30 mM); 15 ml) 20 (sintetizat așa cum a descris Salih și alții, Bioche.J. (1987), 247, pag 181-193). Curgerea este oprită și tamponul care conține disulfura se lasă pe coloană peste noapte (18 ore) la 20°C. 25 (v) Curgerea se reia cu adăugarea a 45 ml din același tampon care conține metilpiridildisulfură, urmate de 30 ml tampon de aplicare. Se colectează tot timpul fracții de 5 ml. 30

Fracțiile se supun analizei pentru activitatea față de ΒΑΡΝΑ. Fracțiile care conțin maximum de activitate ce este întârziată de coloană și eluate în tampon ce conține metilpiridildisulfură se adună 35 la un loc și se introduc pe o coloană (80 ml volum de pat] (40 ml/oră/cm^a] de Sepharose^R IH-20 (Pharmacia) care a fost în prealabil echilibrată cu EDTA apos (1 mM) în etandiol (33 % în volum). Cromatografierea se continuă prin aplicarea a 300 ml din acest tampon. Fracțiile de 8 ml se analizează pentru activitatea față de ΒΑΡΝΑ și se înregistrează prin AA₂₇₁.

Fracțiile care conțin maximum de activitate față de ΒΑΡΝΑ (care sunt urmate de un alt maxim de A₂₇₁) se adună și se aplică pe o coloană schimbătoare de cationi Mono S HR 10/10 lucrânduse cum s-a descris în exemplul 21 (iiib). Fracțiile active față de ΒΑΡΝΑ se combină.

Latexul uscat prin pulverizare și materialul recuperat de la tratamentul pentru pH 1,8, cromatografia de afinitate și cromatografia schimbătoare de cationi, se analizează pentru prezența PPIV prin imunodifuzia radială unică așa cum s-a descris mai sus. Aceeași metodă se utilizează pentru măsurarea cantității de chimopapaină, cu un anticorp mono-specific chimopapainei dezvoltat de iepure, preparat așa cum s-a descris în exemplul 22. Curba etalon pentru chimopapaină este realizată prin utilizarea chimopapainei purificate prin metodele descrise aici și ea arată că nu obține nici PPIV, nici PPIII prin imunodifuzia radială unică. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 3.

Tabelul 3

	Proteină (mg)	Activitate specifică ΒΑΡΝΑ* (unităti mg' 1)	Chimopapa ină (mg)	PPIV (% din total proteină)
Latex uscat prin pulverizare	468	1000	144	18,7
Tratament acid	157	1433	92	0,1
Sepharose-L-Ala-L-PheSc	24	4000	28	+
Cromatografie cu schimbători de ioni	15	3533	14	188

+ nu s-a detectat + metoda de analiză nr. 2 ΒΑΡΝΑ

RO 112032 Bl

Exemplul 24. Studiul alergiei la chimopapaină

S-au procurat 40 probe de ser uman de la 3M Diagnostic Systems, SUA. Aceste probe aveau deja efectuat un test existent în comerț cunoscut sub numele Chymofast, pentru IgG față de o formă de chimopapaină existență în comerț, Chymodiactin^R. 20 probe au fost stabilite ca pozitive Chymofas și 20 ca negative. Cele 40 de probe au fost recepționate ‘‘oarbe” și au fost testate în continuare pentru existența anticorpilor naturali IgF față de Chymodiactin^R, PPIII și față de chimopapaina purificată (purificată prin metodele descrise în prezente invenție și la care s-a demonstrat că lipsesc PPIV și PPIII prin imunodifuzia radială unică] utilizând analiza cu un imunosorbent în fază solidă modificat legat de enzimă (ELISA] folosind sistemul biotin-avidin, așa cum se arată mai jos: Plăci de microtitru acoperite cu: antigen de test ser de test

IgE anti-uman monoclonal

Ig de iepure anti-șoarece biotinilat complex avidin-peroxidază substrat (ABTS)

A₄₁₀ de oprire și măsurare Chymodiactin^R s-a utilizat în termenul de expirare, PPIV a fost purificată așa cum s-a descris aici și PPIII a fost purificată conform cu Buttle și Barrett (1984) menționat mai sus. Toți antigenii au fost inactivați prin carboximetilare blândă cu acid iodacetic (10 mM) așa cum au descris Buttle și Barrett (1984) menționat mai sus înainte de utilizare.

Celulele unei plăci de microtitrare se acoperă cu antigenul de test prin incubarea fiecărei celule (orificiu] cu 100 pl antigen de test (10 pg/ml) în tampon carbonat de sodiu (0,05 M, pH 9,6). Serul de cal donor (4 %) se utilizează apoi pentru a reduce legătura nespecifică în timpul etapelor următoare. După incubarea cu serul de test (1/20 diluție) în PBS (0,1 % Tween, 2 % ser de cal, EDTA 10 mM, 50 pg/ml heparină; pH 7,2; 100 pl/celulă) la 37°C timp de 4 ore, urmează IgE anti-uman monoclonal (prteparat așa cum a adescris Kemeny & Richards în J.lmmunol.Methods 1988), 108, pag. 105; 1 pg/ml, 100 pl/celulă) la 37°C timp de 3 ore și apoi Immunoglobilina de iepure anti-șoarece biotinilat (ce se procură de la Dakopatts, Danemarca, 1 pg/ml, 100 pl/celulă] la temperatura camerei peste noapte. Celulele se incubează timp de 30 min la 37°C cu avidin-peroxidază (10 pl/ml, 100 pl/celulă), se adaugă substratul ABTS (2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolinsulfonic acid), 0,5 mg/ml în tampon (100 mM acid citric, Na₂HP0₄ 200 mM, pH 4,2, activat cu 1 pl/ml H₂0₂) și celulele se incubează la temperatura camerei timp de 30 min.Reacția se stopează prin adăugarea de 100 pl/celulă acid citric 100 mM, 0,01 % NaN₃ și se determină absorbanța la 410 mm pentru fiecare celulă, utilizând un cititor Micro ELISA (Dynatech). Standardele IgG se analizează pe intervalul 0,075 până la 4,8 ng/ml (2,4 ng IgH = o unitate internațională IgE). Programul Enzfitter (Lestherbarrew, R.J., 1985, Enzfitter pentru IMB PC, Elsevier-Biosoft, 68 Hille Road, Cambridge CB2 1LA, Marea Britanie) s-a folosit pentru a calcula concentrațiile de IgE îndreptate împotriva fiecăreia din cele patru preparate de antigen, Chymediactin^R, PPIII, PPIV și chimopapaina preparată așa cum s-a descris în exemplul 23.

din cele 40 probe de ser testate au conținut anticorpi IgE contra Chymodiactin^R și valorile obținute pentru PPIII, PPIV și chimopapaina din 12 din cele mai reactive față de Cgymediactin sunt prezentate în tabelul 4 de mai jos. Valorilor medii și standard au fost derivate din 9 determinări.

Se poate vedea că din aceste 12 probe de ser care conțin anticorpi antiChymodiactin, numai 2 anti-chimopapaina reprezintă replica IgE majoră și anticorpii contra PPIII și PPIV reprezintă aproximativ 75 % din IgE relevantă detectată.

Concentrațiile specifice IgE (lU/ml) în probele de ser care conțin anticorpi IgE contra Chymodiactin^R sunt prezentate în tabelul nr. 4.

RO 112032 Bl

Tabelul 4

Proba	PPIV	PPIII	Chimopapaina	Total %	Chimopapaină
Medie	SBM	Medie	SBM	Medie	SBM
1	19,9	1.7	18,8	1,7	8,2	1,3	46,9	18
2	5,1	0,3	4,0	0,1	3,2	0,4	12,3	26
3	5,9	0,4	2,7	0,3	1,2	0,3	9,8	12
4	1,8	0,1	2,3	0.2	1.7	0,1	5,6	29
5	3,4	0,2	2,0	0,2	1.6	0,3	7,0	23
6	3,1	0,2	0,3	0,01	0,3	0,03	3,7	8
7	2,6	0,2	1,6	0,2	0,9	0,2	5,1	18
8	2,0	0,1	1,1	0,1	1.3	0,2	4,4	30
9	1.5	0,2	0,3	0,07	1.7	3,5	3,5	49
10	1,0	0,1	0,3	0,09	0,5	1,8	1,8	28
11	3,6	0,4	1,4	0,2	0,7	5,7	5,7	12
12	0,6	0,1	0,4	0,09	2,3	3,3	3,3	70
TOTAL	50,6	35,2	23,6	109,3	medie 22

Exemplul 25. Inhibarea cu cis- 25 tatină de pui a.amestecurilor de chimopapaină și PPIV.

Chimopapaina se purifică așa cum s-a descris în exemplul 23 și se standardizează prin titrarea locului activ cu E- 3 o 64, utilizândBAPNA ca substrat (Zucker și alții, 1985, Biochem.Biophys.Acta 828 pag. 196-204). PPIV, purificată așa cum s-a descris mai sus, se titrează de asemenea cu E-64, printr-o adaptare a 35 acestei metode pentru utilizarea azocazeinei ca substrat.

Cisteina de pui forma 2 s-a purificat așa cum se descrie de către Anastasi și alții, 1983, Biochem.J. 211, pag. 40 129-138 și s-a standardizat prin titrare cu papaină care fusese anterior titrată cu E-64.

Analizele pentru hidroliza azeocazeinei s-au făcut prin metoda lui Rowan 45 și alții, 1988, citat anterior, cu excepția faptului că preincubarea enzimelor s-a făcut 15 min de 40°C și că inhibitorul s-a încorporat înainte de adăugarea subs tratului.

S-au luat două seturi a câte 9 eprubete și în fiecare eprubetă s-au introdus 125 pl tampon fosfat de sodiu 0,40 IVI care conține EDTA 4 mM și cisteină bază 16 mM, pH 6,8. S-au adăugat chimopapaină și PPIV, în rapoarte variabile la concentrația finală a proteinei de 100 nM. La un set de eprubete s-a adăugat cisteină de pui până la concentrația finală de 1 pM și același volum de apă la celălalt set. Eprubetele au fost apoi preincubate și s-a analizat activitatea de hidrolizare a azeocaseinei.

Efectul cistatinei de pui asupra hidrolizei azeocazeinei prin amestecurile de enzime s-a exprimat ca procentaj de inhibare a activității produse de aceleși amestecuri de enzime în absența cistatinei așa cum se arată în tabelul 5.

Procentajul de inhibare de către cistatina de pui a amestecurilor de chimopapaină și PPIV este prezentat în tabelul 5.

RO 112032 Bl

62

Tabelul 5

PPIV (nM)	Chimopapaină (nM)	A366 -cisteină	A366 +cisteină	% Inhibare
100	0	0,092	0,094	0
80	20	0,158	0,102	35,4
70	30	0,191	0,088	54,0
60	40	0,316	0,06	80,0
50	50	0,347	0,058	83,3
40	60	0,428	0,066	84,5
30	70	0,543	0,028	94,8
20	80	0,588	0,033	94,4
0	100	0,733	0,008	98,9

Se poate vedea că gradul de 20 inhibare de către cistatină de pui este invers proporțional cu concentrația de PPIV.

Exemplul 26. Purificarea chimopapainei prin precipitarea acidă la pH 25 2,2-1,2.

i) Latex de Carica papaya uscat prin pulverizare existent în comerț, obținut de la firma Powell & Scholefield, Marea Britanie, este adus la 20 % (gre- 30 utate/volum) cu apă distilată și agitat timp de o oră. Materialul nedizolvat se îndepărtează prin centrifugare la 9000 x g timp de 30 min la 4°C. Peletele se descarcă și pH-ul supernatantului se re- 35 duce prin adăugare de acid clorhidric (1 M) în picături cu agitare la 4°C, cu un debit de 40 pl/minut/ml. pH-ul amestecului se înregistrează continuu utilizând un electrod combinat Radiometer (tip GK 40 24010) calibrat cu soluții tampon etalon la pH 4,01 și pH 1,09 (Radiometer, 25°C). La pH 2,2 și la intervale de 0,2 unități de pH în jos până la 1,2 adăugarea de acid se oprește și pH-ul se 45 menține constant în timp ce se continuă agitarea la 4°C. După aceea se scoate și se depozitează o par te alicotă (echivalentă cu 10 ml soluție de pornire). Adăugarea de acid clorhidric la soluția rămasă se continuă până când se atinge următorul interval de pH.

ii) Toate probele se centrifughează la 9000 x g timp de 30 min la 4°C și peleții se descarcă.

iii) pH-ul fiecărui supernatant se modifică la pH 6,8 prin adăugarea în picături de NaOH 1M (400 pl/minut). Fiecare probă se centrifughează din nou la 9000 x g timp de 30 min pentru a îndepărta orice precipitat suplimentar.

într-o altă experiență se efectuează precipitarea acidă la pH 1,8 la 25°C.

Supernatanții finali sunt fiecare analizați în ce privește activitatea față de ΒΑΡΝΑ și prezența PPIV și a chimopapainei conform cu prezența invenție prin imunodifuzia radiată unică așa cum s-a descris mai sus. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 6 și arată că îndepărtarea PPIV până la nivele mai mici de 0,1 % din totalul proteinei se realizează cu precipitarea acidă la 4°C la pH 1,8 și mai jos de și până la sub 0,5 % prin precipitare la 25°C la pH 1,8.

RO 112032 Bl

Tabelul 6

Condițiile	Temperatura (°C)	Proteina (mg)	Activitate ΒΑΡΝΑ* (unităti x 103)	Activitate specifică ΒΑΡΝΑ* (unităti mg1)'	Chimopapaină	PPIV (% din total proteină)
Soluția de plecare	-	946	15,8	1670	208	20,30
pH- 2,2	4	848	9,5	1120	231	7,56
pH- 2,0	4	865	9,1	1052	230	1,20
pH- 1,8	4	796	9,0	1131	199	0,09
pH- 1,6	4	828	7,7	930	224	0,06
pH- 1,4	4	869	7,8	898	225	0,05
pH- 1,2	4	784	7,1	906	166	0,03
pH- 1,8	20	925	8,3	897	269	0,43

* metoda de analiză nr. 2 ΒΑΡΝΑ.

Exemplul 27. Prepararea anticorpilor IgG monospecifici dezvoltați în oaie.

Chimopapaină pură preparată așa cum s-a descris în exemplul 21 se carboximetilează blând înainte de utilizare prin metoda descrisă de Zucker și alții (1985) menționată anterior și se dializează în fosfat de sodiu apos (10 mM), pH- 7,3 care conține NaCI (0,14 M). Antiserul la chimopapaină se dezvoltă într-o oaie prin injecție intramusculară cu 100 pg proteină carboximetilată în adjuvant complet Freund, urmată după o lună de 50 pg, și se prezintă în același fel. IgG se purifică parțial din antiser prin fracționare cu sulfat de amoniu așa cum au descris Heide și Schwick (1978) citat anterior, după care se dializează în fosfat de sodiu apos (10 mM) care conține NaCI (0,14 M) la pH-7,3.

Preparatele IgG de anticorpi față de papaină, proteinaza papaia III și proteinaza papaia IV se prepară în mod asemănător.

Antigenii carboximetilați individuali sunt cuplați separat conform cu instrucțiunile fabricanților care însoțesc coloanele furnizate sub numele comercial

Zetaffinity (Anachem) echilibrate în fosfat de sodiu apos (10 mM) la pH 7,3 care conține NaCI (0,14 M). Contaminarea potențială sau anticorpii din reacții secundare sunt scoși afară prin absorbție din preparatele IgG prin trecerea prin aceste coloane astfel încât preparatele IgG dau reacții de precipitare cu anticorpii lor respectivi, dar nu se produc reacții secundare de precipitare cu anticorpi diferiți. Coloanele care leagă antigenul se regenerează pentru reutilizare cu dietilamină apoasă (0,05 M), pH 11,5 și se reechilibrează imediat în tampon fosfat.

în felul acesta preparatele monospecifice de anticorpi IgG contra chimopapainei, PPIII și PPIV și a papainei se separă și se pot utiliza pentru analizele cantitative ale fiecărui antigen prin imunodifuzie radială unică așa cum s-a descris mai sus.

Exemplul 28. Purificarea chimopapainei - precipitarea acidă la pH 1,5.

i) Latex de Carica papaya uscat prin pulverizare luat din comerț (20 g) de la firma Siebels, SUA, se agită în apă distilată și deionizată (prerăcită la 4°C, 250 ml) timp de 60 min la Q°C. pH-ul

RO 112032 Bl amestecului se modifică la pH 1,5 prin adăugarea de acid clorhidric 1 N cu un debit de 10 pl/minut/ml timp în acre pH-ul se înregistrează continuu, utilizând un electrod combinat Radiometer (tip GK 5 2401C) calibrat cu soluții tampon la pH 4,01 și 1,09 (Radiometer, 25°C). Când se ajunge la pH de 1,5, se lasă o perioadă de 10 min pentru ca pH-ul să se stabilizeze, timp în care pH-ul este în io continuare ajustat dacă este necesar.

ii] Amestecul se centrifughează la 12000 x g timp de 30 min la 4°C și peletele se descarcă.

iii) (a) pH-ul supernatantului se 15 modifică la pH 7,0 prin adăugarea de NaOH (1 m) cu un debit de 10 μΙ/min/ml cu continua înregistrare a pH-ului utilizând electrodul Radiometer calibrat cu soluție tampon etalon de 20 7,01 (Radiometer, 25°C). Când se ajunge la pH 7,0, se lasă să stea o perioadă de 10 min pentru a se stabiliza pH-ul, timp în care pH-ul este în continuare ajustat dacă este necesar. Ames- 25 tecul se centrifughează la 12000 x g, timp de 30 min, la 4°C și peletele se descarcă.

(b) Supernatantul se dializează extensiv la 4°C față de 30 volume de apă 30 deionizată și distilată cu două schimbări făcute la intervale de 12 ore.

Soluția dializată este în continuare purificată prin cromatografie cu schimbători de cationi pe o coloană S-Sepha- 35 rose de înaltă performanță 35/100 (Pharmacia). Pentru fiecare experiență se utilizează maximum 3 g proteină (determinate prin A_28Q). Coloana se preechilibrează cu EDTA apoasă (1 mM) la 4°C. După aplicarea probei, coloana se spală cu EDTA apoasă (1 mM) la debit de 10 ml/minut până când A_28O revine la zero.

Se introduce în coloană un gradient (0,175 mM K⁺/ml) până la 0,5 M K⁺ și tot timpul se colectează fracții a câte 25 ml. Fracțiile de vârf se analizează pentru activitatea față de ΒΑΡΝΑ.

Fracțiile care conțin chimopapaină cu activitatea specifică cea mai mare față de ΒΑΡΝΑ (eluate între 0,17 și 0,22 M K⁺) se adună la un loc. Chimopapaina colectată astfel se dializează extensiv la 4°C contra a 30 volume de apă deionizată și distilată cu cinci schimbări făcute la intervale de 12 ore. Dializatul este uscat prin înghețare și se depozitează la -20°C.

întregul procedeu de purificare se repetă cu o serie de prilejuri. Prezența chimopapainei conform invenției, a papainei a PPIII și a PPIV, este analizată utilizând imunodifuzia radială unică așa cum s-a descris mai sus și anticorpii propuși în oaie așa cum s-a descris în exemplul 27. Activitatea față de ΒΑΡΝΑ și titrarea locului activ cu acid iodacetic s-a efectuat utilizând metoda ΒΑΡΝΑ nr. 1 descrisă mai sus. Progresul realizat la purificări este prezentat prin valorile medii arătate în tabelul 7.

Tabelul 7

	Total prote-ină (mg)	Activitate specifică ΒΑΡΝΑ (unități mg1)’	Locuri active (%)	Chimopapaină (% din total proteină)	PPIV (% din total proteină)	PPIII (% din total proteină)	Papaină [% din total proteină)
Material de pornire	10203	572	30	25	22	14	5
pH 1,5	8168	461	28	30	0,1	14	<0,1
Dializă	4351	674	42	59	0,1	24	<0,1
Cromatografie cu schimb cationi	948	1079	72	100	0,1	<0,1	<0,1
Dializă	767	1098	89	100	0,1	<0,1	0,1
Uscare prin înghețare	ND	905-	ND	ND	ND	ND	ND

ND nu s-a determinat

Proteina estimată prin greutatea totală uscată

RO 112032 Bl

Exemplul 28. Purificarea chimopapainei - precipitarea acidă la pH 1,5 și cromatografiere de afinitate.

i-iii] Latex de Carica papaya uscat pulverizat din comerț (50 g] obținut de la firma Siebels, SUA, se prepară și se supune tratamentului la pH 1,5 așa cum s-a descris în exemplul 28 (i-iii) a). Supernatantul se dializează extensiv la 4°C contra a 30 volume de apă deionizată și distilată cu două schimări făcute la intervale de 12 ore.

iv) 0 coloană (350 ml volum de pat) de ECH-Sepharose^R cuplată cu L-AlaL-PheSc (preparată așa cum s-a descris în exemplul 10) se echilibrează cu etandiol apos (33 % volum/volum) care conține acetat de sodiu (50 mM), pH 4,5 peste noapte și apoi se echilibrează cu NaH₂P0₄/Na₂HP0₄ apos (50 mM Na⁺) care conține EDTA (1 mM) în etandiol (33 % volum/volum) la pH 6,8 (tamponul de aplicare).

Supernatantul dializat (de mai sus) se filtrează utilizând un filtru cu mărimea perilor de 0,2 pm adăugând etandiol până la 33 % (volum/volum). pH-ul soluției se verifică și se modifică la pH 7,0 dacă este necesar. Se adaugă L-cisteină apoasă (200 mM) propaspăt preparată până la o concentrație de 4 mM, soluția se amestecă bine și se lasă să stea timp de 15 min la 4°C. După aceea ea se introduce în coloana de afinitate la 4°C cu un debit de până la 40 ml/h/cm². Coloana se spală cu 10 volume de pat de tampon de aplicare.

v) Chimopapaina se eluează cu 3 volume de pat de HgCI₂ apoasă (10 mM) în etandiol (33 % volum/volum) care conține acetat de sodiu (50 mM), pH 4,5 și se colectează fracții de câte 25 ml. Fracțiile care au activitate față de ΒΑΡΝΑ se adună la un loc și se purifică mai departe prin cromatogtafie schimbătoare de cationi pe o coloană S-Sepharose de înaltă performanță 35/100 (Pharmacia).

Coloana se pre-echilibrează cu EDTA apos (1 mM) la 4°C. După ce se aplică proba în coloană, ea se spală cu EDTA apos (1 mM) la 10 ml/min debit până când A₂₈₀ revine la zero. Se aplică trei volume de pat de K₂HP0₄/KH₂P0₄ apos (50 mM K⁺), pH 7,2 care conține EDTA (1 mM) și L-cisteină (500 mM) în coloană și curgerea se oprește timp de 30 min. Apoi se aplică în coloană alte trei volume de pat tampon de cisteină proaspăt preparată și curgerea se oprește timp de 30 min.Coloana se spală cu alte șase volume de pat tampon de cisteină și apoi se re-echilibrează cu K₂HP0₄/ KH₂P0₄ apos (50 mM K⁺) care conține EDTA (1 mM), pH 7,2.

Se aplică în coloană un gradient (0,175 mM K⁺/ml) până la 0,5 M K⁺ și tot timpul se colectează fracții a câte 25 ml. Fracțiile de vârf se analizează pentru activitatea față de ΒΑΡΝΑ. Primul vârf eluat între 0,2 și 0,25 M K⁺ este chimopapaină. Al doilea vârf, eluat la aproximativ 0,45 m K⁺, este proteinază papaia III.

Fracțiile care conțin chimopapaina cu activitate specifică cea mai mare față de ΒΑΡΝΑ se adună la un loc. Chimopapaina astfel adunată se dializează extensiv la 4°C, contra a 30 volume de apă deionizată și distilată cu cinci schimbări făcute la intervale de 12 ore.

Chimopapaina eluată din coloana de cromatografie cu schimb de cationi se activează cu tampon de cisteină și de aceea este susceptibilă de inactivare prin oxidare. Pentru a preveni în mare măsură sau a reduce mult inactivarea enzimei active prin oxidare, fracțiile se colectează în eprubete care conțin o suspensie de tetrationat de sodiu (200 mM) pentru a da o concentrație finală de 5 mM NaS₄0₆ în fiecare fracție. Se poate lucra și altfel și anume chimopapaina adunată la un loc se dializează sub azot contra apei din care s-a scos oxigenul prin barbotarea sa cu azot, cu un debit de 0,1 l/minut, timp de 30 min într-un container etanș sub azot.

în final dializatul se usucă prin înghețare și se depozitează la -20°C.

întregul procedeu de purificare se repetă pe o serie de alte probe și progresul purificărilor (analizat așa cum s-a descris în exemplul 28) este rezumat prin valorile medii arătate în tabelul 8.

RO 112032 Bl

Tabelul 8

	Total proteină (mg]	Activitate specifică ΒΑΡΝΑ (unități mg'1]	Locuri active (%J	Chimopapaină (% din total proteină)	PPIV (% din total proteină)	PPIII (% din total proteină)	Papaină (% din total proteină)
Material de pornire	25.508	527	30	25	22	14	5
pH 1,5	20.421	401	28	30	<0,1	14	<0,1
Dializă	10.877	674	42	59	<0,1	24	<0,1
Sepharose-L-AlaL-PheSc	1.673	1446	86	66	<0,1	13	<0,1
Cromatografie cu schimb cationi	951	1625	100	100	<0,1	<0,1	<0,1
Dializă	828	1743	100	ND	ND	ND	ND
Uscare prin înghețare	ND	1320-	ND	ND	ND	ND	ND

ND nu s-a determinat

Proteina estimată la total greutatea uscată

Exemplul 29. Purificarea chimo- 25 papainei - precipitarea acidă la pH 1,5 și cromatografiere de afinitate.

i-iii) Latex de Carica papaya uscat prin pulverizare obținut de la firma Siebels, SUA, se prepară și se supune 30 tratamentului la pH 1,5, dializei și cromatografiei cu schimbători de cationi pe S-Sepharose^R așa cum s-a descris în exemplul 28.

iv) Fracțiile care conțin chimo- 35 papaină cu activitatea specifică cea mai mare față de ΒΑΡΝΑ se adună la un loc și se adaugă etandiol până la 33 % (volum/volum). Se adaugă L-cisteină apoasă (200 mM] propaspăt preparată 40 până se ajunge la o concentrație de 4 mM și soluția se aplică pe o coloană

ECH-Sepharose^R cuplată cu L-Ala-LPheSc asa cum s-a descris în exemplul 29 (iv],

v] Chimopapaina se eluează cu trei volume de pat de HgCI₂ apoasă (10 mM) în etandiol (33 % volum/volum) care conține acetat de sodiu (50 mM), pH 4,5 și se colectează fracții de câte 25 ml. Fracțiile care au activitate față de ΒΑΡΝΑ se adună și se dializează extensiv la 4°C contra a 30 volume apă deionizată și distilată cu cinci schimbări la intervale de 12 ore. Dializatul se usucă prin înghețare și se depozitează la -20~° C.

Progresul purificării (analizată așa cum s-a descris în exemplul 28) este prezentat în tabelul 9.

RO 112032 Bl

72

Tabelul 9

	Total prote-ină (mg)	Activitate specifică ΒΑΡΝΑ (unități mg1)	Locuri active (%)	Chimopapaină (% din total proteină)	PPIV (% din total proteină)	PPIII (% din total proteină)	Papaină (% din total proteină)
Material de pornire	28.795	632	31	27	25	16	6
pH 1,5	23.257	458	24	28	<0.1	13	<0,1
Dializă	8.319	916	57	75	0,2	25	<0,1
Cromatografie cu schimb ionic	3.102	1103	72	91	<0,1	<0,2	<0,1
Sepharose-L-AlaL-PheSc	947	1245	89	ND	ND	ND	ND
Dializă	858	1587	88	100	ND	<0,1	<0.1
Uscare prin înghețare	972	1265-	69	ND	<0.1	ND	ND

ND nu s-a determinat

Proteina estimată la total greutatea uscată

Exemplul 30. Două preparate de chimopapaină conform invenției se analizează utilizând metoda nr. 1 ΒΑΡΝΑ și metoda nr. 2 în aceeași zi. Proteina se estimează prin greutatea totală uscată. Preparatul A de chimopapaină este provenit dintr-un procedeu de purificare așa cum s-a descris în exemplul 28. Preparatul B de chimopapaină este provenit dintr-un procedeu de purificare așa cum s-a descris în exemplul 29 (fracțiile finale colectate în tetrationat de sodiu). Rezultatele analizei efectuate pe probe triple sunt cele din tabelul 10.

Tabelul 1O

Preparat de chimopapaină	Activitatea specifică ΒΑΡΝΑ (unități mg'1)
Metoda de analiză nr. 1	Metoda de analiză nr. 2
A	855	2227
B	1261	3591

Exemplul 31. Chimopapaina purificată așa cum s-a descris în exemplul 28 și dializată sub azot așa cum s-a descris, se usucă prin înghețare și se depozitează la -2O°C. Chimopapaina uscată prin înghețare are o activitate specifică față de ΒΑΡΝΑ (1 mM) la 37°C și pH 6,0 de 1345 unități mg^-1.

Pentru a prepara 100 fiole care să aibă compoziție cu chimopapaină purificată, se prepară o soluție vrac (43,75 g) așa cum se descrie mai jos. Soluția vrac se menține la 4°C până la 12°C tot timpul prelucrării.

Clorhidrat de L-(+)cisteină monohidrat (166 mg) se adaugă la aproximativ 30 g apă pentru injecție pentru a obține o concentrație de 22 mM în volumul final. pH-ul soluției se modifică la pH 5,0 până la 5,5 cu NaOH (1 M] sau HCI (0,1 M) sau HCI (0,1 M). Soluția de cisteină se adaugă la chimopapaina purificată (358 mg] pentru a obține o concentrație în volumul final de 11000 unități/ml. pH-ul soluției agitate se modifică la pH 5,9 până la 6,1 cu NaOH (1

RO 112032 Bl

M) sau Hcl (0,1 M) și se aduce la 43,75 g cu apă pentru injecții. Soluția se sterilizează prin trecerea prin două filtre cu mărimea porilor 0,2 microni, în serie 0,4 g alicote din soluție se introduc în fiole de sticlă 100 x 5 ml. Fiolele sunt acoperite cu dop, apa se îndepărtează prin uscare cu înghețare sub presiune redusă și tiolele care conțin produsul liofilizat se etanșează sub vid.

Fiecare fiolă conține o pulbere amorfă albă care are 3,27 mg chimopapaină și 1,52 mg clorhidrat de cisteină de sodiu (nominal 4000 unități și 8 pmoli, respectiv lăsând 10 % spațiu gol). Compozițiile sunt în general reconstituite chiar înainte de utilizare prin adăugarea a 2 ml apă pentru injecții ca să se obțină o soluție injectabilă ce conține nominal 4000 unități chimopapaină și 4 mM Lcisteină.

Claims (16)

1. Revendicări

   1. Procedeu pentru purificarea chimopapainei, caracterizat prin aceea că cuprinde:

   a) incubarea unei soluții apoase de chimopapaină brută cu o matrice cromatografică cu afinitate direcționată spre o poziție activă care cuprinde o matrice suport cuplată covalent, eventual printr-un braț distanțator, la N-terminal al unei peptide reversibile inhibitoare de chimopapaină, în acre aminoacidul cu C-terminal al respectivei peptide este un derivat de fenilalanină, alanină, ciclohexilalanină sau leucină și respectiva peptidă fiind capabilă să se lege la poziția activă a chimopapainei mai puternic decât la poziția activă a PPIV astfel că respectiva peptidă se leagă la poziția activă a moleculei de chimopapaină; și

   b) eluarea chimopapainei cu un eluent adecvat.
2. 2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că aminoacidul cu C-terminal este D sau L-fenilalanină semicarbazonă, D sau L-fenilalanină-metoxiimină, D sau L-fenilalanilhoximă, D sau L-alanin-semicarbazonă, D sau L-ciclohexilalanin-semicarbazonă sau

   D sau L-leucin-semicarbazonă.
3. 3. Procedeu pentru purificarea chimopapainei, caracterizat prin aceea că cuprinde:

   a) precipitarea unui amestec apos conținând chimopapaină brută la un pH de la 1,2 la 1,8;

   b) separarea unei soluții apoase de chimopapaină brută din amestecul respectiv; și

   c) neutralizarea și eventual desalinizarea soluției de chimopapaină brută.
4. 4. Procedeu pentru purificarea chimopapainei, caracterizat prin aceea că cuprinde:

   a) precipitarea unui amestec conținând chimopapaină brută la un pH mai mic de 2,0;

   b) sepaparea unei soluții apoase de chimopapaină brută din respectivul amestec;

   c) neutralizarea și eventual desalinizarea respectivei soluții de chimopapaină brută;

   d) incubarea soluției obținute în etapa c) cu o matrice cromatografică cu afinitate direcțională la o poziție activă conținând o matrice suport cuplată covalent, eventual printr-un braț distanțator la N-terminal al unei peptide reversibile inhibitoare de chimopapaină în care aminoacidul cu C-terminal al respectivei peptide este un derivat de fenilalanină, alanină, ciclohexilalanină sau leucină și respectiva peptidă fiind capabilă să se lege la poziția activă a moleculei de chimopapaină; și

   e) eluarea chimopapainei cu un eluent adecvat.
5. 5. Procedeu conform revendicării 4, caracterizat prin aceea că precipitarea acidă este efectuată la un pH cuprins între 1,2 și 1,8.
6. 6. Procedeu conform revendicărilor de la 3 la 5, caracterizat prin aceea că cuprinde cel puțin o etapă de cromatografie cu schimb cationic.
7. 7. Procedeu conform cu oricare dintre revendicările 1,24 sau 5, caracterizat prin aceea că peptidă reversibilă inhibitoare de chimopapaină este aleasă dintre L-Ala-L-PheSc, L-Ala-D-PheSc, L

   RO 112032 Bl

   Phe-D-PheSc, L-Phe-L-PheMo, L-Phe-LPheOx, L-Tyr-L-PheSc, L-Ala-L-CheSc, și L-Ala-L-LeuSc.
8. 8. Procedeu conform cu oricare dintre revendicările anterioare, carac- 5 terizat prin aceea că produsul rezultat este o chimopapaină care are o activitate specifică față de ΒΑΡΝΑ (1 mM) la 37°C și pH 6,0 cuprinsă între 800 și 1700 unități per mg, și care conține mai io puțin de 0,2 % din fiecare dintre papaia proteinază III (PPIII), papaină și papaia proteinază IV (PPIV).
9. 9. Procedeu conform revendicări

   8, caracterizat prin aceea că produsul 15 rezultat este o chimopapaină care are o activitate specifică față de ΒΑΡΝΑ [1mM] la 37°C și pH 6,0 cuprinsă între 1000 și 1700 unități per mg,
10. 10. Procedeu conform cu oricare 20 dintre revendicările de la 1 la 7, caracterizat prin aceea că produsul este o chimopapaină care are o activitate specifică față de ΒΑΡΝΑ (2,5 mM) la 40°C și pH 6,8 cuprinsă între 3000 și 4500 25 unități per mg, și care conține cel puțin de 0,2 % din fiecare dintre papaia proteinază III (PPIII), papaină și papaia proteinază IV (PPIV).
11. 11. Procedeu conform reven- 30 dicării 10, caracterizat prin aceea că produsul rezultat este o chimopapaină care are o activitate specifică față de ΒΑΡΝΑ (2,5 mM) la 40°C și pH 6,8 cuprinsă între 3500 și 4500 unități per 35 mg,
12. 12. Procedeu conform cu oricare dintre revendicările de la 8 la 11, caracterizat prin aceea că produsul este o chimopapaină care are o activitate față de azocazeină care este cel puțin 95 % inhibată de concentrațiile de cisteină de pui până la 1 pm.
13. 13. Procedeu conform cu oricare dintre revendicările de la 8 la 12, caracterizat prin aceea că produsul este o chimopapaină care conține cel puțin 70 % enzimă activă.
14. 14. Procedeu conform cu oricare dintre revendicările de la 1 până la 7, caracterizat prin aceea că produsul este o chimopapaină care are o activitate specifică față de ΒΑΡΝΑ (1mM) la 37°C și la pH = 6,0, de cel puțin 1300 unități per mg, și care conține mai puțin de 0,2 % din fiecare dintre papaia proteinază III (PPIII), papaină și papaia proteinază IV (PPIV).
15. 15. Procedeu conform cu oricare dintre revendicările de la 1 până la 7, caracterizat prin aceea că produsul se utilizează în chemonucleoliză.
16. 16. Procedeu conform cu oricare dintre revendicările de la 1 până la 7, caracterizat prin aceea că produsul se utilizează pentru producerea unui medicament pentru aplicații în chemonucleoliază.