WO2013038936A1 - ペルオキシダーゼ反応の停止方法及び反応停止剤 - Google Patents

ペルオキシダーゼ反応の停止方法及び反応停止剤 Download PDF

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peroxidase
citric acid
salt
tetraalkylbenzidine
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一夫 中川
京子 上萩
浅田　起代蔵
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タカラバイオ株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase

Definitions

  • the present invention relates to a method for stopping a color reaction by peroxidase, and a stop agent used for the stop method. More specifically, the present invention relates to a method for stopping a color reaction by a peroxidase using tetraalkylbenzidine or a salt thereof as a color developing substance, and a stopper used in the stopping method.
  • an enzyme immunoassay method in which an antigen or antibody is labeled with an enzyme is widely used.
  • a sandwich method In this method, (1) a first antibody against a substance (antigen) to be measured is first solid-phased on a carrier such as a plate or a bead, and an antigen is added thereto. Then, the antigen is bound to the immobilized antibody. (2) Next, a second antibody labeled with an enzyme is added to form an immobilized antibody-antigen-labeled antibody complex.
  • the enzyme-labeled antibody not bound to the antigen is removed by washing, and the amount of the antigen is determined by measuring the enzyme activity bound to the solid phase. That is, since the enzyme activity is determined by the amount of the enzyme-labeled antibody bound to the solid phase, and the amount of the enzyme-labeled antibody is determined by the amount of the antigen bound to the immobilized antibody, the enzyme activity is correlated with the antigen amount.
  • the enzyme peroxidase is widely used because it has a relatively small molecular weight, a fast reaction, and high sensitivity can be expected in a short time.
  • peroxidase activity has been measured by various reaction methods.
  • the most commonly used method is the colorimetric determination of a dye by forming a coloring substance by oxidizing a coloring substance in the presence of a peroxide. Yes.
  • Various materials have been used as such coloring substances.
  • Orthophenylenediamine or the like has been used as a typical coloring material, but it is harmful to the human body and requires caution during use.
  • Tetraalkylbenzidine has been developed as a new coloring substance, and 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (hereinafter referred to as TMBZ), which has a very sensitive sensitivity and is non-carcinogenic, has been developed (non-patented). It is used in the sandwich method (Patent Document 1) and the test strip (Patent Document 2) because of its usefulness.
  • JP-A-62-28666 Japanese Patent Laid-Open No. 52-21892
  • a strong acid such as 0.5-2 M sulfuric acid is generally used.
  • sulfuric acid is used to stop the peroxidase reaction using tetraalkylbenzidine as the coloring material
  • the rate of fading increases as the color intensity increases and the risk of precipitate formation increases, affecting the reliability of the data. It was found that there is a possibility of affecting. Further, since the fading becomes prominent after 1 hour, it has been found that there is a problem in that the time condition of the measurement is remarkably limited.
  • an object of the present invention is to provide a method for stopping a color reaction with a peroxidase that suppresses fading after the reaction is stopped in a color reaction with a peroxidase, and a stop agent used in the stop method. .
  • the inventors of the present invention have made extensive studies in order to solve the above-described problem of improving the color stability after stopping the reaction. As a result, in the peroxidase reaction containing tetraalkylbenzidine as a color-developing substance, it was found that the reaction solution to which a reaction terminator containing citric acid was added had high coloration stability, and the present invention was completed.
  • [1] A method for stopping a peroxidase reaction, comprising adding citric acid to a peroxidase reaction solution containing a peroxidase and a tetraalkylbenzidine or a salt thereof to stop the reaction.
  • [2] The method according to [1], wherein the tetraalkylbenzidine or a salt thereof is 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine or a salt thereof.
  • [3] The method according to [1], wherein citric acid is added to the peroxidase reaction solution so that the final concentration is 0.125 M or more.
  • a peroxidase reaction terminator containing citric acid as an active ingredient is added to a reaction solution containing tetraalkylbenzidine or a salt thereof and peroxidase so that the final concentration of citric acid is 0.125 M or more.
  • the kit according to [7]. [9] (2-a) tetraalkylbenzidine or a salt thereof, (2-b) A kit for an enzyme immunoassay containing a peroxidase-labeled antibody or antigen and (2-c) a peroxidase reaction terminator containing citric acid as an active ingredient.
  • the peroxidase reaction terminator containing citric acid as an active ingredient is a reaction solution containing tetraalkylbenzidine or a salt thereof and peroxidase-labeled antibody or antigen, and the final concentration of citric acid is 0.125 M or more.
  • the kit according to [9], which is a reaction terminator added so that [11] The kit according to any one of [7] to [10], wherein the tetraalkylbenzidine or a salt thereof is 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine or a salt thereof.
  • the sensitivity or accuracy of the measurement of the peroxidase activity is improved.
  • citric acid is not toxic to the human body as it is used as a food additive, so it can be effective in stopping the reaction and improving the safety of the reaction stopper. The problem is less likely to occur.
  • the citric acid solution has a low metal corrosivity, so that it is not likely to corrode the analytical instrument.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the absorbance of a reaction solution after elapse of a color reaction with peroxidase by addition of sulfuric acid or citric acid aqueous solution of each concentration and the elapsed time.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the absorbance of the color reaction solution with peroxidase after the reaction is stopped by the addition of sulfuric acid and the PIP concentration.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the PIP concentration and the absorbance of the color reaction solution with peroxidase after the reaction was stopped by adding an aqueous citrate solution.
  • Peroxidase is an enzyme that reduces peroxides such as peroxides of hydrogen peroxide.
  • Peroxidase is known to be extracted from horseradish, milk, yeast, leukocytes, erythrocytes and the like.
  • peroxidase derived from horseradish which is widely used as a research reagent and labeling enzyme, is preferred.
  • the color reaction by peroxidase as used in the present invention refers to a reaction catalyzed by peroxidase, for example, a color reaction of a dye conjugated to a decomposition reaction of hydrogen peroxide.
  • a color reaction by peroxidase is sometimes simply referred to as a peroxidase reaction.
  • a peroxidase-labeled antibody or antigen is used and the amount of peroxidase activity is peroxidized.
  • An enzyme immunoassay method is described in which measurement is performed using a substrate solution containing a product and a coloring substance.
  • tetraalkylbenzidine or a salt thereof is used as a color developing substance, and therefore any method for measuring the amount of peroxidase activity using a substrate solution containing a color developing substance selected from peroxides and tetraalkylbenzidine or a salt thereof. This method is also applied.
  • the method of the present invention can be used in a method for detecting peroxides such as hydrogen peroxide using peroxidase, and a method for detecting and measuring peroxidase in a sample.
  • peroxidase is widely used for the detection of substances using antibodies, and the method of the present invention can be suitably used for enzyme immunoassays using peroxidase-labeled antibodies or antigens.
  • a liquid in which a peroxidase reaction is performed in such a method is referred to as a peroxidase reaction liquid, and the reaction liquid contains a peroxide, a peroxidase, and a tetraalkylbenzidine or a salt thereof as a coloring substance.
  • these components may be present in the reaction solution in advance or may be added separately.
  • the method for stopping the peroxidase reaction of the present invention is characterized in that the reaction is stopped by adding citric acid to the peroxidase reaction solution.
  • the reaction is stopped by adding citric acid to the peroxidase reaction solution.
  • the final concentration of citric acid in the reaction solution is 0.125 M or more
  • the color reaction by peroxidase is stably stopped.
  • absorbance measurement at 450 nm used in the end point assay of color reaction with peroxidase using 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine as a color substance the higher the final citric acid concentration, the higher the absorbance. Therefore, it is preferable in terms of measurement sensitivity.
  • the citric acid concentration is preferably 0.125M or more, more preferably 0.24M or more, still more preferably 0.5M or more, and even more preferably 1M or more after the final concentration after being added to the peroxidase reaction solution. is there.
  • the concentration of citric acid is not particularly limited, but for example, the final concentration of citric acid after addition to the peroxidase reaction solution is preferably 3M or less, more preferably 1.5M or less. Further, the preferred range of the final concentration of citric acid in the present invention is 0.980 M to 1.471 M (see Example 2 described later). In this invention, the citric acid solution prepared so that it may become this citric acid final concentration can be used as a reaction terminator.
  • the peroxidase in the present invention may be a peroxidase alone or a peroxidase labeled product.
  • the peroxidase-labeled product include peroxidase-labeled antibodies or antigens, and the labeled product can be prepared according to a known method.
  • the peroxidase-labeled antibody used in the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody against the substance to be measured, but a peroxidase-labeled monoclonal antibody is preferred from the viewpoint of measurement reproducibility. Labeling of the antibody with peroxidase can be performed by a known method, for example, a method using glutaraldehyde, a method using periodic acid, or a method using introduction of a maleimide group.
  • the tetraalkylbenzidine or a salt thereof used in the present invention is a derivative of benzidine, which is oxidized in combination with the decomposition of hydrogen peroxide by peroxidase to turn into a strong blue compound, and becomes yellow under acidity.
  • tetraalkylbenzidine examples include 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine.
  • the salt examples include 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine dihydrochloride dihydrate.
  • TMBZ 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine
  • a salt thereof preferably used in the present invention can measure peroxidase activity with very sensitive sensitivity and is non-carcinogenic. Is done.
  • the composition of the composition containing TMBZ used in the present invention is not limited as long as it can be used for a color reaction of a dye conjugated to a peroxidase reaction, and a commercial product such as a hydrochloride of TMBZ or a DMSO solution is used. can do.
  • the temperature at which the peroxidase reaction is stopped is not particularly limited as long as citric acid is sufficiently mixed with the reaction solution, but is preferably 4 to 37 ° C, more preferably 20 to 30 ° C.
  • the substance to be measured is not particularly limited.
  • Substances that are desired to be measured in fields such as research, diagnosis, and environmental measurement, and for which antibodies that bind to the substances can be obtained can be measured.
  • it includes antigens and allergens derived from human or non-human animal organisms, plants, microorganisms, and viruses.
  • the reaction of peroxidase can be stopped by citric acid, and as a result, the peroxidase activity can be measured by the coloration of tetraalkylbenzidine under acidic conditions. Therefore, as another aspect of the present invention, there is a method for measuring peroxidase activity, characterized in that citric acid is added to a peroxidase reaction solution containing peroxidase and tetraalkylbenzidine or a salt thereof to stop the reaction.
  • a reaction stopper for a peroxidase reaction containing citric acid as an active ingredient is provided.
  • the reaction terminator is preferably used in the method for terminating the peroxidase reaction of the present invention.
  • the reaction terminator in the present invention contains citric acid as an active ingredient, stops the reaction catalyzed by peroxidase when added to a reaction solution containing tetraalkylbenzidine and peroxidase, and is a yellow pigment produced after the reaction is stopped There is no limitation as long as the absorbance is stably maintained. Specifically, for example, an aqueous citric acid solution can be mentioned.
  • the citric acid content in the reaction terminator is not generally determined, and the final concentration of citric acid after being added to the peroxidase reaction solution is preferably 0.125 M or more, more preferably 0.5 M or more, and even more preferably 1 M or more.
  • a citric acid solution prepared to be suitable as a reaction terminator is preferably 3M or less, more preferably 1.5M or less. If it becomes such a citric acid concentration, the method for preparing the reaction terminator is not particularly limited, and for example, it can be prepared by dissolving citric acid monohydrate in water.
  • containing citric acid as an active ingredient means containing citric acid as a component that substantially stops the peroxidase reaction, and the reaction terminator of the present invention includes citric acid.
  • the well-known component which can stop peroxidase reaction may be contained in the range which does not impair the effect of this invention, and the component which does not participate in peroxidase reaction may be contained.
  • a kit containing a reaction terminator used in the method for terminating the peroxidase reaction of the present invention is also an aspect of the present invention.
  • the (1-a) tetraalkylbenzidine or a salt thereof in the kit those similar to those used in the method for terminating the peroxidase reaction of the present invention can be used, and among them, 3, 3 ′, 5, 5′-tetramethylbenzidine or a salt thereof is preferred.
  • the (1-b) reaction terminator is not particularly limited as long as it is a reaction terminator of the present invention.
  • the form of the kit and the method of use are not particularly limited.
  • (1-b) a peroxidase reaction terminator containing citric acid as an active ingredient, and (1-a) a reaction solution containing tetraalkylbenzidine and peroxidase are used.
  • the peroxidase activity can be measured by stopping the peroxidase reaction by adding so that the final concentration of citric acid is 0.125 M or more.
  • what is necessary is just to add the reaction terminator at the point which wants to stop reaction.
  • (2-a) tetraalkylbenzidine or a salt thereof A kit for an enzyme immunoassay containing (2-b) peroxidase-labeled antibody or antigen and (2-c) a peroxidase reaction terminator containing citric acid as an active ingredient can be mentioned.
  • the same one as used in the method for terminating the peroxidase reaction of the present invention can be used, and among them, 3, 3 ′, 5, 5′-tetramethylbenzidine or a salt thereof is preferred.
  • Examples of the peroxidase-labeled antibody or antigen include those described in the peroxidase reaction termination method of the present invention, and the preparation method is also the same.
  • reaction terminator is not particularly limited as long as it is the reaction terminator of the present invention.
  • kits and the method of use are not particularly limited.
  • (2-c) a peroxidase reaction terminator containing citric acid as an active ingredient, (2-a) tetraalkylbenzidine or a salt thereof and (2- b) Enzyme immunoassay can be performed by adding peroxidase to a reaction solution containing an antibody or antigen so that the final concentration of citric acid is 0.125 M or more and measuring peroxidase activity.
  • what is necessary is just to add the reaction terminator at the point which wants to stop reaction.
  • steps 1) to 3) can be carried out in exactly the same manner as in conventional enzyme immunoassay methods using peroxidase-labeled antibodies.
  • steps 1) to 3) can be carried out in exactly the same manner as in conventional enzyme immunoassay methods using peroxidase-labeled antibodies.
  • fading of the coloration that occurs after the reaction is stopped is suppressed, even if it takes time between steps 4) and 5), reproducible data can be obtained. .
  • the present invention can also be applied to enzyme immunoassays other than the sandwich method as described above (for example, competitive method, Western blot method).
  • kits containing the above Used for detection and quantification of substances to be measured (3-a) tetraalkylbenzidine or a salt thereof, (3-b) a peroxidase-labeled antibody that binds to the measurement target substance, or a peroxidase-labeled measurement target substance, and (3-c) a peroxidase reaction terminator containing citric acid as an active ingredient,
  • a kit containing the above is also encompassed by the present invention.
  • a method for stabilizing a color reaction by peroxidase comprising adding citric acid to a peroxidase reaction solution containing tetraalkylbenzidine as a color developing substance, [13] The method according to [12], wherein the tetraalkylbenzidine is 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine.
  • room temperature is 4 to 37 ° C. unless otherwise specified.
  • Example 1 Termination of Color Reaction by Peroxidase with Reaction Stopper Containing Citric Acid 1.5 mL Micro Centrifuge Tube (manufactured by Tref) and TMB One Component HRP Microwell Substrate (manufactured by SurModics) and 500 ⁇ L obtained by the present inventors After adding 20 ⁇ L of the anti-Rat Collagen 2 antibody-peroxidase labeled product solution using periodic acid, the mixture was stirred and allowed to stand at room temperature for 8 minutes to perform a color reaction with peroxidase. Next, 500 ⁇ L of various reaction stoppers were added to stop the reaction.
  • the reaction terminator is 0.5 M sulfuric acid prepared by diluting sulfuric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) with purified water, or citric acid monohydrate (manufactured by Nacalai Tesque) 0.25 M, 0.5 M 1M, 1.5M, and 2M aqueous solutions were used, and the final concentration of sulfuric acid or citric acid used in each reaction stopper in the reaction solution was 0.245M for sulfuric acid, 0.123M, 0.245M for citric acid, They were 0.490M, 0.735M, and 0.980M.
  • FIG. 1 shows 0.5M sulfuric acid ( ⁇ in FIG. 1) or citric acid aqueous solution of each concentration (in FIG. 1, 0.25M ( ⁇ ), 0.5M ( ⁇ ), 1M ( ⁇ ), 1.5M ( ( ⁇ )
  • FIG. 1 shows the relationship between the light absorbency of the reaction liquid after reaction stop by addition of 2M ((circle)), and elapsed time.
  • 0.5 M sulfuric acid or an aqueous citric acid solution having various concentrations was added for the purpose of stopping the reaction, no increase in the absorbance of the reaction solution was observed immediately after the addition. From this, it was shown that citric acid can stop the color reaction by peroxidase like sulfuric acid.
  • Example 2 Identification of a citric acid aqueous solution concentration at which an absorbance equivalent to that of a reaction solution after stopping the reaction with 0.5 M sulfuric acid was obtained.
  • the same test as in Example 1 was performed, and the absorbance at 450 nm of the reaction solution immediately after stopping the reaction was measured. .
  • the reaction was performed in quadruplicate and the average value of the measured values is shown in Table 1.
  • the reaction terminator used was 0.5 M sulfuric acid or an aqueous citric acid monohydrate solution of 2 M, 2.25 M, 2.4 M, 3 M.
  • the final concentration of sulfuric acid or citric acid in each reaction solution was 0.245 M for sulfuric acid, 0.980 M, 1.103 M, 1.176 M, and 1.471 M for citric acid.
  • Table 1 in the final concentration range of 0.980 to 1.471M, the reaction by substantially adding 0.5M sulfuric acid was obtained in the same measured value as the stop condition.
  • Example 3 Evaluation of Stability of Color Reaction by Peroxidase The following test was performed using TaKaRa Procollagen type I C-peptide (PIP) EIA Kit (Precoated) (manufactured by Takara Bio Inc.). After adding 100 ⁇ L of peroxidase-labeled anti-PIP monoclonal antibody solution attached to the kit to each well of the anti-PIP monoclonal antibody plate attached to the kit, add 20 ⁇ L of the PIP solution of each concentration prepared in advance to each well with a micropipette. The reaction was performed at 0 ° C. for 3 hours. The PIP solution was immediately added (within 5 minutes).
  • PIP Procollagen type I C-peptide
  • reaction solution was discarded, and after washing 4 times with PBS, 100 ⁇ L of the TMBZ solution supplied with the kit was added to each well with an 8-unit pipette and allowed to react at room temperature (20-30 ° C.) for 15 minutes.
  • 100 ⁇ L of a reaction terminator was added to each well in the order in which the TMBZ solution was added, and the reaction was stopped, and then mixed well.
  • the absorbance at 450 nm was measured 1 hour and 3 hours later.
  • the reaction solution after stopping the reaction was allowed to stand at room temperature. The reaction was performed in duplicate and the average value of the measured values was adopted.
  • FIG. 2 shows the reaction mixture at 450 nm immediately after the reaction was stopped by addition of 0.5 M sulfuric acid ( ⁇ in FIG. 2), 1 hour later ( ⁇ in FIG. 2), and 3 hours later ( ⁇ in FIG. 2).
  • FIG. 3 shows a color reaction solution with peroxidase immediately after stopping the reaction by adding 50 w / v% aqueous citrate solution ( ⁇ in FIG. 3), 1 hour later ( ⁇ in FIG. 3), and 3 hours later ( ⁇ in FIG. 3).
  • FIG. 3 shows the relationship between the light absorbency in 450 nm, and PIP density
  • the reaction solution after the termination of the reaction by addition of 0.5 M sulfuric acid is particularly fading under conditions where the PIP concentration is 640 ng / mL or more, and the degree of decrease in absorbance over time is high, and the reliability of the data. was damaged.
  • the reaction solution after the reaction was stopped by addition of citric acid maintained the absorbance curve immediately after the reaction was stopped even after 3 hours from the stop of the reaction. From this, it became clear that the color stability of the reaction solution after the stop of the color reaction by peroxidase was dramatically improved by using the reaction terminator containing citric acid according to the present invention as an active ingredient. This indicates that the accuracy of the measurement is improved and the limitation on the time condition of the measurement is improved.
  • the present invention the sensitivity or accuracy of measurement of peroxidase activity can be improved. Therefore, the present invention is useful in the fields of immunobiochemistry, genetic engineering, applied life science, and medicine.

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Abstract

　ペルオキシダーゼ及びテトラアルキルベンジジン又はその塩を含有するペルオキシダーゼ反応液に、クエン酸を好ましくは終濃度が０．１２５Ｍ以上となるよう添加することを特徴とする、ペルオキシダーゼ反応の停止方法。本発明により、ペルオキシダーゼ活性の測定の感度あるいは精度を向上することができ、加えて反応停止作業、反応停止剤の安全性の改善という効果も得ることができることから、本発明は、免疫生化学分野、遺伝子工学分野、応用生命科学分野、及び医学分野において有用である。

Description

ペルオキシダーゼ反応の停止方法及び反応停止剤
　本発明は、ペルオキシダーゼによる呈色反応の停止方法、及び当該停止方法に使用する停止剤に関する。更に詳しくは、テトラアルキルベンジジン又はその塩を発色物質としたペルオキシダーゼによる呈色反応の停止方法、及び当該停止方法に使用する停止剤に関する。
　体液中の成分、例えば血液中あるいは尿中の抗原又は抗体などを測定する方法として、抗原又は抗体を酵素で標識して使用する酵素免疫測定方法が普及している。代表的な方法としてサンドイッチ法があるが、この方法では（１）まず測定しようとする物質（抗原）に対する第１の抗体をプレートやビーズなどの担体に固相化しておき、これに抗原を添加して抗原を固相化抗体に結合させる。（２）次いで酵素で標識した第２の抗体を添加し、固相化抗体－抗原－標識抗体複合体を形成する。（３）そして抗原に結合しなかった酵素標識抗体を洗浄して除去し、その後固相に結合した酵素活性を測定することにより抗原量を求める。すなわち、酵素活性は固相に結合した酵素標識抗体の量によって決まり、その酵素標識抗体量は固相化抗体に結合した抗原量によって決まるので、酵素活性は抗原量に相関することになる。ここで酵素としては、分子量が比較的小さく、反応が早く、短時間で感度の高い測定が期待できるためペルオキシダーゼが広く用いられている。
　従来からペルオキシダーゼ活性は種々の反応方法で測定されているが、過酸化物の存在下、発色物質を酸化させることにより色素を形成させ、これを比色定量する方法が最も一般的に行なわれている。かかる発色物質としては種々のものが使用されてきた。代表的な発色物質としてオルトフェニレンジアミンなどが用いられていたが、人体に有害であり使用時に注意が必要であった。新たな発色物質としてテトラアルキルベンジジン、なかでも非常に鋭敏な感度が得られかつ非発癌性である３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（以下、ＴＭＢＺという）が開発され（非特許文献１）、その有用性のためサンドイッチ法（特許文献１）やテストストリップ（特許文献２）に用いられている。
特開昭６２－２８６６６号公報 特開昭５２－２１８９２号公報
テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、第３０巻、３２９９－３３０２頁、１９７４年
　ペルオキシダーゼによる呈色反応の停止には、一般的に０．５～２Ｍの硫酸のような強酸を用いる。ところがテトラアルキルベンジジンを発色物質に用いたペルオキシダーゼ反応の停止に硫酸を用いた場合、発色強度が高くなるにつれ退色の速さが速く、かつ沈殿物の生成リスクが高くなり、データの信頼性に影響を及ぼす可能性があることが分かった。また退色は１時間を超えると顕著になるため、測定の時間的条件が著しく制限される点においても問題があることが分かった。
　上記の現状に鑑み、本発明の目的は、ペルオキシダーゼによる呈色反応において反応停止後の退色を抑制するペルオキシダーゼによる呈色反応の停止方法、及び当該停止方法に使用する停止剤を提供することである。
　本発明者らは、上述した反応停止後の呈色安定性の改善という問題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、発色物質としてテトラアルキルベンジジンを含有するペルオキシダーゼ反応において、クエン酸を含有する反応停止剤を添加した反応液の呈色安定性が高いことを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明を概説すれば、下記[１]～[１１]に関する。
[１]　ペルオキシダーゼ及びテトラアルキルベンジジン又はその塩を含有するペルオキシダーゼ反応液にクエン酸を添加して反応を停止させることを特徴とする、ペルオキシダーゼ反応の停止方法。
[２]　テトラアルキルベンジジン又はその塩が３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン又はその塩である[１]記載の方法。
[３]　ペルオキシダーゼ反応液に終濃度が０．１２５Ｍ以上となるようクエン酸を添加する[１]記載の方法。
[４]　ペルオキシダーゼがペルオキシダーゼ標識物を含む[１]記載の方法。
[５]　ペルオキシダーゼ標識物がペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原である[４]記載の方法。
[６]　クエン酸を有効成分として含有する、[１]～[５]いずれかに記載のペルオキシダーゼ反応の停止方法に使用される反応停止剤。
[７]　（１－ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、及び
（１－ｂ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤
を含有するペルオキシダーゼ活性を測定するためのキット。
[８]　クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤が、テトラアルキルベンジジン又はその塩とペルオキシダーゼを含有する反応液に、クエン酸の終濃度が０．１２５Ｍ以上となるように添加される反応停止剤である[７]記載のキット。
[９]　（２－ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、
（２－ｂ）ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原、及び
（２－ｃ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤
を含有する酵素免疫測定法のためのキット。
[１０]　クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤が、テトラアルキルベンジジン又はその塩とペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原を含有する反応液に、クエン酸の終濃度が０．１２５Ｍ以上となるように添加される反応停止剤である[９]記載のキット。
[１１]　テトラアルキルベンジジン又はその塩が３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン又はその塩である[７]～[１０]いずれかに記載のキット。
　本発明によれば、ペルオキシダーゼ活性の比色定量において、反応後の呈色が安定化されるため、ペルオキシダーゼ活性の測定の感度あるいは精度の向上が実現される。また、硫酸による反応停止の際に見られる沈殿の発生がないために、ペルオキシダーゼ活性が高い領域での測定も可能となった。加えてクエン酸は、食品添加物として使用されているとおり人体への毒性がないため、反応停止作業、反応停止剤の安全性の改善という効果も得ることができ、強酸で懸念される流通上の問題が生じにくい。更にクエン酸溶液は金属腐食性が低いことにより、分析機器を腐蝕する恐れもすくないことも本発明の効果として挙げることができる。
図１は、硫酸又は各濃度のクエン酸水溶液の添加によるペルオキシダーゼによる呈色反応停止後の反応液の吸光度と経過時間との関係を示す図である。 図２は、硫酸添加による反応停止後のペルオキシダーゼによる呈色反応液の吸光度とＰＩＰ濃度との関係を示す図である。 図３は、クエン酸添水溶液加による反応停止後のペルオキシダーゼによる呈色反応液の吸光度とＰＩＰ濃度との関係を示す図である。
　ペルオキシダーゼは過酸化物、例えば過酸化水素のペルオキシドを還元する酵素である。ペルオキシダーゼは西洋わさび、牛乳、酵母、白血球、赤血球などから抽出されるものが知られているが、本発明には研究用試薬、標識用酵素として汎用されている西洋わさび由来のペルオキシダーゼが好ましい。
　本発明でいうペルオキシダーゼによる呈色反応とは、ペルオキシダーゼが触媒する反応、例えば過酸化水素の分解反応に共役した色素の呈色反応を言う。本明細書では、かかる色素のことを発色物質といい、ペルオキシダーゼによる呈色反応のことを単にペルオキシダーゼ反応と記載することもある。当該反応を利用するものとして、例えば石川榮治ら編集「酵素免疫測定法」、３０－４９頁（医学書院１９８２年発行）には、ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原を用い、ペルオキシダーゼ活性量を過酸化物及び発色物質を含有する基質溶液を用いて測定する酵素免疫測定法が記載されている。本発明では発色物質としてテトラアルキルベンジジン又はその塩を用いることから、ペルオキシダーゼ活性量を過酸化物及びテトラアルキルベンジジン又はその塩から選択される発色物質を含有する基質溶液を用いて測定する方法ならいずれの方法にも適用される。
　具体的には、本発明の方法は過酸化物、例えば過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて検出する方法や試料中のペルオキシダーゼを検出・測定する方法に利用することが可能である。また、前記のとおり、ペルオキシダーゼは抗体を用いた物質の検出に広く利用されており、本発明の方法はペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原を利用した酵素免疫測定法に好適に使用することができる。本発明では、かかる方法においてペルオキシダーゼ反応が行われる液のことをペルオキシダーゼ反応液といい、該反応液には、過酸化物、ペルオキシダーゼ、発色物質としてテトラアルキルベンジジン又はその塩が含有される。なお、これらの成分は、予め反応液に存在したものであっても、別途添加したものであってもよい。
　本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法では、前記ペルオキシダーゼ反応液にクエン酸を添加して反応を停止させることを特徴とする。本発明において、該反応液におけるクエン酸終濃度が０．１２５Ｍ以上であると安定にペルオキシダーゼによる呈色反応が停止される。また３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンを発色物質としたペルオキシダーゼによる呈色反応のエンドポイントアッセイで用いられる４５０ｎｍにおける吸光度測定を行う場合、更にクエン酸終濃度が高いほど吸光度が高くなり、測定感度の面で好ましい。よって、クエン酸濃度としては、ペルオキシダーゼ反応液へ添加された後の終濃度が好ましくは０．１２５Ｍ以上、より好ましくは０．２４Ｍ以上、更に好ましくは０．５Ｍ以上、更により好ましくは１Ｍ以上である。また、クエン酸の濃度に特に上限はないが、例えばペルオキシダーゼ反応液への添加後のクエン酸の終濃度が好ましくは３Ｍ以下、より好ましくは１．５Ｍ以下である。また、本発明におけるクエン酸終濃度の好適な範囲は、０．９８０Ｍ～１．４７１Ｍである（後述の実施例２参照）。本発明では、かかるクエン酸終濃度となるように調製されたクエン酸溶液を、反応停止剤として用いることができる。
　本発明におけるペルオキシダーゼは、ペルオキシダーゼ単体であっても、ペルオキシダーゼ標識物に含まれるものであってもよい。ペルオキシダーゼ標識物としては、ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原が挙げられるが、標識物の調製は公知の方法に従って行なうことができる。また、本発明に使用されるペルオキシダーゼ標識された抗体としては、測定対象物質に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のどちらでも良いが、測定の再現性の観点からはペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体が好ましい。抗体のペルオキシダーゼによる標識は公知の方法、例えばグルタルアルデヒドを用いる方法、過ヨウ素酸を用いる方法、マレイミド基の導入を利用する方法により実施することができる。
　また、本発明で用いられるテトラアルキルベンジジン又はその塩はベンジジンの誘導体であり、溶液中でペルオキシダーゼによる過酸化水素の分解と共役して酸化し強い青色の化合物に変わり、酸性下で黄色となる。テトラアルキルベンジジンとしては、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンが挙げられる。また、その塩としては、例えば３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン二塩酸塩二水和物が挙げられる。
　なかでも本発明に好ましく用いられる３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）又はその塩は非常に鋭敏な感度でペルオキシダーゼ活性を測定することができ、且つ非発癌性であるとされる。本発明に用いられるＴＭＢＺを含む組成物の態様としてはペルオキシダーゼ反応に共役した色素の呈色反応に使用できるものであれば限定はなく、ＴＭＢＺの塩酸塩など、又はＤＭＳＯ溶液などの市販品を使用することができる。
　ＴＭＢＺは、ペルオキシダーゼによる過酸化水素の分解と共役して酸化し鋭敏に青緑色（λｍａｘ＝６５５ｎｍ）に発色する。この発色は酸性下では直ちに黄色（λｍａｘ＝４５０ｎｍ)の色素に変化する。したがって、ペルオキシダーゼによる呈色反応をクエン酸で停止させる本発明の方法では、硫酸を用いる従来の方法と同様に酸性下で反応を停止させることができ、同じ測定波長でペルオキシダーゼ活性の比色定量ができる。
　ペルオキシダーゼ反応が停止される温度としては、クエン酸が反応液に十分混合されれば特に限定はないが、４～３７℃が好ましく、２０～３０℃がより好ましい。
　なお、本発明の方法を免疫測定法にて使用する場合、測定対象となる物質に特に限定はない。研究、診断、環境測定などの分野で測定することが望まれ、かつそれに結合する抗体を取得可能である物質を測定対象とすることができる。例えばヒトもしくは非ヒト動物の生体由来物質、植物、微生物、ウイルスに由来する抗原やアレルゲン等が挙げられる。
　かくして、ペルオキシダーゼの反応をクエン酸によって停止することが出来、その結果、テトラアルキルベンジジンの酸性下での呈色によりペルオキシダーゼ活性を測定することが可能となる。従って、本発明の別の態様として、ペルオキシダーゼ及びテトラアルキルベンジジン又はその塩を含有するペルオキシダーゼ反応液にクエン酸を添加して反応を停止させることを特徴とする、ペルオキシダーゼ活性の測定方法が挙げられる。
　また、本発明の一態様として、クエン酸を反応液に添加することでペルオキシダーゼ反応を停止させることができることから、クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤を提供する。該反応停止剤は、前記本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法に好適に用いられる。
　本発明における反応停止剤は、有効成分としてクエン酸を含有し、テトラアルキルベンジジンとペルオキシダーゼを含有する反応液に添加された際にペルオキシダーゼの触媒する反応を停止し、かつ反応停止後に生じた黄色色素の吸光度が安定に保持されるものであれば限定はない。具体的には、例えば、クエン酸水溶液が挙げられる。
　反応停止剤におけるクエン酸含有量は一概には決定されず、ペルオキシダーゼ反応液へ添加された後のクエン酸終濃度が好ましくは０．１２５Ｍ以上、より好ましくは０．５Ｍ以上、更に好ましくは１Ｍ以上となるよう調製されたクエン酸溶液が反応停止剤として適している。また、特に上限はないが、例えば反応液への添加後のクエン酸の終濃度が好ましくは３Ｍ以下、より好ましくは１．５Ｍ以下となるよう調製された反応停止剤が本発明に適している。かかるクエン酸濃度となるのであれば、反応停止剤の調製方法は特に制限されず、例えば、クエン酸一水和物を水に溶解して調製することができる。
　なお、本明細書において「クエン酸を有効成分として含有する」とは、ペルオキシダーゼ反応を実質的に停止する成分としてクエン酸を含有することを意味し、本発明の反応停止剤には、クエン酸以外に、本発明の効果を損なわない範囲内で、ペルオキシダーゼ反応を停止可能な公知の成分が含まれていてもよく、また、ペルオキシダーゼ反応に関与しない成分が含まれていてもよい。
　上記の、本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法に使用される反応停止剤を含有するキットも本発明の一態様である。
　具体的には、
（１－ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、及び
（１－ｂ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤
を含有するペルオキシダーゼ活性を測定するためのキット（ペルオキシダーゼ活性測定用キット）が挙げられる。
　該キットにおける（１－ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩としては、本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法にて用いられるものと同様のものを用いることができ、なかでも、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン又はその塩が好ましい。また、（１－ｂ）反応停止剤は、本発明の反応停止剤であれば特に限定はない。
　キットの形態や使用方法は特に制限されず、例えば、（１－ｂ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤を、（１－ａ）テトラアルキルベンジジンとペルオキシダーゼを含有する反応液に、クエン酸の終濃度が０．１２５Ｍ以上となるように添加することで、ペルオキシダーゼ反応を停止させてペルオキシダーゼ活性を測定することができる。該反応液には、本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法における反応液に含有される成分と同様の成分を添加してもよい。また、反応停止剤の添加は、反応を停止させたいポイントで添加すればよい。
　また、
（２－ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、
（２－ｂ）ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原、及び
（２－ｃ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤
を含有する酵素免疫測定法のためのキットが挙げられる。
　該キットにおける（２－ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩としては、本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法にて用いられるものと同様のものを用いることができ、なかでも、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン又はその塩が好ましい。
　（２－ｂ）ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原としては、本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法にて記載したものが例示され、その調製方法も同様である。
　（２－ｃ）反応停止剤は、本発明の反応停止剤であれば特に限定はない。
　キットの形態や使用方法は特に制限されず、例えば、（２－ｃ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤を、（２－ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩と（２－ｂ）ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原を含有する反応液に、クエン酸の終濃度が０．１２５Ｍ以上となるように添加してペルオキシダーゼ活性を測定することで、酵素免疫測定を行なうことができる。該反応液には、本発明のペルオキシダーゼ反応の停止方法における反応液に含有される成分と同様の成分を添加してもよい。また、反応停止剤の添加は、反応を停止させたいポイントで添加すればよい。
　より詳しくは、本発明を利用した酵素免疫測定法の一例としては、例えば下記のような工程１）～５）の手順での測定が例示される。
１）固相化一次抗体による測定対象物質の捕捉と固相の洗浄。
２）測定対象物質へのペルオキシダーゼ標識二次抗体の結合、並びに固相の洗浄。
３）基質溶液（過酸化水素並びにＴＭＢＺ）を添加してインキュベーション（ペルオキシダーゼによる呈色反応）。
４）本発明の反応停止剤を添加してペルオキシダーゼによる呈色反応を停止。
５）吸光度を測定。
　上記１）～３）の工程は、従来のペルオキシダーゼ標識された抗体を用いた酵素免疫測定法とまったく同一の操作で実施することができる。本発明では、反応停止後に生じる呈色の退色が抑制されていることから、工程４）と５）の間に時間がかかった場合であっても、再現性のあるデータを取得することができる。
　なお、本発明が上記のようなサンドイッチ法の以外の酵素免疫測定法（例えば競合法、ウェスタンブロット法）にも適用できることは言うまでもない。
　測定対象物質の検出・定量に使用される、
（３－ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、
（３－ｂ）測定対象物質に結合するペルオキシダーゼ標識抗体、又はペルオキシダーゼ標識された測定対象物質、及び
（３－ｃ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤、
を含有するキットも本発明に包含される。
　以上詳細に説明したように、本発明の態様として、
［１２］発色物質としてテトラアルキルベンジジンを含有するペルオキシダーゼ反応液にクエン酸を添加することを特徴とする、ペルオキシダーゼによる呈色反応の安定化方法、
［１３］テトラアルキルベンジジンが３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンである［１２］記載の方法、
［１４］ペルオキシダーゼ反応液に終濃度が０．１２５Ｍ以上となるようクエン酸を添加する［１２］記載の方法、
［１５］ペルオキシダーゼ反応液がペルオキシダーゼ標識物を含有する反応液である［１２］記載の方法、
［１６］ペルオキシダーゼ標識物がペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原である［１５］記載の方法、
［１７］クエン酸を有効成分として含有する、［１２］～［１６］いずれかに記載のペルオキシダーゼによる呈色反応の安定化方法に使用される反応停止剤及び／又は安定化剤、
も提供される。
　以下に実施例により、更に詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲内に限定されるものではない。なお、本明細書において、室温とは特に断りのない限り４～３７℃のことである。
実施例１　クエン酸を含有する反応停止剤によるペルオキシダーゼによる呈色反応の停止
　１．５ｍＬ　Ｍｉｃｒｏ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　Ｔｕｂｅ（Ｔｒｅｆｆ社製）にＴＭＢ　Ｏｎｅ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ＨＲＰ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社製）５００μＬと本発明者らが取得した過ヨウ素酸をもちいた抗Ｒａｔ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　２抗体－ペルオキシダーゼ標識物液２０μＬを添加して攪拌後、８分間室温で静置してペルオキシダーゼによる呈色反応を行った。次に各種反応停止剤を５００μＬ添加して反応を停止した。反応停止後の各反応液を９６　Ｗｅｌｌ　Ｍｉｃｒｏ　ｔｉｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）各１ウェルに１００μＬずつ分注し、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｍａｘ　Ｍｉｃｒｏ　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて停止直後から５分毎に４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。反応は４連で行い測定値の平均値を採用した。ここで反応停止剤は、硫酸（和光純薬工業社製）を精製水で希釈して調製した０．５Ｍ硫酸、又はクエン酸一水和物（ナカライテスク社製）０．２５Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ水溶液を使用し、各反応停止剤に用いられた硫酸又はクエン酸の反応液における終濃度は、硫酸が０．２４５Ｍ、クエン酸が０．１２３Ｍ、０．２４５Ｍ、０．４９０Ｍ、０．７３５Ｍ、０．９８０Ｍであった。
　その結果を図１に示す。すなわち図１は、０．５Ｍ硫酸（図１中●）又は各濃度のクエン酸水溶液（図１中、０．２５Ｍ（×）、０．５Ｍ（◇）、１Ｍ（△）、１．５Ｍ（□）、２Ｍ（○））の添加による反応停止後の反応液の吸光度と経過時間との関係を示す図である。図１に示すとおり、反応停止を目的として０．５Ｍ硫酸、又は各濃度のクエン酸水溶液を添加したところ、添加直後から反応液の吸光度上昇がみられなくなった。このことから、クエン酸は硫酸と同様、ペルオキシダーゼによる呈色反応を停止できることが示された。今回用いた最も希薄なクエン酸水溶液（濃度０．２５Ｍ）であっても添加後のペルオキシダーゼによる呈色反応は進まず当該反応を停止できることが確認された。一方、硫酸による反応停止後の反応液と比較した各クエン酸水溶液による反応停止後の反応液の４５０ｎｍにおける吸光度は、クエン酸終濃度が低い場合には低く、クエン酸の終濃度が高くなるにつれて高くなり、０．５Ｍ硫酸による反応停止後の反応液と同等の吸光度を得るには２Ｍ以上のクエン酸水溶液の添加、すなわち終濃度１Ｍ以上のクエン酸の添加が必要であることが判明した。
　更に驚くべきことに、吸光度４付近を示す本測定条件において、図１に示すとおり硫酸による反応停止条件では反応停止後の反応液が退色し吸光度の低下が観測されたことと比較し、クエン酸による反応停止条件ではいずれのクエン酸濃度条件においても退色が抑制され、吸光度の安定性が顕著に改善されたことが判明した。また、硫酸による反応停止条件で反応停止後に見られた沈殿物はクエン酸による反応停止条件では見られなかった。
実施例２　０．５Ｍ硫酸による反応停止後の反応液と同等の吸光度が得られるクエン酸水溶液濃度の同定
　実施例１と同様の試験を行い、反応停止直後の反応液の４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。反応は４連で行い、測定値の平均値を表１に示した。ここで反応停止剤は０．５Ｍ硫酸、又は２Ｍ、２．２５Ｍ、２．４Ｍ、３Ｍとなるクエン酸一水和物水溶液を使用した。また、各反応液における硫酸又はクエン酸の終濃度は、硫酸が０．２４５Ｍ、クエン酸が０．９８０Ｍ、１．１０３Ｍ、１．１７６Ｍ、１．４７１Ｍであった。表１に示されるように、終濃度０．９８０～１．４７１Ｍの範囲で実質的に０．５Ｍ硫酸添加による反応を停止条件と同様の測定値を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すとおり２Ｍ以上のクエン酸水溶液添加条件において、０．５Ｍ硫酸添加による反応停止後の反応液と同等の吸光度が安定して得られることが判明した。したがって以降の実施例ではクエン酸を含む反応停止剤として５０ｗ／ｖ％クエン酸一水和物水溶液を用いることとした。５０ｗ／ｖ％クエン酸一水和物水溶液は同２．３８Ｍに相当する。
実施例３　ペルオキシダーゼによる呈色反応の安定性の評価
　ＴａＫａＲａ　Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅ　Ｉ　Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＩＰ）　ＥＩＡ　Ｋｉｔ（Ｐｒｅｃｏａｔｅｄ）（タカラバイオ社製）を用いて以下の試験を行った。キット添付のペルオキシダーゼ標識抗ＰＩＰモノクローナル抗体液を１００μＬずつキット添付の抗ＰＩＰモノクローナル抗体プレートの各ウェルに添加した後、あらかじめ調製した各濃度のＰＩＰ液をマイクロピペットで２０μＬずつ各ウェルに添加し、３７℃で３時間反応した。ＰＩＰ液の投入はすみやかに（５分以内）行った。次に反応液を捨て、ＰＢＳで４回洗浄後、キット添付のＴＭＢＺ溶液を８連ピペットで１００μＬずつ各ウェルに添加し、室温（２０～３０℃）で１５分間反応させた。次に反応停止剤を１００μＬずつ、ＴＭＢＺ溶液を入れた順番に各ウェルに添加し反応を停止させた後よく混和し、反応停止直後、１時間後、３時間後に４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。各測定の間、反応停止後の反応液は室温に静置した。反応は２連で行い、測定値の平均値を採用した。ここで反応停止剤には０．５Ｍ硫酸、又は５０ｗ／ｖ％クエン酸一水和物水溶液を使用した。また、各反応液における硫酸又はクエン酸の終濃度は、硫酸が０．２５Ｍ、クエン酸が１．１９Ｍであった。
　その結果を図２及び図３に示す。すなわち図２は、０．５Ｍ硫酸添加による反応停止直後（図２中〇）、１時間後（図２中□）、３時間後（図２中◇）のペルオキシダーゼによる呈色反応液の４５０ｎｍにおける吸光度とＰＩＰ濃度との関係を示す図である。図３は、５０ｗ／ｖ％クエン酸添水溶液加による反応停止直後（図３中●）、１時間後（図３中■）、３時間後（図３中◆）のペルオキシダーゼによる呈色反応液の４５０ｎｍにおける吸光度とＰＩＰ濃度との関係を示す図である。図２から明らかなように、０．５Ｍ硫酸添加による反応停止後の反応液は、特にＰＩＰ濃度６４０ｎｇ／ｍＬ以上の条件において退色が著しく、経時的な吸光度低下の度合いが高く、データの信頼性が損なわれた。一方でクエン酸添加による反応停止後の反応液は、図３から明らかなように、反応停止３時間後であっても反応停止直後の吸光度カーブを維持していた。このことから本発明によるクエン酸を有効成分として含む反応停止剤を用いたことによって、ペルオキシダーゼによる呈色反応停止後の反応液の呈色安定性が飛躍的に向上することが明らかとなった。このことは測定の精度が向上し、かつ測定の時間的条件の制限が改善される効果を生んだことを示す。
　また、０．５Ｍ硫酸添加による反応停止後の反応液は、ＰＩＰ濃度が６４０ｎｇ／ｍＬ以上の条件において、沈殿の発生が観察された。一方５０ｗ／ｖ％クエン酸水溶液添加による反応停止後の反応液ではＰＩＰ濃度２５６０ｎｇ／ｍＬであっても沈殿が発生せず正常に吸光度測定が可能であった。このことは本発明によるクエン酸を有効成分として含む反応停止剤を用いることによって、従来ＰＩＰ濃度６４０ｎｇ／ｍＬ以下と制限されていた当該キットの測定可能範囲が広がるという利点が得られたことを示す。
　本発明により、ペルオキシダーゼ活性の測定の感度あるいは精度を向上することができる。したがって本発明は、免疫生化学分野、遺伝子工学分野、応用生命科学分野、及び医学分野において有用である。

Claims (11)

  1. 　ペルオキシダーゼ及びテトラアルキルベンジジン又はその塩を含有するペルオキシダーゼ反応液にクエン酸を添加して反応を停止させることを特徴とする、ペルオキシダーゼ反応の停止方法。
  2. 　テトラアルキルベンジジン又はその塩が３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン又はその塩である請求項１記載の方法。
  3. 　ペルオキシダーゼ反応液に終濃度が０．１２５Ｍ以上となるようクエン酸を添加する請求項１記載の方法。
  4. 　ペルオキシダーゼがペルオキシダーゼ標識物を含む請求項１記載の方法。
  5. 　ペルオキシダーゼ標識物がペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原である請求項４記載の方法。
  6. 　クエン酸を有効成分として含有する、請求項１～５いずれかに記載のペルオキシダーゼ反応の停止方法に使用される反応停止剤。
  7. 　（１－ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、及び
    （１－ｂ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤
    を含有するペルオキシダーゼ活性を測定するためのキット。
  8. 　クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤が、テトラアルキルベンジジン又はその塩とペルオキシダーゼを含有する反応液に、クエン酸の終濃度が０．１２５Ｍ以上となるように添加される反応停止剤である請求項７記載のキット。
  9. 　（２－ａ）テトラアルキルベンジジン又はその塩、
    （２－ｂ）ペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原、及び
    （２－ｃ）クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤
    を含有する酵素免疫測定法のためのキット。
  10. 　クエン酸を有効成分として含有するペルオキシダーゼ反応の反応停止剤が、テトラアルキルベンジジン又はその塩とペルオキシダーゼ標識された抗体又は抗原を含有する反応液に、クエン酸の終濃度が０．１２５Ｍ以上となるように添加される反応停止剤である請求項９記載のキット。
  11. 　テトラアルキルベンジジン又はその塩が３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン又はその塩である請求項７～１０いずれかに記載のキット。
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